ES2561708B2

ES2561708B2 - La hormona inhibidora de gonadotrofinas (GnIH) y su uso para controlar la pubertad, la reproducción, la ingesta y el crecimiento en peces

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Publication number: ES2561708B2
Application number: ES201400644A
Authority: ES
Inventors: José Antonio MUÑOZ CUETO; José Antonio PAULLADA SALMERON
Original assignee: Universidad de Cadiz
Current assignee: Universidad de Cadiz
Priority date: 2014-07-31
Filing date: 2014-07-31
Publication date: 2016-06-30
Anticipated expiration: 2034-07-31
Also published as: ES2561708A1; WO2016016478A1

Abstract

La hormona inhibidora de gonadotrofinas (GnIH) y su uso para controlar la pubertad, la reproducción, la ingesta y el crecimiento en peces.#La lubina, Dicentrarchus labrax, es una de las especies más cultivadas en la UE. Un problema en su cultivo es el adelanto de la pubertad, que conlleva crecimientos pobres y deterioro en la calidad de la carne. La presente invención se enmarca en el sector de Biotecnología (sector de aplicación de Acuicultura). La invención relata la estrategia de clonación de la hormona inhibidora de las gonadotrofinas (GnIH) de la lubina, que contiene dos nuevos péptidos de la familia RFamida. Estos péptidos han sido sintetizados y utilizados para generar anticuerpos específicos y han demostrado tener efectos inhibidores sobre diferentes factores neuroendocrinos y endocrinos que controlan la reproducción de la lubina. Esta invención puede resultar de interés para controlar la pubertad, la reproducción, la ingesta y el crecimiento de peces.

Description

LA HORMONA INHIBIDORA DE GONADOTROFINAS (GNIH) y SU USO PARA CONTROLAR LA PUBERTAD, LA REPRODUCCIÓN, LA INGESTA y EL CRECIMIENTO EN PECES.

5: SECTOR DE LA TÉCNICA

Según el área de la técnica esta invención se encuadra en el sector de la Biotecnología. Según el sector de aplicación, la invención tiene un interés para el sector de la Acuicultura, principalmente para la mejora y optimización de los cultivos de lubina y especies próximas (peces percomorfos).

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ESTADO DE LA TÉCNICA

lS: En vertebrados, el área preóptica y el hipotálamo representan las principales áreas neuroendocrinas que controlan la reproducción a través de su conexión con la hipófisis y la modulación de la secreción de gonadotrofinas. Los peces teleósteos, a diferencia de los tetrápodos, carecen de eminencia media y de un sistema que ponga en contacto vascular el hipotálamo con la hipófisis, por lo que las poblaciones celulares implicadas en el control neuroendocrino de la reproducción inervan de forma más o menos directa a las células del lóbulo anterior

20 25: adenohipofisario. Esta inervación directa de la hipófisis de peces teleósteos ha permitido caracterizar que neurohormonas o factores hipotalámicos pueden estar implicados en el control de la secreción de las hormonas adenohipofisarias. La presencia de fibras nerviosas de las células que producen la hormona liberadora de las gonadotrofinas (GnRH) en el entorno próximo de las células gonadotropas, constituyó una evidencia clara de la acción de estas neurohormonas sobre el ciclo reproductivo de peces (Kah et aL, 1987; 1989; 1992). Estas neurohormonas modulan la actividad de la hipófisis y desencadenan una serie de cascadas endocrinas que conducen a la reproducción (Kah et aL, 1993j Trudeau, 1997, Zohar et aL, 2010). La GnRH constituye el principal factor inductor del proceso reproductivo en todos los vertebrados, a través de la estimulación de la síntesis y

secreción de gonadotrofinas (GTHs), siendo su antagonista funcional en peces la dopamina, que inhibe la secreción estas hormonas adenohipotisarias que controlan la reproducción (GTHs), como se demostró en el carpín dorado (Peter y Paulencu, 1980; Chang y Peter, 1983; Chang el al., 1983). La existencia de una inhibición dopaminérgica sobre la secreción de gonadotrofinas ha sido demostrada en otras especies de peces teleósteos, taJes como la anguila, el pez gato, la trucha, la liJapia, el salmón coho, la carpa o el mujol (Van Asselt et al., 1988; Levavi-Sivan el aL, 2003; Vidat et aL, 2004; Dufour el al., 2005; Aizen el aL, 2005). Estos conocimientos pennitieron utilizar la GnRH y desarrollar compuestos agonistas y antagonistas de la GnRH y/o la dopa mina (pimozide, domperidona), así como métodos de combinación y administración de los mismos para controlar el proceso reproductivo de peces en la práctica acuícola, como se refleja en las patentes US5288705A, EP0368000B 1, US5643877 A, WO 19960 17619A9, US6210927BI , US7958848B2, entre otras. Sin embargo, la dopamina no parece operar en otros peces teleósteos, en particular en peces marinos como la lubina y otros percifonnes (Copeland and Thomas, 1989; King et al., 1994; Holland et aL, 1998b; Zohar and Mylonas, 2001 ; Prat et al., 2001).

La Honnona lnhibidora de las Gonadotrofinas (GnIH)

En el año 2000 se identificó en aves un pequefio péptido hipotalámico de 12 aminoácidos que actuaba directamente sobre la hipófisis inhibiendo la síntesis y liberación de gonadotrofinas (Tsutsui et al., 2000; Tsutsui et al., 2007), por lo que fue denominado honnona inhibidora de las gonadotrofinas o GnIH.

El precursor de la proteína que codifica el gen GnIH origina 2 o 3 posibles péptidos maduros, dependiendo de la especie, caracterizados por un extremo Cterminal que contiene la secuencia de aminoácidos LPQRFamida, que puede variar en uno o dos aminoácidos dependiendo de la especie estudiada. De los posibles péptidos que se encuentran codificados por el gen GnIH, solo aquellos que tienen un papel de inhibición de la secreción de las gonadotrofinas son denominados como GnlH.

La familia de la GolH incluye diferentes péptidos, que dependiendo del grupo filogenético, han recibido distintos nombres. Así, en mamíferos están caracterizados los péptidos RFRP-l, RFRP-2 Y RFRP-3; en aves se ha descrito un péptido GnIH, y dos péptidos relacionados con la GnIH denominados GnIHRP-l Y GnIHRP-2; en ranas se ha denominado al péptido GnIH como fGRP, y a los péptidos relacionados codificados por este precursor como fGRP-RP-I, tGRP-RP2; en peces teleósteos, tales como el pez cebra o el carpín dorado, se han descrito tres posibles péptidos GnIH, denominados LPXRFa-l, LPXRFa-2 y LPXRFa-3, pudiendo ser la X=L o Q (Parhar el al., 2012).

La identificación y localización cerebral de este neuropéptido, mediante técnicas ELISA, técnicas inmunohistoquimicas, técnicas de hibridación in situ (Tsutsui et al., 2000; Tsutsui y Ukena, 2006; Tsutsui et al., 2007), así como la distribución de las fibras en zonas donde se ubican las células liberadoras de gonadotrofinas, sugieren que la GnIH tiene un efecto modulador de la síntesis y liberación de la propia GnRH además de ejercer sus efector inhibidores directos sobre la secreción de gonadotrofinas (hormona luteinizante (LH) y hormona estimulante del foliculo (FSH)) como se ha demostrado en vertebrados tales como aves y mamíferos. Además de lo mencionado anteriormente, la Gnlli también impide el desarrollo gonadal, la síntesis de esteroides y la actividad espennatogénica en aves, lo que sugiere que este neuropéptido puede actuar a distintos niveles del eje reproductivo (Tsutsui et al., 2007; Bentley et al., 2009).

La presencia de células GnIH en el hipotálamo posterior parece ser una característica conservada a lo largo de la evolución de vertebrados (Tsutsui et al., 2007). Así, recientemente se ha puesto también de manifiesto la presencia de un péptido similar de tipo LPXRF-amida en peces (Sawada et al., 2002; Osugi et al., 2006; Tsutsui et al., 2007). La localización del péptido del tipo LPXRF-amida (homologo a la GnIH de aves y mamíferos) en peces, incluida la lubina europea, ha permitido caracterizar la presencia del mismo en células de áreas cerebrales tales como el bulbo olfativo/nervio terminal, y en el área preóptica, zonas donde se encuentran ubicadas las células de tipo GnRH-I1I y GnRH-I, respectivamente

(González-Martínez el al., 2001, 2002). También se han localizado células GnIH en la región del tegmento mesencefálico, donde se encuentran las células de tipo GnRH-II (González-Martínez el al., 2001, 2002). La presencia de inervación GnIH en áreas neuroendocrinas relacionadas con la reproducción como el área preóptica y el hipotálamo, la inervación GnIH presente en la hipófisis y la expresión de GnIH en las gónadas de la lubina, hace pensar que la GnlH también puede estar ejerciendo efectos inhibidores a distintos niveles del eje reproductivo en peces percifonnes y, mas concretamente, en la lubina europea, donde se ha centrado nuestro estudio.

La relación entre la función reproductiva y el balance energético esta bien establecida y, como regla general, aquellos péptidos que estimulan la ingesta suprimen la función reproductiva y viceversa. Estudios recientes han demostrado que además de sus funciones reproductivas, la GnIH puede también tener un efecto estimulador en la ingesta de alimentos. Este efecto estimulador ha sido obsetvado en diferentes especies de pájaros (Tachaibana et al., 2005, 2008) Y roedores (Johnson et al., 2007; Johnson y Fraley, 2008, Murakami et al., 2008). Sin embargo, el tratamiento con GnIH humana en gallos tiene un efecto inhibidor de la ingesta (eline et aL, 2008), lo que sugiere la importancia especie-especifica de la secuencia de aminoácidos de la GnIH para su efecto fisiológico. El hallazgo dc proycccioncs GnIH en el ccrcbro dc ovcja cn el entorno de las células secretoras de neuropéptido Y (NPY) Y de las propio mela cortinas (POMC), concuerda con el efecto descrito de la GnIH sobre la ingesta de alimento y sugiere que estas interacciones pueden mediar en estos efectos (Qi et al., 2009). Por todo lo dicho anteriormente, la GnIH parece ser un neuropéptido multifuncional, que controla el balance que existe entre reproducción, ingesta y crecimiento.

Problemática planteada.

La producción de mundial de alimentos deberá crecer un 70% entre 2010 y 2050. En relación a los alimentos de origen acuáticos, más de la mitad del total consumido hoy en el mundo procede de granjas de acuicultura. En 2030 se estima

que esta producción rondara el 65%. Así, la producción de pescado de acuicultura

en la Unión Europea en 2011 fue 647.156 Toneladas, siendo Espafia el Estado

miembro de la VE con mayor volumen de producción en acuicultura con 271.963

t. en 2011, un 7,8% más que en 2010 (frente al 2,3% de incremento de la pesca) y

5: con un valor económico de 457 millones de euros, un 9,7% más que en 2010

(Informe APROMAR 2013).

La lubina, Dicentrarchus lahrax, es junto a la dorada, una de las especies que

sostienen la producción de la acuicultura marina en Andalucía, en España y en

Europa. Entre las principales especies acuícolas de la Unión Europea, la lubina se

10: situó en el 60 lugar en cuanto a producción (73.196 Tn), yen So lugar en cuanto a

valor económico (casi 400 millones de euros). En la Comunidad de Andalucía la

lubina acumuló en 2012 el 66% de la producción de peces, con 4.150 Toneladas y

un valor de 29,4 millones de euros.

No obstante, aunque el cultivo de lubina está en la actualidad ampliamente

lS: distribuido, la reproducción controlada de esta especie y su producción son

manifiestamente mejorables. En el caso de la lubina, uno de los principales

problemas que se presentan es el adelanto de la pubertad y de la primera

reproducción en condiciones de cultivo, en particular en machos. Este aspecto

debe ser tenido muy en cuenta por su implicación práctica en la productividad de

20: las piscifactorfas (Carrillo et aL, 1993; 1995; 2009). Un desarrollo gonadal precoz

conlleva crecimientos pobres y un deterioro de la calidad de la carne, como se ha

puesto de manifiesto en salmónidos, carpas, lubina y bacalao, por lo que en estas

especies es conveni ente suprimir o retrasar la pubertad para permitir un mayor

crecimiento somático adecuado del animal.

2S: Además, hay que tener en cuenta que la temperatura representa un factor limitante

en la reproducción de esta especie. Las ovulaciones y las puestas en hembras sólo

se producen de forma espontánea cuando el rango de temperatura es 9-17°C, y por

encima de 16-17°C la puesta se bloquea a pesar de que las hembras han alcanzado

la maduración (Carrillo et al., 2009). Ello implica en muchos casos la necesidad

30: de enfriar el agua en las instalaciones acuícolas, con el consiguiente coste

económico. Sin embargo, los mecanismos mediante los cuales las temperaturas elevadas inhiben el proceso reproductivo están aún sin esclarecer.

Por ello, la presente invención se centra en la clonación y caracterización del precursor de la hormona inhibidora de gonadotrofinas o GnIH. síntesis de los S péptidos maduros sbGnIH-1 y sbGnlH-2, generación de anticuerpos específicos contra los péptidos sbGnIH-l y sbGnIH-2, su uso para identificar las células GnIH y sus proyecciones, así como en la determinación de los efectos de la GnlH en la lubina europea Dicentrarchus Jabrax. Estas herramientas generadas pueden ser de gran utilidad para solventar estos problemas de pubertad precoz en la lubina

10 y dilucidar los mecanismos mediante los cuales se inhibe la reproducción en la lubina, proporcionando la posibilidad de generar antagonistas funcionales de la GnIH que sean usados para favorecer la reproducción de esta especie.

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BREVE DESCRIPCiÓN DE LA INVENCiÓN

La presente invención hace referencia al hallazgo y aislamiento del AON copia de

un nuevo neuropéptido correspondiente al precursor de la hormona inhibidora de

gonadotrofinas (GoIH o LPXRFa) en peces perciformes y, mas concretamente, en

S: la lubina europea, Dicentrarchus labrax. Además, hemos diseñado y sintetizado a

partir de dicho precursor dos péptidos maduros denominados sbGnIH-l o

sbLPXRFa-l y sbGnIH-2 o sbLPXRFa-2. Estos péptidos han sido modificados

con una amidación e-lenninal y un residuo de cisteína N-terminal para su

acoplamiento a KLH, con objeto de favorecer el proceso de inmunización y la

10: generación de anticuerpos específicos contra la GnIH-l y la GnIH-2 de lubina en

conejos (anti-sbGnIH-1 y anti-sbGnIH-2) y en cabras (anti-sbGnIH-2). Estos

anticuerpos han sido utilizados para caracterizar el patrón de localización de las

células GnIH-inmunopositivas y sus proyecciones en el cerebro y la hipófisis de la

lubina. La invención incluye también ensayos de inyección que ponen de

15: manifit!sto un claro efecto inhibidor de la GnIH sobre diferentes factores

neuroendocrinos y endocrinos que controlan el proceso reproductivo de la lubina.

Esta invención nos ha pennitido profundizar en el conocimiento de los

mecanismos mediante los cuales se controla y se inhibe la reproducción en la

lubina. Esta invención puede ser de gran utilidad para controlar la pubertad de la

20: lubina y solventar los problemas de pubertad precoz en los machos de esta

especie. Dado que el desarrollo gonadal precoz conlleva crecimientos pobres y un

deterioro de la calidad de la carne, suprimir O retrasar la pubertad puede pennitir

un mayor crecimiento somático del animal, con los consiguientes beneficios para

la producción en la práctica acuÍcola. Asimismo. esta invención abre la

25: posibilidad de usar el ADN copia y los anticuerpos específicos generados para

bloquear los efectos inhibidores de la GnIH sobre la reproducción, así como

generar antagonistas funcionales de la GnIH que sean usados para promover el

desarrollo gonadal, la maduración, la puesta y favorecer la reproducción de la

lubina. Por tanto, la aplicación de esta invención pennitirá resolver problemáticas

30: reales que se presentan en el cultivo acuícola de la lubina y que afectan a la

reproducción y el crecimiento de esta especie. Además, es de esperar que estas herramientas generadas puedan ser de aplicación a especies próximas a la lubina y, en particular, a peces pcrcomorfos como la dorada, la scriola, la corvina o el atún.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

l. Clonación y caracterización del ADN copia de la GnIH de lubina

Para la clonación de la GnIH de lubina hemos partido de una librería de expresión de cerebro y hemos seguido una estrategia basada en el uso de ccbadores degenerados para la amplificación por PCR sobre la misma. La amplificación mediante PCR y la posterior c1cctroforcsis permitieron identificar bandas del tamaño esperado. Estas bandas fueron aisladas, los ácidos nueleicos fueron cluídos y la sccucnciación de estos fragmentos de ADN y su posterior comparación y alineamiento con las secuencias GnIA de otras especies disponibles en las bases de datos nos pennitió determinar que se trataba de una secuencia parcial del precursor de la honnona inhibidora de gonadotrofinas de la lubina (GnIH o precursor LPXRFamida).

Posterionnente, utilizando oligonueleótidos específicos diseñados a partir de la secuencia parcial clonada de lubina, y mediante la modificación de los extremos 5'y 3' Y la utilización de kits comerciales (SMARTcr RACE cDNA Clontech), obtuvimos la secuencia completa de nueleótidos que codifican para el precursor de la GnlH (o precursor LPXRFamida) de lubina. La secuencia completa clonada de la GnIA de lubina consta de 878 nucleótidos (SEQ ID NO 1), de los cuales 600 nucleótidos (SEQ ID NO 2) codifican el péptido precursor de la GnIA de lubina (ORF) de 200 aminoácidos (SEQ ID NO 3), 49 nueleótidos corresponden al extremo 5 'UTR Y 226 nueleótidos corresponden al extremo 3 'UTR y a la cola poli-A. A diferencia de otros vertebrados, en los que se han descrito tres posibles péptidos GnIA, en estc precursor de lubina hemos identificado solo dos posibles péptidos funcionales, denominados sbGnIH-l o sbLPXRFa-l (PLHLHANMPMRF, SEQ ID NO 4) Y sbGnIH-2 o sbLPXRFa-2 (SPNSTPNMPQRF, SEQ ID NO 5) (Figura l y 2). El análisis filogenético identificó claramente la secuencia clonada en la lubina dentro de la rama en la que se ubican las secuencias GnIHILPXRFa de peces y otros vertebrados (Figura 3).

2.: Expresión de la GnIH de lubina en tejidos centrales y periféricos

Una vez clonada e identificada la secuencia, se diseñaron cebadores específicos para estudiar, mediante PCR convencional (RT-PCR), la distribución tisular del ARN mensajero en tejidos centrales (bulbo olfativo, telencéfalo, diencéfalo, techo óptico, cerebelo, medula espinal, retina e hipófisis) y periféricos (corazón, hígado, riñón, intestino, músculo, ovario y testículo) de la lubina. En tejidos centrales, la expresión fue muy evidente en te1encéfalo, diencéfalo, techo óptico, cerebelo y retina (Figura 4). En tejidos periféricos, los ARN mensajero de la GnIH fueron evidenciados en el testículo, ovario, riñón e intestino (Figura 4). La expresión de la GnIH en áreas centrales sensoriales como la retina, el techo óptico y el cerebelo, en áreas neuroendocrinas del telencéfal0 y el diencéfalo, así como en el ovario y el testículo refuerzan la implicación de la GnlH en el control de la reproducción de la lubina.

3.: Disei'lo y síntesis de los péptidos sbGnIH-l y sbGnIH-2

Como hemos indicado anterionnente, en la secuencia de la GnlH de lubina deducida identificamos dos posibles péptido maduros, a los cuales hemos denominado sbGnIH-l (sbLPXRFa-l) y sbGnIH-2 (sbLPXRFa-2). El siguiente paso fue sintetizar esos péptidos, que fueron modificados con una amidación en su extremo C-tenninal, característica de los péptidos GnIH funcionales. Ambos péptidos fueron utilizados para los ensayos funcionales que se detallarán más adelante.

Las secuencias de los péptidos sintetizados fue la siguiente:

sbGnlH-I: NH2-PLHLHANMPMRF-CONH2 (SEQ ID NO 6) sbGnIH-2: NH2-SPNSTPNMPQRF-CONH2 (SEQ ID NO 7)

El péptido sbGnIH-I sintetizado (12 aminoácidos) tenía un peso molecular estimado de 1462,81 Da y un peso molecular experimental de 1461,75 Da, tal como se observó mediante análisis de espectro fotometría de masas (Figura 5). Este péptido fue purificado mediante HPLC. mostrando un pico principal con un tiempo de retención de 13 ,75 minutos, y un nivel de pureza del 95,2% (Figura 5). La secuencia fue verificada mediante espectrometría de masas en tándem (MSIMS).

El péptido sbGnIH-2 sintetizado (12 aminoácidos) tenía un peso molecular estimado de 1374,54 Da y un peso molecular experimental de 1373,65 Da, tal como se observó mediante análisis de espectrofotometría de masas (Figura 6). Este péptido fue purificado mediante HPLC. mostrando un pico principal con un tiempo de retención de 13,1 minutos, y un nivel de pureza del 95,1% (Figura 6). La secuencia fue verificada mediante espectrometría de masas en tándem (MSIMS).

4. Generación de anticuerpos anti-sbGnIH-l y anti-sbGnIH-2

Asimismo. estos péptidos sbGnIH-1 y sbGnIH-2 han sido utilizados para la generación de anticuerpos específicos dirigidos contra los mismos, obtenidos en conejo y cabra. Estos péptidos tenían una amidación e-terminal y un residuo de cisteína N-terminal para su acoplamiento a KLH, con objeto de favorecer el proceso de inmunización. En el caso del péptido sbGnIH-I , los anticuerpos fueron generados en conejo. En el caso del péptido shGnIH-2, se generaron anticuerpos tanto en conejo como en cabra. El protocolo de inmunización fue el siguiente:

ES 2 561708 Al

Apéndice 1. Producción de anticuerpos en conejo

Fecha: Inmunización Sangrado Suero

Semana O: Pre-serum 3 mi + lest

Semana I: I

Semana 5: 11

Semana 9: 111

Semana 11: f USA + test

Semana 11: 1II+2v '='20 mi

Semana 13: IV

Semana 15: IV+2v+sangrado final 50-70 mi + test

Apéndice 2. Producción de anticuerpos en cabra

Fecha: Inmunización Sangrado Suero

Semana O: Prc:-serum 3 mi + lest

Semana 1: I

Semana 5: 11

Semana 9: 111

Semana 11: ELlSA + test

Semana 11: 1II+2v :::::50 mi + test

Semana 13: IV

Semana 15: lV+ 2v+sangrado final 50-70 mi + test

Tras el periodo de inmunización (15 semanas) se procedió al sangrado de los animales, a la obtención del suero con los anticuerpos y a la realización de pruebas de ELISA para su titulación. Se utilizaron placas de ELISA NuncIrnmunoTM Plate MaxiSorpTM Surfacc cubiertas con péptido libre (0.004 rng/ml) y proteína (0.002 mg/ml) y un rango de dilución de las muestras de 1: 121

1:: 161051 (suero). Como anticuerpos secundarios se usaron inmunoglobulinas anti-Ig de conejo obtenidas en cabra (Agriscra) a una dilución 1:6667 e inmunoglohulinas anti-Ig de cabra obtenidas en conejo (DAKO) a una dilución

1:: 10.000.

Los ensayos de ELISA obtenidos muestran las respuestas de Jos anticuerpos generados frente a los antígenos, en relación al suero prcinmune (Figuras 7, 8 Y 9), en las que se evidencia la curva sigmoidea característica en función de la dilución del suero. Todos los sueros generados mostraron un buen título, con rangos óptimos de dilución entre 1 :7000-1: 11000 para los anticuerpos generados en conejo (anti-sbGnIH-1 y anti-sbGnlH-2). y de 1:2000-1 :6000 para el anticuerpo generado en cabra (anti-sbGnIH-2).

5. Localización inmunohistoouímica de la GnIH en el cerebro y la hipófisis de la lubina

La obtención de anticuerpos específicos contra los péptidos sbGnIH-1 y sbGnIH-2 ha pennitido esclarecer el patrón de distribución espacial de las células GnIH y sus proyecciones por medio de técnicas inmunohitoquímicas. La tineión inmunohistoquímica reveló una alta señal especifica cuando incubamos las secciones con los anticuerpos generados, no mostrando ninguna reacción inespecífica al incubar con el suero pre-inmune o cuando suprimimos los anticuerpos secundarios. Los resultados obtenidos fueron altamente consistentes y no se han encontrado diferencias en el inmunomarcaje entre los anticuerpos contra los péptidos GnIH-l y GnIH-2 en los ejemplares de lubina analizados.

Así, los sueros anti-sbGnJH-1 y anti-sbGnIH-2 de lubina nos pennitjeron realizar un análisis completo en secciones seriadas del cerebro, desde las porciones más rostrales (bulbos olfativos) a las más caudales (médula). Tanto para la forma sbGnIH-1 como shGnIH-2, hemos detectado la presencia de cuerpos celulares en el bulbo olfativo, en particular en las células ganglionares del nervio tenninal, en la transición entre la zona mas caudal del bulbo olfativo y la más rostral del telencéfalo, diferenciándose dos poblaciones celulares independientes: una población más rostral y dorsal, en la porción medial de los bulbos y otra población más caudal y ventral en la región del nervio tcnninal. La inmunoreactividad también fue evidente en células de los núcleos central y lateral del telencéfalo ventral, en el núcleo posterior pcrivcntricular del área preóptica. Además, detectamos células inmunorrcactivas de gran tamaño en la zona dorsal-lateral del sinencéfalo rostral. También encontramos células inmunorrcactivas en el núcleo gusta torio secundario, siendo estas células de la zona central del tegrnento mucho mas numerosas y de mcnor tamaño quc las descritas anteriormente. Además fueron detectadas células en la pars distal proximal y en la pars intermedia de la adenohipófisis.

En cuanto al patrón de inervación, detectamos fibras sbGnIH-l-y sbGnIH-2inmunorreactivas principalmente en el cerebro anterior y medio. Las fibras fueron mas evidentes en el telencéfalo ventral, área preóptica, tálamo ventral, hipotálamo medio-basal, receso lateral, techo óptico, torus semicircularis, tegmento rostrallateral y en la región caudal del tegmento (núcleo gustatorio secundario). Además hemos localizado fibras en el telencéfalo dorsal, el romboencéfalo ventral, el nervio óptico y en el órgano pineal, así como en la pars distal proximal y pars intermedia de la adenohip6fisis.

Este patrón de distribución de células y fibras GnlH en áreas sensoriales olfativas (bulbo olfativo, nervio tenninal), fotosensitivas (nervio óptico, tceho óptico) y gustativas (núcleo gustatorio secundario), así como en áreas neuroendocrinas relacionadas con la reproducción (telencéfalo ventral, área preóptica, hipotálamo mediobasal) y en la propia adenohip6fisis refuerzan la consideración de la implicación de la GnIH de lubina en el control de procesos como la reproducción, la ¡ngesta y el metabolismo.

6. Dctenninación de los efectos de la GnlH en la lubina

Una vez caracterizados los posibles péptidos GnlH maduros, se diseñó un experimento para comprobar cual es el efecto in vivo de la GnIH sobre la lubina europea. Los ensayos se realizaron con la fonna sbGnIH-2. Los resultados obtenidos nos mostraron un marcado efecto inhibidor de la GnIH sobre diversos genes cerebrales e hipofisarios que se encuentran implicados en la cstimulación de la reproducción. Así, pudimos observar una disminución de la expresión del ARN mensajero en la honnoDa liberadora de las gonadotrofinas de tipo JI (GnRH-2) a las 6 horas post-inyección (hpi) a todas las dosis analizadas O, 2 Y 4 ¡.tg) Y una inhibición en la expresión de GnRH-I a las 12 hpi a la dosis más alta (4 ¡.tg)(Figura 10). No se observaron efectos de la sbGnlH-2 sobre los niveles de ARN mensajero de la fonna GnRH-3 de lubina, a ninguna de las do sis y tiempos de post-inyección analizados. Las kisspeptinas también fueron inhibidas tras el tratamiento con sbGnIH-2 a las 6 hpi (Figura 10). La inhibición de las kisspcptinas de tipo I (Kissl) fue evidente COn la dosis intennedia (2 ¡.tg), mientras que en el caso de la Kiss2 esta inhibición tuvo lugar a la dosis más alta de 4 "g (Figura 10).

A nivel hipofisario también se observó un efecto inhibidor de la GnIH sobre la expresión de la honnona estimulante del foJiculo (FSH), que está implicada en la maduración inicial de los ovocitos y en la vitelogénesis, y sobre la hormona luteinizante (LH), encargada de la maduración final y puesta, siendo más marcados los efectos sobre esta última (Figura 11). Este efecto inhibidor fue evidente tanto a las 6 hpi (a todas las dosis para la LH y a dosis de 2 y 4 ¡.tg para FSH) como a las 12 hpi (a la dosis de 2"g lanto para FSH como para LH)( Figura 11). Esta inhibición de los ARN mensajeros de estos factores neuroendocrinos y endocrinos estimuladores de la reproducción muestran la inactivación del eje

reproductivo que provoca la GnIH a distintos niveles del eje cerebro-bipófisisgónada de la lubina.

Por lo tanto, esta invención aborda aspectos novedosos sobre el control neuroendocrino del proceso reproductivo en peces, en general, y en la lubina 5 europea en particular. Como novedades podemos destacar la generación de herramientas para identificar la presencia y los niveles de la hormona inhibidora de las gonadotrofinas en la lubina en distintos estadios (estadios larvarios, juveniles y adultos) y el desarrollo de procedimientos para caracterizar los efectos de este nuevo factor neuroendocrino en peces. Además proponemos una 10 aplicación de esta herramienta, ya que esta invención proporciona una metodología a seguir para inhibir la pubertad precoz de esta especie mediante el uso de inyecciones o implantes de GnIH. Asimismo, esta invención puede pennitir la generación de agonistas y/o antagonistas de la GnIH, a través de la modificación de distintos aminoácidos de las secuencias descritas, que pueden ser

15 utilizados para inhibir o estimular la reproducción en animales adultos, respectivamente, con el consiguiente beneficio para el control y la mejora de la productividad de esta especie en acuicultura.

DESCRIPCIÓN DEL CONTENIDO DE LAS FIGURAS

Figura 1. Secuencia de 878 nuclc6tidos del precursor de GnIH de la lubina

europea, Dicentrarchus labrax (SEQ ID NO 1). La secuencia presenta extremos

5'UTR y 3'UTR, de 49 nucleótidos y 226 nucleótidos, respectivamente. La

S: secuencia de 600 nuc1eótidos comprendida entre el atg (primer codoo, metionina)

y el tga (codón stop) marcados en gris se corresponde con la región codificante u

ORF (SEQ ID NO 2). La secuencia de 200 aminoácidos codificada se muestra en

mayúsculas con letra cursiva. En negrita y subrayadas se muestran dos posibles

señales de poliadenilación (aataaa) presentes en el extremo 3'UTR.

10: Figura 2. Secuencia completa de 200 aminoácidos del precursor de La GnlH de la

lubina europea (SEQ ID NO 3). El fragmento que se muestra corresponde a la

zona codificante de la secuencia de nucleótidos aislada. Los péptidos maduros

sbGnlH-I o sbLPXRFa-1 (PLHLHANMPMRF, posición 94-105, SEQ ID NO 4)

Y sbGnlH-2 o sbLPXRFa-2 (SPNSTPNMPQRF, posición 116-127, SEQ ID NO

15: 5) aparecen marcados en negrita y sombreados en color gris. Nótese los

aminoácidos de procesamiento de estos péptidos, que son K o R en el extremo 5' ,

Y GR en el extremo 3'. El codón stop se encuentra indicado por un asterisco.

Figura 3. Árbol filogenético del precursor identificado del péptido LPXRFamida

y los posibles péptidos RFamidas de otros vertebrados. El método usado para

20: construir el árbol filogenético fue el "Neightbour-joining method". Los datos

fueron obtenidos mediante 1000 repeticiones, para detenninar los índices de

confianza dentro del árbol filogenético. Los ortólogos de GnIH comparten el

extremo C-tenninal común LPXRFamida (X = L o Q o M en el caso de peces) el

cual ha sido identificado en otros vertebrados desde humanos a peces. Los

25: péptidos de lubina también sustituyen el aminoácido Lisina (L) por el aminoácido

metionina (M).

Figura 4. Expresión del péptido precursor de la GnIH en tejidos centrales y periféricos de lubina mediante RT-PCR.

Figura 5. Síntesis del péptido sbGnIH-1 de lubina, modificado con una amidación en su extremo e-tenninal (NH2-PLHLHANMPMRF-CONH2, SEQ ID NO 6). Se presenta el análisis mediante espectrofotometría de masas, que muestra un pico de peso molecular 1461,75 Da y el análisis de HPLC, que evidencia el pico correspondiente a la sbGnIH-l con un tiempo de retenci6n de 13,75 minutos y una pureza del 95,2%. La secuencia fue verificada mediante espectrometria de masas en tándem (MSIMS).

Figura 6. Síntesis del péptido sbGnIH-2 de lubina, modificado con una amidación en su extremo C-tenninal (NH2-SPNSTPNMPQRF-CONH2, SEQ ID NO 7). Se presenta el análisis mediante espectrofotometria de masas, que muestra un pico de peso molecular 1373,65 Da y el análisis de HPLC, que evidencia el pico correspondiente a la sbGnIH-2 con un tiempo de retención de 13,1 minutos y una pureza del 95,1%. La secuencia fue verificada mediante espectrometría de masas en tándem (MSIMS).

Figura 7. Test de ELISA del suero anti-sbGnIH-1 obtenido en conejo. Se muestra la respuesta obtenida en un ensayo del suero anti-sbGnIH-I generado frente al suero preinmune del mismo conejo. Se utilizaron placas de ELlSA cubiertas con el péptido sbGnIH-I libre (0.004 mg/ml) y proteína (0.002 mg/ml) y un rango de dilución de los sueros de 1: 121-1 : 161 OSI. El ensayo muestra un título óptimo a diluciones entre 1 :9000 y 1: 11500 (parte lineal de la curva entre 1 y 2 de absorbancia a 650 nm).

Figura 8. Test de ELISA del suero anti-sbGnIH-2 obtenido en conejo. Se muestra la respuesta obtenida en un ensayo del suero anti-sbGnIH-2 generado frente al suero preinmune del mismo conejo. Se utilizaron placas de ELlSA cubiertas con el péptido sbGnIH-2 libre (0.004 mg/ml) y proteína (0.002 mg/ml) y un rango de dilución de los sueros de 1: 121-1 : 1 6 1 051. El ensayo muestra un título óptimo a diluciones entre 1 :7000 y 1:11000 (parte lineal de la curva entre 1 y 2 de absorbancia a 650 nm).

Figura 9. Test de ELlSA del suero anti-sbGnIH-2 obtenido en cabra. Se muestra la respuesta obtenida en un ensayo del suero anti-sbGnfH-2 generado frente al suero preinmune de la misma cabra. Se utilizaron placas de ELlSA cubiertas con el péptido sbGnlH-2 libre (0.004 rnglrnl) y proteína (0.002 rnglrnl) y un rango de dilución de los sueros de 1: 121-1 : 161 OS l. El ensayo muestra un título óptimo a diluciones entre 1 :2000 y 1 :6000 (parte lineal de la curva entre 1 y 2 de absorbancia a 650 om).

Figura 10. Efecto del tratamiento intracerebroventricular (leV) con el péptido sbGnIH-2 sobre la expresión de GnRH-I, GnRH-2, Kiss-l y Kiss-2 en el cerebro de ejemplares machos de lubina europea. Las dosis empleadas fueron J~g, 211g Y 4"g totales de sbGnlH-2 disuelto en PBS. Los controles fueron tratados solo con vehículo (PBS). Los ejemplares fueron muestreados a las 6 y 12 horas postinyección (6 hpi Y 12 hpi, respectivamente). La expresión relativa para los genes objeto de estudio fue detenninada mediante PCR cuantitativa, usando el gen 18s

como normalizador. Cada valor representa la media ± error estándar de 5 individuos diferentes (n=5). Las diferentes letras indican diferencias estadísticas significativas entre grupos, tras aplicar ANOV A de una vía (p ~ 0.05) seguido del test de Tukey.

Figura 11. Efecto del tratamiento intracerebroventricular (leV) con el péptido sbGnlH-2 sobre la expresión FSH y LH en la hipófisis de ejemplares machos de lubina europea. Las dosis empleadas fueron l ....g, 2....g Y 4 ....g totales de sbGnlH-2 disuelto en PBS. Los controles fueron tratados solo con vehículo (PBS). Los ejemplares fueron muestreados a las 6 y 12 horas post-inyección (6 hpi y 12 hpi. respectivamente). La expresión relativa para los genes objeto de estudio fue detenninada mediante PCR cuantitativa. usando el gen 18s como nonnaJizador. Cada valor representa la media ± error estándar de 5 individuos diferentes (0=5). Las diferentes letras indican diferencias estadísticas significativas entre grupos. tras aplicar ANOVA de una vía (p ~0.05) seguido del test de Tukey.

MODO DE REALIZACIÓN DE LA INVENCIÓN

La estrategia de clonación descrita anteriormente nos permitió obtener la secuencia completa de nucleótidos, que codifican para el precursor de la los hormona inhibidora de gonadotrofinas (GnIH) de la lubina Dicentrarchus labrax. El análisis de la secuencia de aminoácidos de la misma nos ha permitido postular la secuencia de dos péptidos maduros potencialmente funcionales de la familia RF-amida, denominados sbGnIH-l o sbLPXRFa-l (secuencia NH2PLHLHANMPMRF-CONH2) y sbGnIH-2 o sbLPXRFa-2 (secuencia NH2SPNSTPNMPQRF-CONH2). Estos péptidos fueron sintetizados, su peso molecular determinado por espectrofotometria de masas, purificados mediante HPLC y su secuencia verificada mediante espectrometria de masas en tándem (MSIMS). La actividad de estos péptidos en lubina fue detenninada mediante ensayos in vivo, tal como se describe a continuación.

Animales y recogidas de muestras

Un total de 40 lubinas (Dicentrarchus labrax), con un peso comprendido 839,03g ± 10, 12g se obtuvieron en el "Laboratorio de Cultivos Marinos" de la Universidad de Cádiz (Puerto Real, España), donde se mantuvieron en condiciones de fotoperiodo natural, temperatura de 19"C ± 1°C y salinidad constante de 39 ppt. Los peces fueron distribuidos en 8 tanques (5 ejemplares en cada tanque) con una capacidad total 1,3 m3 totales, un radio de 61 cm y 90 cm de altura. La cantidad de agua efectiva, teniendo en cuenta la densidad de carga, fue de 1 m3.

Para detenninar la funcionalidad de la GnlH sobre el eje reproductivo de la lubina se analizaron sus efectos sobre los niveles de ARN mensajero de diversos genes implicados en la estimulación de la reproducción (GnRH-l, GnRH-2, GnRH-3, Kisspeptina-l, Kisspeptina-2, FSH y LH) mediante PCR cuantitativa. Para ello, los peces fueron anestesiados con MS-222 (Sigma St Louis, MO), medidos, y pesados. Se les realizó una pequeña incisión en el cráneo con un microtaladro a modo de vía, y se inyectaron intracerebroventriculannente (leV) con la ayuda de

un micromanipulador I~lg, 2~lg o 4~lg del péptido sbGnlH-l (NH2

SPNSTPNMPQRF-CONH2), utilizando como vehículo PBS. Los individuos

controles fueron inyectados exclusivamente con PBS. Los individuos tratados y

sus controles fueron sacrificados a las 6 horas y 9 horas después de la inyección.

S: Los cerebros y las hipófisis de los ejemplares se extrajeron mediante disección, y

las muestras se congelaron inmediatamente en nitrógeno líquido y se almacenaron

seguidamente a -800C hasta su posterior análisis. El ARN total de las muestras

fue extraído usando TRIsure (Bioline, Londres, Reino Unido) siguiendo las

recomendaciones del fabricante, fue cuantificado mediante espectro fotometría en

10: un equipo NANODROP (Eppendorf) y su pureza fue evaluada por la relación de

absorbancias Abs260 nmlAbs280 nm. El ARN total (1 ~g) fue retrotranscrito a

ADN copia (ADNc) y el ADN genómico fue eliminado usando el QuantiTect®

Reverse Transcription Kit (Qiagen, Hilden, Alemania). El análisis de la expresión

génica se llevó a cabo en un equipo de PCR cuantitativa un equipo CFX96

lS: Manager System (Bio-Rad, Alcobendas. España) y el kit SensiF AST SYBR No

ROX (Bioline, Londres, Reino Unido). Las reacciones de qPCR se llevaron a

cabo por duplicado en un volumen total de 20 ~I, a partir de 5 ng de ADNc, con

cebadores específicos obtenidos a partir de las secuencias GnRH-J, GnRH-2,

GnRH-3, Kisspeptina-l , Kisspeptina-2, FSH y LH de lubina disponibles en las

20: bases de datos, usando el gen l8S de lubina como gen nonnalizador (Ver Tabla).

El protocolo seguido en la PCR cuantitativa fue el siguiente: a) Activación de la

enzima: 950C durante 2 minutos; b) 40 ciclos: Desnaturalización a 95DC durante

lO s; Anillamiento y extensión a 60"C (GnRH-I, GnRH-3, FSH, LH, 18S); 610C

(Kiss-l , Kiss-2) y 63°C (GnRH-2), durante 25 segundos; c). Curva de melting de

2S: 70°C a 95°C cada 0.5°C durante 5 segundos. Se generaron curvas de melting de

cada muestra, para corroborar que presentaban un único pico y solo se amplificaba

el gen objeto de estudio. Para descartar la posible contaminación del agua se

realizaron controles negativos sustituyendo el ADNc por agua DEPe. La

expresión de los genes estudiados se calculó mediante el método .6..6.Ct. Las

30: posibles diferencias significativas en la expresión de los genes objeto de estudio

entre los animales inyectados con las distintas dosis de sbGnlH-2 (1 ~lg, 2~lg o

4~g) Y los controles (PBS) en los distintos tiempos post-inyección (6 y 12 horas post-inyección), se analizaron mediante el estadístico ANOV A de una vía, seguido del test de Tukcy. Cuando los requerimientos de nonnalidad y homogeneidad de varianza no fueron satisfechos, se realizaron las

5 transfonnacioncs necesarias (transfonnación logarítmica o raíz) para cumplir con estos requisitos. Las diferencias se consideraron significativas con P<O.05 .

Los resultados obtenidos demostraron el cfccto inhibidor de la sbGnIH-2 sobre la GnRH-l , GnRH-2, Kisspcptina-l , Kisspcptina-2, FSH y LH de lubina, mostrando su efectividad para provocar un bloqueo del eje reproductivo en esta especie. Esta 10 evidencia demuestra la utilidad de la GnIH de lubina para reducir la incidencia de la pubertad precoz o frenar el proceso reproductivo en la lubina. Estos efectos inhibidores de la reproducción pueden incidir de forma positiva en el crecimiento y la productividad de esta especie en la práctica aeuíeola ya que está claramente demostrado que la energía destinada a la reproducción representa un límite para

15 los recursos energéticos destinados al crecimiento.

Tabla: Cebadores usados en PCR cuantitativa

Nombre del cebador: Secuencia (S -3')

GnRH1(1'): GGTCFT~TGGACT.EAT,,~GG

GnRH1{R): TGATICCTCTGCACAACCTAA

GnRH2(1') .~ GnRH2{R): TGGGCT(¡ctréiWtGTGT, ~j<. " -...,.""".;....~-""-.. CCAGCTCCCTCTTGCCTC

GnRH3(F): TGT®GÁGAGt;tAGAt~t 'f",

GnRH3{R): GTITGGGCACTCGCCTCTI

Kfssl(F): GéÁTCAATACTGGCATCAGCAAAGA

Kiss l{R): TCAÁCCATTCTGACCTGGGAAAcrT

Ki",(F): 9GGAGGATIC~GCCCGTGTTTCT

Kiss2{R): GAGGCCGAACGGGTIGAAGTIGAA

LH~lff': rtGAGCTTCCT~CTGttCA

LH~ (Rl: GCAGGCTCTCGAAGGTACAG

FSH~ (Fl: ACCAACATCAGCATt~G1G

18S (F): TCAGACCCAAAACCCATGCG

18S (Rl: ACCctGATICCCCGTIACCC

Claims

REIVINDICACIONES

1.

Un polinucleótido aislado cuya secuenCIa de nucleótidos presenta una identidad de secuencia de al menos un 80% con (a) la SEQ ID NO 1, o (b) la secuencia complementaria de dicha secuencia de nucleótidos, o (e) ambos (a) y (b).
2.

Un polinucleótido aislado cuya secuencia de nucleótidos presenta una identidad de secuencia de al menos un 80% con (a) la SEQ ID NO 2, o (h) la secuencia complementaria de dicha secuencia de nucleótidos, o (e) ambos (a) y (b).
3.

Un polinucleótido aislado cuya secuencia de nudeótidos presenta una identidad de secuencia de al menos un 80% con (a) la secuencia que codifica un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos presentada en la SEQ ID NO 3 desde el residuo aminoacídico número 1 al 93, o (b) la secuencia complementaria de dicha secuencia de nucleótidos, o (c) ambos

(a) y (b).
4.

Un polinucleótido aislado cuya secuencia de nucleótidos presenta una identidad de secuencia de al menos un 80% con (a) la secuencia que codifica un péptido que tiene la secuencia de aminoácidos presentada en la SEQ ID NO 3 desde el residuo aminoacídico número 94 al 105, o (b) la secuencia complementaria de dicha secuencia de nucleótidos, o (c) ambos

(a) y (b).
5.

Un polinucleótido aislado cuya secuencia de nucleótidos presenta una identidad de secuencia de al menos un 80% con (a) la secuencia que codifica un péptido que tiene la secuencia dc aminoácidos presentada en la SEQ ID NO 3 desde el residuo aminoacídico número 106 al 115, o (b) la

secuencia complementaria de dicha secuencia de nucleótidos. o (e) ambos

(a) y (b).
6. Un polinucle6tido aislado cuya secuencIa de nucleótidos presenta una identidad de secuencia de al menos un 80% con (a) la secuencia que codifica un péptido que tiene la secuencia de aminoácidos presentada en la SEQ ID NO 3 desde el residuo aminoacidico número 116 al 127, o (b) la secuencia complementaria de dicha secuencia de nucleótidos, o (e) ambos

(a) y (b).
7. Un polinucleótido aislado cuya secuencia de nucle6tidos presenta una

identidad de secuencia de al menos un 80% con (a) la secuencia que codifica un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos presentada en la SEQ ID NO 3 desde el residuo aminoacídico número 128 al 200, o

(b) la secuencia complementaria de dicha secuencia de nucleótidos, o (e) ambos (a) y (b).
8.

Los polinucleótidos aislados en las reivindicaciones ] a 7 en forma de ADN
9.

Los polinucIeótidos aislados en las reivindicaciones 1 a 7 en forma de ARN
10.

Un polipéptido precursor sbGnIH de 200 aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de al menos un 80% con la secuencia descrita en la figura 2 (SEQ ID NO 3) o una sal no tóxica del mismo.
11.

Un péptido sbGnlH-l de 12 aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de al menos un 80% con la secuencia NH2-PLHLHANMPMRFCOOH (SEQ ID NO 4) o una sal no tóxica del mismo.
12.

Un péptido como el descrito en la SEQ ID NO 4, modificado con una amidación en su extremo C-tcnninal, que tiene una identidad de secuencia de al menos un 80% con la secuencia NH2-PLHLHANMPMRF-CONH2 (SEQ ID NO 6) o una sal no tóxica del mismo.
13.

Un péptido como los descritos en las reivindicaciones 11 y 12, en los cuales se han eliminado I o más aminoácidos.
14.

Un péptido como los descritos en las reivindicaciones 1I y 12, en los cuales se han añadido 1 o más aminoácidos.
15.

Un péptido como los descritos en las reivindicaciones 11 , 12, 13 Y 14 en los cuales se han modificado 1 o más aminoácidos.
16.

Un péptido sbGnlH-2 de 12 aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de al menos un 80% con la secuencia NHrSPNSTPNMPQRFCOOH (SEQ JD NO 5) o una sal no tóxica del mismo.
17.

Un péptido como el descrito en la SEQ ID NO 5, modificado con una amidación en su extremo C-tenninal, que tiene una identidad de secuencia de al menos un 80% con la secuencia NH2-SPNSTPNMPQRF-CONH2 (SEQ ID NO 7) o una sal no tóxica del mismo.
18.

Un péptido como los descritos en las reivindicaciones 16 y 17. en los cuales se han eliminado 1 o más aminoácidos.
19.

Un péptido como los descritos en las reivindicaciones 16 y 17, en los cuales se han anadido I o más aminoácidos.
20.

Un péptido como los descritos en las reivindicaciones 16, 17, 18 Y 19, en los cuales se han modificado 1 o más aminoácidos.
21.

Un anticuerpo capaz de unirse específicamente a péptidos que tienen una identidad de secuencia de al menos un 80% con los péptidos descritos en las reivindicaciones 11 y 12.
22.

El uso del anticuerpo descrito en la reivindicación 21 en técnicas inmunocitoquímicas e inmunohistoquímicas, de Wcstcrn-blot, de DotBlol, de ELISA y de EIA.
23.

Un anticuerpo capaz de unirse específicamente a péptidos que tienen una identidad de secuencia de al menos un 80% con los péptidos descritos en las reivindicaciones 16 y 17.
24.

El uso del anticuerpo descrito en la reivindicación 23 en técnicas inmunocitoquímicas e inmunohistoquímicas, de Westem-blot, de OotBlOl, de ELISA y de EIA.
25.

Un método de inhibir o estimular la reproducción de los peces mediantc la administración a dicho pez de una cantidad eficaz de un péptido que tiene

una identidad de secuencia de al menos un 80% con el péptido descrito en la reivindicación 12 (NH,-PLHLHANMPMRF-CONH" SEQ ID NO 6) o una sal no tóxica del mismo.

s

26. Un método según la reivindicación 25, en el que dicha administración es mediante inyección.

10

27. Un método según la reivindicación 25, en el que dicha administración es la implantación. 28. Un método según la reivindicación 25, en el que dicha administración es mediante la disolución en agua en la que los peces están nadando.

15

29. Un método según la reivindicación 25, en el que dicha administración es por vía oral a través de la alimentación.

20

30. Un método según la reivindicación 25, en el que dicha administración es por transgénesis a través de un vector que incluye un promotor que pennita sobreexpresar o dejar de expresar a voluntad dicho péptido.

25

31 . Un método de inhibir la reproducción de los peces mediante la administración a dicho pez de una cantidad eficaz de un péptido que tiene una identidad de secuencia de al menos un 80% con el péptido descrito en la reivindicación 17 (NH,-SPNSTPNMPQRF-CONH" SEQ ID NO 7) o una sal no tóxica del mismo.
32.

Un método según la reivindicación 31, en el que dicha administración es mediante inyección.
33.

Un método según la reivindicación 31, en el que dicha administración es la implantación.
34.

Un método según la reivindicación 31, en el que dicha administración es mediante la disolución en agua en la que los peces están nadando.
35.

Un método según la reivindicación 31, en el que dicha administración es por vía oral a través de la alimentación.
36.

Un método según la reivindicación 31, en el que dicha administración es por transgénesis a través de un vector que incluye un promotor que permita sobrcexpresar o dejar de expresar a voluntad dicho péptido.
37.

Un método de inhibir o estimular la reproducción de los peces mediante la administración a dicho pez de una cantidad eficaz de un péptido que tiene una identidad de secuencia de al menos un 80% con los péptidos descritos cn la reivindicaciones 10, 11, 13, 14,15,16,18, 19 Y 20
38.

Un método según la reivindicación 37, en el que dicha administración es mediante inyección.
39.

Un método según la reivindicación 37, en el que dicha administración es la implantación.
40.

Un método segUn la reivindicación 37, en el que dicha administración es mediante la disolución en agua en la que los peces están nadando.
41.

Un método según la reivindicación 37, en el que dicha administración es por vía oral a través de la alimentación.
42.

Un método según la reivindicación 37, en el que dicha administración es por transgénesis a través de un vector que incluye un promotor que pennita sobreexpresar o dejar de expresar a voluntad dicho péptido.
43.

Un método de inhibir o estimular el crecimiento de los peces mediante la administración a dicho pez de una cantidad eficaz de un péptido que tiene una identidad de secuencia de al menos un 80% con los péptidos descritos en la reivindicaciones 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16,17, 18, 19y20.
44.

Un método según la reivindicación 43, en el que dicha administración es mediante inyección.
45.

Un método según la reivindicación 43, en el que dicha administración es la implantación.
46.

Un método segun la reivindicación 43, en el que dicha administración es mediante la disolución en agua en la que los peces están nadando.
47.

Un método según la reivindicación 43, en el que dicha administración es por vía oral a través de la alimentación.
48.

Un método según la reivindicación 43, en el que dicha administración es por transgénesis a través de un vector que incluye un promotor que permita sobreexpresar o dejar de expresar a voluntad dicho péptido.
49.

Un método de inhibir o estimular la ¡ngesta de los peces mediante la administración a dicho pez de una cantidad eficaz de un péptido que tiene una identidad de secuencia de al menos un 80% con los péptidos descritos cnlarcivindicaciones IO,Il, 12, 13,14,15, 16. 17, 18, 19y20.
50.

Un método según la reivindicación 49, en el que dicha administración es mediante inyección.
51.

Un método según la reivindicación 49, en el que dicha administración es la implantación.
52.

Un método según la reivindicación 49, en el que dicha administración es mediante la disolución cn agua en la que los peces están nadando.
53.

Un método según la reivindicación 49, en el que dicha administración es por vía oral a través de la alimentación.

54, Un método según la reivindicación 49, cn el que dicha administración es por transgénesis a través de un vector que incluye un promotor que pcnnita sobrecxpresar o dejar de expresar a voluntad dicho péptido.
55.

Un método de inhibir o estimular la reproducción de los peces mediante la administración a dicho pez de una cantidad eficaz de polinucle6tidos que tienen una identidad de secuencia de al menos un 80% con los polinucleótidos descritos en las reivindicaciones 8 y 9.
56.

Un método según la reivindicación 55, en el que dicha administración es mediante inyección.
57.

Un método según la reivindicación 55, en el que dicha administración es la implantación.
58.

Un método según la reivindicación 55, en el que dicha administración es mediante la disolución en agua en la que los peces están nadando.
59.

Un método según la reivindicación 55, en el que dicha administración es por vía oral a través de la alimentación.
60.

Un método según la reivindicación 55, en el que dicha administración es por transgénesis a través de un vector que incluye un promotor que permita sobreexpresar O dejar de expresar a voluntad dicho polinucleótido.
61.

Un método de inhibir O estimular el crecimiento de los peces mediante la administración a dicho pez de una cantidad eficaz de polinucleótidos que tienen una identidad de secuencia de al menos un 80% con los polinucleótidos descritos en las reivindicaciones 8 y 9.
62. Un método según la reivindicación 61, en el que dicha administración es mediante inyección.

s

63. Un método según la reivindicación 61, en el que dicha administración es la implantación.

10

64. Un método según la reivindicación 61, en el que dicha administración es mediante la disolución en agua en la que los peces están nadando. 65. Un método según la reivindicación 61, en el que dicha administración es por vía oral a través de la alimentación.

15

66. Un método según la reivindicación 61, en el que dicha administración es por transgénesis a través de un vector que incluye un promotor que permita sobreexpresar o dejar de expresar a voluntad dicho polinucleótido.

20

67. Un método de inhibir o estimular la ¡ngesta de Jos peces mediante la administración a dicho pez de una cantidad eficaz de polinucleótidos que tienen una identidad de secuencia de al menos un 80% con los poJinucleótidos descritos en las reivindicaciones 8 y 9.

25

68. Un método según la reivindicación 67, en el que dicha administración es mediante inyección.
69. Un método segun]a reivindicación 67, en el que dicha administración es la implantación.
70. Un método según la reivindicación 67, en el que dicha administración es mediante la di solución en agua en la que los peces están nadando.

s

71. Un método según la reivindicación 67, en el que dicha administración es por vía oral a través de la alimentación.

10

72. Un método según la reivindicación 67, en el que dicha administración es por transgénesis a través de un vector que incluye un promotor que permita sobreexpresar o dejar de expresar a voluntad dicho polinucleótido.

15

73. Un método de inhibir o estimular la reproducción de los peces mediante la administración a dicho pez de una cantidad eficaz de los anticuerpos descritos en las reivindicaciones 21 y 23. 74. Un método según la reivindicación 73, en el que dicha administración es mediante inyección.

20

75. Un método según la reivindicación 73, en el que dicha administración es la implantación.
76. Un método según la reivindicación 73, en el que dicha administración es mediante la disolución en agua en la que los peces están nadando.
77.

Un método según la reivindicación 73, en el que dicha administración es por vía oral a través de la alimentación.
78.

Un método de inhibir o estimular el crecimiento de los peces mediante la administración a dicho pez de una cantidad eficaz de los anticuerpos descritos en las reivindicaciones 21 y 23.
79.

Un método según la reivindicación 78, en el que dicha administración es mediante inyección.
80.

Un método según la reivindicación 78, en el que dicha administración es la implantación.
81.

Un método segun la reivindicación 78, en el que dicha administración es mediante la disolución en agua en la que los peces están nadando.
82.

Un método según la reivindicación 78, en el que dicha administración es por vía oral a través de la alimentación.
83.

Un método de inhibir o estimular la ¡ngesta de los peces mediante la administración a dicho pez de una cantidad eficaz de los anticuerpos descritos en las reivindicaciones 21 y 23.
84.

Un método según la reivindicación 83, en el que dicha administración es mediante inyección.
85.

Un método segun la reivindicación 83, en el que dicha administración es la implantación.
86. Un método según la reivindicación 83, en el que dicha administración es s mediante la disolución en agua en la que los peces están nadando.
87. Un método según la reivindicación 83, en el que dicha administración es por vía oral a través de la alimentación.