ES2575752B2

ES2575752B2 - Obtención de extractos liquénicos y uso de los mismos para mejorar la recuperación de microorganismos asociados a líquenes

Info

Publication number: ES2575752B2
Application number: ES201431971A
Authority: ES
Inventors: Elena GONZÁLEZ BIOSCA; Eva BARRENO RODRÍGUEZ; Ricardo DELGADO SANTANDER; Raquel FLORES MARTÍN
Original assignee: Universitat de Valencia
Current assignee: Universitat de Valencia
Priority date: 2014-12-31
Filing date: 2014-12-31
Publication date: 2017-01-17
Anticipated expiration: 2034-12-31
Also published as: ES2575752A1; WO2016107951A1

Abstract

Obtención de extractos liquénicos y uso de los mismos para mejorar la recuperación de microorganismos asociados a líquenes.#La presente invención se refiere un extracto liquénico y el uso del mismo para mejorar la recuperación de microorganismos asociados a líquenes. Así, la invención va dirigida a un método para mejorar u optimizar el aislamiento y/o cultivo de microorganismos asociados a líquenes que comprende el procesado de talos liquénicos lavados o lavados y machacados en un medio de cultivo que comprende el extracto liquénico de una población de la especie de liquen de la que se quieren aislar los microorganismos. También se describen el método de obtención del extracto liquénico y la composición que comprende el extracto liquénico así obtenido.

Description

Obtención de extractos liquénicos y uso de los mismos para mejorar la recuperación de microorganismos asociados a líquenes

La presente invención se refiere a la obtención de extractos liquénicos y al uso de los mismos para mejorar la recuperación o aislamiento de los microorganismos asociados a talos liquénicos. Así, la invención proporciona un nuevo método para la obtención de extractos liquénicos y la preparación de nuevos medios de cultivo enriquecidos con

dichos extractos liquénicos que imitan los nutrientes presentes en los talos liquénicos. Por lo tanto, la presente invención pertenece al área de la Microbiología, en concreto, al campo de las técnicas microbiológicas para el aislamiento de microorganismos.

ESTADO DE LA TÉCNICA El liquen es un organismo simbiótico formado por, al menos, un hongo (micobionte) y una microalga verde o una cianobacteria (ficobionte). Mientras los hongos se encargan del abastecimiento de agua y sales minerales, las microalgas o las cianobacterias proporcionan los productos fotosintéticos, como los glúcidos. Se calcula que existen aproximadamente 14.000 especies agrupadas en 600 géneros. Adicionalmente, existen microorganismos asociados a las simbiosis liquénicas, tales como bacterias y virus, así como otros hongos y microalgas, cuyo aislamiento e identificación es deseable tanto desde el punto de vista ecológico o ambiental, como desde el punto de vista biotecnológico debido a la gran cantidad y diversidad de aplicaciones que pueden tener dichos microorganismos. Sin embargo, actualmente existen muchas dificultades para aislar dichos microorganismos asociados a las simbiosis liquénicas así como para recuperarlos en números elevados. Esto es debido, entre otras causas, a que se usan medios de cultivo sintéticos que no reproducen las condiciones nutritivas de los talos liquénicos, se analizan mayoritariamente muestras congeladas, o no se hacen análisis microbiológicos adecuados de las muestras de los talos liquénicos

Cardinale el al. 2006 (FEMS Microbiol. Ecol., 57: 484-495) llevaron a cabo un análisis molecular de las comunidades bacterianas heterótrofas asociadas a varias especies de liquenes mediante métodos dependientes e independientes del cultivo. En el análisis bacteriológico utilizaron once muestras de talos liquénicos congelados de ocho especies distintas recolectadas en Austria, siendo una de ellas Pseudevernia furfuracea, y dos medios de cultivo sintéticos para el cultivo de las bacterias

liquénicas. Como resultado, obtuvieron tan sólo algunas decenas de colonias bacterianas a partir de nueve de los once talos liquénicos analizados, evidenciando la

dificultad para la recuperación de bacterias liquénicas, tanto de la superfice (ectoliquénicas) como del interior (endoliquénicas) de los talos liquénicos. Dichos autores no aportaron datos cuantitativos sobre las bacterias cultivables aisladas en unidades formadoras de colonias (UFC) por gramo (UFC/g).

Liba el al. , 2006 (J. Appl. Microbiol., 101 : 1076-1086) también hicieron aislamientos de bacterias heterótrofas (principalmente bacterias fijadoras de nitrógeno) asociadas a distintas especies de líquenes, pero las recuperaron mediante un paso previo de enriquecimiento en medio líquido. Pese al enriquecimiento aislaron pocas bacterias con dicha capacidad y al utilizar un medio de cultivo líquido tampoco dieron datos cuantitativos sobre las UFC/g.

Selbmann el al., 2010 (Polar Biol. , 33: 71-83) realizaron un estudio de las bacterias cultivables asociadas a líquenes antárticos con muestras de talos liquénicos conservadas mediante congelación. La congelación de los talos liquénicos, especialmente en ausencia de agentes crioprotectores, disminuye tanto la viabilidad como la cultivabilidad de los microorganimos en los medios de cultivo. Por ello, de los dieciséis talos liquénicos de las distintas especies y géneros analizados, sólo consiguieron aislar bacterias en cinco de ellos y en números muy bajos en comparación con los obtenidos con la presente invención. Como en los dos estudios anteriores, los autores no aportaron datos concretos de UFC/gr.

Grube el al. 2009 (ISME J., 3: 1105-1115) describieron el aislamiento de densidades bacterianas considerables (107_104 UFCfg) en algunas especies de líquenes mediante el uso de un medio pobre en nutrientes desarrollado para el recuento de bacterias de aguas oligotréficas. Las especies liquénicas que crecen sobre suelos (terrícolas) presentaron mayores niveles poblacionales bacterianos (107 UFC/g, ya que habitan ambientes en los que las poblaciones microbianas suelen ser mucho más altas (108_ 109 células bacterianas/g) que las que crecen sobre rocas (104 UFC/g). Sin embargo, Grube el al. 2009 no emplearon medios de cultivo concretos que simulasen las condiciones nutritivas de los talos liquénicos analizados. Más recientemente, el grupo de Grube y colaboradores (Grube el al., 2014; ISME J.; doi:10.1038/ismej.2014.138) han descrito más de 800 especies bacterianas en el liquen modelo Lobada pulmonaria mediante técnicas ámicas independientes del cultivo. Estos autores han propuesto que dichas bacterias poseen la capacidad de contribuir en múltiples aspectos de la simbiosis liquénica, entre los que se incluyen distintas funciones esenciales, tales como: i) proporcionar nutrientes, especialmente nitrógeno, fósforo y azufre, ii) conferir protección frente factores de estrés biótico (como patógenos) y abiótico, jii) contribuir a la fotosíntesis mediante la provisión de vitamina 812, IV) contribuir al crecimiento de hongos y algas liquénicas mediante la provisión de hormonas, v) detoxificación de metabolitos tóxicos, y vi) degradación de las partes más viejas del talo liquénico (reciclaje de nutrientes). No obstante, para confirmar todas estas funciones potenciales, así como estudiar sus posibles aplicaciones biotecnológicas, es necesario disponer de bacterias cultivables y para ello se requiere el método de la presente invención.

Lasken & McLean, 2014 (Nat. Rev. Genet. 15: 577-584) describen un nuevo método basado en las secuencias de nueva generación o NGS (de sus iniciales en inglés New Generation Sequences) para la identificación de especies microbianas que todavía no han podido ser cultivadas mediante las técnicas rutinarias de cultivo microbiológico, seguida de la secuenciación parcial o completa del gen ribosómico 16S. Sin embargo, esta técnica de estudio basada sólo en el análisis de secuencias de ADN es independiente del cultivo de los microorganismos liquénicos, y aunque resulta útil para estudios de diversidad, no permite obtener cultivos puros de los mismos, lo cual es un requisito necesario tanto para la descripción de nuevos taxones microbianos como para su caracterización bioquímica, fisiológica y metabólica por sus posibles aplicaciones biotecnológicas. Especialmente complejo y difícil es el aislamiento y caracterización de microorganismos que están asociados a simbiosis mutualistas cíclicas, como es el caso de los talos liquénicos.

Por lo tanto, sigue existiendo en el estado de la técnica la necesidad de proporcionar una solución a este problema todavía no resuelto, como es la provisión de un método de cultivo que no sólo pueda emplearse en el aislamiento e identificación de microorganismos asociados a talos liquénicos cuyo cultivo no ha sido posible hasta ahora o presenta grandes dificultades con los métodos habituales, sino que además sirva para incrementar significativamente la recuperación y aislamiento de microorganismos liquénicos, tanto en cantidad como en diversidad.

DESCRIPCiÓN DETALLADA DE LA INVENCiÓN Los inventores de la presente invención han descubierto que la adición de un extracto liquénico procedente de talos de una misma población de una especie liquénica en un medio de cultivo permite, sorprendentemente, tanto el aislamiento como el cultivo de microorganismos asociados a la población de la especie de liquen de la que se ha obtenido dicho extracto liquénico con una mayor eficacia que si el aislamiento y el cultivo se llevan a cabo en un medio de cultivo estándar sin extracto liquénico.

Las ventajas de la presente invención frente a los distintos métodos que existen en el estado de la técnica para aislar microorganismos asociados a una población de una especie de liquen incluyen:

-: Permite incrementar el número de microorganismos recuperados tras el cultivo, tanto oligotrofos como copiotrofos y tanto en cantidad como en diversidad, gracias a que se emplea un medio de cultivo que simula las condiciones nutritivas existentes en el talo liquénico a partir del que se quieren aislar los microorganismos de interés. -Permite incrementar la recuperación de microorganismos asociados a líquenes, ya que los análisis microbiológicos se realizan a partir de muestras de talos liquénicos frescos. -Permite incrementar el número de microorganismos recuperados tras el cultivo, tanto ecto-como endoliquénicos, gracias a un lavado extensivo de talols liquénico/s que permite, a su vez, la eliminación de la etapa de desinfección de dichos talos liquénicos que afecta negativamente a la recuperación de dichos microorganismos.

En base a este descubrimiento, se han desarrollado una serie de aspectos inventivos que serán descritos en detalle a continuación .

Método de obtención del extracto liguénico de la invención

Tal como se ha explicado previamente, la presente invención se basa en el empleo de un extracto procedente de talos de una misma población de una especie liquénica en un medio de cultivo para aislar o cultivar con mayor eficacia los microorganismos asociados a dicha especie liquénica. Por lo tanto, la puesta en práctica de la invención comprende obtener dicho extracto liquénico.

Así, en un aspecto, la invención se relaciona con un método para obtener un extracto liquénico, de aquí en adelante "método para obtener el extracto liquénico de la invención", que comprende:

(a): recolectar al menos un talo liquenico de una especie liquénica de interés,

(b): lavar y proceder a la disrupción del talo liquénico con una solución isotónica estéril , y

(e): esterilizar por filtración el producto obtenido tras llevar a cabo la etapa b).

Las distintas etapas que comprenden este método permiten obtener un extracto liquénico que conserva, de forma inalterada, todos los componentes y nutrientes naturales que están presentes en la especie liquénica, lo que le diferencia de otros métodos descritos en el estado de la técnica.

Así, en una primera etapa, el método para obtener el extracto liquénico de la invención comprende recolectar al menos un talo liquénico de una especie liquénica de interés.

En la presente descripción, se entiende por "especie liquénica" o "liquen" al organismo (talo, holobionte) que surge de la simbiosis entre, al menos, un hongo heterótrofo (micobionte) y uno o más organismos fotosintéticos que pueden ser microalgas verdes

o cianobacterias (fotobiontes). La base de la simbiosis mutualistas es la integración morfológica, metabólica y genética entre los simbiontes (talos), donde el hongo adquiere los carbohidratos necesarios para su metabolismo a partir de los fotobiontes, mientras que el hongo proporciona agua, elementos minerales y moléculas señal (p. ej. NO) para la protección de las algas en el agresivo medio aéreo. La nomenclatura de las especies liquénicas se hace mediante el nombre del hongo simbionte.

En la presente invención se entiende por "talo liquénico" o "talo" al cuerpo vegetativo del liquen, que está compuesto por al menos un hongo (micobionte) y uno o varios fotobiontes (microalgas y/o cianobacterias) y otros microorganismos asociados (bacterias, virus y otros hongos o algas u otros organismos), no diferenciado en un eje caulinar con hojas y en raíces, y que no presenta verdaderos tejidos.

Como entiende el experto en la materia, la especie liquénica recolectada puede estar formando parte de una población de una especie liquénica. Así, en una realización particular de la etapa (a), los talos liquénicos recolectados pertenecen a la misma población de la especie liquénica. En la presente invención, se entiende por

"población" o "población biológica" al conjunto de organismos o individuos de la misma especie que coexisten en un mismo espacio y tiempo, y que comparten ciertas propiedades biológicas, las cuales producen una alta cohesión reproductiva y ecológica del grupo. La cohesión reproductiva implica el intercambio de material genético entre los individuos. La cohesión ecológica se refiere a la presencia de interacciones entre ellos, resultantes de poseer requerimientos similares para la supervivencia y la reproducción, al ocupar un espacio generalmente heterogéneo en cuanto a la disponibilidad de recursos.

Métodos para la recolección de, al menos, un talo liquénico de la especie liquénica de interés son ampliamente conocidos en el estado de la técnica y son práctica de rutina para el experto en la materia. En la recolección pueden emplearse bisturís, navajas, cuchillos, tijeras, guantes, pinzas, etc. Y, una vez recogido, se puede almacenar en bolsas, placas Petri o tubos de plástico para su traslado al laboratorio.

El procesado de la especie liquénica puede llevarse a cabo a partir de talos frescos o congelados. Así, en una realización particular, el talo liquénico es preferentemente fresco y, en su defecto, puede estar congelado. En el caso de emplear talos frescos, estos pueden procesarse directamente tras su recogida o pueden mantenerse refrigerados (por ejemplo, alrededor de los 4°C) hasta que sean procesados, dentro de un plazo de unos pocos días. El término "fresco" incluye tanto talos recién recolectados como talos refrigerados. Alternativamente, tras la recolección del talo éste puede ser congelado en caso de que el almacenamiento hasta su procesado vaya a ser más prolongado. En este caso, el experto en la materia entiende que antes de emplear el talo congelado para obtener el extracto liquénico éste tiene que ser descongelado. Técnicas para congelar y descongelar talos liquénicos son ampliamente conocidas en el estado de la técnica y son práctica de rutina para el experto en la materia.

Tras la recolección del talo liquénico, el método comprende el lavado y la posterior disrupción del talo liquénico con una solución isotónica estéril [etapa b)].

Tanto el lavado como la disrupción del talo se llevan a cabo con una solución isotónica estéril. Cualquier solución isotónica estéril puede usarse en el lavado y disrupción del talo liquénico. En la presente invención se entiende por "solución isotónica" a la composición que comprende varias sales disueltas en agua con la finalidad de crear

una solución salina con una concentración de sales equivalente al tejido biológico. En una realización particular, dicha solución isotónica estéril es la solución Ringer. La solución Ringer típica comprende, en general, cloruro de sodio, cloruro de potasio, cloruro de calcio y bicarbonato sódico (este último usado para equilibrar el pH). Por ejemplo, una típica solución isotónica estándar comprende 5 9 de NaCI, 0,42 9 de KCI, 0,25 9 de CaCI2 y 0,2 9 de bicarbonato sódico disuelto en un litro de agua destilada.

Adicionalmente, la solución isotónica estéril empleada en el presente método puede estar suplementada con un agente surfactante. En la presente invención, se entiende por "agente surfaclanle" o "tensioactivo" o "detergente" a la sustancia que influye por medio de la tensión superticial en la superficie de contacto entre dos fases. La clasificación se fundamenta en el poder de disociación del tensioactivo en presencia de un electrolito y de sus propiedades fisicoquímicas. Los agentes surfactantes pueden ser iónicos o no-iónicos; y dentro de los iónicos según la carga que posea la parte que presenta la actividad de superficie serán: aniónicos, catiónicos yanfóteros. Cualquier agente surfactante puede emplearse en el contexto de la presente invención. No obstante, en una realización particular, el agente surfactante es polisorbato 20 o monooleato de polioxietileno sorbitan, comúnmente conocido como Tween 20®.

Para la obtención del extracto liquénico primero se realiza un lavado breve, con agua destilada estéril, del talo liquénico recolectado para eliminar las impurezas más gruesas (polvo, tierra, etc). Después el talo se somete a un lavado más prolongado con una solución isotónica estéril, por ejemplo, durante 30 minutos a 200 r.p.m a temperatura ambiente. Tras dicho lavado del talo, se procede a la disrupción del mismo. En la presente invención se entiende por "disrupción" a la rotura del talo liquénico en fragmentos más pequeños. La disrupción puede llevarse a cabo mediante dilacerado, machacado, triturado, etc. No obstante, en una realización particular, la disrupción del talo liquénico se lleva a cabo mediante triturado.

En la presente invención se entiende por "dilacerado" a la técnica que comprende fragmentar el talo liquénico en trozos más pequeños. El dilacerado de los talos liquénicos puede hacerse, por ejemplo, mediante el empleo de cuchillas, bisturís, etc.

En la presente invención se entiende por "machacado" a la técnica que comprende golpear algo para deformarlo, aplastarlo o reducirlo a fragmentos pequeños sin llegar a triturarlo. El machacado de los talos liquénicos se puede hacer, por ejemplo, mediante el empleo de un mortero o con una maza en una bolsa de plástico.

En la presente invención se entiende por "triturado" a la técnica que comprende moler

o desmenuzar el talo liquénico sin llegar a reducirlo enteramente a polvo. El triturado del talo liquénico puede hacerse, por ejemplo, mediante una máquina trituradora.

Una vez llevada a cabo la etapa (b) se obtiene un producto que comprende el talo liquénico lavado y fragmentado en la solución isotónica, junto con los compuestos y sustancias bioactivosJas liberadas y disueltas en dicha solución. Dicho extracto liquénico será sometido a una esterilización por filtración [etapa c) del método para obtener el extracto liquénico de la invención).

El empleo en el presente método de un proceso físico de filtración sin uso de calor ni de compuestos químicos (por ejemplo, disolventes), permite que no se alteren las propiedades de las sustancias liquénicas que se han extraído en la etapa b) del método. Obteniendo así un extracto liquénico que conserva de forma intacta todos los compuestos y sustancias bioactivoslas presentes en la especie liquénica en su estado fresco. Por este motivo, el uso del extracto liquénico obtenido mediante el presente método es óptimo para cultivar ylo aislar microorganismos asociados a una población de una especie liquénica de interés. Este aspecto se explicará en detalle más adelante en la presente descripción.

La esterilización por filtración se logra por el paso de un líquido o un gas a través de un material capaz de retener los microorganismos presentes. Existen varios tipos de filtros y cualquiera de ellos puede usarse en la presente invención. Ejemplos de filtros incluyen, sin limitar a, filtros de profundidad y los filtros de superficie o filtros de membrana.

Los filtros de profundidad están elaborados por un material fibroso (papel, asbesto o fibra de vidrio) dispuesto al azar, de manera que dentro de la estructura del filtro se crean vías tortuosas donde pueden quedar retenidos la mayoría de los contaminantes presentes. Dadas sus características, los filtros de profundidad se usan principalmente como prefiltros, ya que permiten eliminar las partículas grandes pero no la eliminación total de los microorganismos. Así, en una realización particular, la esterilización por filtración comprende el empleo de un pre-filtro.

Los filtros de superficie son filtros elaborados generalmente a partir de acetato de celulosa o nitrato de celulosa y contienen poros de tamaño uniforme. Al conocer el tamaño de poro que presentan, se pueden seleccionar filtros capaces de retener los microorganismos de la solución. En una realización particular, el tamaño de poro del filtro es de entre 0,22 y 0,45 ¡Jm. Para una filtración esterilizante óptima se pueden usar combinaciones de un filtro de profundidad (pre-filtro), con un tamaño de poro de, por ejemplo, 0,8 I-Im, con un filtro de superficie que tenga un tamaño de poro, por ejemplo, de 0,22 IJm. En otra realización todavía más particular, la esterilización por filtración de la etapa e) se lleva a cabo con un prefiltro (con tamaño de poro de 0,8 IJm) Y un filtro, en donde el tamaño de poro del filtro es de entre 0,22 y 0,45 IJm.

Cualquier especie liquénica puede emplearse para obtener el extracto liquénico de la invención. El talo liquénico está constituido por hongos liquenizantes junto con los fotobiontes. Ejemplos de hongos liquenizantes que conforman una especie liquénica incluyen, sin limitar a, los Lecanoromycetes que contienen 14.000 especies conocidas de las cuales el 95 % están formando líquenes (ascolíquenes), estableciendo simbiosis mutualistas con microalgas verdes (clorolíquenes) o cianobacterias (cianolíquenes); solo unos pocos establecen simbiosis interna con algas y cianobacterias al mismo tiempo (cefalodios). En el trabajo de Miadlikowska etal., 2014 (Mol Phylogenet Evol 79: 132-168) aparecen relacionados los géneros de los hongos de esta clase que liquenizan, en resumen 1139 taxones, 317 géneros, 66 familias, 17 órdenes y 5 subclases: Acarosporomycetidae, Lecanoromycetidae, Ostropomycetidae, Umbilicariomycetidae y "Candelariomycetidae". Solo un pequeño porcentaje de los Basidiomycetes son capaces de liquenizar (basisiolíquenes) y los géneros más comunes (Omphalina, Dyctionema, etc.) aparecen relacionados en las publicaciones de Lutzoni, 1997 (Syst Biol. 46 (3): 373-406) y de Hodkinson et al., 2014 (Fungal Divers. 64 (1): 165-179).

Algunos ejemplos más pormenorizados de especies liquénicas pueden ser

Acarospora spp. Gladonia spp., Evernía spp., Flavoparmelia spp., MeJanelia spp., Pamotrema spp., Platismatia spp., Pseudevernia spp. , Ramalina spp., Tephromela spp., Usnea spp. o Xanthoparmelia spp. , No obstante, en una realización particular, la especie liquénica se selecciona del grupo que consiste en Pamotrema spp., Pseudevernia spp. y Ramalina spp.

Ejemplos de Ramalina spp. incluyen, pero no se limitan a, R. asahinae, R. bourgaeana

R. canariensis, R. farinacea, R. fasligiala, R. fraxinea" R. impleclens, R. subgeniculata,

Ejemplos de Parmotrema spp. incluyen, pero no se limitan a, P. arnold;¡, P. austrosinense, P. crinilum,. P. hypoleucinum, P. perlatum, P. pseudotinctorum.

Ejemplos de Pseudevernia spp. incluyen, pero no se limitan a, P. ceralea, P. cirrhata,

P. consocians, P. furfuracea, P. furfuracea varo ceralea, P. furfuracea varo furfuracea ,

P. isidiophora , P. kamerunensis, P. mauritiana.

Ejemplos de Evernia spp. incluyen, pero no se limitan a, E. divaricata, E. iIIyrica, E. furfuracea, E. mesomorpha, E. prunastri

Ejemplos de Parmelia spp. incluyen, pero no se limitan a, P. barrenaae, P. saxatilis, P. serrana, P. sulcata.

Ejemplos de Usnea spp. incluyen, sin limitar a, U. barbata, U. dasypaga, U. filipendula,

U. florida, U. hirta, U. rubicunda, U. rubiginea, U. scabrida, U. sphacelata, U. strigosa,

U. subfloridana.

Ejemplos de Cetraria spp. -en sentido amplio-y Karnefeltia incluyen, pero no se limitan a, C. aculeata, C. crespoae, C. islandica, C. ericetarum, y C. iberica (Karnefeltia merrillií.

Extracto liguénico de la invención y sus usos

En otro aspecto, la invención se relaciona con un extracto liquénico, de aquí en adelante "extracto liquénico de la invención", obtenido mediante el método de obtención del extracto liquénico descrito anteriormente.

El extracto liquénico de la invención se caracteriza porque comprende de forma intacta todos los compuestos y sustancias bioactivos/as presentes en la especie liquénica en su estado fresco o natural. Esta característica es consecuencia del método de obtención empleado pues, tal como se ha explicado, en el método de obtención se emplea un proceso físico de esterilización (esterilización por filtración)

que no altera las propiedades físicas, químicas o biológicas de los compuestos y sustancias presentes en el liquen.

Como entiende el experto en la materia, el extracto liquénico de la invención puede estar formando parte de una composición que además de comprender dicho extracto liquénico, comprende otros compuestos o sustancias que pueden potenciar o facilitar el crecimiento o aislamiento de los microorganismos. Así, en otro aspecto, la invención se relaciona con una composición, de aquí en adelante "composición de la invención», que comprende el extracto liquénico de la invención. Ejemplos de otros compuestos o sustancias que pueden estar presentes en la composición de la invención incluyen , sin limitar a, una fuente de carbono, una fuente de nitrógeno, una fuente de fósforo, vitaminas, antifúngicos o antibacterianos según interese, etc.

En el contexto de la presente invención, la composición puede ser liquida o sólida. En una realización particular, la composición es un medio de cultivo.

La presencia en el extracto liquénico de la invención de los compuestos y sustancias biactivosJas presentes en la especie liquénica en su estado fresco o natural permite que, si este extracto liquénico es añadido a un medio de cultivo, se puedan aislar y cultivar microorganismos asociados a dicha especie liquénica con mayor eficacia que si el medio de cultivo no comprende el extracto liquénico.

Por lo tanto, en otro aspecto, la invención se relaciona con el uso del extracto liquénico de la invención y/o de la composición de la invención, para aislar y/o cultivar los microorganismos asociados a una especie liquénica de interés, en donde el extracto liquénico es obtenido a partir de, al menos, un talo liquénico de la especie liquénica de la que se quiere aislar el/los microorganismo/s. En una realización particular, el cultivo se lleva a cabo en un medio mínimo suplementado con, al menos, un extracto liquénico obtenido a partir de talos de la misma población que el/los talo/s de la especie liquénica de la que se quiere aislar el/los microorganismo/s. El término "población" ha sido definido previamente.

En una realización particular, el microorganismo asociado a la especie liquénica se selecciona del grupo que consiste en bacterias, algas, hongos filamentosos, levaduras y virus de los microorganismos liquénicos anteriores.

Ejemplos de hongos no liquenizantes asociados a líquenes incluyen, sin limitar a, a miembros de filo Ascomycola (Bates el al., 2012. The Lichenologisl 44(1): 137-146, doi:10.1017/S002428291 1000648. Los hongos liquenizantes se han mencionado previamente.

Ejemplos de algas incluyen, sin limitar a, las microalgas verdes. Las microalgas verdes que suelen asociarse con los Ascolíquenes y Basidiolíquenes son, dentro de las Chlorophyta, de las clases Trebouxiophyceae y Ulvophyceae, (por ejemplo: Trebouxia, Asterochloris, Coccomyxa, Dictyochloropsis s.l. eh/arel/a, Elliptochloris, Phycopeltis, Trentepohlia, etc.) o cianobaclerias de los órdenes Chroococcales, Nostocales, y Stigonematales (por ejemplo: Nostoc, Rhizonema, Scytonema, Stigonema, etc.) [Friedl T. & Büdel B. 2008. Photobionts. En: Nash T. H. (Ed.), Lichen biology, Segunda edición. Cambridge University Press, Cambridge, pp. 9-26].

Ejemplos de virus de microorganismos liquénicos incluyen, sin limitar a, Ivy (hiedra) latent Cytorhabdovirus y Apple (manzano) mosaic virus (ApMV). Ambos son tipos de virus de ARN de doble cadena encontrados en algas liquénicas del género Trebouxia (Petrzik, K. el al. , 2014. Eur. J. Planl Palhol. , 138(3): 549-559).

Ejemplos de bacterias incluyen, sin limitar a, las pertenecientes entre otros a los Ordenes Actinomycetales, Badila/es, Burkholderiales, Caulobacterales, Rhizobia/es, RhodospiriIJa/es, Pseudomonadales, Sphingomonadales y Xanlhomonada/es (Cardinale el al., 2006; Cardinale el al., 2008 (FEMS Microbio!. Eco!. 66:63-71) Liba el al., 2006 ; Grube & Berg 2009 (Fungal Biology Reviews 23: 72-85.); Grube el al., 2009, 2014; Hodkinson & Lulzoni 2009 (Symbiosis, 49: 163-180.); Selbman el al., 2010 ; Bates el al., 2011 (App!. Environ. Microbio!. 77(4): 1309-1314; Lasken & McLean, 2014).

En otra realización particular, la especie liquénica de interés se selecciona del grupo que consiste en Pamolrema spp., Pseudevernia spp. y Ramalina spp. Ejemplos de otros géneros y especies liquénicas que pueden emplearse en la presente invención han sido descritos previamente en el método de obtención del extracto liquénico de la invención.

Método para aislar microorganismos asociados a una especie liguénica de interés En otro aspecto, la invención se relaciona con un método para aislar microorganismos asociados a una especie liquénica de interés, de aquí en adelante "método de aislamiento de la invención", que comprende

(a): recolectar al menos un talo liquénico de la especie liquénica de la que se quieren aislar los microorganismos, en condiciones de asepsia ,

(b): Lavar de forma extensiva el talo liquénico recolectado en la etapa (a), con solución isotánica.

(e): Llevar a cabo la disrupción del talo liquénico lavado en la etapa (b), y

(d): cultivar, en un medio de cultivo mínimo suplementado con, al menos, el extracto liquénico de la invención:

(i): el producto obtenido de la disrupción del talo liquénico de la etapa (e), y/o

(ii): la solución de lavado recuperada tras el lavado extensivo de la etapa (b)

en donde, en el caso de que se cultiven (i) y (ii), se cultivan de forma independiente, y el extracto liquénico se obtiene a partir del especie liquénica de interés de la que se quieren aislar los microorganismos.

En una primera etapa, el método de aislamiento de la invención comprende recolectar al menos un talo liquénico de la especie liquénica de la que se quieren aislar los microorganismos, en condiciones de asepsia.

La recolección del talo de la especie liquénica de interés tiene que hacerse en condiciones asépticas, es decir, en las condiciones de recogida adecuadas para que los líquenes no resulten contaminados con otros microorganismos ajenos al propio liquen. Como entiende el experto en la materia, pueden recogerse uno o más talos de la misma especie liquénica. Los líquenes pueden crecer en una gran variedad de sustratos, tales como la corteza de los árboles, la superticie de las rocas, el suelo, materiales artificiales (vidrio, uralita, tejas, cemento, etc.), etc., por lo que para obtener los talos liquénicos primero hay que recogerlos de su entorno. Para ello, pueden emplearse bisturís, navajas, cuchillos, tijeras, guantes, pinzas, etc. y una vez recogidos los talos, se pueden almacenar en bolsas, placas Petri o tubos de plástico para su traslado al laboratorio. Con la finalidad de conseguir dichas condiciones asépticas de recogida, todo el material anteriormente mencionado puede ser esterilizado o descontaminado antes de ser usado. Una vez recogido el/los talo/s liquénicols de su entorno, estos son llevados al laboratorio para ser procesados.

Una característica esencial del método de aislamiento de la invención es que el extracto liquénico empleado en el medio de cultivo tiene que haberse obtenido de la misma especie liquénica de la que se quiere aislar el/los microorganismo/s. Por ejemplo, si el objetivo es aislar los microorganismos asociados a la especie liquénica Pseudevernia furfuracea (L.) Zopf, el extracto liquénico con el que se suplementará el medio mínimo se obtendra a partir del talo/s de una especie de P. furfuracea. Otro ejemplo puede ser Ramalia farinacea (L.) Ach. o Parmotrema spp. , en dichos casos los medios de cultivo se suplementarían con extractos liquénicos de los respectivos líquenes.

En una realización particular de la etapa (a), los talos liquénicos recolectados pertenecen a la misma población de la especie liquénica. El término población ha sido descrito previamente. Así, en el aislamiento de microorganismos asociados a líquenes, se puede añadir al medio mínimo un extracto liquénico obtenido a partir de talos de líquenes de la misma población que los líquenes de los que se quieren aislar y cultivar los microorganismos.

En una segunda etapa, el método de aislamiento de la invención comprende lavar de forma extensiva con una solución isotónica el talo liquénico recolectado en la etapa (a). En la presente invención se entiende por "lavar de forma extensiva" o "lavado extensivo" al lavado cuya duración abarca desde los 60 hasta los 90 minutos. En una realización particular, el lavado extensivo del talo liquénico comprende el lavado durante al menos, aproximadamente 60 minutos, preferiblemente, aproximadamente 90 minutos. Cualquier solución isotónica estéril puede emplearse en el lavado del talo liquénico recolectado en la etapa a). No obstante, en una realización particular, el lavado se lleva a cabo con una solución isotónica estéril que comprende un agente surfactante. En otra realización particular, la solución isotónica estéril es solución Ringer. En otra realización todavía más particular el agente surfactante es Tween 20. Tanto definiciones como ejemplos de soluciones isotónicas y agentes surfactantes han sido descritos previamente en la presente descripción y son aplicables al presente aspecto inventivo.

Opcionalmente, tras el lavado extensivo del talo liquénico con solución isotónica, y la separación del mismo de la solución de lavado obtenida en la etapa (b) se puede proceder a eliminar del talo posibles restos del lavado con agua destilada estéril mediante, por ejemplo, un enjuagado.

A continuación, se lleva a cabo la disrupción del talo liquénico. El término "disrupción" ha sido definido previamente en la presente descripción. La disrupción puede llevarse a cabo mediante machacado, dilacerado, triturado, etc. No obstante, en una realización particular, la disrupción del talo liquénico se lleva a cabo mediante machacado en un tampón de maceración antioxidante estéril (AMB de sus iniciales en inglés Antioxidant Maceration Buffer) y en condiciones de asepsia. El efecto técnico asociado a este procedimiento de machacado es la obtención de mayor cantidad de microorganismos aislados que mediante el empleo de las otras técnicas de disrupción (triturado/dilacerado). Asimismo, el empleo de tampón de maceración antioxidante previene las posibles reacciones de oxidación que pudieran ocurrir durante el procesado del material y que pudieran inhibir el crecimiento microbiano.

Una vez llevadas a cabo las etapas (a) a (c) del método de aislamiento de la invención se lleva a cabo la etapa (d) que comprende cultivar, en un medio de cultivo mínimo suplementado con, al menos, el extracto liquénico de la invención:

(i): el producto obtenido de la disrupción del talo liquénico de la etapa (c), y/o

La puesta en practica del método de la invención requiere que el medio mínimo esté suplementado con un extracto liquénico obtenido a partir de talos de la especie liquénica de interés, es decir, a partir de talos del liquen del que se quieren aislar los microorganismos. Por ejemplo, tal como se ha explicado previamente para aspectos inventivos anteriores, si el objetivo es aislar los microorganismos asociados a la especie liquénica P. furfuracea, el extracto liquénico con el que se suplementara el medio mínimo se obtendra a partir de talols de dicha especie. Otro ejemplo puede ser

R. farinacea o Parmotrema spp., en dichos casos los medios de cultivo se suplementarían con extractos liquénicos de las respectivas especies liquénicas. En una realización particular, la etapa de cultivo (d) se lleva a cabo en un medio mínimo suplementado con, al menos, un extracto liquénico obtenido a partir de talos de la misma población que elllos talols de la especie liquénica recolectado según la etapa (a). El término población ya ha sido definido previamente.

En la presente invención se entiende por "medio mínimo" a cualquier medio de base mineral que comprende los compuestos básicos para permitir el crecimiento de los microorganismos. Ejemplos de medios mínimos incluyen, sin limitar a, medio mínimo AB (Chillan el al., 1974, Proc. Nall. Acad. ScL USA, 71 :3672-3676): K,HPO" 3 g; NaH, PO, 1 g; NH,CL 1 g; MgSO, -7H,O 0,3 g; KCI 0,15 g; CaCl, 0,01 g; FeSO, 7H,O 2,5 mg, por 1 L de agua destilada; glucosa 0,5%), medio M9, medio MBMA, medio M63 y medio MA. Más detalles pueden encontrarse en Santander el al., 2014 (FEMS Microbiol. Ecol. 90(3): 895-907, doi: 10.1111 /1574-6941.12444). Para llevar a cabo el método de aislamiento de la invención no es necesario que el medio mínimo lleve una fuente de carbono, pues basta con la presencia del extracto liquénico de la invención. No obstante, en una realización particular, el medio mínimo comprende una o más fuentes de carbono que, en otra realización todavía más particular, dicha fuente de carbono es glucosa y/o manitol al 0,5 %.

Asimismo, dependiendo del tipo de microorganismo que se quiera aislar (bacterias, algas, hongos filamentosos o unicelulares (levaduras) y/o virus), el medio de cultivo mínimo puede estar suplementado con otros componentes. Por ejemplo, si el microorganismo que se quiere aislar mediante el método de aislamiento de la invención es una bacteria liquénica (es decir, asociada a un liquen), el medio de cultivo tendrá que ir suplementado con otros compuestos que eviten el crecimiento de otros microorganismos que puedan interferir con el crecimiento de la bacteria. Así, el medio mínimo de cultivo puede ir suplementado con, al menos, un antifúngico. En la presente invención se entiende por "antifúngico" a toda sustancia que tiene la capacidad de evitar el crecimiento de algunos tipos de hongos o incluso de provocar su muerte. Ejemplos de antifúngicos incluyen, sin limitar a, polienos (e.g. anfotericina 8), pirimidinas (e.g. fluorocitosina), imidazoles (e.g. miconazol), triazoles (e.g. fluconazol), cardinas y cicloheximida. En una realización particular, el cultivo del paso

(d) se lleva a cabo en un medio de cultivo mínimo suplementado al menos con el extracto liquénico y con al menos un antifúngico, preferiblemente, natamicina.

Por otro lado, si el microorganismo que se quiere aislar del talo liquénico es un virus asociado a un microorganismo liquénico (bacterias, algas, hongos filamentosos o levaduras), entonces el medio de cultivo estará suplementado con un césped del microorganismo liquénico para que el virus pueda crecer. Así, en otra realización particular, el cultivo del paso (d) se lleva a cabo en un medio de cultivo mínimo

suplementado al menos con el extracto liquénico y con el microorganismo liquénico de interés.

En una realización particular, el microorganismo asociado a la especie liquénica de interés se selecciona del grupo que consiste en bacterias, algas, hongos filamentosos, levaduras y virus de los microrganismos liquénicos antes mencionados. Ejemplos de hongos y algas asociados a talos liquénicos ya han sido descritos en párrafos anteriores.

Ejemplos de especies liquénicas que pueden emplearse para aislar microorganismos asociados a ellas han sido mencionados en aspectos inventivos anteriores. En una realización particular, el talo liquénico de la especie liquenica se selecciona del grupo que consiste en Pamotrema spp. , Pseudevernia spp. y Ramalina spp.

A lo largo de la descripción y las reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y características de la invención se desprenderán en parte de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Los siguientes ejemplos y figuras se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de la presente invención.

BREVE DESCRIPCiÓN DE LAS FIGURAS

Figura 1. Especie de liquen fruticuloso, Pseudevernia furfuracea, en corteza de Pinus sylvestris. Barra de escala = 1 centímetro.

Figura 2. Mejora de la recuperación de bacterias asociadas a Pseudevernia furfuracea con un protocolo de aislamiento modificado y medio de cultivo mínimo. Se muestra la media de los recuentos de bacterias cultivables (UFC/g) ectoliquénicas (barras blancas) y endoliquénicas de P. furfuracea (barras grises) en los medios de cultivo KB, 8BM Y MMS después de 7 días de incubación a 25°C. Las muestras de talos liquénicos se tomaron en la primavera de 2012 de varios ejemplares de Pinus sylvestris de la Sierra de Javalambre (Teruel, España). Cada barra representa el valor medio de los recuentos en cada medio de cultivo de tres talos diferentes analizados en experimentos independientes. La desviación estándar de los datos se indica mediante líneas verticales.

,.

Figura 3. Comparación del crecimiento de cepas bacterianas de Pseudevernia furfuracea en medio mínimo enriquecido con liquen versus sin liquen con o sin fuentes de carbono. Imágenes representativas que muestran el crecimiento de cepas bacterianas seleccionadas aisladas de P. furfuracea en el medio AS suplementado o no con glucosa (G), manitol (M), o ambos (GM) y/o extracto de liquen (L) después de 96 horas de incubación a 25°C. Algunos detalles del crecimiento diferencial de algunas cepas bacterianas se indican con asteriscos negros. Todas las cepas ensayadas crecieron en el medio de cultivo control KB (datos no mostrados).

Figura 4. Efecto de los medios de cultivo enriquecidos con extracto de liquen y el tiempo de incubación sobre el crecimiento de cepas bacterianas de Pseudevernia furfuracea. El gráfico de columnas apiladas de crecimiento de 139 cepas bacterianas de P. furfuracea en el medio mínimo AS suplementado o no con fuentes de carbono (glucosa, G; manitol, M; o glucosa y manitol, GM) y/o extracto de liquen (L) después de 24 horas (a) y 96 horas (b) de incubación a 25°C. El crecimiento de bacterias en cada medio ensayado se comparó con el control en el medio KS, que se fij ó arbitrariamente en un crecimiento del 100%. Los resultados del crecimiento se agruparon en tres categorías (no crecimiento, crecimiento en el punto de inoculación y crecimiento incrementado). Los datos mostrados proceden de un experimento realizado por duplicado. Las diferencias significativas (p<0,001) entre los dos medios de cultivo se indican mediantes asteriscos situados arriba de las columnas apiladas. También se encontraron diferencias significativas (p<0,001 ) entre 24 horas (a) y 96 horas (b) de incubación.

Figura 5. Efecto de los medios enriquecidos con liquen en la recuperación de bacterias asociadas a Pseudevernia furfuracea de una muestra de talo. Se muestra la media de los recuentos de bacterias cultivables (UFC/g) ectoliquénicas (a) y endoliquénicas de P. furfuracea (b) en los medios de cultivo AS, ASG y A8GM enriquecidos o no con extracto de liquen y en el medio K8, después de 3 días de incubación a 25°C. La muestra de talo se tomó en la primavera de 2012 de un ejemplar de Pinus sylvestris de la Sierra de Javalambre (Teruel, España). Cada barra representa el valor medio de los recuentos realizados por duplicado en cada medio de cultivo de la misma muestra de talo. La desviación estándar de los datos se indica mediante líneas verticales. Las diferencias significativas se indican con letras diferentes arriba de las barras de error (*p<0,005; **p<O,01 ).

Figura 6. Efecto de los medios enriquecidos con liquen y el tiempo de

incubación en la recuperación de bacterias asociadas a Pseudevernia furfuracea de muestras compuestas de distintos talos. Se muestra la media de los recuentos de bacterias cultivables (UFC/g) ectoliquénicas (Figuras 6a, Be) y endoliquenicas de P. furfuracea (b, d) de muestras compuestas por cinco talos distintos, en los medios de cultivo enriquecidos con liquen con alto (ABGML) y bajo (ABL) contenido de nutrientes, en el medio sin liquen con alto contenido en nutrientes (ABGM) y en el medio rico en nutrientes KB, al aumentar el tiempo de incubación hasta 15 días a 25°C. Las muestras de talos liquénicos se tomaron en el otoño de 2012 (Figuras 6a, 6b) y en el verano de 2013 (Figuras 6c, 6d) de varios ejemplares de Pinus sylvestris de la Sierra de Javalambre (Teruel, España). Cada punto representa el valor medio de los recuentos realizados por triplicado en cada medio de cultivo de la misma muestra compuesta de distintos talos. La desviación estándar de los datos se indica mediante líneas verticales.

Figura 7. Efecto de dos antifúngicos sobre el crecimiento de hongos filamentosos de muestras de Pseudevernia furfuracea. Se muestran dos ejemplos representativos del efecto de la cicloheximida (C) y la natamicina (N) en el medio rico en nutrientes KB sobre el crecimiento de dos hongos filamentosos, aislados frecuentemente de muestras de talos liquénicos, tras 7 días de incubación a 25°C

Fígura 8. Efecto de la cicloheximída (e) y la natamícína (Nat) en la recuperación de bacterias de Pseudevernia furfuracea. Se muestra la media de los recuentos de bacterias cultivables (UFC/ml) ectoliquénicas de P. furfuracea tanto en medio de cultivo rico en nutrientes (KB) como medio mínimo (ABGM), suplementados con cicloheximida o natamicina. H, hongos filamentosos que invaden las placas de medio de cultivo en un periodo de 3-5 días. H', hongos filamentosos que invaden las placas de medio de cultivo en un periodo superior a 7 días. Cada barra representa el valor medio de los recuentos en cada medio de cultivo de dos talos diferentes de P. furfuracea analizados por duplicado. La desviación estándar de los datos se representa mediante líneas verticales. Los asteriscos indican diferencias estadísticamente significativas (**p<0,01; ***p<0,0001).

Figura 9. Efecto del tiempo de lavado en la recuperación de bacterias ectoliquénicas de Pseudevernia furfuracea. Se muestra la media de los recuentos

de bacterias cultivables (U Fe/mi) ectoliquénicas de P. furfuracea tanto en medio de cultivo rico en nutrientes (KB) como medio mínimo (ABGM), ambos suplementados con natamicina, tras 3 días de incubación a 25°C. Cada símbolo representa el valor medio de tres recuentos en cada medio de cultivo de una composición de talos de P. furfuracea La desviación estándar de los datos se representa mediante líneas verticales.

Figura 10. Efecto de distintos tratamientos de desinfección y del procesado de los talos liquénicos en la recuperación de bacterias endoliquénicas de Pseudevernia furfuracea. Se muestra la media de los recuentos de bacterias cultivables (UFC/ml) endoliquénicas de P. furfuracea tanto en medio de cultivo rico en nutrientes (KB) como medio minimo (ABGM), ambos suplementados con natamicina, tras 7 días de incubación a 25°C. Los detalles sobre el tipo y/o tiempo de desinfección ensayado se muestran en la figura. Los tipos de procesado comparados fueron dilacerado (Dil.) versus machacado (Mach.). Cada barra representa el valor medio de tres recuentos en cada medio de cultivo de una composición de talos de P. furfuracea La desviación estándar de los datos se representa mediante líneas verticales. Los asteriscos indican diferencias estadísticamente significativas (*p<O,05; **p<O,01 ; ***p<O,0001 ).

EJEMPLOS

A continuación se ilustrará la invención mediante unos ensayos realizados por los inventores que ponen de manifiesto la efectividad del producto de la invención.

Ejemplo 1 Aislamiento de bacterias asociadas a especies liquénicas mediante el uso de un extracto liquénico

MATERIAL Y METODDS

Muestras de líquenes lugar del muestreo y toma de muestras los talos del liquen Pseudevernia furfuracea (Figura 1) se obtuvieron de una zona de bosque de Pinus sylvestris en las montañas de la Sierra de Javalambre, situada en la comarca Gúdar-Javalambre, en la provincia de Teruel (Aragón, España). Los muestreos iniciales se llevaron a cabo en mayo de 2012. A partir de entonces, se tomaron nuevas muestras en el mismo lugar. En cada muestreo, las muestras de líquenes se recogieron a partir de al menos cinco árboles seleccionados al azar dentro de un área de unos 50 metros. Se recogieron especímenes fisiológicamente activos que se retiraron cuidadosamente de la corteza de los árboles utilizando guantes estériles, transfiriéndose después a placas Petri de plástico estériles que se almacenaron en bolsas de plástico individuales. Los distintos talos liquénicos muestreados se transportaron al laboratorio y se mantuvieron a 4°C hasta su procesamiento dentro de las 24 horas después del muestreo. La temperatura de cada muestreo se registró in situ y los datos de humedad se obtuvieron de la Agencia Española de Meteorología (AEMET).

Análisis bacteriológico

Para el aislamiento de bacterias asociadas a P. furfuracea, las muestras de talos liquénicos se analizaron inicialmente como sigue. Brevemente, cada talo individual se lavó en agua destilada estéril 1 minuto y con ayuda de un bisturí estéril se cortaron submuestras de 0,2 g en placas Petri estériles. Estas submuestras se dilaceraron en solución salina estéril (0,9% NaCI en agua destilada, pH 7,0) (SS) Y a continuación se realizaron diluciones decimales seriadas en solución salina estéril tamponada con fosfato (PBS) (10 mM, pH 7,0 (NaCI8 g; KCI 0,2 g; Na,HPO, • 12H,O 2,9 g; KH,PO, 0,2 g; agua destilada hasta 1 L). Tanto de las muestras de dilacerado de talo como de sus diluciones se sembraron alícuotas de 100 IJI en el medio sólido no selectivo King B (KB) (King et al., 1954; J. Lab. Clin. Med. 44:301-307) utilizado rutinaria mente para el aislamiento de bacterias asociadas a plantas, tras suplementario con cicloheximida (50 mg I mL) (Biosca et al., 2003; Phytopathology 93: 485-492, modificado segun Ishimaru & Klos, 1984, Phytopathology. 74:1342-1345) para evitar el crecimiento de hongos. Las placas se incubaron durante una semana a 25°C en condiciones de oscuridad y las colonias bacterianas que aparecieron en ellas se contaron para determinar las unidades formadoras de colonias por gramo (UFC/g) de talo. Las colonias morfológicamente diferentes se purificaron en el mismo medio y crioconservaron a -80°C en 25% (v/v) de glicerol estéril.

Modificación del protocolo del aislamiento de bacterias para mejorar la recuperación de bacterias asociadas a Po furfuracea Para tratar de mejorar la recuperación de bacterias asociadas al liquen P. furfuracea se ensayaron dos modificaciones del protocolo de aislamiento de bacterias mediante el análisis de tres muestras de talo diferentes en experimentos independientes. En primer lugar, para incrementar la recuperación, mayoritariamente, de bacterias ectoliquénicas, tras un breve lavado de 1-2 minutos en SS estéril, las muestras se sometieron a un lavado extensivo en matraces de 250 mL con 50 mL de solución de Ringer estéril (Schaad et al., 1990; Methods in Phytobacteriology. Z. Klement, K. Rudolph & D.C. Sands (eds.) Akadémia Kiadó, Budapest, pp. 153-190.) suplementada con un 0,05% del surfactante Tween 20 (RST), con agitación durante 90 minutos a 200 r.p.m. a temperatura ambiente (Biosca et al., 2011 ; En: IV International Conference on Environmental, Industrial and Applied Microbiology, BioMicroWorld 2011). En segundo lugar, para aumentar la recuperación de bacterias endoliquénicas, estos mismas muestras de talos lavados se sometieron a una desinfección en superficie (con etanol 70% (v/v) durante 1 minuto), se lavaron dos veces durante 5 minutos en agua destilada estéril y se dilaceraron en 3 mL de tampón de maceración antioxidante (AMB) (Gorris et al., 1996; Acta Hortic. 411: 47-51 ); para prevenir el estrés oxidativo que se pudiera producir durante el procesado de los talos liquénicos y que podría afectar al aislamiento de bacterias liquénicas. Cada muestra de dilacerado de talo se agitó ligeramente durante 5-10 minutos en hielo antes de proceder a su siembra en las placas de medio de cultivo. Tanto de las muestras de lavado de talos como las de dilacerado de talos y sus respectivas diluciones, se sembraron alícuotas de 100 IJI por duplicado en placas de KB. Dado que algunas bacterias liquénicas, como Methylobacterium sp., crecieron durante el aislamiento de microalgas de P. furfuracea en el medio mínimo BBM (de las iniciales en inglés Bold's Basal Medium ) utilizado para el crecimiento de microalgas (Bischoff & Bold, 1963. Some soil algae from enchanted rack and related algal species. Phycological Studies IV., Univ. No.

6318, Texas, p. 1-95) en estudios anteriores, este medio de cultivo junto con el medio Metanol Sales Minerales (MMS) (Green , 2006. Methylobacterium. Prokaryotes 5, pp. 257-265), selectivo para Methylobacterium, se incluyeron en estos ensayos después de añadirles cicloheximida, como se ha descrito anteriormente. Todas las placas inoculadas se incubaron durante una semana a 25°C en condiciones de oscuridad, anotándose el número de colonias bacterianas que se desarrollaron en todos los medios de cultivo. Las poblaciones de bacterias endoliquénicas y endoliquénicas cultivables se estimaron calculando los valores medios de UFC/g de muestras de talos lavados y talos desinfectados y dilacerados, respectivamente. De cada medio de cultivo se seleccionaron al azar colonias con diferente morfología colonial y se purificaron y crioconservaron como se ha mencionado anteriormente.

Desarrollo de medios de cultivo enriquecidos con extracto de liquen Para aumentar aún más la recuperación de bacterias cultivables asociadas a Pseudevernia furfuracea , se trató de simular las condiciones nulricionales de este liquen mediante el desarrollo de varios medios de cultivo mínimos enriquecidos con extractos de talos de P. furfuracea. Para este propósito, se incluyó el medio mínimo AB (Chiltan el al., 1974, citado ad supra), que se suplementó o no con glucosa (G) (fuente de carbono principal de fotobionte) (ABG) y/o manitol (M) fuente de carbono principal del micobionte) (ABM y ABGM ), y/o extractos de liquenes (L) (ABL, ABLG, ABLM Y ABLGM). Los diferentes medios de cultivo AS se prepararon añadiendo al medio glucosa y/o manitol esterilizados por filtración (cada uno a 0,5% (p/v) de acuerdo con Cardinale et al. (2006, citado ad supra) y/o extractos de liquen fresco (también al 0,5% (v/v». Para la preparación de los extractos de liquen, los talos de P. furfuracea se lavaron brevemente con agua destilada estéril, después se lavaron con RST estéril durante 30 minutos a 200 r.p.m . a temperatura ambiente, a continuación se trituraron en RST (5%) (p/v) en una licuadora y se esterilizaron por filtración (incluyendo el uso de prefiltros de policarbonato con un tamaño de poro de 0,8 micras, Millipore). También se utilizaron para algunos ensayos los medios mínimos BBM y MMS suplementados o no con extractos de liquen. Todos los medios de cultivo sólidos se prepararon con agar bacteriológico al 1,5% (plv) (Pronadisa) y se suplementaron con cicloheximida como se ha descrito anteriormente.

Evaluación de los medios de cultivo enriquecidos con liquen en el crecimiento de aislados bacterianos de P. furfuracea Para investigar el efecto de la adición de extracto de liquen a los medios mínimos sobre el crecimiento de una colección de aislados bacterianos de P. furfuracea, inicialmente se ensayaron 20 cepas en el medio AB (suplementado o no con fuentes de carbono y/o extracto de liquen) y BBM y MMS (con y sin extracto de liquen). En base a estos resultados, se seleccionó el medio AB como medio mínimo basal (modificado o no con la glucosa y/o manitol y/o extracto de liquen) para la realización de nuevos ensayos con una colección de 139 cepas bacterianas liquénicas obtenidas en este estudio y en otros de nuestro laboratorio. Además, a efectos comparativos, se incluyeron ocho cepas bacterianas heterótrofas de referencia de la Colección Española de Cultivos Tipo (CECT) (BaciJlus cereus CECT 495, Enferobacter cJoacae CECT 194, Enterococcus faecalis CECT 481 , Escherichia coN CECT 101 , Micrococcus luteus CECT 245, Pseudomonas fluorescens CECT 378, Salmonella enterica CECT 443 y Serratia marcescens CECT 159). Todas las cepas se inocularon en todos los medios enriquecidos o no con liquen , utilizando el medio Ka, en el que habitualmente se purificaron, como control de crecimiento, que se fijó arbitrariamente como un crecimiento del 100%. Los inóculos bacterianos se prepararon a partir de cultivos crecidos en placas de Ka a 25°C durante 48 horas y se resuspendieron en PBS estéril (aproximadamente a 108 UFC/ml). Estos inóculos bacterianos se inocularon con un multi-inoculador (Denley multipunto inoculador), al menos por duplicado, en todos los medios anteriormente mencionados. Por otra parte, para determinar el efecto del tiempo de incubación sobre el crecimiento bacteriano, las placas se incubaron durante 96 horas a 25°C y el crecimiento y la coloración se registraron después de 24 horas y 96 horas de incubación. Para el análisis estadístico posterior, los resultados de crecimiento se agruparon en dos (no crecimiento versus crecimiento) o tres categorías (no crecimiento, crecimiento en el punto inoculado y mayor crecimiento (crecimiento abundante en el punto inoculado).

Mejora de la cultivabilidad de las bacterias asociadas a P. furfuracea a partir de muestras de talo individuales Con el fin de evaluar el protocolo de aislamiento de bacterias y los medios de cultivo enriquecidos con liquen en la mejora de la cultivabilidad tanto de bacterias ectoliquénicas como endoliquénicas de talos de P. furfuracea , se analizaron nuevas submuestras de talo (0,2 g) según a la metodología descritas anteriormente. A continuación, se sembraron alícuotas (100 IJI) de lavado de talo y dilacerado de talo por duplicado en los medios enriquecidos o no con extracto de liquen (con o sin glucosa o glucosa y manitol) y el medio KB, y se incubaron a 25°C durante 3 días. Tras la incubación, las colonias bacterianas se contaron en todos los medios de cultivo, y las poblaciones de bacterias cultivables ectoliquénicas y endoliquénicas se estimaron mediante el cálculo de los valores medios de UFC/g de lavado de talo y dilacerado de talo lavado y desinfectado, respectivamente. Una selección aleatoria de las colonias que mostraron diferentes morfologías en las placas de aislamiento se purificaron y crioconservaron como ya se ha mencionado. El lavado y dilacerado de talo restantes también se criopreservaron para posteriores análisis.

Mejora de la cultivabilidad de las bacterias asociadas a P. furfuracea a partir de muestras compuestas por distintos talos

Para validar la metodolog ía desarrollada en este estudio en distintas muestras de talos, se tomaron nuevas muestras de líquenes de la misma localidad muestreada en mayo de 2012, pero de diferentes ejemplares recolectados de P. sylvestris, en dos

muestreos adicionales en octubre de 2012 y septiembre de 2013. En este caso, para cada muestreo realizado se analizaron muestras de 1 9 compuestas por distintos talos de P. furfuracea (submuestras de 0,2 9 de cinco talos de diferentes pinos), en lugar de analizar talos individuales. Los recuentos de bacterias cultivables ectoliquénicas y endoliquénicas de P. furfuracea se determinaron por triplicado en los medios de cultivo enriquecidos con liquen, ABLGM, con alto contenido nutrientes (con dos fuentes de carbono, glucosa y manitol) y ABL con bajo contenido nutrientes (sólo con

los nutrientes del extracto de liquen), y en el medio sin liquen con alto contenido en nutrientes ABGM y el medio rico en nutrientes KB , estos últimos con propósitos comparativos. Las placas se incubaron como se ha descrito anteriormente y el número de colonias que aparecieron en ellas se registró a distintos intervalos de tiempo hasta 15 días, a no ser que el número de colonias fuera demasiado alto o aparecieran hongos filamentosos en las placas de los medios de cultivo. Además, para estudiar el efecto del medio de aislamiento en la diversidad de las bacterias recuperadas, también se registraron las diferentes morfologías coloniales observadas en los diferentes medios de cultivo al final del experimento. Las colonias que mostraron distintos fenotipos se seleccionaron al azar, se purificaron mayoritariamente en placas de KB y se criopreservaron como se ha descrito anteriormente.

Optimización del protocolo de aislamiento para meiorar la recuperación de bacterias asociadas a P. furfuracea Con objeto de avanzar en la optimización del método de recuperación de bacterias liquénicas desarrollado, se ensayaron dos modificaciones adicionales del protocolo de aislamiento de bacterias mediante el análisis de nuevas muestras de talos en experimentos independientes. En primer lugar, para reducir el crecimiento de hongos filamentosos contaminantes que dificultan la recuperación de las bacterias de crecimiento más lento, se seleccionó otro antifúngico distinto al habitual y se comparó el efecto de ambos antifúngicos sobre el crecimiento de una selección de 7 hongos filamentosos que crecen frecuentemente en las placas de aislamiento de bacterias a partir de las muestras de talos liquénicos. La cicloheximida (50 mg/L) es el antifúnfico más ampliamente utilizado para reducir o evitar el crecimiento de hongos durante el aislamiento de bacterias de muestras ambientales, y la natamicina (21 ,6 mg/L, según Pedersen, 1992, Appl. Environ. Microbiol. 58(3):1064-1066), descrito como un antifúngico más eficaz que la cicloheximida, sin riesgos para la salud (se usa en la industria de alimentos) y sin efectos sobre el crecimiento bacteriano, a diferencia de la cicloheximida. Dichos ensayos se realizaron inicialmente en placas del medio de cultivo general rico en nutrientes KB, donde los hongos seleccionados crecen rápidamente. A continuación, se ensayó el efecto de la adición de dichos antifúngicos en la recuperación de bacterias liquénicas tanto en KB como en el medio mínimo (ABGM).

En segundo lugar, con el fin de aumentar la recuperación de bacterias endoliquénicas que parecían verse afectadas por el paso de desinfección: i) se evaluó el efecto del tiempo de lavado en la recuperación de bacterias ectoliquénicas tanto en el medio de cultivo rico en nutrientes (KB) como en el medio mínimo (ABGM ), ambos suplementados con natamicina, y ii) se ensayó el efecto de la desinfección de los talos liquénicos con etanol 70% (v/v) a dos tiempos distintos (30 segundos y 1 minuto) o con peróxido de hidrógeno al 8% (v/v) durante 5 minutos, incluyendo submuestras que se procesaron sin someterse a ningún tratamiento de desinfección. Al mismo tiempo, también se investigó el efecto del tipo de disrupción de los talos en el tampón antioxidante AMB, comparando el procesado de los mismos mediante dilacerado (anteriormente explicado) frente al machacado, en el interior de una bolsa de plastico esterilizada, con una maza de goma (Ordax el al., 2009, J. Appl. Microbiol. 107(1):106-16). En ambos casos, tras la disrupción de los talos, se procedió a la incubación de los mismos en hielo picado, durante 5-10 minutos. Tras dicha incubación, se realizaron diluciones decimales seriadas de los extractos en AMB, sembrandose alícuotas de 100 IJI por duplicado tanto directamente de dichos extractos como de sus respectivas diluciones en los medios de cultivo KB y ABGM con natamicina. Todas las placas inoculadas se incubaron durante una semana a 25°C en condiciones de oscuridad, anotándose el número de colonias bacterianas que se desarrollaron en los medios de cultivo. En este caso, las poblaciones de bacterias endoliquénicas cultivables se estimaron calculando los valores medios de UFC/g.

Análisis estadístico Los datos de los recuentos de bacterias cultivables se expresaron como las medias de dos o tres determinaciones por cada análisis bacteriológico y medio de cultivo, y se normalizaron mediante transformación logarítmica. La significación estadística de las diferencias observadas entre dos medias normalizadas se evaluó mediante un test paramétrico t de Student y en el caso de tres o más medias con un análisis ANOVA seguido de un análisis post-hoc de Bonferroni o de Dunnet. Las variables categóricas se compararon mediante la prueba de Chi-cuadrado. El análisis multivariante se realizó por medio de un modelo de regresión logística para determinar el efecto de la adición de extracto de liquen a los medios de cultivo, el tiempo de incubación y el protocolo de aislamiento de bacterias, en el crecimiento de aislados bacterianos de P. furfuracea. Los valores de p inferiores a 0,05 se consideraron significativos. Los datos se analizaron con el programa SPSS 19.0 (SPSS Statistics 18M).

RESULTADOS

Aislamiento de bacterias

i) Análisis inicial El aislamiento de Methylobacterium sp. en el medio mínimo BBM utilizado para el aislamiento de microalgas de Pseudevernia furfuracea fue el comienzo de una investigación para estudiar las bacterias cultivables asociadas a la especie de liquen

P. furfuracea. Un análisis bacteriológico preliminar de muestras del talo de P. furfuracea, mediante el dilacerado de talos individuales en SS estéril, mostró resultados similares, sólo crecieron escasas colonias en el medio de cultivo no selectivo KB después de 7 días de incubación, rindiendo bajos recuentos bacterianos (102 UFC/g de talo fresco). Debido al bajo número de colonias bacterianas recuperadas, se siguieron dos aproximaciones para tratar de mejorar la recuperación de bacterias asociadas a P. furfuracea. En primer lugar, se modificó el método de aislamiento de bacterias a partir de las muestras de talo y, en segundo lugar, se desarrollaron medios de cultivo enriquecidos con extracto de liquen (ver debajo).

ii) Mejora de la recuperación de bacterias asociadas a P. furfuracea mediante modificación del protocolo de aislamiento de bacterias. Para mejorar la recuperación de bacterias asociadas a de P. furfuracea, se ensayaron dos modificaciones en el protocolo de aislamiento: un lavado extensivo de las

2.

muestras de talo con un agente tensioactivo (Tween 20) para incrementar la recuperación de bacterias ectoliquénicas, y el uso de un tampón de antioxidante (AMB) para dilacerar las muestras de talo y mejorar el aislamiento de las bacterias endoliquénicas. En primer lugar, cuando se comparó el aislamiento de bacterias endoliquénicas de talos desinfectados y dilacerados en el tampón antioxidante AMB frente a SS, los resultados mostraron que los recuentos bacterianos medios en KB fueron mayores en AMB (103 UFC/g de talo fresco) (Figura 2) que en SS (102 UFC/g de talo fresco) (datos no mostrados), para el mismo período de incubación (7 días). Además, las colonias bacterianas aisladas con AMB aparecieron antes en placas del medio KB después de 3 a 5 días de incubación.

En segundo lugar, al comparar el aislamiento de bacterias ectoliquénicas, estimadas por el lavado de talos frescos, frente a las endoliquénicas de dilacerado de talos (Figura 2), los recuentos medios de bacterias cultivables fueron más bajos para las ectoliquénicas que para las endoliquénicas en los tres medios de cultivo ensayados. En el medio KB, los recuentos medios de bacterias ectoliquénicas fueron de 3,3 x 102 UFC/g de talo fresco lavado, siendo inferiores a los obtenidos con bacterias endoliquénicas (1 x 103 UFC/g de talo fresco dilacerado), después de 7 días de incubación (Figura 2). Curiosamente, la inclusión de los medios mínimos BBM y MMS con propósitos comparativos, rindió recuentos de bacterias endoliquénicas significativamente más altos (de 1,8 hasta 2,1 x 103 UFC/g de talo fresco dilacerado, respectivamente) que los obtenidos en el medio rico en nutrientes KB (1 x 103 UFC/g de talo fresco dilacerado) después de 7 días (Figura 2), pero las colonias fueron más pequeñas y aparecieron de 2 a 4 días más tarde que en las placas de KB. Del mismo modo, los recuentos medios de bacterias ectoliquénicas de talos frescos lavados también fueron más altos en BBM (6,7 x 102 UFC/g) que en las placas de KB (3,3 x 10' UFC/g), pero no en el medio MMS (1 ,3 x 10' UFC/g) (Figura 2). El crecimiento en medio mínimo sin fuente de carbono (BBM) o sólo con metanol (MMS) fue probablemente a expensas de los nutrientes presentes en los lavados o de los dilacerados de talos utilizados como inóculo en las placas de aislamiento. No hubo soporte estadístico para las diferencias encontradas entre los recuentos bacterianos medios obtenidos en KB, BBM Y MMS (p>0,05), ni para las observadas entre bacterias ectoliquénicas frente a las endoliquénicas en cada medio de cultivo, probablemente debido a la variabilidad de los recuentos obtenidos con diferentes talos.

¡ii) Los medios de cultivo enriquecidos con liquen mejoran el crecimiento de cepas bacterianas de P. furfuracea .

Debido a que el aumento de la recuperación de colonias bacterianas de talos liquénicos en medio mínimo podría ser debido al extracto de liquen utilizado como inóculo durante el aislamiento bacteriano, también se ensayó el efecto de la adición de extracto de liquen al medio mínimo (suplementado o no con fuentes de carbono) en el crecimiento de una colección de cepas bacterianas de P. furfuracea . Los resultados de experimentos preliminares con 20 cepas bacterianas cultivadas en los medios ASG, ABM, ABGM, BBM Y MMS enriquecidos o no con extracto de liquen, mostraron un crecimiento más rápido y mayor en los medios de cultivo enriquecidos con liquen, con mejores resultados con los medios AS con respecto a los medios SSM y MMS (datos no mostrados). En la Figura 3 se muestran imágenes representativas del crecimiento de cepas bacterianas aisladas de P. furfuracea en el medio mínimo AS suplementado o no con fuentes de carbono y/o extracto de liquen. Para algunas de las cepas ensayadas se observó un crecimiento mayor en todos los medios de cultivo enriquecidos con liquen y con fuentes de carbono en comparación con los medios de cultivo sin liquen, suplementados sólo con fuentes de carbono. Además, para algunas cepas, el crecimiento fue mayor en el medio con alto contenido en nutrientes, ASLGM, enriquecido con extracto de liquen y con glucosa y manitol. Curiosamente, la fuente de carbono utilizada en el medio de cultivo AS no sólo afectó al crecimiento de algunas cepas, sino también a la pigmentación de algunas de ellas; pues en el medio AS con glucosa (sola o con manitol) algunas cepas mostraron una pigmentación más fuerte (de color amarillento o rosáceo), independientemente de la presencia de extracto de liquen.

Para confirmar estos resultados iniciales, se realizaron más experimentos con todos los medios de cultivo AS utilizando 139 cepas bacterianas aisladas de P. furfuracea y ocho cepas bacterianas de referencia de fuentes no liquénicas. El efecto del tiempo de incubación sobre el crecimiento bacteriano también se investigó después de 24 horas y 96 horas de incubación. Como se muestra en la Figura 4, cuando cada uno de los medios de cultivo enriquecidos con liquen se comparó con los medios correspondientes sin extracto de liquen, y los resultados de crecimiento se agruparon en tres categorías: i) no crecimiento, ii) crecimiento en el punto inoculado y iii) aumento del crecimiento, se observaron diferencias significativas (p<O,001) tanto después de 24 horas (Figura 4a) como tras 96 horas (Figura 4b) de incubación. Así, creció un mayor porcentaje de cepas en los medios de cultivo enriquecidos con liquen frente a los medios de cultivo sin liquen, y tras 96 horas frente a 24 horas de incubación. Por otra parte, también se encontraron diferencias significativas (p<O,001) entre los diferentes medios de culti vo enriquecidos con liquen, con un mayor porcentaje de cepas mostrando un mayor crecimiento en el medio ABLGM con alto

5 contenido de nutrientes (20,4%), seguido por los medios de cultivo ABLM (19,7%) Y ABLG (16,4 %), Y un menor porcentaje en el medio con bajo contenido en nutrientes ABL (2,7%), después de 96 horas de incubación (Figura 4b).

Cuando los resultados se analizaron agrupándolos en dos categorías (crecimiento

10 versus no crecimiento), el crecimiento en los medios enriquecidos con liquen frente a los medios de cultivo sin liquen, la prueba de Chi-cuadrado reveló que el porcentaje de cepas que crecieron en un medio de cultivo enriquecido con liquen (91 ,7%) fue significativamente mayor (p<0,001) que en el mismo medio sin extracto de liquen (66%) después de 96 horas de incubación. Además, las cepas de líquenes crecieron

15 significativamente antes (p<O,001) en presencia de extracto de liquen (75,3% después de 24 horas) que en los medios de cultivo sin liquen (38,3% después de 24 horas de incubación). En este sentido, un análisis de regresión logística reveló que el uso de un medio de cultivo con extracto de liquen con respecto a un medio de cultivo sin liquen multiplica por cinco la probabilidad de que las bacterias asociadas líquenes crezcan

20 (Razón de probabilidades (odds ratio) = 5,2, 95% intervalo de confianza = 4,2 a 6,4; p<0,001) (Tabla 1), independientemente del período de incubación y del protocolo de procesamiento utilizado para el aislamiento de bacterias.

Tabla 1. Modelo de regresión logística de la probabilidad de crecimiento bacteriano

Factores: p(SE) Razón de probabilidades (odds ratio) [95% le¡ Valor P

Medio con liquen

Si No': 1,64(0,1) 5,18 (4,21-6,37) < 0,001

Tiempo de incubacion

96 horas 24 horas·: 1,19 (0, 1) 3,28 (2,68-4,01) < 0,001

Protocolo de aislamiento

Dilacerado Lavado·: 0,14 (0,12) 1,15 (0,9 1-1,4) 0,25

Constante: -1 ,69 (0,16)

*Categoría de referencia

Como era de esperar, el tiempo de incubación multiplica por 3 la probabilidad de que las bacterias asociadas a líquenes crezcan (Razón de Momios (odds ratio) = 3,3, intervalo de confianza del 95% = 2,7-4,0, p<O,001) (Tabla 1), independientemente de la presencia de extracto de liquen en el medio y del protocolo para el aislamiento de bacterias. Sin embargo, el protocolo utilizado para el aislamiento de bacterias a partir de talo liquénico (lavado frente dilacerado) no tuvo un efecto significativo sobre el crecimiento bacteriano (p>O,05) (Tabla 1).

Además, cuando el crecimiento de las cepas bacterianas de referencia no liquénicas en los medios de cultivo enriquecidos con liquen se comparó con el de los medios de cultivo sin liquen, de nuevo un mayor porcentaje de cepas crecieron en los medios de cultivo enriquecidos con liquen (78,1%) frente a los que no contenían extracto de liquen (59%) después de 96 horas de incubación. Además, una cepa de referencia auxótrofa fue capaz de crecer en todos los medios de cultivo enriquecidos con liquen pero no en ninguno de los medios de cultivo sin liquen ensayados. Sin embargo, en contraste con los resultados obtenidos con las cepas bacterianas aisladas de P. furfuracea, no se encontraron diferencias significativas entre los medios de cultivo enriquecidos con liquen frente a los que no contenían extracto de liquen (p>0,05).

iv) Los medios de cultivo enriquecidos con liquen mejoran la cultivabilidad de las bacterias asociadas a talos individuales de P. furfuracea. El siguiente paso fue ensayar los medios enriquecidos con liquen y el protocolo modificado de aislamiento de bacterias con nuevas submuestras del talo de P. furfuracea. Como se muestra en la Figura 5, justo después de 3 días de incubación a 25°C, las bacterias ectoliquénicas y endoliquénicas del talo de P. furfuracea, se recuperaron en números más altos en todos los medios de cultivo enriquecidos con liquen (los recuentos medios variaron de 9,5 x103 a 1,8 x104 UFC/g de talo fresco lavado y 3,9 a 5,7 x104 UFC/g de talo fresco dilacerado), seguido por los medios de cultivo sin liquen (recuentos medios variaron de 5 x1 03 a 1,0 x104 UFC/g de talo fresco lavado (excepto para el medio AS donde no se recuperaron colonias) y desde 9,5 x103 a 3,7 x104 UFC/g de talo fresco dilacerado), y por lo general, en números más bajos en las placas KB (los recuentos medios variaron de 7 x 103 UFC/g de talo fresco lavado a 1,0 x104 UFC/g de talo fresco dilacerado) utilizado para fines comparativos. Por otra parte, los recuentos bacterianos en los medios de cultivo mínimos con alto contenido en nutrientes (con y sin extracto de liquen) fueron más altos que los obtenidos en los medios de cultivo mínimos con bajo contenido en nutrientes, especialmente cuando se compararon con el medio de cultivo AB, tanto para bacterias ectoliquénicas como endoliquénicas (Figura 5), que también crecieron antes en los medios de cultivo mínimos con alto contenido en nutrientes sin liquen que en el medio mínimo AB. En este sentido, las colonias endoliquénicas en el medio de cultivo AB sólo se observaron después de 3 días de incubación, obteniéndose los recuentos medios de colonias más bajos. En el caso de los medios ABL, con bajo contenido en nutrientes, y AB, las colonias bacterianas crecieron más lentamente que en los otros medios de cultivo, al igual que las colonias de hongos filamentosos contaminantes que crecieron menos que en otros medios de cultivo. Estas diferencias fueron más pronunciadas con respecto al medio KB rico en nutrientes.

A pesar de que los recuentos bacterianos en los medios enriquecidos con liquen fueron superiores a los obtenidos con los medios de cultivo sin liquen, no hubo diferencias significativas (p>O,05) entre los recuentos medios obtenidos en cada medio de cultivo ensayado, ni entre bacterias ectoliquénicas y endoliquénicas para cada medio de cultivo (p>O,05). Sin embargo, cuando los valores medios de UFC/g obtenidos tanto con bacterias ectoliquénicas (Figura 5a) como endoliquénicas (Figura 5b) se analizaron mediante la agrupación de los medios de aislamiento en dos categorías (medios enriquecidos con liquen frente a medios de cultivo sin liquen ), los resultados revelaron recuentos bacterianos significativamente más altos en los medios mínimos con extracto de liquen que en estos mismos medios sin liquen, y que en el medio KB (p<O,05) (Figuras 5a y 5b). Cuando se contrastaron los recuentos medios obtenidos con bacterias ectoliquénicas frente a bacterias endoliquénicas después de 3 días de incubación a 25°C, de nuevo los tamaños poblacionales de bacterias fueron significativamente más altos en el dilacerado del talo que en la superticie del talo (p<O,001 ).

v) Mejora de la cultivabilidad de las bacterias asociadas a P. furfuracea a partir de muestras compuestas por distintos talos mediante el uso de medios de cultivo enriquecidos con liquen y períodos de incubación prolongados. En base a los dos resultados anteriormente mencionados, decidimos evaluar dos medios de cultivo enriquecidos con liquen, ABLGM (alto contenido en nutrientes) y ABL (bajo contenido en nutrientes), junto con el protocolo de aislamiento de bacterias mejorado, para aumentar la cultivabilidad de un rango más amplio de bacterias asociadas a P. furfuracea, utilizando muestras compuestas por distintos talos de muestreos adicionales realizados en el otoño de 2012 y el verano de 2013, incluyendo los medios de cultivo sin liquen ABGM y KB con propósitos comparativos. Además, para favorecer la recuperación de bacterias de crecimiento lento en el medio ABL con bajo contenido en nutrientes, el período de incubación se prolongó hasta 15 días. La influencia del período de incubación y del medio de aislamiento en la recuperación de bacterias asociadas a P. furfuracea se investigaron mediante la determinación del incremento en el número de colonias, tanto de bacterias ectoliquénicas y endoliquénicas, a partir de muestras compuestas por distintos talos, a lo largo del tiempo. Como se muestra en la Figura 6, en general, los recuentos bacterianos medios aumentaron rápidamente dentro de los primeros 3 días de incubación, de manera similar a los resultados mostrados en la Figura 5 con un talo individual. Los recuentos bacterianos continuaron aumentando con períodos de incubación más largos hasta que el número de colonias se estabilizó después de aproximadamente 7 a 15 días dependiendo del medio de aislamiento utilizado, sin tener en cuenta el protocolo de aislamiento bacteriano y la muestra (compuesta por distintos talos) analizada. En general, el medio de cultivo ABL, con liquen y bajo contenido en nutrientes, alcanzó los mayores conteos después de 15 días de incubación, seguido por el medio con liquen y alto contenido en nutrientes ABLGM y el medio de cultivo ABGM sin liquen , en los que los recuentos se estabilizaron un poco antes en algunos casos. En el medio de cultivo rico en nutrientes KB los recuentos de bacterias se estabilizaron mucho antes (en una semana) (Figura 6). De nuevo, en el medio ABL, con bajo contenido en nutrientes, las colonias bacterianas fueron más pequeñas y los hongos filamentosos crecieron más despacio y en menor número que en los medios de cultivo con mayor cantidad de nutrientes ABLGM, ABGM Y KB. En general, los recuentos bacterianos medios en los medios enriquecidos con liquen ABLGM y ABL fueron mayores que los obtenidos con los medios de cultivo ABGM, sin liquen, y KB, independientemente de la muestra analizada, del protocolo de aislamiento de bacterias y del período de incubación (Figura 6).

Al comparar los valores medios de UFC/g de las bacterias ectoliquénicas, estimados en talos lavados, frente a los de las bacterias endoliquénicas en lo talos dilacerados, estos fueron mayores (P<0,05) para las bacterias ectoliquénicas, independientemente de la muestra analizada, del período de incubación y del medio de cultivo utilizado para el aislamiento (Figura 6), siendo diferentes a los obtenidos con los talos individuales muestreados en la primavera de 2012. Curiosamente, al comparar la cultivabilidad de las bacterias ectoliquénicas frente a la de las bacterias endoliquénicas entre los dos medios de cultivo enriquecidos con liquen , los recuentos bacterianos fueron más altos en el medio ABLGM, con alto contenido en nutrientes, que en el medio ABL, con bajo contenido en nutrientes, para las bacterias ectoliquénicas (Figuras 6a y 6e), independientemente de la muestra analizada y del período de incubación. En este sentido, los recuentos bacterianos medios de bacterias ectoliquénicas oscilaron desde 1,7 hasta 6,5 x 104 UFC/g en el medio ABLGM y 1,3 a 5,6 x 104 UFC/g en el medio ABL, después de 15 días de incubación (Figuras 6a y 6 e). Por el contrario, el medio ABL con bajo contenido en nutrientes rindió mayores recuentos bacterianos que el medio ABLGM, con alto contenido en nutrientes, para las bacterias endoliquénicas (Figuras 6b y 6d), independientemente de la muestra analizada y del tiempo de incubación. Así, al final del periodo experimental, los números medios de bacterias endoliquénicas variaron desde 4,8 hasta 7,9 x 103 UFC/g en el medio de ABL y de 1 a 1,5 x 10' UFC/g en el medio ABLGM (Figuras 6b y 6d). También se observaron estas diferencias entre bacterias ectoliquénicas frente a las endoliquénicas dependiendo del medio de aislamiento en el caso del medio sin liquen ABGM y del medio rico en nutrientes KB, en los que los valores medios de UFC/g fueron de nuevo menores que en los medios enriquecidos con liquen. En el medio de cultivo ABGM los recuentos medios de bacterias fueron más altos que en el medio KB (Figuras 6a y 6c), en el caso de las bacterias ectoliquénicas mientras que sucedió al contrario para las bacterias endoliquénicas (Figuras 6b y 6d). Después de 15 días de incubación, los recuentos de bacterias ectoliquénicas variaron de 9,5 x 103 a 4,7 x 10' UFC/g en el medio ABGM y de 7,7 x 10' a 3,9 x 10' UFC/g para el medio KB (Figuras 6a y 6c). Por el contrari o, los valores medios de bacterias endoliquénicas variaron de 4 x 102 hasta 1 x 103 UFC/g en placas de ABGM y de 1 a 1,25 x 103 UFC/g en las placas KB (Figuras 6b y 6d ).

No hubo soporte estadístico a las diferen cias observadas entre los recuentos bacterianos medios en cada medio de cultivo ensayado (P>0,05), excepto entre los medios ABLGM y ABGM para las bacterias ectoliquénicas en uno de los muestreos, el de otoño. Esto podría deberse, al menos en parte, a la variabilidad en los recuentos bacterianos en las placas de aislamiento, más pronunciados con las muestras de dilacerado de talos que con las de lavado de talos.

En cuanto a la diversidad bacteriana, analizada inicialmente por comparación del número colonias morfológicamente distintas aisladas en los medios de cultivo

enriquecidos con liquen frente a los medios de cultivo sin liquen después de 15 días de incubación, se encontró una mayor diversidad en los medios de cultivo enriquecidos con liquen frente a los medios de cultivo sin liquen (datos no mostrados). Además, la identificación de una selección de cepas bacterianas aisladas de distintos talos de P. furfuracea e identificadas mediante secuenciación parcial del gen bacteriano ADNr 168 ha revelado una gran diversidad de bacterias cultivables, similar a la descrita en otros líquenes analizados mayoritariamente por técnicas independientes del cultivo como es la secuenciación masiva (Cardinale et al., 2006, 2008; Liba el al., 2006; Grube & Berg, 2009; Grube el al., 2009; Hodkinson & Lutzoni, 2009; Selbman et al., 2010 ; Bates el al., 2011 ; Lasken & McLean, 2014; Grube el al., 2014).

vi) Optimización de la recuperación de bacterias asociadas a P. furfuracea, Puesto que el crecimiento de hongos filamentosos en las placas de aislamiento de bacterias liquénicas dificultó la recuperación de las mismas, especialmente en el caso de las bacterias de crecimiento más lento, y pese a que todos los medios de cultivo utilizados contenían el antifúngico cicloheximida (actidiona), se decidió evaluar otra antifúngico más eficaz como la natamicina (pimaricina) y aparentemente sin riesgos para la salud (Pedersen, 1992, Appl. Enviran. Microbiol. 58(3):1064). Por ello, se investigó el efecto de ambos antifúngicos sobre el crecimiento de una selección de los 7 hongos filamentosos más frecuentes en las placas de aislamiento de las muestras de talos liquénicos en el medio de cultivo KB (el medio de cultivo, de los ensayados, en el que los hongos se desarrollan más rápidamente). Tal y como se muestra en la Figura 7 la adición de natamicina al medio de cultivo KB fue capaz de suprimir el crecimiento de los hongos filamentosos ensayados, mientras que con la cicloheximida sólo se observó una reducción de su crecimiento. En base a dichos resultados y a la mayor toxicidad de la cicloheximida, el siguiente paso fue realizar un estudio comparativo del efecto de cada uno de los dos antifúngicos por separado en la recuperación de bacterias liquénicas tanto en medio de cultivo rico en nutrientes (KB) como en el medio mínimo (ABGM). Como se puede observar en la Figura 8, en el medio de cultivo control sin antifúngicos los hongos filamentosos invadieran las placas de KB en un periodo de 3-5 días, viéndose dicho crecimiento reducido cuando el medio de cultivo se suplementó con cicloheximida. En este último caso, el crecimiento de los hongos filamentosos requirió de un periodo superior a 7 días para invadir las placas de KB. Sin embargo, la adición de natamicina reveló una actividad antifúngica significativamente superior a la de la cicloheximida, inhibiendo el crecimiento de los

hongos filamentosos tanto en el medio KB como en el medio ABGM durante un periodo superior a 15 días. Dicho periodo es considerado como el tiempo mínimo de

incubación para favorecer la recuperación de bacterias liquénicas de crecimiento lento, especialmente en medios con bajo contenido en nutrientes. En consecuencia, la adición de natamicina a los medios de cultivo constituyó una optimización pa ra la recuperación de bacterias liquénicas, independientemente del medio de cultivo utilizado.

Por otra parte, puesto que los resultados de la Figura 6 parecían indicar que la cultivabilidad de las bacterias endoliquénicas podría verse afectada por el paso de desinfección previo a la disrupción de los talos liquénicos. Y dado que dicho paso se realiza después de llevar a cabo un lavado extensivo de los mismos, se confirmó en primer lugar el efecto del tiempo de lavado en la recuperación de bacterias ectoliquénicas en medios de cultivo con natamicina (Figura 9), así como la eliminación de las mismas como paso previo al análisis de bacterias endoliquénicas (Figura 10). Los resultados de dichos ensayos, no sólo confirmaron que los recuentos medios de bacterias ectoliquénicas recuperadas aumentaron muy significativamente (p<0,000 1) conforme se incrementó el tiempo de lavado de los talos liquénicos (que se estabilizarón entre los 60 y 90 minutos de lavado, independientemente del medio de cultivo ensayado) (Figura 9), sino que también sugerían la posibilidad de prescindir del paso de desinfección que parecía afectar negativamente a la recuperación de bacterias endoliquénicas. En este sentido, el siguiente paso fue investigar el efecto de la desinfección en la recuperación de bacterias endoliquénicas en los medios KB y ABGM con natamicina a partir de los talos lavados 90 minutos (Figura 10). Además, para tratar de estandarizar y agilizar el procesado de los talos liquénicos, se comparó la eficiencia en el aislamiento de cepas bacterianas de talos procesados mediante dilacerado, un proceso que conlleva unos 5 -10 minutos por muestra, con respecto al machacado, que permite procesar un mayor número de muestras en menos tiempo (aproximadamente 1,5 minutos/muestra). Como se muestra en la Figura 10, cuando se comparó el aislamiento de bacterias endoliquénicas de submuestras de talos lavados frente al de submuestras de los mismos, pero desinfectadas, los recuentos medios de bacterias endoliquénicas en talos sin desinfectar fueron significativamente superiores (p<0,01) (entre 1 y 2 unidades logarítmicas, según el caso). Dichos resultados evidenciaron el efecto negativo de la desinfección en la recuperación de bacterias endoliquénicas, independientemente del tipo y tiempo de desinfección ensayados, así como del medio de cultivo empleado. Dichos resultados junto con los

obtenidos tras el lavado extensivo de los talos liquénicos (60-90 minutos, Figura 9), demostraron no sólo que tras dicho lavado no es necesario llevar a cabo un paso de desinfección sino que dicho paso afecta negativamente a la cultivabilidad y/o viabilidad de las bacterias endoliquénicas y, por lo tanto, a su recuperación. 5 Adicionalmente, cuando lo que se comparó fue el efecto del tipo de procesado de los talos liquénicos en la recuperación de bacterias endoliquénicas, en concreto el dilacerado frente al machacado, ambos en tampón antioxidante AMB, los resultados mostraron que, en la mayoría de los casos, los recuentos bacterianos medios fueron significativamente mayores en los talos liquénicos procesados por machacado

10 (p<0,05) (Figura 10) que en los que se dilaceraron, tras un período de incubación de 7 días. Dichos resultados fueron independientes tanto del medio de cultivo utilizado como de la desinfección y se confirmaron posteriormente con muestras de nuevos talos liquénicos de varias especies y con medios de cultivo suplementados con los respectivos extractos liquénicos (datos no mostrados).

3.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Método para obtener un extracto liquénico que comprende:

(a)

recolectar al menos un talo liquénico de una especie liquénica de interés,

(b)

lavar y proceder a la disrupción del talo liquénico con una solución isotónica estéril , y

(e)

esterilizar por filtración el producto obtenido tras llevar a cabo la etapa b).
2.

Método según la reivindicación 1, en el que los talos liquénicos recolectados pertenecen a la misma población de la especie liquénica.
3.

Método según la reivindicación 1 Ó 2, en el que la solución isotónica estéril de la etapa b) está suplementada con un agente surfactante.
4.

Método según la reivindicación 3, en el que el agente surfactante es Tween 20.
5.

Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que la esterilización por filtración de la etapa e) se lleva a cabo con un prefiltro y un filtro, en donde el tamaño de poro del filtro es de entre 0,22 y 0,45 !-1m.
6.

Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que la disrupción del talo liquénico se lleva a cabo mediante triturado.
7.

Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que la solución isotónica es solución Ringer.
8.

Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que la especie liquénica se selecciona del grupo que consiste en Pamotrema spp., Pseudevernia spp. y Ramalina spp.
9.

Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que el talo liquénico es preferentemente fresco o congelado.
10.

Un extracto liquénico obtenido según el método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9.
11.

Una composición que comprende el extracto liquénico según la reivindicación 10.
12.

Composición según la reivindicación 11, en la que la composición es un medio de cultivo para microorganismos.
13.

Método para aislar microorganismos asociados a una especie liquénica de interés que comprende

(a)

recolectar al menos un talo liquénico de la especie liquénica de la que se quieren aislar los microorganismos, en condiciones de asepsia,

(b)

Lavar de forma extensiva el talo liquénico recolectado en la etapa (a),

(e)

Llevar a cabo la disrupción del talo liquénico lavado en la etapa (b), y

(d)

cultivar, en un medio de cultivo mínimo suplementado con, al menos, un extracto liquénico según la reivindicación 10:

(i)

el producto obtenido de la disrupción del talo liquénico de la etapa (c), y/o

(ii)

la solución de lavado recuperada tras el lavado extensivo de la etapa (b)

en donde, en el caso de que se cultiven (i) y (ii), se cultivan de forma independiente, y el extracto liquénico se obtiene a partir de la especie liquénica de interés de la que se quieren aislar los microorganismos.
14.

Método según la reivindicación 13, en el que la etapa de cultivo (d) se lleva a cabo en un medio mínimo suplementado con , al menos, un extracto liquénico obtenido a partir de talos de la misma población que el talo de la especie liquénica recolectado según la etapa (a).
15.

Método según la reivindicación 13 o 14, en el que el lavado se lleva a cabo con una solución isotónica estéril que comprende un agente surfactante.
16.

Método según cualquiera de las reivindicaciones 13 a 15, en el que el lavado extensivo del talo liquénico comprende el lavado durante al menos, aproximadamente 60 minutos, preferiblemente, aproximadamente 90 minutos.
17.

Método según la reivindicación 15 o 16, en el que la solución isotónica estéril es solución Ringer.
18.

Método según cualquiera de las reivindicaciones 15 a 17, en el que el agente surfactante es Tween 20.
19.

Método según cualquiera de las reivindicaciones 13 a 18, en el que la disrupción del talo comprende el machacado del talo liquénico en un tampón de maceración antioxidante estéril y en condiciones de asepsia.
20.

Método según la reivindicación 17, en el que el tampón de maceración antioxidante estéril es tampón AMB estéril.
21.

Método según cualquiera de las reivindicaciones 13 a 20, en el que el medio de cultivo mínimo comprende una o mas fuentes de carbono.
22.

Método según la reivindicación 21 , en el que la fuente de carbono es glucosa y/o manito!.
23.

Método según cualquiera de las reivindicaciones 13 a 22, en el que los microorganismos asociados a la especie liquénica de interés se seleccionan del grupo que consiste en bacterias, algas, hongos filamentosos, levaduras y/o virus de microorganismos liquénicos.
24.

Método según la reivindicación 23, en el que para aislar bacterias liquénicas, el cultivo del paso (d) se lleva a cabo en un medio de cultivo mínimo suplementado al menos con el extracto liquénico y al menos con un antifúngico, preferiblemente, natamicina.
25.

Método según la reivindicación 23, en el que para aislar virus de un microorganismo liquénico, el cultivo del paso (d) se lleva a cabo en un medio de cultivo mínimo suplementado al menos con el extracto liquénico y con el microorganismo liquénico de interés.
26.

Método según cualquiera de las reivindicaciones 13 a 25, en el que el talo liquénico se selecciona del grupo que consiste en Pamotrema spp., Pseudevemia spp. y Ramalina spp.
27.

Uso de un extracto liquénico según la reivindicación 10 y/o de la composición según la reivindicación 11 o 12, para aislar y/o cultivar microorganismos asociados a una especie liquénica de interés, en donde el extracto liquénico es obtenido a partir de, al menos, un talo liquénico de la especie liquénica de la que se quieren aislar los

5 microorganismos.
28. Uso según la reivindicación 27, en el que el cultivo se lleva a cabo en un medio mínimo suplementado con, al menos, un extracto liquénico obtenido a partir de talos de la misma población que el talo liquénico de la especie liquénica de la que se

10 quieren aislar los microorganismos.
29. Uso según la reivindicación 27 o 28, en el que el microorganismo asociado a la especie liquénica se selecciona del grupo que consiste en bacterias, algas, hongos filamentosos, levaduras y/o virus de microorganismos liquénicos.
30. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 27 a 29, en el que la especie liquénica de interés se selecciona del grupo que consiste en Pamotrema spp. , Pseudevernia spp. y Ramalina spp.