ES2215296T5

ES2215296T5 - Utilizacion de la resonancia magnetica nuclear de una dimension para identificar ligandos que se unen a biomoleculas blanco.

Info

Publication number: ES2215296T5
Application number: ES98918461T
Authority: ES
Inventors: Stephen W. Fesik; Philip J. Hajduk; Edward T. Olejniczak
Original assignee: Abbott Laboratories
Current assignee: Abbott Laboratories
Priority date: 1997-04-18
Filing date: 1998-04-17
Publication date: 2009-07-06
Anticipated expiration: 2018-04-17
Also published as: HK1027158A1; BG64326B1; HUP0003956A2; CN1252868A; HU228433B1; TW574502B; HUP0003956A3; NO995078L; US6043024A; KR20010006454A; BR9808079A; EP0975954A1; EP0975954B2; AU7138098A; BG103856A; CZ9903683A3; CO5060446A1; ES2215296T3; ZA982919B; DE69821475D1

Abstract

La invención se refiere a un procedimiento para identificar compuestos que se unen a moléculas blanco específicas. El procedimiento comprende los pasos de: a) producir un primer T2-o espectro de fotones filtrados o de difusión de un compuesto o una mezcla de compuestos químicos, B) exponer un producto o mezcla de productos químicos a la molécula blanco; c) generar un segundo T2- o espectro de fotón filtrado-difusión de un producto o una mezcla de productos químicos que han sido expuestos a moléculas blanco en el paso (b), y d) comparar los citados primeros y segundos T2- o espectros de protón filtrado-difusión para determinar las diferencias entre los citados primero y segundo espectros. Las diferencias identifican la presencia de uno o más compuestos que son ligandos que se han unido a la molécula blanco.

Description

Utilización de la resonancia magnética nuclear de una dimensión para identificar ligandos que se unen a biomoléculas blanco.

Campo técnico de la invención

La presente invención está relacionada con un método de rastreo de compuestos que se unen a biomoléculas diana utilizando espectroscopia de resonancia magnética nuclear (RMN) unidimensional.

Antecedentes de la invención

Una de las herramientas más poderosas para el descubrimiento de nuevas guías de fármacos es el rastreo al azar de bases de datos de productos químicos sintéticas y naturales para descubrir compuestos que se unen a una molécula diana concreta (es decir, la identificación de ligandos de esa diana). Utilizando este método, se pueden identificar ligandos por su capacidad para formar una asociación física con una molécula diana o por su capacidad para alterar una función de una molécula diana.

Cuando se pretende la unión física, típicamente se expone una molécula diana a uno o más compuestos de los que se sospecha que son ligandos y se realizan análisis para determinar si se forman complejos entre la molécula diana y uno o más de esos compuestos. Tales análisis, como es bien sabido en la técnica, someten a ensayo los cambios groseros en la molécula diana (v.g., cambios de tamaño, carga, movilidad) que indican la formación de complejos.

Cuando se miden los cambios funcionales, se establecen condiciones de análisis que permiten una medida de un evento biológico o químico relacionado con la molécula diana (v.g., reacción catalizada por enzima, activación de enzima mediada por un receptor). Para identificar una alteración, se determina la función de la molécula diana antes y después de la exposición a los compuestos de ensayo.

Los análisis físicos y funcionales existentes han sido utilizados con éxito para identificar nuevas guías de fármacos para su uso en el diseño de compuestos terapéuticos. Existen, sin embargo, limitaciones inherentes a esos análisis que comprometen su precisión, fiabilidad y eficacia.

Un defecto principal de los análisis existentes hace referencia al problema de los "falsos positivos". En un análisis funcional típico, un "falso positivo" es un compuesto que desencadena el análisis pero cuyo compuesto no es eficaz para lograr la respuesta deseada. En un análisis físico típico, un "falso positivo" es un compuesto que, por ejemplo, se ancla por si mismo a la diana pero no de manera específica (v.g., unión no específica). Los falsos positivos son particularmente prevalentes y problemáticos cuando se rastrean concentraciones superiores de supuestos ligandos debido a que muchos compuestos tienen efectos no específicos a esas concentraciones.

De una manera similar, los análisis existentes resultan importunados por el problema de los "falsos negativos", que se producen cuando un compuesto da una respuesta negativa en el análisis pero cuyo compuesto es realmente un ligando para la diana. Los falsos negativos se producen típicamente en análisis en los que se utilizan concentraciones de compuestos de ensayo que o bien son demasiado elevadas (produciendo toxicidad) o bien son demasiado bajas en relación con la constante de unión o disociación del compuesto a la diana.

Recientemente se ha demostrado que se pueden utilizar análisis espectrales N^{15}/H^{1} bidimensionales para identificar compuestos que se unen a una proteína diana, y este enfoque supera muchos de los problemas asociados con otros análisis existentes para la identificación de ligandos. No obstante, este enfoque requiere que la proteína esté marcada con N^{15}, soluble y tenga un buen comportamiento hasta concentraciones de 0,3 M o superiores. Además, sólo las proteínas que dan origen a mapas de correlación N^{15}/H^{1} analizables pueden ser utilizadas en este método, que, con la tecnología actual, limita el peso molecular de la proteína diana a menos de 40 kDa. Además, el método lleva tiempo, ya que los compuestos son sometidos a ensayo en combinaciones de 10, y, cuando se ha determinado que al menos uno de los compuestos de la mezcla es activo, cada compuesto debe ser sometido a ensayo individualmente en cuanto a la unión a la proteína diana.

Debido a los problemas inherentes a los métodos existentes, continúa existiendo la necesidad de proporcionar medios nuevos, rápidos, eficaces, exactos y fiables de rastreo de compuestos para identificar y diseñar ligandos que se unan específicamente a una diana concreta.

Breve resumen de la invención

En un aspecto, la presente invención proporciona un procedimiento, como se define en las reivindicaciones 1-8.

Una ventaja de la presente invención es la capacidad del procedimiento de la presente invención para determinar la unión de ligandos potenciales a una molécula diana no marcada de cualquier tamaño o composición, siempre que el tamaño de la diana sea suficientemente mayor que el ligando potencial con el fin de ocasionar cambios en sus velocidades de relajación o difusión tras la unión a la molécula diana.

Otra ventaja de la presente invención es la capacidad del procedimiento de la presente invención para determinar la unión incluso de ligandos que se unen débilmente a la molécula diana.

Una ventaja adicional del procedimiento de la presente invención es la capacidad del procedimiento para identificar un compuesto o compuestos activos en una mezcla de compuestos mediante comparación directa de los desplazamientos químicos en los diferentes espectros con los desplazamientos químicos conocidos de los compuestos de los que consta la mezcla en ausencia de la biomolécula diana.

En esta realización preferida, el procedimiento de determinación de la unión de un ligando se puede llevar a cabo en presencia de un segundo ligando unido. Según esta realización, la molécula diana está unida a ese segundo ligando antes de exponer esa diana a los compuestos de ensayo.

En este método se utiliza un procedimiento de rastreo espectroscópico de protón de filtrado T_{2} o filtrado por difusión como se ha mostrado antes para identificar un primer ligando y uno posterior que se unen a la molécula diana. Se forma un complejo de la molécula diana y dos o más ligandos y los datos estructurales se obtienen preferiblemente utilizando la espectroscopia de RMN o la cristalografía de rayos X. Esos datos estructurales se utilizan para determinar la orientación espacial de los ligandos entre sí y con respecto a la molécula diana.

Basándose en la orientación espacial, los ligandos son conectados para formar un ligando de elevada afinidad que es útil como ligando para la molécula diana concreta y es útil como fármaco farmacéuticamente activo potencial. La selección de un grupo conector apropiado se realiza manteniendo la orientación espacial de los ligandos entre sí y con respecto a la molécula diana basada en los principios del ángulo de enlace y la información de la longitud del enlace bien conocidos en la técnica de la química orgánica. El procedimiento de conexión o el esquema sintético para combinar al menos los dos ligandos para formar el ligando de elevada afinidad se realiza mediante procedimientos sintéticos bien conocidos y/o análisis retrosintético. El ligando de elevada afinidad puede ser preparado mediante cualquier método que produzca realmente el ligando final y no esté limitado a conectar simplemente los dos ligandos juntos a través de un grupo conector. Se puede utilizar cualquier síntesis lineal o método sintético convergente para formar el producto final. Una vez que se han encontrado al menos los dos ligandos que tienen afinidad por la molécula diana (preferiblemente una proteína), se diseña el ligando de elevada afinidad y se elaboran mediante métodos bien conocidos por los expertos en la técnica. Los ligandos se seleccionan de la reserva diversa de pequeñas moléculas que tienen diversos átomos y disposiciones moleculares, estereoquímica, etc. El factor limitante es que al menos los dos ligandos tienen cierta afinidad como ligando con al menos un sitio del polipéptido o la molécula diana. El procedimiento de rastreo descrito aquí, no obstante, puede identificar un único ligando o una pluralidad de ligandos que también pueden ser manipulados mediante los métodos de diseño de fármacos tradicionales para formar productos farmacéuticamente activos o pueden ser utilizados en el procedimiento de diseño de fármacos descrito aquí para conectar al menos dos ligandos para formar un ligando de elevada afinidad.

Así, el método de diseño molecular comprende un procedimiento como se define en la reivindicación 9.

La identificación de los radicales ligando subsiguientes se puede realizar en ausencia o presencia del primer ligando (v.g., la molécula diana puede ser unida al primer ligando antes de ser expuesta a los compuestos de ensayo para la identificación del segundo ligando).

En una realización preferida, la molécula diana utilizada en un procedimiento de rastreo o diseño es un polipéptido. La diana polipeptídica se produce preferiblemente de forma recombinante a partir de una célula huésped transformada con un vector de expresión que contenga un polinucleótido que codifique el polipéptido.

Breve descripción de los dibujos

En los dibujos que forman parte de la memoria:

La Fig. 1 muestra (A) un espectro de filtrado T_{2} del compuesto 1 en tampón acuoso, (B) un espectro de filtrado T_{2} del compuesto 1 en presencia de FKBP, (C) un espectro de filtrado T_{2} de FKBP, (D) un espectro diferencia obtenido restando (C) de (B), y (E) un espectro diferencia obtenido restando (D) de (A). Para todos los experimentos, el tiempo de bloqueo del giro del filtro T_{2} era de 200 ms, con un retraso del eco del giro de 1 ms, la concentración del compuesto 1 era de 100 \muM, la concentración de FKBP era de 50 \muM, y el tampón era PO_{4} 50 mM, NaCl 100 mM, pH 6,5 (95% de D2O).

La Fig. 2 muestra (A) un espectro de filtrado T_{2} de una mezcla de compuestos 1-9, (B) un espectro de filtrado T_{2} de una mezcla de compuestos 1-9 en presencia de FKBP, (C) un espectro de filtrado T_{2} de FKBP, (D) un espectro diferencia obtenido restando (C) de (B), (E) un espectro diferencia obtenido restando (D) de (A), y (F) un espectro de filtrado T_{2} de referencia del compuesto 1 solo. Para todos los experimentos, el tiempo de bloqueo del giro del filtro T_{2} era de 200 ms, con un retraso del eco del giro de 1 ms, la concentración de todos los compuestos químicos era de 100 \muM, la concentración de FKBP era de 50 \muM, y el tampón era PO_{4} 50 mM, NaCl 100 mM, pH 6,5 (95% de D2O).

La Fig. 3 muestra (A) un espectro de filtrado T_{2} de una mezcla de compuestos 2-9, (B) un espectro de filtrado T_{2} de una mezcla de compuestos 2-9 en presencia de FKBP, (C) un espectro de filtrado T_{2} de FKBP, (D) un espectro diferencia obtenido restando (C) de (B), y (E) un espectro diferencia obtenido restando (D) de (A). Para todos los experimentos, el tiempo de bloqueo del giro del filtro T_{2} era de 200 ms, con un retraso del eco del giro de 1 ms, la concentración de todos los compuestos químicos era de 100 \muM, la concentración de FKBP era de 50 \muM, y el tampón era PO_{4} 50 mM, NaCl 100 mM, pH 6,5 (95% de D2O).

La Fig. 4 muestra un espectro de filtrado por difusión del compuesto 1 en presencia de FKBP utilizando una fuerza de gradiente baja, (B) un espectro de filtrado por difusión del compuesto 1 en presencia de FKBP utilizando una fuerza de gradiente elevada, (C) un espectro diferencia obtenido restando (B) de (A), (D) un espectro de filtrado por difusión del compuesto 1 utilizando una fuerza de gradiente baja, y (E) un espectro diferencia obtenido restando (C) de (D). Para todos los experimentos, las fuerzas de gradiente bajas y elevadas se corresponden con 3 y 48 Gauss/cm, respectivamente. La fuerza de gradiente elevada era suficiente para eliminar la señal de HDO residual de la muestra. Se utilizó un tiempo de retraso de la difusión de 300 ms, la concentración de todos los compuestos químicos era de 100 \muM, la concentración de FKBP era de 50 \muM, y el tampón era PO_{4} 50 mM, NaCl 100 mM, pH 6,5 (95% de D2O).

La Fig. 5 muestra (A) un espectro de filtrado por difusión de una mezcla de compuestos 1-9 en presencia de FKBP utilizando una fuerza gradiente baja, (B) un espectro de filtrado por difusión de una mezcla de compuestos 1-9 en presencia de FKBP utilizando una fuerza de gradiente elevada, (C) un espectro diferencia obtenido restando (B) de (A), (D) un espectro de filtrado por difusión de una mezcla de compuestos 1-9 utilizando una fuerza de gradiente baja, (E) un espectro diferencia obtenido restando (C) de (D), y (F) un espectro de referencia del compuesto 1 solo. Para todos los experimentos, las fuerzas de gradiente bajas y elevadas se corresponden con 3 y 48 Gauss/cm, respectivamente. La fuerza de gradiente elevada era suficiente para eliminar la señal de HDO residual de la muestra. Se utilizó un tiempo de retraso de la difusión de 300 ms, la concentración de todos los compuestos químicos era de 100 \muM, la concentración de FKBP era de 50 \muM, y el tampón era PO_{4} 50 mM, NaCl 100 mM, pH 6,5 (95% de D2O).

La Fig. 6 muestra (A) un espectro de filtrado por difusión de una mezcla de compuestos 2-9 en presencia de FKBP utilizando una fuerza gradiente baja, (B) un espectro de filtrado por difusión de una mezcla de compuestos 2-9 en presencia de FKBP utilizando una fuerza de gradiente elevada, (C) un espectro diferencia obtenido restando (B) de (A), (D) un espectro de filtrado por difusión de una mezcla de compuestos 2-9 utilizando una fuerza de gradiente baja, y (E) un espectro diferencia obtenido restando (C) de (D). Para todos los experimentos, las fuerzas de gradiente bajas y elevadas se corresponden con 3 y 48 Gauss/cm, respectivamente. La fuerza de gradiente elevada era suficiente para eliminar la señal de HDO residual de la muestra. Se utilizó un tiempo de retraso de la difusión de 300 ms, la concentración de todos los compuestos químicos era de 100 \muM, la concentración de FKBP era de 50 \muM, y el tampón era PO_{4} 50 mM, NaCl 100 mM, pH 6,5 (95% de D2O).

Descripción detallada de la invención

La presente invención proporciona un método de rastreo rápido y eficaz para identificar ligandos que se unen a moléculas diana terapéuticas.

Los ligandos son identificados sometiendo a ensayo la unión de las moléculas a una molécula diana (v.g., una proteína, ácido nucleico, etc.) siguiendo, con una espectroscopia de resonancia magnética nuclear (RMN) los cambios de las velocidades o bien de relajación o bien de difusión de las resonancias del ligando tras la adición de la diana. La reserva de moléculas rastreadas puede ser seleccionada a partir de una colección de compuestos tales como los asequibles actualmente en la mayoría de las compañías farmacéuticas o laboratorios universitarios.

La información sobre las relaciones estructura/-actividad entre los ligandos identificados mediante semejante procedimiento puede ser utilizada para diseñar nuevos fármacos que sirvan como ligandos para la molécula diana. A modo de ejemplo, cuando se identifican dos o más ligandos para una molécula diana dada, se forma un complejo de esos ligandos y la molécula diana. La orientación espacial de los ligandos entre sí así como con respecto a la molécula diana se deriva de los datos estructurales. La orientación espacial define la distancia entre los sitios de unión de los dos ligandos y la orientación de cada ligando a esos sitios.

Utilizando esos datos de la orientación espacial, se conectan después los dos o más ligandos para formar un nuevo ligando. La conexión se completa de manera que se mantiene la orientación espacial de los ligandos entre sí y a la molécula diana.

Existen numerosas ventajas en el procedimiento de descubrimiento basado en la RMN 1D para la presente invención. Primero, debido a que el procedimiento de la presente invención identifica ligandos midiendo directamente la unión a la molécula diana, el problema del falso positivo se reduce significativamente.

Segundo el problema de los falsos negativos se reduce significativamente ya que el presente procedimiento puede identificar compuestos que se unen específicamente a la molécula diana con un amplio intervalo de constantes de disociación.

Tercero, utilizando la presente invención se elimina el requerimiento de proteínas marcadas con N^{15} de bajo peso molecular (<40 kDa) que sean estables a elevadas concentraciones, como requieren los métodos en los que se utiliza la espectroscopia de correlación N^{15}/H^{1}.

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Cuarto, la capacidad de identificar directamente los compuestos activos en una mezcla de compuestos mediante la comparación de los desplazamientos químicos conocidos reduce significativamente la cantidad de tiempo requerida para rastrear e identificar compuestos activos que se unan a la molécula diana.

Debido a que las señales de los ligandos potenciales son controladas para detectar la unión a la molécula diana, se pueden identificar dos o más ligandos que se unen simultáneamente a la molécula diana. La capacidad para identificar simultáneamente los sitios de unión de diferentes ligandos permite a un artesano experto 1) definir la unión cooperativa negativa y positiva entre ligandos y 2) diseñar nuevos fármacos conectando dos o más ligandos en un único compuesto a la vez que se mantiene una orientación apropiada de los ligandos entre sí y con respecto a sus sitios de unión.

En su aspecto principal, la presente invención proporciona un procedimiento de rastreo de compuestos para identificar la presencia de compuestos que son ligandos que se unen a una molécula diana específica. Ese procedimiento se define en la reivindicación 1.

Cuando en un procedimiento de la invención se rastrea más de un compuesto en la etapa (b) y cuando se observa una diferencia entre espectros, se puede identificar el compuesto activo por el conocimiento previo de los desplazamientos químicos de los compuestos de la mezcla en ausencia de la molécula diana. En ausencia de semejante información, se realizan etapas adicionales para identificar qué compuesto específico se está uniendo a la molécula diana. Aquellas etapas adicionales se definen en la reivindicación 2.

Se puede utilizar cualquier molécula diana en el procedimiento de la presente invención, siempre que la molécula diana sea suficientemente más grande que los compuestos de ensayo con el fin de causar grandes diferencias en las velocidades de relajación o difusión del compuesto de ensayo después de unirse a la molécula diana. Debido a la importancia de las proteínas en la química médica, una molécula diana preferida es un polipéptido. En una realización preferida, la molécula diana es un polipéptido de peso molecular superior a 5 kDa.

El procedimiento de rastreo de la presente invención comienza con la generación o adquisición de un espectro de protón unidimensional o bien de filtrado T_{2} o bien de filtrado por difusión del compuesto o la mezcla de compuestos. Los métodos para generar los espectros de protón unidimensionales de filtrado T_{2} o filtrado por difusión son bien conocidos en la técnica (ver, v.g., S. Meiboom y D.Gill, Rev. Sci. Instrum. 29:688 (1.958), S.J. Gibbs y C.S.Johnson, Jr J. Magn. Reson. 93:395-402 (1.991) y A.S. Altieri, y col. J. Am. Chem. Soc. 117:7566-7567 (1.995)).

Para facilitar la adquisición de los datos de RMN de un gran número de compuestos (v.g., una base de datos de compuestos orgánicos pequeños de origen sintético o natural), se emplea un intercambiador de muestras. Utilizando el intercambiador de muestras, se pueden manejar sin vigilancia un total de 60 muestras. Así, utilizando los parámetros de adquisición típicos (128 barridos por desintegración por inducción libre (fid), se pueden adquirir 100-120 espectros en un período de 24 horas.

Para facilitar el tratamiento de datos de RMN, se utilizan programas para transferir y tratar automáticamente los múltiples datos de RMN unidimensionales.

En la Fig. 1A se muestra un espectro de filtrado T_{2} unidimensional de una mezcla de compuestos. En la Fig. 2A se muestra un espectro de filtrado por difusión unidimensional representativo de una mezcla de compuestos.

Tras la adquisición del primer espectro, la molécula diana marcada es expuesta a uno o más compuestos de ensayo. Cuando se va a someter a ensayo más de un compuesto de ensayo simultáneamente, se prefiere utilizar una base de datos de compuestos tales como una pluralidad de pequeñas moléculas. Tales moléculas se disuelven típicamente en dimetilsulfóxido perdeuterado. El compuesto de la base de datos puede ser adquirido de vendedores o creado según las necesidades deseadas.

Los compuestos individuales pueden ser seleccionados entre otros basándose en el tamaño (peso molecular = 100-300) y en la diversidad molecular. Los compuestos de la colección pueden tener diferentes formas (v.g., anillos aromáticos planos, anillos alifáticos plegados, compuestos alifáticos de cadena lineal y ramificada con enlaces sencillos, dobles, o triples) y diversos grupos funcionales (v.g., ácidos carboxílicos, ésteres, éteres, aminas, aldehídos, cetonas, y diversos anillos heterocíclicos) para maximizar la posibilidad de descubrir compuestos que interaccionen con sitios de unión ampliamente diversos.

En el procedimiento de rastreo por RMN de la presente invención se utilizan concentraciones de ligando que oscilan de aproximadamente 0,05 a aproximadamente 1,0 mM. A estas concentraciones, los compuestos que son ácidos o alcalinos pueden cambiar significativamente el pH de las soluciones de proteínas tamponadas. Los desplazamientos químicos son sensibles a los cambios de pH así como las interacciones de unión directa, y por lo tanto se pueden observar cambios de desplazamiento químico "falsos positivos", que no son resultado de la unión del ligando sino de los cambios de pH. Por tanto es necesario asegurarse de que el pH de la solución tamponada no cambia tras la adición del ligando. Más abajo se expone un método para controlar el pH.

Los compuestos se almacenan a 263K en forma de soluciones de partida 1,0 y 0,1 M en dimetilsulfóxido (DMSO). Esto es necesario debido a la solubilidad limitada de los ligandos en solución acuosa. No es posible ajustar directamente el pH de la solución de DMSO. Además, el HCl y el NaOH forman sales insolubles en DMSO, de modo que se deben utilizar ácidos y bases alternativos. Se ha encontrado que el siguiente enfoque produce un pH estable.

Las soluciones de partida en DMSO 1,0 M se diluyen 1:10 en fosfato 50 mM, pH 7,0. Se mide el pH de esa solución de alícuota diluida. Si el pH de la alícuota no cambia (es decir, permanece a 7,0), se elabora una solución de trabajo diluyendo la solución de partida en DMSO 1:10 para elaborar una solución 0,1 M y esa solución se almacena.

Si el pH de la alícuota diluida es menor de 7,0, se añade etanolamina a la solución de partida en DMSO 1,0 M, después esa solución se diluye 1:10 con tampón fosfato para elaborar otra alícuota, y el pH de la alícuota se vuelve a verificar.

Si el pH de la alícuota diluida es mayor de 7,0, se añade ácido acético a la solución de partida en DMSO 1,0 M, esa solución de partida se diluye después 1:10 con tampón fosfato para elaborar otra alícuota, y se vuelve a verificar el pH de la alícuota.

La etanolamina y el ácido acético son solubles en DMSO, y se añaden los equivalentes apropiados para asegurarse de que tras la transferencia al tampón acuoso, el pH no cambia. El ajuste del pH es un procedimiento interactivo, repetido hasta que se obtiene el resultado deseado.

Obsérvese que este procedimiento se realiza en diluciones 1:10 de las soluciones de partida 1,0 M (ligando 100 mM) para asegurarse de que no se observan cambios de pH a las concentraciones inferiores utilizadas en los experimentos (0,1 a 10 mM) o en sistemas tampón diferentes/más débiles.

Tras la exposición de los compuestos de ensayo a la molécula diana, se genera un segundo espectro de filtrado T_{2} o por difusión unidimensional. Para el enfoque de filtrado T_{2}, el segundo espectro se genera de la misma manera mostrada antes. El primer y el segundo espectros se comparan después para determinar si hay cualquier diferencia entre los dos espectros. Las diferencias en los espectros de filtrado T_{2} unidimensionales indican que el ligando se está uniendo a la molécula diana. Esas diferencias se determinan utilizando procedimientos normalizados bien conocidos en la técnica. Para el método de filtrado por difusión, el segundo espectro se genera considerando las diferencias espectrales entre fuerzas de gradiente bajas y elevadas - seleccionando así aquellos compuestos cuyas velocidades de difusión son comparables con las observadas en ausencia de la molécula diana.

A modo de ejemplo, en la Fig. 1 se muestran comparaciones de los espectros de filtrado T_{2} unidimensionales antes y después de la exposición de diversas moléculas diana a una mezcla de compuestos de ensayo, y la posterior identificación de un compuesto activo. Una descripción detallada de cómo se realizaron estos estudios se puede encontrar más adelante en el Ejemplo 1.

También a modo de ejemplo, en la Fig. 2 se muestran comparaciones de los espectros de filtrado por difusión unidimensionales antes y después de la exposición de diversas moléculas diana a una mezcla de compuestos de ensayo, y la posterior identificación de un compuesto activo. Una descripción detallada de cómo se realizaron estos estudios se puede encontrar más adelante en el Ejemplo 2.

Para descubrir moléculas adicionales que se unen a la proteína, se seleccionan las moléculas para el ensayo basándose en las relaciones estructura/actividad del rastreo inicial y/o en la información estructural de las guías iniciales cuando se unía a la proteína. A modo de ejemplo, el rastreo inicial puede dar como resultado la identificación de ligandos, todos lo cuales contienen un anillo aromático. En la segunda tanda del rastreo se utilizarían otras moléculas aromáticas como compuestos de ensayo.

Debido a su importancia en la química médica, una molécula diana preferida para su uso en semejante procedimiento es un polipéptido. En una realización preferida, se puede realizar un procedimiento de detección de la unión de un ligando a la molécula diana en presencia de un segundo ligando. Según esta realización, la molécula diana se une a ese segundo ligando antes de ser expuesta a los compuestos de ensayo.

Las moléculas diana preferidas, los métodos para generar los espectros, y los métodos para comparar los espectros son los mismos mostrados antes.

La etapa inicial en el procedimiento de diseño es la identificación de dos o más ligandos que se unan a la molécula diana específica. La identificación de tales ligandos se realiza utilizando la espectroscopia de filtrado T_{2} o por difusión unidimensional como se ha mostrado antes.

Una vez que dos o más ligandos son identificados por unirse a la molécula diana en sitios diferentes, se forma un complejo entre la molécula diana y los ligandos. Cuando existen dos ligandos, el complejo es un complejo ternario. Se forman complejos cuaternarios y otros complejos cuando hay tres o más ligandos.

Los complejos se forman mezclando la molécula diana simultáneamente o sucesivamente con los diversos ligandos en circunstancias que permitan a esos ligandos unirse a la diana. Los métodos para determinar esas condiciones son bien conocidos en la técnica.

Una vez que se ha formado el complejo, se obtienen los datos estructurales. Se puede utilizar cualquier método para obtener datos estructurales. Tales métodos son bien conocidos en la técnica. Los métodos ejemplares y preferidos son la RMN y la cristalografía de rayos X.

Un análisis de los datos estructurales puede revelar la orientación espacial relativa de los ligandos entre sí así como la conformación de la molécula diana. Primero, la orientación espacial de cada ligando con respecto a la molécula diana permite la identificación de aquellas porciones del ligando directamente implicadas en la unión (es decir, aquellas porciones que interaccionan con el sitio de unión a la diana) y aquellas porciones de cada ligando que se proyectan a partir del sitio de unión y qué porciones pueden ser utilizadas en procedimientos de conexión posteriores.

Segundo, los datos de orientación espacial se utilizan para mapear las posiciones relativas de cada ligando entre sí. En otras palabras, se pueden calcular las distancias discretas entre los ligandos orientados espacialmente.

Tercero, los datos de orientación espacial también definen las relaciones tridimensionales entre los ligandos y la diana. Así, además de calcular las distancias absolutas entre ligandos, también se pueden determinar las orientaciones angulares de esos ligandos.

El conocimiento de las orientaciones espaciales de los ligandos y la diana se utiliza después para seleccionar conectores para conectar dos o más ligandos en una sola entidad que contiene todos los ligandos. El diseño de los conectores se basa en las distancias y la orientación angular necesarias para mantener cada porción de ligando de la entidad única en una orientación apropiada para la diana.

La conformación tridimensional de los conectores adecuados es bien conocida o es fácilmente averiguable por un experto normal en la técnica. Si bien es teóricamente posible conectar dos o más ligandos a lo largo de cualquier intervalo de distancia y proyección tridimensional, en la práctica se prefieren ciertas limitaciones de distancia y proyección. En una realización preferida, los ligandos están separados por una distancia de menos de aproximadamente 15 Angstroms (\ring{A}), más preferiblemente menos de aproximadamente 10 \ring{A} e, incluso más preferiblemente menos de aproximadamente 5 \ring{A}.

Una vez que se ha identificado un grupo conector adecuado, los ligandos se conectan con ese conector. Los métodos para conectar ligandos son bien conocidos en la técnica y dependen de la estructura química del ligando y del propio grupo conector. Los ligandos son conectados entre sí utilizando aquellas porciones del ligando que no están directamente implicadas en la unión a la molécula diana.

Los siguientes Ejemplos ilustran las realizaciones preferidas de la presente invención y no son limitantes de la memoria ni de las reivindicaciones en modo alguno.

Ejemplo 1 Rastreo de Compuestos utilizando la espectroscopia de filtrado T_{2} A. FKBP

Se preparó proteína de unión FK humana recombinante (FKBP) como describen Logan y col., J. Mol. Biol. 236:637-648 (1.994).

La secuencia de pulsos empleada para explotar los cambios de las velocidades de relajación transversales (T_{2}) de los ligandos potenciales en presencia de la molécula diana es la secuencia de Carr-Purcell-Meiboom-Gill (CPMG) como describen S. Meiboom y D. Gill, en Rev. Sci. Instrum, 29:688 (1.958).

La presente invención saca ventaja del hecho de que las grandes moléculas o complejos de moléculas que voltean lentamente en solución tendrán tiempos de relajación transversal (T_{2}) más cortos que una molécula pequeña que voltea rápidamente en solución. Esto es bien conocido en la técnica. La presente invención saca ventaja del hecho de que una pequeña molécula, que normalmente voltea rápidamente cuando está libre en solución, volteará más lentamente cuando se una a una molécula diana más grande. Así, las velocidades de relajación transversales (T_{2}) de la molécula pequeña cambiarán (disminuirán) cuando se unan a una molécula diana.

Esto se demuestra en la Fig. 1 para FKBP y el compuesto 1, que se une a FKBP con una afinidad de 200 \muM. En la Fig. 1A, se aplica una secuencia CPMG con un tiempo de bloqueo del giro de 200 ms al compuesto en ausencia de FKBP. Puesto que las velocidades de relajación transversal de las moléculas pequeñas libres en solución son generalmente del orden de segundos, se produce una relajación insignificante durante el tiempo de bloqueo del giro, y se observan las señales del ligando libre. En presencia de FKBP, sin embargo, las señales del ligando se reducen significativamente tras el tiempo de bloqueo del giro, y sólo los picos de la proteína residual y del ligando permanecen en el espectro, como se muestra en la Fig. 1B. Estas diferencias pueden ser detectadas o bien mediante inspección directa, o bien mediante un método de diferenciación espectral en el que el espectro de FKBP solo (tras el bloqueo del giro, Fig. 1C) se resta del espectro del compuesto en presencia de FKBP (también después del bloqueo del giro, Fig. 1B), dando como resultado el espectro mostrado en la Fig. 1D. Este espectro contiene en ese caso sólo los picos del ligando residual, que, si se desea, puede ser incluso reducido adicionalmente en intensidad mediante la aplicación de tiempos de bloqueo del giro más largos. Este espectro (Fig. 1D) es restado después del espectro del compuesto de ensayo solo (Fig. 1A), dando como resultado el espectro mostrado en la Fig. 1E. Los picos positivos del espectro diferencia corresponden a los desplazamientos químicos del compuesto en ausencia de la proteína diana, como se demuestra mediante la comparación de la Fig. 1A con la Fig. 1E, mientras los picos negativos corresponden a los desplazamientos químicos del compuesto cuando se une a FKBP. Esta información puede ser utilizada para identificar el compuesto activo.

Los mismos experimentos se pueden realizar sobre una mezcla de compuestos. En estos experimentos, los compuestos 2-9, que son conocidos por no unirse a FKBP, fueron combinados con el compuesto 1. La Fig. 2 muestra los espectros de filtrado T_{2} para la mezcla de compuestos en ausencia de FKBP (Fig. 2A), la presencia de FKBP (Fig. 2B), y para FKBP solo (Fig. 2C). El espectro de la Fig. 2D, obtenido restando la Fig. 2C de la Fig. 2B, contiene las resonancias de los ligandos en presencia de la proteína. El espectro de la Fig. 2E, obtenido restando la Fig. 2D de la Fig. 2A, contiene picos positivos que corresponden a las posiciones de las resonancias del compuesto 1 en ausencia de FKBP, como se demuestra en el espectro de referencia mostrado en la Fig. 2F. La información del desplazamiento químico contenida la Fig. 2E se utiliza no sólo para detectar la presencia de un ligando que se une a la proteína, sino que también puede ser utilizada para identificar qué compuesto de la mezcla de compuestos se está uniendo, siempre que semejante información del desplazamiento químico acerca de los ligandos libres sea conocida a priori.

La Fig. 3 muestra el mismo grupo de experimentos con una mezcla de compuestos 2-9 solamente, que no se unen a FKBP. Como se observa en la Fig. 3E, no se observan resonancias del ligando absortivo, positivas en el espectro diferencia, indicando que no se están uniendo ligandos a FKBP.

Ejemplo 2 Rastreo de compuestos utilizando la espectroscopia de filtrado por difusión A. FKBP

La secuencia de pulsos empleada para explotar los cambios en las velocidades de difusión de los ligandos potenciales en presencia de la molécula diana es la descrita por S.J. Gibbs y C.S. Johnson, Jr. J. Magn. Reson. 93:395-402 (1.991) y A.S. Altieri, y col. J. Am. Chem. Soc. 117:7566-7567 (1.995).

La presente invención saca ventaja del hecho de que las moléculas pequeñas difunden más rápidamente que las moléculas grandes en solución. Esto es bien sabido en la técnica. La presente invención saca ventaja del hecho de que una pequeña molécula, que normalmente difunde rápidamente cuando está libre en solución, difundirá más lentamente cuando se una a una molécula diana más grande. Así, las velocidades de difusión de la molécula más pequeña cambiarán (disminuirán) cuando se unan a una molécula diana.

La capacidad para detectar la unión del ligando utilizando filtros de difusión se demuestra para la unión de FKBP al compuesto 1, como se muestra en la Fig. 4. Primero, se obtienen los espectros de filtrado por difusión a fuerzas de gradientes débiles y fuertes sobre una muestra del compuesto 1 en presencia de FKBP (Fig. 4A y 4B, respectivamente). Estos espectros son restados después para producir el espectro mostrado en la Fig. 4C. Este espectro contiene resonancias del ligando residual del compuesto 1. Este espectro es restado después de un espectro de referencia del compuesto 1 solo (después de un gradiente débil, Fig. 4D), para rendir un espectro que contiene las resonancias del ligando que se une a la proteína (Fig. 4E). Como con el experimento de filtrado T_{2}, los picos positivos de la Fig. 4E corresponden a los desplazamientos químicos del ligando en ausencia de proteína, mientras los picos negativos corresponden a los desplaza-
mientos químicos cuando se unen a FKBP. Esta información puede ser utilizada para identificar el compuesto activo.

Los mismos experimentos se pueden realizar en una mezcla de compuestos. En estos experimentos, los compuestos 2-9, que se sabe que no se unen a FKBP, fueron combinados con el compuesto 1. Las Fig. 5 y 5B muestran espectros de la mezcla de compuestos en presencia de FKBP después de fuerzas de gradiente débiles y fuertes, respectivamente. La diferencia entre estos espectros produce un espectro (Fig. 5C). La sustracción de este espectro de un espectro de control de la mezcla de ligandos en ausencia de FKBP (después de un gradiente débil, Fig. 5D), rinde un espectro (Fig. 5E) que contiene las resonancias positivas en los desplazamientos químicos para el compuesto 1 en ausencia de FKBP (Fig. 5F). La información del desplazamiento químico contenida en la Fig. 5E se utiliza no sólo para detectar la presencia de un ligando que se une a la proteína, sino que también puede ser utilizada para identificar qué compuesto de la mezcla de compuestos se está uniendo, siempre que semejante información del desplazamiento químico acerca de los ligandos libres sea conocida a priori.

La Fig. 6 muestra el mismo grupo de experimentos con una mezcla de compuestos 2-9 solamente, que no se unen a FKBP. Como se observa en la Fig. 6E, no se observan resonancias del ligando positivas en el espectro diferencia, indicando que ningún ligando se está uniendo a FKBP.

Todos los espectros de RMN fueron registrados a 300 K en un espectrómetro AMX500 NMR. Todos los espectros fueron registrados con 256 barridos y una anchura de barrido de protón de 8333,3 Hz y una duración del pulso a 90 grados de protón de 7 \mus. Para los experimentos de filtrado T_{2}, el tiempo de bloqueo del giro era de 200 ms con un retraso del eco de giro de 1 ms. Para los espectros de filtrado en gradiente, las fuerzas de gradiente bajas y elevadas corresponden a 3 y 48 Gauss/cm, respectivamente, y se utilizó un tiempo de retraso de la difusión de 300 ms. En todos los experimentos, la concentración de cada ligando era de 100 \muM, la concentración de FKBP era de 50 \muM, y el tampón era PO_{4} 50 mM, NaCl 100 mM, pH 6,5 (95% de D2O). Los datos de RMN fueron tratados y analizados en ordenadores Silicon Graphics.

Los ejemplos anteriores no son limitantes y la presente invención también está dirigida a un procedimiento de diseño de un ligando de elevada afinidad que es la combinación conectada de al menos dos ligandos encontrados en el ejemplos presentado antes.

TABLA 1

1

Claims

1. Un procedimiento de rastreo de compuestos para identificar la presencia de compuestos que son ligandos que se unen a una molécula diana específica que comprende las etapas de:

a): generar un primer espectro de RMN de filtrado T_{2} o por difusión unidimensional de un compuesto o una mezcla de compuestos químicos;

b): exponer el compuesto o la mezcla de compuestos químicos a una molécula diana;

c): generar un segundo espectro de RMN de filtrado T_{2} o por difusión unidimensional de dicho compuesto o dicha mezcla de compuestos químicos cuando se expone a la molécula diana en la etapa (b); y

d): comparar dichos primer y segundo espectros de RMN de filtrado T_{2} o por difusión unidimensionales para determinar las diferencias entre dichos primer y segundo espectros de RMN, identificando las diferencias la presencia de uno o más compuestos entre dicho compuesto o dicha mezcla de compuestos químicos, respectivamente, que son ligandos que se han unido a la molécula diana.

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2. El procedimiento de la reivindicación 1, donde se utiliza una mezcla de compuestos químicos de (b), que comprende adicionalmente las etapas posteriores a la etapa (d) de

(e): generar un primer espectro de RMN de filtrado T_{2} o por difusión unidimensional de cada compuesto de la mezcla;

(f): exponer dicho compuesto de dicha mezcla individualmente a la molécula diana,

(g): generar un segundo espectro de RMN de filtrado T_{2} o por difusión unidimensional de cada compuesto cuando se expone a la molécula diana en la etapa (f); y

(h): comparar cada espectro de RMN generado en la etapa (g) con dicho primer espectro de RMN para determinar las diferencias en cualquiera de esos espectros de RMN comparados, identificando las diferencias la presencia de un compuesto que es un ligando que se ha unido a la molécula diana.

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3. El procedimiento de la reivindicación 1, que comprende adicionalmente la etapa de unir la molécula diana a un segundo ligando antes de la etapa (a).

4. El procedimiento de la reivindicación 1, donde los compuestos rastreados se seleccionan de una colección de compuestos de diversas moléculas pequeñas.

5. El procedimiento de la reivindicación 1, donde la molécula diana se selecciona entre los polipéptidos.

6. El procedimiento de la reivindicación 5, donde el polipéptido se selecciona entre una enzima o un receptor.

7. El procedimiento de la reivindicación 1, donde la molécula diana se selecciona entre los ácidos polinucleicos.

8. El procedimiento de la reivindicación 1, donde la molécula diana no está marcada.

9. Un procedimiento de diseño de un ligando de elevada afinidad a una molécula diana, que comprende

(a): identificar un primer ligando para la molécula diana utilizando la espectroscopia de RMN de filtrado T_{2} o por difusión unidimensional utilizando un procedimiento según la reivindicación 1;

(b): identificar uno o más ligandos adicionales para la molécula diana utilizando la espectroscopia de RMN de filtrado T_{2} o por difusión unidimensional;

(c): formar un complejo entre el primer ligando identificado y uno o más de los ligandos adicionales identificados con la molécula diana;

(d): determinar la estructura tridimensional de al menos esa porción del complejo donde el primero y uno o más ligandos adicionales se están uniendo a la molécula diana y, de ese modo, la orientación espacial del primer y uno o más ligandos adicionales sobre la molécula diana; y

(e): conectar el primer y uno o más ligandos adicionales para mantener la orientación espacial determinada en la etapa (d) para formar el ligando de alta afinidad.

10. Un procedimiento según la reivindicación 9, donde la molécula diana se selecciona entre los polipéptidos.

11. Un procedimiento según la reivindicación 9, donde la molécula diana no está marcada.

12. Un procedimiento según la reivindicación 9, donde el ligando y uno o más ligandos adicionales están conectados juntos por medio de una síntesis orgánica lineal o convergente para formar el ligando de alta afinidad.

13. Un procedimiento según la reivindicación 9, donde el ligando de alta afinidad es un radical farmacéuticamente activo.

14. Un procedimiento según la reivindicación 9, donde el primer y uno o más ligandos adicionales se seleccionan de una reserva de diversas moléculas pequeñas.

15. Un procedimiento según la reivindicación 14, donde las moléculas pequeñas se seleccionan entre una colección de compuestos.

16. Un procedimiento según la reivindicación 9, donde el complejo se forma combinando el primer y uno o más ligandos adicionales con la molécula diana en solución.

17. Un procedimiento según la reivindicación 16, donde el complejo formado en solución es similar o idéntico al complejo formado entre el ligando o uno o más ligandos adicionales en condiciones fisiológicas.

18. Un procedimiento según la reivindicación 1, que comprende adicionalmente las etapas de:

(e): utilizar dicha comparación para ayudar a la identificación de un compuesto químico que es un ligando para dicha molécula diana, y

(f): preparar dicho compuesto.

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19. Un procedimiento según la reivindicación 9, que comprende antes de la etapa (a) una etapa de selección de una molécula diana y después de la etapa (e) una etapa de preparación de un compuesto químico cuya estructura es aquella obtenida conectando dicho primer ligando y dichos ligandos identificados adicionales de tal manera que se mantenga la orientación espacial determinada en la etapa (d).

20. El procedimiento de la reivindicación 18 o la reivindicación 19, donde la molécula diana es un polipéptido.

21. El procedimiento de la reivindicación 20, donde dicho polipéptido tiene un peso molecular mayor de 5 kDa.