ES2307413B2 - Uso del quitosano para incrementar la esporulacion de hongos. - Google Patents
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Abstract
Uso del quitosano para incrementar la
esporulación de hongos.
Esta invención se refiere a una composición en
base a la utilización del quitosano que permite incrementar la
esporulación de hongos, agentes de control biológico.
Description
Uso del quitosano para incrementar la
esporulación de hongos.
Esta invención se refiere a una composición en
base a la utilización del quitosano que permite incrementar la
esporulación de hongos, agentes de control biológico.
La utilización de organismos naturales, como
bacterias, virus y hongos, para el control de plagas y
enfermedades, presenta un gran interés. En concreto, los hongos son
organismos con gran potencial como agentes de control biológico, ya
que tienen una capacidad de reproducción extremadamente alta, un
tiempo de generación muy corto, y en ocasiones son muy específicos
en su acción, atacando únicamente al huésped con el cual han
co-evolucionado. Además, los hongos tienen fases
saprofíticas en las cuales pueden sobrevivir sin el huésped, y
permanecer en el medio hasta que éste vuelva a aparecer (12).
Los hongos nematófagos son un grupo de hongos
antagonistas de nematodos (parásitos de plantas y animales) (18) y
son, por tanto, buenos candidatos para su uso como agentes de
control biológico de nematodos parásitos (31). Además de ello,
también tienen la capacidad de infectar y colonizar otros
organismos, incluyendo otros hongos y raíces de plantas (10).
Pochonia. chlamydosporia es un buen
ejemplo de este tipo de hongos, ya que es utilizado como agente de
control biológico contra nematodos fitopatógenos (5, 11, 18),
especialmentene radiculares, es un buen colonizador de la raíz de
cereales (15) y diversas hortalizas (3, 4) y en experimentos in
vitro es capaz de inhibir el crecimiento de estos hongos
patógenos radiculares (6, 9, 25).
Otros hongos nematófagos de especial interés son
Paecilomyces lilacinus, Lecanicillium lecanii y
Pochonia rubescens, capaces también de inhibir a varios
fitopatógenos in vitro (6, 9, 23, 7).
Los hongos entomopatógenos son un grupo de
hongos patógenos de insectos con numerosos ejemplos de su eficacia
en la supresión de plagas de insectos, por lo que presentan gran
potencial como agentes de control biológico (8). Los géneros
Beauveria, Metarhizium, Lecanicillium, Cordyceps y
Paecilomyces son los más importantes para su desarrollo como
agentes de control biológico frente a plagas de vegetales (1).
Por ejemplo, el hongo entomopatógeno
Beauveria bassiana, además de su papel en el control de
plagas vegetales, es capaz de colonizar endofíticamente tejidos (7,
29, 19) y de inhibir, en experimentos in vitro, el
crecimiento del hongo fitopatógeno Penicillium vermoesenii
(1).
Por otro lado, el quitosano es, en su mayoría,
un polímero de \beta-1-4
glucosamina, una forma parcialmente desacetilada de la quitina. El
quitosano se puede obtener por procesos químicos sometiendo la
quitina a la acción de un medio alcalino muy concentrado, y a
temperaturas superiores a 60ºC. En estas condiciones se produce la
reacción de desacetilación, que consiste en la pérdida del resto
acetilo del grupo amido del carbono 2 de la
N-acetilglucosamina, quedando un grupo amino en esa
posición. El quitosano se obtiene de fuentes naturales de quitina,
principalmente a partir de caparazones de crustáceos y plumas de
calamar, procedentes de las plantas procesadoras de
marisco.
marisco.
Se ha comprobado que el quitosano y sus
derivados presentan actividad antimicrobiana frente a diferentes
grupos de microorganismos, como bacterias y hongos. La acción
bactericida del quitosano se debe a que desestabiliza las membranas
celulares, provocando la pérdida del contenido celular (14).
Asimismo, existen numerosas evidencias del efecto del quitosano
sobre hongos fitopatógenos. En concreto, el quitosano inhibe la
germinación de las esporas de hongos fitopatógenos (17), afecta a su
crecimiento (24, 16, 20, 27), induciendo alteraciones morfológicas
(13) y ultraestructurales en las hifas y provoca reducción de la
producción de toxinas (21).
\vskip1.000000\baselineskip
La presente invención permite incrementar la
esporulación de hongos filamentosos mediante el uso del quitosano.
Dichos hongos podrán ser utilizados posteriormente como agentes de
control biológico.
Las esporas son el principal mecanismo de
inoculación de estos hongos por lo que aumentar la esporulación de
los hongos agentes de control biológico, permite incrementar la
producción de inóculo de los hongos para su posterior formulación y
aplicación.
El quitosano es un buen inductor de la
esporulación de hongos agentes de control biológico presentando los
hongos crecidos en medio de cultivo con quitosano valores de
producción más de 40 veces mayores que en el medio control sin
quitosano.
\newpage
El quitosano aplicado en estos medios de cultivo
presenta una serie de ventajas, que aunque comprenden, no se limitan
a las siguientes:
- \bullet
- No afecta las características biológicas de los conidios; se ha comprobado experimentalmente que los conidios del hongo entomopatógeno Beauveria bassiana producidos en medio con quitosano, no muestran diferencia en la viabilidad con respecto a los conidios control.
- \bullet
- No afecta a la patogenicidad de los conidios; los conidios procedentes de medio con quitosano no muestran cambios en su patogenicidad frente a insectos al compararlos con los conidios control.
Por lo tanto, un primer aspecto de la invención
se refiere al uso del quitosano para aumentar la esporulación de
hongos.
Un segundo aspecto de la invención se refiere al
uso del quitosano para la elaboración de un medio de cultivo para
incrementar la esporulación de hongos.
En una realización preferida los hongos son
hongos entomopatógenos u hongos nematófagos. En una realización más
preferida, el hongo nematófago se selecciona de la lista que
comprende, pero no se limita a: Pochonia chlamydosporia,
Pochonia rubescens o Paecilomyces lilacinus. En otra
realización más preferida el hongo entomopatógeno se selecciona de
la lista que comprende, pero no se limita a: Beauveria bassiana o
Lecanicillium cf. psalliotae.
Otro aspecto de la invención se refiere al medio
de cultivo para incrementar la esporulación de hongos que comprende
al menos quitosano. En adelante este medio de cultivo será
denominado como medio de cultivo de la invención.
En una realización preferida el medio de cultivo
de la invención presenta una concentración de quitosano de entre
0,1 mg/ml y 2 mg/ml En una realización más preferida el medio de
cultivo de la invención presenta una concentración de quitosano de
entre 0,5 mg/ml y 1,5 mg/ml En una realización aún más preferida el
medio de cultivo de la invención presenta una concentración de
quitosano de 1 mg/ml.
Otro aspecto de la invención se refiere al
método para incrementar la esporulación de hongos que comprende la
selección del hongo, su inoculación al medio de cultivo de la
invención y la incubación de dicho hongo inoculado en el medio de
cultivo de la invención, en condiciones apropiadas para el
crecimiento de hongos.
Otro aspecto de la invención se refiere al
método para la obtención de esporas para su uso como agente de
control biológico que comprende la selección del hongo, la
inoculación del hongo seleccionado al medio de cultivo de la
invención, su incubación en condiciones apropiadas para la
esporulación y el aislamiento de las esporas producidas en el paso
anterior.
A lo largo de la descripción y las
reivindicaciones, la palabra "comprende" y sus variantes no
pretenden excluir otras características técnicas, aditivos,
componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos,
ventajas y características de la invención se desprenderán en parte
de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Los
siguientes ejemplos y figuras sirven para ilustrar la invención y
no deben ser considerados como limitativos del alcance de la
misma.
Figura 1: Se muestra el resultado obtenido en la
esporulación del hongo entomopatógeno B. bassiana (aislado
119, colonias de 18 días) al añadir concentraciones crecientes de
quitosano al medio de cultivo. En la gráfica se puede observar que
el aumento de la concentración de quitosano va acompañado de un
aumento de la esporulación, alcanzando el valor máximo a la
concentración de quitosano de 1 mg/ml.
Figura 2: Se refleja el efecto del quitosano
aplicado a concentraciones de 2 mg/ml en medio CMA (agar extracto
de maíz), sobre la esporulación de hongos agentes de control
biológico.
Figura 3: Esta gráfica muestra el valor de LT50
(tiempo letal medio, tiempo que tarda un organismo patógeno en
matar a la mitad de la población del organismo diana) del hongo
entomopatógeno Beauveria bassiana (aislado 119) inoculado en
larvas de Galleria mellonella estadios L3-L4.
Los tratamientos aplicados a las larvas de G. mellonella son
los siguientes:
- -
- B. bassiana 119: Bbl19 CMA; se trata de conidios de B. bassiana cepa 119 crecidos en medio de cultivo CMA
- -
- Bb119 CMA+HCl; se trata de conidios de B. bassiana cepa 119 crecidos en medio de cultivo CMA con HCl
- -
- Bb119 CMA+T8s; se trata de conidios de B. bassiana cepa 119 crecidos en medio de cultivo CMA con quitosano a 2 mg/ml
- -
- Controles sin B. bassiana 119: Control H_{2}O-T8s; consiste en agua recogida de placas de medio de cultivo CMA con quitosano
- -
- Control H_{2}O-HCl; consiste en agua recogida de placas de medio de cultivo CMA con HCl
- -
- Control H_{2}O; consiste en agua recogida de placas de medio de cultivo CMA
- -
- Control H_{2}O-SL, consiste en agua recogida de placas de medio de cultivo CMA, sin pasarla por lana de vidrio
- -
- Control SN, se trata de un control en el que no se añade nada a las larvas.
\vskip1.000000\baselineskip
Los siguientes ejemplos y figuras sirven para
respaldar la eficacia del uso del quitosano, así como del medio de
cultivo de la invención, para incrementar la esporulación de hongos,
manteniendo las características biológicas de los mismos.
\vskip1.000000\baselineskip
Se estudió el efecto del quitosano en la
esporulación de hongos nematófagos y hongos entomopatógenos. Los
hongos utilizados fueron los siguientes:
\vskip1.000000\baselineskip
- Pochonia chlamydosporia (P.c.), hongo
nematófago, 9 cepas aisladas de distinta procedencia
geográfica:
- \quad
- P.c.123 (Sevilla, aislado de Heterodea avenae),
- \quad
- P.c.BK69 (Nueva Zelanda),
- \quad
- P.c.BK132 (Kenia,),
- \quad
- P.c.BK309 (Zimbawe,),
- \quad
- P.c.BK392 (Cuba,),
- \quad
- P.c.BK 399 (China,),
- \quad
- P.c. 4624 (Perth, Australia),
- \quad
- P.c.64 (Tarragona, aislado de Meloidogyne sp.),
- \quad
- P.c75 (Valladolid, aislado de Heterodea schachtii, c).
\vskip1.000000\baselineskip
- Pochonia rubescens, hongo nematófago
(Escocia, aislado de Heterodea avenae).
\vskip1.000000\baselineskip
- Paecilomyces lilacinus, hongo
nematófago
\vskip1.000000\baselineskip
- Beauveria bassiana, hongo
entomopatógeno, 3 cepas aisladas de distinta procedencia
geográfica:
- \quad
- B.b119 (Orihuela, Alicante, aislado de coleóptero),
- \quad
- B.b193 (Valencia, aislado de Rhynchophorus ferrugineus),
- \quad
- B.b203 (Elche, Alicante, aislado de Rhynchophorus ferrugineus).
\vskip1.000000\baselineskip
- Lecanicillium cf. psalliotae, hongo
entomopatógeno (Elche, Alicante, aislado de Phoenicococcus
marlatti).
\vskip1.000000\baselineskip
El quitosano utilizado fue el denominado T8s,
(Marine BioProducts GMBH). Se trata de un quitosano con un peso
molecular de 70 KDa, y un grado de desacetilación del 79.6%.
Para utilizar experimentalmente el quitosano,
previamente debe disolverse. Para ello, el quitosano en polvo se
disolvió con Ácido Clorhídrico 0.25 M y se ajustó el pH a 5.6 con
Hidróxido de Sodio 1 M. La disolución de quitosano se sometió a
diálisis en agua destilada a 4ºC, con dos cambios al día, a lo
largo de tres días, para eliminar las sales presentes en el
quitosano, o formadas al ajustar el pH del HCl a 5.6 con NaOH (2).
Tras la diálisis se comprobó que el pH del quitosano se mantuvo
estable a 5.6. Se utilizó un pH de 5.6 para que el pH no afectase a
los hongos. A un pH más básico el quitosano no es soluble y un pH
más ácido puede influir en el crecimiento del hongo. Asimismo, el
ajuste de pH se realizó con HCl y NaOH debido a que el producto de
la neutralización, NaCl es muy soluble y se puede eliminar
fácilmente por diálisis.
Finalmente, se sometió el quitosano disuelto a
esterilización mediante vapor húmedo en autoclave.
El medio de cultivo suplementado con quitosano
se realizó preparando el medio de cultivo CMA (agar extracto de
maíz, BBL). Se eligió el medio CMA para estudiar el efecto en la
esporulación debido a que es el medio de cultivo en el que los
hongos estudiados muestran mayor esporulación. Una vez esterilizado
con vapor húmedo en autoclave (20 minutos a 120ºC), se añadió el
volumen de quitosano necesario para obtener la concentración de
quitosano deseada. (13). Por último, se dispensó el medio de
cultivo en placas Petri de plástico estériles de nueve centímetros
de diámetro. Como control se utilizaron placas conteniendo CMA sin
quitosano.
Se realizó un segundo control añadiendo al medio
de cultivo Ácido Clorhídrico 0.25M con pH 5.6 ajustado con
Hidróxido de Sodio, y dializado. Para este segundo control se usó
el mismo volumen de HCl a pH 5.6 que el volumen de quitosano
utilizado para preparar la mayor concentración de quitosano (2
mg/ml). Este segundo control se realizó para descartar posibles
efectos inhibitorios debidos al Cloruro Sódico producido al ajustar
el pH del Ácido Clorhídrico con el Hidróxido de Sodio.
Las placas con el medio descrito se inocularon
en el centro con discos de 5 mm tomados del borde de colonias, de
los distintos hongos creciendo activamente, y se incubaron a 25ºC
en oscuridad. Se realizaron tres réplicas por tratamiento.
Cuando las colonias tenían entre 18 y 21 días
(próximas a alcanzar el borde de la placa) se extrajeron los
conidios y se cuantificaron.
Para extraer los conidios se trabajó en una
cámara de flujo laminar, con material esterilizado por vapor húmedo
en autoclave, y con el instrumental flameado previamente. Se añadió
agua destilada estéril sobre la placa, se arrastraron los conidios
utilizando un asa de vidrio, se recogieron con una micropipeta y se
dispusieron en tubos Eppendorf estériles de 1,5 ml. La
concentración de conidios se calculó utilizando una cámara de
Neubauer de 0,025 mm^{2} de área y 0,1 mm de profundidad. De esta
forma se calculó el número de conidios por cm^{2}.
En la figura 1 se puede observar que el aumento
de la concentración de quitosano va acompañado de un aumento de la
esporulación del hongo B. bassiana (aislado 119), alcanzando
el valor máximo a la concentración de quitosano de 1 mg/ml.
Los resultados del efecto del quitosano en la
esporulación en los hongos agentes de control biológico se resumen
en la Tabla 1 y Figura 2. Podemos observar que tanto en los hongos
nematófagos como en los hongos entomopatógenos hay un claro aumento
de la esporulación por cm^{2}. En algunas especies o cepas la
esporulación llega a incrementarse más de 40 veces respecto al
control (B. bassiana, aislado 119).
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(Tabla pasa a página
siguiente)
\newpage
Se comprobó la viabilidad de los conidios
procedentes de los hongos creciendo en medio con quitosano según lo
descrito en el ejemplo 1, comparando su germinación respecto a la
de los conidios procedentes de las placas control (sin
quitosano).
Para ello, los conidios se lavaron varias veces
por centrifugación a 13500 rpm durante 5 minutos, y resuspensión en
agua destilada estéril. De esta forma se eliminan posibles
inhibidores de la germinación producidos por los propios conidios
(22). Se ajustó la concentración a 10^{6} conidios/ml, utilizando
agua destilada estéril. Los conidios se dispusieron en portaobjetos
con diez pocillos de 6 mm de diámetro (ICN Biomedicals) como se
indica a continuación: Se añadieron 25 \mul de la suspensión de
conidios por pocillo, con tres réplicas por tratamiento, y dos
pocillos por réplica (en total seis pocillos por tratamiento). Los
portaobjetos se dispusieron dentro de una placa de petri estéril,
sobre un trozo de papel estéril humedecido, formando una cámara
húmeda.
Tras 24 horas se contó al microscopio el número
de conidios germinados y sin germinar de tres zonas al azar de cada
pocillo y se calculó el porcentaje de conidios germinados. Se
consideró que los conidios habían germinado cuando la longitud del
tubo germinal media más de la mitad del diámetro del conidio
(17).
Por último, los conidios se sembraron en placas
petri con medio de cultivo rico en nutrientes PDA (Agar dextrosa de
patata) utilizando un asa de vidrio. A lo largo de las 72 horas
siguientes se cuantificó el número de colonias.
No se observaron diferencias en la viabilidad de
los conidios producidos en medio suplementado con quitosano
respecto a los conidios producidos en medio sin quitosano.
\vskip1.000000\baselineskip
Para la realización del ensayo de patogenicidad
se utilizaron 15 larvas de estadio L3-L4 del
lepidóptero Galleria mellonella repartidas en 3 réplicas.
Como inóculo se utilizaron los conidios del hongo entomopatógeno
Beauveria bassiana (aislado 119) procedentes de placas sin
quitosano y placas con quitosano a 2 mg/ml, ajustando su
concentración a 2\cdot10^{6} conidios/ml con agua destilada
estéril.
Se pusieron 5 larvas en una placa Petri. A cada
una de las larvas se le añadió una gota (20 mul) de las
suspensiones de 2\cdot10^{6} conidios/ml, inoculando
4\cdot10^{4} conidios por larva. Se cerraron las placas para
evitar fugas de los insectos. Se anotaron cada día, durante 10
días, los individuos muertos de cada uno de los tratamientos.
Como control se utilizaron extractos sin
conidios obtenidos de placas de CMA con Quitosano, CMA con HCl y
CMA. Todos estos extractos se prepararon pasando el contenido
recogido de cada placa por lana de vidrio.
Se realizó un cuarto control en el que el
contenido recogido de una placa de CMA no se pasó por lana de
vidrio.
Por último se utilizó un quinto control al que
no se añadió nada (insectos sin tratar).
Con todos los datos obtenidos se calculó la LT50
(tiempo letal medio, tiempo que tarda un organismo patógeno en
matar a la mitad de la población del organismo diana).
Los resultados de los ensayos de patogenicidad
se muestran en la Figura 3. No se observaron diferencias en el nivel
de patogenicidad frente a G. mellonela entre los conidios
procedentes de los distintos tratamientos (hongo crecido en placa
de CMA, en placa de CMA con Quitosano o en placa de CMA con HCl),
con valores de LT50 entorno a los 6-7 días. Los
insectos de los tratamientos control superaron los 10 días de
supervivencia, por lo tanto no se pudo calcular la LT50.
\vskip1.000000\baselineskip
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Claims (11)
1. Uso del quitosano para incrementar la
esporulación de hongos.
2. Uso del quitosano para la elaboración de un
medio de cultivo para incrementar la esporulación de hongos.
3. Uso según cualquiera de las reivindicaciones
anteriores donde los hongos son hongos entomopatógenos u hongos
nematófagos.
4. Uso según la reivindicación anterior donde el
hongo nematófago se selecciona del grupo que consiste en:
Pochonia chlamydosporia, Pochonia rubescens o
Paecilomyces lilacinus.
5. Uso según la reivindicación 3 donde el hongo
entomopatógeno se selecciona del grupo que consiste en:
Beauveria bassiana o Lecanicillium cf.
psalliotae.
6. Medio de cultivo para incrementar la
esporulación de hongos que comprende al menos quitosano.
7. Medio de cultivo según la reivindicación
anterior donde el quitosano está a una concentración de entre 0,1
mg/ml y 2 mg/ml.
8. Medio de cultivo según la reivindicación 6
donde el quitosano está a una concentración de entre 0,5 mg/ml y
1,5 mg/ml.
9. Medio de cultivo según la reivindicación 1
donde el quitosano está en una concentración de 1 mg/ml.
10. Método para incrementar la esporulación de
hongos que comprende:
- A.
- Selección del hongo
- B.
- Inoculación al medio de cultivo según cualquiera de las reivindicaciones 6 a 9.
- C.
- Incubación en condiciones apropiadas para la esporulación de hongos.
11. Método para la obtención de esporas para su
uso como agente de control biológico que comprende:
- A.
- Selección del hongo
- B.
- Inoculación al medio de cultivo según cualquiera de las reivindicaciones 6 a 9.
- C.
- Incubación en condiciones apropiadas para la esporulación de hongos
- D.
- Aislamiento de las esporas producidas en el paso anterior.
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