DE2146275B2 - PROCESS FOR THE PRODUCTION OF INSULIN AND PANCREATIN - Google Patents
PROCESS FOR THE PRODUCTION OF INSULIN AND PANCREATINInfo
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Description
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren Jur Gewinnung von Insulin und Pankreatin, wobei ein fcisulinhaltiges Pankrealin als Ausgangsmaterial dient, •us dem durch ein geeignetes Verfahren das Insulin txtrahiert wird und der Pankreatinrückstand mit voll erhaltenen spczilischcn Enzymaktivitäien (Lipase, Amylase, Trypsin, Chymotrypsin) anfällt.The present invention relates to a method Jur recovery of insulin and pancreatin, wherein a Fcisulin-containing pancreatic is used as the starting material, • from which the insulin is produced by a suitable process t is extracted and the pancreatin residue with full obtained specific enzyme activities (lipase, amylase, trypsin, chymotrypsin).
Nach den bisher bekannten Verfahren kann man •us der Pankreasdrüse entweder nur Insulin oder nur Pankreatin gewinnen. Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren ist nun erstmalig möglich, reines Insulin lind hochaktives Pankrealin nebeneinander zu gewinnen, so daß die Pankreasdrüse doppelt genutzt »ird.According to the methods known up to now, the pancreatic gland can either only be used with insulin or only Gain pancreatin. According to the method according to the invention, pure insulin is now possible for the first time lind to gain highly active pancreas side by side, so that the pancreatic gland is used twice »Ird.
Die ständige Zunahme der Zuckerkrankheit und die Tatsache, daß es bis heute noch keinen vollwertigen insulinersatz gibt, erhöhen den Insulinbedarf laufend. Da auch die Verdauungskrankheiten in der heutigen Zeit stark zunehmen, wächst auch der Pankreatinbedarf zur Substitutionstherapie weiter an. Die Folge ist eine schon jetzt spürbare Verknappung von Pankreasdrüsen. Das eriindungsgemäße Verfahren vermag diesen Mangel durch die doppelte Nutzung der Drüsen zu beseitigen und ist deshalb von besonderer Bedeutung.The constant increase in diabetes and the fact that to this day there is still no full-fledged one insulin substitutes increase the need for insulin continuously. As also the digestive diseases in today As time increases, the need for pancreatin for substitution therapy continues to grow. The consequence is already a noticeable shortage of pancreatic glands. The method according to the invention is able to remedy this deficiency by the double use of the glands and is therefore of particular importance Meaning.
Die heutigen Verfahren zur Herstellung von Insulin verwenden durchwegs saures Äthanol zur Extraktion des Insulins aus Pankreasdrüse. Dadurch werden jedoch die Enzyme der Pankreasdrüse irreversibel inaktiviert. Speziell von der Lipsse können im Extraktionsrückstand nur noch Restaktivitäten nachgewiesen werden. Es fehlt nicht an Versuchen, die verbleibenden Enzymaktivitäten im Extraktionsrückstand für andere Verwendungszwecke zu isolieren. Zur Pankreatingewinnung ist dieser Rückstand keinesfalls geeignet (vgl. zum Beispiel K. J a η h ο 1 m und P. Ho 1 m, Novo Therapeutisk Lab., dänische Patentschrift 1 02821; S. Hoek, N. V. Phillips'Gbeilarnpenfabrieker, niederländische Patentschrift 1 12 875; R. K ο j e r, Tarchominskie Zaklady Farmaceutyczne »Polfa«, polnische Patentschrift 50 085; Wellcome Foundation Ltd., niederländische Patentanmeldung 66 02 259 vom 23. August 1966). Durch die vorliegende Erfindung ist es nun möglich, Insulin aus Pankreatin zu gewinnen und bei einem Pankreatinverlubt von nur etwa 10% die spezitischen Enzymaklivitäten praktisch in ihrer vollen Höhe zu erhalten. Das Pankreatin wird dabei aus den Pankreasdrüsen durch Gefriertrocknung und anschließender Entfettung mit einem Fettlösungsmittel gewonnen, wobei das Insulin vollständig erhalten bleibt.Today's methods of making insulin consistently use acidic ethanol to extract the insulin from the pancreatic gland. However, this irreversibly inactivates the pancreatic gland enzymes. Especially from the Lipsse, only residual activities can be detected in the extraction residue. There has been no lack of attempts to isolate the remaining enzyme activities in the extraction residue for other uses. This residue is in no way suitable for obtaining pancreatin (cf., for example, K. J a η h ο 1 m and P. Ho 1 m, Novo Therapeutisk Lab., Danish patent specification 1 02821; S. Hoek, NV Phillips'Gbeilarnpenfabrieker, Dutch patent specification 1 12 875; R. K ο jer, Tarchominskie Zaklady Farmaceutyczne "Polfa", Polish patent specification 50 085; Wellcome Foundation Ltd., Dutch patent application 66 02 259 of 23 August 1966). The present invention now makes it possible to obtain insulin from pancreatin and, with a pancreatin loss of only about 10%, to maintain the specific enzyme activities practically to their full extent. The pancreatin is obtained from the pancreatic glands by freeze-drying and subsequent degreasing with a fat solvent, the insulin being completely retained.
Das erfindungsgemäße Verfahren zur Gewinnung von Insulin und Pankreatin mit voll erhaltenen spezifischen Enzymaktivitäten (Lipase, Amylase, Trypsin, Chymotrypsin) ist dadurch gekennzeichnet, daß man aus Pankreasdrüsen durch Gefriertrocknung und anschließende Entfettung mit einem Fettlösungsmittel gewonnenes, insulinhaltiges Pankreatin mit einem Gemisch aus Wasser und einem mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittel extrahiert, wobei das Gemisch ein einwertiges Salz in einer Konzentration von 1 bis 5% enthält, aus dem extrahierten Rückstand insulinfreies Pankreatin durch Vakuumtrocknung zurückgewinnt und aus dem Extrakt das Insulin durch Entfernung des organischen Lösungsmittels ausfällt und in an sich bekannter Weise reinigt.The inventive method for obtaining insulin and pancreatin with fully obtained specific Enzyme activities (lipase, amylase, trypsin, chymotrypsin) is characterized in that one from pancreatic glands by freeze-drying and subsequent degreasing with a fat solvent obtained, insulin-containing pancreatin with a mixture of water and a water-miscible one organic solvent extracted, the mixture being a monovalent salt in a concentration of 1 to 5%, insulin-free pancreatin is recovered from the extracted residue by vacuum drying and the insulin is precipitated from the extract by removing the organic solvent and cleans in a manner known per se.
Das eriindungsgemäße Verfahren arbeitet ohne Säurezusatz nur mit wäßrig-organischen Lösungsmitteln, bevorzugt wäßrigem Äthanol. Der starke Einsalzeffekt von einwertigen Salzen wird genutzt, wobei vorzugsweise als anorganisches Salz Natriumchlorid verwendet wird. Das pH der Extraktionslösung sollte dem Stabilitätsoplimum der Enzyme angepaßt bei etwa 6 liegen. Andere organische Lösungsmittel (z. B. Aceton, Methanol) sind statt dem bevorzugten Äthanol ebenfalls verwendbar. Mit Äthanol werden jedoch die günstigsten Ergebnisse erhalten. Vorzugsweise enthält das Extraktionsgemisch das organische Lösungsmittel in einer Konzentration von etwa 60 bis 80%. Die Abtrennung des organischen Lösungsmittels kann beispielsweise durch Destillation erfolgen. Hierdurch hinterbleibt ein wäßriger Rückstand, in welchem das einwertige Salz so stark konzentriert ist, daß das Insulin ausgesalzen, also unlöslich wird.The process according to the invention works without the addition of acid only with aqueous-organic solvents, preferably aqueous ethanol. The strong salting effect of monovalent salts is used, whereby sodium chloride is preferably used as the inorganic salt. The pH of the extraction solution should adjusted to the stability optimum of the enzymes at about 6. Other organic solvents (e.g. acetone, methanol) can also be used instead of the preferred ethanol. Be with ethanol however, get the most favorable results. The extraction mixture preferably contains the organic one Solvent in a concentration of about 60 to 80%. The separation of the organic solvent can be done, for example, by distillation. This leaves an aqueous residue in which the monovalent salt is so concentrated that the insulin is salted out, i.e. insoluble.
Die folgenden Beispiele dienen zur weiteren Erläuterung des erfindungsgemäßen Verfahrens:The following examples serve to further illustrate the process according to the invention:
10 kg Pankreatin werden mit 1501 70%igem wäßrigen Äthanol, der 3,5 kg Natriumchlorid enthält, 30 Minuten lang bei 0° gerührt und anschließend über eine Nutsche abgesaugt. Das extrahierte Pankreatin wird sogleich im Vakuum getrocknet. Aus dem blanken Filtrat wird der Alkohol im Vakuum ab-10 kg of pancreatin with 1501 70% aqueous Ethanol containing 3.5 kg of sodium chloride, stirred for 30 minutes at 0 ° and then over sucked off a suction filter. The extracted pancreatin is immediately dried in a vacuum. From the pure filtrate, the alcohol is removed in vacuo.
destilliert und das hierdurch ausgesa'.zene Insulin durch Zentrifugation gewonnen. Zur Entfernung von Fettbestandteilen wird mit etwa 101 Alkohol extrahiert und das im Rückstand verbleibende Insulin nach Auflösen in Wasser bei pH 2,5 durch Zugabe von 12% Natriumchlorid erneut ausgesalzen. Zur weiteren Reinigung wird der Niederschlag mit 4,5%iger Natriumchloridlösung unter Zusatz von 5 g Äthylendiamintetraessigsäure bei pH 6,6 gerührt, wobei das Insulin in Lösung geht. Aus dieser Lösung wird es durch Zugabe von Zinkacetat ausgefällt, der Zink-Insulin-Niederschlag in wenig Salzsäure von pH 2,5 gelöst und über ein Molekularsieb geeigneten Vernetzungsgrades Chromatographien (Elutionsmi'tel zu 1 m-Essigsäure, 1 "„ NaCl). Aus den gewonnenen Fraktionen wird das Insulin durch Zugabe von Natriumchlorid gefällt und anschließend kristallisiert. Die Ausbeute an Kristallinsulin beträgt 3 g mit einer biolocischen Aktivität von 28 I. E./mg (nach DAB 7/ DDR).distilled and the insulin thus sucked out obtained by centrifugation. To remove fat components is extracted with about 101 alcohol and the insulin remaining in the residue after dissolving in water at pH 2.5 by adding 12% Salt out the sodium chloride again. For further purification, the precipitate is washed with 4.5% sodium chloride solution stirred with the addition of 5 g of ethylenediaminetetraacetic acid at pH 6.6, the insulin going into solution. From this solution it becomes precipitated by adding zinc acetate, the zinc-insulin precipitate in a little hydrochloric acid of pH 2.5 dissolved and chromatographed over a molecular sieve with a suitable degree of crosslinking (elution agent to 1 m-acetic acid, 1 "" NaCl). From the obtained In fractions, the insulin is precipitated by adding sodium chloride and then crystallized. The yield of crystalline insulin is 3 g with a biological activity of 28 I.U./mg (according to DAB 7 / GDR).
Die Qualität des zurückgewonnenen Pankreatins ergibt sich aus dem Vergleich der spezifischen Enzymaktivitäten vor und nach der Insulinextraktion.The quality of the recovered pancreatin results from the comparison of the specific enzyme activities before and after insulin extraction.
EnzymeEnzymes
Vor
Extraktionbefore
extraction
Nach ExtraktionAfter extraction
Lipase 44 500 43 000Lipase 44,500 43,000
Amylase 45 000 41 100Amylase 45,000 41 100
Chymotrypsin 11680 9 750Chymotrypsin 11680 9 750
Trypsin 2 980 2 980Trypsin 2,980,2,980
Die Enzymeinheilen werden nach Standardmethoden bestimmt und sind ir. 1. E. pro g Pankreatin angegeben. The enzyme units are determined according to standard methods and are given as 1. E. per g of pancreatin.
100g Pankreatin werden mit 1500 ml 7Ö"oigem wäßrigen Aceton, das 50 g Natriumchlorid enthält, wie im Beispiel 1 angegeben, extrahiert und aufgearbeitet. Die Insulinausbeute entspricht der des Beispiels 1. Folgende spezifische Enzymaktivitäten werden nach der Extraktion gefunden:100g of pancreatin are with 1500 ml 7Ö "o strength aqueous acetone containing 50 g of sodium chloride as indicated in Example 1 was extracted and worked up Insulin yield corresponds to that of Example 1. The specific enzyme activities are found after extraction.:
Lipase 30 700Lipase 30 700
Amylase 30 200Amylase 30 200
Chymotrypsin 6 050Chymotrypsin 6 050
Trypsin 3 450Trypsin 3 450
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C3 | Grant after two publication steps (3rd publication) | ||
| E77 | Valid patent as to the heymanns-index 1977 | ||
| 8339 | Ceased/non-payment of the annual fee |