ES2499790B2

ES2499790B2 - Método para amplificar la detección de dianas en una matriz de cristal líquido alineado

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Publication number: ES2499790B2
Application number: ES201430918A
Authority: ES
Inventors: Morten Andreas Geday; Eva OTÓN MARTÍNEZ; José Miguel ESCOLANO MOYANO; José Manuel OTÓN SÁNCHEZ; Xabier Quintana Arregui
Original assignee: Universidad Politecnica de Madrid
Current assignee: Universidad Politecnica de Madrid
Priority date: 2014-06-17
Filing date: 2014-06-17
Publication date: 2015-07-20
Anticipated expiration: 2034-06-17
Also published as: ES2499790A1; WO2015193525A1

Abstract

La presente invención se refiere a un método para amplificar la detección de dianas en una matriz de cristal líquido alineado y a un dispositivo para la detección amplificada de dianas que comprende: uno o más elementos de unión con la capacidad de formar un complejo con una diana, cristal líquido, y medios de polarización configurados para visualizar el alineamiento del cristal líquido. El dispositivo está caracterizado porque comprende medios de flujo con la capacidad de poner en contacto dinámico dicho cristal líquido con los mencionados elementos de unión. Los métodos de detección amplificada están basados en el contacto dinámico entre un flujo de cristal líquido y elementos de unión con capacidad de formar complejos con la diana.

Description

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MÉTODO PARA AMPLIFICAR LA DETECCIÓN DE DIANAS EN UNA MATRIZ DE CRISTAL LÍQUIDO ALINEADO

DESCRIPCIÓN

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se encuadra en el campo de la detección de microorganismos (bacterias, virus y otros microbios), micropartículas, biomoléculas o cualquier tipo de diana susceptible de ser detectada con una molécula de biorreconocimiento, en matrices de cristal líquido. Mediante el uso de un nuevo mecanismo de amplificación, se consigue un aumento significativo en la sensibilidad de detectores basados en cristales líquidos.

ESTADO DE LA TÉCNICA

La primera mención del uso de dispositivos basados en cristal líquido como sensores aparece en el artículo: V.K. Gupta, J.J. Skaife, T.B. Dubrovsky, N.L. Abbott, “Optical amplification of ligand-receptor binding using liquid crystals”, Science vol. 279 (5359), 1998, y la solicitud de patente US 2002/0142453 A, en los cuales se muestra el desalineamiento que se produce en una célula de cristal líquido por el cambio de rugosidad de sus superficies de alineamiento. Se describen las distorsiones causadas en el cristal líquido por dianas que se han unido específicamente a un receptor. Las zonas en las que no hay diana aparecen oscuras, mientras que en las zonas en donde se han unido dianas se produce desalineamiento del cristal líquido, causando la aparición de puntos brillantes en el fondo oscuro. El tamaño de dichos puntos es mayor que las propias dianas. Desde entonces, se han buscado materiales y metodologías que mejoren estos sistemas, dotándolos de una mayor sensibilidad y fiabilidad.

Así, en la solicitud de patente WO 2007/036905 A2 (C. Woolverton, 2007) se describe un sensor de cristal líquido, en el que se emplean micropartículas superparamagnéticas suspendidas dentro del mismo. La unión de partículas diana a estas micropartículas produce un cambio en el alineamiento del cristal líquido, causando la aparición de puntos brillantes en un fondo oscuro cuando se observan las células entre polarizadores cruzados con la ayuda de un microscopio.

En la patente US 6,411,354 B1 (O.D. Lavrentovich, T. Ishikawa, 2002), se detallan formas para alinear un tipo específico de cristales líquidos (cristales líquidos liotrópicos cromónicos), para la fabricación de células de cristal líquido con aplicaciones, por ejemplo, a biosensores.

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También se conoce la detección de dianas específicas en la interfase entre un cristal líquido termotrópico, generalmente hidrófobo, y una muestra acuosa que incluye la diana que se pretende detectar. La unión de la diana al receptor modifica la superficie, alterando el alineamiento del cristal líquido. Éste pasa de estar alineado perpendicularmente a la interfase a estar alineado en paralelo, señalando así la presencia de la diana al colocar polarizadores cruzados. Esta tecnología está relacionada con la publicación original: J.M. Brake, M.K. Daschner, Y.Y. Luk, y N.L. Abbott, “Biomolecular interactions at phospholipiddecorated surfaces of liquid crystals”, Science vol. 302 (2094), 2003, y con la solicitud del mismo autor US 2010/233729 A1. En algunos casos, se emplea una gota de cristal líquido depositada sobre un único sustrato; en otros, el cristal líquido se deposita en una pluralidad de pozos que se exponen a la muestra acuosa.

Estas técnicas de detección prometen avances importantes, aunque todavía requieren mejoras, por ejemplo, en su sensibilidad, fiabilidad o simplicidad de uso. El mayor problema de los métodos mencionados es que el factor de amplificación que se obtiene es raramente superior a unas decenas de veces del tamaño de la diana. Esto implica que la detección de micropartículas requiere el uso de un microscopio o un sistema de lentes. El uso de aparatos de microscopía no solo incrementa el coste del sistema de detección, además reduce el área de inspección a pocos milímetros cuadrados. Reducir el área de inspección puede reducir significativamente la sensibilidad del sistema, ya que se encontrará un número menor de dianas ligadas al sustrato. El uso de un microscopio, además, suele incluir un sistema microfluídico que es incompatible con muestras muy viscosas.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN

Los inventores han diseñado un dispositivo y procedimiento mejorado para la detección de dianas, basados en cristales líquidos. A diferencia de otros, este procedimiento es más sensible, no requiere instrumentación adicional, y en consecuencia resulta de manejo más sencillo.

Es por tanto un primer aspecto de la presente invención un dispositivo para la detección amplificada de dianas que comprende: uno o más medios de unión con la capacidad de formar un complejo con una diana, cristal líquido, y medios de polarización de luz configurados para visualizar el alineamiento de dicho cristal líquido, caracterizado porque comprende medios de flujo con la capacidad de poner en contacto dinámico dicho cristal líquido y dichos medios de unión.

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Un segundo aspecto es el método para la detección de una diana en una muestra, caracterizado porque comprende (i) poner en contacto la muestra con uno o más medios de unión con capacidad de unirse a dicha diana, (ii) accionar medios de flujo para crear un flujo de cristal líquido que contacte con los medios de unión, (iii) visualizar el alineamiento del cristal líquido mediante medios de luz polarizada, de forma que, en caso de estar la diana presente en la muestra, se observe una o más áreas de desalineamiento en el cristal líquido.

La presente invención introduce un método de amplificación de la señal de varios centenares de veces el tamaño de la diana. La invención supone un significativo avance, porque se modifica el instrumental e incluso el área de aplicación de los biosensores de cristal líquido. Ya no resulta necesario un sistema de microscopía y se pueden inspeccionar grandes áreas, incluso con distintos receptores (aptámeros, anticuerpos, proteínas,..) en el mismo dispositivo.

El método y dispositivo de la presente invención hace uso de las distorsiones provocadas en una matriz de cristal líquido en flujo por la presencia de un cuerpo que modifica su alineamiento. El sensor se basa en la detección óptica o eléctrica de este desalineamiento.

En los sensores conocidos hasta el momento, la detección y el contacto entre el complejo diana/receptor y el cristal líquido no implicaba ningún flujo, y la detección se basaba en la distorsión ejercida sobre el cristal líquido en reposo. Al realizar la detección mientras el cristal líquido está en contacto dinámico con la muestra, se produce una amplificación significativamente mayor que en otros métodos. En consecuencia, el dispositivo y método de la presente invención difiere considerablemente de otros ya existentes, y proporciona una amplificación del desalineamiento del cristal líquido en la matriz muy superior a la de los dispositivos conocidos hasta la fecha. El método de detección se basa en la observación de un flujo para detectar interferencias en el flujo lineal de una matriz alineada.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

La figura 1 muestra una realización particular de un dispositivo de la invención en el que las moléculas de cristal líquido (4) se encuentran alineadas en ausencia de la diana y la muestra aparece completamente oscura (6). Los sustratos A y B presentan una capa de alineamiento (1), y una capa de funcionalización para dianas específicas (2). Entre ambas se sitúan espaciadores (3) de tamaño calibrado micrométrico y, en ambos extremos, unos polarizadores cruzados, uno de ellos alineado en la dirección de flujo. La flecha (5) muestra la dirección de flujo del cristal líquido.

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La figura 2 muestra el mismo dispositivo de la figura 1, pero en el que la presencia de una diana (7) produce un flujo perturbado (8), desalineando las moléculas del cristal líquido y produciendo una señal (10), al ser observado entre polarizadores cruzados.

La figura 3 es análoga a la figura 1, pero en este caso el alineamiento original del cristal líquido es homeotrópico (perpendicular).

La figura 4 es análoga a la figura 2, pero en este caso el alineamiento original del cristal líquido es homeotrópico (perpendicular).

Las figuras 5, 6 y 7 son fotografías de algunos resultados obtenidos con dispositivos y métodos de acuerdo con la presente invención. En todos los casos, se aplica un flujo del cristal líquido liotrópico Sunset Yellow y se observan los resultados entre polarizadores cruzados. Las dianas que se han detectado tienen un tamaño entre 2 a 12 micrómetros de diámetro. Se observa un desalineamiento muy acentuado y un flujo perturbado detrás de dichas partículas.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

Dispositivo

En su forma más sencilla, el dispositivo de la presente invención comprende: uno o más medios de unión con la capacidad de formar un complejo con una diana, cristal líquido, medios de polarización de la luz configurados para visualizar el alineamiento del cristal líquido y medios de flujo con la capacidad de poner en contacto dinámico dicho cristal líquido con dichos medios de unión.

Los tipos de muestras que se pueden analizar son, en general, cualquiera que admita la fijación de la diana en los medios de unión. Como ejemplos, aunque no limitados solo a ellos, se pueden citar: fluidos corporales de humanos y animales incluyendo leche y derivados, cursos de agua, regadíos, desagües y aguas residuales, pozos y aljibes, aguas fluviales y marítimas para detección de microbios patógenos o microalgas. Se puede así utilizar el dispositivo en distintos puntos de la cadena de alimentación, controles de fabricación de materias primas de origen o destino biológico.

En la presente invención, se entiende por diana cualquier sustancia capaz de unirse específicamente a los medios de unión (receptores) y así provocar desalineamiento en el flujo de cristal líquido. En una realización particular, la diana se selecciona del grupo que consiste en micropartículas, moléculas orgánicas o biomoléculas, por ejemplo, proteínas, ADN, ARN o fragmentos de los mismos. En otra realización, la diana se selecciona del

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grupo que consiste en microorganismos o fragmentos de los mismos. Como ejemplos de microorganismos, aunque no limitados solo a ellos, se pueden citar: bacterias, virus, levaduras, células eucariotas y otros microbios.

Los cristales líquidos son materiales que están en un estado intermedio entre sólido y líquido. Están ordenados como los sólidos, pero pueden fluir como los líquidos. Muchas sustancias alcanzan el estado cristal líquido en determinados rangos de temperatura o de concentración. Los primeros se denominan cristales líquidos termotrópicos y los segundos cristales líquidos liotrópicos. En la presente invención se pueden emplear ambos tipos.

Pueden usarse cristales líquidos termotrópicos, por ejemplo 5CB (4-ciano-4'-pentilbifenilo), MBBA (N-(4-metoxibenciliden)-4-butilanilina), mezclas comerciales de cristales líquidos termotrópicos de Merck como MDA-98, MLC-6023-000, MLC-6042-000, MLC-6204-100, MLC-6019-100, MLC-13000-000, MLC-6401, MLC-6290-000, MLC-6025-000, MDA-01-130, MLC-6096, MDA-02-3900, MDA-02-4476, MLC-6025, ZLI-3417-000, ZLI-3417-100, ZLI2788-000, ZLI-3700-000, ZLI-1565-H, ZLI-3449-000, ZLI-3449-100, ZLI-2116-100, ZLI-3261, ZLI-1957/5, ZLI-3786 y ZLI-811. También pueden emplearse cristales líquidos liotrópicos como el colorante comercial Sunset Yellow FCF ((5E)-6-oxo-5-[(4-sulfonatofenil) hidraciniliden] naftalen-2-sulfonato disódico) o Cromolyn (ácido 5-[3-(2-carboxi-4oxocromen-5-il)oxi-2-hidroxipropoxi]-4-oxocromen-2-carboxílico), y también otros liotrópicos cromónicos o mezclas de todos los anteriores.

El dispositivo de la presente invención puede adoptar diversas configuraciones, siempre y cuando sea posible que entren en contacto de forma dinámica el flujo de cristal líquido y los medios de unión. En una realización preferida, el dispositivo es una célula que comprende un primer sustrato con una primera cara exterior y una primera cara interior, y un segundo sustrato con una segunda cara exterior y una segunda cara interior, en donde al menos uno de los sustratos es total o parcialmente transparente. De acuerdo con esta realización particular, sobre las caras exteriores se colocan los medios de polarización, preferiblemente polarizadores cruzados. Entre ambas caras interiores, enfrentadas entre sí, se sitúan espaciadores y al menos en una de ellas se deposita una capa de funcionalización. Cada uno de los sustratos puede estar compuesto, por ejemplo, por vidrio, silicio, cuarzo o materiales poliméricos.

Una realización particular del dispositivo de la invención se ejemplifica en las figuras 1 y 2, con alineamiento homogéneo del cristal líquido, y en las figuras 3 y 4, con alineamiento homeotrópico.

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Al menos una de las caras interiores incluye una capa de alineamiento. Dicha capa de alineamiento preferiblemente se acondiciona adecuadamente utilizando compuestos orgánicos o inorgánicos u otros métodos para inducir alineamiento por procedimientos físicos. Como ejemplos, aunque no limitados solo a ellos, se pueden citar: el acondicionamiento con o sin frotado de la superficie, el fotoalineamiento, la estabilización en 2D o 3D, o cualquier otro tipo de procedimiento utilizado de forma estándar, con o sin la aplicación de campos eléctricos o magnéticos externos. En cada caso, el experto en la materia puede utilizar cualquiera de los métodos descritos en la literatura véase por ejemplo:

I. H. Bechtold, M. L. Vega, E. A. Oliveira, J. J. Bonvent “Surface Treatments for Lyotropic Liquid Crystals Alignment”, Molecular Crystals and Liquid Crystals, vol. 391 (1), 2003; U. Kaeder y K. Hiltrop. "Alignment of lyotropic nematics by surface action", Trends in Colloid and Interface Science, vol. 84, 250-252, 1991; L. Parry Jones, “Alignment Properties of Liquid Crystals”, Handbook of Visual Display Technology, 1387-1402, 2012, así como la patente mencionada más arriba US 6,411,354 B1. Preferiblemente, en al menos una de las dos caras interiores se fijan elementos de unión, formando una capa de funcionalización, la cual incluye, preferiblemente, receptores específicos de la diana basados en anticuerpos, aptámeros, DNA, RNA, proteínas,fragmentos funcionales de los mismos o cualquier otro tipo de molécula con función de reconocimiento. La unión a la cara interior de estos medios de unión se puede realizar por enlace covalente, enlace iónico, interacciones de van der Waals, quimisorción, fisisorción o combinaciones de los mismos. Con el objeto de detectar una pluralidad de dianas en un mismo dispositivo, se pueden usar dos o más medios de unión con la capacidad de formar complejos con una o más dianas específicas distintas. Resulta particularmente útil que cada uno de dichos dos o más elementos de unión, se encuentren fijos en regiones distintas del sustrato. Preferiblemente, el dispositivo se configura de forma que carece de medios de unión en una de sus regiones, la cual actúa como control negativo.

De acuerdo con esta realización particular, la célula se monta una vez preparadas las superficies de los sustratos. En el montaje se utilizan espaciadores, preferiblemente microesferas de tamaño calibrado, cuya función es asegurar un espesor homogéneo en toda la superficie de la célula. Para sellar la célula y mantener los sustratos unidos se utiliza, preferiblemente, un adhesivo (por ejemplo, uno de curado UV). Los espaciadores se colocan, preferiblemente, fuera del área activa del dispositivo para evitar falsos positivos. De acuerdo con una realización particular, el primer sustrato y el segundo sustrato están separados por una distancia de entre 1 y 1000 µm, preferiblemente entre 5 y 600 µm, más preferiblemente entre 10 y 500 µm.

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En una realización particular, la célula se llena con la muestra líquida problema en la que se quiere evaluar la presencia de la diana. La muestra se puede tratar previamente con micropartículas capaces de unirse a la diana. Después, se lava la célula con una solución tampón adecuada.

En otra realización particular, la disolución en la que se quiere evaluar la presencia de la diana y el cristal líquido se mezclan antes de ser introducidos en la célula, de forma que el cristal líquido y la diana (si está presente) entran en contacto dinámico con los medios de unión.

Después, se activa el flujo de cristal líquido, lo cual puede hacerse por presión positiva o negativa, fuerza centrífuga o capilaridad, dependiendo de la estructura de la célula y su espesor. También puede hacerse con un sistema fluídico simple. Se inicia, así, el flujo de cristal líquido en la célula, el cual fluye con una dirección preferencial dentro del dispositivo. Cuando en la cara interior de los sustratos no se ha unido ninguna diana, el cristal líquido no se ve afectado y no hay desalineamientos, según se observa colocando el dispositivo entre polarizadores cruzados. Cuando el cristal líquido se encuentra con una diana que esté unida a la superficie, se produce un flujo perturbado detrás de dicha diana ("corriente abajo"). Cuando se observa la célula entre polarizadores cruzados se detecta un desalineamiento significativo mientras fluye el cristal líquido. Este desalineamiento es suficiente para observar la presencia de dianas a simple vista o con una lente.

El dispositivo de la presente invención se comercializa, preferiblemente, preparado para introducir la muestra y es de pequeño tamaño, permitiendo realizar el análisis de muestras “in situ”. El dispositivo puede incluir medios de visualización y grabado, tales como cámaras

o vídeos. De acuerdo con una realización particular, la amplificación es suficiente como para observarse a simple vista o con una pequeña lente, por ejemplo, de entre 2 y 20 aumentos. De acuerdo con una realización alternativa, el desalineamiento en el cristal líquido se observa mediante uno o más de los métodos que se seleccionan del grupo que consiste en un método colorimétrico, mediante un cambio de conductividad y/o mediante un cambio de permeabilidad.

La fabricación del dispositivo de la presente invención puede realizarse siguiendo métodos descritos en la bibliografía, relacionados o no con sensores, como por ejemplo en: S. Kumar,

J. Noh y C.H. Jang, "State of the Art in Liquid Crystals Nanophysiochemical Properties at Surfaces and Interfaces and Frontier for Posterity", Biochip Journal, vol. 3 (3), 181-189, 2009; y A. Hussain, A.S Pina y A.C.A. Roque, "Bio-recognition and detection using liquid crystals", Biosensors and Bioelectronics, vol. 25 (1), 2009.

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Método de Detección

El método de la presente invención comprende poner en contacto una muestra en la que se quiere detectar la presencia de una diana y un dispositivo en donde se va a unir la diana de forma específica. La diana se une a unos elementos de unión.

Cuando se llena el dispositivo con cristal líquido en una célula previamente preparada para alinearlo en una dirección específica, la presencia de la diana unida a los elementos de unión provoca una perturbación en el alineamiento de las moléculas de cristal líquido.

Cuando se introduce el cristal líquido se produce un flujo de moléculas ordenadas en una dirección. Cuando el cristal líquido encuentra una diana se crea un flujo perturbado "corriente abajo" respecto a la misma. Esta perturbación produce un efecto de desalineamiento que, según han descubierto los inventores, es extraordinariamente acusado, y que puede observarse como una línea fina, significativamente mayor que cualquier efecto de amplificación descrito en la bibliografía. El efecto se puede observar mientras el cristal líquido fluye a través de la célula, aunque también poco después de finalizado el flujo (decenas de segundos o minutos, dependiendo del cristal líquido, el espesor, la temperatura y algunos otros factores). El factor de amplificación depende de la velocidad de flujo; típicamente, se alcanzan factores de amplificación de varios cientos. El efecto permite incluso la detección de dianas a simple vista. Cuando se detiene el flujo, las moléculas de cristal líquido empiezan a realinearse. De acuerdo con una realización de la invención, la detección se realiza en el momento de introducir el cristal líquido o inmediatamente después. En otra realización, la detección tiene lugar hasta 20 minutos después o entre 1 y 5 minutos después, siempre antes de que se produzca el realineamiento de las moléculas de cristal líquido.

El método de amplificación puede incluir uniones específicas de grupos secundarios (por ejemplo, aptámeros, anticuerpos, affibodys, péptidos, moléculas con afinidad por cualquier componente de la diana, etc…) que se adhieren a las dianas de forma específica. Los grupos secundarios pueden incluir: micropartículas (por ejemplo, partículas paramagnéticas, nanotubos de carbono, micropartículas de sefarosa, nanopartículas de oro, etc…) o catalizadores, especialmente enzimáticos (por ejemplo, catalasas o peroxidasas). Los grupos secundarios que incluyen micropartículas provocarían o amplificarían el desalineamiento que se produce en torno a la diana después de que se una el grupo secundario. Dicho desalineamiento o amplificación del mismo puede ser provocado por: el volumen de la partícula, las propiedades magnéticas o eléctricas de la partícula, la

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capacidad de aglutinación de las partículas, etc… Otras micropartículas, como las nanopartículas de oro, podrían influir en las propiedades ópticas del cristal líquido que se encuentra próximo. Los grupos secundarios que incluyen catalizadores pueden actuar de distintas formas. Por un lado, pueden degradar compuestos específicos dentro del medio en que se encuentra el cristal líquido, produciendo compuestos secundarios que den lugar a la señal de amplificación. Este podría ser el caso, por ejemplo, de una catalasa unida a un grupo secundario que degradaría el H2O2 que podría estar presente en el medio produciendo burbujas de oxígeno en el entorno de la diana enlazada. Por otro lado, los catalizadores pueden tener una actividad de degradación de las moléculas de cristal líquido, provocando el desalineamiento en esa zona, que se traduciría en el paso de la luz en la zona afectada en una célula oscura o, a la inversa, una zona oscura en una celda que permite el paso de la luz. Un ejemplo podría ser la cloroperoxidasa que se ha descrito como una enzima capaz de degradar Sunset Yellow: J. Zhang, M. Feng, Y. Jiang, M. Hu, S. Li, Q. Zhai, “Efficient decolorization/degradation of aqueous azo dyes using buffered H2O2 oxidation catalyzed by a dosage below ppm level of chloroperoxidase”, Chemical Engineering Journal, vol. 191, 236-242, 2012.

A continuación, se ofrecen a modo ilustrativo algunas realizaciones preferidas de la invención, la cual no debe considerarse limitada solo a ellos.

REALIZACIONES PREFERIDAS

1.: Se seleccionan dos sustratos planos. Uno de ellos, al menos, debe ser transparente. El material del que están hechos los sustratos puede ser vidrio, cuarzo, o polímeros transparentes como p. ej. PMMA. Si el segundo sustrato no es también transparente puede ser de metal, cerámica, silicio u otros materiales inertes y rígidos. Ambos sustratos deben ser adecuados (y acondicionados) para la deposición de capas que se describe a continuación.

2.: Se deposita una capa de alineamiento en la cara interior de, al menos, uno de los dos sustratos. La capa de alineamiento puede incluir compuestos orgánicos o inorgánicos, o métodos para inducir alineamiento por procedimientos físicos: la capa puede acondicionarse con o sin frotado de la superficie, o por fotoalineamiento, estabilización en 2D o 3D o cualquier otro tipo de procedimiento utilizado de forma estándar con o sin la aplicación de campos eléctricos o magnéticos externos.

3.: En al menos uno de los dos sustratos se fijan receptores de dianas específicas basados en: anticuerpos, aptámeros, DNA, RNA, proteínas o fragmentos funcionales de los

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mismos, etc. El sustrato se puede funcionalizar por completo o solamente en un área específica. La funcionalización consiste en modificar la superficie del sustrato introduciendo grupos funcionales químicos que se enlazarán a dianas específicas.

4. Se ensamblan los dos sustratos, formando una célula con las caras interiores

5 enfrentadas entre sí y con una distancia calibrada (de un micrómetro a varios cientos de micrómetros) entre ambos sustratos.

5. Se introduce la muestra problema, que contiene la diana a detectar en la célula. Las células se pueden llenar por presión positiva o negativa, fuerza centrífuga o capilaridad, dependiendo de la estructura de la célula y su espesor.

10 6. Se lava el interior de la célula con una disolución tampón adecuada, utilizando alguno de los métodos de llenado del apartado 5.

7.: Se introduce el cristal líquido en la célula utilizando alguno de los elementos de flujo descritos más arriba.

8.: Se coloca la célula entre polarizadores cruzados para la detección de dianas.

15 También se pueden colocar los polarizadores fijándolos a las caras externas de los sustratos previamente al montaje de la célula.

9. Se observa la célula entre polarizadores cruzados para la detección de las dianas relevantes.

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Claims

REIVINDICACIONES

1. Un dispositivo para la detección amplificada de dianas que comprende: uno o más

5 medios de unión fijados en el dispositivo, con la capacidad de formar un complejo con una diana, medios para iniciar e introducir un flujo de cristal líquido hacia los medios de unión en una dirección preferencial dentro del dispositivo, y medios de polarización de luz configurados para visualizar el alineamiento de dicho cristal líquido.

10 2. El dispositivo según la reivindicación 1, caracterizado porque los medios de unión se seleccionan del grupo que consiste en: anticuerpos, aptámeros, ADN, ARN y proteínas, y fragmentos funcionales de los mismos, que contienen zonas específicas de unión a las dianas.
3. El dispositivo según cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, caracterizado porque la

15 diana está unida a grupos secundarios de forma específica aumentando la sensibilidad de la detección o la especificidad de la diana.
4.

El dispositivo según la reivindicación 3, caracterizado porque dichos grupos secundarios son enzimas.
5.

El dispositivo según cualquiera de las reivindicaciones 3 ó 4, caracterizado porque

20 dichas uniones específicas a grupos secundarios degradan compuestos específicos del cristal líquido.
6.

El dispositivo según cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5, caracterizado porque dichas uniones específicas a grupos secundarios están asociadas a una micropartícula.
7.

El dispositivo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque el

25 cristal líquido se selecciona del grupo que consiste en cristales líquidos termotrópicos, liotrópicos, liotrópicos cromónicos y mezclas de los mismos.
8. El dispositivo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado porque la diana se selecciona del grupo que consiste en micropartículas, proteínas, ADN, ARN, microorganismos y fragmentos de los mismos.

30 9. El dispositivo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizado porque dichos medios de flujo se seleccionan del grupo que consiste en inyección microfluídica directa, presión positiva, presión negativa, capilaridad, fuerza centrífuga y una mezcla de los mismos.
10. El dispositivo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, caracterizado porque 35 comprende un primer sustrato plano con una primera cara exterior y una primera cara

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interior, y un segundo sustrato con una segunda cara exterior y una segunda cara interior en donde al menos uno de los sustratos es total o parcialmente transparente.
11.

El dispositivo según la reivindicación 10, caracterizado porque, al menos una de las caras interiores, comprende medios de unión formando una capa de funcionalización, y porque, al menos una de las caras interiores, comprende una capa de alineamiento configurada para inducir el alineamiento de las moléculas del cristal líquido.
12.

El dispositivo según cualquiera de las reivindicaciones 10 u 11, caracterizado porque el primer sustrato y el segundo sustrato están separados por una distancia de entre 1 y 1000 µm.
13.

El dispositivo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, caracterizado por comprender dos o más medios de unión distintos con la capacidad de formar complejos con una o más dianas.
14.

El dispositivo según la reivindicación 13, caracterizado por comprender dos o más elementos de unión con la capacidad de formar complejos con dos o más dianas específicas distintas.
15.

El dispositivo según la reivindicación 14, caracterizado porque cada uno de dichos dos

o más medios de unión se encuentra en una región distinta del primer sustrato.
16.

El dispositivo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, caracterizado porque en una de sus regiones no se fijan elementos de unión
17.

El dispositivo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, caracterizado porque comprende medios de visualización y grabado que se seleccionan entre cámaras, vídeos y lentes.
18.

Método para la detección de una diana en una muestra, caracterizado porque comprende (i) poner en contacto la muestra con uno o más medios de unión con capacidad de unirse a dicha diana, (ii) accionar medios de flujo para crear un flujo de cristal líquido que contacte con los medios de unión, (iii) visualizar el alineamiento del cristal líquido mediante medios de luz polarizada, de forma que, en caso de estar la diana presente en la muestra, se observe una o más áreas de desalineamiento en el cristal líquido.
19.

El método según la reivindicación 18, caracterizado porque la detección tiene lugar al mismo tiempo que el flujo de cristal líquido.
20.

El método según la reivindicación 18, caracterizado porque la detección tiene lugar hasta 60 minutos después de finalizar el flujo de cristal líquido.
21.

El método según cualquiera de las reivindicaciones 19 ó 20, caracterizado porque después de la etapa (i), y antes de la etapa (ii), se lava con una disolución tampón.

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22.

El método según cualquiera de las reivindicaciones 19 a 21, caracterizado porque, en dicha muestra, se incuba la muestra con grupos secundarios según reivindicaciones 3, 4 ó 6 antes de la etapa (i).
23.

El método según cualquiera de las reivindicaciones 19 a 21, caracterizado porque, en dicha muestra, se incuba la muestra con grupos secundarios según reivindicaciones 3, 4 ó 6 antes de la etapa (ii).

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