DE1695304B2 - Verfahren zur Herstellung von 5'-Inosinsäure und S'-Guano-sinmono-,- di- und -triphosphat - Google Patents

Description

läyre, Aromoulftkwaeser, Kaliurohydroxid oder Natriumhydroxid, je nach dem verwendeten Nährmedium, eingestellt.

S'-Xanthylsfture wird dem NShrmedium in einer Menge von etwa 5,0 bis 30 mg/ml zugesetzt s

S'-Xanthyls&ure kann als reines Produkt verwendet werders, oder es können rohe S'-Xanthylsgure, 5'-Xanthylsäure enthaltende Substanzen oder 5'-Xanthylsäure enthaltende Kulturflössigkeiten, die durch Fermentation erhalten worden sind, verwendet werden, wenn %a das Wachstum der genannten Mikroorganismen und die Anreicherong von 5'-Inosinsäure oder der 5'-Guanosinphosphate im Kulturmedium dadurch nicht nachteilig beeinflußt werden.

Die 5'-Xanthylsäure kann dem Nährmedium zu Beginn der Züchtung oder auch nach Beginn der Züchtung zugegeben werden.

Nach einer Ausgestaltung der Erfindung enthält das Nährmedium außerdem ein oberflächenaktives Mittel.

Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren kanu beispielsweise die Bildung von Guanylsäure beeinträchtigt werden, wenn Mn+^-Ionen in dem Kulturmedium vorhanden sind. Wenn das Mn⁺⁺-Ionen enthaltende Kulturmedium jedoch ein oberflächenaktives Mittel enthält, wird Guanylsäure nahezu in einer solchen Menge gebildet, wie sie erzielt wird, wenn das Kulturmedium keine Mn⁺⁺-Ionen enthält. In den Fällen, in denen billige natürliche Zusätze bzw. Nährstoffe, die Mn⁺⁺-Ionen enthalten, verwendet werden, ist es daher vorteilhaft, wenn dem Nährmedium ein oberflächenaktives Mittel zugesetzt wird. Die dem Nährmedium zuzusetzenden oberflächenaktiven Mittel oder Dispergiermittel können anionisch, kationisch oder nichtionisch sein. Solche Substanzen sind in der Technik bekannt und umfassen allgemein Materialien, wie die Natriumsalze von höhermolekularen Alkylsulfaten oder -sulfonaten, Polyoxyäthylenglycolderivate, höhere Fettsäuren mit 12 bis 20 Kohlenstoffatomen, z. B. Laurinsäure, Myristinsäure, Palmitinsäure, Stearinsäure oder ölsäure und organische Ester von höheren Fettsäuren, wie z. B. Sorbitmonooleat.

Nach etwa 2- bis 8tägigem Züchten unter den angegebenen Bedingungen werden wesentliche Mengen und zwar 24 Stunden lang bei 3O⁰C, Om Einsaatmedium besitzt einen pH-Wert von 7,2,

Die entstandene Einsaatkultur wird im einer Menge von 10 Volumprozent in das Fermentatioiwmedium eingeimpft. 20-ral-Anteile des Einsaat- oder Ferroentationsmediums werden in 250-m>Ejl«uneyerkolben eingefüllt und nach Sterilisation (10 Minuten lang bei 120^pC unter Druck) verwendet Das Fermentationsmedium besitzt folgende Zusammensetzung:

10% Glucose,

0,6% Harnstoff,

1,0% KH₁PO₄,

l,0< K₁HPO₄,

1,0% MgSO₄-7H.O,

0,01% CaCl,-2H₁O,
30 μ g/l Biotin,
20 mg/1 Adenin,

5 mg/ml Vitamin B₁,
10 mg/1 Calciumpantothenat, 1,0% Fleischextrakt.

Der pH-Wert des Mediums wird mit verdünntem Natriumhydroxid auf 7,8 eingestellt. 5'-Xantnylsäure

^ä|5 (80 % Reinheit) ist vor Einimpfung des Einsaatstammes in das Fermentationsmedium in einer solchen Menge zu dem Fermentationsmedium hinzugegeben worden, daß sich eine Endkonzentration von 25 mg/ml ergibt. Die Züchtung wird dann unter aerobem Schütteln der Kultur 120 Stunden lang bei 3O⁰C durchgeführt. Der pH-Wert des Mediums wird während der Züchtung mit verdünntem Ammoniakwasser auf 7,5 eingestellt, beginnend 72 Stunden nach Anfang der Züchtung und dann bis zur Beendigung. Nach Abschluß der Fermentation werden 10,8 mg/ml 5'-Guanosinmonophosphat, 2,4 mg/ml 5'-Guanosindiphosphat, 8,2 mg/ml 5'-Guanosintriphosphat und 12,7 mg/ml 5'-Inosinsäure in der Kulturflüssigkeit angereichert gefunden. Außerdem finden sich kleine Mengen an 5'-Xanthylsäure, Guanosin, Guanin und Hypoxanthin ebenfalls in der Kulturflüssigkeit.

Ein Liter des Filtrates, das man erhalten hat, indem man die Mikroorganismenzellen von der Kulturflüssigkeit abfiltrierte, wird mit Salzsäure auf einen

5'-Inosinsäure und S'-Guanosinmono-, -di- und tri- 45 pH-Wert von 2,0 eingestellt und an Aktivkohle adsorphosphat in der Kulturflüssigkeit und in den Zellen biert. Die mit äthanolischem Ammoniak erhaltene der Mikroorganismen gefunden.
Nach Beendigung der Züchtung

können die gebildeten 5'-Guanosinphoshate und die 5'-Inosinsäure entweder als einzelne Verbindungen oder im Gemisch nach üblichen Verfahren gewonnen werden, z. B. durch Behandeln mit einem Ionenaustauscherharz, Extrahieren mit Lösungsmitteln, Ausfällen, Adsorbieren oder Chromatographie.

Die folgenden Beispiele dienen der weiteren Erläuterung der Erfindung. Falls nach anders angegeben, beziehen sich die Prozentangaben auf das Gewicht pro Liter Wasser.

Beispiel 1

Brevibaeterium amniöfliagenes ATCC 21172 wird als Einsaatstamm verwendet. Dieser Stamm ist eine Mutante, die erhalten worden ist durch Behandlung von Brevibaeterium ammoniagenes ATCC 6872 mit abfließende Lösung wird dann konzentriert. Danach wird der pH-Wert der konzentrierten Lösung auf 2,5 eingestellt und die Lösung durch ein Anionenaustauscherharz (Styrol-Divinylbenzol-Copolymerisat, Cl-Form) geschickt und mit Salzsäure eluiert. Es werden Fraktionen erhalten, die 5'-Inosinsäure, 5'-Guanosinmonophosphat, 5'-Guanosindiphosphat und 5'-Guanosintriphosphat enthalten. Die Lösungen, die diese Fraktionen enthalten, werden auf einen pH-Wert von 7,0 eingestellt und unter vermindertem Druck eingeengt. Äthanol wird hinzugefügt und das Gemisch der Natriumsalze von 5'-Inosinsä;ire und 5'-Guanylisinphosphate abgetrennt. Die Ausbeute beträgt 21,4 g.

Das Gemisch der Natriumsalze wird wiederum durch einen Anionenaustauscherharz (Styrol-Divinylbenzol-Copolymerisat Cl-Form) geschickt, und die vier daran adsorbierten Verbindungen, 5'-Inosinsäure₍

UV-Strahlen, Dieser mutante Stamm ist Adenin «5 5'-Guänosiamönophösphat, S'-GuÄnosindiphosphat

bedürftig. Das Einsaatbacterium wird ία einem und 5'-Guanosintriphosphat werden fraktioniert elu-

Medium gezüchtet, das 2% Glucose, 1% Pepton, iert und auf diese Weise voneinander getrennt

1% Hefeextoakt und 0,3% Natriumchlorid enthält, Der pH-Wert von jeder Fraktionierung wird auf

la 95 304

7,0. eingestellt, und die Lösungen werden unter ver- ergibt. Der pH-Wert des Mediums wird während der

mtodertem Druck konzentriert, Äthanol wird hinzu- Züchtung mit verdünnter Natriumhydroxidlösung auf

gefugt und jede der Verbindungen in Form des Na- 7,6 eingestellt, , , ,

triurosalzes abgetrennt. Die Ausbeute beträgt 8,7 g Nach Abschluß der Fermentation sino 8 rag/ml

5'-Inosinsäure, 8,2 g 5'-Guanosinmonophospbat, 1,8 g 5 5'-Inosinsäurc, 4 rag/ml S'-Guanosinmonophosphat

Guanosindiphosphat und 6,7 g Guanosintriphosphat, und 7 mg/ml 5'-Guanosintriphospbat in der Kulturflüssigkeit angereichert worden. Außerdem finden sich

Beispiel 2 kleine Mengen an 5'-Guanosindiphosphat, 5'-Xanthyl-

Brevibacterium ammoniagenes ATCC 21172 wird säure, Guanosin und Guanin in der Kulturflüssigkeit,

wiederum als Einsaatstamm verwendet. Eine Einsaat- ¹⁰ B ' i e 1 3

kultur wird unter Verwendung desselben Mediums ueisp

und derselben Bedingungen wie in Beispiel 1 erhalten. Der mutante Stamm Corynebacterium glutamicum

Die entstandene Einsaatkultur wird in einer Menge ATCC 21173 wird als Einsaatbacterium verwendet.

von 10 Volumprozent in ein Fermentationsmedium Diese Mutante wird durch Behandlung von Coryne-

der folgenden Zusammensetzung eingeimpft: *5 bacterium glutamicum ATCC13032 mit Nitrosoguani-

din erhalten. Der mutante Stamm ATCC 21173 besitzt

15% Glucose, die spezielle Eigenschaft, daß sein Wachstum durch

0,6 % Harnstoff, Adenin, Guanin oder Hypoxanthin erheblich beschleu-

0,5% KH₁PO₄, nigt wird. Eine Einsaatkultur dieses Stammes wird in

0,5% K₁HPO₄, ^ao einer Menge von 10 Volumprozent in ein Fermen-

0,5% MgSO₄ · 7H₂O, tatiousmedium der folgenden Zusammensetzung ein-

0,01 % CaCI₁ · 2 H₁O, geimpft:
10 mg/1 FeSO₄ -7H₁O,

1 mg/1 ZnSO₄ · 7 H₁O, 13 % Glucose,

3 mg/ml MnQ₁ · 4H₁O, *5 1,0% KH₁PO₄,

5 mg/1 Vitamin B₁, 1,0 % K₁HPO₄,

10 mg/1 Calciumpanthenat, 1,0 % MgSO₄ · 7 H₁O,

30 mgfl Adenin, 1,5 % NH₄Cl,

30 μ g/l Biotin, 0,5 % Hefeextrakt,

1,0% Fleischextrakt 30 3% CaCO₃.

Die Züchtung wird 72 Stunden lang bei 35° C durch- Das Fermentationsmedium besitzt einen pH-Wert

geführt. Dann wird eine 5'-Xanthylsäure enthaltende von 7,3. Zum Zeitpunkt des Einimpfens der Einsaat-

FermentationsfiOssigkeit (enthaltend 30 mg/ml 5'-Xan- kuitur in das Fermentationsmedium wird außerdem

thylsäure) in einer äquivalenten Menge der Fennen- 35 5'-Xanthylsäure in einer Menge von 20 mg/ml zuge-

tationsflüssigkeit des vorliegenden Beispiels zugegeben. fügt. Die übrigen Züchtungsbedingungen entsprechen

Außerdem wird ein oberflächenaktives Mittel, Alkyl- den in dem Beispiel 1 beschriebenen. Nach 120 Stunden

dimethylbenzylammoniumchlorid, dem Medium in der Züchtung sind 8,1 mg/ml S'-Inosinsäure, 7,5 mg/ml

einer Menge von 3,0 mg/ml zugegeben. Die Züchtung 5'-Guanosinmonophosphorsäure und 8,4 rag/ml

wird dann weitere 48 Stunden lang durchgeführt. 40 5'-Guanosindiphosphorsäure in der Kulturflüssigkeit

Während der Züchtung wird eine Ammoniumchlorid- angereichert worden. Außerdem findet man kleinere

lösung in einer solchen Menge zu dem Medium hinzu- Mengen an 5'-Xanthylsäure, Guanosin und Guanin in

gefügt, daß sich eine Endkonzentration von 0,5 % der Fermentationsflüssigkeit.

Claims (3)

ι * mit Hilfe von in Bierhefe (Saccharorayces cerevisiae) Patentansprüche: enthaltenden Enzymen gewonnen. H Gem&ß dem erflndungsgeroäßen Verfahren gelingt

1. Verfahren zur Herstellung von 5Mnosinsäure es demgegenüber, gleichzeitig S'-Jnosins&ure und und S'-Guanosinmono«, -di- und -triphosphat, d a- 5 S'-Guanosinmono-,-di- und -tnphospbat im Rahmen durchgekeunzeichnet, daß man Brevi- eines einzigen Verfahrens auf fermentativem Wege bacterium amrooniagenes ATCC 21172 oder dadurch herzustellen, daß man Brevibactenura ammo. Corynebacterium glutamicum ATCC 2X173 unter niagenes ATCC 21172 oder Corynebactenum glutaaeroben Bedingungen in einem wäßrigen Nähr- raicum ATCC 21173 unter aeroben Bedingungen ,η medium, das etwa 5,0 bis 30 mg/ml 5'-Xanthylsäure i° einem wäßrigen Nährmedium, das etwa 5 bis 30 mg/ml enthält, bei einer Temperatur von etv-'a 20 bis 40° C 5'-Xanthylsäure enthält, bei einer Temperatur von wad einem pH-Wert von etwa 5,5 bis 9,0 züchtet, 20 bib 40⁰C und einem pH-Wert von etwa 5,5 bis 9 5'-Inosinsäure und 5'-Guanosinmono., -di- und züchtet, 5'-Inosinsäure und 5 -Guanosinmono-, -di- -triphosphat in der entstehenden Kulturflüssigkeit und -triphosphat in der entstehenden Flüssigkeit anreichert und aus dieser gewinnt »5 anreichert und aus dieser gewinnt

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekenn- Die als Ausgangsmaterial verwendete 5'-Xanthylzeichnet daß man eine 5'-XanthyIsäure enthaltende säure kann beispielsweise gemäß der britischen Kulturflüssigkeit dem Nährmedium zugibt Patentschrift 1170 970 in großen Mengen auf fermen-

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekenn- tativem Wege hergestellt werden und ist -ils relativ zeichnet daß das Nährmedium außerdem ein ao leicht zugänglich anzusehen,
oberflächenaktives Mittel enthält. Gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren reichern

sich sowohl 5'-Inosinsäure als auch 5'-Guanosinmono-, -di- und triphosphat in dem Kulturmedium in,

gegenüber bekannten Verfahren hohen Anteilen an.

35 Für die Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens ist entweder ein synthetisches oder ein natür-

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung liches Nährmedium geeignet, solange es die für das

von 5'-Inosinsäure und 5'-Guanosinmono-, -di- und Wachstum des verwendeten Stammes notwendigen

-triphosphat. Nährstoffe enthält. Solche Nährstoffe sind in der

5'-Guanosinnucleotide und 5'-Inosinsäure finden 3° Technik bekannt; zu ihnen gehören Substanzen wie eine verbreitete Verwendung als Würzstoffe. Außer- eine Kohlenstoffquelle, eine Stickstoffquelle und andern haben sie auf dem Gebiet der Medizin Bedeutung, organische Substanzen, die durch den verwendeten

Aus der französischen Patentschrift 1 465 166 ist Mikroorganismus in geeigneten Mengen ausgenutzt bekannt 5'-Inosinsäure unter Züchten von Mikroorga- werden. So können als Kohlenstoffquelle Kohlennismen, wie Brevibacterium ammoniagenes ATCC 35 hydrate, z. B. Glucose, Fructose, Maltose, Sucrose, 19183, Brevibacterium ammoniagenes ATCC 19184, Stärke, Stärkehydrolysate oder Melassen oder orga-Brevibacterium ammoniagenes ATCC 19185 und nische Säuren, z. B. Essigsäure, Milchsäure oder Micrococcus glutamicus ATCC 19186, in Gegenwart Glutaminsäure, genannt werden. Diese Substanzen von Biotin herzustellen. Nach den dortigen Ausfüh- können entweder einzeln oder in Gemischen zweier rangen wird unter Anwendung der genannten Mikro- 4<> oder mehrerer verwendet werden. Als Stickstoffquelle Organismen 5'-Inosinsäure in einer Menge gebildet, können verschiedene Arten von anorganischen oder die je nach dem speziellen Mikroorganismus in dem organischen Salzen oder Verbindungen verwendet Bereich von 15,6 bis 19,6 mg/ml liegt. Außerdem wer- werden, wie z. B. Harnstoff, Ammoniak oder Ammoden bei dem bekannten Verfahren gegebenenfalls niumsalze, wie Ammoniumchlorid, Ammoniumsulfat, geringe Mengen Hypoxanthin gebildet. 45 Ammoniumnitrat, Ammoniumacetat oder Ammo-

J'-Guanosinsäurenucleotide sind aus der Ribo- niumphosphat, oder natürliche stickstoffhaltige Stoffe,

nucleinsäure (RNS) von natürlichen Substanzen, wie z. B. Maisquellflüssigkeit, Hefeextrakt, Fleisch-

z. B. von Mikroorganismen, gewonnen worden. Aus extrakt, Pepton, Fischmehl, Bouillon, Caseinhydroly-

der französischen Patentschrift 1 369 382 ist bekannt, sate, Casaminosäure, Fischpreßsäfte und Reiskleie-

RNS durch spezifisch wirkende Enzyme, z. B. unter 5° extrakt. Auch diese Substanzen können entweder allein

Verwendung von Streptomyces aureus, in 5'-Guanosin- oder .'Js Kombination von zwei oder mehreren ver-

monophosphat zu spalten. Aus der französischen Pa- wendet werden. Anorganische Stoffe, die zu dem

tentschrift 1 369 070 ist ferner bekannt, aus Hefe ge- Züchtungsmedium hinzugefügt werden können, sind

wonnenes Guanosin durch Phosphorylierung in z. B. Magnesiumsulfat, Natriumphosphat, Kalium-

5'-Guanosinmonophosphat zu überführen. 5'-Guano- 55 dihydrogenphosphat, Kaliummonohydrogenphosphat,

sinmonophosphat kann ferner durch Züchten be- Eisensulfat, Manganchlorid, Calciumchlorid, Natrium-

stimmter Mikroorganismen (z, B. Mutanten von chlorid und Zinksulfat

Bacillus megaterium de Bary) in üblichen Nährmedien Außerdem können dem Kulturmedium Amino-

»us deren Kulturmedien gewonnen werden (franzö- säuren, Vitamine, Purine, Pyrimidine, Biotin und

sieche Patentschrift 1372 054). ⁶° Pantothenat zugegeben werden.

Aus der französischen Patentschrift 1440 633 ist ein Die Züchtung dec genannten Mikroorganismen wird

mikrobiologisches Züchtungsverfahren z. B, unter unter aeroben Bedingungen, wie z. B. aerobem

Verwendung von Brevibacterium ammoniagenes ATCC Schütteln der Kultur oder durch Rühren und Belüften

6872 bekannt, nach dem Guanin in 5'-Guanosindi- einer Submerskultur, bei einer Temperatur von etwa

und -triphosphat überführt wird. Nach dem Verfahren 65 20 bis 4O⁰C und einem pH-Wert von etwa 5,5 bis 9,0

der französischen Patentschrift 1343 794 werden durchgeführt

5'«Gudnosirtdi* und -triphosphat aus S'-Guanosin· Der pH-Wert der Kulturflüssigkeit wird während

fflöttööhosphat durch enzymatisch« Phosphorylierung des Züchtens mit Salzsäure, Schwefelsäure, Phosphor·