DE1517775A1

DE1517775A1 - Verfahren zur Herstellung eines milchkoagulierenden Enzyms

Info

Publication number: DE1517775A1
Application number: DE19661517775
Authority: DE
Inventors: Knud Aunstrup
Original assignee: Novo Terapeutisk Laboratorium AS
Current assignee: Novo Terapeutisk Laboratorium AS
Priority date: 1965-12-02
Filing date: 1966-11-30
Publication date: 1970-01-29
Also published as: GB1108287A; BR6685010D0; AT282511B; SE347288C; CH470477A; NL147782B; CA1137898A; NL6617035A; FI42693B; BE690571A; DE1517775B2; SE347288B; US3988207A; NO120183B; DK110031A; ES333922A1

Description

Novo Terapeutisk Laboratorium A/S, Kopenhagen /Dänemark

"Verfahren zur Herstellung eines milchkoagulierenden Bnzyms"

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung eines milchkoagulierenden Enzyme.

Bei der Herstellung von Käse ist es erforderlich, die Milch zu koagulieren, um das Kasein von der Molke abzutrennen. Es ist Üblich, hierbei ein Enzym zu verwenden, das aus Kälbermagen isoliert wurde. Um eine zufriedenstellende Käseausbeute zu erzielen und im Hinblick auf den nachfolgenden Reifeprozess des Käses ist es sehr wichtig, dass die proteolytieche Aktivität des Labferments niedrig ist, so dass so wenig Kasein wie möglich während der Herstellung und des Reifeprozesses des Käses aufgelöst wird.

Von Kälbermagen gewonnenes Lab reicht für den vorerwähnten Zweck aus. Es ist jedoch damit zu rechnen, dass in Zukunft der Bedarf an Lab nicht durch Bnζyme aus Kälbermagen gedeckt werden kann. Deshalb sind schon verschiedene Versuche unternommen worden,um andere milchkoagulierende Bnzyme aufzufinden,

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die eine niedrige proteolytische Aktivität besitzen.

Eine grosse Reihe von Microorganismen erzeugen Proteinasen mit milchkoagulierender Wirkung, von denen die meisten aber

ebenso eine beträchtliche proteolytische Wirkung zeigen, so dass die bei der Herstellung von Käse erzielte Ausbeute zu niedrig ist, wobei noch während des Reifeprozessee des Käses bitter schmeckende Zerfallsprodukte des Kaseins (Peptide) entstehen. Dies gilt beispielsweise für die Proteinase von Bacillus subtilis und Aspergillus saitoi.

Enzyme von Mucor pusillus scheinen ein günstigeres Verhältnis zwischen milchkoagulierender und proteolytischer Wirkung zu besitzen. Dieser Microorganismus scheint für eine Oberflächenkultur am geeignetsten zu sein, während er bei einer Tauchkultur verhältnismässig niedrige Ausbeuten bringt.

Es wurde nun gefunden, dass es möglich ist, ein milchkoagulierendes Enzym in grossen Ausbeuten und mit geringen Kosten dadurch herzustellen, dass ein Mucor miehei Cooney und Emerson Stamm oder eine natürliche oder künstliche Variante oder Mutante hiervon in einem geeigneten NährraeUium kultiviert wird.

Das erfindungsgemässe Verfahren wird vorzugsweise mit einer Tauchkultur durchgeführt, es ist aber auch durchaus möglich, sich hierbei einer Oberflächenkultur zu bedienen.

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Dei einer vorzugsweisen Ausführungeform der Erfindung wird der Mucor miehei Conney und Emerson Stamm CBS 370*65 oder eine natürliche oder künstliche Variante oder Mutante hiervon einer Tauchkultur in einem geeigneten Nährmedium unterworfen.

Es liegt aber auch im Rahmen der Erfindung, den zuletzt erwähnten Stan CBS 370.65 oder eine natürliche oder künstliche Variante oder Mutante hiervon vermittels einer Oberflächenkultur in einem geeigneten Nährmedium zu züchten.

Der vorerwähnte neue Mucor Stamm wurde aus einer in Kopenhagen im September 1965 entnommenen Probe isoliert und im Centraalbureau voor Schimmelculturen, Baarn, Holland als der Gruppe Mucor miehei Cooney und Emerson zugehörig identifiziert. Der neue Stamm wurde bei dem genannten Institut unter der oben angegebenen CBS Nummer hinterlegt.

Im Folgenden wird eine morphologische Beschreibung des obigen neuen Mucor CBS 370.65 gegeben:

Turf: Kurz, 2.-3 mm hoch, zuerst weiss, später mausgrau bis dunkelmausgrau;

Sporangiophoren; 6-10 fX> Durchmesser, Verzweigung unter Bildung

eines Stammesj

Sporangien; kugelförmig, 25-60 α Durchmesser, Wandungen

mit kurzen Stacheln besetzt.

Kolumnen; Subglobose bis oval, 20-40 LL Durchmesser! Sporangiosporen; Farblos, subglobose bis elliptisch,

3-5 x 4-6 K-

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Zygosporen t Zahlreich, subglobose, warzig, gelblich bis rötlich, braun wenn jung, schwärzlich bei grosserer Reife, 30-4S/JU im Durchmesser, auf einem homothallischen

Myzel erzeugt}

Azygosporen; vorhanden;

Knospen unbekannt

Wachstum bei 3O-55°C, sehr schnell bei 40°C

Die Herstellung eines milchkoagulierenden Enzyms durch Tauchkultivierung in einem Nährmedium von dem vorerwähnten Mucor Stamm CBS 370.65 wird nachfolgend beispielsweise im einzelnen beschrieben:

1. Versuch mit Schüttelflaschen.

Es wurde ein Nährmedium	folgender Z
angewandt:
Kartoffelstärke	40g/l
Sojamehl	30 g/l
gemahlene Gerste	100 g/l
CaCU₃	5 g/l
Sojaöl	0,5 cm³/!

2 ' Drei Erlenmeyer Flaschen mit einem Volumen von 500 cm , die jeweils 100 cm des vorerwähnten Mediums enthielten, wurden mit einer Sporehsuspension von Mucor miehei Cooney und Emerson CBS 370.65 okuliert und bei 30°C während sieben Tagen auf einen Schütteltisch gebracht. Das Myzel wurde abfiltriert und die Enzymaktivität des Filtrates wurde nach der Kunitz Methode (J.Gen. Physiol. 18, 459 (1935)) bestiemt.

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Flasche I χ 15800 Kunitz Labeinheiten pro Liter Flasche II : 17700 Kunitz » « η n Flasche III : 15700 Kunitz » " η η

2. Halbindustrieller Versuch«

In einem Okulierungstank wurde ein Nährmedium folgender Zusammensetzung hergestellt:

Kartoffelstärke	2	1*5	5	kg
Sojamehl		kg
Gerstenmehl	5	kg
bakterielle Amylase	500
Novo 5000 SKB	ca.	g
CaCO	g
Wasser	40 1

Die Mischung wurde auf etwa 70 C erhitzt und während etwa 30 Minuten auf dieser Temperatur gehalten. Hiernach wurde die Mischung während 90 Minuten bei 120°C unter direkter Einleitung von Dampf gekocht. Nach der Abkühlung betrug das Volumen etwa 50 Liter. Im Anschluss an die Abkühlung auf 34 C wurde das Medium mit Sporen von einer Fernbach Flasche, die YPPSS-Agar (Thermophilic Fungi Cooney & Emerson, London I964) folgender Zusammensetzung enthielt, okuliert:

Hefeextrakt	4 g
K₂HPO₄	1 g
MgSO₄. 7 H₂O	0,5 g
Lösliche Stärke	15 g
Agar	20 g
Wasser	1000 cm³

Die Fernbach Flasche war mit einer lyophilisierten Kultur von Mucor miehei Cooney und Emerson CBS 370.65 okuliert und für die Sporenbildung bei 40°Π inkubiert worden.

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Nach der Okulierung wurde mit dem UmrUhren (240 U/min) und der Belüftung (60 l/min) begonnen. Die Fermentation wurde während 48 Stunden fortgesetzt bis ein gutes Wachstum im Tank beobachtet wurde.

Der Inhalt des Tanks wurde dann in einen Haupt-Fermentationstank mit einer Füllung folgender Zusammensetzung überführt:

Kartoffelstärke 8 kg Sojamehl 6 kg

gemahlene Gerste 20 kg

bakterielle Amylase

Novo 5000 SKB 25 g

CaCO₃ 2 kg

Das Medium wurde gekocht und sterilisiert in derselben Weise wie das Medium des Okulierungstanks. Das Endvolumen betrug 200 Liter.

Nach der Ofculierung wurde mit dem Umrühren ( 4OO U/min) und mit der Belüftung (0,2 m7min) begonnen. Wenn es erforderlich war, wurde Sojaöl als schaumhemmendes Mittel zugegeben. Während der Fermentation wurde der pH-Wert konstant auf 6,5 gehalten.

Nach 129 Stunden betrug der Gehalt der Kulturflüssigkeit an milchkoagulierendem Enzym 2580 Kunitz Lab-Einheiten pro Liter.

3. Zusätzlicher Versuch in der Schüttelflasche. Es wurden Erlenmeyerkolben mit einem Fassungsvermögen von

rt «J

500 cm verwendet, die jeweils 100 cm° an Medium (siehe die

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nachfolgende Tabelle) enthielten. Die Kolben wurden bei 30°C. auf einem sich drehenden Schütteltisch (240 U/min) während der in der nachfolgenden Tabelle angegebenen Zeitdauer inkubiert.

Das Okulierungsmaterial bestand aus einer Sporensuspension, die durch Kultivierung von Mucor miehei Cooney und Emerson CBS 370.65 auf YPFSS-Agar bei 40°C während 2-3 Tagen und Auswaschen der Sporen mit sterilem Wasser erhalten wurde. Das YPPSS-Agar hatte die oben angegebene Zusammensetzung.

Die Aktivität des milchkoagulierenden Enzyms wurde nach Kunitz bestimmt und in KRU (Kunitz Rennet Units) angegeben.

Die Zusammensetzung des Mediums ist in der Tabelle in Gramm pro Liter angegeben. Bei sämtlichen zur Anwendung gelangenden Medien wurde die Stärke vor der Sterilisierung mit bakterieller Amyläse abgebaut.

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BAP ORIGINAL

Tabelle

Medium No, 95	40	aktivität ^lKRU/cm3 nach Inkubatior	6 Tage 13,5	97 05 25	30	40	26 55 62 63 H	40	40	40	40
Zusammensetzung des Mediums in g/l	30	pH nach Inkubatio:	7 Tage 15,4		100	30		30	20	20	20'
Kartoffelmehl	100	8 Tage 17,2	40		100	40	100	100	100	100
Sojamehl		6 Tage 6,1	30			30
gemahlene Stärke		7 Tage 6,9				50		10
gemahlener Mais		8 Tage 7,0	100	40		50			10
gemahlene Maiekeimlinge
gelbes Erbsenmehl			1						10
Reismehl	1		5	1		1	1	1	1
Trocken-- rückstand	5		3	5		5	4 5	5	5
Ma₂SO₄	3	1		3	1	3	3	3	3
CaCO₃		5	11,5		5
KH₂PO₄	3	11,9	13,6	3	12,0	2,6	7,1	4,9
		13,8	19,2		13,2	13,3	14,8	14, q
9,7	7,0	21,2	13,6	14,6	12,9	16,7	15,4
10,7	6,8	6,1	17,8	6,2	6,1	6,2	5,9
14,6	7,5	6,5	18,2	6,8	6,0	6,4	6,3
6,1		6,9	6,0	6,9	6,7	6,2	6,J
7,1	6,7
7,2	6,8

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Ee können Ausbeuten an milohkoagulierendem Enzym in derselben Grössenordnung wie bei den obigen Versuchen mit Schuttelflaschen erhalten werden, wenn man in einem grösseren Maßstab mit (halbindustriellen) Versuchsanlagen arbeitet.

4· Zur weiteren Veranschaulichtes sei darauf hingewiesen, dass milchkoagulierendes Enzym, das in einer entsprechenden Weise unter Verwendung von Mucor pusillus (vom Centraalbureau voor Schimmelculturen, Baarn, Holland) hergestellt worden war, in einer Menge von etwa 300 Kunitz Labeinheiten pro Liter (vgl. Tabelle Medium 955 Schüttelflasche) erhalten "wurde, während unter Verwendung von Muoor miehei CBS 370.65 hergestelltes milchkoagulierendes Enzym etwa 10,000 Kunitz Labeinheiten pro Liter oder noch beträchtlich mehr auswies.

Bei Verwendung eines Mediums aus 10J6 entrahmter Milch, 1% Glukose, 0,l£ Hefeextrakt und 0,005 M CaCl₂ wurden die folgenden Ergebnisse erhalten:

Mucor pusillus1 900 Kunitz Labeinheiten

pro Liter Muoor miehei CBS 370.65 :55OO Kunitz Labeinheiten

pro Liter

5. Versuch mit einer Oberfläohenkultur.

In Erlenmeyerkolben mit einem Fassungsvermögen von 500 cm wurden 25 g einer Mischung von Weizenkleie und Wasser (1:1) sterilisiert. Zu diesem Zwecke würden die Kolben während

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45 Minuten bei 120°C erhitzt. Nach Abkühlen auf 4O⁰C wurden sie mit Sporen des Mucor miehei Cooney und Emerson Stammes CBS 37O.65 in der oben beschriebenen Weise okuliert. Die Kolben wurden während 3 Tagen bei 4O⁰C inkubiert. Die Kleie wurde dann mit 200 cm Wasser extrahiert. Die milchkoagulierende Aktivität des Extraktes wurde auf 4500 KRU/l bestimmt.

Das nach der Erfindung hergestellte mxlchkoagulierende " Enzym wird nachfolgend mit von Kälbermagen gewonnenem Lab in Vergleich gesetzt.

Die Aktivität gegen Natriumkaseinat bei pH 6,3 und 37°C wird mit der von Rennin verglichen. Es wurden dieselben Mengen an KRU der beiden Enzyme eingesetzt und die optische Dichte (OD) wurde bei 280 myu. nach Ausfallung mit Trichloressigsäure bestimmt. Nach I80 Minuten hatte sich die OD des mit Rennin behandelten Kaseinats nicht geändert (konstant bei 0,137) während die OD für das Mucor miehei Enzym von 0,136 auf 0,265 angestiegen war, was für die praktische Käseherstellung ziemlich unbedeutend ist.

Das nach der vorliegenden Erfindung hergestellte milchkoagulierende Enzym wurde zur Herstellung von Käse eingesetzt, wobei der erzielte Geschmack und die Ausbeuten befriedigend wareh.

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Claims

Patentansprüche

1. Verfahren zur Herstellung eines milchkoagulierenden Enzyms, dadurch gekennzeichnet, dass ein Mucor miehei Cooney und Emerson Stamm oder eine natürliche oder kunstliche Variante oder Mutante hiervon in einem geeigneten Nfthrmedium kultiviert wird«

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass ein Mucor aiehei Cooney und Baerson Stamm oder eine natürliche oder künstliche Variante oder Mutante hiervon nach dem Tauchkulturverfahren in einen geeigneten Nährmedlum kultiviert wird.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass ein Mucor miehei Cooney und Emerson Stamm oder eine natürliche oder künstliche Variante oder Mutante hiervon nach dem Oberfllchenkulturverfahren in einem geeigneten Nährmedium kultiviert wird.

4. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass der Mucor miehei Cooney und Baerson Stamm CBS 370.65 oder eine naturliche oder künstliche Variante oder Mutante hiervon nach dem Tauchkulturverfahren in einem geeigneten Nährmediua kultiviert wird.

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5· Verfahren nach Anspruch 3» dadurch gekennzeichnet, dass der Mucor miehei Cooney und Emerson Stamm CBS 37°·65 oder eine natürliche oder künstliche Variante oder Mutante hiervon nach dem Oberflächenkulturverfahren in einem geeigneten Nährmedium kultiviert wird.

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