DE2335334B2 - PROCESS FOR THE RECOVERY OF HIGHLY PURIFIED PHOSPHATIDES FROM ANIMAL ORGANS - Google Patents
PROCESS FOR THE RECOVERY OF HIGHLY PURIFIED PHOSPHATIDES FROM ANIMAL ORGANSInfo
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Description
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von hochgereinigten Phosphatide:! aus tierischen Organen. Phosphatide bzw. Phosphatidgemische kornmen in tierischen Organen stets mit Begleitsubstanzen vergesellschaftet vor, die für eine spätere Verwendung störend oder ungeeignet sind und deshalb abgetrennt werden müssen. Als Beispiele für solche Begleitsubstanzen seien erwähnt: Peptide, Aminosäuren, öo Sterine, Sterincster, Mono-, Di- und Triglyceride, freie Fettsäuren und Zucker.The invention relates to a method for the production of highly purified phosphatides :! from animal Organs. Phosphatides or phosphatide mixtures grains in animal organs always associated with accompanying substances for later use are disruptive or unsuitable and must therefore be disconnected. As examples of such accompanying substances are mentioned: peptides, amino acids, öo sterols, sterol sterols, mono-, di- and triglycerides, free Fatty acids and sugars.
Verfahren zur Phosphatidgevvinnung und ihrer Reinigung sind schon mehrfach beschrieben worden. So gibt die DL-PS 62 400 die Lehre, pflanzenphsophatidhaltiges Material mit Alkohol und Chloroform zu extrahieren und nach Filtration vom Unlöslichen das mnnesmittel im Vakuum abzuziehen. Ein solches Darsiellupgsverfahren führt zu Phosphatidgemischen, deren Reinheitsgrad noch sehr zu wünschen übrig läßt. Würde beispielsweise ein phosphatidhaltiges Material aas tierischen Organen auf diese Weise behandelt werden, wären die Phosphatide noch u. a. mit Zucker und Aminosäuren verunreinigt.Process for phosphatid recovery and their Cleaning have already been described several times. For example, DL-PS 62 400 teaches the use of phytophosphate To extract the material with alcohol and chloroform and after filtration of the insoluble the Remove the solvent in a vacuum. Such a Darsiellupgsverfahren leads to phosphatide mixtures, whose degree of purity still leaves a lot to be desired. For example, a phosphatide-containing material would When animal organs are treated in this way, the phosphatides would still be a.o. with sugar and contaminated amino acids.
Auch die Mabnahmen, die die DT-AS 12 41559 sowie die GB-PS S 96 903 zur Herstellung eines arachidonsäurereichen Phosphatides unter Anwendung von vier Vcrfahrenssiufen vorschlagen, sind ungenügend, falls sehr reine Phosphatide gewünscht werden. Nach diesem bekannten Verfahren muß erst in zwei Verfahrensstufen durch aufeinanderfolgendes Entwässern eines tierischen Organs mit Alkohol und durch Extraktion sämtlicher Lipoide mit Petroläther ein Gesamtlipoidextrakt hergestellt werden, der dann mit aliphatischen Ketonen extrahiert, dabei aber nur unvollständig von Neutralfette!! und Giyeeriden befreit wird und schließlich durch Extraktion mit einem aliphatischen Ester oder einem Alkohol-Chlorkohlenwasserstoff-Gemisch und Abscheidung des Phosphatidsiemisches aus dieser Extraktionslösung durch Kühlen aufgearbeitet wird. Diese beiden Behandlungsvorgänge des zuvor gewonnenen Gesamtlipoidextraktes reichen aber nicht aus, um Phosphatide zu erhalten, weiche sovvohl frei ion wasserlöslichen, nicht phosphatidischen Begleiisiofien sind, als auch keine Neutralfette und Glyceride enthalten. Dies trifft auch die mehrstufige Arbeitsweise gemäß der DT-PS 6 35 325 zur Gewinnung von Lipoiden aus Geweben des Zentralnervensystems /.u, wobei in drei aufeinanderfolgenden Stufen mitteis bestimmter Lösungsmittel zunächst die Gesamtlipuide gewonnen werden, die dann von Cholesterin und wasserlöslichen Verunreinigungen im Wege einer speziellen P;handlung mit Aceton befreit werden müssen: die native Zusammensetzung bleibt dabei nicht erhalten und auch eine für ein Rcinprodukt notwendige weitgehende Abtrennung der phosphorfreien Lipoide \on den Phosphatide)! findet nicht statt.Also the measurements that the DT-AS 12 41559 and GB-PS S 96 903 for the production of a phosphatides rich in arachidonic acid using of four procedural stages are insufficient, if very pure phosphatides are desired. According to this known method must only be used in two Process stages by successive dehydration of an animal organ with alcohol and by extracting all lipoids with petroleum ether a total lipid extract can be produced, which then extracted with aliphatic ketones, but only incomplete of neutral fats !! and Giyeeriden freed and finally by extraction with an aliphatic ester or an alcohol-chlorinated hydrocarbon mixture and separating the phosphatide mixture from this extraction solution by cooling is worked up. These two treatment processes for the previously obtained total lipid extract are sufficient but not enough to obtain phosphatides, so avoid water-soluble ones, not phosphatidic ones As well as being associated with them, there are no neutral fats and contain glycerides. This also applies to the multi-stage working method according to DT-PS 6 35 325 Extraction of lipoids from tissues of the central nervous system /.u, being in three consecutive Steps with the help of certain solvents first the total lipuids are obtained, which then from Cholesterol and water-soluble impurities are freed by means of a special treatment with acetone must be: the native composition is not retained and also one for a rcin product necessary extensive separation of the phosphorus-free lipoids from the phosphatides)! does not take place.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, aus dem Gesamiiipoidextraki tierischer Organe ein sehr reines Phosphatidgemisch zu gewinnen, um daraus eine injizierbare, stabile wäßrige Dispersion herstellen zu können. Darüber hinaus soll die native Zusammensetzung der Phosphatide weitestgehend erhalten bleiben.The invention is based on the object of extracting a very pure extract from the total extract of animal organs Obtain phosphatide mixture in order to produce an injectable, stable aqueous dispersion therefrom can. In addition, the native composition of the phosphatides should largely be preserved stay.
Das erfindungsgemäße Verfahren beruht im Prinzip darauf, einen Gesamtlipoidextrakt durch eine bestimmte Lösungsmittelbehandlung von den Proteinen vollständig *.u befreien und aus diesem vergereinigten Gesamtlipoidextrakt entweder zuerst die wasserlöslichen Verunreinigungen durch einen speziellen Waschvorgang zu entfernen und dann zur Gewinnung des hochreinen Phosphatidgemisches die anderen, phosphin freien Lipoide durch einen Adsorptionsvorgang abzutrenneii, oder -iber zuerst die Adsorption und dann den Waschvorgang vorzunehmen.The method according to the invention is based in principle on a total lipoid extract by a specific Solvent treatment from the proteins completely free and purified from this Total lipid extract either the water-soluble first To remove impurities through a special washing process and then to recover the highly pure phosphatide mixture the other, phosphine-free lipoids through an adsorption process to be separated off, or via adsorption first and then carry out the washing process.
Zur Erläuterung der angestrebten besonders hohen Reinheit sei angeführt, daß das zu gewinnende Phosphatidgemisch eiweißfrei und frei von Peptiden sein :imß und darüber hinaus weitestgehend befreit von Aminosäuren, Sterinen, Sterinestern, Mono-, Di- und Friglyceriden, fieien Fettsäuren und Zuckern sein soll. Bei der naiiven Zusammensetzung der Phosphatide darf keine Änderung in der für die einzelnen Organe spezifischen Zusammensetzung der Einzelkomponenten eintreten. Das bedeutet beispielsweise, daß der Aldehydgehalt als Mat für den Gehalt an Plasma-To explain the particularly high purity sought, it should be mentioned that the phosphatide mixture to be obtained Be protein-free and free of peptides: in and beyond that, largely free of Amino acids, sterols, sterol esters, mono-, di- and friglycerides, free fatty acids and sugars should be. In the case of the normal composition of the phosphatides there must be no change in that for the individual organs specific composition of the individual components occur. This means, for example, that the Aldehyde content as a mat for the content of plasma
logenen (Accialphosphatide) erhalten bleiben muß und daß am Feitsäuremuster der Phosphatide keine Veränderung wie Epoxidbildung oder Hydroperoxidbildung auftreten darf. Ferner darf das Verfahren zur Reindarstellung von Phosphatiden nicht zu einer merklichen Erhöhung des Gehaltes an Lysoverbindungen führen, d. h., hydrolytische Spaltungen müssen vermieden werden. Daraus folgt ferner, daß der Phosphatid-Rohextrakt nur mit neutralen Salzlösungen schonend behandelt werden darf, wobei noch die Einschränkung gemacht werden muß, daß Calcium- und Kaliumionen bei den Reinigungsoperationen nicht zugegen sein dürfen, weil diese Ionen vor den Phosphatiden salzartig bzw. auch adsorptiv gebunden werden und dann eine spätere pharmazeutische Verwendung nachteilig beeinflussen können.logenen (Accialphosphatide) must be preserved and that there was no change in the acidic acid pattern of the phosphatides how epoxide formation or hydroperoxide formation may occur. Furthermore, the procedure for The pure preparation of phosphatides does not lead to a noticeable increase in the content of lyso compounds lead, d. that is, hydrolytic cleavage must be avoided. It also follows that the crude phosphatide extract can only be treated gently with neutral salt solutions, with one more restriction must be made that calcium and potassium ions are not used in the cleaning operations may be present because these ions are bound in a salty or adsorptive manner in front of the phosphatides and can then adversely affect a later pharmaceutical use.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird das vorliegende Problem der Herstellung hochgereinigter Phosphatide tierischen Ursprungs mit weitestgehend eewahrter nativer Zusammensetzung dadurch gelöst, daßIn accordance with the present invention, the present problem of producing more highly purified Phosphatides of animal origin with largely preserved native composition dissolved by that
a) ein lösungsmittelfreier Gesamtlipoidextrakt in alkoholhaltigen Lösungsmitteln, z. B. Gemischen \on Methanol und Chloroform oder von Äthanol und Benzol, aufgenommen und bei Temperaturen bis etwa 40 C eingedampft wird, wobei die Aufnahme des Extraktes und das Eindampfen mehrmals vorgenommen werden, wonach der getrocknete Extrakt in Petroläthcr in Gegenwart eines inerten Gases bei Gefrierschranktemperaturen einige Zeit .-.ichen gelassen und \on den ungelösten Proteinen abgetrennt wird, danach vorzugsweise die Abtrennung der Proteine durch Eindampfen der Pctrolätherlösung und Behandeln mittels alkoholhaltiger Lösungsmittel, z. B. Chloroform-Methanol, vervollständigt wird, wonacha) a solvent-free total lipid extract in alcohol-containing solvents, e.g. B. Mixtures \ on methanol and chloroform or of ethanol and benzene, taken up and at temperatures is evaporated to about 40 C, the absorption of the extract and the evaporation several times be made, after which the dried extract in petroleum ether in the presence of a inert gas at freezer temperatures for some time Proteins is separated, then preferably the separation of the proteins by evaporation the Pctrolätherlösung and treatment by means of alcohol-containing solvents, z. B. chloroform-methanol, is completed, after which
b) der von Proteinen und Lösungsmitteln befreite Extrakt in einem polaren bzw. schwach polaren, im Falle der Phosphatide die Bildung mizellarer Strukturen verhindernden, mit Wasser nicht oder nur wenig mischbaren Lösungsmittel aufgenommen und mit neutralen wäßrigen Natriumsalzlösungen in Abwesenheit von Calcium- und Kaliumioncn und anschließend mit Wasser gewaschen wird, undb) the extract from proteins and solvents in a polar or weakly polar, in the case of the phosphatides preventing the formation of micellar structures, with water not or only slightly miscible solvent was added and neutral aqueous sodium salt solutions in the absence of calcium and potassium ions and then washed with water will, and
c) der von Lösungsmitteln und Wasser befreite Extrakt in einem unpolaren, im Falle der Phosphatide die Bildung von Mizellen ermöglichenden Lösungsmittel mit Siedepunkt unter 100° C gelöst, über Kieselgel od. dgl. nitriert und vom Lösungsmittel befreit wird,c) the extract freed from solvents and water in a nonpolar one, in the case of the phosphatides Solvents with a boiling point below 100 ° C that enable the formation of micelles are dissolved, is nitrated over silica gel or the like and freed from the solvent,
mit der Maßgabe, daß der Verfahrensschritt gemäß c) auch vor dem Verfahrensschritt gemäß b) durchgeführt werden kann.with the proviso that the process step according to c) is also carried out before the process step according to b) can be.
Der als Ausgangsmaterial dienende Gesamtlipoidextrakt wird aus tierischen Organen, beispielsweise aus Hirn- und Nervengewebe, Netzhaut, Herzen, Testes, Eigelb od. dgl., durch Extraktion mittels organischer Lösungsmittel, wie z. B. Methanol-Chloroform oder Äthanol-Diäthyläther, gewonnen. Bei Durchführung des dreistufigen Reinigungsverfahrens gemäß der Erfindung ist es wichtig, daß die Lipoproteide des Gesamtlipoidextraktes zunächst in Lipoide und Proteine aufgespalten und die Proteine daraus entfernt werden.The total lipid extract used as the starting material is obtained from animal organs, for example from Brain and nerve tissue, retina, heart, testes, egg yolk or the like, by extraction using organic Solvents such as B. methanol-chloroform or ethanol-diethyl ether obtained. When performing of the three-step purification process according to the invention, it is important that the lipoproteins of the Whole lipid extract is first split into lipids and proteins and the proteins are removed from them will.
In der ersten Reinigungsstufe a) können als alkoholhaltige Lösungsmittel Gemische aus niedermolekularen Alkoholen und unpolaren oder schwach polaren organischen Lösungsmitteln, deren Siedepunkte 100 C nicht überschreiten, gegebenenfalls mit einem geringen Wassergehalt, verwendet werden. Bei der mehrmaligen Behandlung mit den alkoholhaltigen Lösungsmitteln wird bevorzugt zunächst ein Gemisch aus Methanol, Chloroform und Wasser, dann ein Gemisch aus Äthanol und Benzol und schließlich ein Gemisch ausIn the first cleaning stage a), mixtures of low molecular weight solvents can be used as alcohol-containing solvents Alcohols and non-polar or weakly polar organic solvents with a boiling point of 100 ° C should not be exceeded, possibly with a low water content. With the repeated Treatment with the alcohol-containing solvents is preferably initially a mixture of methanol, Chloroform and water, then a mixture of ethanol and benzene and finally a mixture of
ίο Methanol und Chloroform angewendet.ίο methanol and chloroform applied.
In der zweiten Reinigungsstufe b) können zum Aufnehmen des von den Proteinen und danach durch Eindampfen im Vakuum von dem Lösungsmittel befreiten Extraktes, der außer den Lipoiden noch die wasserlöslichen Begleitstoffe enthält, als polare bzw. schwach polare Lösungsmittel vorteilhaft Essigsäureäthylester, Diäthyläther oder Chloroform bzw. diese enthaltende Gemische verwendet werden. Zum Waschen mit Natriumsalzlösungen werden verschieden konzentrierte, z. B. gesättigte wäßrige Natriumchloridlösungen verwendet. Die so gereinigte Lösung wird vom Wasser befreit und im Vakuum bis zur Lösungsmittelfreiheit eingedampft.In the second cleaning stage b) you can pick up des is freed from the proteins and then freed from the solvent by evaporation in vacuo Extract, which in addition to the lipoids also contains the water-soluble accompanying substances, as polar or weakly polar solvents advantageously ethyl acetate, diethyl ether or chloroform or these containing mixtures can be used. For washing with sodium salt solutions are different concentrated, e.g. B. used saturated aqueous sodium chloride solutions. The solution thus purified becomes freed from water and evaporated in vacuo until there is no solvent.
Bei der Hersteilung der Lösung in der dritten Reinigungsstufe
c) können als unpolare Lösungsmittel vorteilhaft Pentan, Hexan, Heptan sowie Gemische dieser
Kohlenwasserstoffe, einschließlich Petroläther, Anwendung finden.
Das nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhaltene Phosphatidgemisch zeichnet sich durch große
Reinheit aus und ist daher zur Herstellung von wäßrigen injizierbaren stabilen Dispersionen gut geeignet.
Weiterhin bleibt die native Zusammensetzung des Phosphatidgemisches weitgehend erhalten und seine
Verwendung für pharmazeutische Präparate ist sehr vorteilhaft.In the preparation of the solution in the third purification stage c), pentane, hexane, heptane and mixtures of these hydrocarbons, including petroleum ether, can advantageously be used as non-polar solvents.
The phosphatide mixture obtained by the process according to the invention is distinguished by its high purity and is therefore well suited for the production of aqueous injectable stable dispersions. Furthermore, the native composition of the phosphatide mixture is largely retained and its use for pharmaceutical preparations is very advantageous.
Die erfindungsgemäß erhaltenen hochgereinigten, organspezifischen Phosphatide eignen sich durch ihre organotrope Wirkung zur Behandlung von Erkran-The highly purified, organ-specific phosphatides obtained according to the invention are suitable because of their organotropic effect for the treatment of diseases
Ί° kungen innerer Organe. Beispielsweise können Netzhautphosphatide
mit Erfolg bei der Behandlung von Makulopathien, Metamorphopsien und juvenilen Formen
von Retinitis pigmentosa eingesetzt werden.
Die Erfindung wird anhand der nachfolgenden Beispiele näher erläutert.Ί ° kings of internal organs. For example, retinal phosphatides can be used with success in the treatment of maculopathies, metamorphopsias, and juvenile forms of retinitis pigmentosa.
The invention is explained in more detail with the aid of the following examples.
a) 9,2 g Gesamtlipoidextrakt aus Kälberherzen wurden mit 500 ml einer Mischung von Chloroform, Methanol und Wasser im Verhältnis 16:8:1 versetzt. Die nach Extraktion erhaltene Lösung wurde abgesaugt und im Vakuum bei 40° C eingedampft. Dieser Vorgang wurde mit 500 ml der gleichen Lösungsmittelmischung wiederholt. Nach abermaligem Absaugen und Eindampfen wurde der Rückstand in 50 ml Benzol gelöst und mit 50 ml Äthanol versetzt, abgesaugt und wieder im Vakuum bei 4O0C eingedampft. Auch dieser Schritt wurde mit den gleichen Lösungsmittelmengen wiederholt. Der Eindampfrückstand wurde dann 18 h im Vakuumexsikkator über Silikagel getrocknet. Danach wurde mit 500 ml Petroläther (Siedebereich 40 bis 6O0C) versetzt und die Luft im Kolben mit N2 verdrängt. Diese Lösung wurde nun 24 h in der Tiefkühltruhe bei —20°C stehen gelassen.a) 9.2 g of total lipid extract from calf hearts were mixed with 500 ml of a mixture of chloroform, methanol and water in a ratio of 16: 8: 1. The solution obtained after extraction was filtered off with suction and evaporated at 40 ° C. in vacuo. This process was repeated with 500 ml of the same solvent mixture. After re-suction and evaporation, the residue was dissolved in 50 ml of benzene and 50 ml of ethanol, suction filtered and again evaporated in vacuo at 4O 0 C. This step was also repeated with the same amounts of solvent. The evaporation residue was then dried over silica gel in a vacuum desiccator for 18 hours. Was then added with 500 ml of petroleum ether (boiling range 40 to 6O 0 C) and displaces the air in the flask with N 2. This solution was then left to stand in the freezer at -20 ° C. for 24 hours.
Anschließend wurde die Lösung bei -2O0C 30 min bei 4000 Touren zentrifugiert. Die klare Lösung wurde abgegossen und im Vakuum bei 4O0C zur Trockene eingedampft. Der Eindampfrückstand wurde in 50 mlSubsequently, the solution at -2O 0 C for 30 min was centrifuged at 4000 tours. The clear solution was decanted and evaporated in vacuo at 4O 0 C to dryness. The evaporation residue was in 50 ml
5 65 6
Chloroform gelöst und mit dem gleichen Volumen Beispiel 2
Methanol versetzt. Nach listünd'P.cm Stehen in derDissolved chloroform and with the same volume of Example 2
Methanol added. After listünd'P.cm standing in the
Tiefkühltruhe bei -20 C wurde der cebildete flockige 5 g eines aus Schweinenetzhäuten gewonnene GeNiederschlag durch 10 min Zentrifugen bei samtlipoidextraktes wurden, wie im Beispiel 1, nach 3000 Touren abgetrennt. Die klare überstehende Lö- 5 der unter a) beschriebenen Verfahrensweise vorgereisung wurde im Vakuum bei 40 C eingedampft. Aus- nigt. Das so vorgereinigte Produkt wurde dann zuerst beute: 8,8 g. " nach der unter c) und dann nach der unter b) beschrie-In the freezer at -20 C, the flaky 5 g of a precipitate obtained from pig reticules was formed by 10 min centrifuges with velvet lipid extract were, as in Example 1, after 3000 tours separated. The clear protruding Lö- 5 of the procedure described under a) pre-icing was evaporated at 40 ° C. in vacuo. Excuses. The product thus pre-cleaned was then first Loot: 8.8 g. "according to the under c) and then according to the under b)
b) Der \on Proteinen und alkoholhaltigem Lösungs- benen Verfahrensweise weitergereinigt. Ausbeute:
mittel befreite Extrakt (8.Sg) wurde in 100 ml Äther 2.8 g. Das Produkt war frei von Proteinen, Peptiden.
gelöst und dreimal mit je 100 ml gesättigter Kochsalz- io Aminosäuren, Kohlehydraten und phosphorfreien
lösung ausgeschüttelt. Anschließend wurde die Äther- Lipoiden. Der Phosphorgehalt betrug 3,67",,.
phase einmal mit 100 ml Wasser ausgeschüttelt. „ 1C1 3b) The protein and alcohol-containing solution levels process is further purified. Yield: medium freed extract (8.Sg) was 2.8 g in 100 ml of ether. The product was free of proteins and peptides. dissolved and extracted three times with 100 ml of saturated sodium chloride each amino acids, carbohydrates and phosphorus-free solution. Subsequently it became the etheric lipoids. The phosphorus content was 3.67 "".
phase extracted once with 100 ml of water. " 1C 1 3
Etwaige Emulsionsbildung wurde durch vorsichtigeAny emulsification was avoided by careful
Zugabe von wenigen Tropfen Äthanol beseitigt. Die 10 g eines aus Schwcineleber gewonnenen Gesamt-Adding a few drops of ethanol eliminated. The 10 g of a total made from black liver
Ätherphase wurde über Na2SO1 getrocknet und bei 15 lipoidextraktes wurden wie im Beispiel 1 nach der dortEther phase was dried over Na 2 SO 1 and at 15 lipoid extracts were as in Example 1 after there
40 C im Vakuum eingedampft. Ausbeute: 6,1 g. Das unter a) beschriebenen Verfahrensweise vorgercinigt.40 C evaporated in vacuo. Yield: 6.1 g. The procedure described under a) vorgercinigt.
Produkt war frei von Aminosäuren. Peptiden und Danach wurde das vorgercinigle Produkt wie unter hlProduct was free from amino acids. Peptides and After that, the preliminary product was as described under St.
Kohlehydraten. beschrieben v\eitergereiniut, wobei statt Äther eineCarbohydrates. described v \ eitergereiniut, where instead of ether a
c) 6 g des vorgereinigten Extraktes wurden in 14 g Mischung aus Methanol und Chloroform \erwendet Hexan gelöst und durch eine mit 12g Kiesclgel der 20 wurde.c) 6 g of the pre-purified extract were used in a 14 g mixture of methanol and chloroform Dissolved hexane and replaced it with a silica gel containing 12g.
Firma Merck. Darmstadt, gefüllte Chromatographicr- Das so gereinigte Produkt wurde dann nach derMerck company. Darmstadt, filled Chromatographicr- The product purified in this way was then after the
säule nitriert. Nachdem die Lösung durch die Säule unter c/ beschriebenen Arbeitsweise von phosphor-column nitrided. After the solution has passed through the column of phosphorus
durchgelaufen war. wurde die Säule mit 36 ml Hexan freien Lipoiden befreit, wobei Petroläthcr (Siede-had gone through. the column was freed with 36 ml of hexane-free lipoids, petroleum ether (boiling point
nachcluicrt. Das gesamte Hexan-Lluat wurde bei bereich 40 bis 60 C) anstelle von Hexan verwende:nachcluicrt. The entire hexane lluate was used at range 40 to 60 C) instead of hexane:
40 C im Vakuum eingedampft. Ausbeute: 4.1 g. Das 25 wurde. Die Ausbeute betrug 4.8 g. Das Produkt war40 C evaporated in vacuo. Yield: 4.1 g. That turned 25. The yield was 4.8 g. The product was
Produkt war frei von Glyceriden. Stcrincn und deren frei von Proteinen. Peptiden, Aminosäuren. Kohle-Product was free from glycerides. Stcrincn and their protein free. Peptides, amino acids. Money-
I stern, freien fettsäuren und sonstigen phosphor- hydraten und phosphorfreien Lipoiden. Der Pho-.phor-I star, free fatty acids and other phosphorus hydrates and phosphorus-free lipoids. The Pho-.phor-
freien Lipoiden. Der Phosphorgehalt betrug 3.87",,. gehalt betrug 3.68",.free lipoids. The phosphorus content was 3.87 ",. Content was 3.68" ,.
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| 8235 | Patent refused |