DE1944048B2

DE1944048B2 - Verfahren zur Herstellung eines wasserlöslichen Enzymsystems

Info

Publication number: DE1944048B2
Application number: DE1944048A
Authority: DE
Inventors: Huibert Cornelis Theues Oss Moelker (Niederlande)
Original assignee: Organon NV
Current assignee: Organon NV
Priority date: 1968-08-31
Filing date: 1969-08-29
Publication date: 1973-10-31
Also published as: ES370744A1; DE1944048A1; DE1944048C3; NL6812443A; JPS5029036B1; CH554903A; BR6911904D0; US3654083A; SE369911B; GB1280497A; DK124482B; FR2022145A1; BE738168A

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines wasserlöslichen Enzymsystems, wobei das Enzym mit Verbindungen, welche mehrere reaktionsfähige Gruppen enthalten, unter Ausbildung kovalenter Bindungen zur Reaktion gebracht wird.

Es ist bekannt, Enzyme durch kovalente Bindungen mit unlöslichen Polymeren zu verkoppeln, um unlösliehe Enzymsysteme zu erhalten. In einem Bericht in Ann. Rev. Biochemistry 35 (Π), S. 873 ff. (1966), beschreiben I. Si Im a η und E. K a t c h a 1 s k i die Herstellung solcher Enzymsysteme. Manchmal werden wasserlösliche Polymere als Träger verwendet. die mit Hilfe von bifunktionellen Reagenzien vernetzt werden, so daß letzten Endes wieder unlösliche Enzymsysteme erhalten werden. Ein bekanntes Beispiel ist die Kopplung von Trypsin mit dem Copolymeren aus Äthylen und Maleinsäureanhydrid und die Vernetzung des Kopplungsproduktes mit Hexamethylendiamin, wie sie von E. Katchalski in Biochemistry 3, S. 1905 ff. (1964), beschrieben worden ist.

Die auf diese Weise modifizierten Enzyme sind von Bedeutung, weil man natürlich ein und dasselbe Enzympräparat für mehrere enzymatische Um-Setzungen verwenden will. Die zu unlöslichen Systemen modifizierten Enzyme sind stabiler als die unmodifizierten Enzyme. Diese Modifizierung ist besonders wichtig, wenn verhältnismäßig teure Enzyme verwendet werden.

In vielen Fällen ist es jedoch wünschenswert, lösliche Enzymsysteme zu verwenden. Textilien werden z.B. von einer unlöslichen Λ-Amylase überhaupt nicht entschlichtet, da auf einem festen Trager, wie z. B. Baumwolle, das Substrat, wie z. B. Stärke, mit dem unlöslichen Enzym nicht nur in einem geringen Grad reagieren kann. Darüber hinaus besitzen Enzyme, die an einen festen Träger gebunden sind, nur eine sehr geringe Umsetzungsgeschwindigkeit, verglichen mit Enzymen in Lösung. Außerdem besitzt unlösliche Protease nur eine geringe Wirkung zur Entfernung von Proteinflecken aus Textilfasern. Darüber hinaus wird die lösliche stabile Form für therapeutische und kosmetische Zwecke oft der unlöslichen Form vorgezogen werden.

Es ist ferner bekannt, lösliche Eiizymsysteme durch Vernetzung zu erhalten.

In Biopolymers 5, S. 577 bis 582 (1967), beschreiben R. P. P a t e 1 et al. die Herstellung wasserlöslicher Systeme von Chymotrypsin mit Polyacrylsäure, Polyglutaminsäure und Carboxymethylcellulose (CMC). Die Verknüpfung mit den beiden zuerst genannten Polymeren wird mit Hilfe von Woodwards Reagenz K durchgeführt, die CMC wird in Form ihres Azides angewendet. Nur in wenigen Fällen konnte die durch die Kopplung erhaltene Aktivitätsausbeute als zufriedenstellend bezeichnet werden.
Der Vernetzungsgrad war sehr gering. Über die Stabilität der abgetrennten Systeme sind keine Daten vorhanden.

Aus der britischen Patentschrift 1 120 298, USA.-Patentschrift 3 296 094 und den französischen Patent-Schriften 1 291 521, 1 327 001 ist es bekannt, Enzyme durch Zusatz von freien Proteinhydrolysaten, Aminosäuren und Polypeptiden zu stabilisieren. Nach diesen bekannten Verfahren tritt jedoch nur eine mäßige Stabilisierung auf. Außerdem ist die Aktivitätsausbeute nach diesen Verfahren verhältnismäßig

20 gering.

Es war daher Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zur Herstellung von wasserlöslichen Enzymsystemen zu entwickeln, die eine gute Stabilität und hohe Aktivität besitzen.

Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß gelöst durch ein Verfahren zur Herstellung eines wasserlöslichen Enzymsystems, wobei das Enzym mit Verbindungen, welche mehrere reaktionsfähige Gruppen enthalten, unter Ausbildung kovalenter Bindungen zur Reaktion

gebracht wird, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man eine Redoxase oder eine Hydrolase als Enzym zusammen mit einem Proteinhydrolysa* einsetzt.

Diese erfindungsgemäß hergestellten Enzymsysteme

zeigen eine gute Stabilität gegen thermische Denatu-

rierung. Ferner sind sie in einem pH-Bereich stabil, der weiter ist als derjenige der Originalenzyme, und zwar sowohl nach der sauren als auch nach der basischen Seite hin. Darüber hinaus wurde festgestellt, daß diese Enzyme gegen die Wirkung von Detergentien besonders stabil sind. Alle diese Eigenschaften machen die vorliegenden Systeme sehr geeignet zur Verwendung in Waschmitteln und in flüssigen Gemischen zur Reinigung von Oberflächen und für pharmazeutische und kosmetische Präparate, wie Salben und Lotionen.

Mit dem Ausdruck »Proteinhydrolysat« sind eine oder mehrere Aminosäuren oder Peptide oder deren Gemische gemeint. Die letzteren können z. B. durch Hydrolyse von Proteinen erhalten werden. Diese Hydrolyse kann auf jede bekannte Weise durchgeführt werden, z. B. mit einer Säure oder einem Enzym.

Als Proteine eignen sich die folgenden Substanzen

besonders: Casein, Serumalbumin, Lactoglobulin, Ovalbumin, Fibroin, Myosin, Keratin, Kollagen, Gelatine, Sojaproteine und rohe Proteingemische.

Das Proteinhydrolysat hat bei dem Vernetzungsverfahren eine enzymschützende Wirkung, deren Mechanismus noch unbekannt ist. In den in Frage stehenden Enzymsystemen, die einen hohen Gehalt an Peptiden oder Aminosäuren besitzen, üben die zuletzt genannten Substanzen einen günstigen Einfluß auf die Eerhaltung der Enzymstruktur aus, besonders auf die sogenannten tertiären oder quaternären Strukturen, wie z. B. in Angew. Chem. 78, S. 217 (1966), beschrieben. Die Zerstörung dieser Strukturen

6g wird Denaturierung genannt. Sie geschieht leicht, z. B. bei erhöhten Temperaturen und durch die Wirkung von chemischen Substanzen, wie Detergentien, Oxydationsmitteln und starken Säuren und

Basen. Da die Aktivität sehr stark von der Erhaltung dieser Strukturen abhängt, wird angenommen, daß in den in Frage stehenden Systemen die Peptide und Aminosäuren diese Strukturen stark fixieren. In den erfindungsgemäßen Systemen übt die Gegenwart der Proteinhydrolysate keinen nachteiligen Einfluß auf die Enzymaktivität aus.

Die Verbindung, mit der das Enzym und das Proteinhydrolysat vernetzt sind, ist ein wasserlösliches reaktives Polymer, das aus einem reaktiven Monomeren oder einem nicht reaktiven Polymeren gebildet sein kann, das auf übliche Weise aktiviert worden ist. Es ist jedoch ebenfalls möglich, andere bifunktionelle Verbindungen, wie Dialdehyde, ungesättigte Aldehyde und halogenierte Carbonsäureester und Äther, zu verwenden. Die geeignetsten löslichen Vernetzungsmitte] sind: Polyacrylsäure, die z. B. mit N-Äthyl-5-phenyl-isoxazolium-3'-sulfonat(Woodwards Reagenz K) aktiviert worden ist, das Azid der Carboxymethylcellulose, Äthylenmaleinsäureanhydrid. Polyglutamin- *° säure, die mit Woodwards Reagenz K aktiviert worden ist, Dextrane, die mit Isothiocyangruppen substituiert sind, Dimethyladipinsäurederivate, Glutaraldehyd, Carbodiimide und Phenol-2,4-disulfonylchlorid, Bromcyan. Polysaccharide mit Bromcyan aktiviert, Crotonaldehyd, Acrolein und Chlorameisensäureester oder ein Gemisch dieser Agenzien.

Die Vernetzungsreaktion wird in Hinsicht auf die pH-Stabilität der Enzyme bei einem pH-Wert von ungefähr 4 bis 10,5, der von dem Enzym und dem verwendeten Reagenz abhängig ist, durchgeführt, aber es kann auch ein pH-Wert von 5 bis 8 angewendet werden. Die Reaktion setzt schon unmittelbar oberhalb des Gefrierpunktes, z. B. bei 4°C, ein. Sie dauert dann jedoch so lange, daß z. B. 20 bis 48 Stunden für eine ausreichende Vernetzung erforderlich hind. Daher wird die Reaktion vorzugsweise bei einer höheren Temperatur durchgeführt, es darf jedoch noch nicht die Gefahr der thermischen Denaturierung des Enzyms bestehen.

Es hat sich gezeigt, daß das erfindungsgemäße Verfahren zu Produkten mit guter Stabilität führt, wenn ein hydrolytisches Enzym, wie Amylase Amyloglucosidase, Esterase, Lipase, Ribonuclease und Protease, sowie eine Redoxase wie Katalase verwendet werden. Die Proteasen wurden besonders in Waschmitteln getestet. Selbst Detergentien und Oxydationsmittel denatuieren die Enzymsysteme aus einer mikrobiologischen Protease von einem Bazillus und einem Proteinhydrolysat, die auf diese Weise hergestellt wurden, bei einer Temperatur von ungefähr 6O⁰C nicht stark.

Hydrolysate, die durch Wirkung der zu stabilisierenden Protease selbst hergestellt worden sind, besonders auf diese Weise hergestellte Caseinhydrolysate, sind sehr geeignet als Proteinhydrolysat. Die Kombination von Glutaraldehyd als Vernetzungsmittel und Caseinhydrolysat als schützendes Agenz hat sich als außerordentlich nützlich zur Herstellung von Proteasesystemen erwiesen.

Abhängig von der Art des Enzyms, des Vernetzungsmittels und des Proteinhydrolysats werden verschiedene Mischungsverhältnisse verwendet. In Systemen, die aus Protease, Caseinhydrolysat und Glutaraldehyd zusammengesetzt sind, ist das Gewiditsverhältnis zwischen Protease und Glutaraldehyd vorzugsweise zwischen (1 bis 5): (5 bis 1). Der Gewichtsanteil des Hydrolysats ist in der gleichen Größe wie der des Vernetzungsmittels. Das bevorzugte Verhältnis zwischen den Mengen des Enzyms, des Proteinhydrolysats und des Glutaraldehyds ist ungefähr 2:1:1.

Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele näher erläutert.

Beispiel 1

0,5 g einer mikrobiologischen Protease wurden in 75 cm³ 0,05 m Phosphatpuffer vom pH 6,5 gelöst. Zu dieser Lösung wurden 25 cm³ einer Suspension von 1 g Äthylenmaleinsäureanhydrid in Wasser zugegeben. Die Suspension wurde 16 Stunden lang bei 5°C gerührt und dann dialysiert. Dann wurde ein unlöslicher Rückstand durch Zentrifugieren von der Suspension abgetrennt. Anschließend wurde die Suspension lyophilisiert, und man erhielt 1,13 g lösliches Endprodukt. Auf die gleiche Weise wurde ein lösliches Enzymsystem. hergestellt mit dem Unterschied, daß die Vernetzung nach der Zugabe von 1 g Albuminhydrolysat durchgeführt wurde. Die Suspension wurde dialysiert und lyophilisiert, und man erhielt 1,4 g eines löslichen Enzymsystems.

Die Tabelle zeigt die Aktivitätsausbeute und die Stabilität der zwei Enzymsysteme und einen Vergleich mit den Stabilitätseigenschaften des Originalenzyms.

	Vor der	Nach der Vernetzung	Mit
	Ver	Ohne	Albumin-
	netzung	Albumin-	hydroly-
		hydroly-	sat
	0,46	sat	0,20
Aktivität (E/mg)	(100 β/,)	0,07	98°/„
Aktivitätsausbeute ....		35°/„
Restliche Aktivität nach
60 Minuten langem
Erhitzen auf 6O⁰C in
0,1 m TR IS-Puffer	28°/„		65°/„
vom pH-Wert 9,0...		4O°/o
Restliche Aktivität nach
60 Minuten langem
Erhitzen auf 60"C in
0,4°/₀ einer Lösung
von einer Wasch
mittelzusammen	<10°/e		62 »/ο
setzung bei pH 8,7*)		42°/₀
Restliche Aktivität nach
15 Minuten langem
Erhitzen auf 6O⁰C in
0,4°/₀ einer perborat-
haltigen Waschmittel
zusammensetzung bei	<lO°/o		76%
pH 8,7**)	38 »/ο

*) Zusammensetzung des Waschmittels:

30% Natriumtripolyphosphat, 30% Natriumsulfat, 25 % Natriumcarbonat, 5% Natriumdodecylbenzolsulfonat, 5 % Polyglykolether, 5 % Carboxymethylcellulose, optische Aufheller usw.

*) Zusammensetzung des perborathaltigen Waschmittels: 28 % Natriumtripolyphosphat, 17% Natriumsulfat, 6% anionische Detergentien, 4 % nichtionische Detergentien, 22% Natriumperborat, 16% eines schmutzsuspendierenden Mittels (CMC u. dgl.), 7% Feuchtigkeit.

Die proteolytische Aktivität wurde spektrophotometrisch bestimmt durch Messung der Extinktion bei 280 nm, die von den Peptiden herrührt, die nach

Hydrolyse des Caseins in Trichloressigsäure löslich sind, entsprechend der Beschreibung von M. K u η i t ζ in J. Gen. Physiol. 30, S. 291 (1947). Inkubationszeit: 30 Minuten bei 35° C und pH 8,0.

Es wird ein lösliches Enzymsystem mit einer wesentlich besseren Stabilität erhalten, verglichen mit einem System, das ohne Albuminhydrolysat hergestellt worderi ist, und das Produkt wird in einer viel höheren Ausbeute erhalten. Wir heben die höhere Stabilität der erfindungsgemäßen Systeme gegenüber den perborathaltigen Detergentien hervor.

Beispiel 2

100 mg gereinigtes Chymotrypsin vom Rind wurden in 10 cm³ 0,2 m Natriumacetatpuher (pH 4,5) gelöst. Zu dieser Lösung wurden 2 cm³ einer 8%igen Lösung von Caseinhydrolysat zugegeben. Das Caseinhydrolysat wurde durch 20 Stunden lange Hydrolyse einer 4°/₀igen Caseinlösung mit einer bakteriellen Protease bei 35° C und einem pH-Wert von 9,0 hergestellt. Nach der Hydrolyse wurde das erhaltene Produkt 5 Minuten auf 100° erhitzt, um die proteolytische Aktivität zu zerstören, und anschließend gefriergetrocknet.

Zu der erhaltenen Lösung wurden 200 mg Glutaraldehyd in Form einer 25°/„igen Lösung unier Rühren bei Raumtemperatur zugegeben. Nach 30 Minuten wurde das Reaktionsgemisch auf 4³C abgekühlt und bei dieser Temperatur gegen destilliertes Wasser dialysiert und gefriergetrocknet.

Auf gleiche Weise wurde ein Enzymsystem ohne Caseinhydrolysat hergestellt. Die Eigenschaften des Enzymsystems werden in der folgenden Tabelle gezeigt.

Nach einer Reaktionszeit von 20 Stunden wurden die Gemische dialysiert und gefriergetrocknet. Die Ausbeute und Stabilität der erhaltenen Enzymsysteme werden in der folgenden Tabelle gezeigt.

	Aktivitätsausbeute	Vor der	Nach der	Vernetzung
	Restliche Aktivität nach	Ver	Ohne	Mit
	20 Minuten Erhitzen	netzung	Casein	Casein
	₁₅ auf 60° C in 0,1m		hydroly	hydroly
in	TRIS-Puffer, pH 8,0	(100%)	sat	sat
Restliche Aktivität nach		S°/o	21%
20 Minuten Erhitzen
auf 60°Cin0,4%iger
2o Lösung eines Wasch	14°/o
mittels (s. Beispiel 1)		69°/o	87%
bei pH 8,0



9%
3O°/o	30%

	Vor der	Nach der Vernetzung	Mit
	Ver	Ohne	Cas&in-
	netzung	Casein	hydroly-
		hydroly	sat
	(100%)	sat	12%
Aktivitätsausbeute ....		<2%
Restliche Aktivität nach
30 Minuten Erhitzen
auf 50°C in 0,1m
Phosphatpuffer,	25%		74%
pH 7,8		unbe
		stimm
	bar

Beispiel 4

In diesem Beispiel wurde das reaktive Produkt aus einem Gemisch von Bromcyan und Dextran, das auf folgende Weise hergestellt worden war, als polyfunktionelle reaktive Verbindung verwendet:

400 mg Dextran mit einem Molekulargewicht von ungefähr 10 000 wurden in 20 cm³ destilliertem Wasser gelöst. Zu dieser Lösung wurden 80 mg Bromcyan zugegeben. Während der Reaktion wurde der pH-Wert durch ständige Zugabe von 1 η Natriumhydroxid auf 11,0 bis 11,5 gehalten. Nach 10 Minuten langer Reaktion wurde das erhaltene reaktive Dextranderivat zu 200 mg einer bakteriellen Protease, die in 5 cm³ 0,5 m Phosphatpuffer vom pH 8,0 gelöst war, unter Rühren zugegeben.

In zwei Parallelversuchen wurden 1,25 cm³ 8%iges Caseinhydrolysat bzw. 1,0 cm³ 4%ige Glycinlösung vorher zu der Proteaselösung zugegeben. Nach einer Reaktionszeit von 20 Stunden bei Raumtemperatur wurden die Lösungen dialysiert und gefriergetrocknet.

Die erhaltenen Resultate gehen aus der folgenden Tabelle hervor.

Die Aktivität des Chrymotrypsins wurde bei pH 7,8 und 30°C durch kontinuierliche Titration der nach der Hydrolyse von N-Benzoyltyrosinäthylester gebildeten Säure bestimmt.

Beispiel 3

80 mg Bromcyan wurden in 5 cm³ destilliertem Wasser gelöst und zu einer Lösung von 200 mg einer bakteriellen Protease in 0,5 m Phosphatpuffer vom pH 8,0 unter Rühren bei 20⁰C zugegeben.

In einem zweiten Ansatz wurden 1,25 cm³ einer 8%igen Caseinhydrolysatlösung, die wie im Beispiel 2 beschrieben hergestellt worden war, zu dem gleichen Reaktionsgemisch zugegeben.

60

	Vor der	Nach	der Vernetzung	Mit
	Ver	Ohne	Mit	Glycin
	netzung	Zu	Casein
		satz	hydroly
	(100%)		sat	98%
Aktivitätsausbeute..		79%	120%
Restliche Aktivität
nach 20 Minuten
Erhitzen auf 60° C
in 0,1 m TRIS-	14%			24%
Puffer, pH 8,0 ...		26%	25%
desgleichen in 0,4%
Lösung eines
Waschmittels (Bei	9%			15%
spiel 1) bei pH 8,0	16%	16%

B e i s ρ i e 1 5

0,5 g einer mikrobiologischen Protease wurden in 75 cm³ 0,5 m Phosphatpuffer vom pH-Wert 6,5 gelöst.

Zu dieser Lösung wurden 25 cm³ einer Lösung zugegeben, die 0,125 g Glutaraldehyd enthielt.

In einem zweiten Versuch wurden vorher 0,25 g Glutaminsäure zu der Proteaselösung zugegeben.

Beide Lösungen wurden 16 Stunden lang bei 5°C gerührt und anschließend dialysiert. Ein unlöslicher Rückstand wurde durch Zentrifugieren entfernt, und die überstehende Lösung wurde gefriergetrocknet. Man erhielt 0,72 bzw. 0,75 g dialysierte und gefriergetrocknete Enzymsysteme.

Ein Vergleich ist in der nächsten Tabelle angegeben.

8	5	Aktivitätsausbeute ....	Vor der	Mach der	Vernetzung
	Restliche Aktivität nach	Ver	Ohne	Mit
	15 Minuten Erhitzen	netzung	Casein-	Casein-
	₁₀ auf 7O⁰C in 0,1m		hydroly-	hydroly-
	Natriumacetat-Puffer,	(100 °/₀)	sat	sat
pH 4,5		9O°/o	100 ·/„



29°/o
41°/o	47 »A,

Aktivitätsausbeute

Restliche Aktivität nach
60 Minuten Erhitzen
auf 60⁰C in 0,1m
TRIS-Puffer, pH 9,0

desgleichen nach 30 Minuten Erhitzen auf
60° C in 0,4°/₀iger Lösung eines Waschmittels (s. Beispiel 1),
pH 9,0

Vor der

Vernetzung

(100 °

10 "/ο

Nach der Vernetzung

Ohne
Glutamin-

<3°/o

unbestimm
bar

Mit

Glutaminsäure

30°/₀
50°/„

60°/o

Beispiel 6

250 mg eines gereinigten Amyloglucosidasepräparates (24 E/mg) wurden in 20 cm³ 0,1 m TRIS-Puffer bei einem pH-Wert von 8,0 gelöst. Zu dieser Lösung wurden 12,5 cm³ einer 8,0°/₀igen Caseinhydrolysatlösung in 0,1 m TRIS-Puffer bei pH 8,0 zugegeben. Das Caseinhydrolysat wurde durch enzymatische Hydrolyse von Casein bei pH 8,0 mit Hilfe einer mikrobiologischen Protease hergestellt.

Zu der erhaltenen Lösung wurden 0,5 g CMC-Azid, die in 40 cm³ 0,1 m TRIS-Puffer vom pH 8,0 gelöst waren, zugegeben. Das lösliche CMC-Azid wurde entsprechend Nature 189, S. 576 ff., (1962) hergestellt. Die Lösung wurde 16 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Dann wurde das erhaltene Präparat dialysiert und gefriergetrocknet. Man erhielt 1,6 g trockenes Produkt mit einer Aktivität von 3,75 E/mg.

Auf gleiche Weise wurde ein Präparat ohne Caseinhydrolysat hergestellt. An Stelle von diesem Hydrolysat wurden 12,5 cm³ 0,1 m TRIS-Puffer vom pH-Wert 8,0 verwendet. Ausbeute: 0,59 g trockenes Produkt mit einer Aktivität von 9,15 E/mg.

Die Aktivität der Amyloglucosidasepräparate wurde durch spektrophotometrische Bestimmung der Menge der bei der Hydrolyse von löslicher Stärke gebildeten Glucose nach Anfärben mit o-Toluidin (K. Dubowski, J. CUn. Chem. 8, S. 215 ff., [1962]) bei 635 nm gemessen. Inkubationszeit: 15 Minuten bei 4O⁰C und pH 4,5.

In der folgenden Tabelle werden die Aktivitätsausbeute und die Stabilität der erhaltenen Produkte mit denjenigen des Ausgangsmaterials verglichen.

Die verbesserte Stabilität des Amyloglucosidasesystems zeigt sich auch deutlich bei Verwendung dieses Präparates zur Herstellung von Dextrose aus Stärke.

Es erwies sich in der Tat als möglich, den gleichen

Hydrolysegrad (D. E.-Wert) mit einer Dosis des nach diesem Beispiel hergestellten Enzymsystems zu erreichen, die ebenso groß ist wie diejenige eines nicht vernetzten Enzyms, jedoch in kürzerer Zeit als mit dem nicht vernetzten Enzym oder im Falle der gleichen Hydrolysezeit einen höheren Hydrolysegrad zu erreichen, wie im folgenden erklärt wird.

Eine 30°/₀ige Stärkelösung wurde mit ot-Amylase vorhydrolysiert bis zu einem D. E.-Wert von ungefähr 12. Dann wurde die Lösung mit verschiedenen Mengen von Amyloglucosidase und einem gemäß diesem Beispiel hergestellten Amyloglucosidasesystem bei pH 4,0 und 6O⁰C weiterhydrolysiert. Am Ende dei Hydrolyse wurde das Dextroseäquivalent (D. E.-Wert d. h. der Prozentsatz von gebildeter Glucose, bezoger auf die Maximalmenge von Glucose, die theoretiscl· erhalten werden kann) bestimmt, indem der Glucose gehalt gemäß Somogyi — Nelson, J. Biol Chem. 195, S. 19 ff., (1952), bestimmt wurde.

40	Dosierung	D.	E.-Wert
		Amyloglu
		cosidase
	Stärke, Hydro-
45 2,5 E/gm	48 Stunden
lysezeit	Stärke, Hydro-	88,0
2,5 E/gm	60 Stunden
lysezeit	Stärke, Hydro-	93,8
2,5 E/gm	48 Stunden
50 lysezeit	Stärke, Hydro-	94,2
2,5 E/gm	60 Stunden
lysezeit	96,2
	Amyloglu
cosidase
system

92,1

96,0

96,4

96,6

Beispiel 7

Eine Lösung von 200 mg bakterieller Protease
20 cm⁸ 1 m TRIS-Puffer vom pH 8,0 wurde mit ui ohne 240 mg Caseinhydrolysat hergestellt.

Es wurde auch eine Lösung von 200 mg bakteriell Protease, die mit 1000 mg Glutaraldehyd vernetzt Wi

mit und ohne 240 mg Caseinhydrolysat in 20 ei

1 m TRIS-Puffer bei einem pH-Wert von 8 hergestel

Die verbesserte Ausbeute und Stabilität, die dui die erfindungsgemäße Methode erreicht wird, gf deutlich aus der folgenden Tabelle hervor.

309544A

Vor der Vernetzung

Ohne Caseinhydrolysat

Mit Caseinhydrolysat

Nach der Vernetzung

Ohne Caseinhydrolysat

Mit Caseinhydrolysat

Aktivitätsausbeute

Restliche Aktivität nach Stehenlassen bei Raumtemperatur

3 Tage

12 Tage

18 Tage

(100%)

28%
17%
13%

121%

52% 38% 28%

62%

37% 33% 25%

115%

79% 74% 64%

Beispiel 8

Auf gleiche Weise wie im Beispiel 6 beschrieben wurde 1 g eines handelsüblichen rohen Gemisches von Glucoseoxidase und Katalase mit und ohne Albuminhydrolysat mit Carboxymethylcellulose gekoppelt.

In der unten angegebenen Tabelle werden die Aktivitätsausbeute und die Stabilitätseigenschaften der erhaltenen Enzymsysteme verglichen. Die Glucoseoxidaseaktivität wird durch titrimetnsche Bestimmung der Gluconsäuremenge gemessen, die nach einer 15minutigen Inkubation einer Glucoselösung mit Glucoseoxidase bei pH 5,1 und 35° C zurückblieb, wie von L. Underkofler in Proc. Int. Sypm. Enzyme Chemistry, Tokyo und Kyoto, S. 436 (1957), beschrieben.

Die Katalaseaktivität wurde durch Zersetzung von Wasserstoffperoxid spektrophotometrisch bei 240 nm bei einem pH von 7,0 und 25°C, wie von Beers und Sizer in J. Biol. Chem. 195, S. 133 (1952),

	beschrieben, bestimmt.	der	. . .	Vor der	Nach der ^	/ernetzung
15	Aktivitätsausbeute	. . .	der	Ver	Ohne	Mit
	Glucoseoxidase .	der		netzung	Alnumin-	Albumin-
	Restliche Aktivität	Glucoseoxidase nach	der		hydrolysat	bydrolysat
	10 Minuten Erhitzen	Mi-
20	auf 8O⁰C, pH 4,5	auf
	Aktivitätsausbeute		(100%)	54%	72%
	Katalase
	Restliche Aktivität
	Katalase nach 10
25	nuten Erhitzen	22%	51%	55%
	8O⁰C, pH 4,5
	(100 %)	62%	80%
		**\J£ J Q***

3D
	59%	85%	91%

Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Herstellung eines wasserlöslichen Enzym-Systems, wobei das Enzym niii Verbindungen, welche mehrere reaktionsfähige Gruppen enthalten, unter Ausbildung kovalenter Bindungen zur Reaktion gebracht wird, d adurch gekennzeichnet, daß man eine Redoxase oder eine Hydrolase als Enzym zusammen mit einem Proteinhydrolysat einsetzt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als eine Hydrolase eine Protease und als Proteinhydrolysat ein solches einsetzt, welches durch diese Protease hergestellt worden ist.