ES2530292B2 - Construcción génica y métodos para detectar compuestos antifúngicos y antitumorales - Google Patents
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Abstract
Construcción génica y métodos para detectar compuestos antifúngicos y antitumorales.#La presente invención se refiere a una construcción génica para la amplificación de la respuesta a señales que activan la ruta de integridad celular (CWI) en Saccharomyces cerevisiae. Comprende un alelo hiperactivo de la MAPKK de esta ruta, bajo el control del promotor de un gen inducible por Rlm1, que implica la creación de un circuito de retroalimentación positiva cuya estimulación conduce a la muerte celular. La invención también se refiere a los métodos para detectar agentes que alteren la pared celular o la función de componentes de la propia ruta, lo que permite la detección de compuestos farmacológicos antifúngicos y/o antitumorales.
Description
- Construcción génica y métodos para detectar compuestos antifúngicos y
- antitumorales
- 5
- Sector de la Técnica
- La presente invención se encuadra en el sector de la industria farmacéutica
- biotecnológica Y, más concretamente, en programas de cribado farmacológico
- para búsqueda de compuestos con actividad antifúngica o modificadora de la
- señalización mediada por MAPKs (Mitogen Activated Protein Kinases).
- \O
- Eslado de la técnica:
- La epidemiología de la infección fúngica invasiva (IFI) ha cambiado en los
- últimos 20 años, por lo que hoy dia las micosis se consideran enfermedades
- emergentes. Su incidencia ha aumentado significativamente y la población de
- 1 S
- riesgo se ha extendido incluyendo a pacientes con diferentes enfermedades de
- base tales como los que padecen un cáncer hematológico, los ingresados en
- unidades de cuidados intensivos, los trasplantados de órgano sólido o aquellos
- que reciben altas dosis de corticosteroides u otros inmunosupresores (Garcia
- Vidal et al. , 2013. Pathogenesis of invasive fungal infections. Curr. Opin. Infec!.
- 20
- Dis. 26, 270-276). Además, este aumento se ha observado también en otras
- poblaciones de pacientes mucho más numerosas como son los que sufren
- enfermedad pulmonar obstructiva crónica. También es relevante el hecho de
- que la etiología de las micosis invasivas está cambiando. Además de Gandida
- albicans yAspergillus fumigatus, se están identificando como agentes causales
- 25
- de IFI otras especies como Candida glabrata, Aspergillus terreus, Trichosporon
- asahii, Fusarium spp , Scedosporium spp, Mucora/es y dematiaceos. Todas
- estas especies emergentes tienen la característica común de ser mucho más
- resistentes a los antifúngicos que C. albicans y A. fumigatus, lo que aumenta
- la mortalidad ya de por si elevada.
- 30
- El número actual de antifúngicos efectivos es relativamente reducido y,
- contrariamente a lo que se podía esperar por analogía con lo que ocurre en el
- caso de los fármacos antibacterianos que actúan sobre la pared celular, sólo
- se ha comercializado hasta el momento un tipo de compuestos antifúngicos
- que actúan sobre esta diana, inhibiendo la síntesis de ~-glucano: las
- equinocandinas (Drew el al. , 2013. Recent advances in the treatment 01 life-
- S
- threatening, invasive lungal infections. Expert. Opin. Pharmacother. 14,2361
- 2374). Una de las razones de la escasez de f;,rmacos antifúngicos de este tipo
- probablemente sea el limitado número de procedimientos de rastreo
- específicos dirigidos a esta diana, frente a la estrategia clásica de buscar
- inhibidores del crecimiento fúngico de una forma general. Se han propuesto
- 10
- algunas metodologías enfocadas a la búsqueda de antifúngicos que
- específicamente actúen sobre la pared celular, como son la búsqueda de
- compuestos inhibidores de GTPasas fúngicas que regulan el proceso de
- mantenimiento de la integridad de la pared celular (EP0892854B1),
- compuestos que puedan inhibir manosH-transferasas (N u O-glicosilaciones) ,
- 15
- que son enzimas ausentes en células de mamíferos y esenciales para el
- mantenimiento de la pared celular fúngica (US6153376A), o bien inhibidores
- específicos del producto de genes relacionados con esta estructura y que son
- esenciales para la viabilidad fúngica como CaKRE5, CaALR1 o CaCdc24
- (W00068420A2). Se han propuesto también estrategias orientadas a la
- 20
- valoración de la expresión de genes indicadores de la actividad de la vía de la
- gtuc;,n-sintasa, como son los genes SKM1, YPS3, YKL 161C (MLP1), MET10,
- etc. (W02004057033A1). Asimismo, se ha propuesto una metodología para
- identificar compuestos que alteren la pared celular mediante la valoración de la
- expresión del promotor de uno de estos genes, MLP1, en virtud de que su
- 25
- expresión está regulada por la ruta de integridad de la pared celular (CWI , Cell
- Wall Integrily) de forma dependiente del factor de transcripción Rlm1 , de
- manera que cuando se induce la ruta, consecuencia de una alteración
- significativa de la pared celular, este es el gen cuya expresión más se induce.
- La fusión de dicho promotor al gen de resistencia al antibiótico nurseotricina
- 30
- permite detectar la inducción de la ruta en función de la resistencia de la
- levadura a dicho antibiótico (ES2303452B 1).
Otra de las razones que podrían explicar el bajo número de inhibidores de la biogénesis de la pared celular fúngica identificados hasta el momento, podría ser precisamente la existencia del eficaz mecanismo de salvamento inducido
por la ruta CWI ante condiciones que hacen peligrar a esta estructura.
Todo tipo de células, desde las procarióticas más elementales hasta las eucarióticas más complejas, utilizan rutas de transducción de señales para reconocer el ambiente que las rodea y adaptarse a él, así como para comunicarse con otras células. De especial relevancia en organismos eucariotas son las rutas en las que intervienen MAPKs (Mitogen Activafed Protein Kinases) . Estas proteín quinasas regulan procesos esenciales como son la expresión génica o la traducción, estabilidad y localización de proteínas.
No es de extrañar, por tanto, que las MAPKs jueguen un papel esencial en
procesos como la embriogénesis, la proliferación y diferenciación celular, la apoptosis, la respuesta a estrés, la movilidad celular, la homeostasis metabólica, la inmunidad o la función cardiaca, o que las anormalidades en señalización por MAPKs se asocien con enfermedades humanas como la obesidad, diabetes, desórdenes neurodegenerativos, artritis reumatoide o
cáncer (Kim and Choi, 2010. Pathological roles of MAPK signaling pathways in human diseases. Biochim. Biophys. Acta. 1802,396·405).
Estas rutas, conservadas evolutivamente en eucariotas, comparten una
cascada de tres protein quinasas: una MAPK quinasa quinasa (MKKK o MEKK), una MAPK kinasa (MKK o MEK) y la propia MAPK, que se fosforHan y
activan sucesivamente en condiciones de estimulación. Una vez activadas, las MAPKs fosforilan a su vez a proteínas efectoras, por ejemplo, factores de
transcripción, regulando de esta manera la expresión génica (Yang et al., 2013. MAP kinase signalling cascades and transcriptional regulation. Gene 513, 113).
En la levadura Saccharomyces cerevisiae, un organismo unicelular eucariótico,
operan 5 MAPKs: Fus3, Kss1 , Hog1 , Smk1 y Slt2, que definen 5 rutas que
regulan el apareamiento, el crecimiento filamentoso, la respuesta a condiciones de estrés osmótico, la formación de las esporas y la integridad celular, respectivamente (Chen and Thorner, 2007. Function and regulation in MAPK
signaling pathways: Lessons learned lrom the yeast Saccharomyces cerevisiae. Biochim. Biophys. Acta. 1773, 1311-1340). En respuesta a una
agresión a la pared celular de S. cerevisiae, una estructura esencial que la
protege y da lorma, se produce la estimulación de la ruta mediada por la MAPK Slt2, denominada ruta de integridad de la pared celular (CWI; revisado por Levin en 2005 -Levin, D.E., 2005. Cell wall integrity signaling in Saccharomyces cerevisiae. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 69,262-291-). La activación de esta ruta
dispara un mecanismo compensatorio dirigido a mantener la estabilidad de la pared celular mediante una remodelación de la misma, fundamentalmente a
través de un cambio en el patrón de expresión génica, y con ello asegurar la
viabilidad celular frente a dicha agresión. La MAPK 5112 es activada por las
MAPKKs redundantes Mkkl y Mkk2 quienes a su vez son activadas por la MAPKKK Bckl. Bckl recibe el estimulo de la proteina kinasa C Pkcl , a su vez activada por la GTPasa Rhol en respuesta a la señal detectada por los mecanosensores de membrana Mid2 y Wscl ,2,3. Una vez activada, SIt2 loslorila y activa al lactor de transcripción Rlml , que promueve un incremento en la transcripción de una serie de genes, entre ellos YKL 161C (MLP1), CRH1, CWP1, SLT2 o RLM1 . Por otro lado, la pared celular no está presente en
células de mamíferos, mientras que esta ruta también está conservada en
hongos patógenos, como Candida albicans (Navarro-Garcia, F. el al. , 2001.
Signal transduction pathways and cell-wall construction in Candida albicans.
Med. Mycol. 39 Suppl1, 87-100), Aspergitlus fumigalus (May, G.S el al. , 2005. Mitogen activated protein kinases 01 Aspergillus fumigalus. Med.Mycol. 43 Suppl 1, S83-S86) o Cryplococcus neofonnans (Kozubowski, L. el al., 2009. Signalling pathways in the pathogenesis 01 Cryplococcus. Cell Microbiol. 11, 370-380).
En conclusión, es necesario desarrollar nuevos sistemas de búsqueda y estrategias terapéuticas para solventar estos problemas. En esa línea de
actuaciones se incluye la invención aquí presentada, que se orienta a la utilización de cepas hipersensibles para el rastreo farmacológico de compuestos que específicamente dañen la pared celular fúngica, o inhiban el mecanismo compensatorio controlado por la ruta CWI.
Descripción detallada de la invención
Construcción génica y métodos para detectar compuestos antifúngicos y antitumorales.
Para obtener un sistema con el que rastrear nuevos fármacos con efecto potencialmente antifúngico, en la presente invención se ha realizado una construcción génica que incluye el gen MKK1 de Saccharomyces cerevisiae modificado mediante una mutación que da lugar a un cambio en el aminoácido 386 de la proteína, de manera que la serina de la secuencia silvestre está sustituida por una prolina, lo que da lugar a una forma hiperactiva del gen (MKK1 S380P ): en la construcción génica, además, dicho gen está precedido por una secuencia promotora inducible por el factor de transcripción Rlm1 de la ruta CWI y también se incluye una secuencia de terminación de la transcripción.
En la presente invención, por "secuencia promotora" se entiende la región de una molécula de ADN a la que se une la ARN polimerasa para iniciar la transcripción y por "secuencia de terminación de la transcripción" se entiende la secuencia de ADN localizada en el extremo de la porción transcrita, y que causa que la ARN polimerasa termine la transcripción.
Un aspecto de la presente invención se refiere a una construcción génica que comprende los siguientes componentes, en el orden que se indica en la dirección de transcripción de 5' a 3': -la secuencia promotora de un gen inducible por el factor de transcripción Rlm1 de la ruta de integridad celular (CWI) de Saccharomyces cerevisiae, -una secuencia de ONA cuya expresión da lugar a la proteína Mkk1 de Saccharomyces cerevisiae con una mutación que produce la modificación del aminoácido S386 por P386 en dicha proteína, denominada Mkk1 s386P, según se describe en SEO ID NO: 3, y
5 -una secuencia de terminación de la transcripción. En esta construcción génica la distancia entre el extremo 3' de la secuencia promotora y el extremo 5' de la secuencia de ONA cuya expresión da lugar a la proteína Mkk1s386P es menor o igual a 18 nucleótidos y la distancia entre el extremo 3' de la secuencia de ONA cuya expresión da lugar a la proteína
10 Mkk1 s386Py el extremo 5' de la secuencia de terminación es menor o igual a 18 nucleótidos. De hecho, en la unión entre dos de los componentes de la construcción pueden quedar, por ejemplo, nucleótidos de secuencias diana de enzimas de restricción insertadas en la secuencia de uno o varios componentes para facilitar la unión de los distintos componentes de la construcción, o bien
15 otras secuencias de nucleótidos, siempre que no alteren la funcionalidad de la construcción.
En una realización preferida, la secuencia promotora pertenece al gen YKL161C (MLP1), que se describe en SEO ID NO:1. Por otro lado, cemo 20 secuencia de terminación de la transcripción, una realización preferida incluye la secuencia de terminación ADHt, descrita en SEO ID NO:4. La realización más preferida de la invención, caracterizada por SEO ID NO: 13, incluye
pYKL161C y ADHt.
25 La sobreexpresión del alelo de MKK1s386P que codifica una versión hiperactiva de esta MAPKK es letal para la célula. Se ha elaborado una construcción génica que da lugar a un circuito genético de retroalimentación positiva que conduce a una elevada amplificación de la señal que se transmite a través de la ruta CWI de la levadura S. cerevisiae y resulta en lelalidad para las células.
30 La construcción génica objeto de esta invención conduce a una amplificación conlinua de la señal transmitida por la MAPK SIt2 a través del factor de
transcripción Rlm1. El esquema que incluye una realización preferida de la
invención es: pYKL161C-MKKls 386P-ADHt, y por tanto comprende los
siguientes componentes:
pYKL161C-promotor del gen YKL161C (MLPI), caracterizado por SEO
ID NO: 1, que presenta una elevada inducción transcripcional en respuesta a
daño en pared y a estimulas que activan la ruta CWI.
MKKls 386P_ caracterizado por SEO ID NO: 2; alelo de MKKI que codifica una versión hiperactiva de esta MAPKK, cuya sobreexpresión es letal para la célula.
ADHt-región de terminación transcripcional del gen ADHI, caracterizada por SEO ID NO: 4.
Otro aspecto de la invención se refiere a vectores en los que se han insertado las posibles construcciones de la invención. Estos vectores, posteriormente, pueden utilizarse para transformar células de S. cerevisiae. Además, las construcciones de la invención pueden integrarse directamente en el genoma de una cepa de S. cerevisiae.
La invención también incluye a la cepa de S. cerevisiae depositada con fecha 26 de septiembre de 2014 en la Colección Española de Cultivos Tipo (CECT), ubicada en el Parque Cientifico de la Universidad de Valencia, 46980 Paterna
(Valencia), con número de acceso CECT13115 que, internamente, recibe la
referencia yEA 1.
Tal y como se indica en la figura 1, en una célula que incluye la construcción génica de la invención, se genera un circuito de amplificación, de retroalimentación positiva, y la estimulación de la ruta supone la activación de la cascada de quinasas hasta 51t2, la fosforilación y activación de Rlm1 , la
inducción del promotor YKL161C y la expresión del alelo hiperactivo correspondiente. Su expresión conduce a una mayor activación de Slt2, por tanto de Rlm1, y por tanto una mayor expresión de YKL 161C, generándose un
bucle de activación que se retroalimenta positiva y continuadamente mientras se mantenga el estímulo. Ello conlleva una gran amplificación de la sef"lal y, por tanto, una respuesta celular excesiva, lo que conduce a la muerte de la célula a bajas concentraciones de cualquier agente que altere la pared de S. cerevisiae. Por tanto, la construcción génica de la invención confiere a las células que la portan una hipersensibilidad a los estímulos que activan la ruta
CWI.
Esta invención tiene aplicaciones como sistema biosensor de estímulos externos. Las cepas que incluyen la construcción génica pueden utilizarse para detectar con más facilidad estímulos débiles que activen naturalmente la ruta
CWI, debido a su mayor sensibilidad.
La capacidad biosensora de las cepas fúngicas con la construcción genica que
da lugar al circuito amplificador de señal permite su utilización como herramienta de cribado farmacológico para la identificación de diferentes tipos de fármacos:
i) Por una parte, para la búsqueda de antifúngicos.
Con una cepa de levadura que incluya la construcción génica de la invención,
que da lugar al circuito de amplificación en la ruta CWI, podemos rastrear 2
tipos de compuestos con actividad antifúngica de una manera muy sencilla y
sensible:
(A) compuestos que alteran procesos de la pared celular o dañan
directamente dicha estructura. Estos compuestos provocan la muerte celular al
estimular el circuito de amplificación de la ruta CWI, lo que se detecta mediante sistemas de rastreo HTS (High throughput screening). La cepa que contiene la
construcción génica es hipersensible al daño en la pared, debido al efecto
amplificador de la senal, por lo que puede permitir descubrir compuestos que, siendo activos sobre esa diana, esten en baja concentración o tengan una
potencia reducida en la muestra a ensayar (productos naturales o de síntesis
- química), por lo que no podrían ser detectados directamente como inhibidores
- del crecimiento fúngico en una cepa silvestre de S. cerevisiae.
- (B) compuestos que inhiben a componentes de la ruta CWI y, por tanto,
- S
- al mecanismo compensatorio que se dispara en condiciones de daño en la
- pared celular y que permite mantener la integridad de esta estructura esencial.
- Este segundo tipo de compuestos podría potenciar la acción de otros
- antifúngicos que actúen directamente sobre la pared celular en terapias
- combinadas. Estos compuestos se identifican por su capacidad de evitar la
- 10
- muerte celular de las cepas fúngicas que incluyen las construcciones génicas
- de la invención en condiciones de activación del circuito de amplificación por
- algún estimulo conocido de la ruta CWI. El hecho de que su forma de
- identificación en el rastreo sea por recuperación de la viabilidad celular,
- favorece el aislamiento de compuestos con poca toxicidad per se sobre la
- 15
- célula eucariótica.
- ii) Por otra parte, este bioensayo se puede utilizar en el rastreo
- farmacológico para la búsqueda de antitumorales.
- 20
- Hay que tener en cuenta que tanto las proteínas que operan en las rutas
- mediadas por MAPKs en la levadura S. cerevisíae, como los mecanismos de
- activación, las interacciones moleculares que determinan el reconocimiento y
- la especificidad de sustratos o la localización subcelular de los componentes,
- son muy parecidos a los del resto de organismos eucarióticos, incluyendo los
- 25
- de eucariotas superiores. De hecho, esta conservación estructural y funcional
- ha hecho posible el uso de S. cerevísiae como modelo experimental de célula
- eucariótica para la clonación o caracterización de genes humanos que
- codifican proteínas de señalización. Por tanto, los posibles compuestos que se
- obtendrían en un cribado con el segundo bioensayo anteriormente descrito (B)
- 30
- como inhibidores de los componentes de la ruta CWI son, potencialmente,
- inhibidores de rutas de MAPKs similares en células de mamífero. Dado que, en
- este caso, la diana no es específica de hongos, los compuestos seleccionados
pueden tener efecto antitumoral ya que estas rutas de MAPKs son esenciales en la proliferación celular de células eucarióticas superiores, jugando un papel fundamental en algunos procesos oncológicos.
El desarrollo de bioensayos utilizando este sistema , ya sea mediante el uso de la construcción génica o mediante el uso de los vectores ylo células que la contienen, tiene una serie de ventajas destacables, como es su fácil
adaptabilidad a la tecnologla de alto rendimiento (HTS), ya que admite formatos de alta densidad , presenta un sistema de detección muy fácil (medida de
crecimiento por espectrometría, frente a otros sistemas basados en genes reporteros que implican medida de actividad enzimatica), rapidez en la obtención de resultados, bajo coste (permite el uso de medios de cultivo
sencillos no definidos, sin requerimientos nutritivos especificos), etc. Una
innovación importante de este sistema es la combinación de una elevada sensibilidad de las levaduras que portan la construcción génica de la invención con una gran selectividad de acción.
Otro aspecto de la invención se refiere a un kit para la detección de compuestos
antifúngicos y/o antitumorales que incluye las construcciones génicas, los vectores y/o las células eucariotas de la invención.
En conclusión, las cepas de levaduras que incluyen esta construcción génica constituyen un sistema sencillo, fácil de manipular, sensible, especifico, seguro
y muy económico de búsqueda de compuestos tanto que alteren la pared fúngica como que modifiquen la senalización a través de rutas de MAPKs, y
por tanto con potencial actividad antifúngica o antitumoral.
Figura 1: Esquema ilustrativo de la forma de operar del circuito genético de amplificación y retroalimentación de la ruta CWI mediada por la MAPK SIt2 en
la levadura S. cerevisiae. Se muestran los distintos componentes que
- participan en esta ruta de respuesta a estrés sobre la pared celular y la composición de la construcción génica de la invención.
- S
- Figura 2: Ensayos de sensibilidad en medio líquido de la cepa yEA 1 Y las isogénicas silvestre BY4741 y mutante Y00993 (sIt2lJ), frente a rojo Congo (representado como "RC"), un compuesto alterante de la pared celular, utilizando un método de microdilución.
- 10
- Figura 3: Ensayos de recuperación de la viabilidad en medio líquido en presencia de rojo Congo de la cepa yEA1 y las isogénicas silvestre BY4741 y mutante slt2lJ, tras la adición de cercosporamida (representada como "C"), un agente que inhibe la señalización a través de la ruta CWI, utilizando un método de microdilución.
- 15
- Modo de realización de la invención La presente invención se ilustra adicionalmente mediante los ejemplos, los cuales no pretenden ser limitativos de su alcance. siguientes
- 20 25
- Ejemplo 1: Construcción del plásmido pEAl que incluye la cassette de amplificación de la señal de la ruta CWI. Para construir el plásmido pEA1 con la cassette de amplificación de la señal de la ruta CWI , se amplificaron por separado y mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) los tres módulos que incluye la construcción génica de la invención (los sitios de corte de las correspondientes enzimas de restricción se indican mediante subrayado):
- 30
- Región promotora del gen YKL161C, utilizando los oligonucleótidos cebadores MLP1PR5 (CCCCGGAATTCGGGCCCACAACAAGAACGT GGGCGATAC), caracterizado por SEQ ID NO: 5, que introduce puntos de corte EcoRI y PspOMI; y MLP1PR3 (CCCCCTCGAGCATTTAATTG TGAATCTTTCTTCG), caracterizado por SEQ ID NO: 6, que introduce
un punto Xhol. Como molde se utilizó DNA genómico de la cepa S288C
de S. cerevisiae.
Amplificación de la versión hiperactiva del gen MKK1s386P. Se utilizaron
los oligonucleótidos cebadores MKKI-5 (CCCGTCGACTCGAGATGG CTICACTGTICAGACC), caracterizado por SEO ID NO: 7, que
introduce sitios de corte Sall-Xho/ al comienzo de la secuencia
amplificada y el oligonucleótido MKKI-3 (CCCGTCGACTIAATCTTIC CAGCACTICC), caracterizado por SEO ID NO:8, que introduce un sitio
Sall al final de la secuencia amplificada. Como molde se utilizó el
plásmido pNV7W_MKK1s386P (Watanabe, Y. el al. 1995. Yeast RLMl
encades a serum response factor-like protein that may function
downstream of the Mpkl (Slt2) mitogen-activated protein kinase pathway. Mol. Cell Biol. 15, 5740-5749).
Amplificación de la región terminadora del gen ADH1 , con los
oligonucleótidos ADHT5 (CCCCGGATCCGTCGACCCTGAGTAAATAA GCG), caracterizado por SEO ID NO: 9, que introduce sitios de corte BamHI-Sall, y ADHT3B (CCCCCGGATCCCGGTGGTGGTCAATAAG), caracterizado por SEO ID NO: 10, que introduce un sitio de corte BamHI. Como molde se utilizó DNA genómico de la cepa S288C de S.
A continuación, la construcción génica se ensambló subclonando en tándem los tres módulos indicados anteriormente, siguiendo la secuencia EcoRI
pYKL161C-Xhol-MKK1S386P-San-ADHI-BamHI , y se introdujeron como un fragmento génico en el vector de integración M4366 HO-hisG-URA3-hisG-polyHO (Voth el al. 2001. Yeast vectors for integration at the HO locus. Nucleic Acids Res. 29, E59) (número de acceso AF324729) entre los sitios EcoRI y BamHl, generándose el plásmido pEAl.
Ejemplo 2: Construcción de la cepa recombinante yEA1 de S. cerevisiae
Para construir la cepa recombinante yEA1 de S. cerevisiae, se integró la
construcción génica pYKL 161C-MKK1S386P-ADHI en el genoma de la cepa silvestre BY4741 (colección EUROSCARF) mediante su transformación con el fragmento Notl-Notl procedente del plásmido pEA 1, dirigiéndose por tanto la
integración al locus HO de dicha cepa. Para la transformación, se siguió el método del acetato de litio seleccionando los transformantes en medio carente 5 de uracilo. Se confirmó su integración en el locus HO mediante ensayos de amplificación por PCR, utilizándose los oligonucleótidos 5'
CTGATATGTCTGAGG-3' , caracterizado por SEO ID NO: 11 , que hibrida en el gen HO, y 5 '-CATIGGAAATIAGGGC '-3, caracterizado por SEO ID NO: 12, que hibrida en la secuencia de la región promotora del gen YKL 161C. Tras la
10 verificación de su integración correcta, se forzó la pérdida del marcador de selección URA3, presente en la cassette de integración, mediante el cultivo en presencia de ácido 5-fluoroorótico, que resulta tóxico para aquellas células
portadoras del gen URA3, obteniéndose la cepa yEA 1.
15 Ejemplo 3: Ensayo de la cepa yEA1 frente a agentes alterantes de la pared
celular.
A modo de ejemplo de la aplicabilidad de este sistema en la búsqueda de antifúngicos alterantes de la pared celular fúngica, se muestra la inhibición del
crecimiento que provoca el rojo Congo, una sustancia que se une a la quitina
20 de la pared celular e interfiere con la estabilidad de la pared celular de la
levadura. Los ensayos se realizaron en la cepa yEA 1, en comparación con la
cepa silvestre BY4741 y con una cepa mutante slt2Ll isogénica (la cepa Y00993 de EUROSCARF). El ensayo se realizó mediante el cultivo de un preinóculo de cada cepa de levadura en medio YPD (Yeast Extraet-Peptone-Dextrose, medio
25 común de crecimiento de hongos) hasta una concentración de 2 x 107 células (equivalente a una 00600 entre 0,8 y 1,2), desde el cual se diluyó el cultivo hasta una DO estimada 0,01 , inoculándose 75 ~I de esta suspensión en cada pocillo de una placa multipocillo (96 pocillos), que contenia 75 ~I de medio fresco YPD en cada pocillo, al que se añadió rojo Congo en una concentración
30 comprendida entre 0,0029 y 1 ,5 ~g/ml, tal y como se indica en la Figura 2. Las placas multipocillo se incubaron a 24°C durante 24 horas, valorándose el crecimiento de las tres cepas utilizadas en un lector de placas como
absorbancia a 600nM. En el gráfico de la Figura 2, se muestra el
comportamiento en este ensayo de las tres cepas, con el crecimiento representado en ordenadas y las concentraciones de rojo Congo utilizadas en el eje de abscisas. Se puede observar cómo la Concentración Mínima
Inhibitoria (CMI) de este compuesto sobre la cepa yEA 1 que incluye la
construcción génica de la invención es menor que sobre la cepa silvestre
BY4741 e, incluso, que sobre la cepa delecionada en el gen SLT2. Ello indica la elevada sensibilidad de la cepa yEA 1, que porta la construcción génica aqui
Ejemplo 4: Ensayo de la cepa yEA 1 frente a agentes inhibidores de la señalización a través de la ruta CWI. A modo de ejemplo de la aplicabilidad de este sistema en la búsqueda de compuestos inhibidores de la ruta CWI de
hongos, se muestra un ensayo de recuperación del crecimiento por cercosporamida. La cercosporamida es un inhibidor comercial de la protein kinasa Pkc1 , componente esencial en la sef'lalización a través de la ruta CWI. El ensayo se realizó igual que en el ejemplo 3, con la excepción de que se
aMdió una concentración fija de O,025~g/ml de rojo Congo a todos los pocillos para inducir el circuito genético de retroalimentación positiva a que da lugar la
construcción génica de la invención y concentraciones variables de cercosporamida, en un rango que no resulta tóxico para la cepa silvestre (entre 2,5 y 40~g/ml); se utilizaron, además, las mismas tres cepas que en el ejemplo
3. En el gráfico de la Figura 3 se muestra, en ordenadas, el crecimiento en estas condiciones de las tres cepas ensayadas, tras 24 horas de incubación a 24°C, frente a las concentraciones de cercosporamida utilizadas, en el eje de abscisas. Se observa la recuperación del crecimiento que provocó la
cercosporamida en la cepa yEA1 a partir de una concentración de 20~g/ml,
mientras que la cepa mutante s1t2L'l isogénica no creció a ninguna de las concentraciones ensayadas.
Texto libre de la lista de secuencias
El texto libre utilizado en la lista de secuencias se corresponde en espaf'lol a las siguientes características:
SEO ID NO: 5 Secuencia artificial de AON ; cebador basado en YKL 161C de Saccharomyces
EcoRI.
Nucle6tidos del 12 al 17: sitio de reconocimiento de la enzima de restricción PspOMI.
SEO ID NO: 6 Secuencia artificial de ADN; cebador basado en YKL 161C de Saccharomyces
Nucle6tidos del5 a110: sitio de reconocimiento de la enzima de restricción Xhol
SEO ID NO: 7 Secuencia artificial de ADN; cebador basado en MKK1 de Saccharomyces
cerevisiae Nucle6tidos del 4 al 9: sitio de reconocimiento de la enzima de restricción Sallo
Nucle6tidos del9 a114: sitio de reconocimiento de la enzima de restricción Xhol
SEO ID NO: 8 Secuencia artificial de ADN; cebador basado en MKK1 de Saccharomyces
cerevisiae.
Nucleótidos del4 al 9: sitio de reconocimiento de la enzima de restricción Safl.
SEO ID NO: 9 Secuencia artificial de AON; cebador basado en ADH1 de Saccharomyces cerevisiae.
Nucle6tidos del 5 al 10: sitio de reconocimiento de la enzima de restricción
BamHI.
Nucle6tidos del 11 al 16: sitio de reconocimiento de la enzima de restricción
Sa/l.
SEQ ID NO: 10 Secuencia artificial de ADN: cebador basado en ADHI de Saccharcmyces
Nucle61idos del 6 al 11: sitio de reconocimiento de la enzima de restricción
BamHI.
SEQ ID NO: 11
Cebador basado en el gen HO de Saccharomyces cerevisiae.
SEQ ID NO: 12 Cebador basado en la región promotora del gen YKL 161C de Saccharomyces cerevisiae.
SEQ ID NO: 13 Secuencias artificial de AON; construcción génica que comprende la región promotora del gen YKL161C, el gen MKKI5386P y la región de terminación del gen ADHI de Saccharcmyces cerevisiae. Nucleótidos del 1 al 6: sitio de reconocimiento de la enzima de restricción
EcoRI.
Nucle6tidos del 7 al 12: sitio de reconocimiento de la enzima de restricción
PspOMI.
Nucleótidos del 13 al 1204: promotor del gen YKL 161C de S. cerevisiae.
Nucleótidos del 1205 al 1210: sitio de reconocimiento de la enzima de
restricción Xhol.
Nucle6tidos del 1211 al 2737: gen MKKI5386P de S. cerevlsiae.
Nucleótidos del 2738 al 2743: sitio de reconocimiento de la enzima de
restricción Sa/l.
Nucleótidos del 2744 al 2938: región de terminación del gen ADHI de S.
cerevisiae.
Nucleátidos del 2939 al 2944 : sitio de reconocimiento de la enzima de restricción BamHI.
,.
Claims (13)
- REIVINDICACIONES
- 1.
- Construcción génica que comprende los siguientes componentes, en el orden que se indica en la dirección de transcripción de 5' a 3': -la secuencia promotora de un gen inducible por el factor de transcripción Rlm1 de la ruta de integridad celular (CWI) de Saccharomyces cerevisiae, -una secuencia de DNA cuya expresión da lugar a la proteína Mkk1 de Saccharomyces cerevisiae con una mutación que produce la modificación del aminoácido S386 por P386 en dicha proteína, según se describe en SEO ID NO: 3 y denominada Mkk1 SJ86P, y -una secuencia de terminación de la transcripción; en la que la distancia entre el extremo 3' de la secuencia promotora y el extremo 5' de la secuencia de DNA cuya expresión da lugar a la proleína Mkk1 s386P es menor o igual a 18 nucleótidos y la distancia entre el extremo 3' de la secuencia de DNA cuya expresión da lugar a la proteina Mkk1 s386Py el extremo 5' de la secuencia de terminación es menor o igual a 18 nucleótidos.
-
- 2.
- Construcción génica en la que la secuencia de DNA cuya expresión da lugar a la proleína Mkk1 5386P es el polinucleótido que se describe en SEO ID NO: 2, denominado MKK1s386P.
- 3.-Construcción génica según cualquiera de las reivindicaciones 1-2 en la que la secuencia promotora es la región promotora del gen YKL 161c, caracterizada por SEO ID NO: 1.
-
- 4.
- Construcción génica según cualquiera de las reivindicaciones 1-3 en la que la secuencia de terminación de la transcripción es la secuencia de terminación de gen ADHI de Saccharomyces cerevisiae, caracterizada por SEO ID NO: 4.
-
- 5.
- Construcción génica caraclerizada por SEO ID NO: 13.
-
- 6.
- Vector que contiene cualquiera de las construcciones definidas en las reivindicaciones 1-5.
-
- 7.
- Célula de S. cerevisiae que contiene el vector definido en la reivindicación 6.
-
- 8.
- Célula recombinante de S. cerevisiae que incluye en su genoma cualquiera de las construcciones definidas en las reivindicaciones 1-5.
- 9. Cepa de S. cerevisiae depositada en la Colección de Cultivos Tipo (CECT) 10 con el número de acceso CECT13115.
- 10. Método para detectar compuestos antifúngicos que alteran la pared celular fúngica que incluye los siguientes pasos: a) inocular una cantidad suficiente de una cepa de S. cerevisiae según se15 define en cualquiera de las reivindicaciones 7-9 en medio de cultivo que contiene, en sucesivos tubos, microtubos o pocillos, concentraciones crecientes de los productos que se desea evaluar; b) incubar el medio de cultivo inoculado del paso a); c) determinar el crecimiento de la cepa inoculada en el paso a);20 d) seleccionar el/los producto/s incluido/s en el medio de cultivo del paso a) en el que se detecte menor crecimiento de la cepa de S. cerevisiae definida en las reivindicaciones 7-9 con respecto a una cepa silvestre utilizada como control.
- 11 . Método para detectar compuestos antitumorales o antifúngicos inhibidores25 de la señalización a través de la ruta CWI que incluye los siguientes pasos: a) inocular una cantidad suficiente de una cepa de S. cerevisiae según se define en cualquiera de las reivindicaciones 7-9 en medio de cultivo que contiene un compuesto que estimula la ruta CWI y, en sucesivos tubos, microtubos o pocillos, concentraciones crecientes de los productos que se30 desea evaluar; b) incubar el medio de cultivo inoculado del paso a); c) determinar el crecimiento de la cepa inoculada en el paso a); d) seleccionar el/los producto/s incluido/s en el medio de cultivo del paso a) en el que se detecte mayor crecimiento de la cepa de S. cerevisiae definida en las reivindicaciones 7-9 con respecto a una cepa silvestre utilizada como control.5 12. Método según la reivindicación 11 en el que el compuesto estimulador de la ruta CWI del paso a) es el Rojo Congo.
- 13. Uso de la construcción génica, los vectores ylo las células definidas en lasreivindicaciones 1-9 en la detección de compuestos antifúngicos ylo de 10 compuestos antitumorales.
- 14. Kit para la detección de compuestos antifúngicos ylo antitumorales que incluye las construcciones génicas, los vectores ylo las células eucariotas definidas en las reivindicaciones 1-9.
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|---|---|---|---|
| ES201400935A ES2530292B2 (es) | 2014-11-21 | 2014-11-21 | Construcción génica y métodos para detectar compuestos antifúngicos y antitumorales |
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Applications Claiming Priority (1)
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|---|---|---|---|
| ES201400935A ES2530292B2 (es) | 2014-11-21 | 2014-11-21 | Construcción génica y métodos para detectar compuestos antifúngicos y antitumorales |
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| ES2530292A1 ES2530292A1 (es) | 2015-02-27 |
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| ES2303452B1 (es) * | 2006-10-30 | 2009-06-17 | Universidad Complutense De Madrid | Estirpe de la levadura saccharomyces cerevisiae y metodo para la dete ccion de sustancias antifungicas con actividad sobre la pared celular. |
-
2014
- 2014-11-21 ES ES201400935A patent/ES2530292B2/es active Active
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2015
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