DE1933375B2

DE1933375B2 - 25-hydroxyverbindungen der vitamind-reihe, verfahren zu ihrer herstellung und 25-hydroxycholecalciferol enthaltendes mittel

Info

Publication number: DE1933375B2
Application number: DE19691933375
Authority: DE
Inventors: Hector Floyd Madison Wis DeLuca (V St A), Blunt, John Wilson, Christ church (Neu Seeland)
Original assignee: Wisconsin Alumni Research Foundation
Current assignee: Wisconsin Alumni Research Foundation
Priority date: 1968-07-01
Filing date: 1969-07-01
Publication date: 1973-02-15
Also published as: NL150682B; FR2012069A1; GB1261291A; IT1052283B; FR2012069B1; NL7608841A; NL6910023A; DE1933375C3; DE1933375A1

Description

Ο—C-R'

thiumaluminiumhydrid reduziert und Cholesl 5,7-dien-3/*,25-diol aus dem Reaktionspro dukt isoliert oder

b) den aus der Verbindung der Formel V erhal tenen26-Norcholest-5,7-dien-25-on-3/i-yleste in einem geeigneten Lösungsmittel mit eine Methyl-Grignard-Verbindung umsetzt, da: Reaktionsgemisch in eine kalte, wäßrige Am moniumchioridlösung gibt, die Lösungsmit telschicht abtrennt und daraus Cholest 5.7-dien-3/i.25-diol isoliert und das erhaltene Cholest-5,7-dien-3/i,25-diol der Formel II!

OH

(HD

HO

mit Ultraviolettlicht bestrahlt und die Bestrahlungsprodukte chromatographisch aufarbeitet

6. Mittel, enthaltend 25-Hydroxycholecalciferol neben üblichen inerten und physiologisch verträglichen Träger- oder Hilfsstoffen.

35 Die Erfindung betrifft neue 25-Hydroxyverbindun gen der Vitamin-D-Reihe. Insbesondere betrifft die Erfindung die 25-Hydroxyverbindungen von Vitamin D₂ (Ergocalciferol) und von Vitamin D, (Cholecalciferol) der Formeln I und II

40

45

in der R eine Alkylgruppe mit 1 bis 16 Kohlen-Stoffatomen oder eine Phenylgruppe und R' eine Alkylgruppe mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen oder eine Phenylgruppe bedeutet, in einem geeigneten Lösungsmittel mit Ν,Ν'-Dibromdimethylhydantoin bis zur Lösung des N,N '-Di oromdimethylliydantoins umsetzt, die erhaltene Lösung abkühlt, das aufgefallene Dimethylhydantoin abfiltriert, das Filtrat zur Trockne einengt, den Rückstand in einem geeigneten Lösungsmittel aufnimmt und mit einer Lösung von Trimcthylphosphit umsetzt, das Lösungsmittel abzieht, den erhaltenen Rückstand chromatographisch über ein Aluminiumoxid enthaltendes Absorptionsmaterial auftrennt und entweder

a) den aus der Verbindung der Formel IV erhaltenen Diester von Cholest-5,7-dien-3/>'.25-dio! in einem geeigneten Lösungsmittel mit Li-

CH,

HC)
25-Hydroxyergocalciferol

Γ OU

CH,

HO

25-HvdroxvcholecaIciferol

Außerdem betrifft die Erfindung Verfahren zur Her-.tellung dieser Verbindungen.

Die antirachitische wirkung von Vraminen der D-Reihe, insbesondere von Ergocalciferol und Cholecalciferol, ist ebenso wie deren Verwendung als Zusätze zu Nahrungsmitteln bekannt.

Es wurde überraschenderweise festgestellt dp 6 die 25-Hydroxyderivate dieser Verbindungen, die den Formeln 1 und II entsprechen, eine größere biologische W lrkung autweisen als die Stammverbindun°en Sie sind daher als Arzneimittel besonders wirksam, insbesondere zur Bekämpfung von rachitischen Erkrankungen.

Die neuen Verbindungen können dadurch hergestellt werden, daß man Säugetiere, insbesondere Schweine, mit an Ergocalciferol bzw. Cholecalciferol angereichertem Futter über einen längeren Zeitraum verabreicht, dann deren Blut sammelt, das Blutplasma isoliert, die Serumproteine des Blutplasmas abtrennt die Serumproteine mit einem Methanol-Chloroform-Gemisch extrahiert, den gegebenenfalls in Chloroform angereicherten Extrakt wäscht und einengt, den Rückstand mit einem niedrig siedenden Kohlenwasserstoff oder Kohlenwasserstoffgemisch aufnimmt und chromatographisch über Kieselsäure die entsprechende 25-Hydroxy verbindung von Ergocalciferol bzw. Cholecalciferol abtrennt. Wenn auch in den folgenden Heispielen nur die biologische Bildung der 25-Hydroxy-

verbindungen an kastrierten Ebern gezeigt wird, so ist diese Synthese nicht auf diese Tiere beschränkt, denn auch bei anderen Warmblütern, nämlich Hühnern, konnten diese Hydroxyderivate nach Verfüttern von Ergo- und Cholecalciferol im Blut nachgewiesen werden. Für eine praktische Gewinnung dieser neuen wirksamen Substanzen, kommen abtr nur Säugetiere in Frage, da nur bei diesen eine Blutentnahme in größerem Maße ohne Schädigung der Tiere möglich ist.

Es wurde weiter festgestellt, daß 25-Hydro.xycholecalciferol durch Bestrahlen einer Lösung von Cholest-5.7-dien-3p'.25-diol mit Ultraviolettlicht und chromatographische Aufarbeitung des Bestrahlungsprodukts hergestellt werden kann.

Cholest-5.7-dien-3,y.25-dioi der Formel 111

—ς-O H

HO

ist eine n. u,- Verbindung. Sie kann dadurch hergestellt werden, daß man eine Verbindung der allgemeinen Formel

O -O-C-R

(ivi

C = O

(V)

in der R eine Alkylgruppc mit 1 bis 16 Kohlenstoffatomen oder eine Pheny!gruppe und R' eine Alkylgruppc mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen oder eine Phenyigruppe bedeutet, in einem geeigneten Lösungsmiltel mit N.N'-Dibromdimethylhydantoin bis zur Lösung des N.N'-Dibromdimethylhydantoins umsetzt. die erhaltene Lösung abkühlt, das ausgefallene Dimethylhydantoin ahfillriert. das Filtrat zur Trockne einengt, den Rückstand in einem geeigneten Losungsmitlel aufnimmt und mit einer Lösung von I iimcthylphosphit umsetzt, das I.ösungsmitlcl ab/ichl. den erhaltenen Rückstand chromatographisch über ein Alimiiniumoxyd enthaltendes Absorptionsmaterial auftrennt und entweder

al den aus der Verbindung der Formel IV erhaltenen Diester von Cholcst-5.7-dien-3,;.25-diol in einem geeigneten Lösungsmittel mit Lilhiumaluminiuinhydrid reduziert und Cholest-5.7-dien-.y'.25-diol aus dem Reaktionsprodukt isoliert. oder

b) den aus der Verbindung der Formel V erhaltenen 26-Norcholcst-5.7-dicn-25-on-.V-y lostet" in einem geei;¹. "ton Lösungsmittel mil einer Meihyl-Gri-( >o gnard-Verbindung umsetzt, das Reaklionsgemisdi

in eine kalte wäßrige Ammoniumchloridlösung gibt, die Lösuiigsmittelschichi abtrennt und daraus Cholcsl-5.7-dien-3,;.25-diol isoliert.

Als Gruppen R und R' sind die niederen Alkylgruppen. insbesondere die Melhylgruppc sowie die Phenylgnippc bevorzugt.

5
Das Verfahren wird durch folgendes Formclschcma erläutert:

O
S- O -C-R'

il ,

R—C—O

(IV)

— c—ο

(V)

O R--C

HO

Ii ,

R—C —O

O (- -O —C R'

OH

(HD

HO

(III)

HO

Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele niiher erläutert.

Beispiel 1

Herstellung von 25-Hydroxyergocaleiferol.
biologisch

IEs wurden vier kastrierte Eber gemischter Zucht mit einem Gewicht von 75 bis 91 kg mit Futter gefüttert, dem so viel in Wasser dispergierbares Vitamin D₂ zugesetzt worden war, daß je 450 g Futter 70 000 Internationale Einheiten Vitamin D₂ vorhanden waren. Hierduich wurde jedes Schwein täglich mit 500 000 I. E. Vitamin D₂ gefüttert. Nach 26 Tagen dieser Fütterung wurde das Blut der Schweine gesammelt und sofort mit '/io des Volumens einer 0.1 m-Natriumoxalatlösung zur Verhütung des Koagulierens versetzt. Die Zellen wurden aus dem Blut abzentrifugiert. Das erhaltene Plasma (4,1 1) wurde mit so viel Ammoniumsulfat versetzt, bis eine 70%ige Sättigung erreicht war. Das Plasma wurde bei 4 C 7 Tage stehengelassen, bis die Serumproteine ausgefällt waren. Der Niederschlag wurde durch Zentrifugieren über 25 Minuten bei 25 000 U/Min, in einer Sharplcs-AS-Y6-P-Zentrifuge gesammelt und mit 6.6 1 eines Gemisches von Methanol und Chloroform im Verhältnis 2:1 extrahiert und 24 Stunden stehengelassen. Anschließend wurden unter Rühren nochmals 2.21 Chloroform zugegeben. Das denaturierte Protein wurde durch Filtrieren über Glaswolle abgetrennt und mit weiteren 4.4 1 des Methanol-Chloroform-Gemisches extrahiert. Die vereinigten Filtrate wurden zu einer wäßrigen, melhanolhaltigen Phase und einer Chloroformphase absitzen gelassen. Die wäßrige Phase wurde abgezogen und erneut mit 2 1 Chloroform extrahiert und erneut absitzen gelassen. Die Chloroformschichten wurden vereinigt, mit 10 1 Wasser gewaschen. 24 Stunden stehengelassen und in einem Rotationsschnellverdampfer eingeengt, bis 50 ml eines öligen, schwarzen Rückstandes erhalten wurden. Der Rückstand wurde mit gesättigter Natriumchloridlösung getrocknet. Er wurde im Rotationsschnellverdampfer /.um Trocknen eingedampft und in 100 ml eines im wesentlichen aus η-Hexan bestehenden Kohlenwasserstoffgemisches aus unmittelbar destillierten aliphatischen Naphthafraktionen mit einem Siedebereich von 65 bis 67 C (Skelly B) gelöst.

Zur Auftrennung der gewünschten Plasmafraktionen durch Chromatographie wurde zuerst ein radioaktives Auftrennungsprofi! für das Plasma wie folgt aufgenommen:

Es wurde radiochemisch reines ³H-Vitamin D₂ hergestellt, indem 1 g Vitamin D₂ mit 3,0 Ci tritiierter Essigsäure 2 Wochen stehengelassen wurde und das Produkt dreimal über eine Vielfachsäule mit Kieselsäure und einmal über eine Säule mit umgekehrter Phase bis zur Erzielung einer konstanten spezifischen Aktivität chromatographiert wurde. Das erhaltene ³H-Vitamin D₂ hatte eine spezifische Aktivität von 12001/Min./I.E. oder 8,6mc/mMol (vgl. P. Neville und H. F. D e L.u c a in »Biochemistry«, Bd. 5 [1966], S. 2201, bezüglich der Säulen und der Bestimmung der radiochemischen Reinheit).

Es wurden 10 Ratten von je etwa 400 g Gewicht,

die mit einer an Vitamin D armen Diät gemäß

H. Steenbockin »Science«, Bd.58 (1923), S.449.

gefüttert worden waren, intraperitoneal mit 10 0001. E.

Η-Vitamin D₂ in 0,1 ml Äthanol behandelt. Nach 24 Stunden wurde durch Herzpunktierung Blut entnommen und zentrifugiert. Es wurden 40 ml Plasma erhallen. Das Plasma wurde mit einem Gemisch von Methanol und Chloroform im Verhältnis 2:1 gemäß Blunt u. a. in »Biochemistry«, Bd. 7 (1968), S. 3317. extrahiert. Der Chloroformextrakt wurde über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und in einem Schnellvcrdampfcr zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wurde mit dem KolilcnwasserstolTgemisch wie vorher gelöst und mit dem aus dem Schweineblut erhaltenen Extrakt vermischt.

Der kombinierte Extrakt wurde in fünf gleiche Teile aufgeteilt und jeder Teil über eine Säule mit Kieselsäurefüllung gemäß Blunt a. a. O. chromatogra-

is phiert. Das Radioaktivitätsprofil des Extrakts in einer derartigen Säule ist in der beigefügten F i g. 1 wiedergegeben, wobei das Maximum III unverändertes Vitamin D, darstellt. Die Fraktionen von je 10 ml unter jedem Maximum wurden vereinigt und auf antirachitische Wirkung biologisch nach dem Reihentest gemäß der US-Pharmakopoe 1955 gegen Ratten geprüft. Die Fraktionen unter dem Maximum IV(F ig. 1) waren etwa 1.5mal aktiver als die Fraktionen unter dem Maximum III. während die Fraktionen unter den Maxima I, II. IVa und V wenig oder keine biologische Aktivität besaßen.

Die Fraktionen des Maximums IV von den fünf Teilmengen wurden gesammelt, in einen Schnellverdampfer zur Trockne eingedampft und erneut auf einer Mehrfachsäule mit Kieselsäure gemäß Neville und De L u c a a. a. O. chromatographierl, wobei jedoch die Mischkammer 250 ml des Kohlenwasscrstofflösungsmiltels (Skellysolve B) und die Vorratskammer 400 ml eines Gemisches von 85% Diäthyl-

äther im Kohlenwasserstoffgemisch enthielt. Sobald die Vorratskammer leer war. wurde sie mit 300 m! reinem Diäthyläther gefüllt. Das Elutionsprofil der kombinierten Fraktionen, in 5-ml-Fraktionen aufgeteilt, ist in F i g. 2 wiedergegeben, wobei das Maximum IVa immer noch auftritt.

Die Fraktionen 63 bis 98 wurden vereinigt, im Schiicüverdampfer eingedampft und über einer Verteilungskolonne mit Celitc (Diatomecnerde) wie folgt chromatographiert:

Es wurden 200 ml des KohlenwasserstofflösungsinittHs (Skelly B) mit dem gleichen Volumen eines Gemisches aus S0"n Methanol und 20% Wasser äquilibrien. Es wurden 20 g Celitc mit 15 ml der Methanolphase gemischt und trocken in Teilmengen von 2 cm in einer Säule von 60 cm Höhe und 1 cm Durchmesser gepackt. Die Oberphasc wurde als mobile Phase benutzt. Die kombinierten Fraktionen wurden in 1 bis 3 ml der mobilen Phase auf die Säule gebracht, und die Säule wurde mit der mobilen Phase entwickelt.

Es wurden 5-ml-Fraktionen gesammelt. Die Fraktionen 11 bis 17 wurden erneut vereinigt, zur Trockne eingedampft und auf einer gleichen Verteilungssäule erneut chromatographiert. Das Radioaktivitätsprofil auf dieser Seite ist in F i g. 3 wiedergegeben.

Die Radioaktivitätsbestimmungen wurden mil einem Flüssigkeits-Scintillationszähler (Packard Tri-Carb Modell 3003) mit einem automatischen, äußeren Standardisierungssystem durchgeführt. Die zu zählenden Proben wurden mit einem Luftstrom zur Trockne eingedampft, in Toluol-Zähllösiing aus 2 g 2.5-Diphenyloxazol und 100 mg l,4-bis-[2-(4-m?lhyl· 5-phenyloxazolyl)benzol] je Liter Toluol eelöst und ausgezählt.

309 507/551

Identifizierung

Zur Identifizierung war es erforderlich, die als Maximum IV erhaltene Verbindung in den Tctramc-Ihylsilyläthcr zu überführen. Es wurden 30 g des isolierten Materials unter einem Strom von trockenem Stickstoff zur Trockne eingedampft. Es wurden einige Tropfen einer Reagenzlösung aus 10 ml trockenem Pyridin, 4 ml Hexamethyldisilazan und 2 ml Trimethylsilylchlorid zugefügt, die Lösung mit Stickstoff gespült und das Gemisch 3 Stunden bei Raumtemperatur im Dunkeln stehengelassen. Es wurden 3 ml des Kohlenwasserstofflösungsmittels (Skclly B) zugefügt und 2 ml 10%iger Schwefelsäure zugegeben. Das Gemisch wurde heftig gemischt und dann absitzen gelassen. Die Kohlenwasserstoffphase wurde über wenig wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und über eine Kieselsäure enthaltende Säule gemäß L u η d u.a. in »Arch. Biochem. Biophysics«. Bd. 120 (1967), S. 513, Chromatographien. In den Röhrchen 19 bis 27 wurde die Silylätherverbindung (15 |xg) gefunden, die durch Gaschromatographie als rein befunden wurde. Sie wurde zur Bestimmung des Massenspektrums verwendet.

Das Ultraviolettspektrum und die gaschromatographischen Werte ließen die Trien-Struktur des Vitamins D₂ in der Verbindung vermuten. Das Massenspektrum der Verbindung aus dem Maximum IV ergab intensive Maxima beim m/<?-Wert 136 (C₉H₁₂O) und 118 (C₉H₁₀) aus dem Ring A einschließlich C₆ und C₇, die auch im Spektrum des Vitamins D₂ auftreten.

Das Massenspektrum der Verbindung aus dem Maximum IV zeigte ein ionisiertes Molekül bei m/e 412; 16 Masseneinheiter. mehr als beim Vitamin D₂. was auf ein zusätzliches Sauerstoffatom hinweist. Durch ein hochauflösendes Massenspektrum wurde dieser Befund bestätigt, der die genaue Masse des Ions mit 412.3341 ergab, entsprechend der Zusammensetzung von C₂₈H₄₄O₂ (berechnet 412,3341). Die Lage des zusätzlichen Sauerstoff-Substituenten in der Seitenkette ergibt sich aus dem Vergleich der Spektren von Vitamin D₂ und der neuen Verbindung. Beide zeigen Maxima bei m/e 271 (C₁₉H₂₇O — 271,2065 gemäß der hochauflösenden Massenspeklrometrie). Diese ergeben sich aus dem Verlust der gesamten Seitenkette durch die Spaltung der Bindung bei C₁₇ bis C₂₀. Außerdem enthielt das hochauflösende Spektrum der neuen Verbindung kleinere Maxima, die wahrscheinlich der Seitenkette selbst entsprechen, bei m/e 141,1255 (C₉H₁₇O) und 123.1181 (C₉H₁₅).

Ein Bruchstück der Masse 59 (C₃H₇O gemäß der hochauflösenden Massenspektrometrie) und die Abspaltung von 58 Masseneinheiten aus dem Molekülion zu einem Maximum bei m/e 354 (354,2900 — C₂₅H₃₈O) im Massenspektrum des Materials aus den Fraktionen IV, aber nicht im Spektrum des Vitamins D₂ ergaben einen Hinweis auf die Hydroxylfunktion bei C₂₅. Das erstere Maximum würde aich durch Spaltung der C^js-Bindung zum Ion (CH₂J₂ = OH(+) und das letztere durch eine Wasserstoffumlagerung unter Abspaltung der Acetonstruktur ergeben, was bei Hotnoallylalkoholen ein bekannter Prozeß ist

Der Beweis für die Stellung der Hydroxylgruppe wurde aus dem Massenspektriim des Silyläthers der Verbindung aus dem Maximum IV erhalten, das ein Molekülion bei m/e 556 für einen Di-trimethylsilyläthcr und das erwartete starke Maximum bei m/e 131 (Grundmaximum) entsprechend der Struktur

C₆H₁₅SiO (CHj)₂C=C)-Si(CHj)J

durch hochauflöscnde Massenspektrometrie zeigte. Dieses Maximum, das auch im Spektrum der Trimethylsilylälherderivale von 25-Hydroxycholesterin und 25-HydroxycholecalciferoI auftritt, aber nicht in

ίο den Spektren der Silyläther von Vitamin D₂ oder D₃. macht die Lage der zusätzlichen Hydroxylfunktion am C₂₅ Atom erforderlich.

Das Kernresonanzspektrum des Materials aus den Fraktionen des Maximums IV, das in CDC!₃-Lösung mit einem Varian Associates Modell HA-100-Spektromcler mit angeschlossenem Rechner für die Zeitmittlung wegen der kleinen Substanzmengen unter Verwendung von Tetramcthylsilan als Vcrgleichsstandard aufgenommen wurde, unterstützte diese Schlußfolgerungen und ergab unabhängigen Beweismaterial für die angenommene Struktur der Verbindung gemäß Formel I. Es wurden die folgenden Werte als Λ-Werte in Teilen je Million Teile (ppm) gegenüber Tctramethylsilan (A = O) erhalten. Ein starkes Singulett bei A 1.24 ppm kann den beiden Methylgruppen am C₂₅ zugeschrieben werden, während zwei DuplettsbeirtO.79(J = 6.5 Hz)und0,81 ppm (J = 7.0Hz) auf die restlichen Methylsubstituenten der Scitcnketten an C₂₁ und C₂₈ zurückgeführt werden müssen.

Die Spektren von 25-Hydroxycholesterin und 25-Hydroxycholecalcifcrol zeigen ein Singulett für die Methylgruppen an C₂₆ und C₂₇ in der gleichen Stellung (A 1,20 ppm). Es muß bemerkt werden, daß zwei DuplcUsbcinO.87(J = 7,0 Hz)und.) 0.98(J = 6.0Hz) im ursprünglichen Ergocalciferolspcktrum in der neuen Verbindung nicht mehr vorliegen. Dieser Befund kann nur durch eine Hydroxylsubstitution am C₂₅ erklärt werden, da diese Dupletts zwei Methylgruppen entsprechen. Das verbleibende identifizierbare Kennzeichen ist das Singulett an der angularen C₁₈-Methylgruppe. Diese Werte lassen die Struktur der neuen Verbindung als 25-HydroxycrgocalcifcroI der Formel I erkennen.

Die hochauflöscnden Massenspektren wurden mit einem MS-9-Spektrometer der Associated Electrical Industries erhalten, der mit einem Rechner Scientific Data Systems Sigma-7 gekoppelt war.

Beispiel 2

Herstellung von 25-Hydroxycholecalciferol.

biologisch

Es wurden vier kastrierte Eber von 94 bis 118 kg mit einem Normalfutter, das mit täglich 250 000 Internationalen Einheiten (I.E.) Vitamin D₃ angereichert war, 26 Tage gefüttert. Das Blut der Schweine wurde gesammelt und mit 1,61 0,1 m-Natriumoxalatlösung behandelt Es wurden 6,8 1 Plasma erhalten. Die Serumproteine wurden durch Zugabe von so viel Ammoniumsulfat zum Serum, daß eine Sättigung von 65 bis 70% erreicht wurde, ausgefällt. Die Niederschlagbildung erfolgte durch Stehenlassen über 3 Tage bei 4° C. Der Niederschlag wurde durch Zentrifugieren 25 Minuten bei 15 000 U/Min, gesammelt und mit 9 1 Methanol—Chloroform im Verhältnis 2:1 extrahiert*). Der Gesamtextrakt aus diesem Verfahren wurde eingeengt und auf 50 ml mit einem Kohlenwasserstoff-

*) Canadian J. Biochem. PhysioU Bd. 37 (1959), S. 911.

lösungsmittel, das hauptsächlich η-Hexan enthielt und aus direkt destillierten aliphatischen Naphthas erhalten worden war (Skelly B) mit einem Siedcbercich 60 bis 68 C vermischt und auf 100000 I.E. ViI-amin-D-Wirkung biologisch im Ratlcn-Rcihenvcrsuch gemäß der US-Pharmakopoe 1955 geprüft.

Its wurden 20 ml des Extrakts auf eine chroinalographischc Absorplionssäule mit 25 g Kieselsäure von 58 cm Höhe und 1.5 cm Durchmesser gegeben. Die Säule wurde mit einem Äiher-Skelly-B-Gemisch mit abfallender Konzentration eluiert, das dadurch erhalten wurde, daß 400 ml eines Gemisches aus 85¹Vo Äther in Skelly B aus einer Vorratskammer in einer Mischkammer, die anfangs 250 ml Skelly B enthielt, laufengelassen wurden. Nachdem 36 Fraktionen von 11 ml gesammelt worden waren, wurde in die Vorratskammer 250 ml reiner Äther gegeben. Es wurden weitere 30 Fraktionen von 11 ml gesammelt. Die Fraktionen 5! bis 60 wurden vereinigt und auf eine Verteilungssäule gegeben. Diese Säule wurde wie folgt aufgebaut: 20 g Celite (Diatomeenerde) wurden mit 15 ml einer stationären Phase aus 80% Methanol und 20Vo Wasser, äquilibriert mit einem gleichen Volumen Skelly B. vermischt. Etwa ² , des Materials wurden in eine Glassäule von 1 cm Durchmesser gepackt. Die Fraktionen 51 bis 60 wurden in einer kleinen Menge mobiler Phase (Skelly B. äquilibricrl mit Methanol—Wasser) auf die Säule gegeben und mit mobiler Phase eluiert, wobei Fraktionen von 5 ml gesammelt wurden. Die Fraktionen 17 bis 21 wurden vereinigt. Der Rest von den 50 ml Ausgangsextrakt wurde in gleicher Weise chromatographiert und verteilt und die gleichen Fraktionen gesammelt.

In allen Fällen wurden die Fraktionen, die ein Ultraviolett Absorptionsmaximum bei 264 ιτίμ in Diäthylather hatten (,· = 18 200) gesammelt und vereinigt.

Identifizierung

Durch das Ultraviolettspektrum und gaschromatographische Werte wurde das isolierte Material mit einer dem Vitamin D₃ ähnlichen Struktur in Zusammenhang gebracht. Durch eine hochauflösende Massenspektrometric gemäß Beispiel 1 wurden die Unterschiede der Struktur zwischen der neuen Verbindung und Vitamin D₃ aufgeklärt.

Das Molekulargewicht des isolierten Produkts betrug 400 (C₂₇H₄₄O₂. ein Cholecalciferol). Im Massenspektrum des isolierten Produkts und im Vitamin D₃ zeigt die Gegenwart eines Maximums bei m/e 271 (C₁₉H₂₇O) die Stelle der zweiten Hydroxylgruppe an der Seitenkette an, da das Fragment m/e 271 durch einen Verlust der Seitenkette durch Spaltung der Bindung bei C₁₇ bis C₂₀ auftritt. Außerdem könnte ein Maximum bei m/e 59 (C₃H₇O) im Spektrum der isolierten Verbindung, aber nicht im Spektrum des Vitamins D₃, durch eine Spaltung der Bindung bei C₂₄ — C₂₅ auftreten, wobei die Hydroxylgruppe am C₂₅ gebunden ist. Die Lage der Hydroxylgruppe am C₂₅ wurde mit dem Kernresonanzspektrum bei 100 MHz (gemessen in CDCl₃ mit Tetramethylsilan als Standard) gemäß Beispiel 1 verifiziert. Hierbei wurde ein starkes Singulett-Maximum bei b 1.20 ppm (wie in 25-Hydroxycholesterin) und die Abwesenheit des Dupletts bei h 0,87 ppm wegen der sekundären C_{26 27}-Methylgruppen wie im Cholecalciferol aufgefunden. Die anderen Besonderheiten des Kernresonanzspektrums, die beim Vitamin D₃ und der neuen Verbindung identisch sind, sind die folgenden:

<) 0,58 ppm — Tetramethylsilan.

Λ 0,54 ppm Resonanz der C₁₈ — H,-Gruppe.

Λ 0.93 ppm - Duplett der C₂₁ — H,-Gruppe

(./ = 6 Hz).

<) 4,81,5,03 ppm —■ Maxima der C₁₉ — H₂-Gruppe.

Λ 6,02 ppm (J = 11.5 Hz), 6,24 ppm (J = 10,5 Hz)

Dupletts der Protonen in den Stellungen

6 und 7.

Beispiel 3

Herstellung von 25-Hydroxycholecalciferol,
synthetisch

A. Herstellung von Cholest-5,7-dien-3/i,25-diol
aus 3.25-Cholcsteryldiacetat

Es wurden 100 mg 3,25-Cholesteryldiacetai in einem Gemisch aus 1,5 ml trockenem Benzol und 1,5 ml eines trockenen Kohlenwasserstoffgemisches. das hauptsächlich aus η-Hexan besteht und durch direkte Destillation von Naphthas hergestellt worden ist und einen Siedebereich von 60 bis 68⁰C hat (Skelly B), gelöst. Die erhaltene Lösung wurde zu 32 mg feinpulverisiertem N.N'-Dibromdimcthylhydantoin in einem Reagenzglas zugegeben, das dann in ein Wasserbad von 72 bis 74" C eingetaucht wurde. Nach vollständiger Lösung des N.N'-Dibromdimethylhydantoins wurde die Lösung in Eis gekühlt. Der gebildete kristalline Niederschlag von Dimethylhydantoin wurde abfiltriert und zweimal mit je 1 ml kaltem Skelly B gespült. Die Spülflüssigkeit und das Fillrat wurden zur Trockene unterhalb 40 C unter vermindertem Druck eingedampft. Der Rückstand wurde in 0.4 ml trockenem Xylol aufgenommen. Die Lösung wurde tropfenweise zusammen mit zweimal 0.1 ml Spülflüssigkcit zu einer Lösung von 0.1 ml TrimethylphoNpliit in 0.3 ml Xylol gegeben, die auf etwa 130 bis 135 C gehalten worden war. Das erhaltene Gemisch wurde etwa 90 Minuten umgesetzt, während es auf der angegebenen Temperatur gehalten wurde und anschließend bei etwa 65° C unter vermindertem Druck zur Trockne eingedampft.

Der erhaltene Rückstand wurde in Skelly B gelöst und auf eine chromatographische Säule mit 25 g neutralem Aluminiumoxid der Aktivitätsstufe I gegeben. Die Säule wurde mit einem Gemisch aus Diäthyläther und Skelly B im Verhältnis 3. ΐ und danach mit einem Gemisch dergleicnen Lösungsmittel im Verhältnis 1 · 1 eluiert. Es wurden Fraktionen von 12 ml gesammelt. Die das Diacetat von ChoJest-5,7-dien-3f)'.25-diol gemäß dem Ultraviolettspektrum (Maxima bei 272. 282 und 294 mμ) enthaltenden Fraktionen wurden vereinigt und zur Trockne eingedampft.

Es wurde die Diacetatverbindung erhalten, die in 3 ml trockenem Äthyläther gelöst und mit einer kleinen Menge (10 mg) Lithiumaluminiumhydrid etwa 5 Minuten umgesetzt wurde. Die erhaltene Lösung wurde mit mehreren gleichen Teilen Wasser zur Entfernung anorganischer Bestandteile gewaschen, getrocknet und der Äther unter vermindertem Druck abgezogen. Der erhaltene Rückstand in einer Menge von 18 mg wurde als Cholest-5,7-dien-3/?,25-diol mit folgenden Eigenschaften identifiziert:

F. 169 bis 171⁰C (aus wäßrigem Methanol), UV-Spektrum: )._max 272, 282 und 294 πΐμ.

29^7

'282 UOOO. Kernresonanzspektrum;

t „ι

Q₈ — H₃ ι) 0.65 ppm.

Qs — H₃ Λ 0,98 ppm,

C₂₁ — H₃ Λ 0,89 ppm (Duplett. J = 6.5 Hz),

C₂₆.27 — ^H3 Λ 1,20 ppm,

C₆₇ — H Λ 5,4 ppm (Multiple«).

Als Ausgangsmaterial können auch andere Ester als die 3,25-Diacetatverbindung eingesetzt werden. Die Estergruppen brauchen nicht in den Stellungen 3 und 25 gleich zu sein. Zum Beispiel kann 25-Benzoyloxy-cholesterylacetat in gleicher Weise als Ausgangsmaterial verwendet werden, wobei vergleichbare Ergebnisse erhalten werden. Im allgemeinen kann der Substituent in 3-Slellung am Steroidkern des Ausgangsmaterials eine Gruppe der Formel

R' CO O -

sein, in der R eine Alkylengruppe mit 1 bis 16 Kohlenstoffatomen oder eine Phenylgruppe ist. und der Substituent in der 25-Stellung kann eine Gruppe der Formel

R' — CO — O —

sein, in der R' eine Ajkylgruppe mil I bis 6 Kohlenstoffatomen oder eine Phenylgruppe ist.

An Stelle von Lithiumaluminiumhydrid kann z. B. auch alkoholisches Kalium oder Natriumhydroxid zur Reduktion verwendet werden.

B. Herstellung von Cholest-5,7-dien-3/7.25-diol
aus 26-Norcholest-5-en-25-on-3/i'-ylacetat

Kemresonanzspektrum:

C₁₈-H₃ Λ 0,63 ppm,
C«~~^H3 ^Λ 0,95 ppm,
C₂₇ — H₃ d 2,12 ppm,
OCOCH₃ Λ 2,02 ppm.

ίο Durch Gaschromatographie wurde gefunden, dai die einzige Verunreinigung aus dem Ausgangsmate rial 26-Norcholest-5-en-25-on-3/i-ylacetat bestand.

Es wurden 245 mg des Rückstands, der etwa 180 ms der 5,7-Dien-Verbindung enthielt, in 3.5 ml trockenen-Benzol gelöst und zu einer Grignardreagenzlösum zugefügt, die durch Zugabe von 0,24 mg Methyljodic in 2,5 ml trockenem Äther zu 72 mg Magnesiumdrehspänen erhalten worden war. Das Gemisch wurde 2,5 Stunden am Rückfluß erhitzt, 17 Stunden stehengelassen und anschließend zu einer kalten Ammoniumchloridlösung zugegeben. Es bildete sich eine wäßrige Schicht und eine Ätherschicht. Die Ätherschicht wurde abgezogen, getrocknet und der Äther verdampft. Der Rückstand wurde mit Skelly B verrieben und ergab nach dem Filtrieren 212 ms eines amorphen Pulvers, das gemäß dem Ultraviolettspektrum und der Gaschromatographie aus 140 mg Cholest-5.7-dien-3/i,25-diol bestand, während der Rest 25-Hydroxycholesterin war.

Mengen der Reaktionsteilnehmer. Temperaturen und Lösungsmittel können auch geändert werden, ohne daß die Ergebnisse erheblich voneinander abweichen. Es können auch andere Aufarbeitungsverfahren angewendet werden.

Es wurden 142 mg 26-NorchoIest-5-en-25-on-3/i-ylacetat in einem Gemisch aus 2,2 ml trockenem Skelly B gelöst und zu 50 mg Ν,Ν'-Dibromdimethylhydantoin gegeben. Die Umsetzung wurde gemäß Verfahren A durchgeführt. Der erhaltene Rückstand wurde in 0,5 ml Xylol aufgenommen. Die Lösung wurde zusammen mit 0,3 ml Xylol-Spülflüssigkeit tropfenweise zu 0,15 ml Trimethylphosphit in 0,5 ml Xylol von etwa 130 bis 135° C gegeben. Das Gemisch wurde 90 Minuten bei dieser Temperatur umgesetzt. Anschließend wurde das Lösungsmittel unter vermindertem Druck bei etwa 65° C abgezogen.

Der erhaltene Rückstand wurde in Chloroform gelöst und auf eine chromatographische Säule mit 20 g neutralem Aluminiumoxid der Aktivuätsstufe I gegeben. Die Säule wurde mit Chloroform eluierl. Es .wurden Fraktionen von 5,5 ml gesammelt. Das 26 - Norcholest - 5,7 - dien - 25 - on - 3// - ylacetat wurde das den Fraktionen 10 bis 14 durch Eindampfen des Lösungsmittels gewonnen. Die Dienverbindung im Produkt wurde durch folgende spektroskopischc Werte identifiziert:

Ultraviolettspektruni:

/„„«272. 282, 294ma.,_2S2 = 11000.
Infrarotspektrum: ₍„

'■ma* 1730. 1712 cm"¹, entsprechend der
Carbonylabsorplion der Acetat- bzw.
Mclhylketongruppcn.

C. Herstellung von 25-Hydroxycholecalciferol
aus Cholest-5,7-dien-3/i,25-diol

Es wurden 106 mg des gemäß Verfahren B hergestellten Gemisches mit einem Gehalt von 70 mg Cholest-5,7-dien-3/f.25-diol in 400 ml Äther gelöst und unter einer Hochdruck-Quecksilberdampflampe (Hanau. Modell 654A) 3,5 Minuten bestrahlt. Die Bestrahlung wurde in einem Mantel um einen doppclwandigen. wassergekühlten Quarzfinger durchgeführt. Während der Bestrahlung wurde die Ätherlösung heftig gerührt und kontinuierlich mit Stickstoff ausgespült.

Die Bestrahlungsprodukte wurden in einer Vielfachsäule gemäß G. A. Fischer und J. J. Kabara in Anal. Biochem., Bd. 9 (1966). S. 303, mit 14 g wärmeaktivierter Kieselsäure (Bio-Rad. HA. Siebmaschengröße unter 0.044 mm der California Corp. for Biochemical Research, Los Angeles. California. USA) unter Verwendung von Äther-Skelly B im Verhältnis 1 : 1 chromatographiert. Die Säule wurde mit einem Lösungsmittelgradienten eluiert. der dadurch hergestellt wurde, daß Äther in eine 250-ml-Mischkammcr einlaufen gelassen wurde, die ursprünglich mit der Lösung aus Äther und Skelly B im Verhältnis 1 : I gefüllt war. Es wurden Fraktionen von 2.8 ml gesammelt.

Durch Ullravioleltspektrometrie und Gaschromatographie wurde gefunden, daß nur die Fraktionen 33 bis 3S 25-Hydroxyprecholecaleiferol (.^:„_lil( 1u\ my.. ,·,,,, = 90001 enthielten. Diese Fraktionen wurden vereinigt und etwa 7 Tage hei Raumtemperatur unter einer Stickstoffatmosphäre stehengelassen. Danach

hatte sich die Verbindung in 25-Hydroxycholecalciferol mit folgenden Eigenschaften umgewandelt:

Ultraviolettspektrum:
/.„,« 265 mo, f = 18000.

Kernresonanzspektrum:

C₂₁ — H₃ Λ 0,90 ppm (Duplett, J = 8 Hz). C₁₈ — H₃ 6 0,54 ppm,
^C26.27 — H₃ ή 1,22 ppm,
C₁₉ — H₂ ό 4,80 ppm und 5,00 ppm. Q.7 — H 6 5,97 ppm (Duplett, J = 12 Hz). 6,25 ppm (Duplett. J = 12 Hz).

Molekulargewicht:
400,3340 (berechnet C₂₇H₄₄O₂ 400.3341).

Die höheren Fraktionen als Fraktion 38 enthielten 25-Hydroxytachysterol₃, 25-Hydroxycholesterin und eine kleine Menge nicht umgesetztes 5.7-Dien. Die Fraktionen, die 25-Hydroxytachystcrol₃ und unverändertes 5,7-Dien enthielten, wurden mit gleichartiaen Fraktionen vereinigt, die aus einem zweiten Bestrahlungsansatz stammten und erneut 3.5 Minuten bestrahlt. Es wurde chromatographisch über aktivierte Kieselsäure eine zusätzliche Ausbeute von 8 me 25-Hydroxycholecalciferol erhalten.

Die Bestrahlung von 15 mg des 5,7-Diens. das gemäß A hergestellt worden war, über 2.5 Minuten gemäß der vorherigen Verfahrensweise ergab 2.4 mn 25-Hydroxyprecholecalciferol, das in der genannten Weise in 25-Hydroxycholecalciferol überecführt wurde.

Beispiel 4

A. Heilversuch gegen Rachitis

Entwöhnte Jungratten wurden mit einer rachitogenen Diät gemäß Steeboch und Black I Biol Chem., Bd. 64 (1925), S. 263, 21 Tage gefüttert. Die Diät wurde durch Zugabe von wasserlöslichen Vitaminen gemäß DeLuca u.a. in J. Nmr.. Bd. 75 (1961), S. 175, modifiziert. Nach der Mangeldiät über 21 Tage wurde eine Einzeldosis von 4 I.E. Standard-Vitamin D₃ oder D₂ oder 25-Hydroxyergocalciferol oder 25-Hydroxycholecalciferol verabreicht. 7 Tage später wurden die Ratten getötet und an den herauspräparierten Ellen und Speichen der Reihenversuch durchgeführt. Die biologische Wirkung wurde gemäß der US-Pharmakopoe, K.Auflage 1955, durchgeführt.

Während Vitamin D₃ und Vitamin D₂ nur Werte von 40 I.E. je μg ergaben, zeigte Hydroxyergocalciferol einen Wert von etwa 60 I.E. je _txg und 25-Hydroxycholecalciferol einen Wert von 56 bis 60 I.E. je μg (Syntheseprodukt 55 bis 60 I.E. je |_Ag).

B. Calciumtransportversuch Entwöhnte männliche Jungratten wurden in hängenden Drahtkäfigen gehalten und nach Belieben mit einer gereinigten Vitamin D-armen Mangelkost gemäß DeLuca a. a. O. gefüttert. Die Diät erzeugte keine Rachitis bei Ratten, rief aber in 3 bis 4 Wochen schwere Vitamin D-Mangelerscheinungen hervor, die durch einen niedrigen Ca⁺⁺- Gehalt im Serum uuu Jurch vermindertes Wachstum gekennzeichnet sind (H. Steenbock und D. C Herting, J. Nutr., Bd. 57 [1955], S. 449).

Nach 6 Wochen Mangeldiät wurde den Ratten eine Dosis von 0,25 μg Vitamin D₃, D₂, 25-Hydroxyergocaleiferol und 25-Hydroxycholecalciferol in Baumwollsamenöl oral oder in 0,02 ml Äthanol intravenös verabreicht. Die Vergleichstiere erhielten lediglich Äthanol bzw. Baumwollsaroenöl. Nach der in der folgenden Tabelle I aufgeführten Zeit wurden die Ratten getötet und gemäß J. E. ZuIl u. jl, Science Bd. 149 (1965), S. 182, der Calciumtransport an umgestülpten Eingeweidesäcken geprüft. Der Calciumtransport wird als Verhältnis ⁴⁵Ca (serumsiitigV^Ca (schleimhautseitig) ausgedrückt.

Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle 1 angegeben.

Tabelle I

	Probe	Vergleich	Stunden	Tier	Transport
		Baumwollöl	nach	zah	verhältnis
		Äthanol	Verab
	Vitamin D₃	reichung
20	Baumwollöl
			6	0,66 ± 0,02
	Äthanol		4	1,59 ± 0,17

25	Vitamin D₂		5	0,74 ± 0,03
	Äthanol	12	4	1,16 ± 0,06
		24	4	1,01 ± 0,12
30		4	4	1,32 ± 0,10
		6
			5	1,40 ± 0,39
		3	5	1,54 ± 0,36
3S	25-OH-Ergocalciferol	4	4	1,88 ± 0,30
	Äthanol	6	5	2,06 ±0,12
		8	5	3,35 ± 0,70
		12
40
			5	1,94 ± 0,41
	25-OH-Cholecalciferol	3	5	2,09 ± 0,65
	Baumwollöl	4	5	2,74 ± 0,49
45		6	5	3,51 ± 0,23
	Äthanol...	8	5	3,58 ± 0,59
		12
		6	0,89 ± 0,04
50	12	4	1,24 ± 0,07
	24	5	2,31 ± 0,50
	4	4	2,33 ± 0,31
	6

Aus den Werten ergibt sich, daß synthetisches ode natürliches 25-Hydroxycholecalciferol den Calcium transport in den Eingeweiden schneller als Vitamin D einsetzen läßt und daß 25-Hydroxyergocalciferol it dieser Hinsicht dem Vitamin D₂ überlegen ist.

Mit 25-Hydroxycholccalciferol wurde ein weitere Versuch durchgeführt, wobei

a) das Inkubationsmedium aus 125 mMol Natrium chlorid, 30 mMol Tris-Cl. 0.25 mMol CaCl₂ 2H₂O und 10 mMol Fruktose bestand, das mi HCl auf den pH-Wert 7.4 eingestellt und mi einer Ca⁴⁵-Lösung auf etwa 10⁵ Impulse/Min./m Medium gebracht worden war,

b) 1,5 Stunden Sauerstoff durch das Medium bei 37° C perlen gelassen wurde und

c) die Ratten intravenös mit 0,25 μg Vitamin D₃ oder 25-HydroxychoIecalciferol in 0.02 ml Äthanol behandelt wurden.

Die Vergleichstiere erhielten nur Äthanol. Die Ergebnisse sind in Tabelle II angegeben.

Tabelle II

	Stunden	Tier-	Tran->port-
	nach	zah!	\erhallnis
Prcbc	Verab
	reichung	12	1.25 ± 0.05
Vergleich		4	1.74 ± 0.12
25-OH-ChoIecalriferol	3		(p < 0.01 über
			Vergleich)
		4	1.66 ±0.13
	4	4	2.6 ± 0.4
	6	4	2.3 - 0.6
	10	4	1.0! ■ 0.12
Vitamin D₃	4	4	1.32 ± 0.10
	6	3	2.0 f 0.3
	10

	Stunden	Tier	Serumjzehall	π mg-"«
	nach	zahl	Ca ι
Probe	Verab			± 0.1
	reichung	2	3.8	± 0.1
Vitamin D₃ . . .	4	3	3.9	± 0.4
	8	3	5,0	± 0.4
	12	4	6,6
	16			± 0.3
25-OH-ChoIecalciferol		3	4.4	± 0.2
aus Schweinen .. .	4	4	5.7	i 0.4
	8	4	7.1	± 0.4
	12	3	7.2	± 0.5
	16	7	6.4	± 0.21
synthetisch	8	6	7.36
	12

Aus der labeile III ergibt sich, daß 25-Hydro\yergo- bzw. -cholecalciferol die Knochenmobilisierung und damit den Calciumgehalt im Blut schneller in Gang setzen als Vitamin D₂ bzw. Vitamin D₃. Hieraus ergibt sich, daß die neuen Verbindungen an Stelle von Vitamin D₂ bzw. D₃ als Nahrungsmittelzusatz überlegen sind.

C. Serum-Calciumspiegcl

(Knochenmobilisierung I

Entwöhnten männlichen Jungratten wurde 11 bis 15 Tage bzw. 3 bis 4 Wochen eine Vitamin-D-Mangeldiät gemäß De L u ca a.a.O. verabreicht, wobei ^ jedoch Calcium fortgelassen -".!rde. Hie R:·.¹.!.·:¹. "'irden dann intravenös mit 2.5 ^g Vitamin D,. Vitamin D₃, 25-1 Iydroxyergocalcifcrol und 25-H\droxycholecalciferol in 0.02 ml Äthanol behandelt. Vergleichsliere wurden nur mit Äthanol behandelt. Das Serum wurde nach den in Tabelle III angegebenen Zeiträumen gesammelt und gemäß Webster. Am. J. Clin. Pathol... Bd. 131 (1969). S. 330. auf Calcium geprüft. Die Versuche wurden doppelt ausgeführt.

Die Ergebnisse sind in Tabelle III aufgeführt.

laoelle III	Probe	Stunden	8	licr-	Scrim	ilcIi.iI
		nach	12	AlIlI	( .ι in	Uli!-" ι
	Vergleich	Verab	16
	reichung	24	6	3.7	: 0.2
0	4	4	4.0	- 0.4
0	8	4	\7	: 0.5
Vitamin D₂ 4	12	4	3.7	r 11.3
	16	4	3.6	- 0.3
	24	3	4.2	- 0.1
		6	S.7	- 0.3
		4	4.3	- 0.3
25-OH-Ergocalciferol	5	4.(>	j 0.3
	5	4.,S	ι 0.3
	4	5.1	- 0.2
	6	6.0	. 0.4

D. Zusatz von 25-Hydroxycholecalciferol
zu Hühnerfutter

Es wurden Fütterungsversuche an Hiihi·^>ri^ gemäß »Vitamin D in Pultry Feed Supplement 1 n«t Action. Methods of Analysis-..X-O-A-C >. ^Ίν 1Ί 965). 10. Ausgabe, durchgeführt. Das aus Schweinen isolierte 25-Hydroxycholecalciferol wurde in einer Menge \on 125 jig in 25 g Maisöl dispergiert und zur Fütterung \erwendet. Nach dem Füttern wurden die Knochen der einzelnen Hühner gruppenweise geordnet und der Prozentsatz Asche in den von Feuchtigkeit und Fett freien Knochen als Einzelreakiion auf jede Dosierung bestimmt. Die Wirksamkeit des Präparats wurde aus der Aufzeichnung von Standardpräparaten abgeschätzt. Die erhaltenen Ergebnisse sind in der folgenden 7;ä>elle IV aufgeführt.

Tabelle IV

liner- I
nan. Mule
Hühneieinhcilen " I

■■•j 111(1 11
I ullci

Kürpcrjjewicht

anfangs

am 1-iule

Knocheii-

a>chc. "ι. !.Schienbein I

Verglciclisgruppe: nur Maisöl

0 35 j 116 ! 28.3

Vergleichsgruppc: Vitamin D
als Verglcichsstandard zugesetzt

('S

400	0.113	35	142	32.4
400	0.158	35	M5	33.4
400	0.225	35	151	35.3
400	0.319	35	166	38.7
400	0.450	35	152	4I.S

imu ii.iiiKiialc I liiliiiciciiiliciieii = (1.0-5 m < hiiliviihil'iTnl

19

I 933 375

Fortseizuns

Internationale Hühnereinheiten*!

;ig KX) g

Futter

Körpergewicht

anfangs

am Ende

Knochenasche. °'u (Schienbein)

Versuchsgruppe: 25-Hydroxycholecalciferol in Maisöl

0.158	35	140	32.2
0.225	35	151	36.3
0.319	35	162	41,2

*l Internationale Hühnereinheiten = 0.025 ;ig Cholecalciferol

Aus den vorstehenden Werten wurde geschätzt, daß jedes Gramm des mit öl verdünnten 25-Hydroxycholecalciferols wenigstens 206 Internationalen Hübnereinheiten Vitamin D₃ entsprach. Es ist somit wirksamer als Vitamin D₃in Hühnerfutterzusätzen und kann allgemein als Ersatz Tür Vitamin D verwendet werden

Hierzu 1 Blatt Zeichnungen

Claims

(IV) (V) Patentansprüche:

1. 25-Hydroxyergocalciferol.

2.25-Hydroxycholecalciferol.

3. Cholest-SJ-dien-S/^S-diol.

4. Verfahren zur Herstellung von 25-Hydroxyergocalciferol bzw. 25-Hydroxycholecalciferol nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man Säugetiere mit an Ergocalciferol bzw. Cholecalciferol angereichertem Futter über einen längeren Zeitraum füttert, deren Blut sammelt, das Blutplasma isoliert, die Serumproteine des Blutplasmas abtrennt, die Serumproteine mit einem Methanol-Chloroformgemisch extrahiert, den gegebenenfalls in Chloroform angereicherten Extrakt wäscht und einengt, den Rückstand mit einem niedrigsiedenden Kohlenwasserstoff oder Kohlenwasserstoffgemisch aufnimmt und chromatographisch über Kieselsäure die entsprechende ?n 25-Hydroxyverbindung von Ergocalciferol bzw. Cholecalciferol abtrennt.

5. Verfahren zur Herstellung von 25-Hydroxycholecalciferol nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Verbindung der allgemeinen Formel