ES2299286B2 - Promotores y su uso. - Google Patents
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Abstract
Promotores y su uso.
Dos promotores, los promotores de acuF y de hsp,
comprenden las secuencias de nucleótidos de la SEC ID Nº: 1 y 2,
respectivamente.
Description
Promotores y su uso.
La invención se refiere a promotores y a su
uso.
Históricamente, el género Monascus se ha
usado mucho como aditivos alimentarios, en China y en países
asiáticos. El fermentado se obtiene como granos de color rojo
escarlata a púrpura que tienen la estructura de grano del arroz
original bien conservada. Además, tradicionalmente, al producto se
le atribuye un efecto potenciador de la salud. La aplicación de
Monascus en la fabricación del vino de arroz se debe a su
alto contenido de alfa-amilasa, que promueve la
conversión del almidón en glucosa. Ciertas investigaciones
científicas han confirmado los efectos farmacológicos de fermentados
de Monascus tales como monacolina K, mevinolina y similares.
También se ha confirmado el efecto conservante del fermentado de
Monascus.
Se han dirigido estudios en este campo a los
productos génicos de Monascus spp, siendo de un interés cada
vez mayor que la base de datos EST de Monascus pueda
proporcionar más información para la tecnología de ADN
recombinante.
Los inventores han investigado la base de datos
EST de Monascus de BCRC 38072 depositada en el Food Industry
Research and Development Institute. Se obtuvieron dos genes con
altas proporciones de expresión y se consideraron el gen de la
fosfoenolpiruvato carboxiquinasa (acuF) y el de la proteína de
choque térmico (hsp). Se examinaron las regiones cadena arriba de
los dos genes y se identificaron las dos regiones promotoras.
Entonces se consiguió la invención.
Por consiguiente, una realización de la
invención proporciona una molécula de ADN aislada que comprende una
secuencia de nucleótidos de la SEC ID Nº: 1 o una secuencia de
nucleótidos hibridable con la SEC ID Nº: 1 en condiciones
rigurosas. La molécula de ADN tiene actividad promotora.
También se proporciona un ADN recombinante que
incluye una región promotora y una región codificante. La región
promotora tiene la secuencia de nucleótidos de la SEC ID Nº: 1 o la
secuencia de nucleótidos hibridable con la SEC ID Nº: 1 en
condiciones rigurosas y la región codificante tiene una secuencia
de nucleótidos que codifica una proteína deseada.
Otra realización de la invención proporciona un
vector de expresión que comprende un promotor. El promotor tiene la
secuencia de nucleótidos de la SEC ID Nº: 1 o la secuencia de
nucleótidos hibridable con la SEC ID Nº: 1 en condiciones
rigurosas.
Otra realización de la invención proporciona una
molécula de ADN que comprende una secuencia de nucleótidos de la SEC
ID Nº: 2 o una secuencia de nucleótidos hibridable con la SEC ID
Nº: 2 en condiciones rigurosas. La molécula de ADN tiene actividad
promotora.
Además, otra realización de la invención
proporciona un ADN recombinante que comprende una región promotora
y una región codificante. La región promotora tiene la secuencia de
nucleótidos de la SEC ID Nº: 2 o la secuencia de nucleótidos
hibridable con la SEC ID Nº: 2 en condiciones rigurosas y la región
codificante tiene una secuencia de nucleótidos que codifica una
proteína deseada.
Además, otra realización de la invención
proporciona un vector de expresión que comprende un promotor que
tiene la secuencia de nucleótidos de la SEC ID Nº: 2 o la secuencia
de nucleótidos hibridable con la SEC ID Nº: 2 en condiciones
rigurosas.
Las realizaciones de la invención pueden
entenderse mejor y pueden ponerse de manifiesto otras ventajas
cuando se hace referencia a la siguiente descripción y a los dibujos
adjuntos, en los que:
La fig. 1 ilustra los procedimientos para una
realización de la región promotora de acuF.
La fig. 2 ilustra el vector recombinante de la
realización de la región promotora de acuF. La realización de la
región promotora de acuF se clonó en el vector pHygEGFP obteniéndose
el vector recombinante pMS-acuF.
Las figs. 3A y 3B ilustran la expresión de EGFP
después de la transformación de pMS-acuF. Fig. 3A:
campo brillante; fig. 3B: bajo un filtro fluorescente.
La fig. 4 ilustra los procedimientos para una
realización de la región promotora de Hsp.
La fig. 5 ilustra el vector recombinante de la
realización de la región promotora de Hsp. La realización de la
región promotora de Hsp se clonó en el vector pHygEGFP obteniéndose
pMS-hsp.
Las figs. 6A y 6B ilustran la expresión de EGFP
después de la transformación de pMS-hsp. Fig. 6A:
bajo un campo luminoso; Fig. 6B: bajo un filtro fluorescente.
La fig. 7 ilustra la electroforesis de los
productos de la PCR. Calle 1: marcador de 1 kb (escala de ADN
Bio-1kbT^{TM}); calles 2-5:
transformantes Nº 1-4; calle 6: BCRC 38072 de tipo
silvestre, (-) control; y calle 7: pHygEGFP, (+) control.
Se obtuvieron dos genes con altas proporciones
de expresión por medio de la investigación de la base de datos
Monascus EST de BCRC 38072 recogido en el Food Industry
Research and Development Institute y se consideraron el gen de la
fosfoenolpiruvato carboxiquinasa (acuF) y el gen de la proteína de
choque térmico (Hsp). Se propuso que los dos genes se regulan por
promotores fuertes situados cadena arriba, y los promotores pueden
usarse para la sobreexpresión de proteínas.
Se observó que Monascus BCRC 38072 tenía
las características de:
CYA, 25ºC, 7 días. Colonias de
25-26 mm de diámetro, micelio inicialmente blanco,
que se vuelve de color naranja rojizo claro y cambia a naranja
rojizo intenso.
MEA, 25ºC, 7 días. Colonias de 48 mm de
diámetro, de color naranja rojizo brillante que cambia a naranja
rojizo vivo.
G25N, 25ºC, 7 días. Colonias de
28-29 mm de diámetro, naranja rojizo intenso,
naranja amarillento intenso en los centros.
Aleurioconidios que se producen individualmente
u ocasionalmente en cadenas cortas, de forma obpiriforme a globosa,
10-13x8-10 \mum. Cleistotecio
globoso, 37-72 \mum de diámetro. Ascosporas
hialinas, elipsoides, 4,6-6,3 (-6,6) x
3,3-4,2 \mum.
De acuerdo con el sistema de clasificación de
Hawksworth & Pitt (1983), BCRC 38072 se identificó como:
BCRC 38072 está entre M. pilosus y M.
ruber.
1. BCRC 38072 es similar a M. pilosus en
el color de las colonias y en la velocidad de crecimiento.
2. BCRC 38072 es similar a M. ruber en la
morfología de las ascosporas.
BCRC 38072, M. ruber y M. pilosus
comparten una similitud de secuencia del 100% en fragmentos ITS de
ADNr y en el gen de la \beta-tubulina.
BCRC 38072 se denominó temporalmente Monascus
pilosus K. Sato de D. Hawksw. & Pitt.
La fosfoenolpiruvato carboxiquinasa (acuF) es
importante para la gluconeogénesis en animales y se expresa de
manera persistente y fuerte en células.
La gluconeogénesis en un animal incluye las
etapas de transferir piruvato a oxaloacetato por medio de la
piruvato carboxilasa, y la transferencia de oxaloacetato a
fosfoenolpiruvato por la fosfoenolpiruvato carboxiquinasa. Las
reacciones son como se indican a continuación.
La proteína del choque término (Hsp) es una
familia de proteínas con genes muy conservados y que está muy
extendida en procariotas y eucariotas. Esta familia de proteínas
incluye 4 subfamilias: Hsp 90 (83-90 kDa), Hsp 70
(66-78 KFa), Hsp 60 y familias de Hsp pequeñas
clasificadas por sus pesos moleculares. La sobreexpresión de estas
proteínas en un animal se induce por estímulos ambientales.
Los promotores de los genes acuF y Hsp se
compararon con una base de datos publicada por BLAST, y no se
encontró ninguna secuencia similar. Después se prepararon vectores
recombinantes por medio de la recombinación de promotores de acuF o
Hsp con pHygEGFP, que incluye Hph (higromicina B fosfotransferasa)
y la proteína de fusión de la proteína fluorescente verde potenciada
(EGFP). Se ha demostrado que los dos promotores tienen la actividad
de abrir genes cadena arriba por la observación de la expresión de
EGFP usando estos vectores recombinantes.
Por consiguiente, una realización de la
invención proporciona una molécula de ADN aislada que comprende una
secuencia de nucleótidos de la SEC ID Nº: 1 o una secuencia de
nucleótidos hibridable con la SEC ID Nº: 1 en condiciones
rigurosas. La secuencia de ADN tiene actividad promotora. La
molécula de ADN que tiene actividad promotora puede comprender de
aproximadamente 117 a aproximadamente 1116 nucleótidos contiguos de
la SEC ID Nº: 1, particularmente de aproximadamente 367 a
aproximadamente 1116 nucleótidos contiguos de la SEC ID Nº: 1, y más
particularmente de aproximadamente 517 a aproximadamente 1116
nucleótidos contiguos de la SEC ID Nº: 1. Además, la molécula de
ADN se obtiene a partir de bacterias u hongos, particularmente de
Monascus sp., más particularmente de Monascus pilosus,
Monascus ruber o Monascus purpureus. La molécula de ADN
puede donarse por ingeniería genética a partir de la secuencia
cadena arriba del codón de iniciación de la fosfoenolpiruvato
carboxiquinasa (acuF) en BCRC 38072 depositado en el Food Industry
Research and Development Institute. La modificación por ingeniería
genética incluye la construcción de una biblioteca génica,
hibridación de colonias, primer-walking o PCR
Además, será fácil para los especialistas en la técnica obtener la
secuencia de ADN o la región promotora sustancial por PCR,
hibridación y síntesis artificial de acuerdo con la secuencia de ADN
descrita en la invención. Las condiciones rigurosas para la
hibridación pueden encontrarse en el documento EP 1325959 A1 P7
[0036].
Otra realización de la invención proporciona un
ADN recombinante que comprende una región promotora y una región
codificante. La región promotora comprende la secuencia de
nucleótidos de la SEC ID Nº: 1 o la secuencia de nucleótidos
hibridable con la SEC ID Nº: 1 en condiciones rigurosas.
Particularmente, la región promotora comprende de aproximadamente
117 a aproximadamente 1116 nucleótidos contiguos de la SEC ID Nº: 1,
más particularmente de aproximadamente 367 a aproximadamente 1116
nucleótidos contiguos de la SEC ID Nº: 1, o incluso de
aproximadamente 517 a aproximadamente 1116 nucleótidos contiguos de
la SEC ID Nº: 1. La región promotora puede obtenerse a partir de
Monascus sp, particularmente a partir de Monascus pilosus,
Monascus ruber o Monascus purpureus, y puede clonarse por
ingeniería genética desde la secuencia cadena arriba del codón de
iniciación de la fosfoenolpiruvato carboxiquinasa (acuF) en BCRC
38072 depositado en el Food Industry Research and Development
Institute. La región codificante comprende una secuencia de
nucleótidos que codifica una proteína deseada. La proteína deseada
incluye enzimas tales como proteasa, poliquétido sintasa y lipasa;
factores de transcripción tales como activadores y ARN polimerasa;
y hormonas tales como insulina y factor de crecimiento.
Otra realización de la invención proporciona un
vector de expresión que comprende un promotor que tiene la
secuencia de nucleótidos de la SEC ID Nº: 1 o la secuencia de
nucleótidos hibridable con la SEC ID Nº: 1 en condiciones
rigurosas. El promotor es como se define en la región promotora de
la realización del ADN recombinante. El material para construir la
realización del vector de expresión incluye una secuencia de
molécula adecuada para la auto-amplificación en una
célula hospedadora o la integración en el cromosoma del hospedador,
tal como un plásmido, un fago o un virus. El vector de expresión
selectivamente incluye una secuencia de nucleótidos que codifica una
proteína deseada, y la proteína deseada incluye enzimas tales como
proteasa, poliquétido sintasa y lipasa; factores de transcripción
tales como un activador y la ARN polimerasa; y una hormona tal como
insulina y un factor de crecimiento.
Otro aspecto de la invención se refiere a un
sistema de expresión que comprende el vector de expresión definido,
y una célula hospedadora adecuada para expresar la proteína deseada.
El vector se utiliza para transformar la célula hospedadora por
transformación. La célula hospedadora puede ser cualquier célula
adecuada para expresar la proteína deseada. Las células hospedadoras
adecuadas incluyen bacterias, levaduras, células animales, células
de insectos, células vegetales u hongos filamentosos. Los hongos
filamentosos pueden ser Monascus sp., particularmente
Monascus pilosus, Monascus ruber, o Monascus
purpureus, más particularmente BCRC38072. La transformación
puede completarse aplicando un método de transformación para hongos
filamentosos que pertenecen al género Aspergillus usando el
sistema de hospedador-vector conocido habitual.
Véase el documento EP 1325959 A1 P5 [0022].
La invención también se refiere a un
transformante que comprende una secuencia de nucleótidos de a) la
SEC ID Nº: 1, b) de aproximadamente 117 a aproximadamente 1116
nucleótidos contiguos de la SEC ID Nº: 1, c) de aproximadamente 367
a aproximadamente 1116 nucleótidos contiguos de la SEC ID Nº: 1, o
d) de aproximadamente 517 a aproximadamente 1116 nucleótidos
contiguos de la SEC ID Nº: 1, o una secuencia de nucleótidos
hibridable con la secuencia de nucleótidos definida anteriormente
en condiciones rigurosas. El transformante además comprende una
secuencia de nucleótidos que codifica una proteína deseada.
La invención también se refiere a un método para
la expresión de una proteína. El método comprende cultivar una
realización de un transformante que incluye una secuencia de
nucleótidos que codifica una proteína deseada en un medio, producir
y acumular la proteína deseada procedente del transformante en el
medio y recoger la proteína deseada del medio.
Una realización de la invención proporciona una
molécula de ADN aislada que comprende una secuencia de nucleótidos
de la SEC ID Nº: 2 o una secuencia de nucleótidos hibridable con la
SEC ID Nº: 2 en condiciones rigurosas. La molécula de ADN tiene
actividad promotora. La molécula de ADN que tiene actividad
promotora puede comprender de aproximadamente 443 a aproximadamente
1478 nucleótidos contiguos de la SEC ID Nº: 2, particularmente de
aproximadamente 759 a aproximadamente 1478 nucleótidos contiguos de
la SEC ID Nº: 2, más particularmente de aproximadamente 982 a
aproximadamente 1478 nucleótidos contiguos de la SEC ID Nº: 2. La
molécula de ADN puede obtenerse a partir de bacterias u hongos,
particularmente a partir de Monascus sp., más
particularmente a partir de Monascus pilosus, Monascus ruber
o Monascus purpureus. El ADN se clonó por ingeniería
genética a partir de la secuencia cadena arriba del codón de
iniciación de la proteína de choque térmico (hsp) en BCRC38072
depositado en el Food Industry Research and Development Institute.
La ingeniería genética incluye la construcción de una biblioteca
génica, hibridación de colonias, shotgun y PCR. Además, los
especialistas en la técnica podrán obtener la secuencia de ADN o la
región promotora sustancial por PCR, hibridación y síntesis
artificial de acuerdo con la secuencia descrita en la invención.
Las condiciones rigurosas para la hibridación pueden encontrarse en
el documento EP 1325959 A1 P7 [0036].
Otro aspecto de la invención proporciona un ADN
recombinante que comprende una región promotora y una región
codificante. La región promotora comprende una secuencia de
nucleótidos de la SEC ID Nº: 2 o una secuencia de nucleótidos
hibridable con la SEC ID Nº: 2 en condiciones rigurosas.
Particularmente, la región promotora comprende de aproximadamente
443 a aproximadamente 1478 nucleótidos contiguos de la SEC ID Nº:
2, más particularmente de aproximadamente 759 a aproximadamente 1478
nucleótidos contiguos de la SEC ID Nº: 2, o incluso de
aproximadamente 982 a aproximadamente 1478 nucleótidos contiguos de
la SEC ID Nº: 2. La molécula de ADN puede obtenerse a partir de
bacterias u hongos, particularmente a partir de Monascus sp.,
más particularmente a partir de Monascus pilosus, Monascus
ruber o Monascus purpureus. El ADN se clonó por
ingeniería genética a partir de la secuencia cadena arriba del
codón de iniciación de la proteína de choque térmico (hsp) en
BCRC38072 depositado en el Food Industry Research and Development
Institute. La región codificante comprende una secuencia de
nucleótidos que codifica una proteína deseada. La proteína deseada
incluye enzimas tales como proteasa, poliquétido sintasa y lipasa;
factores de transcripción tales como activador y ARN polimerasa; y
hormonas tales como insulina y factor de crecimiento.
Otra realización de la invención proporciona un
vector de expresión que comprende un promotor que tiene la
secuencia de nucleótidos de la SEC ID Nº: 2 o la secuencia de
nucleótidos hibridable con la SEC ID Nº: 2 en condiciones rigurosas.
El promotor es como se define en la región promotora de la
realización del ADN recombinante. El material para construir la
realización del vector de expresión incluye una secuencia de
molécula adecuada para la auto-amplificación en una
célula hospedadora o la integración en el cromosoma del hospedador,
tal como un plásmido, un fago o un virus. El vector de expresión
selectivamente incluye una secuencia de nucleótidos que codifica una
proteína deseada, y la proteína deseada incluye enzimas tales como
proteasa, poliquétido sintasa y lipasa; factores de transcripción
tales como un activador y la ARN polimerasa; y una hormona tal como
insulina y un factor de
crecimiento.
crecimiento.
Otro aspecto de la invención se refiere a un
sistema de expresión que comprende el vector de expresión definido,
y una célula hospedadora adecuada para expresar la proteína deseada.
El vector de expresión se utiliza para transformar la célula
hospedadora por transformación. La célula hospedadora puede ser
cualquier célula adecuada para expresar la proteína deseada. Las
células hospedadoras adecuadas incluyen bacterias, levaduras,
células animales, células de insectos, células vegetales u hongos
filamentosos. Los hongos filamentosos pueden ser Monascus
sp., particularmente Monascus pilosus, Monascus
ruber o Monascus purpureus, más particularmente
BCRC38072. La transformación puede completarse aplicando un método
de transformación para hongos filamentosos que pertenecen al género
Aspergillus usando el sistema de
hospedador-vector conocido habitual. Véase el
documento EP 1325959 A1 P5
[0022].
[0022].
La invención también se refiere a un
transformante que comprende una secuencia de nucleótidos de a) la
SEC ID Nº: 2, b) de aproximadamente 443 a aproximadamente 1478
nucleótidos contiguos de la SEC ID Nº: 2, c) de aproximadamente 759
a aproximadamente 1478 nucleótidos contiguos de la SEC ID Nº: 2, d)
de aproximadamente 982 a aproximadamente 1478 nucleótidos contiguos
de la SEC ID Nº: 2, o una secuencia de nucleótidos hibridable con la
secuencia de nucleótidos definida anteriormente en condiciones
rigurosas. El transformante además comprende una secuencia de
nucleótidos que codifica una proteína deseada.
La invención también se refiere a un método para
la expresión de una proteína. El método comprende cultivar un
transformante que incluye una secuencia de nucleótidos que codifica
una proteína deseada en un medio, producir y acumular la proteína
deseada procedente del transformante en el medio y recoger la
proteína deseada del
medio.
medio.
En este documento se describen ejemplos
prácticos.
\newpage
Ejemplo
1
(1) Célula hospedadora: Monascus BCRC
38702 (Food Industry Research and Development Institute).
(2) Célula competente: células competentes E.
coli ECOS^{TM} DH5 \alpha (Yeastern Biotech Co., Ltd).
(3) Plásmido: pHygEGFP (BD Biosciences), vector
pGEM®-T Easy (PROMEGA).
(4) Medio:
a. Para E. coli: caldo LB (USB), agar
(USB).
b. Para Monascus sp. y Neurospora
crassa: PDA (DIFICO), PDB (DIFICO), medio de Vogel (véase *) y
top agar.
(5) Antibióticos: ampicilina, higromicina B
(SIGMA).
* Medio de Vogel.
1. Solución de oligoelementos: 5 g de ácido
cítrico \cdot H_{2}O, 5 g de ZnSO_{4} \cdot 7 H_{2}O, 1 g
de Fe(NH_{4})_{2}(SO_{4})_{2}
\cdot 6 H_{2}O, 250 mg de CuSO_{4} \cdot5 H_{2}O, 50 mg de
MnSO_{4} \cdot H_{2}O, 50 mg de H_{3}BO_{3}, 50 mg de
Na_{2}MoO_{4} \cdot 2 H_{2}O en 95 ml de ddH_{2}O. El
volumen final: 100 ml.
2. Solución de biotina: 5 mg de biotina (Sigma)
en 199 ml de etanol al 5%
3. Solución madre de sal de Vogel 50X: 150 g de
citrato Na_{3} \cdot 5 H_{2}O, 250 g de KH_{2}PO_{4}, 100
g de NH_{4}NO_{3}, 10 g de MgSO_{4} \cdot 7 H_{2}O, 5 g de
CaCl_{2} \cdot 2 H_{2}O (lentamente disuelto en 20 ml de
H_{2}O previamente) en 750 ml de ddH_{2}O, añadir 5 ml de
solución de oligoelementos y 5 ml de solución de biotina. El
volumen final: 1 litro. Después de la filtración y la
esterilización, la solución se almacena a temperatura ambiente.
4. Medio de Vogel modificado: glucosa al 1% en
sal de Vogel 1X.
Los procedimientos para el promotor de acuF son
como se muestran en la fig. 1. Se encontró un gen de alta expresión
Contig ID: MPTC00008457 en la base de datos EST de Monascus
BCRC 38072 en el Food Industry Research and Development Institute
(FIRDI) y se identificó como el gen de la fosfoenolpiruvato
carboxiquinasa (acuF). Se especuló que el gen estaba regulado por un
promotor fuerte. Después se diseñó una sonda de 465 pb de acuerdo
con la secuencia 5' terminal del gen acuF. La sonda de acuF se
amplificó por PCR a partir del cromosoma de Monascus. Después
de esto, el producto de PCR se unió al vector pGEM®-T Easy, y la
sonda de acuF se obtuvo por marcaje con DIG (digoxigenina). Se
realizó una hibridación de colonias usando la sonda en la biblioteca
de fósmidos de Monascus BRCR 38072, y se seleccionó el
fósmido que contenía el gen acuF. El fósmido mpf01014A4 se
secuenció por la técnica primer walking, y se localizó la supuesta
secuencia del promotor cadena arriba del gen acuF. La supuesta
secuencia del promotor de 1116 pb se secuenció satisfactoriamente y
después se comparó con la base de datos BLAST, pero no se encontró
ningún gen similar. La supuesta secuencia del promotor de acuF de
1116 pb se unió a pHygEGFP por sitios de restricción BglII y
KpnI y el plásmido resultante se denominó
pMS-a1 como se muestra en la fig. 2 (a la derecha).
pMS-a1 se usó para transformar Monascus y se
observó expresión de EGFP como se muestra en la fig. 3, siendo la
fig. 3A de campo brillante y siendo la fig. 3B con filtro
fluorescente. Los resultados confirmaron que el supuesto promotor
de acuF tiene actividad promotora. Debe indicarse que el
pMS-a1 utilizado para transformar E. coli
DH5\alpha se ha depositado como PTA-5687 en la
American Type Culture Collection el 10 de diciembre de 2003. Los
procedimientos se describen con detalle como se indica a
continuación.
continuación.
Se clonó la sonda de acuF por reacción en cadena
de la polimerasa (PCR) en BCRC38072.
Se diseñaron cebadores de acuerdo con la base de
datos EST de Monascus.
- Cebador de avance:
- 5'-TGTTAATAGGACCGCCCTGC-3' (SEC ID Nº: 3)
- Cebador inverso:
- 5'-AGTATGCGGTCAGAGCACC-3' (SEC ID Nº: 4)
\newpage
Las condiciones de reacción se indican a
continuación.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Después de la reacción, los fragmentos
amplificados se extrajeron con un volumen igual de fenol/cloroformo
(24/25) y se precipitaron con un décimo de volumen de acetato sódico
3 M y el doble de volumen de etanol al 100%. El ADN precipitado se
lavó con etanol al 70%, se centrifugó y se secó al aire. El
producto se disolvió en ddH_{2}O y se almacenó a -20ºC.
El producto de PCR de la sonda de acuF se
purificó y se recogió. El ADN se mezcló con el vector pGEM®-T Easy
en una relación de 3:1. Se añadieron 1 \mul de la ADN ligasa de T4
y 10 x tampón de unión y también se añadió una cantidad adecuada de
ddH_{2}O para constituir un volumen final de 10 \mul. La
reacción de unión se realizó a temperatura ambiente durante una
hora. Después de la unión, se añadieron 5\mul de producto de
unión a 100 \mul de células competentes E. coli ECOS^{TM}
DH5\alpha para la transformación. Se seleccionó el plásmido
recombinante de 3483 pb y se confirmo por PCR. Se obtuvo el
plásmido recombinante TA-acuF.
El gen del promotor de acuF se clonó por
reacción en cadena de la polimerasa (PCR) a partir del fósmido:
mpf01014A4.
A continuación se indican los cebadores y las
condiciones de reacción usadas.
- Cebador de avance:
- 5'-GAAGATCTCTCGTATGTTGTGTGGAATTGTGAGC-3' (SEC ID Nº: 6)
- Cebador inverso:
- 5'-ATGGTACCTGTTTCTGAGTGAGGTCGAGTG-3' (SEC ID Nº: 7)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
Después de la reacción, los fragmentos
amplificados se extrajeron por un volumen igual de fenol/cloroformo
(24/25) y se precipitaron por un décimo de volumen de acetalo sódico
3 M y el doble del volumen de etanol al 100%. El ADN precipitado se
lavó con etanol al 70%, se centrifugó y se seco al aire. El
producto se disolvió en ddH_{2}O y se almacenó a -20ºC.
El producto de PCR del promotor de acuF y el
vector de clonación pHygEGFP se digirieron por separado por
BglII y KpnI durante 4 horas. Los fragmentos
resultantes se separaron por electroforesis de ADN y extrajeron por
el kit de extracción de gel QIAquick®. El vector y el promotor de
acuF se mezclaron en una relación de 1:3 y se añadieron a
ddH_{2}O para conseguir un volumen final de 10 \mul. La unión
se realizó a 16ºC durante 4 horas. Después de la unión, se añadieron
5 \mul de la reacción a 100 \mul de células E. coli
competentes ECOS^{TM} DH5\alpha para la transformación. Se
seleccionó un plásmido con 6,1 kb y se confirmo por PCR. Se obtuvo
el plásmido recombinante pMS-a1.
Se cultivó solución de esporas de
Monascus en cultivo inclinado de PDA y se incubo a 30ºC
durante 5-7 días. Las esporas se limpiaron con agua
esterilizada y se filtraron por medio de un Miracloth esterilizado
de dos capas para retirar las hitas y el agar. Las esporas filtradas
se contaron con microscopia óptica por medio de un hemocitómetro.
Las esporas se recogieron con una concentración de 10^{7}
esporas/ml en 50 ml de medio de Vogel modificado y se incubaron a
30ºC con vibración a 200 rpm durante 16-18 horas.
Las esporas germinadas se filtraron por medio de un Miracloth de dos
capas y se lavaron con agua esterilizada. Las hifas se aclararon
con tampón de digestión
enzimática.
enzimática.
Las hifas en el Miracloth se lavaron por 10 ml
de tampón de digestión enzimática y se añadieron a 5 ml de mezcla
enzimática. La mezcla se agitó vorticialmente a temperatura ambiente
durante 30 minutos. La degradación de la pared celular se observó
con microscopia óptica cada 10 minutos durante la agitación
vorticial hasta que se liberaron protoplastos de un 90% de las
hifas. La mezcla se filtró con Miracloth de dos capas, y la
solución filtrada se centrifugó a 1500 rpm a 4ºC durante 15 minutos
para recoger los protoplastos. El sobrenadante se desechó y el
sedimento se lavó con tampón de digestión enzimática dos veces y
después con STC otras dos veces. Se añadieron 1,5 ml de STC, 20
\mul de DMSO y 0,4 ml de PTC en la solución y los protoplastos se
contaron bajo un microscopio. Los protoplastos se distribuyeron en
una concentración 10^{7} protoplastos/ml y se almacenaron a
-80ºC.
-80ºC.
Los protoplastos se lavaron con STC dos veces y
se centrifugaron a 1500 rpm a 4ºC durante 15 minutos. El
sobrenadante se desechó y el sedimento de protoplastos se resolvió
en 50 \mul de STC. Se añadieron 1-10 \mug de
ADN plasmídico a la solución. La electroporación se realizó en las
condiciones de 200 Ohms, 25 \muF, 0,7 KV. Después se añadió 1 ml
de tampón de regeneración a la mezcla y la mezcla se puso a 30ºC
durante una noche. A la mezcla se le añadieron 10 ml de top agar a
50ºC que contenía 30 \mug/ml de higromicina B, y la mezcla después
se vertió en top agar que contenía 30 \mug/ml de higromicina B.
Después de 3-5 días de cultivo a 30ºC, pueden
observarse los
transformantes.
transformantes.
(1) Se muestrearon algunas hitas y esporas de
los transformantes y se pusieron en un portaobjetos, se añadió una
gota de agua destilada y el portaobjetos se cubrió con un
cubreobjetos. Después, la muestra se observó por microscopia óptica.
Se observó la fluorescencia verde de las hifas y de las esporas con
un filtro GFP (Ex. 430-510 nm; Em.
475-575 nm).
(2) El transformante se cultivó en PDB (caldo de
patata-dextrosa) a 30ºC con una vibración de 200
rpm durante 5-10 días. El cultivo se homogeneizó y
se extrajo el ADN cromosómico. La PCR se realizó con un cebador
específico de HPH-EGFP y se obtuvo un producto de
1740 pb.
Para confirmar adicionalmente el fragmento más
pequeño del promotor de acuF (1116 pb) que tenía actividad
promotora, se prepararon productos de PCR que tenían fragmentos de
1000 pb, 750 pb, 600 pb y 500 pb del promotor de acuF a partir de
pMS-a1. A continuación se indican los cebadores para
la preparación de estos productos de
PCR.
PCR.
\newpage
\global\parskip0.900000\baselineskip
Los productos de PCR que tenían 1000 pb, 750 pb,
600 pb y 500 pb del promotor de acuF se clonaron en pMS y se
denominaron pMS-a2, pMS-a3,
pMS-a4 y pMS-a5. Estos plásmidos
después se utilizaron para transformar Monascus BCRC 38072 y
se seleccionaron por medio de una placa de PDA que contenía
Hyg^{r} a una concentración de 30 \mug/ml. Los resultados se
muestran a continuación.
El fragmento más pequeño que tenía actividad
promotora era de 600 pb. Pudo detectarse fluorescencia en el
transformante que contenía el fragmento de 600 pb.
Estos plásmidos también se utilizaron para
transformar Monascus pilosus BCRC 31527 y se seleccionaron
por placa con PDA que contenía Hyg^{r} a 50 \mu1/ml. Los
resultados se muestran como se indica a continuación.
\newpage
\global\parskip1.000000\baselineskip
El menor fragmento que tenía actividad promotora
tenía 600 pb. Pudo detectarse fluorescencia en el transformante que
contenía el fragmento de 600 pb.
Estos plásmidos también se utilizaron para
transformar Neurospora crassa BCRC 32685 y se seleccionaron
por placa con PDA que contenía Hyg^{r} a 50 \mug/ml. Los
resultados se muestran a continuación.
Los resultados también confirmaron que el
fragmento más pequeño que tenía actividad promotora tenía 600
pb.
Se confirmo que los fragmentos más pequeños del
promotor de acuF que tenían actividad promotora tenían 600 pb (SEC
ID Nº: 18) y podían expresarse en Monascus BCRC 38072,
Monascus pilosus BCRC3 1527 y Neurospora crassa
BCRC326.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
2
(1) Célula hospedadora: Monascus BCRC
38702 (Food Industry Research and Development Institute).
(2) Células competentes: células competentes
E. coli ECOS^{T}M DH5\alpha (Yeastern Biotech Co.,
Ltd).
(3) Plásmido: pHygEGFP (BD Biosciences), vector
pGEM®-T Easy (PROMEGA).
(4) Medio;
a. Para E. coli: caldo LB (USB), agar
(USB).
b. Para Monascus sp., y Neurospora
crassa: PDA (DIFICO), PDB (DIFICO), medio de Vogel (como se ha
indicado anteriormente) y top agar.
(5) Antibióticos: ampicilina, higromicina B
(SIGMA).
Los procedimientos para promotor de Hsp son como
se muestran en la fig. 4. Se encontró proteína de choque térmico
(Hsp) obtenida a partir de una biblioteca de ADNc de Monascus
BCRC 38072 con alta expresión después de una incubación de 3 días a
25ºC. Se diseñó una sonda para Hsp de acuerdo con el extremo 5' de
la secuencia del gen de Hsp y se amplificó a partir del cromosoma de
Monascus por PCR. El producto de PCR se unió al vector
pGEM®-T Easy, y la secuencia resultante se denominó
TA-Hsp. Ta-Hsp se marcó con DIG
(digoxigenina) y se amplificó por PCR para producir una sonda con
marcaje con DIG. La hibridación de colonias se realizó en una
biblioteca de fósmidos de Monascus BCRC 38072 usando la
sonda, y se encontró el fósmido que contenía Hsp. La secuencia del
gen Hsp y la región 5' se localizaron a partir de la secuencia
resultante del fósmido usando la técnica shotgun. Se diseñaron
cebadores a partir de la región 5' del gen Hsp. Se amplificó una
región de 1478 pb a partir del cromosoma de Monascus por
PCR. La región de 1478 pb se digirió en los sitios de restricción
BglII y XhoI y se unió a un vector comercializado
pHygEGFP. El plásmido resultante se denominó
pMS-hsp como se muestra en la fig. 5. (a la
derecha). El vector pMS-hsp se utilizó para
transformar Monascus BCRC 38072 y los transformantes se
seleccionaron por higromicina B. La observación de la expresión de
EGFP en los transformantes obtenidos con microscopia fluorescente
indica que la región de 1478 pb tiene actividad promotora como se
muestra en la fig. 6. La fig. 6A está bajo un campo luminoso y la
fig. 6B está bajo un filtro fluorescente. El ADN cromosómico del
transformante de Monascus BCRC38072 se extrajo por el kit
QIAGEN DNeasy® Plant y se usó como plantilla para la reacción de
PCR con cebadores específicos de HPH-EGFP. Se obtuvo
un producto de PCR de 1740 pb como se muestra en la fig. 7. La
calle 1 indica un marcador de 1 kb (escala de ADN
Bio-1Kb^{TM}), las calles 2-5 los
transformantes Nº 1-4, la calle 6 BCRC 38072 de tipo
silvestre, (-) control, y la calle 7 pHygEGFP, (+) control. Debe
indicarse que pMS-hsp utilizado para transformar
E. coli DH5\alpha se ha depositado como
PTA-5688 en la American Type Culture Collection el
10 de diciembre de 2003. Los procedimientos se describen con
detalle como se indica a continuación.
Se clonó la sonda de Hsp por reacción en cadena
de la polimerasa (PCR) a partir de Monascus BCRC38072.
Se diseñaron cebadores de acuerdo con la base de
datos de Monascus EST.
- Cebador de avance:
- mptc3161-A: 5'-GCTTATCTCCAATGCCTCCG-3' (SEC ID Nº: 8)
- Cebador inverso:
- mptc3161-B: 5'-CAAGGTCTCGCTCGTTAC-3' (SEC ID Nº: 9)
Más adelante de indica la condición de
reacción:
Después de la reacción, los fragmentos
amplificados se extrajeron por volúmenes iguales de
fenol/cloroformo (24/25) y se precipitaron por un décimo de volumen
de acetato sódico 3 M y el doble del volumen de etanol al 100%. El
ADN precipitado se lavó con etanol al 70%, se centrifugó y se secó
al aire. El producto se disolvió en ddH_{2}O y se almacenó a
-20ºC.
El producto de PCR de la sonda de Hsp se
purificó y recogió. El ADN se mezcló con el vector pGEM®-T Easy en
una relación de 3:1. Se añadieron 1 \mul de ADN ligasa de T4 y 10
x tampón de unión y se añadió una cantidad adecuada de ddH_{2}O
para producir un volumen final de 10 \mul. La reacción de unión
se realizó a temperatura ambiente durante 1 hora. Después de la
unión, se añadieron 5 \mul de producto de unión a 100 \mul de
células E. coli competentes ECOS^{TM} DH5\alpha para la
transformación. Se seleccionó un plásmido recombinante de 3482 pb y
se confirmó por PCR. Se obtuvo el plásmido recombinante
TA-Hsp.
Se diseñaron cebadores del promotor de Hsp a
partir de la base de datos EST de Monascus, y el gen
promotor de Hsp se clon por reacción en cadena de la polimerasa
(PCR) a partir de BCRC 38072.
A continuación se indican los cebadores y las
condiciones de reacción usadas.
- Cebador de avance:
- Mps17-9259-F: 5'-AGTGGCAGCCAACCCTCACC-3' (SEC ID Nº: 11)
- Cebador inverso:
- Mps17-7782-R: 5'-CGGGCTGATAGAGCAGATAGATAGATG-3' (SEC ID Nº: 12)
Después de la reacción, los fragmentos
amplificados se extrajeron por volúmenes iguales de
fenol/cloroformo (24/25) y se precipitaron por un décimo de volumen
de acetato sódico 3 M y el doble del volumen de etanol al 100%. El
ADN precipitado se lavó con etanol al 70%, se centrifugó y se secó
al aire. El producto se disolvió en ddH_{2}O y se almacenó a
-20ºC.
El producto de PCR del promotor de Hsp y el
vector de clonación pHygEGFP se digirieron por separado por
BglII y XhoI durante 16 horas. Los fragmentos
resultantes se separaron por electroforesis de ADN y se extrajeron
por el kit de extracción de gel QIAquick®. El vector y el promotor
de Hsp se mezclaron en una relación de 1:3, y se añadió ddH_{2}O
para conseguir un volumen final de 10 \mul. La unión se realizó a
16ºC durante 16 horas. Después de la unión se añadieron 5 \mul de
la reacción a 100 \mul de células E. coli competentes
ECOS^{TM} DH5\alpha para la transformación. Se seleccionó el
plásmido con 6215 pb y se confirmo por PCR. Se obtuvo el plásmido
recombinante pMS-hsp.
Se cultivó en placas una solución de esporas de
Monascus en un cultivo inclinado de PDA y se incubó a 30ºC
durante 5-7 días. Las esporas se limpiaron con agua
esterilizada y se filtraron por medio de un Miracloth esterilizado
de dos capas para retirar las hitas y el agar. Las esporas filtradas
se contaron con microscopia óptica por medio de un hemocitómetro.
Las esporas se recogieron en una concentración de 10^{7}
esporas/ml en 50 ml de medio de Vogel modificado y se incubaron a
30ºC con una vibración de 200 rpm durante 16-18
horas. Las esporas germinadas se filtraron por medio de un
Miracloth de 2 capas y se lavaron con agua esterilizada. Las esporas
germinadas se aclararon con tampón de digestión enzimática.
Las hifas en el Miracloth se lavaron con 10 ml
de tampón de digestión enzimática y se añadieron a 5 ml de mezcla
enzimática. La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 30
minutos. Se observó la degradación de la pared celular con
microscopia óptica cada 10 minutos de agitación hasta que se
liberaron el 90% de los protoplastos de las hifas. La mezcla se
filtró con un Miracloth de dos capas y la solución filtrada se
centrifugó a 1500 rpm a 4ºC durante 15 minutos para recoger los
protoplastos. El sobrenadante se desechó y el sedimento se lavó con
tampón de digestión enzimática dos veces y después con STC dos
veces. Se añadieron 1,5 ml de STC, 20 \mul de DMSO y 0,4 ml de
PTC a la solución y los protoplastos se contaron con un microscopio.
Los protoplastos se distribuyeron en una concentración de 10^{7}
protoplastos/ml y se almacenaron a -80ºC.
Los protoplastos se lavaron con STC dos veces y
se centrifugaron a 1500 rpm a 4ºC durante 15 minutos. El
sobrenadante se desechó y el sedimento de protoplastos se resolvió
en 50 \mul de STC. Se añadió 1-10 \mug de ADN
plasmídico a la solución. La electrotransformación se realizó en las
condiciones de 200 Ohms, 25 \muF, 0,7 KV. Después se añadió 1 ml
de tampón de regeneración a la mezcla y la mezcla se puso a 30ºC
durante una noche. Se añadieron 10 ml de top agar a 50ºC que
contenía 30 \mug/ml de higromicina B y la mezcla después se
vertió en un top agar que contenía 30 \mum/ml de higromicina B.
Después de 3-5 días de cultivo a 30ºC, se observaron
los transformantes.
(1) Algunas hifas y esporas de los
transformantes se muestrearon y se pusieron en un portaobjetos, se
añadió una gota de agua destilada, se cubrieron con un cubreobjetos
y se observaron con microscopia óptica. Se observó la fluorescencia
verde de las hifas y las esporas con un filtro GFG (Ex.
430-510 nm; Em. 475-575 nm).
(2) El transformante se cultivó en PDB (caldo de
patata-dextrosa) a 30ºC con 200 rpm de vibración
durante 5-10 días. El cultivo se homogeneizó y se
extrajo el ADN cromosómico. La PCR se realizó con cebadores
específicos de HPH-EGFP y se obtuvo un producto de
1740 pb.
Para confirmar adicionalmente el fragmento más
pequeño del promotor de Hsp (1478 pb) que tenía actividad
promotora, se prepararon productos de PCR que tenían fragmentos de
1036 pb, 720 pb y 467 pb del promotor de Hsp a partir de
pMS-Hsp. A continuación se indican los cebadores
para la preparación de estos productos de PCR.
Los productos de PCR que tenían fragmentos de
1478 pb, 1036 pb 720 pb y 497 pb del promotor de Hsp se clonaron en
vectores de expresión y los vectores de expresión después se
utilizaron para transformar Monascus BCRC 38072 y se
seleccionaron por placas de PDA que contenían Hygr a una
concentración de 30 \mug/ml. Los resultados se muestran a
continuación.
El fragmento más pequeño que tenía actividad
promotora era de 497 pb. La fluorescencia pudo detectarse en el
transformarte que contenía el fragmento de 497 pb.
Estos plásmidos también se utilizaron para
transformar Monascus pilosus BCRC 31527 y Neurospora
crassa BCRC 32685 y se seleccionaron por placas de PDA que
contenían Hyg^{r} a 50 \mug/ml o 200 \mug/ml. Los resultados
se muestran como se indica a continuación.
Los fragmentos más pequeños del promotor de Hsp
que tenían actividad promotora, según se confirmó, eran de 497 pb
(SEC ID Nº: 24) y podían expresarse en Monascus BCRC 38072,
Monascus pilosus BCRC31527 y Neurospora crassa
BCRC326.
Las realizaciones del vector de expresión pueden
obtenerse por amplificación por PCR y unión de la realización de la
secuencia promotora con un gen marcador en una región cadena abajo
del mismo. El gen marcador puede ser, por ejemplo, un gen de
resistencia a higromicina o hyg-GFP, y el vector de
expresión después se construye como un marcador para la
investigación de la transformación, por ejemplo, para la estimación
de la eficacia de clonación del gen.
Las realizaciones de la secuencia del promotor
también pueden unirse con un gen marcador y un gen diana deseado en
una región cadena abajo del mismo para la detección in vivo o
in situ de una reacción con proteínas o sitios activos en la
proteína diana.
En las realizaciones del sistema de expresión,
los transformantes, y el método para la expresión de proteínas en la
invención, el promotor puede unirse a un gen enzimático deseado tal
como proteasa, amilasa, quitinasa, fitasa o glucoamilasa en una
región cadena abajo del mismo. Usando este sistema, puede acortarse
el tiempo de producción de estos enzimas y puede aumentarse en gran
medida la velocidad de producción. Por ejemplo, la mayor velocidad
de producción de la proteasa de Monascus mejora la eficacia
de la soja como medio de cultivo, y el coste puede reducirse.
Además, la mayor velocidad de producción de la amilasa de
Monascus mejora la sacarificación de Monascus durante
la fabricación del vino, dando como resultado una mejora del proceso
y el desarrollo de nuevos vinos.
En otras realizaciones del sistema de expresión,
transformantes y métodos para la expresión de proteínas, el
promotor puede unirse a genes de metabolitos secundarios tales como
la poliquétido sintasa, o el gen de la péptido sintasa no ribosomal
en una región cadena abajo del mismo. Este sistema proporciona un
tiempo de producción avanzado de los metabolitos secundarios, con lo
que se aumenta la velocidad de producción y se reduce en gran
medida el coste.
Además, pueden insertarse genes activadores de
la transcripción cadena abajo de la realización del promotor en el
vector, y los genes regulados por el activador pueden activarse por
el activador sobreexpresado, aumentando de esta manera en gran
medida la velocidad de producción.
Aunque la invención se ha descrito a modo de
ejemplo y en términos de realizaciones preferidas, debe entenderse
que la invención no se limita a las mismas.
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the genus Monascus. EP1325959 A1.
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Skinner D. Z. (2003). Transformation of Monascus
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\global\parskip0.000000\baselineskip
<110> Food Industry Research &
Development Institute
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Promotores y su uso
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> 0470-A20212
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<140> P200402939
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
2004-12-10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> US 60/529,330
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
2003-12-12
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn version 3.2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1116
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Monascus BCRC 38072
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> promotor
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(1116)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> acuF promotor
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
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<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1478
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Monascus BCRC 38072
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> promotor
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(1478)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Hsp promotor
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Acu-F cebador de
avance
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> primer_bind
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(20)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptgttaatagg accgccctgc
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
Acu-F-cebador inverso
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> primer_bind
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(19)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipagtatgcggt cagagcacc
\hfill19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 465
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> AcuF sonda
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_binding
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(465)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (36)..(36)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n=a, t, c, o g
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 34
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> AcuF promotor cebador de avance
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> primer_bind
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(34)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgaagatctct cgtatgttgt gtggaattgt gagc
\hfill34
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> AcuF promotor cebador inverso
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> primer_bind
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(30)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipatggtacctg tttctgagtg aggtcgagtg
\hfill30
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> mptc3161-A
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> primer_bind
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(20)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgcttatctcc aatgcctccg
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> mptc3161-B
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> primer_bind
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(18)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcaaggtctcg ctcgttac
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 264
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Hsp sonda
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_binding
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(264)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
Mps17-9259-F
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> primer_bind
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(20)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipagtggcagcc aaccctcacc
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
Mps17-7782-R
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> primer_bind
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(27)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcgggctgata gagcagatag atagatg
\hfill27
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> acuF-B2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> primer_bind
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(30)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgaagatcttg tcgatgcaat cgggcaatcc
\hfill30
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> acuF-KpnI
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> primer_bind
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(30)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipatggtacctg tttctgagtg aggtcgagtg
\hfill30
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> acuF-B3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> primer_bind
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(30)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 15
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgaagatcttg atgattggga tcggactcgg
\hfill30
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> acuF-B4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> primer_bind
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(28)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 16
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgaagatcttg cggatccgag gataaaac
\hfill28
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> acuF-B5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> primer_bind
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(28)
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgaagatctcc cggtattgtc cgaggctc
\hfill28
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 600
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Monascus BCRC 38072
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> promotor
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(600)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Hsp
promotor-497bp-cebador de avance
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> primer_bind
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(22)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipccgagagcgc gtatatgtaa cg
\hfill22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Hsp
promotor-497bp-cebador inverso
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> primer_bind
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(23)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipctgatagagc agatagatag atg
\hfill23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Hsp
promotor-720bp-cebador de avance
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> primer_bind
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(20)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptgaattgtgt gggtgcgtgg
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Hsp
promotor-720bp-cebador inverso
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> primer_bind
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(20)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcagtgcatct tagcggttgg
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Hsp
promotor-1478bp-cebador de
avance
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> primer_bind
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(20)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipagtggcagcc aaccctcacc
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 497
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Monascus BCRC 38072
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> promotor
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(497)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 24
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (50)
1. Una molécula de ADN que comprende una
secuencia de nucleótidos de 517 a 1116 nucleótidos contiguos de la
SEC ID Nº: 1 o una secuencia de nucleótidos que puede hibridar con
la misma en condiciones rigurosas, donde la molécula de ADN tiene
actividad promotora.
2. La molécula de ADN de acuerdo con la
reivindicación 1, donde la molécula de ADN comprende una secuencia
de nucleótidos de 367 a 1116 nucleótidos contiguos de la SEC ID Nº:
1 o una secuencia de nucleótidos que puede hibridar con la misma en
condiciones rigurosas.
3. La molécula de ADN de acuerdo con la
reivindicación 1, donde la molécula de ADN comprende una secuencia
de nucleótidos de 117 a 1116 nucleótidos contiguos de la SEC ID Nº:
1 o una secuencia de nucleótidos que puede hibridar con la misma en
condiciones rigurosas.
4. La molécula de ADN de acuerdo con la
reivindicación 1, donde la molécula de ADN comprende una secuencia
de nucleótidos de la SEC ID Nº: 1 o una secuencia de nucleótidos que
puede hibridar con la misma en condiciones rigurosas.
5. La molécula de ADN de acuerdo con la
reivindicación 1, donde la molécula de ADN procede de bacterias u
hongos.
6. La molécula de ADN de acuerdo con la
reivindicación 1, donde la molécula de ADN procede de
Monascus sp.
7. La molécula de ADN de acuerdo con la
reivindicación 1, donde la molécula de ADN procede de Monascus
pilosus, Monascus ruber o Monascus purpureus.
8. La molécula de ADN de acuerdo con la
reivindicación 7, donde la molécula de ADN procede de BCRC 38072
depositado en el Food Industry Research and Development
Institute.
9. La molécula de ADN de acuerdo con la
reivindicación 8, donde la molécula de ADN procede de la secuencia
cadena arriba del codón de iniciación del gen de la
fosfoenolpiruvato carboxiquinasa (acuF) de BCRC 38072.
10. Un ADN recombinante, que comprende:
una región promotora que comprende una secuencia
de nucleótidos de 517 a 1116 nucleótidos contiguos de la SEC ID Nº:
1 o una secuencia de nucleótidos que puede hibridar con la misma en
condiciones rigurosas; y
una región codificante que comprende una
secuencia de nucleótidos que codifica una proteína deseada.
11. El ADN recombinante de acuerdo con la
reivindicación 10, donde la región promotora comprende una
secuencia de nucleótidos de 367 a 1116 nucleótidos contiguos de la
SEC ID Nº: 1 o una secuencia de nucleótidos que puede hibridar con
la misma en condiciones rigurosas.
12. El ADN recombinante de acuerdo con la
reivindicación 10, donde la región promotora comprende una
secuencia de nucleótidos de 117 a 1116 nucleótidos contiguos de la
SEC ID Nº: 1 o una secuencia de nucleótidos que puede hibridar con
la misma en condiciones rigurosas.
13. El ADN recombinante de acuerdo con la
reivindicación l0, donde el promotor comprende una secuencia de
nucleótidos de la SEC ID Nº: 1 o una secuencia de nucleótidos que
puede hibridar con la misma en condiciones rigurosas.
14. El ADN recombinante de acuerdo con la
reivindicación 10, donde la región promotora procede de
Monascus sp.
15. El ADN recombinante de acuerdo con la
reivindicación 10, donde la región promotora procede de Monascus
pilosus, Monascus ruber o Monascus purpureus.
16. El ADN recombinante de acuerdo con la
reivindicación 15, donde la región promotora procede de BCRC 38072
depositado en el Food Industry Research and Development
Institute.
17. El ADN recombinante de acuerdo con la
reivindicación 16, donde la región promotora procede de la
secuencia cadena arriba del codón de iniciación del gen de la
fosfoenolpiruvato carboxiquinasa (acuF) de BCRC 38072.
18. Un vector de expresión que comprende un
promotor que comprende una secuencia de nucleótidos de 517 a 1116
nucleótidos contiguos de la SEC ID Nº: 1 o una secuencia de
nucleótidos que puede hibridar con la misma en condiciones
rigurosas.
19. El vector de expresión de acuerdo con la
reivindicación 18, donde el promotor comprende una secuencia de
nucleótidos de 367 a 1116 nucleótidos contiguos de la SEC ID Nº: 1 o
una secuencia de nucleótidos que puede hibridar con la misma en
condiciones rigurosas.
20. El vector de expresión de acuerdo con la
reivindicación 18, donde el promotor comprende una secuencia de
nucleótidos de 117 a 1116 nucleótidos contiguos de la SEC ID Nº: 1 o
una secuencia de nucleótidos que puede hibridar con la misma en
condiciones rigurosas.
21. El vector de expresión de acuerdo con la
reivindicación 18, donde el promotor comprende una secuencia de
nucleótidos de la SEC ID Nº: 1 o una secuencia de nucleótidos que
puede hibridar con la misma en condiciones rigurosas.
22. El vector de expresión de acuerdo con la
reivindicación 18, donde el promotor procede de Monascus
sp.
23. El vector de expresión de acuerdo con la
reivindicación 18, donde el promotor procede de Monascus
pilosus, Monascus ruber o Monascus purpureus.
24. El vector de expresión de acuerdo con la
reivindicación 23, donde el promotor procede de BCRC 38072
depositado en el Food Industry Research and Development
Institute.
25. El vector de expresión de acuerdo con la
reivindicación 21, donde el promotor procede de la secuencia cadena
arriba del codón de iniciación del gen cíe la fosfoenolpiruvato
carboxiquinasa (acuF) de BCRC 38072.
26. Una molécula de ADN, que comprende una
secuencia de nucleótidos de 982 a 1478 nucleótidos contiguos de la
SEC ID Nº: 2 o una secuencia de nucleótidos que puede hibridar con
la misma en condiciones rigurosas, donde la molécula de ADN tiene
actividad promotora.
27. La molécula de ADN de acuerdo con la
reivindicación 26, donde la molécula de ADN comprende una secuencia
de nucleótidos de 759 a 1478 nucleótidos contiguos de la SEC ID Nº:
2 o una secuencia de nucleótidos que puede hibridar con la misma en
condiciones rigurosas.
28. La molécula de ADN de acuerdo con la
reivindicación 26, donde la molécula de ADN comprende una secuencia
de nucleótidos de 443 a 1478 nucleótidos contiguos de la SEC ID Nº:
2 o una secuencia de nucleótidos que puede hibridar con la misma en
condiciones rigurosas.
29. La molécula de ADN de acuerdo con la
reivindicación 26., donde la molécula de ADN comprende una
secuencia de nucleótidos de la SEC ID Nº: 2 o una secuencia de
nucleótidos que puede hibridar con la misma en condiciones
rigurosas.
30. La molécula de ADN de acuerdo con la
reivindicación 26. donde la molécula de ADN procede de bacterias u
hongos.
31. La molécula de ADN de acuerdo con la
reivindicación 26. donde la molécula de ADN procede Monascus
sp.
32. La molécula de ADN de acuerdo con la
reivindicación 31, donde la molécula de ADN procede de Monascus
pilosus, Monascus ruber o Monascus purpureus.
33. La molécula de ADN de acuerdo con la
reivindicación 32, donde la molécula de ADN procede de BCRC 38072
depositado en el Food Industry Research and Development
Institute.
34. La molécula de ADN de acuerdo con la
reivindicación 33, donde la molécula de ADN procede de la secuencia
cadena arriba del codón de iniciación del gen de la proteína del
choque térmico (hsp) de BCRC 38072.
35. Un ADN recombinante que comprende:
una región promotora que comprende una secuencia
de nucleótidos de 982 a 1478 nucleótidos contiguos de la SEC ID Nº:
2 o una secuencia de nucleótidos que puede hibridar con la misma en
condiciones rigurosas; y
una región codificante que comprende una
secuencia de nucleótidos que codifica una proteína deseada.
36. El ADN recombinante de acuerdo con la
reivindicación 35, donde la región promotora comprende una
secuencia de nucleótidos de 759 a 1478 nucleótidos contiguos de la
SEC ID Nº: 2 o una secuencia de nucleótidos que puede hibridar con
la misma en condiciones rigurosas.
37. El ADN recombinante de acuerdo con la
reivindicación 35, donde la región promotora comprende una
secuencia de nucleótidos de 443 a 1478 nucleótidos contiguos de la
SEC ID Nº: 2 o una secuencia de nucleótidos que puede hibridar con
la misma en condiciones rigurosas.
38. El ADN recombinante de acuerdo con la
reivindicación 35, donde el promotor comprende una secuencia de
nucleótidos de la SEC ID Nº: 2 o una secuencia de la nucleótidos que
puede hibridar con la misma en condiciones rigurosas.
39. El ADN recombinante de acuerdo con la
reivindicación 35, donde la región promotora procede de
Monascus sp.
40. El ADN recombinante de acuerdo con la
reivindicación 35, donde la región promotora procede de Monascus
pilosus, Monascus ruber o Monascus purpureus.
41. El ADN recombinante de acuerdo con la
reivindicación 40, donde la región promotora procede de BCRC 38072
depositado en el Food Industry Research and Development
Institute.
42. El ADN recombinante de acuerdo con la
reivindicación 41, donde la región promotora procede de la
secuencia cadena arriba del codón de iniciación del gen de la
proteína de choque térmico (hsp) de BCRC 38072.
43. Un vector de expresión que comprende un
promotor que contiene una secuencia de nucleótidos de 982 a 1478
nucleótidos contiguos de la SEC ID Nº: 2 o una secuencia de
nucleótidos que puede hibridar con la misma en condiciones
rigurosas.
44. El vector de expresión de acuerdo con la
reivindicación 43, donde el promotor comprende una secuencia de
nucleótidos de 759 a 1478 nucleótidos contiguos de la SEC ID Nº: 2 o
una secuencia de nucleótidos que puede hibridar con la misma en
condiciones rigurosas.
45. El vector de expresión de acuerdo con la
reivindicación 43, donde el promotor
comprende una secuencia de nucleótidos de 443 a
1478 nucleótidos contiguos de la SEC ID Nº: 2 o una secuencia de
nucleótidos que puede hibridar con la misma en condiciones
rigurosas.
46. El vector de expresión de acuerdo con la
reivindicación 43, donde el promotor comprende una secuencia de
nucleótidos de la SEC ID Nº: 2 o una secuencia de nucleótidos que
puede hibridar con la misma en condiciones rigurosas.
47. El vector de expresión de acuerdo con la
reivindicación 43, donde el promotor procede de Monascus
sp.
48. El vector de expresión de acuerdo con la
reivindicación 43, donde el promotor procede de Monascus
pilosus, Monascus ruber o Monascus purpureus.
49. El vector de expresión de acuerdo con la
reivindicación 48, donde el promotor procede de BCRC 38072
depositado en el Food Industry Research and Development
Institute.
50. El vector de expresión de acuerdo con la
reivindicación 49, donde el promotor procede de la secuencia cadena
arriba del codón de iniciación del gen de la proteína de choque
térmico (hsp) de BCRC 38072.
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