DE68909445T2

DE68909445T2 - Methode zur Bestimmung genetischer Sequenzen und Testsatz hierfür.

Info

Publication number: DE68909445T2
Application number: DE89103103T
Authority: DE
Inventors: Chia-Gee Wang
Original assignee: Profile Diagnostic Sciences Inc
Current assignee: Profile Diagnostic Sciences Inc
Priority date: 1988-02-26
Filing date: 1989-02-22
Publication date: 1994-05-11
Anticipated expiration: 2009-02-23
Also published as: DE68909445D1; EP0330185A1; ATE95246T1; JPH0223897A; EP0330185B1

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Analyse von Gensequenzen und eine Ausrüstung, die bei der Analyse solcher Sequenzen von Nutzen ist.
Die Identifikation von Gensequenzen ist ein wichtiger Vorgang in der biologischen, medizinischen und biotechnologischen Forschung. Die Identifikation von und die Gewinnung quantitativer Informationen über Teile genetischen Materials, d.h. Gensequenzen, ist in einer Vielzahl von Anwendungsbereichen von großem Interesse. Solche Informationen ermöglichen beispielsweise die Identifikation von Zellen oder Organismen, oder sogar von einzelnen höheren Organismen mit Hilfe des "genetischen Fingerabdrucks". Das Wissen über das Vorhandensein und die Menge eines speziellen genetischen Materials ist in der Forschung und bei der Diagnose und Behandlung von Krankheiten von Bedeutung. Es besteht auch großes Interesse an der Kartierung von Genen durch Identifikation von Genfragmenten oder Gensequenzen. Eine Reihe von derzeit zur Identifizierung solcher Gensequenzen gebräuchlichen Verfahren wird nach dem "Southern Blotting"- Verfahren typisiert, das eine genetische Probe verwendet, um zugehörige Genfragmente zu identifizieren. Eine genetische Probe ist ein einzelner DNS- oder RNS-Strang aus einem Fragment genetischen Materials, das normalerweise eine bekannte Nucleotidsequenz besitzt. Mit der Probe werden identische oder nahezu identische komplementäre Gensequenzen aufgrund der Bildung komplementärer Doppelhelices oder Dubletts nachgewiesen. Beim "Southern Blotting"-Verfahren werden die zu identifizierenden Genfragmente zunächst in einem Gel der Größe nach mittels Elektrophorese getrennt, die getrennten Fragmente werden dann auf eine dünne Nitrocelluloseschicht übertragen, ohne daß es zu einer Änderung der relativen Position der Fragmente kommt, und eine spezielle radioaktiv markierte genetische Probe wird auf die dünne Schicht aufgetragen. Anschließend wird ein Autoradiogramm erstellt, aus dem die Restriktionsfragmente hervorgehen, die mit der genetischen Probe zu radioaktiven Hybriden oder Dubletts hybridisiert sind.
Die EP-A-0,304,845 beschreibt und beansprucht ein Verfahren zur Analyse von Genausprägungen, bei dem mRNS-Moleküle mit einem festen Substrat verbunden werden, und das feste Substrat mit einer wäßrigen Suspension markierter Mikrokügelchen in Berührung gebracht wird, mit denen Genprobenmoleküle verbunden sind. Die Genprobenmoleküle umfassen Sequenzen, die mit Sequenzen hybridisieren, die aus den zu analysierenden unbekannten oder mRNS-Zielmolekülen bestehen oder für diese charakteristisch sind, so daß die markierten Mikrokügelchen mit den mRNS-Zielmolekülen auf dem Substrat verbunden sind. Die Genausprägungen werden analysiert, indem das feste Substrat von dem nicht mit mRNS-Zielmolekülen verbundenen Mikrokügelchen getrennt wird und markierte, verbundene Mikrokügelchen nachgewiesen werden. Das hier beschriebene, bevorzugte Nachweisverfahren ist der Nachweis mittels Röntgenfluoreszenz von Metallelementmarkierungen.
Klonen, Hybridisieren und mit radioaktiven Genproben arbeitende Techniken sind im einzelnen in dem Text "Molecular Cloning" von T. Maniatis et al., Cold Spring Harbor Laboratory, 1982, beschrieben.
Markierte Mikrokügelchen wurden schon in einer Reihe von Analyseverfahren verwendet, beispielsweise in Immunoassayverfahren. Ausführliche Erläuterungen zu den Mikrokügelchen finden sich in den US-Patenten Nr. 4,454,233, erteilt am 12. Juni 1984, und Nr. 4,436,826, erteilt am 13. März 1984, beide erteilt an Chia-Gee Wang. Diese Patente beschreiben die Verwendung von Mikrokügelchen in Verbindung mit einem Antikörper-Detektor, und die Verwendung von Markierungsreportermolekülen, die mit einer Reihe von Verfahren einschließlich der Röntgenfluoreszenz nachgewiesen werden können. Das US-Patent Nr. 4,663,277, erteilt am 5. Mai 1987, ebenfalls an Chia-Gee Wang, beschreibt ein Verfahren zum Nachweis von Viren oder Proteinen mittels Festphasenverstärkung. Die gesuchten Viren oder Proteine in einer Probe werden mit einem festen Substrat in Berührung gebracht, das mit einem Antikörper beschichtet ist, der mit dem gesuchten Virus oder Protein einen Komplex bildet, und mit dem Antikörper beschichtete Mikrokügelchen werden dann an den Zielkomplex gebunden. Die Nachweisempfindlichkeit wird durch die markierten Mikrokügelchen verstärkt. Die Verwendung der Röntgenfluoreszenzanalyse wird hier beschrieben, und es wird gezeigt, daß damit der gleichzeitige Nachweise verschiedener Arten von Zielsubstanzen möglich ist.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Analyse von Gensequenzen angegeben, welches folgende Schritte umfaßt: Beimischen in ein wäßriges Medium unter vorbestimmten Analysebedingungen (1) genetisches Material, welches eine zu analysierende Sequenz (Zielsequenz) enthält, und (2) schwach hybridisierte Nucleotiddubletts aus (i) einer genetischen Probe für die Zielsequenz, wobei die Zielsequenz eine charakteristische Sinnsequenz umfaßt, und die genetische Probe eine zu der charakteristischen Sinnsequenz der Zielsequenz komplementäre Antisinnsequenz umfaßt, und (ii) einem mit einem markierten Mikrokügelchen verbundenen Reportermolekül, wobei die genetische Probe in der Lage ist, unter den vorbestimmten Analysebedingungen mit der Zielsequenz stärker zu hybridisieren als mit dem Reportermolekül; so daß Zielsequenzen mit genetischen Proben der Dubletts hybridisieren und dementsprechend Reportermoleküle von den Probe-Reporter-Dubletts dissoziieren;
Unterscheiden der dissoziierten Reportermoleküle von undissoziierten Probe-Reporter-Dubletts;
und Erfassen der Markierungen der Mikrokügelchen, die mit den differenzierten, dissoziierten Reportermolekülen verbunden sind.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird außerdem eine Ausrüstung zur Analyse von Gensequenzen in einem wäßrigen Medium angegeben, welches genetisches Material enthält, das eine zu analysierende genetische Zielsequenz umfaßt, wobei die Ausrüstung ein wäßriges Medium umfaßt, das in dem Medium oder in getrennten Teilen des Mediums die folgenden Komponenten enthält: A. schwach hybridisierte Nucleotiddubletts aus (i) einer genetischen Probe für die Zielsequenz und (ii) einem Reportermolekül, das mit einem markierten Mikrokügelchen verbunden ist; und B. eine Vielzahl von nucleotidhaltigen Homopolymeren, die in der Lage sind, wahlweise mit den Reportermolekülen (ii) zu hybridisieren, wenn die Reportermoleküle nicht mit den genetischen Proben (i) hybridisiert sind.
In einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Analyse von Gensequenzen angegeben, welches folgendes umfaßt: Beimischen in ein wäßriges Medium unter vorbestimmten Analysebedingungen (I) genetisches Material, welches eine zu analysierende Sequenz (Zielsequenz) enthält, und (II) schwach hybridisierte Nucleotiddubletts aus (a) einer genetischen Probe für die Zielsequenz, wobei die genetische Probe mit einem markierten Mikrokügelchen verbunden ist, und (b) einem Homopolymermolekül, wobei die Zielsequenz eine charakteristische Sinnsequenz umfaßt, und die genetische Probe (1) eine zu der charakteristischen Sinnsequenz der Zielsequenz komplementäre Antisinnsequenz und (2) eine hybridisierbare Sequenz umfaßt, die mit dem Homopolymer hybridisieren kann, wobei die genetische Probe in der Lage ist, unter den vorbestimmten Analysebedingungen mit der Zielsequenz stärker zu hybridisieren als mit dem Homopolymer; so daß die Zielsequenzen mit genetischen Proben der Probe-Homopolymer- Dubletts zu Ziel-Probe-Dubletts hybridisieren, und die von den genetischen Proben der entstandenen Ziel-Probe-Dubletts getragenen markierten Mikrokügelchen von den Homopolymeren dissoziiert werden; Abtrennen der übrigen Probe-Homopolymer-Dubletts von den Ziel-Probe-Dubletts; und Erfassen der Markierungen der markierten Mikrokügelchen in den übrigen Probe-Homopolymer-Dubletts, um die Abnahme von einer bestimmten Zahl von Markierungen in den anfangs vorgesehenen Probe-Homopolymer-Dubletts zu messen.
In dieser weiteren Ausführungsform wird gemäß vorliegender Erfindung auch eine Ausrüstung zur Analyse von Gensequenzen in einem wäßrigen Medium angegeben, welches genetisches Material enthält, das eine zu analysierende genetische Zielsequenz umfaßt, wobei die Ausrüstung ein wäßriges Medium umfaßt, welches Komponente (A) enthält, die aus schwach hybridisierten Nucleotiddubletts aus (a) einer mit einem markierten Mikrokügelchen verbundenen genetischen Probe für die Zielsequenz und (b) einem Homopolymermolekül besteht, wobei die genetische Probe in der Lage ist, unter den vorbestimmten Analysebedingungen mit der Zielsequenz stärker zu hybridisieren als mit dem Homopolymer.
Bekannte Techniken wie das "Southern Blotting"-Verfahren beinhalteten eine heterogene Analyse, bei der das zu analysierende Material an einen Feststoff gebunden ist, und ein in einer flüssigen Phase aufgebrachter Detektor, wie zum Beispiel eine Genprobe, sich an die übrigen Bindungsstellen auf dem zu analysierenden Material binden muß. Nachdem eine beachtliche Anzahl von Bindungsstellen unerreichbar gemacht werden kann, indem das zu analysierende Material an einen Feststoff gebunden wird, ist die Empfindlichkeit dieser Analyse herabgesetzt. Außerdem beinhalten die bekannten Techniken eine Reihe zeitraubender Maßnahmen bzw. Handgriffe.
Man benötigt also ein Verfahren zur Analyse von genetischem Material mit größerer Empfindlichkeit bzw. weniger Handgriffen. Die vorliegende Erfindung gibt ein homogenes Analyseverfahren an, bei dem ein Profil der gerade analysierten Gensequenzen in einer flüssigen Phase behandelt wird und mit einem Minimum an Handgriffen rasch bestimmt werden kann.
Fig. 1 ist eine schematische Darstellung einer Ausführungsform der Analyse der vorliegenden Erfindung.
Fig. 2 ist eine schematische Darstellung einer weiteren Ausführungsform der Analyse der vorliegenden Erfindung.
Nucleinsäuren als genetisches Material finden sich in allen lebenden Zellen. Die beiden Arten von Nucleinsäure, Desoxyribonucleinsäure (DNS) und Ribonucleinsäure (RNS), unterscheiden sich hauptsächlich in ihrer Ribosezuckereinheit voneinander. Jeder Mikroorganismus enthält eine einzigartige Sequenz von Nucleotiden und läßt sich anhand spezieller Abschnitte seiner DNS oder RNS identifizieren, vor allem aber durch seine reichlich vorhandene ribosomale RNS (rRNS). Höhere Organismen haben nicht nur eine einzigartige DNS-Sequenz, sondern in bestimmten Geweben enthält jede Zelle eine Satz Genausprägungen in Form der Boten-RNS (mRNS). Diese einzigartige Eigenschaft stellt ein wirkungsvolles Mittel dar zum Nachweis und zur Identifikation von Organismen oder Zellen mit Hilfe genetischer Proben.
Genetische Proben sind einzelsträngige Nucleinsäureketten mit einer speziellen Sequenz ("Antisinnsequenz"), die unter entsprechenden Analysebedingungen mit einer "Sinnsequenz" der Nucleinsäurezielsequenzen auf spezielle Weise hybridisieren können. Die Zielsequenz kann DNS, rRNS oder mRNS sein. Die DNS ist normalerweise doppelsträngig, während die RNS normalerweise einzelsträngig ist. Eine Sequenz eines doppelsträngigen "Dubletts" kann bei einer erhöhten Temperatur zu zwei komplementären einzelsträngigen Sequenzen denaturiert werden, wobei bei längeren Dubletts eine höhere Schmelztemperatur erforderlich ist.
Eine Analyse unter Verwendung von genetischen Proben umfaßt zwei Teile, nämlich Nachweis und Analysenbericht. Die einzigartige Probensequenz weist den Sinn der Zielsequenz nach, indem sie mit dieser hybridisiert und dabei ein Antisinn-Sinn-Dublett bildet. Beim Hybridisieren muß dieses Antisinn-Sinn-Dublett sein Vorhandensein durch Reportermoleküle melden, was beispielsweise markierte Enzymmoleküle, fluoreszierende Moleküle, radioaktive Atome oder mittels Röntgenfluoreszenz nachweisbare Elemente oder Verbindungen sein können. In der vorliegenden Erfindung werden Mikrokügelchen, die mehrere Hundert Millionen Traceratome enthalten, zur Bildung markierter Reportermoleküle verwendet.
Bei Verwendung von Mikrokügelchen zur Bildung der Reportermoleküle trägt jedes Reportermolekül mehrere Hundert Millionen Traceratome eines bestimmten Elements und dient als eine Meldeeinheit einer mobilen Festphase. Die große Anzahl von Traceratomen in jeder Meldeeinheit verstärkt das Meldesignal ganz beachtlich im Gegensatz zu dem Signal bei Verwendung eines einzelnen radioaktiven Atoms oder eines Farbänderungsmoleküls als Markierung. Solche Mikrokügelchen sind besonders praktisch bei Röntgenfluoreszenzmessungen, wo zehn oder mehr Meldekanäle, von denen jeder mit einem anderen Markierungselement markiert ist, gleichzeitig melden können, die die Aufgabe haben, ein Profil von genetischen Zielsequenzen gleichzeitig zu analysieren und die Analyse intern zu eichen.
Die Größe solcher Mikrokügelchen bleibt jedoch bei der für ein Virus typischen Größe, so daß sie zwar das Reportermolekül bilden können, indem sich sich mit Nucleotidsequenzen kovalent verbinden, aber keine übermäßig große Anordnung bilden, die die bezeichneten Nachweispaarungen ungünstig beeinflussen würden.
Gemäß dem Verfahren der vorliegenden Erfindung werden genetische Zielsequenzen, die einzelsträngige DNS- oder RNS-Moleküle sein können, in einer wäßrigen Suspension oder in einem wäßrigen Medium analysiert. Ein zuvor hybridisiertes Dublett aus einer genetischen Probe für die Zielsequenz und einem mit einem markierten Mikrokügelchen verbundenen Reportermolekül wird dem Medium mit genetischem Material beigemischt, das eine oder mehrere zu analysierende Sequenzen (Zielsequenzen) enthält. Das Dublett ist ein schwach hybridisiertes Nucleotiddublett, und die genetische Probe ist in der Lage, unter vorbestimmten Analysebedingungen mit der Zielsequenz stärker zu hybridisieren als mit dem Reportermolekül. Unter diesen Bedingungen hybridisiert die genetische Probe vorzugsweise mit der Zielsequenz, so daß dementsprechend das vorhandene Probe-Reporter-Dublett dissoziiert wird unter Freisetzung der Reportermoleküle, die mit markierten Mikrokügelchen verbunden sind.
Der Nachweis der Markierungen der Mikrokügelchen, die mit dissoziierten Reportermolekülen verbunden sind, ist ein Maß für das Vorhandensein und die Menge der Zielsequenzen. Für den Nachweis der Markierungen von Mikrokügelchen von dissoziierten Reportermolekülen ist es notwendig, die dissoziierten Reportermoleküle von undissoziierten Probe-Reporter- Dubletts zu unterscheiden, die selbst die markierten Mikrokügelchen enthalten. Diese Unterscheidung kann auf viele verschiedene Arten erfolgen, beispielsweise durch Sammeln von dissoziierten Reportermolekülen auf einem festen Substrat und Abziehen des wäßrigen Mediums.
Die Markierungen der Mikrokügelchen können beispielsweise eingefärbte Verbindungen sein, Verbindungen, die bei ultravioletter Bestrahlung fluoreszieren, radioaktive Tracer oder Metallelemente oder -verbindungen, die durch Röntgenfluoreszenz nachweisbar sind. Vorzugsweise sollten die Markierungen Metallelemente oder -verbindungen sein, die durch Röntgenfluoreszenz nachweisbar sind. Vorzugsweise sind die Markierungen relativ schwere Elemente mit einer Ordnungszahl über 22, so daß ihre Röntgenfluoreszenz an der Luft nicht stark gedämpft wird. Beispiele für solche Elemente sind Ti, Fe, Ni, Cu, Co, Cr und dergleichen.
Das bevorzugte Nachweisverfahren ist die Röntgenfluoreszenzanalyse. In einem typischen Röntgenfluoreszenzspektrum hat jedes Markierungselement seine charakteristische Spitzenposition oder -energie. Die Zählgeschwindigkeit in dieser Position oder in diesem Kanal ist proportional zur Anzahl der mit dem entsprechenden Element markierten Mikrokügelchen. Die Fluoreszenz wird in Gegenwart von Luft gemessen, mit etwa 10&supmin;&sup8; mol Argongas in der Nähe des Röntgendetektors. Der Kanal des Argonsignals hat nicht den Verstärkungsfaktor der Markierungen der Mikrokügelchen. Bei Verwendung von Mikrokügelchen, von denen jedes angenommenermaßen einen Verstärkungsfaktor von 10&sup8; liefert, wird impliziert, daß der Signalpegel von 10&supmin;¹&sup6; mol für die Targetmoleküle innerhalb von ein paar Sekunden erreicht werden kann. Bei Verwendung eines solchen Systems ist die Analyseempfindlichkeit natürlich sehr viel höher.
Die in der vorliegenden Erfindung verwendeten Mikrokügelchen sind vorzugsweise kleine Latexkügelchen, wie sie von Polyscience, Inc. (Paul Valley Industrial Park, Warrington, PA 18976) geliefert werden. Eine bevorzugte Größe (Durchmesser) der Mikrokügelchen ist 0,3 Mikrometer oder weniger. Zur Verbesserung der Empfindlichkeit sollten die Mikrokügelchen vorzugsweise einen Durchmesser von 0,25 Mikrometer oder weniger besitzen, beispielsweise 0,1 Mikrometer oder darunter. Die Mikrokügelchen sind vorzugsweise nicht kleiner als 0,05 Mikrometer, da unter dieser Größe die Meldesignale reduziert sind.
Die schwachen Hybridisierungseigenschaften des Dubletts aus genetischer Probe und Reportermolekül und die stärkere Hybridisierung der genetischen Probe mit der Zielsequenz unter gegebenen Analysebedingungen können auf die jeweilige Anzahl von Nucleotidbasenpaaren zurückzuführen sein, die das Dublett durch Komplementärbindung bilden. In einer Ausführungsform der Erfindung umfaßt die Zielsequenz eine charakteristische Sinnsequenz, die genetische Probe umfaßt eine zur charakteristischen Sinnsequenz der Zielsequenz komplementäre Antisinnsequenz, und das Reportermolekül umfaßt eine Sinnsequenz, die kürzer ist als die Zielsequenz und komplementär zu einem Teil der Antisinnsequenz der genetischen Probe. Dies kann unter den Analysebedingungen zu der bevorzugten Bindung der Probe an das Target führen. Bedingungen wie Temperatur oder pH-Wert werden so vorbestimmt, daß die genetische Probe mit dem Reportermolekül ein schwach hybridisiertes Dublett und mit der Zielsequenz ein stark hybridisiertes Dublett bildet. Zu diesem Zweck sollte die Analyse vorzugsweise bei einer Temperatur knapp unter der Schmelztemperatur des Dubletts aus genetischer Probe und Reportermolekül durchgeführt werden.
Eine Art der Unterscheidung der dissoziierten Reportermoleküle von undissoziierten Probe-Reporter-Dubletts besteht in der Kombination der dissoziierten Reportermoleküle mit einer anderen Substanz, so daß dem dissoziierten Reportermolekül Unterscheidungsmerkmale mitgegeben werden können, oder daß es an einer von der Position der undissoziierten Probe-Reporter-Dubletts verschiedenen Position gesammelt werden kann. Dazu kann beispielsweise in einem wäßrigen Medium eine Reihe von Nucleotidpolymeren bereitgestellt werden, die Eigenschaften besitzen, aufgrund derer sie wahlweise nur mit dem dissoziierten Reportermolekülen hybridisieren werden.
Vorzugsweise sind die Nucleotidpolymere, die in dem Medium bereitgestellt werden können, nucleotidhaltige Homopolymermoleküle.
Das Reportermolekül enthält eine hybridisierbare Sequenz, die mit dem Homopolymer hybridisieren kann. In dieser hybridisierbaren Sequenz können eine Reihe von Nucleotiden enthalten sein, die mit dem Homopolymer Basenpaare bilden können. Alternativ können Nucleotide, die mit dem Homopolymer Basenpaare bilden können, sowohl in der hybridisierbaren Sequenz als auch in der Sinnsequenz des Reportermoleküls enthalten sein. Die Hybridisierung des Homopolymers und des Reportermoleküls richtet sich dann nach der Anzahl der für die Bildung von Basenpaaren zur Verfügung stehenden Nucleotide und nach den Analysebedingungen. Um eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung handelt es sich dann, wenn die Anzahl der basenpaarbildenden Nucleotiden unter den vorbestimmten Analysebedingungen ausreicht, um ein Reporter-Homopolymer-Dublett zwischen der hybridisierbaren Sequenz und dem Homopolymer zu bilden, wenn das Reportermolekül von der genetischen Probe dissoziiert ist, und unter Reaktionsbedingungen nicht ausreicht, um das Reporter-Homopolymer-Dublett zu bilden, wenn das Reportermolekül mit der genetischen Probe hybridisiert ist, weil einige der basenpaarbildenden Nucleotide durch die genetische Probe blokkiert sind. Wenn die basenpaarbildenden Nucleotide sowohl in der hybridisierbaren Sequenz als auch in der Sinnsequenz des Reportermoleküls enthalten sind, sollten die basenpaarbildenden Nucleotide der Sinnsequenz vorzugsweise neben der hybridisierbaren Sequenz des Reportermoleküls liegen.
Die obigen Homopolymere können aus X Nucleotiden bestehen, und die basenpaarbildenden Nucleotide des Reportermoleküls können aus Y Nucleotiden bestehen, wobei dann, wenn:
X gleich dC, Y gleich G;
X gleich C, Y gleich G;
X gleich dG, Y gleich C;
X gleich G, Y gleich C;
X gleich dC, Y gleich dG;
X gleich C, Y gleich dG;
X gleich dG, Y gleich dC;
X gleich G, Y gleich dC.
Wenn die dissoziierten Reportermoleküle, welche die markierten Mikrokügelchen enthalten, anhand der Hybridisierung mit Homopolymeren in dem Medium differenziert werden, kann das entstehende Dublett aus Homopolymer und Reportermolekülen auf verschiedene Arten von Probe-Reporter-Dubletts unterschieden werden. Beispielsweise kann man die Homopolymere an einem festen Ort vorsehen. Dazu werden die Homopolymere mit einem festen Substrat verbunden, auf dem die dissozierten Reportermoleküle durch Bildung von Reporter- Homopolymer-Dubletts gesammelt werden. Das feste Substrat kann aus jedem Material bestehen, mit dem die Homopolymere verbunden werden können, beispielsweise Glas oder ein hydrophiler polymerer Latex. Das Substrat könnte beispielsweise ein Behälter sein, in dem das wäßrige Medium enthalten ist, und die Homopolymere könnten an einen bestimmten Ort auf der Oberfläche im Inneren des Behälters gebunden sein.
Wenn die Homopolymere an einen bestimmten Ort auf so einem festen Substrat gebunden sind, kann ein vorteilhaftes Nachweisverfahren verwendet werden. Dieses Nachweisverfahren kann durchgeführt werden, wenn die Mikrokügelchen mit Metallelementen oder -verbindungen markiert sind. Die an die dissoziierten Reportermoleküle gebundenen markierten Mikrokügelchen können dann mittels Röntgenfluoreszenzanalyse nachgewiesen werden, wobei eine Röntgenstrahlen- oder Elektronenquelle zum Bestrahlen der auf dem festen Substrat angesammelten dissoziierten Reportermoleküle und ein Röntgenfluoreszenzdetektor verwendet werden, der in der Lage ist, einen schmalen Raumwinkel zu betrachten. Zu diesem Zweck wird der feste Ort der Homopolymere auf dem festen Substrat in bezug auf den Detektor und das wäßrige Medium so gewählt, daß der Detektor im wesentlichen fluoreszierende Röntgenstrahlen erfaßt, die von den angesammelten dissoziierten Reportermolekülen ausgesandt werden, ohne dabei eine signifikante Anzahl von fluoreszierenden Röntgenstrahlen zu betrachten, die von undissoziierten Reportermolekülen in dem wäßrigen Medium ausgesandt werden. Dadurch werden tatsächlich die dissoziierten Reportermoleküle von den undissoziierten getrennt.
Ein alternatives Verfahren zum Nachweis der Markierungen von undissoziierten Reportermolekülen, die sich an einem festen Ort durch die Bildung der Reporter-Homopolymer-Dubletts angesammelt haben, besteht darin, das wäßrige Medium von dem Ort des festen Substrats abzuziehen und, soweit notwendig, das feste Substrat zu waschen. Dabei werden undissoziierte Probe-Reporter-Dubletts von dem Ort des festen Substrats, an dem die Homopolymer-Reporter-Dubletts befestigt sind, entfernt. Dann können die Markierungen der Reportermoleküle an diesem Ort durch geeignete Mittel nachgewiesen werden, da der Nachweis nicht durch "Rausch"-Signale beeinträchtigt wird, die auf die Gegenwart der Markierungen von Reportermolekülen in den undissoziierten Probe-Reporter-Dubletts zurückzuführen sind.
Bei Verwendung von Homopolymermolekülen in dem wäßrigen Medium können andere Verfahren als das Befestigen der Homopolymere an einem festen Substrat durchgeführt werden. Beispielsweise können die Homopolymermoleküle freischwebend sein, und die entstehenden Homopolymer-Reporter-Dubletts können von undissoziierten Probe-Reporter-Dubletts unterschieden werden. Dazu werden beispielsweise die Homopolymermoleküle markiert. Jedes Homopolymermolekül kann mit einem magnetisch markierten Mikrokügelchen verbunden werden. Dissoziierte, markierte Reportermoleküle können dann von undissoziierten Probe-Reporter-Dubletts anhand der gebildeten Reporter-Homopolymer-Dubletts mit magnetischer Markierung unterschieden werden. Solche magnetisch markierten Reporter-Homopolymer-Dubletts können durch magnetische Anziehung an einen gewünschten Ort gesammelt werden. An diesem Ort können dann die Markierungen der an die Reportermoleküle gebundenen Mikrokügelchen nachgewiesen werden. Eine unerwünschte Störung durch undissoziierte Probe-Reporter-Dubletts kann durch die oben beschriebenen Mittel vermieden werden, beispielsweise durch Abziehen des wäßrigen Mediums aus den gesammelten Dubletts.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann auch mit einer Kontrollanalyse arbeiten, die gleichzeitig mit der Analyse einer unbekannten Zielsequenz durchgeführt wird. Dazu können ebenfalls in dem wäßrigen Medium als Kontrolle eine bekannte Menge einer bekannten Zielsequenz und zusätzliche schwach hybridisierte Nucleotiddubletts beigemischt werden. Diese zusätzlichen Dubletts werden aus einer genetischen Probe für die bekannte Zielsequenz und einem an ein markiertes Mikrokügelchen gebundenen Reportermolekül hergestellt, wobei dieses Mikrokügelchen mit einem Metallelement markiert ist, das von der Markierung des Reportermoleküls für die unbekannte Zielsequenz verschieden ist. Die genetische Probe für die bekannte Zielsequenz kann unter vorbestimmten Analysebedingungen mit der bekannten Zielsequenz stärker hybridisieren als mit dem Reportermolekül, zu dem sie zu Beginn hybridisiert wird. Wenn sowohl die unbekannte als auch die bekannte Zielsequenz beigemischt sind, werden durch den Nachweisschritt gleichzeitig und getrennt sowohl die Markierungen von Mikrokügelchen erfaßt, die an Reportermoleküle gebunden sind, die von der genetischen Probe für die bekannte Zielsequenz dissoziiert sind, als auch die von Markierungen für die unbekannte Zielsequenz. Dies geschieht mittels Analyse der Röntgenfluoreszenzcharakteristik verschiedener Metallelemente, welche die verschiedenen Reportermoleküle markieren. Dann ist es leicht, die Analyse der unbekannten Zielsequenzen anhand der Analyse der bekannten Zielsequenz zu eichen.
Die Verwendung einer Kontroll-Zielsequenz kann auch dazu dienen, Unterschiede in der Anzahl von Reportermolekülen, die an ein einzelnes Mikrokügelchen gebunden sind, auszugleichen. Die Mikrokügelchen werden so hergestellt, daß man im wesentlichen ein einzelnes Reportermolekül pro einzelnem Mikrokügelchen hat. Wenn mehr als ein Reportermolekül an ein einzelnes Mikrokügelchen gebunden ist, kann mehr als eine einzelne Zielsequenz zu einer Dissoziierung der an das einzelne Kügelchen gebundenen Reportermoleküle führen. Eine Zählung der Mikrokügelchen wird dann für die Menge der Zielsequenz zu einem niedrigeren Ergebnis führen als dies eigentlich korrekt ist. Mit Hilfe eines Kontrollsystems, in dem die Reportermoleküle genauso an Mikrokügelchen gebunden sind wie bei der Analyse der unbekannten Zielsequenz, läßt sich dies ohne weiteres ausgleichen. Wenn die Anzahl der an ein einzelnes Mikrokügelchen gebundenen Reportermoleküle bekannt ist, kann die Analyse dementsprechend geeicht werden.
Bei Verwendung der Röntgenfluoreszenzanalyse für den Nachweisschritt ist es auch möglich, eine Vielzahl verschiedener unbekannter Zielsequenzen gleichzeitig zu analysieren. Wenn dies erfolgen soll, werden die verschiedenen Arten von Zielsequenzen in der Probe genetischen Materials dadurch analysiert, daß in dem wäßrigen Medium verschiedene Varietäten hybridisierter Nucleotiddubletts beigemischt werden. Jede verschiedene Dublett-Varietät sollte zunächst einen anderen Typ genetischer Probe enthalten, so daß jeder Typ in der Lage ist, mit einer ganz bestimmten, anderen Art von Zielsequenz zu hybridisieren, und zweitens ein Reportermolekül, das an ein anders markiertes Mikrokügelchen gebunden ist, wobei die Mikrokügelchen unterschiedlicher Dublett-Varietäten unterschiedliche Metallelementmarkierungen besitzen. Nach dem Einbringen des genetischen Materials in das wäßrige Medium werden Reportermoleküle, die bestimmte einzelnen Zielsequenzen entsprechende Mikrokügelchen besitzen, dissoziiert. Sie werden gleichzeitig und getrennt voneinander durch den Nachweis der Markierungen der unterschiedlich markierten Mikrokügelchen anhand der Analyse der Röntgenfluoreszenzcharakteristik jedes verschiedenen Metallelements nachgewiesen.
Eines der Hauptmerkmale der Erfindung, die homogene Hybridisierung der Zielsequenz in dem wäßrigen Medium, ohne sie an einem Feststoff zu befestigen, wird in einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung beibehalten. In dieser Ausführungsform wird die genetische Probe markiert und wirkt als Reporter in einer negativ korrelierten Analyse, so daß ein getrenntes Reportermolekül weggelassen werden kann.
In dieser alternativen Ausführungsform wird genetisches Material, welches eine Zielsequenz enthält, in ein wäßriges Medium unter vorbestimmten Analysebedingungen mit schwach hybridisierten Nucleotiddubletts aus (a) einer genetischen Probe für die Zielsequenz, wobei die genetische Probe an ein markiertes Mikrokügelchen gebunden ist, und (b) einem Homopolymermolekül beigemischt, wobei die genetische Probe in der Lage ist, unter den vorbestimmten Analysebedingungen mit der Zielsequenz stärker zu hybridisieren als mit dem Homopolymer. Die Zielsequenzen hybridisieren dann mit genetischen Proben der Probe-Homopolymer-Dubletts zu Ziel- Probe-Dubletts, und die markierten Mikrokügelchen, die von den genetischen Proben der entstandenen Ziel-Probe-Dubletts getragen werden, werden von den Homopolymeren dissoziiert. Die verbleibenden Probe-Homopolymer-Dubletts werden von Ziel-Probe-Dubletts getrennt, und die Markierungen der markierten Mikrokügelchen in den verbleibenden Probe-Homopolymer-Dubletts werden nachgewiesen. Gemessen wird die Abnahme der Zahl von Markierungen in den zu Beginn vorgesehenen Probe-Homopolymer-Dubletts.
Eine schwache Hybridisierung des anfänglich bereitgestellten Dubletts und eine stärkere Hybridisierung mit dem eine Zielsequenz enthaltenden Dublett wird genauso erreicht wie oben im Zusammenhang mit der ersten Ausführungsform beschrieben. Dazu muß die Zielsequenz eine charakteristische Sinnsequenz enthalten, und die genetische Probe enthält (1) eine zu der charakteristischen Sinnsequenz der Zielsequenz komplementäre Antisinnsequenz, und (2) eine hybridisierbare Sequenz, die mit dem Homopolymer hybridisieren kann. Eine Anzahl von Nucleotiden, die mit dem Homopolymer Basenpaare bilden können, sind in der hybridisierbaren Sequenz oder sowohl in der hybridisierbaren Sequenz als auch in der Antisinnsequenz der genetischen Probe enthalten.
Die Anzahl von basenpaarbildenden Nucleotiden dürfte unter den vorbestimmten Analysebedingungen ausreichend sein, damit die genetische Probe und das Homopolymer des Probe-Homopolymer-Dubletts in Abwesenheit der Zielsequenzen hybridisiert bleiben, dürfte aber nicht ausreichen, um unter den Reaktionsbedingungen, wenn Zielsequenzen in dem wäßrigen Medium vorhanden sind, hybridisiert zu bleiben, weil einige der basenpaarbildenden Nucleotide durch die Zielsequenz blockiert werden. Vorzugsweise bestehen die basenpaarbildenden Nucleotide sowohl aus der hybridisierbaren Sequenz als auch aus der Antisinnsequenz der genetischen Probe, und die basenpaarbildenden Nucleotide der Antisinnsequenz liegen neben der hybridisierbaren Sequenz. Die Homopolymere können sich aus X Nucleotiden zusammensetzen, und die basenpaarbildenden Nucleotide der genetischen Probe aus Y Nucleotiden, in den oben beschriebenen Kombinationen.
Analysebedingungen wie Temperatur oder pH-Wert werden so vorbestimmt, daß die genetische Probe ein schwach hybridisiertes Dublett mit dem Homopolymer und ein stark hybridisiertes Dublett mit der Zielsequenz bildet. Vorzugsweise wird die Analyse bei einer Temperatur knapp unter der Schmelztemperatur des Dubletts aus genetischer Probe und Homopolymer durchgeführt.
Um das Analyseergebnis zu überprüfen wird die Analyse gewünschtenfalls bei einer Temperatur knapp unter der Schmelztemperatur des Dubletts aus genetischer Probe und Homopolymer durchgeführt, und nachdem zunächst eine Abnahme in der Zahl der Markierungen von Probe-Homopolymer-Dubletts gemessen wurde, wird die Analysetemperatur auf eine Temperatur unterhalb der Schmelztemperatur eines Dubletts abgesenkt, das hergestellt werden kann zwischen (a) den aus der hybridisierbaren Sequenz der genetischen Probe bestehenden basenpaarbildenden Nucleotiden, und (b) dem Homopolymer, und die Markierungen markierter Mikrokügelchen in Probe-Homopolymer-Dubletts werden erfaßt, um eine Zunahme der Anzahl von Markierungen gegenüber der Anzahl aus der ersten Messung zu messen. Die Mikrokügelchen werden in der gleichen Weise markiert wie oben beschrieben, und die Röntgenfluoreszenzanalyse ist ebenfalls das bevorzugte Nachweisverfahren.
Vorzugsweise sollte das Homopolymer der Probe-Homopolymer- Dubletts an ein festes Substrat an einem festen Ort gebunden sein. Dies kann Teil des Behälters für das wäßrige Medium sein, wie oben beschrieben. Dies ermöglicht die Trennung verbleibender Probe-Homopolymer-Dubletts von Ziel- Probe-Dubletts mit Hilfe eines unter einem schmalen Raumwinkel betrachtenden Röntgenfluoreszenzdetektors, wie oben beschrieben. Alternativ kann das wäßrige Medium von dem festen Substrat abgezogen werden, das wahlweise abgewaschen wird, um Ziel-Probe-Dubletts davon zu entfernen und somit Störungen zu beseitigen.
In der alternativen Ausführungsform der Erfindung kann eine bekannte Zielsequenz als Kontrolle verwendet werden, und eine Vielzahl von unbekannten Zielsequenzen kann in ähnlicher Weise wie oben beschrieben analysiert werden.
Falls eine Kontrolle verwendet wird, werden bei dem Verfahren auch als Kontrolle in das wäßrige Medium eine bekannte Menge einer bekannten Zielsequenz und zusätzliche schwach hybridisierte Nucleotiddubletts beigemischt. Die zusätzlichen Dubletts bestehen aus (c) einer genetischen Probe für die bekannte Zielsequenz, und (d) einem Homopolymermolekül, wobei die genetische Probe (c) an ein markiertes Mikrokügelchen gebunden ist, und das Mikrokügelchen mit einem Metallelement markiert ist, das von der Markierung der genetischen Probe für die unbekannte Zielsequenz verschieden ist. Die genetische Probe (c) für die bekannte Zielsequenz ist in der Lage, unter den vorbestimmten Analysebedingungen mit der bekannten Zielsequenz stärker zu hybridisieren als mit dem Homopolymer (d). Folgendes wird gleichzeitig und getrennt voneinander erfaßt: I. die Markierungen der markierten Mikrokügelchen in der verbleibenden Probe für die Dubletts aus unbekannter Zielsequenz (a) und Homopolymer (b), und II. die Markierungen der markierten Mikrokügelchen in der verbleibenden Probe für die Dubletts aus genetischer Probe (c) und Homopolymer (d), und zwar durch Analyse der Röntgenfluoreszenzcharakteristik der verschiedenen Metallelemente, und die Analyse der Zielsequenzen wird gegen die Analyse der Kontrolle geeicht.
Zur gleichzeitigen Bestimmung einer Vielzahl von Zielsequenzen, bei der das genetische Material verschiedene Arten von zu analysierenden Zielsequenzen umfaßt, werden die verschiedenen Arten dadurch analysiert, daß man dem wäßrigen Medium verschiedene Varietäten von schwach hybridisierten Nucleotiddubletts beimischt, wobei jede verschiedene Dublettvarietät aus folgendem besteht: (a) einem unterschiedlichen Typ genetischer Probe, wobei jeder Typ in der Lage ist, mit einer bestimmten Art der verschiedenen Arten von zu analysierenden Zielsequenzen zu hybridisieren, und jeder Typ genetischer Probe an ein anders markiertes Mikrokügelchen gebunden ist, und (b) einem Homopolymermolekül, wobei die Mikrokügelchen der verschiedenen Dublett-Varietäten verschiedene Metallelementmarkierungen besitzen; und die Markierungen der unterschiedlich markierten Mikrokügelchen in den verbleibenden Probe-Homopolymer-Dubletts werden gleichzeitig und getrennt voneinander durch Analyse der Röntgenfluoreszenzcharakteristik von jedem verschiedenen Metallelement nachgewiesen.
Gemäß der Erfindung ist auch eine Ausrüstung angegeben. Die Ausrüstung kann Komponenten umfassen, die eine Analyse gemäß der einen oder der anderen der alternativen Ausführungsformen ermöglichen.
In einer Ausführungsform sind die wesentlichen Bestandteile der Ausrüstung in einem wäßrigen Medium als ganzes oder in getrennten Teilen des Mediums enthalten, wobei diese Komponenten folgende sind:
A. schwach hybridisierte Nucleotiddubletts aus (i) einer genetischen Probe für die Zielsequenz und (ii) einem Reportermolekül, das an ein markiertes Mikrokügelchen gebunden ist; und
B. eine Vielzahl von nucleotidhaltigen Homopolymeren, die in der Lage sind, wahlweise mit den Reportermolekülen (ii) zu hybridisieren, wenn die Reportermoleküle nicht mit den genetischen Proben (i) hybridisiert sind.
Die Eigenschaften der Komponenten der Ausrüstung sind wie oben in Zusammenhang mit der ersten Ausführungsform des Verfahrens der Erfindung beschrieben.
Die Ausrüstung kann des weiteren ein festes Substrat umfassen, an das die Homopolymere gebunden sind, und dies kann Teil des Behälters sein, in dem das wäßrige Medium enthalten sein kann.
In einer Ausführungsform dieser Ausrüstung, bei der verschiedene Arten von Zielsequenzen gleichzeitig analysiert werden können, enthält Komponente A. zusätzlich verschiedene Varietäten von hybridisierten Nucleotiddubletts, wobei jede verschiedene Dublett-Varietät sich zusammensetzt aus (i) einem anderen Typ genetischer Probe, wobei jeder Typ in der Lage ist, mit einer bestimmten Art der verschiedenen Arten von zu analysierenden Zielsequenzen zu hybridisieren, und (ii) einem Reportermolekül, das an ein anders markiertes Mikrokügelchen gebunden ist, wobei die Mikrokügelchen unterschiedlicher Dublett-Varietäten unterschiedliche Metallelementmarkierungen besitzen, und die unterschiedlichen Dublett-Varietäten in demselben wäßrigen Medium oder in getrennten Teilen desselben enthalten sind.
Eine Ausführungsform der Ausrüstung sieht auch die Verwendung einer Kontrolle vor, wobei die Ausrüstung des weiteren umfaßt:
C. eine bekannte Menge einer bekannten Zielsequenz als Kontrolle, die in einem Teil des wäßrigen Mediums enthalten ist, der von dem die Komponente A. enthaltenden wäßrigen Medium getrennt ist; und
D. zusätzliche schwach hybridisierte Nucleotiddubletts, wobei die zusätzlichen Dubletts aus (iii) einer genetischen Probe für die bekannte Zielsequenz und (iv) einem mit einem markierten Mikrokügelchen verbundenen Reportermolekül bestehen, wobei das Mikrokügelchen mit einem von der Markierung des Reportermoleküls (ii) verschiedenen Metallelement markiert ist, und die genetische Probe (iii) in der Lage ist, unter den vorbestimmten Analysebedingungen mit der bekannten Zielsequenz stärker zu hybridisieren als mit dem Reportermolekül (iv).
Eine weitere Ausführungsform der Ausrüstung eignet sich zur Durchführung des oben beschriebenen alternativen Verfahrens. Diese Ausrüstung umfaßt ein wäßriges Medium, welches Komponente (A) enthält, bestehend aus schwach hybridisierten Nucleotiddubletts aus (a) einer genetischen Probe für die Zielsequenz, wobei die genetische Probe an ein markiertes Mikrokügelchen gebunden ist, und (b) einem Homopolymermolekül, wobei die genetische Probe in der Lage ist, unter den vorbestimmten Analysebedingungen mit der Zielsequenz stärker zu hybridisieren als mit dem Homopolymer.
Die Eigenschaften der Komponenten dieser Ausrüstung sind wie oben in Zusammenhang mit der alternativen Ausführungsform des Analyseverfahrens beschrieben.
Diese alternative Ausrüstung kann wahlweise des weiteren ein festes Substrat umfassen, mit dem die Homopolymere verbunden sind, und der Feststoff kann Teil eines Behälters für das wäßrige Medium sein.
Die Ausrüstung kann ausgelegt sein für die Analyse verschiedener Arten von Zielsequenzen, wobei in diesem Fall Komponente (A) zusätzlich verschiedene Varietäten von hybridisierten Nucleotiddubletts enthält, wobei jede der verschiedenen Dublettvarietäten aus (a) einer anderen Art genetischer Probe besteht, wobei jede dieser Arten in der Lage ist, mit einer bestimmten der verschiedenen Arten von zu analysierenden Zielsequenzen zu hybridisieren, und jede Art von genetischer Probe mit einem anders markierten Mikrokügelchen verbunden ist, und (b) aus einem Homopolymermolekül besteht, wobei die Mikrokügelchen der verschiedenen Dublettvarietäten verschiedene Metallelementmarkierungen aufweisen, und die verschiedenen Dublettvarietäten in demselben wäßrigen Medium oder in getrennten Teilen desselben enthalten sind.
Wenn eine Kontrollzielsequenz zu analysieren ist, umfaßt die Ausrüstung ferner: B. eine bekannte Menge einer bekannten Zielsequenz als Kontrolle, die in einem Teil des wäßrigen Mediums enthalten ist, der von dem die Komponente (A) enthaltenden wäßrigen Medium getrennt ist; und
C. zusätzliche schwach hybridisierte Nucleotiddubletts, wobei die zusätzlichen Dubletts aus (c) einer genetischen Probe für die bekannte Zielsequenz und (d) einem Homopolymermolekül bestehen, und die genetische Probe (c) mit einem markierten Mikrokügelchen verbunden ist, wobei das Mikrokügelchen mit einem Metallelement markiert ist, das von der Markierung der genetischen Probe (a) für die unbekannte Zielsequenz verschieden ist, und wobei die genetische Probe (c) in der Lage ist, unter den vorbestimmten Analysebedingungen mit der bekannten Zielsequenz stärker zu hybridisieren als mit dem Homopolymer (d).
Die Analyse der vorliegenden Erfindung ist von Vorteil, da sie rasch und problemlos und mit großer Meßempfindlichkeit durchgeführt werden kann. Da die Bindung an ein festes Substrat erfolgt, gehen keine Bindungsstellen für die Zielsequenz verloren. Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren fallen eine Reihe von Schritten weg, die im Stand der Technik erforderlich sind, beispielsweise das Zentrifugieren, und in den meisten Fällen auch das Waschen. Wenn Mikrokügelchen verwendet werden, ist der Nachweis aufgrund des Verstärkungsfaktors der zahlreichen in oder auf dem Mikrokügelchen getragenen Markierungen höchst empfindlich. Die Notwendigkeit, mit radioaktiven Materialien zu hantieren und diese zu entsorgen, kann wegfallen, wenn man eines der anderen Nachweisverfahren wählt, beispielsweise das bevorzugte Röntgenfluoreszenzverfahren. Dieses letztere Verfahren hat noch den weiteren Vorteil, daß die gleichzeitige Analyse mit einer Kontrolle und/oder die gleichzeitige Analyse einer Reihe verschiedener unbekannter Zielsequenzen möglich ist.
Beispiele für das neue Verfahren sind in den Figuren 1 und 2 dargestellt.
Fig. 1 zeigt die Komponenten in dem wäßrigen Medium in drei Analysestufen gemäß der oben als erstes beschriebenen Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens. Es wird davon ausgegangen, daß sich die Komponenten in einem wäßrigen Medium befinden (nicht dargestellt). Eine genetische Probe 1 mit einer Antisinnsequenz 2 bildet ein Dublett mit einem Reportermolekül 3. Das Reportermolekül 3 umfaßt eine Sinnsequenz 4, eine hybridisierbare Sequenz 5 und ein Mikrokügelchen 6 mit Markierungen (nicht dargestellt). In diesem Stadium befindet sich in dem Medium auch die an das feste Substrat 8 gebundene Homopolymersequenz 7. In Stufe B wird genetisches Material einschließlich der unbekannten Zielsequenz 9 mit der Sinnsequenz 10 eingebracht.
Im Anschluß an das Einbringen der Zielsequenz in Stufe B werden in Stufe C die entstehenden Komponenten in dem wäßrigen Medium dargestellt. Das Reportermolekül 3 hat sich von seinem zuvor gebildeten Dublett mit der Probe 1 dissoziiert, und das Homopolymer 7 bildet ein Dublett durch Hybridisieren mit der hybridisierbaren Sequenz 5 und einem Teil der Sinnsequenz 4 des Reportermoleküls 3, wodurch das Mikrokügelchen 6 am Ort des festen Substrats 8 angeordnet wird. Die Probe 1 hat sich von dem zuvor gebildeten Dublett mit dem Reportermolekül dissoziiert und bildet nun ein Dublett mit der Zielsequenz 9 durch Hybridisieren der Antisinnsequenz 2 der Probe 1 mit der Sinnsequenz 10 der Zielsequenz 9. Das Medium enthält ferner undissoziierte Dubletts aus Reportermolekül 3 und genetischer Probe 1.
Fig. 2 zeigt die oben beschriebene alternative Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens und gibt die Komponenten an, die in dem wäßrigen Medium (nicht dargestellt) in Stufe A, B und C vorhanden sind. Stufe A stellt das wäßrige Medium am Beginn der Analyse vor dem Einbringen des genetischen Materials dar. Das Medium enthält die genetische Probe 11 mit einer Antisinnsequenz 12 und einer hybridisierbaren Sequenz 13 sowie ein Mikrokügelchen 6, das Markierungen aufweist (nicht dargestellt). Das Homopolymer 7, das an das feste Substrat 8 gebunden ist, bildet ein Dublett mit der Probe 11 durch Hybridisieren mit der hybridisierbaren Sequenz 13 und einem Teil der Antisinnsequenz 12 der Probe 11. In Stufe B wird genetisches Material, welches die unbekannte Zielsequenz 9 mit der Sinnsequenz 10 enthält, in das Medium eingebracht. In Stufe C werden die Komponenten dargestellt, die nach dem Einbringen des genetischen Materials vorhanden sind. Die genetische Probe 11 hat sich von dem Homopolymer 7 dissoziiert und hat ein neues Dublett zwischen der Sinnsequenz 10 der Zielsequenz und der Antisinnsequenz 12 der genetischen Probe gebildet. Das Mikrokügelchen 6 wird dadurch zusammen mit dem Dublett von seinem Ort auf dem festen Substrat 8 des Homopolymers 7 weggetragen.
Zur Vereinfachung der Figuren ist von jeder Komponente in jeder Stufe jeweils nur eine dargestellt, obwohl natürlich normalerweise eine Vielzahl solcher Komponenten vorhanden wäre.
Die folgenden Beispiele dienen der Erläuterung der Erfindung, sollen diese aber nicht einschränken. In den Beispielen werden handelsübliche Desoxynucleotid-Homopolymere verwendet. Die Einzelheiten der Bindung der Homopolymere an die Substrate und der Bindung der Reportermoleküle an Latex wie zum Beispiel die Mikrokügelchen finden sich in dem oben erwähnten Text von Maniatis, et al., "Molecule Cloning". Virale und zelluläre myc- und ras-DNS-Klone sind im Handel erhältlich. Geeignete DNS-Fragmente werden in bekannter Weise hergestellt. Verschiedene Zellinien und Primärzellen, die bekanntlich unterschiedliche Mengen von myc- und ras- Sequenzen ausdrücken, können zu Testzwecken verwendet werden. Geeignete Onkogenproben für ras und myc sind im Handel erhältlich.
Die Schmelztemperatur (Tm) von DNS-Dubletts ist in vielen Fällen bekannt oder kann anhand folgender Formel errechnet werden:
Tm = 80ºC + 18,5 (log Konzentration Na Cl) + 58,4 (% CG-Paare) - ( 820 / Anzahl der Basenpaare)
Die Schmelztemperaturen der DNS-Dubletts betragen bekanntlich etwa:
Anzahl der Basenpaare Tm (ºC)
25 75
15 55
12 40
10 25

BEISPIEL I

Restriktionsfragmente von genetischem Material können auf das Vorhandensein und die Menge von ras- und myc-Onkogenen analysiert werden. Es wird ein wäßriges Medium bereitgestellt, in dem folgendes enthalten ist:
(1) Homopolymersequenzen von 20 C-Nucleotiden, die an ein Glassubstrat gebunden sind;
(2) Dubletts aus (a) einer genetischen Probe mit einer Antisinnsequenz für ras, wobei die Probe 25 Nucleotide besitzt, die mit (b) einem Reportermolekül hybridisiert sind, welches 8 G Nucleotide in einer hybridisierbaren Sequenz besitzt sowie eine Sinnsequenz mit 15 Nucleotiden bei einem GC/At-Verhältnis von 1, und zu den Nucleotiden der Antisinnsequenz der Probe komplementär ist; die Sinnsequenz des Reportermoleküls umfaßt 3 G Nucleotide, die neben der hybridisierbaren Sequenz liegen; das Reportermolekül ist an ein mit Cr-Atomen markiertes Mikrokügelchen gebunden;
(3) Dubletts, die die gleichen sind wie die von (2), bei denen aber die Antisinnsequenz der genetischen Probe für myc gilt und die Mikrokügelchen mit Ti- Atomen markiert sind.
Die Analyse wird bei etwa 50ºC durchgeführt. Da die Schmelztemperatur für 15 Basenpaare etwa 55ºC beträgt, bleiben die obigen Dubletts (2) und (3) in dem Medium als schwache Hybriden, die aus 15 Nucleotiden der Sinnsequenz des Reportermoleküls und einer gleichen Anzahl der Antisinnsequenz der genetischen Probe gebildet wurden. Das Hybrid von 15 Basenpaaren hat eine Schmelztemperatur knapp über der Analysetemperatur.
Ein Hybrid zwischen dem Reportermolekül und dem Homopolymer entsteht bei der Analysetemperatur nicht, weil nur 8 G- Nucleotide aus der hybridisierbaren Sequenz des Reportermoleküls für die Bildung von Basenpaaren mit dem Homopolymer zur Verfügung stehen, und weil ein Hybrid von 8 GC-Paaren eine Schmelztemperatur von 35ºC hat, also weit unter der Analysetemperatur.
Genetische Restriktionsfragmente einschließlich ras- und myc-Zielsequenzen werden in das wäßrige Medium eingebracht. Da die Antisinnsequenz der genetischen Probe 25 Nucleotide besitzt, dissoziieren die genetischen Proben von den schwach hybridisierten Probe-Reporter-Dubletts und bilden stärker hybridisierte Dubletts mit den ras- und myc-Zielsequenzen. Jedes dissoziierte Probe-Reporter-Dublett setzt ein Reportermolekül frei, das an ein Mikrokügelchen mit einer Markierung gebunden ist, die für die mit der Probe das anfänglichen Dubletts hybridisierte Zielsequenz spezifisch ist.
Die dissoziierten Reportermoleküle bilden Dubletts durch Hybridisierung, weil beim Freisetzen der genetischen Probe das Reportermolekül 8 G-Nucleotide in seiner hybridisierbaren Sequenz enthält und daneben noch 3 weitere G-Nucleotide in seiner Sinnsequenz, die nicht länger durch Hybridisierung mit der Probe blockiert sind, so daß insgesamt 11 G- Nucleotide für die Hybridisierung mit dem Homopolymer zur Verfügung stehen. Es entsteht ein Homopolymer-Reporter-Hybrid mit 11 GC-Paaren, und es besitzt eine Schmelztemperatur von etwa 63ºC, was höher ist als die Analysetemperatur.
Die Mikrokügelchen der Homopolymer-Reporter-Dubletts sind an dem Ort des Glassubstrats befestigt. Der Nachweis der Markierungen erfolgt mittels Röntgenfluoreszenz, wie oben beschrieben. Fluoreszenzsignale von Cr werden mit der Menge von ras in Korrelation gesetzt, und gleichzeitig erhält man Fluoreszenzsignale von Ti, die mit der Menge von myc in Korrelation gesetzt werden.

BEISPIEL 2

Es werden Restriktionsfragmente analysiert, wie in Beispiel 1 beschrieben. Ein wäßriges Medium wird bereitgestellt, in dem folgendes enthalten ist:
(i) Dubletts aus:
(a) einer Homopolymersequenz mit 20 C-Nucleotiden, die an einem Ende an ein Glassubstrat gebunden sind, wobei das Homopolymer mit (b) einer genetischen Probe hybridisiert ist, die eine hybridisierbare Sequenz aufweist, die 8 G-Nucleotide und eine aus 25 Nucleotiden bestehende Antisinnsequenz für ras enthält, wobei die Antisinnsequenz so gewählt ist, daß sie 3 G-Nucleotide enthält, die am Ende der hybridisierbaren Sequenz liegen; die genetische Probe ist an ein mit Cr-Atomen markiertes Mikrokügelchen gebunden;
(ii) Dubletts, die die gleichen sind wie die von (i), bei denen aber die Antisinnsequenz der genetischen Probe für myc gilt und die Mikrokügelchen mit Ti-Atomen markiert sind.
Die Menge von Mikrokügelchen von jedem Markierungstyp, die also am Ort des Substrats liegen, ist eine bekannte Standardmenge, oder die Menge wird mittels Röntgenfluoreszenz gemessen. Die Analysetemperatur beträgt 45ºC.
Jedes Homopolymer-Probe-Dublett wird aus insgesamt 11 GC- Paaren in der genetischen Probe hergestellt, die mit einer gleichen Anzahl von Nucleotiden in dem Homopolymer hybridisiert sind. Da die Schmelztemperatur für 11 GC-Paare 63ºC beträgt, was über der Analysetemperatur von 45ºC liegt, bleiben die Homopolymer-Probe-Dubletts (i) und (ii) als Hybride in dem Medium.
Genetische Restriktionsfragmente einschließlich ras- und myc-Zielsequenzen werden in das wäßrige Medium eingebracht. Da die Antisinnsequenz der genetischen Probe 25 Nucleotide besitzt, hybridisiert sie vorzugsweise mit der Zielsequenz, wobei die Zielsequenz dadurch die 3 G-Nucleotide der Antisinnsequenz blockiert, die neben der hybridisierbaren Sequenz der genetischen Probe liegen. Dadurch werden die zur Hybridisierung mit dem Homopolymer zur Verfügung stehenden G-Nucleotide der genetischen Probe auf 8 G-Nucleotide der hybridisierbaren Sequenz reduziert. Die Schmelztemperatur für ein Dublett aus 8 GC-Paaren beträgt etwa 35ºC, was unter der Analysetemperatur liegt. Daher wird die genetische Probe von dem Homopolymer freigesetzt, nimmt das markierte Mikrokügelchen mit und ist in dem Medium als Probe-Zielsequenz-Dublett vorhanden.
Die Markierungen der Mikrokügelchen der Homopolymer-Probe- Dubletts, die fest am Ort des Glassubstrats bleiben, werden mittels Röntgenfluoreszenz nachgewiesen, wie oben beschrieben. Die Abnahme der Fluoreszenzsignale von Cr wird mit der Menge von ras in Korrelation gesetzt, und die Abnahme der Fluoreszenzsignale von Ti wird gleichzeitig gemessen und mit der Menge von myc in Korrelation gesetzt.

Claims

1. Verfahren zur Analyse von Gensequenzen, umfassend die folgenden Schritte:

Beimischen in ein wäßriges Medium unter vorbestimmten Analysebedingungen (1) genetisches Material, welches eine zu analysierende Sequenz (Zielsequenz) enthält, und (2) schwach hybridisierte Nucleotiddubletts aus (i) einer genetischen Probe für die Zielsequenz, wobei die Zielsequenz eine charakteristische Sinnsequenz umfaßt, und die genetische Probe eine zu der charakteristischen Sinnsequenz der Zielsequenz komplementäre Antisinnsequenz umfaßt, und (ii) einem mit einem markierten Mikrokügelchen verbundenen Reportermolekül, wobei die genetische Probe in der Lage ist, unter den vorbestimmten Analysebedingungen mit der Zielsequenz stärker zu hybridisieren als mit dem Reportermolekül;

so daß Zielsequenzen mit genetischen Proben der Dubletts hybridisieren und dementsprechend Reportermoleküle von den Probe-Reporter-Dubletts dissoziieren;

Unterscheiden der dissoziierten Reportermoleküle von undissoziierten Probe-Reporter-Dubletts;

und Erfassen der Markierungen der Mikrokügelchen, die mit den differenzierten, dissoziierten Reportermolekülen verbunden sind.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Reportermolekül eine Sinnsequenz umfaßt, die kürzer ist als die Zielsequenz und zu dem Teil der Antisinnsequenz der genetischen Probe komplementär ist.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die anhand von Temperatur und pH-Wert ausgewählten Analysebedingungen so vorbestimmt sind, daß die genetische Probe ein schwach hybridisiertes Dublett mit dem Reportermolekül und ein stark hybridisiertes Dublett mit der Zielsequenz bildet.

4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Analyse bei einer Temperatur knapp unter der Schmelztemperatur des Dubletts aus der genetischen Probe und dem Reportermolekül durchgeführt wird.

5. Verfahren nach Anspruch 2, bei dem ferner in dem wäßrigen Medium eine Anzahl von Nucleotidpolymeren vorgesehen wird, die wahlweise mit dissoziierten Reportermolekülen hybridisieren, um die dissoziierten Reportermoleküle von undissoziierten Reportermolekülen zu unterscheiden.

6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Nucleotidpolymere nucleotidhaltige Homopolymermoleküle sind.

7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß das Reportermolekül eine hybridisierbare Sequenz umfaßt, die mit dem Homopolymer hybridisieren kann, und ferner eine Anzahl von Nucleotiden, die in der Lage sind, Basenpaare mit dem Homopolymer zu bilden, und in der hybridisierbaren Sequenz oder sowohl in der hybridisierbaren Sequenz als auch in der Sinnsequenz des Reportermoleküls enthalten sind.

8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Anzahl basenpaarbildender Nucleotide unter den vorbestimmten Analysebedingungen ausreichend ist, um ein Reporter-Homopolymer-Dublett zwischen der hybridisierbaren Sequenz und dem Homopolymer zu bilden, wenn das Reportermolekül von der genetischen Probe dissoziiert ist, und unter den Reaktionsbedingungen nicht ausreichend ist, um das Reporter-Homopolymer-Dublett zu bilden, wenn das Reportermolekül mit der genetischen Probe hybridisiert ist, weil einige der basenpaarbildenden Nucleotide von der genetischen Probe blockiert werden.

9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß die basenpaarbildenden Nucleotide sowohl in der hybridisierbaren Sequenz als auch in der Sinnsequenz des Reportermoleküls enthalten sind, und die basenpaarbildenden Nucleotide der Sinnsequenz neben der hybridisierbaren Sequenz liegen.

10. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Homopolymere mit einem festen Substrat verbunden sind, auf dem dissoziierte Reportermoleküle durch Bildung von Reporter-Homopolymer-Dubletts angesammelt werden.

11. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß jedes Homopolymermolekül mit einem magnetisch markierten Mikrokügelchen verbunden ist, daß dissoziierte markierte Reportermoleküle von undissoziierten Probe-Reporter- Dubletts unterschieden werden, indem Reporter-Homopolymer- Dubletts mit magnetischer Markierung gebildet werden und die Reporter-Homopolymer-Dubletts durch magnetische Anziehung an einem gewünschten Ort gesammelt werden, und indem die Markierungen der Mikrokügelchen erfaßt werden, die an dieser Stelle mit den Reportermolekülen verbunden sind.

12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß die Mikrokügelchen mit angefärbten Verbindungen markiert sind, nämlich mit Verbindungen, die unter UV-Bestrahlung fluoreszieren, mit radioaktiven Tracern oder mit Metallelementen oder -verbindungen, die mittels Röntgenfluoreszenz nachweisbar sind.

13. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß die Mikrokügelchen mit Metallelementen oder -verbindungen markiert sind, und daß die mit dissoziierten Reportersequenzen verbundenen markierten Mikrokügelchen durch Röntgenfluoreszenzanalyse nachgewiesen werden.

14. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß die Mikrokügelchen mit Metallelementen oder -verbindungen markiert sind, und daß die mit dissoziierten Reportermolekülen verbundenen markierten Mikrokügelchen mittels Röntgenfluoreszenzanalyse unter Verwendung einer Röntgenstrahlen- oder Elektronenquelle, mit der dissoziierte Reportermoleküle bestrahlt werden, die sich auf dem festen Substrat angesammelt haben, und unter Verwendung eines Röntgenfluoreszenzdetektors, der einen schmalen Raumwinkel betrachten kann, nachgewiesen werden, und daß die feste Lage der Homopolymere auf dem festen Substrat derart in bezug auf den Detektor und das wäßrige Medium ausgewählt wird, daß der Detektor im wesentlichen fluoreszierende Röntgenstrahlen betrachtet, die von den angesammelten dissoziierten Reportermolekülen ausgesandt werden, ohne dabei eine signifikante Anzahl von fluoreszierenden Röntgenstrahlen zu betrachten, die von undissoziierten Reportermolekülen in dem wäßrigen Medium ausgesandt werden.

15. Verfahren nach Anspruch 13 oder 14, ferner umfassend die folgenden Schritte: als Kontrolle in das wäßrige Medium Beimischen einer bekannten Menge einer bekannten Zielsequenz und zusätzlicher schwach hybridisierter Nucleotiddubletts, wobei die zusätzlichen Dubletts aus (iii) einer genetischen Probe für die bekannte Zielsequenz und (iv) einem mit einem markierten Mikrokügelchen verbundenen Reportermolekül bestehen, wobei das Mikrokügelchen mit einem von der Markierung des Reportermoleküls (ii) verschiedenen Metallelement markiert ist, und die genetische Probe (iii) in der Lage ist, unter den vorbestimmten Analysebedingungen mit der bekannten Zielsequenz stärker zu hybridisieren als mit dem Reportermolekül (iv);

gleichzeitig und getrennt voneinander Erfassen (A) der Markierungen der Mikrokügelchen, die mit Reportermolekülen (ii) verbunden sind, die von der genetischen Probe (i) für die unbekannte Zielsequenz dissoziiert wurden, und (B) der Markierungen der Mikrokügelchen, die mit Reportermolekülen (iv) verbunden sind, die von der genetischen Probe (iii) für die bekannte Zielsequenz dissoziiert wurden, anhand der Analyse der Röntgenfluoreszenzcharakteristik der verschiedenen Metallelemente;

und Eichen der Analyse der unbekannten Zielsequenzen anhand der Analyse der bekannten Zielsequenz.

16. Verfahren nach Anspruch 13, 14 oder 15, dadurch gekennzeichnet, daß das genetische Material verschiedene Arten von zu analysierenden Zielsequenzen umfaßt, und die verschiedenen Arten von Zielsequenzen analysiert werden, indem dem wäßrigen Medium verschiedene Varietäten von hybridisierten Nucleotiddubletts beigemischt werden, wobei jede der verschiedenen Dublettvarietäten aus (i) einer anderen Art von genetischer Probe besteht, wobei jede Art in der Lage ist, mit einer bestimmten der verschiedenen Arten von zu analysierenden Zielsequenzen zu hybridisieren, und (ii) aus einem Reportermoleküle besteht, das mit einem anders markierten Mikrokügelchen verbunden ist, wobei die Mikrokügelchen verschiedener Dublettvarietäten verschiedene Metallelementmarkierungen besitzen;

und indem gleichzeitig und getrennt voneinander die Markierungen der unterschiedlich markierten Mikrokügelchen anhand der Analyse der Röntgenfluoreszenzcharakteristik von jedem der verschiedenen Metallelemente erfaßt werden.

17. Verfahren zur Analyse von Gensequenzen, umfassend die folgenden Schritte:

Beimischen in ein wäßriges Medium unter vorbestimmten Analysebedingungen (I) genetisches Material, welches eine zu analysierende Sequenz (Zielsequenz) enthält, und (II) schwach hybridisierte Nucleotiddubletts aus (a) einer genetischen Probe für die Zielsequenz, wobei die genetische Probe mit einem markierten Mikrokügelchen verbunden ist, und (b) einem Homopolymermolekül, wobei die Zielsequenz eine charakteristische Sinnsequenz umfaßt, und die genetische Probe (1) eine zu der charakteristischen Sinnsequenz der Zielsequenz komplementäre Antisinnsequenz und (2) eine hybridisierbare Sequenz umfaßt, die mit dem Homopolymer hybridisieren kann, wobei die genetische Probe in der Lage ist, unter den vorbestimmten Analysebedingungen mit der Zielsequenz stärker zu hybridisieren als mit dem Homopolymer;

so daß die Zielsequenzen mit genetischen Proben der Probe- Homopolymer-Dubletts zu Ziel-Probe-Dubletts hybridisieren, und die von den genetischen Proben der entstandenen Ziel- Probe-Dubletts getragenen markierten Mikrokügelchen von den Homopolymeren dissoziiert werden;

Abtrennen der übrigen Probe-Homopolymer-Dubletts von den Ziel-Probe-Dubletts;

und Erfassen der Markierungen der markierten Mikrokügelchen in den übrigen Probe-Homopolymer-Dubletts, um die Abnahme von einer bestimmten Zahl von Markierungen in den anfangs vorgesehenen Probe-Homopolymer-Dubletts zu messen.

18. Verfahren nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß die Homopolymere der Probe-Homopolymer-Dubletts an einem festen Ort mit einem festen Substrat verbunden sind.

19. Verfahren nach Anspruch 17 oder 18, dadurch gekennzeichnet, daß eine Anzahl von Nucleotiden, die in der Lage sind, Basenpaare mit dem Homopolymer zu bilden, in der hybridisierbaren Sequenz oder sowohl in der hybridisierbaren Sequenz als auch in der Antisinnsequenz der genetischen Probe enthalten sind.

20. Verfahren nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß die Anzahl von basenpaarbildenden Nucleotiden unter den vorbestimmten Analysebedingungen für die genetische Probe und das Homopolymer des Proben-Homopolymer-Dubletts ausreicht, um in Abwesenheit der Zielsequenzen hybridisiert zu bleiben, und nicht ausreicht, um unter den Reaktionsbedingungen, in denen Zielsequenzen in dem wäßrigen Medium vorhanden sind, hybridisiert zu bleiben, weil einige der basenpaarbildenden Nucleotiden durch die Zielsequenz blokkiert werden.

21. Verfahren nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, daß die basenpaarbildenden Nucleotiden sowohl in der hybridisierbaren Sequenz als auch in der Antisinnsequenz der genetischen Probe enthalten sind, und daß die basenpaarbildenden Nucleotiden der Antisinnsequenz neben der hybridisierbaren Sequenz liegen.

22. Verfahren nach einem der Ansprüche 17 bis 21, dadurch gekennzeichnet, daß die anhand von Temperatur und pH- Wert ausgewählten Analysebedingungen so vorbestimmt sind, daß die genetische Probe ein schwach hybridisiertes Dublett mit dem Homopolymer und ein stark hybridisiertes Dublett mit der Zielsequenz bildet.

23. Verfahren nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, daß die Analyse bei einer Temperatur knapp unter der Schmelztemperatur des Dubletts aus genetischer Probe und Homopolymer durchgeführt wird.

24. Verfahren nach Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, daß nachdem zunächst die Abnahme der Anzahl von Markierungen von Probe-Homopolymer-Dubletts gemessen wurde, die Analysetemperatur auf eine Temperatur unter der Schmelztemperatur eines Dubletts gesenkt wird, das gebildet werden kann zwischen (a) den in der hybridisierbaren Sequenz der genetischen Probe enthaltenen basenpaarbildenden Nucleotiden und (b) dem Homopolymer, und die Markierungen der markierten Mikrokügelchen in Probe-Homopolymer-Dubletts erfaßt werden, um eine Zunahme der Anzahl von Markierungen gegenüber der Anzahl aus der ersten Messung zu messen.

25. Verfahren nach einem der Ansprüche 17 bis 24, dadurch gekennzeichnet, daß die Mikrokügelchen mit angefärbten Verbindungen markiert werden, nämlich mit Verbindungen, die unter UV-Bestrahlung fluoreszieren, mit radioaktiven Tracern oder mit Metallelementen oder -verbindungen, die mittels Röntgenfluoreszenz nachweisbar sind.

26. Verfahren nach Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, daß die Mikrokügelchen mit Metallelementen oder -verbindungen markiert werden, und die markierten Mikrokügelchen in den Probe-Homopolymer-Dubletts mittels Röntgenfluoreszenzanalyse nachgewiesen werden.

27. Verfahren nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, daß die Mikrokügelchen mit Metallelementen oder -verbindungen markiert werden, und die mit den Probe-Homopolymer-Dubletts verbundenen markierten Mikrokügelchen mittels Röntgenfluoreszenzanalyse nachgewiesen werden, wobei eine Röntgenstrahlen- oder Elektronenquelle zur Bestrahlung der auf dem festen Substrat angesammelten Probe-Homopolymer-Dubletts sowie ein Röntgenfluoreszenzdetektor verwendet werden, der einen schmalen Raumwinkel betrachten kann, und daß die feste Lage des festen Substrats in bezug auf den Detektor und das wäßrige Medium so ausgewählt wird, daß der Detektor im wesentlichen fluoreszierende Röntgenstrahlen betrachtet, die von den angesammelten Probe-Homopolymer-Dubletts ausgesandt werden, ohne eine signifikante Anzahl von fluoreszierenden Röntgenstrahlen zu betrachten, die von den Ziel-Probe-Dubletts in dem wäßrigen Medium ausgesandt werden.

28. Verfahren nach Anspruch 26 oder 27, ferner umfassend die folgenden Schritte: als Kontrolle in das wäßrige Medium Beimischen einer bekannten Menge einer bekannten Zielsequenz und zusätzlicher schwach hybridisierter Nucleotiddubletts, wobei die zusätzlichen Dubletts aus (c) einer genetischen Probe für die bekannte Zielsequenz und (d) einem Homopolymermolekül bestehen, wobei die genetische Probe (c) mit einem markierten Mikrokügelchen verbunden ist, und das Mikrokügelchen mit einem Metallelement markiert ist, das von der Markierung der genetischen Probe (a) für das unbekannte Ziel verschieden ist, und wobei die genetische Probe (c) unter den vorbestimmten Analysebedingungen mit der bekannten Zielsequenz stärker hybridisieren kann als mit dem Homopolymer (d);

gleichzeitig und getrennt voneinander Erfassen (I.) der Markierungen der markierten Mikrokügelchen in den übrigen Probe(a)-Homopolymer(b)-Dubletts und (II.) der Markierungen der markierten Mikrokügelchen in den übrigen Probe(c)-Homopolymer(d)-Dubletts anhand einer Analyse der Röntgenfluoreszenzcharakteristik der verschiedenen Metallelemente;

und Eichen der Analyse der Zielsequenzen anhand der Analyse der Kontrollprobe.

29. Verfahren nach Anspruch 26, 27 oder 28, dadurch gekennzeichnet, daß das genetische Material verschiedene Arten vön zu analysierenden Zielsequenzen umfaßt, und daß die verschiedenen Arten von Zielsequenzen dadurch analysiert werden, daß dem wäßrigen Medium verschiedene Varietäten von schwach hybridisierten Nucleotiddubletts beigemischt werden, wobei jede der verschiedenen Dublettvarietäten aus (a) einer anderen Art genetischer Probe besteht, wobei jede Art mit einer bestimmten der verschiedenen Arten von zu analysierenden Zielsequenzen hybridisieren kann, und jede Art genetischer Probe mit einem anders markierten Mikrokügelchen verbunden ist, und (b) aus einem Homopolymermolekül besteht, wobei die Mikrokügelchen der verschiedenen Dublettvarietäten unterschiedliche Metallelementmarkierungen besitzen;

und daß gleichzeitig und getrennt voneinander die Markierungen der unterschiedlich markierten Mikrokügelchen in den übrigen Probe-Homopolymer-Dubletts durch Analyse der Röntgenfluoreszenzcharakteristik von jedem der verschiedenen Metallelemente nachgewiesen werden.

30. Ausrüstung zur Durchführung des Verfahrens von Anspruch 1 zur Analyse von Gensequenzen in einem wäßrigen Medium, welches genetisches Material enthält, das eine zu analysierende genetische Zielsequenz umfaßt, wobei die Ausrüstung ein wäßriges Medium umfaßt, das in dem Medium oder in getrennten Teilen des Mediums die folgenden Komponenten enthält:

A. schwach hybridisierte Nucleotiddubletts aus (i) einer genetischen Probe für die Zielsequenz und (ii) einem Reportermolekül, das mit einem markierten Mikrokügelchen verbunden ist; und

B. eine Vielzahl von nucleotidhaltigen Homopolymeren, die in der Lage sind, wahlweise mit den Reportermolekülen (ii) zu hybridisieren, wenn die Reportermoleküle nicht mit den genetischen Proben (i) hybridisiert sind.

31. Ausrüstung nach Anspruch 30, dadurch gekennzeichnet, daß die Zielsequenz, genetische Probe, Reportermolekül, markierte Mikrokügelchen und Nucleotide enthaltenden Homopolymere der Definition nach einem der Ansprüche 2, 7 bis 9 oder 11 bis 13 entsprechen.

32. Ausrüstung nach Anspruch 30 oder 31, ferner umfassend ein festes Substrat, mit dem die Homopolymere verbunden sind.

33. Ausrüstung nach Anspruch 30, 31 oder 32 zur Analyse verschiedener Arten von Zielsequenzen, dadurch gekennzeichnet, daß die Komponente A. zusätzlich verschiedene Varietäten von hybridisierten Nucleotiddubletts enthält, wobei jede der verschiedenen Dublettvarietäten sich zusammensetzt aus (i) einer anderen Art genetischer Probe, wobei jede Art in der Lage ist, mit einer bestimmten der verschiedenen Arten von zu analysierenden Zielsequenzen zu hybridisieren, und (ii) einem Reportermolekül, das mit einem unterschiedlich markierten Mikrokügelchen verbunden ist, wobei die Mikrokügelchen der verschiedenen Dublettvarietäten unterschiedliche Metallelementmarkierungen besitzen, und die verschiedenen Dublettvarietäten in demselben wäßrigen Medium oder in getrennten Teilen desselben enthalten sind.

34. Ausrüstung nach einem der Ansprüche 30 bis 33, ferner umfassend:

C. eine bekannte Menge einer bekannten Zielsequenz als Kontrolle, die in einem Teil des wäßrigen Mediums enthalten ist, der von dem die Komponente A. enthaltenden wäßrigen Medium getrennt ist; und

D. zusätzliche schwach hybridisierte Nucleotiddubletts, wobei die zusätzlichen Dubletts aus (iii) einer genetischen Probe für die bekannte Zielsequenz und (iv) einem mit einem markierten Mikrokügelchen verbundenen Reportermolekül bestehen, wobei das Mikrokügelchen mit einem von der Markierung des Reportermoleküls (ii) verschiedenen Metallelement markiert ist, und die genetische Probe (iii) in der Lage ist, unter den vorbestimmten Analysebedingungen mit der bekannten Zielsequenz stärker zu hybridisieren als mit dem Reportermolekül (iv).

35. Ausrüstung zur Durchführung des Verfahrens von Anspruch 17 zur Analyse von Gensequenzen in einem wäßrigen Medium, welches genetisches Material enthält, das eine zu analysierende genetische Zielsequenz umfaßt, wobei die Ausrüstung ein die Komponente (A) enthaltendes wäßriges Medium umfaßt, das schwach hybridisierte Nucleotiddubletts aus (a) einer genetischen Probe für die Zielsequenz umfaßt, wobei die genetische Probe mit einem markierten Mikrokügelchen verbunden ist, und (b) einem Homopolymermolekül, wobei die genetische Probe in der Lage ist, unter den vorbestimmten Analysebedingungen stärker mit der Zielsequenz zu hybridisieren als mit dem Homopolymer.

36. Ausrüstung nach Anspruch 35, dadurch gekennzeichnet, daß die Zielsequenz, die genetische Probe, das markierte Mikrokügelchen und das Homopolymer der Definition nach einem der Ansprüche 19 bis 21, 25 oder 26 entsprechen.

37. Ausrüstung nach Anspruch 35 oder 36, ferner umfassend ein festes Substrat, mit dem die Homopolymere verbunden sind.

38. Ausrüstung nach Anspruch 35, 36 oder 37 zur Analyse verschiedener Arten von Zielsequenzen, dadurch gekennzeichnet, daß die Komponente (A) zusätzlich verschiedene Varietäten von hybridisierten Nucleotiddubletts enthält, wobei jede der verschiedenen Dublettvarietäten aus (a) einer anderen Art genetischer Probe besteht, wobei jede dieser Arten in der Lage ist, mit einer bestimmten der verschiedenen Arten von zu analysierenden Zielsequenzen zu hybridisieren, und jede Art von genetischer Probe mit einem anders markierten Mikrokügelchen verbunden ist, und (b) aus einem Homopolymermolekül besteht, wobei die Mikrokügelchen der verschiedenen Dublettvarietäten verschiedene Metallelementmarkierungen aufweisen, und die verschiedenen Dublettvarietäten in demselben wäßrigen Medium oder in getrennten Teilen desselben enthalten sind.

39. Ausrüstung nach einem der Ansprüche 35 bis 38, ferner umfassend:

B. eine bekannte Menge einer bekannten Zielsequenz als Kontrolle, die in einem Teil des wäßrigen Mediums enthalten ist, der von dem die Komponente (A) enthaltenden wäßrigen Medium getrennt ist; und

C. zusätzliche schwach hybridisierte Nucleotiddubletts, wobei die zusätzlichen Dubletts aus (c) einer genetischen Probe für die bekannte Zielsequenz und (d) einem Homopolymermolekül bestehen, und die genetische Probe (c) mit einem markierten Mikrokügelchen verbunden ist, wobei das Mikrokügelchen mit einem Metallelement markiert ist, das von der Markierung der genetischen Probe (a) für die unbekannte Zielsequenz verschieden ist, und wobei die genetische Probe (c) in der Lage ist, unter den vorbestimmten Analysebedingungen mit der bekannten Zielsequenz stärker zu hybridisieren als mit dem Homopolymer (d).