DE2407046B2 - PROCESS AND REAGENT SYSTEM FOR THE QUALITATIVE AND QUANTITATIVE DETERMINATION OF CATALASE IN MILK AND OTHER LIQUIDS, IN PARTICULAR OF SUCH BIOLOGICAL ORIGIN - Google Patents
PROCESS AND REAGENT SYSTEM FOR THE QUALITATIVE AND QUANTITATIVE DETERMINATION OF CATALASE IN MILK AND OTHER LIQUIDS, IN PARTICULAR OF SUCH BIOLOGICAL ORIGINInfo
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Description
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur qualitativen und quantitativen Bestimmung von Katalase in Milch und anderen Flüssigkeiten, insbesondere in solchen biologischen Ursprungs, und ein Reagenziensystem zur Durchführung des Verfahrens.The present invention relates to a method for the qualitative and quantitative determination of catalase in milk and other liquids, especially those of biological origin, and a reagent system to carry out the procedure.
Verfahren zur qualitativen und quantitativen Bestimmung von Katalase sind an sich bekannt. Eines dieser Verfahren beruht auf der Fähigkeit der Katalase, die Zerlegung von Wasserstoffsuperoxyd unter Freisetzung von Sauerstoff zu katalysieren. Zur praktischen Durchführung wird die zu untersuchende Flüssigkeit mit einer verdünnten Wasserstoffsuperoxyd-Lösung in einem Fermentierungsgefäß vermischt und dann 3 Stunden lang stehengelassen, ehe das Volumen des hierbei entwickelten Sauerstoffs abgelesen wird:Methods for the qualitative and quantitative determination of catalase are known per se. One of these Process is based on the ability of catalase to break down hydrogen peroxide and release it to catalyze by oxygen. For practical implementation, the liquid to be examined is used with a dilute hydrogen peroxide solution mixed in a fermentation vessel and then 3 Let stand for hours before reading the volume of oxygen evolved:
2H2O2 2H 2 O 2
Rasche, zuverlässige, einfache und schnelle Verfahren zur Feststellung von Katalase sind äußerst wichtig, besonders im Falle von Milch, da die Gegenwart von Katalase in Milch auf Mastitis oder Brustdrüsenentzündung hinweist, d. h. auf eine infektiöse Erkrankung am Euter des Milch erzeugenden Tieres. Da die Mastitis für die Viehwirtschaft beträchtliche Verluste bedeuten kann, ist es von großer Wichtigkeit, daß das Vorhandensein der Krankheit durch den Katalase-Nachweis bereits in frühen Stadien der Entzündung nachgewiesen werden kann bei regelmäßigen Kontrollen iles Euterzustands.Rapid, reliable, simple and quick methods for the detection of catalase are extremely important especially in the case of milk, since the presence of catalase in milk indicates mastitis or mastitis indicates, d. H. an infectious disease on the udder of the milk-producing animal. Since the mastitis for livestock farming can mean considerable losses, it is of great importance that that The presence of the disease due to the detection of catalase in the early stages of the inflammation iles ile condition can be proven during regular controls.
Da das obenerwähnte Verfahren zum Katalase-Nachwei:> durch Zugabe von Wasserstoffsuperoxyd in einemSince the above-mentioned method for catalase detection:> by adding hydrogen peroxide in one
Fermentierungsgefäß zeitraubend ist, sind andere Verfahren entwickelt worden. Einige dieser Verfahren beruhen auf der Bestimmung der Koagulation oder des Viskositätsanstiegs von Milch, der alkalische oder oberflächenaktive Substanzen zugesetzt wurden. Als nachteilig wirkt sich bei diesen Verfahren aus, daß bei ihnen ebenfalls Reagenzien gebraucht werden; außerdem ist die Genauigkeit dieser Nachweisverfahren gering, es sei denn, eigens geschultes Personal wird mit den Analyse-Arbeiten betraut, besonders wenn die Mastitis noch nicht weit fortgeschritten istFermentation vessel is time consuming, other methods have been developed. Some of these procedures are based on the determination of coagulation or the increase in viscosity of milk, the alkaline or surfactants were added. A disadvantage of this method is that at they also need reagents; also is the accuracy of this detection method low, unless specially trained staff is entrusted with the analysis work, especially if the Mastitis is not yet advanced
Ein Verfahren zum kolorimetrischen Nachweis von Katalase ist in zwei Veröffentlichungen (Zeitschrift physioL Chem, 329, 40 [1962] und CHn. Chim. Acta, 15, 159-163 [1967]) von Johann Pütter beschrieben, wobei ein System von Reagenzien verwendet wird, zu denen unter anderem Wasserstoffsuperoxyd, Peroxydase und ein Leukofarbstof f gehören. Bei diesen Verfahren wird Wasserstoffsuperoxyd der zu untersuchenden Flüssigkeit zugegeben. Die in der Flüssigkeit eventuell vorhandene Katalase zersetzt das Wasserstoffsuperoxyd, und die Reaktion wird zu bestimmten Zeiten unterbrochen und dabei jeweils die Menge des noch vorhandenen Wasserstoffsuperoxyds nachgewiesen. Man läßt dazu das Wasserstoffsuperoxyd einen Leukofarbstoff oxydieren unter Verwendung von Peroxydase als Katalysator:A method for the colorimetric detection of catalase is in two publications (Zeitschrift physioL Chem, 329, 40 [1962] and CHn. Chim. Acta, 15, 159-163 [1967]) described by Johann Pütter, a system of reagents is used, including hydrogen peroxide, peroxidase and a leuco dye f belong. In this process, hydrogen peroxide is the one to be investigated Liquid added. Any catalase present in the liquid decomposes the hydrogen peroxide, and the reaction is interrupted at certain times and in each case the amount of the still existing hydrogen peroxide detected. The hydrogen peroxide is allowed to do this Oxidize leuco dye using peroxidase as a catalyst:
^eukofarbstoff + H2O2 ^ euco dye + H 2 O 2
PeroxydasePeroxidase
(2)
Farbstoff +H2O(2)
Dye + H 2 O
Auch dieses Verfahren ist kompliziert und für den raschen, jedoch zuverlässigen Nachweis von Katalase durch nicht geschultes Personal zu zeitraubend.This method is also complicated and for the rapid but reliable detection of catalase Too time consuming by untrained staff.
Die der Erfindung zugrunde liegende Aufgabe besteht darin, ein Verfahren der eingangs umrissenen Art zu schaffen, mit welchem einfach, rasch, zuverlässig und exakt quantitativ und qualitativ Katalase in Milch oder anderen Flüssigkeiten bestimmt werden kann, wobei es ferner möglich sein soll, Katalase durch Farbreaktionen nachzuweisen und die Katalase-Bestimmung mit einem einfachen Hilfsmittel, das beispielsweise die Form eines Papierstreifens mit den für den Test adsorbierten Reagenzien hat, durchzuführen.The object on which the invention is based is to provide a method of the type outlined at the outset Art to create with which easily, quickly, reliably and precisely quantitatively and qualitatively catalase in milk or other liquids can be determined, it should also be possible to use catalase Detect color reactions and the catalase determination with a simple tool, for example takes the form of a paper strip with the reagents adsorbed for the test.
Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß gelöst durch Zugabe eines aus einer Substanz oder mehreren synergistischen Substanzen bestehenden ersten Reagens, das in Gegenwart einer in Milch oder anderen Flüssigkeiten vorhandenen Substanz Wasserstoffsuperoxyd freimacht, und durch Zugabe eines zweiten Reagens, das bei Oxydation durch Wasserstoffsuperoxyd eine Farbreaktion ergibt, wobei die Katalase-Konzentration über den dabei entwickelten Farbton bestimmt wird.According to the invention, this object is achieved by adding one or more substances synergistic substances existing first reagent, in the presence of one in milk or another Liquids present substance liberates hydrogen peroxide, and by adding a second Reagent which, when oxidized by hydrogen peroxide, produces a color reaction, with the catalase concentration is determined by the color shade developed in the process.
Zweckmäßig ist das erste Reagens ein organisches oder anorganisches Peroxyd oder eine ein Peroxyd erzeugende Verbindung.The first reagent is expediently an organic or inorganic peroxide or a peroxide generating connection.
Es kann aber auch als erstes Reagens eine Verbindung verwendet werden, die Wasserstoffsuperoxyd in Gegenwart von in der Milch vorhandener Xanthin-Oxydase freimacht, also beispielsweise Xanthin oder Hypoxanthin.However, a compound can also be used as the first reagent, hydrogen peroxide in the presence of xanthine oxidase present in the milk, for example xanthine or hypoxanthine.
Vorteilhaft handelt es sich bei dem ersten Reagens um ein oder mehrere Enzyme, es kann auch Galaktose-Oxydase sein.The first reagent is advantageously one or more enzymes; galactose oxidase can also be used be.
Zweckmäßig besteht das erste Reagens aus den Enzymen 0-Galaktosidase und Galaktose-Oxydase, wobei es sich bei dem zweiten Reagens vorteilhaft um einen Leukofarbstoff handeltThe first reagent expediently consists of the enzymes 0-galactosidase and galactose oxidase, wherein the second reagent is advantageously a leuco dye
Das zweite Reagens umfaßt vorteilhaft zusätzlich das Knzym-Peroxydase.The second reagent advantageously additionally comprises the Knzym peroxidase.
Das Re&genziensystem zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens umfaßt eine poröse Struktur, die mit einem Reagens, das bei Berührung mit der Flüssigkeit oder einem Bestandteil derselben Wasserstoffsuperoxyd erzeugt, und einem zweiten Reagens imprägniert ist, das bei Oxydation durch Wasserstoffsuperoxyd eine Farbänderung erfährtThe agent system for carrying out the invention The method involves a porous structure which is exposed to a reagent upon contact with the Liquid or a component of the same generated hydrogen peroxide, and a second reagent is impregnated, which undergoes a color change when oxidized by hydrogen peroxide
Vorteilhaft ist dabei das erste Reagens vom zweiten getrennt, wobei auch zwischen dem ersten und dem zweiten Reagens eine oder mehrere halbdurchlässige Membranen angebracht sein können.The first reagent is advantageously separated from the second, and between the first and the second reagent one or more semipermeable membranes can be attached.
Die Struktur besteht vorteilhaft aus porösem Papier.The structure is advantageously made of porous paper.
Zweckmäßig sind das erste und das zweite Reagens getrennt in Mikrokapseln eingeschlossen, die ihrerseits in der porösen Struktur dispergiert sind.The first and the second reagent are expediently enclosed separately in microcapsules, which in turn are dispersed in the porous structure.
Dabei können das erste und das zweite Reagens auch getrennt in Gelschichten eingebettet sein.The first and the second reagent can also be embedded separately in gel layers.
Vorteilhaft sind das erste und das zweite Reagens in unlöslicher Form auf der porösen Struktur aufgebracht.The first and the second reagent are advantageously applied to the porous structure in insoluble form.
Zweckmäßig ist die Zusammensetzung 0,09-0,11 mg/ml 0-Galaktosidase, 0,09-0,11 mg/ml Glukose-Oxydase oder Galaktose-Oxydase, 0,9 — 1,1 μg/ml Peroxydase und 0,19 — 0,21 mg/ml p-Tolidin.The composition 0.09-0.11 is expedient mg / ml 0-galactosidase, 0.09-0.11 mg / ml glucose oxidase or galactose oxidase, 0.9-1.1 μg / ml peroxidase and 0.19-0.21 mg / ml p-tolidine.
Vorteilhaft ist 0,09-0,11 mg/ml Galaktose-Oxydase, 03-1,1 μg/ml Peroxydase und 0,19-0,21 mg/ml o-Tolidin vorgesehen, oder 0,09-0,11 mg/ml Hypoxanthin, 0,9-1,^g/ml Peroxydase und 0,19-0,21 mg/ml o-Tolidin oder 0,9-1,1 mg/ml Natriumperborat oder Harnstoff-Peroxyd, 0,9-1,1 μg/ml Peroxydase und 0,19-0,21 mg/ml o-Tolidin.0.09-0.11 mg / ml galactose oxidase, 03-1.1 μg / ml peroxidase and 0.19-0.21 mg / ml are advantageous o-tolidine provided, or 0.09-0.11 mg / ml hypoxanthine, 0.9-1.1 g / ml peroxidase and 0.19-0.21 mg / ml o-tolidine or 0.9-1.1 mg / ml sodium perborate or urea peroxide, 0.9-1.1 μg / ml peroxidase and 0.19-0.21 mg / ml o-tolidine.
Zweckmäßig ist eine Reagenzienmischung in die Struktur eingearbeitet und getrocknet worden.A mixture of reagents has expediently been incorporated into the structure and dried.
Ein Verfahren, in dem nur ein trockenes Testpapier verwendet wird, läßt sich nicht durch Zugabe von Wasserstoffsuperoxyd zum Papier verwirklichen, da Wasserstoffsuperoxyd flüchtig und chemisch instabil ist. Das Wasserstoffsuperoxyd muß vielmehr in der zu prüfenden Flüssigkeit oder im Testpapier erzeugt werden, indem dem Papier eine Substanz zugefügt wird, die mit einer in der Flüssigkeit vorhandenen Substanz reagiert und dabei Wasserstoffsuperoxyd freisetzt. Substanzen, die diese Forderungen erfüllen, sind beispielsweise organische oder anorganische Peroxyde oder eine ein Peroxyd erzeugende Verbindung.A method in which only a dry test paper is used cannot be carried out by adding Realize hydrogen peroxide to paper as hydrogen peroxide is volatile and chemically unstable. Rather, the hydrogen peroxide must be produced in the liquid to be tested or in the test paper by adding a substance to the paper that is similar to a substance present in the liquid reacts and releases hydrogen peroxide. Substances that meet these requirements are for example organic or inorganic peroxides or a compound producing a peroxide.
Auch ist es möglich, eine Enzym-Reaktion zur Erzeugung des Wasserstoffsuperoxyds zu verwenden. Diese Lösung ist besonders günstig im Falle von Milch oder anderen biologischen Flüssigkeiten. Xanthin und Hypoxanthin zusammen mit dem in der Milch vorhandenen Enzym Xanthin-Oxydase ergeben Wasserstoffsuperoxyd. It is also possible to use an enzyme reaction to generate the hydrogen peroxide. This solution is particularly beneficial in the case of milk or other biological fluids. Xanthine and Hypoxanthine together with the enzyme xanthine oxidase present in milk result in hydrogen peroxide.
Am zweckmäßigsten ist es aber, die Milch oder andere biologische Flüssigkeiten mit einem Enzym oder synergistischen Enzymen zu vermischen, die Wasserstoffsuperoxyd in Gegenwart eines in der Flüssigkeit vorhandenen Zuckers freimachen. Eine derartige Erzeugung von Wasserstoffsuperoxyd läßt sich erreichen mit der in Milch vorhandenen Laktose in Verbindung mit dem Enzym Galaktose-Oxydase.However, it is most expedient to use an enzyme or an enzyme to milk or other biological fluids synergistic enzymes mix the hydrogen peroxide in the presence of one in the liquid Free up any sugar. Such generation of hydrogen peroxide can be achieved with the lactose present in milk in connection with the enzyme galactose oxidase.
Galaktose-Oxydase reagiert jedoch spezifisch mit freier Galaktose und reagiert nur langsam mit Laktose. Es ist deshalb vorteilhaft das Enzym 0-GalaktosidaseHowever, galactose oxidase reacts specifically with free galactose and only reacts slowly with lactose. The enzyme 0-galactosidase is therefore advantageous
zuzugeben, das Laktose in Galaktose und Glukose aufspaltet Zusammen mit der ß-Galaktosidase kann
statt der Galaktose-Oxydase (oder in Verbindung mit derselben) das Enzym Glukose-Oxydase verwendet
werden, das spezifisch mit der in der Spaltreaktion erhaltenen Glukose reagiert
Ein zum Nachweis von Katalase in Milch .geeignetes System umfaßt die in den folgenden Formeln angegebenen
Reaktionen, wobei ein Leukofarbstoff in Gegenwart von Peroxydase katalytisch durch das Wasserstoffsuperoxyd
oxydiert wird, das in der zu untersuchenden Flüssigkeit erzeugt wird.to add, which splits lactose into galactose and glucose. Together with the ß-galactosidase, the enzyme glucose oxidase can be used instead of the galactose oxidase (or in connection with the same), which reacts specifically with the glucose obtained in the cleavage reaction
A system suitable for the detection of catalase in milk comprises the reactions given in the following formulas, a leuco dye being catalytically oxidized in the presence of peroxidase by the hydrogen peroxide which is generated in the liquid to be examined.
Die Oxydation wird durch die eventuelle vorhandene Katalase gehemmt:The oxidation is caused by the eventual existing Catalase inhibited:
Laktoselactose
/J-Galaktosidase/ J-galactosidase
GlukoseGlucose
H2O2 H 2 O 2
Peroxydase, + Leukofarbstoff + LeukofarbstoffPeroxidase, + leuco dye + leuco dye
Verfärbung
keine VerfärbungDiscoloration
no discoloration
Ein Papierstreifen, der die oben beschriebenen Reagenzien adsorbiert enthält ist geeignet da das Papier nur in die zu untersuchende Flüssigkeit zur Bestimmung von Katalase eingetaucht werden muß. Ein anderes geeignetes Material kann eine spezifische Struktur haben, so beispielsweise Gelstruktur mit zugesetzten Reagenzien. Auch dieses Material kann in der Form eines Gelstreifens hergestellt werden, wie sie für pH-Bestimmungen seit längerer Zeit verwendet werden.A strip of paper similar to the one described above Reagents adsorbed is suitable because the paper is only used in the liquid to be examined Determination of catalase must be immersed. Another suitable material may be a specific one Have structure, for example gel structure with added reagents. This material can also be used in in the form of a gel strip, as has been used for pH determinations for a long time will.
Es schien jedoch unwahrscheinlich, daß Katalase und Peroxydase um das vorhandene Wasserstoffsuperoxyd konkurrieren würden. Gemäß einer Demonstration von W. E. Knox (Biochem. Biophys. Acta, 14, 117 [1954]), wonach sämtliches Wasserstoffsuperoxyd, das in einem Glukose, Glukose-Oxydase, Katalase, Peroxydase und einer oxydierbaren Verbindung, d.h. einem Wasserstoff-Donator enthaltendem System erzeugt wird, während der durch Peroxydase katalysierten Reaktion verbraucht wurde, ohne dabei von Katalase beeinflußt zu werden, war man allgemein zu der Ansicht gekommen, daß enzymatisch erzeugtes Wasserstoffsuperoxyd im allgemeinen unabhängig von einer eventuell anwesenden Katalase mit Peroxydase reagiert. Für diese Ansicht sprach ferner, daß, obwohl Katalase einen höheren Umsatz auf der Trägersubstanz bewirkt als andere Enzyme, sie trotzdem eine geringe Affinität aim Träger hat während Peroxydase eine hohe Affinität zum Träger hat Außerdem wurde festgestellt, daß Katalase mit hohem Wirkungsgrad enzymatisch erzeugtes, in geringen Mengen vorhandenes Wasserstoffsuperoxyd ausnutztIt seemed unlikely, however, that catalase and peroxidase were around the hydrogen peroxide present would compete. According to a demonstration by W. E. Knox (Biochem. Biophys. Acta, 14, 117 [1954]), after which all hydrogen peroxide, which in a glucose, glucose oxidase, catalase, peroxidase and an oxidizable compound, i.e. a system containing a hydrogen donor, is generated, was consumed during the peroxidase catalyzed reaction without being affected by catalase it was generally believed that enzymatically produced hydrogen peroxide generally reacts with peroxidase independently of any catalase that may be present. This view was also supported by the fact that, although catalase had a higher turnover on the carrier substance than other enzymes, it still has a low affinity for the carrier, while peroxidase has one It has also been found that catalase has high affinity for the carrier exploits hydrogen peroxide, which is produced enzymatically and is present in small quantities
Erfindungsgemäß wurde überraschend festgestellt daß das oben beschriebene System und Reaktion (3) in der erhofften Weise wirksam sind. Die Abweichungen dieser Ergebnisse von den von Knox und anderen Forschern erhaltenen lassen sich mindestens teilweise der Tatsache zuschreiben, daE letztere gewisse, natürlich vorkommende Wasserstoff-Donatoren verwendeten, während erfindungsgemäß auf synthetische Farbstoffe zurückgegriffen worden ist Die enzymatische Erzeugung von Wasserstoffsuperoxyd in situ ergibt eine verhältnismäßig konstante Konzentration des Wasserstoffsuperoxyds, was eine Vorbedingung für den konkurierenden Abbau des Wasserstoffsuperoxyds durch Peroxydase und Katalase bei des Feststellung der Katalase-Konzentration ist.According to the invention it was surprisingly found that the above-described system and reaction (3) in are effective in the hoped-for manner. How these results differ from those of Knox and others Researchers can at least in part attribute to the fact that the latter have certain, naturally occurring hydrogen donors used while the invention is based on synthetic Dyes have been resorted to The enzymatic generation of hydrogen peroxide in situ results a relatively constant concentration of hydrogen peroxide, which is a prerequisite for the competing degradation of hydrogen peroxide by peroxidase and catalase in the determination of the Catalase concentration is.
Es wurde eine große Anzahl von Tests durchgeführt in denen Katalase in der oben beschriebenen Weise bestimmt wurde. Die Gemische der hierbei verwendeten Reagenzien und die flüssigen, für die Tests verwendeten Muster wirkten in der in Gleichung (3) angegebenen Weise zusammen und ergaben bei Abwesenheit von Katalase dunkelblaue oder grünliche Farbtöne. Bei hohen Katalase-Konzentrationen entwik-A large number of tests have been carried out using catalase in the manner described above was determined. The mixtures of the reagents used here and the liquid ones for the tests patterns used cooperated in the manner given in equation (3) and resulted in Absence of catalase dark blue or greenish tones. In the case of high catalase concentrations,
kelten sich blaßgelbe Farbtöne. Die Empfindlichkeit des Verfahrens ist umgekehrt proportional der Peroxydase-Konzentration der Reagenzien-Mischung. Es ist erfindungsgemäß gelungen, die Empfindlichkeit bei ihren Tests mit Milch so einzustellen, daß im Falle einer von einer völlig gesunden Kuh stammenden Milch die Farbreaktion eine dunkelblaue Farbe ergab, während bei Kühen mit Mcstitis-Erkrankungen zunehmender Stärke die Farbtöne von einem mittleren Blau über ein leichtes Blaugrün bis Blaßgelb reichten.pale yellow hues came together. The sensitivity of the Procedure is inversely proportional to the peroxidase concentration of the reagent mixture. It is according to the invention managed to adjust the sensitivity in their tests with milk so that in the case of one of milk obtained from a completely healthy cow while the color reaction resulted in a dark blue color in cows with Mcstitis diseases of increasing strength the color tones from a medium blue to a ranged from light blue-green to pale yellow.
Im folgenden werden Beispiele von Reagenzien-Mischungen mit den vorher erwähnten Verbindungen angegeben, sowie Verfahren, bei denen diese Mischungen zur Feststellung der Katalase-Konzentrationen in Milch verwendet werden. Dazu wird ein Tropfen Milch mit einem Tropfen der Reagenzien-Lösung vermischt, die eine der folgenden Zusammensetzungen hat:The following are examples of reagent mixtures with the aforementioned compounds specified, as well as methods in which these mixtures to determine the catalase concentrations in Milk can be used. To do this, a drop of milk is mixed with a drop of the reagent solution, which has one of the following compositions:
Möglichkeil 1.Possible wedge 1.
0-Galaktosidase 0,1 mg/ml
Glukose-Oxydase oder0-galactosidase 0.1 mg / ml
Glucose oxidase or
Galaktose-Oxydase 0,1 mg/mlGalactose oxidase 0.1 mg / ml
Peroxydase l,0μg/mlPeroxidase 1.0 µg / ml
o-Tolodin 0,2 mg/mlo-Tolodine 0.2 mg / ml
Möglichkeit 2:Option 2:
Galaktose-Oxydase 0,1 mg/mlGalactose oxidase 0.1 mg / ml
Peroxydase 1,0 μg/mlPeroxidase 1.0 µg / ml
o-Tolidin 0,2 mg/mlo-tolidine 0.2 mg / ml
Möglichkeit 3:Option 3:
Hypoxanthin 0,1 mg/mlHypoxanthine 0.1 mg / ml
Peroxydase l^g/mlPeroxidase l ^ g / ml
o-Tolidin 0£ mg/mlo-tolidine £ 0 mg / ml
Möglichkeit 4:Option 4:
Natrium-Perbor at oderSodium perborate or
Harnstoffperoxyd 1,0 mg/mlUrea peroxide 1.0 mg / ml
Peroxydase \fl\ig/m\ Peroxidase \ fl \ ig / m \
o-Tolidin 0,2 mg/mlo-tolidine 0.2 mg / ml
Statt der oben angegebenen Vermischung von Milch und Reagenzien-Lösung kann auch ein Streifen eines Filterpapiers verwendet werden, das in eine der oben angeführten, möglichen Lösungen eingetaucht und dann getrocknet wurde. Wenn das Filterpapier dann in die Milch zum Nachweis der in ihr enthaltenen Katalase eingetaucht wird, absorbiert das Papier eine Milchmenge, die der im Papier vorhandenen Reagenzienmenge entspricht.Instead of the above-mentioned mixing of milk and reagent solution, a strip of a Filter paper can be used, which is immersed in one of the possible solutions listed above and then was dried. If the filter paper is then in the milk for the detection of the catalase contained in it is immersed, the paper absorbs an amount of milk equal to the amount of reagent present in the paper is equivalent to.
Die verwendete Peroxydase kann normale, handelsübliche Reinheit haben (beispielsweise RZ = 0,6). Besondere Reinheitsforderungen in bezug auf eine niedrige Katalase-Konzentration müssen aber an die Glukose-Oxydase und Galaktosidase gestellt werden. Um Stabilität der Reagenzien zu gewährleisten, sollten die Verbindungen in einer geeigneten Pufferlösung mit einem pH-Wert um pH 7 aufgelöst werden.The peroxidase used can have normal, commercially available purity (for example RZ = 0.6). However, special purity requirements with regard to a low catalase concentration must be met Glucose oxidase and galactosidase are provided. To ensure stability of the reagents, should the compounds are dissolved in a suitable buffer solution with a pH value around pH 7.
Die Empfindlichkeit des einphasigen Reagenziensystems reicht aus, um eine bestehende Entzündung am ι ο Euter, die als akute Mastitis bekannt ist, während ihrer Entwicklung nachzuweisen. Das einphasige System erwies sich außerdem als hinreichend empfindlich, um einen visuellen Nachweis in den frühen Stadien des Entzündungsprozesses (subklinische Mastitis) zu ermöglichen, was von besonderem diagnostischem Wert ist. Diese Stadien können photometrisch mit dem einphasigen Nachweissystem festgestellt werden.The sensitivity of the single-phase reagent system is sufficient to prevent an existing inflammation on the ι ο Detect udders known as acute mastitis during their development. The single-phase system It was also found to be sensitive enough to allow visual detection in the early stages of the Inflammatory process (subclinical mastitis), which is of particular diagnostic value is. These stages can be determined photometrically with the single-phase detection system.
Die Empfindlichkeit des Analyseverfahrens kann auf gewünschte Werte angehoben werden durch Weiterentwicklung des Systems zu einem mehrphasigen System, wobei die Wasserstoffsuperoxyd und den Farbstoff ergebenden Reagenzien voneinander durch einen Zwischenraum getrennt sind, durch den das erzeugte Wasserstoffsuperoxyd diffundieren kann und in den die Milch eingebracht wird. Beim Übergang von der Wasserstoffsuperoxyd erzeugenden Phase des Systems durch den Zwischenraum in die Farbstoff erzeugende Phase des Systems hat das Wasserstoffsuperoxyd genügend Zeit zur vollständigen oder teilweisen Zerlegung, falls Katalese in der in den Zwischenraum eingedrungenen oder in ihn eingebrachten Milch enthalten istThe sensitivity of the analysis method can be raised to the desired values through further development of the system to a multiphase system, the hydrogen peroxide and the Dye-yielding reagents are separated from one another by a space through which the The hydrogen peroxide produced can diffuse and into which the milk is introduced. When transitioning from the hydrogen peroxide generating phase of the system through the gap into the dye generating phase of the system, the hydrogen peroxide has enough time to complete or partial dismantling if catalese has penetrated or introduced into the space Milk is included
Durch die Anbringung eines durch die zu untersuchende Flüssigkeit führenden Diffusionswegs für das Wasserstoffsuperoxyd, d. h. eines Durchgangs vom Wasserstoffsuperoxyd erzeugenden Enzym zum Farbstoff erzeugenden System, das hauptsächlich ein katalysierendes Enzym enthält, lassen sich jetzt sogar äußerst geringe Katalase-Mengen nachweisen und damit Mastitis in einer frühen Entwicklungsstufe feststellen.By installing a diffusion path for the Hydrogen peroxide, d. H. a passage from the hydrogen peroxide generating enzyme to the dye generating system, which mainly contains a catalyzing enzyme, can now even Detect extremely low levels of catalase and thus mastitis at an early stage of development determine.
Die folgenden Beispiele beziehen sich auf praktische Anwendungen des erfindungsgemäßen Verfahrens.The following examples relate to practical applications of the method according to the invention.
4545
Verwendet wurde eine Prüfzelle aus zwei Kammern, von denen die eine ständig mit einer halbdurchlässigen Membran verschlossen war und 1 — 10 U Galaktose-Oxydase, berechnet auf Laktose als Trägermittel, enthält Eine geringe Menge (0,5—1 ml) der auf Katalase zu untersuchenden Flüssigkeit wird in die offene Kammer der Prüfzelle eingegeben. Ein Peroxydase und einen Leukofarbstoff der in Beispiel 2 unten beschriebenen Art enthaltendes Prüfpapier ist in der Flüssigkeit so angeordnet, daß der der halbdurchlässigen Membran nächstgelegene Teil des Papiers in einem festen Abstand von einigen Milimetern von der Membran bleibt Verschiedene Empfindlichkeiten in bezug auf Katalase lassen sich erzielen, je nach der Menge der Galaktose-Oxydase, der Probenmenge und des obenerwähnten fest eingestellten Abstands. Mit dieser Anordnung sind halbquantitative Bestimmungen von Katalase in Konzentrationen von etwa 2—20 U/ml möglich, wozu die Entwickhing der Verfärbung des zur Prüfung verwendeten Papiers verfolgt wird. Die Verfärbung ist maximal nach einigen Minuten, wenn keine Katalase vorliegt, erreicht jedoch ein immer schwächeres Verfärbungsmaximum bei zunehmenden Katalase-Konzentrationen.Was used a test cell made of two compartments, one of which was a constantly closed by a semi-permeable membrane, and 1 - 10 U galactose oxidase, calculated on lactose as the carrier agent containing a small amount (0.5-1 ml) of the at catalase The liquid to be examined is introduced into the open chamber of the test cell. A test paper containing peroxidase and a leuco dye of the type described in Example 2 below is arranged in the liquid so that the part of the paper closest to the semipermeable membrane remains at a fixed distance of a few millimeters from the membrane. Various sensitivities with respect to catalase can be achieved , depending on the amount of galactose oxidase, the amount of sample and the above-mentioned fixed distance. With this arrangement, semi-quantitative determinations of catalase in concentrations of about 2-20 U / ml are possible, for which the development of the discoloration of the paper used for the test is followed. The discoloration is at most after a few minutes if no catalase is present, but it reaches an increasingly weaker maximum discoloration with increasing catalase concentrations.
Das Wasserstoffsuperoxyd erzeugende System ist nur an einer Seite einer porösen Struktur wirksam, an deren anderer Seite das die Verfärbung erzeugende System anliegt. Die poröse Struktur bildet damit den Trennraum zwischen den beiden Systemen und kann die zu analysierende Flüssigkeit absorbieren. Gleichzeitig stellt der poröse Zwischenraum den Diffusionsweg für das Wasserstoffsuperoxyd dar. Der Zwischenraum kann durch eine halbdurchlässige Membran verstärkt werden, die die beiden Systeme voneinander getrennt hält. Die poröse Struktur kann aus einer oder mehreren Schichten eines porösen Papiers bestehen.The hydrogen peroxide generating system is only effective on one side of a porous structure, on the other the other side is the system producing the discoloration. The porous structure thus forms the separation space between the two systems and can absorb the liquid to be analyzed. Simultaneously the porous space represents the diffusion path for the hydrogen peroxide. The space can are reinforced by a semi-permeable membrane that keeps the two systems separate from each other. The porous structure can consist of one or more layers of porous paper.
Die beiden Reagenzien-Mischungen können in Gelschichten fixiert verwendet werden. Die folgenden beiden Lösungen werden bei 400C vorzugsweise in 20 — 40% Gelatine oder einer anderen, ein Gel bildenden Substanz zubereitet:The two reagent mixtures can be used fixed in gel layers. The following two solutions are prepared at 40 ° C., preferably in 20-40% gelatin or another substance that forms a gel:
Lösung 1:Solution 1:
Peroxydase (EC. 1.11.1.7, RZ 0,6) 0,5 mg/ml o-Tolidin 0,5 mg/ml.Peroxidase (EC. 1.11.1.7, RZ 0.6) 0.5 mg / ml o-tolidine 0.5 mg / ml.
Puffersalz, beispielsweise ein Phosphat, das einen fast neutralen pH-Wert ergibt.Buffer salt, for example a phosphate, the one almost neutral pH.
Lösung 2:Solution 2:
Galaktose-Oxydase (EC 1.13.9, etwa 20 U/mg, mit Laktose als Trägersubstanz, Nicht-Katalase) 0,5-5 mg/ml.Galactose oxidase (EC 1.13.9, approx. 20 U / mg, with lactose as a carrier substance, non-catalase) 0.5-5 mg / ml.
Puffersalz wie oben.Buffer salt as above.
Statt die beiden Enzym-Systeme an den beiden Seiten einer porösen Zwischenschicht in getrennten Gelschichten wirksam werden zu lassen, können auch zwei poröse Schichten, beispielsweise aus Papier, verwendet werden, nachdem jeweils ein System an jeder Schicht adsorbiert wurde. Diese Schichten können dann zu beiden Seiten oder an verschiedenen Abschnitten einer dritten porösen Schicht, die ebenfalls aus Papier bestehen kann, angebracht werden. Die beiden mit den Reagenzien versehenen Schichten werden zweckmäßigerweise von der Zwischenschicht halbdurchlässige Membranen abgetrenntInstead of the two enzyme systems on both sides of a porous intermediate layer in separate gel layers To make it effective, two porous layers, for example made of paper, can be used, after one system has been adsorbed on each layer. These layers can then be on either side or on different sections of a third porous layer, which can also consist of paper, be attached. The two layers provided with the reagents are expediently made by the intermediate layer separated semi-permeable membranes
Statt in Gelschichten können die Reagenzien des Beispiels 2 in sogenannten, an sich bekannten Mikrokapseln mit Hilfe eines vorbeschriebenen Verfahrens eingekapselt werden, (s. beispielsweise T. M. S. Chang, F. C Macintosh, und F. G. Mason, »Semi-Permeable Aqueous Microcapsules«, Cand. J. PhysioL Pharmacol, 44,115 [1966]). Instead of in gel layers, the reagents of Example 2 can be encapsulated in so-called microcapsules known per se with the aid of a method described above (see, for example, TMS Chang, F. C Macintosh, and FG Mason, "Semi-Permeable Aqueous Microcapsules", Cand. J. PhysioL Pharmacol, 44, 115 [1966]).
Zwei Lösungen ähnlich denen des Beispiels 2 werden zubereitet und dann getrennt in Mikrokapseln eingeschlossen. Diese werden in die verschiedenen Schichten zu beiden Seiten einer porösen Diffusionsschicht eingebracht oder mit einem inerten Diffusionsmittel (z. B. Zellulose-Fasern) vermischt Die Mischung wird dann zu einer porösen Struktur umgeformtTwo solutions similar to those of Example 2 are prepared and then separately enclosed in microcapsules. These are in the different layers introduced on both sides of a porous diffusion layer or with an inert diffusion agent (e.g. B. Cellulose fibers) mixed The mixture is then formed into a porous structure
Die halbdurchlässigen Membranen des Beispiels 3 wurden weggelassen, falls die verwendeten Enzyme zuThe semipermeable membranes of Example 3 were omitted if the enzymes used were too
709525/478709525/478
beiden Seiten oder an verschiedenen Stellen der porösen Struktur so unlöslich angebracht wurden, daß sie nicht in direktem Kontakt miteinander waren. Ein zur Anbringung von Enzymen an Papier geeignetes Verfahren kann verwendet werden, wie z. B. beschrieben in der Veröffentlichung von R. O. S t a s i w, A. B. Pat el und H. D. Brown, »Utilization of Bound Lactase in Clinical Chemistry», Biotechnol. Bioeng., 14, 629(1972).on both sides or in different places of the porous structure so insoluble that they were not in direct contact with each other. One suitable for attaching enzymes to paper Methods can be used such as B. described in the publication by R. O. S t a s i w, A. B. Pat el and H. D. Brown, “Utilization of Bound Lactase in Clinical Chemistry », Biotechnol. Bioeng., 14, 629 (1972).
Wenn es in den Beispielen heißt, daß die verschiedenen Enzym-Systeme in geeigneter Weise an verschiedenen Stellen einer porösen Struktur angebracht werdenWhen it is stated in the examples that the different enzyme systems are appropriately involved in different Place a porous structure to be attached
sollen, so darf das nicht dahin verstanden werden, daß die Systeme beispielsweise an jedem Ende eines Papierstreifens anzubringen sind, sondern vielmehr müssen sie an den verschiedenen Bestandteilen der porösen Struktur oder an Teilen für den Aufbau einer solchen Struktur angebracht werden. Beispiel 4 bezieht sich auf letzteren Fall. Die die Reagenzien enthaltenden Mikrokapseln sind hierbei Bestandteile der Struktur, die entsteht, wenn die Mikrokapseln mit einem geeigneten Verfahren mit einem inerten Diffusionsmedium vermischt werden, worauf die Mischung sich zu einer porösen Struktur umwandelt.should, this should not be understood to mean that the systems, for example, at each end of a Strips of paper are to be attached, but rather they must be attached to the various components of the porous structure or attached to parts for building such a structure. Example 4 relates on the latter case. The microcapsules containing the reagents are here components of the structure that arises when the microcapsules are mixed with an inert diffusion medium using a suitable process whereupon the mixture turns into a porous structure.
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Legal Events
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| C3 | Grant after two publication steps (3rd publication) |