ES2581781T3 - Método por imágenes para administración mejorada por convección de agentes terapéuticos - Google Patents

Abstract

El uso de una solución que contiene un trazador y un agente terapéutico para la manufactura de una solución de medicamento para administrar a un tejido cerebral sólido diana por infusión intersticial por convección a la vez que monitoriza la distribución de la solución de medicamento generando imágenes del trazador en la solución de medicamento caracterizado porque la generación de imágenes es por una técnica de generación de imágenes por MRI o CT y porque el trazador es (i) un quelato metálico de un ión metálico paramagnético conjugado a una molécula portadora consistente de una albúmina, un dendrímero de polialquilenimina, o un dendrímero de poliamidoamina; o (ii) un agente de contraste para CT yodado o (iii) un agente de contraste para CT yodado conjugado con el agente terapéutico o con una albúmina.

Description

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DESCRIPCION

Metodo por imagenes para administracion mejorada por conveccion de agentes terapeuticos Solicitudes relacionadas

Esta reivindica el beneficio de la Solicitud Provisional de Patente de los Estados Unidos No. 60/413,673, presentada el 24 de septiembre de 2002.

Campo

La invencion se relaciona en general con la administracion mejorada por conveccion (CED) de agentes terapeuticos. Mas espedficamente, la invencion se relaciona con un metodo para monitorizar la distribucion de agentes terapeuticos a medida que se mueven a traves de tejido solido durante la CED.

Antecedentes

Las enfermedades intrmsecas del sistema nervioso central (CNS), incluyendo el cerebro, el bulbo raqmdeo, la medula espinal y los nervios perifericos, da como resultado frecuentemente morbilidad seria muerte o disfuncion de movilidad puesto que no hay terapia quirurgica o medica efectiva. Aunque existe un numero creciente de compuestos potencialmente terapeuticos para tratar estos trastornos, la administracion inadecuada de estos agentes al CNS limita su uso efectivo. Las tecnicas de administracion actualmente disponibles se basan en administracion del farmaco sistemica o intratecal, las cuales tienen ambas una serie de limitaciones inherentes. Por ejemplo, la toxicidad sistemica y la incapacidad de muchos compuestos de cruzar desde el sistema circulatorio al CNS restringen frecuentemente la administracion sistemica, e incluso si los agentes administrados sistemicamente entran efectivamente al CNS, su distribucion es tanto heterogenea como no direccionada [vease, por ejemplo Langer, "New methods of drug delivery," Science, 249:1527-1533 (1990); Morrison, "Distribution models of drug kinetics," in Principles of Clinical Pharmacology, Atkinson et al (eds), Academic Press, New York, pp 93-112 (2001); y Pardridge, "Drug delivery to the brain." J Cereb Blood Flow Metab, 17:713-731 (1997)]. La penetracion en el sistema nervioso despues de la administracion intratecal (incluyendo la inyeccion intratecal, la inyeccion intratumoral directa, instilacion intracavitatoria o liberacion controlada desde implantes polimericos), asf como la administracion sistemica, se basa en la difusion y tambien produce dispersion no direccionada, heterogenea a traves del CNS [vease, por ejemplo, Blasberg et al., "Intrathecal chemotherapy: brain tissue profiles after ventriculocisternal perfusion," J Pharmacol Exp Ther, 195:73-83 (1975)]. Las sustancias potencialmente terapeuticas tienen todavfa que ser efectivas en el tratamiento de enfermedades intrmsecas del CNS debido a las limitaciones de estos metodos de administracion.

La administracion mejorada por conveccion (CED) puede ser utilizada para superar algunas de las restricciones asociadas con otros sistemas de administracion. La CED utiliza un gradiente de presion para infundir las sustancias directamente en el espacio intersticial de un tejido solido (infusion intersticial). Puesto que la CED se basa en un flujo en volumen (por conveccion), mas que por difusion, puede ser utilizada para distribuir sustancias de peso molecular tanto pequeno como grande en volumenes clmicamente relevantes dentro de tejido solido [vease, por ejemplo, Morrison et al., "Focal delivery during direct infusion to brain: role of flow rate, catheter diameter, and tissue mechanics," Am J Physiol, 277: R1218-1229 (1999) and Morrison et al., "High-flow microinfusion: tissue penetration and pharmacodynamics," Am J Physiol, 266: R292-305 (1994)]. Adicionalmente, las sustancias son administradas a una concentracion relativamente constante a traves del volumen de distribucion.

Los factores que influyen en la administracion del agente terapeutico por CED incluyen el tipo de tejido infundido (por ejemplo, materia blanca o gris) y las propiedades de enlazamiento al tejido, metabolismo y permeabilidad microvascular del agente. Ademas, la rata de flujo volumetrico, duracion de la infusion y el tamano de la canula (o cateter) utilizado para administrar una infusion puede afectar la distribucion de agentes terapeuticos administrados por CED.

De particular preocupacion durante la CED es el flujo retrogrado (retroflujo) a lo largo del eje de la canula que se utiliza para administrar la infusion a un tejido. El retroflujo puede producir que los agentes terapeuticos infundidos alcancen tejido no buscado, y produzcan subexposicion del objetivo previsto. Los estudios teoricos de los factores que afectan el retroflujo indican que puede ser minimizado utilizando una canula de diametro pequeno, y que puede mantenerse un retroflujo mmimo compensando un incremento en la rata de flujo con un descenso similar en el radio de la canula. Sin embargo, el control de retroflujo sigue siendo una preocupacion, particularmente si la CED se utiliza en una instalacion clmica.

Adicionalmente, a la vez que una serie de estudios de la CED han demostrado que hay una relacion apenas lineal entre el volumen de infusion administrado (volumen de infusion) y el volumen sobre el cual la infusion es distribuida finalmente (volumen de distribucion), tambien muestran que otros factores que influyen en la distribucion de un agente administrado por CED puede no siempre ser conocida para un sujeto dado. Estos factores incluyen la existencia de

rutas preferenciales para el flujo de fluido en la region diana (por ejemplo, tractos de fibra en materia blanca) que puede llevar a la distribucion asimetrica del agente, densidad receptora de celulas variable que puede afectar la temporizacion y el grado de distribucion de un agente, y volumenes diana grandes que pueden requerir largos tiempos de infusion o multiples sitios de administracion.

5 Se ha aplicado la tomograffa computarizada de emision de fotones individual (SPECT) para visualizar la distribucion de un agente administrado por CED, pero el metodo no ofrece resolucion suficiente para proveer detalles de distribucion del agente [vease, por ejemplo Laske et al., "Chronic interstitial infusion of protein to primate brain: determination of drug' distribution and clearance with single-photon emission computerized tomography imaging," J. Neurosurgery, 87: 586-594 (1997)]. Como tal, el SPECT provee solamente un estimativo del volumen de distribucion 10 y no da informacion detallada acerca de la forma de la envoltura de infusion en el tejido.

Mardor Y et al., Mardor Y et al "Monitoring response to convection-enhanced taxol delivery in brain tumor patients using diffusion-weighted magnetic resonance imaging" Cancer Research 20010701 US Vol 61, no 13, 1 July 2001 (2001-07-01), pages 4971-4973 ISSN: 0008-5472 divulga el uso de MRI pesado por difusion (DWMRI) para monitorizar los efectos de la CEDD intramural en los pacientes con tumor cerebral tratados con Taxol.

15 La WO 00/07652 A1, divulga un dispositivo y metodo para administracion direccionado de farmaco, y especialmente la infusion intracraneana o administracion de farmaco por retroperfusion utilizando estereotaxis magnetica no lineal en combinacion con imagenes por resonancia magnetica y/o visualizacion por rayos X.

Lonser Russel R et al "Direct convective delivery of macromolecules to peripheral nerves" Journal of Neurosurgery, American Association of Neurological Surgeons, Us, vol 89, no 4, 1 October 1998 (1998-10-01), pages 610-615, ISSN: 20 0022-3085 divulga un metodo de administracion por conveccion intraneural de macromoleculas que provee una

distribucion homogenea, direccionada, reproducible y segura de la infusion a nervios perifericos.

Puesto que muchos agentes terapeuticos, especialmente los utilizados para destruir tejidos, tales como tejido canceroso, son altamente toxicos, el control en el sitio de la administracion durante la CED es especialmente importante en la instalacion clmica, donde la minimizacion de los efectos colaterales es una preocupacion. Un metodo 25 que permita un control mas preciso sobre el proceso de CED ayudana a asegurar la administracion apropiada de agentes terapeuticos a regiones diana de tejidos sin exposicion del tejido circundante a los agentes. Tal metodo llenana una necesidad largamente sentida y hasta ahora no satisfecha en el arte.

Resumen de la divulgacion

La invencion esta definida en las reivindicaciones anexas. El uso de una solucion que contiene un trazador y un agente 30 terapeutico es divulgado para la manufactura de una solucion de medicamento, caracterizado porque las imagenes se adquieren mediante una tecnica de imagenes por MRI o CT y porque el trazador es

(i) un quelato metalico de un ion de metal paramagnetico conjugado a una molecula portadora que consiste de una albumina, un dendnmero de polialquilenimina o un dendnmero de poliamidoamina; o

(ii) un agente de contraste para CT yodado; o

35 (iii) un agente de contraste para CT yodado conjugado al agente terapeutico o a una albumina.

Se divulgan metodos para administrar un agente terapeutico y generar imagenes exacta y rapidamente de la distribucion y/o la concentracion del agente terapeutico a medida que se mueve a traves del tejido cerebral solido durante la administracion mejorada por conveccion (CED). Los metodos demuestran proveer administracion controlada y direccionada de agentes terapeuticos a sustancialmente solo la region diana prevista de tejido, por lo 40 tanto, por ejemplo, incrementando la seguridad con la cual los agentes terapeuticos altamente toxicos pueden ser administrados a tejidos sensibles en el cerebro. En una realizacion, un trazador, el cual es detectable por imagenes de resonancia magnetica y/o tomograffa computarizada por rayos X, es coinfusionado con un agente terapeutico y utilizado para monitorizar la distribucion y/o concentracion del agente terapeutico a medida que se mueve a traves del tejido solido. El movimiento del trazador puede ser monitorizado para detectar administracion no deseada del agente 45 terapeutico por fuera de un volumen diana dentro de un tejido cerebral solido, y verificar que el agente terapeutico esta alcanzando la diana a la concentracion apropiada. En algunas realizaciones, el trazador esta conjugado directamente al agente terapeutico. Alternativamente, un trazador separado que se distribuye a traves del tejido a una rata que puede ser correlacionada exactamente con la distribucion del agente terapeutico funciona como subrogado para seguir la distribucion del agente terapeutico. En cualquier caso, la velocidad con la cual las imagenes pueden ser generadas, 50 acoplada con una correlacion inesperadamente exacta entre la distribucion del trazador y la distribucion del agente terapeutico, hace posible administrar agentes terapeuticos sustancialmente solo a la region de tejido diana, por ejemplo, sustancialmente solo a la region de un tejido ocupada por un tumor. Adicionalmente, tambien se demuestra una correlacion exacta entre la intensidad de senal de las imagenes y la concentracion del agente terapeutico,

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haciendo posible confirmar la administracion del agente terapeutico a una region direccionada de tejido cerebral solido en una concentracion deseada.

Cualquier descripcion aqu que caiga por fuera del alcance de las reivindicaciones anexas representa el arte anterior util para emprender la invencion reivindicada.

Breve descripcion de los dibujos

La figura 1 es una fotograffa que muestra un sistema de canula para CED. La canula externa (por debajo de la moneda) y la canula de infusion interna (por encima de la moneda) se muestran separadamente.

La figura 2 es una serie de imagenes de resonancia magnetica sopesadas T1 obtenidas inmediatamente despues de la terminacion de la infusion de 120 pl de albumina enlazada a gadolinio en el puente troncoencefalico. Las imagenes sagital (A), axial (B), y de corona (C) a traves de la region del bulbo raqrndeo demuestran claramente la region de infusion (area blanca), y casi el llenado completo del puente troncoencefalico.

La figura 3 es una serie de imagenes de resonancia magnetica sopesadas T1 en tiempo real en los planos de corona (A) y sagital medio (B-H) en diversos puntos del tiempo durante la infusion por CED de albumina-(Gd-1B4M)5 en las regiones pontino y de cerebro medio del bulbo raqrndeo (volumen total de infusion 85 pl). La imagen de corona (A) demuestra la posicion de la punta de la canula de infusion interna (flecha) justo antes de iniciar la infusion de albumina- (Gd-1B4M)5, y las imagenes sagitales media (B-H) revelan que la region infundida con albumina-(Gd-1B4M)5 (area blanca) se incremento a medida que la infusion avanzo. Los diversos volumenes totales de infusion mostrados aqu como ejemplos incluyen 7.5 pl (B), 15 pl (C), 30 pl (D), 40 pl (E), 50 pl (F), 65 pl (G), y 85 pl (H).

La figura 4 es una grafica que muestra la relacion lineal (R2=0.94) entre el volumen de infusion (Vi) y el volumen de distribucion (Vd) en primates infundidos con albumina-(Gd-1B4M)5. La relacion Vd:Vi observada fue 8.7 ± 1.2 (media ± S.D.). Los drculos negros, los cuadrados abiertos y los triangulos negros representan separadamente los datos derivados de tres animales.

La figura 5 es una grafica que muestra que la CED de la albumina-(Gd-1B4M)5 permite la correlacion de volumen predecible de distribucion (Vd) (determinado por imagenes en resonancia magnetica en tiempo real) con respecto a la relacion de volumen de infusion (Vi) en los primates a lo largo de diversos volumenes de infusion. La lmea horizontal representa la relacion Vd:Vi media global de 8.7 ± 1.2 (media ± S.D.).

La figura 6 es una imagen de resonancia magnetica sopesada T1 de corona en un animal infundido con albumina- (Gd-1B4M)5, que muestra la lmea a traves de la region infundida a lo largo de la cual se inhibio la intensidad de la imagen para generar la grafica de la figura 7.

La figura 7 es un perfil de lmea que demuestra el patron de intensidad inesperadamente en forma de cuadrado (a traves de la lmea mostrada en la figura 6) indicativo de una concentracion relativamente uniforme sobre la region de infusion, y una cafda aguda en la concentracion en los bordes de la region infundida.

La figura 8 es una grafica que muestra el cambio en volumen de distribucion desde inmediatamente despues de la infusion (dfa 0) a puntos mas distantes en el tiempo en dos animales diferentes (drculos abiertos y cuadrados negros). El incremento en el dfa 1 postinfusion en volumen de distribucion fue de 35% para el animal 2 y 41% para el animal 3.

La figura 9 muestra imagenes de CT axial (superior) y de corona (inferior) de acido iopanoico-BSA infundidos. Los volumenes discretos estan localizados en y a traves del putamen diana. La forma de las infusiones sigue contornos anatomicos, con alguna dispersion hacia la materia blanca adyacente. La intensidad de la senal es relativamente uniforme a, a-130 pl de infusion, b-200 pl de infusion, y c-235 pl de infusion. Todas las infusiones fueron llevadas a cabo a 1 pl/min.

La figura 10 muestra imagenes de MRI axial (superior) y de corona (inferior) despues de la infusion de gadolinio- DTPA:HSA. Con una resolucion incrementada de la imagen, las distribuciones dentro del putamen se ven claramente. A volumenes mayores de infusion se perfusiona la materia blanca circundante. La intensidad de la senal es relativamente uniforme a traves de una infusion de a-130 pl, infusion de b-185 pl e infusion de c-235 pl. Todas las infusiones fueron llevadas a cabo a 1 pl/min.

La figura 11 muestra imagenes de MIR de corona que muestran que el area perfusionada de la figura 10 no se extiende hacia el tracto optico. En los dos animales mostrados, la infusion alcanzo el aspecto inferior del putamen y rodeo, pero no penetro, el tracto optico (flechas).

La figura 12 muestra la distribucion uniforme del trazador subrogado acido iopanoico:albumina sobre CT. Notense las formas comparables sobre las regiones perfusionadas sobre QAR y las imagenes CT (a y b). Los perfiles de lmea

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vertical (c) y horizontal (e) de la seccion QAR (a) muestra un patron tfpico, el cual esta caracterizado por una lmea base plana, una pendiente por etapas en el borde, y una meseta de intensidad de senal de pico dentro del area de infusion, e indica la concentracion uniforme de 14C-albumina en el area perfusionada. Perfiles de lmea similares (d, f) a traves de la imagen CT (b) tambien muestran el gradiente por etapas en los bordes de la region perfusionada.

La figura 13 muestra la distribucion uniforme del trazador subrogado gadolinio:albumina en una region cerebral diana. Los perfiles de lmea vertical (e, f) y horizontal (c, d) de las imagenes coincidentes de QAR (a) y MRI (b) muestran un patron de onda cuadrado tfpico, indicativo de la distribucion uniforme del trazador de 14C-albumina y gadolinio- albumina en el area perfusionada.

Notense las formas similares de los perfiles de lmea para las dos modalidades de imagenes. El eje vertical ha sido truncado como se muestra.

La figura 14 es una grafica que muestra la correlacion de la concentracion de yodo y la intensidad de senal en CT. Utilizando estandares de homogenizado de cerebro in vitro que contienen tanto el trazador de albumina marcado con 14C y el subrogado, la correlacion entre las unidades Hounsfeld de CT y la radioactividad fue lineal con un valor de r2 que excedfa de 0.995.

Descripcion detallada

La discusion y ejemplos que siguen se entenderan mejor con referencia a las siguientes abreviaturas y terminos.

I. Abreviaturas

CED - administracion mejorada por conveccion MRI - imagenes de resonancia magnetica CT -tomograffa computarizada de rayos X

1B4M - acido 2-(p-isotiocianatobencil)-6-metildietilentriamina pentaacetico.

QAR - autorradiograffa cuantitativa

HSA-(Gd-1B4M)5- albumina de suero humano conjugada a 5 quelatos de gadolinio de acido 2-(p-isotiocianatobencil)- 6-metildietilentriamina pentaacetico.

BSA-(Gd-1B4M)5 - albumina de suero bovino conjugado a 5 quelatos de gadolinio de acido 2-(p-isotiocianatobencil)- 6-metildietilentriamina pentaacetico.

DAB-Am-64-(1B4M-Gd)64 - dendnmero de polipropilen tetrahexacontaamina con un nucleo de diaminobutano conjugado a 64 quelatos 1B4M-Gd.

Vl -volumen de infusion

Vd - volumen de distribucion

GFAP - anticuerpo de protema fibrilarmente acida anti-glial

II. Terminos

Al menos que se explique otra cosa, todos los terminos tecnicos y cientfficos utilizados aqu tienen el mismo significado que se entiende normalmente por una persona de experiencia normal en el arte al cual pertenece esta invencion. Los terminos singular “un”, “una” y “el/la” incluyen referentes plurales a menos que el contexto claramente indique otra cosa. De la misma manera, la palabra “o” se entiende con la inclusion de “y” a menos que el contexto indique claramente otra cosa.

“Que comprende A o B” indica que incluye A o B o incluye A y B a menos que se indique otra cosa.

El termino “sujeto” se refiere a animales, incluyendo mairnferos. Ejemplos de sujetos incluyen humanos y animales veterinarios tales como perros, gatos, reses, ovejas, caballos etc.

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El termino “imagenes” se refiere a cualquier tecnica para formar una representacion de estructuras anatomicas dentro de un cuerpo. Ejemplos de tecnicas de imagenes incluyen tecnicas sonicas (tales como ultrasonido) y tecnicas electromagneticas, por ejemplo, metodolog^as radiologicas que utilizan rayos X (tales como rayos X por CT o convencionales), o un campo magnetico en combinacion con ondas de radio (por ejemplo, MRI).

El termino “solucion” se refiere a una composicion que comprende un solvente y un soluto, e incluye soluciones y suspensiones verdaderas. Ejemplos de soluciones incluyen un solido, lfquido o gas disuelto en un lfquido y partfculas o micelas suspendidas en un lfquido.

Tal como se utiliza aqrn, el termino “infusion intersticial por conveccion” se refiere a administracion mejorada por conveccion. La infusion intersticial por conveccion es un metodo de microinfusion a alto flujo que provee una administracion mejorada por conveccion de agentes terapeuticos. El metodo involucra posicionar la punta de un cateter de infusion dentro de una estructura de tejido y suministrar una solucion que comprende un agente terapeutico a traves del cateter a la vez que se mantiene un gradiente de presion desde la punta del cateter durante la infusion. Despues de que el cateter de infusion ha sido posicionado en el sitio del tejido, se conecta a una bomba que administra una solucion y mantiene un gradiente de presion deseado a lo largo de la administracion del agente. La administracion mejorada por conveccion esta descrita, por ejemplo, en la Patente de los Estados Unidos No. 5,720,720. El termino “infusion” se refiere a una solucion administrada por infusion intersticial por conveccion.

Tal como se utiliza aqrn, “agente terapeutico” se refiere a cualquier molecula que puede ser administrada a un tejido solido para tratar una condicion del tejido. Agentes terapeuticos incluyen agentes antineoplasicos, compuestos radioyodados, toxinas (incluyendo toxinas protemicas), farmacos citostaticos o citoltticos, vectores geneticos y virales, factores neurotroficos, citoquinas, enzimas y agentes para apuntar a lesiones de sitios espedficos. Los agentes terapeuticos tambien incluyen cualquier molecula terapeutica que esta direccionada selectivamente hacia una celula que expresa un antfgeno particular, por ejemplo, inmunotoxinas (vease, por ejemplo, Laske et al., "Tumor regression with regional distribution of the targeted toxin TF-CRM107 in patients with malignant brain tumors," Nature Medicine, 3: 1362-1368, 1997).

El termino “trazador” se refiere a una sustancia que es detectable por tecnicas de imagenes, tales como imagenes basadas en resonancia magnetica o rayos X, por ejemplo, MRI o CT (en algunos ejemplos, un trazador es una molecula que contiene al menos una unidad estructural para imagenes). En ejemplos particulares, el trazador es o no es un agente terapeutico en sf mismo. En otros, el trazador esta conjugado a un agente terapeutico. Un trazador y un agente terapeutico, aunque separados, tambien pueden ser administrados juntos por infusion intersticial por conveccion y el trazador puede ser monitorizado para seguir el proceso de infusion. El termino “trazador subrogado”, cuando se usa, se refiere a una molecula diferente a un agente terapeutico y no conjugada al mismo que es detectable por imagenes, por ejemplo, por MRI o CT.

Una “unidad estructural para imagenes” se refiere a un grupo de atomos detectables en una tecnica de imagenes, por ejemplo, en una tecnica basada en resonancia magnetica o rayos X, tal como MRI o CT. “Unidad estructural de contraste para MR” se refiere a un grupo de atomos detectable en un experimento por MRI en virtud de un contraste diferencial con respecto a los tejidos o estructuras circundantes. “Unidad estructural de contraste para rayos X” se refiere a una unidad estructural para imagenes que es detectable por una tecnica de imagenes por rayos X (tal como CT) en virtud del contraste diferencial con respecto a los tejidos o estructuras circundantes. Desde luego, algunas unidades estructurales para imagenes pueden ser tanto una unidad estructural para contraste por MR, y una “unidad estructural para contraste por rayos X”.

El termino “tejido diana” se refiere a una diana ffsica (usualmente anatomica), por ejemplo, en el cerebro. Ejemplos de tales tejidos diana incluyen un tumor, tal como un tumor cerebral, un quiste, un foco de apoplejfa en el cerebro para ser sometido a ablacion, o una subestructura neuroanatomica particular (tal como el puente troncoencefalico, el cerebro medio, el talamo, el tracto optico o el cortex occipital). El tejido objetivo puede ser una diana ffsica completa o una porcion de la misma a la cual se desea administrar el agente terapeutico.

La expresion “sustancialmente solo al tejido diana” se refiere a la administracion de un agente terapeutico a un tejido diana sin administracion significativa del agente por fuera del tejido diana, lo cual esta caracterizado por una cafda por pasos en la concentracion del agente terapeutico (segun se refleja, por ejemplo, mediante una cafda por pasos en una senal debida a un trazador utilizado para seguir la distribucion del agente terapeutico) en la periferia del tejido diana. Por ejemplo, la administracion sustancialmente solo al tejido diana puede ser reflejada por una gota en la concentracion de agente terapeutico (o una intensidad de senal del trazador) de mas de 75% (tal como mas de 85% o 95%) sobre una distancia de unos pocos milfmetros (tal como una distancia de 1-4 mm) desde la periferia del tejido diana.

El acto de “monitorizar” se refiere a obtener imagenes en serie del trazador a medida que se distribuye (junto con o en proporcion a la distribucion del agente terapeutico) dentro de un tejido solido. Monitorizando la distribucion del trazador, la localizacion y volumen de distribucion de la infusion dentro del tejido puede determinarse en cualquier momento durante el proceso de infusion. Las imagenes en series pueden ser obtenidas a cualquier rata maxima que el instrumento de MRI o CT pueda obtener imagenes. Por ejemplo, pueden obtenerse imagenes en serie a intervalos

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que vanan desde unos pocos milisegundos hasta horas, pero mas tipicamente a intervalos de minutos, tales como intervalos de 1, 2, 5, 10, 15, 20 o 30 minutos. El intervalo entre imagenes en serie puede variarse durante la infusion. En algunos casos, puede ser deseable obtener imagenes a intervalos cortos (por ejemplo, cada 5, 10 o 15 segundos) al comienzo del proceso de infusion para detectar retroflujo a lo largo de la canula, o para verificar que la infusion esta entrando al tejido diana deseado. Una vez que se ha confirmado la administracion al sitio apropiado, el intervalo entre las imagenes puede ser alargado, y las imagenes pueden ser utilizadas para seguir el proceso de infusion, por ejemplo, para determinar si la infusion esta alcanzando tejido por fuera del area diana o si el volumen deseado de distribucion ha sido alcanzado. Cuando se requieren infusiones multiples para completar el tratamiento de una region en particular de tejido solido, el volumen de distribucion de la primera infusion (e infusiones subsecuentes antes de la ultima), puede utilizarse para guiar la colocacion de la canula de tal manera que las porciones no tratadas de la region de tejido solido puedan ser tratadas efectivamente mediante una infusion subsecuente.

La expresion “un volumen de distribucion predeterminados” se refiere a una region de un tejido solido en la cual se desea administrar un agente terapeutico. Por ejemplo, el volumen predeterminado puede corresponder con el volumen ocupado por un tumor, o el volumen predeterminado puede ser una region particular del cerebro que esta direccionada para la destruccion (por ejemplo, el globus pallidus medio). El volumen predeterminado de distribucion puede ser “sustancialmente similar” al volumen de distribucion observado para un trazador que esta siendo monitorizado para seguir la infusion. “Sustancialmente similar” se refiere a una diferencia en volumen o movilidad de menos de 20%, tal como menos de 10% o menos de 5%, entre los volumenes de distribucion o movilidades del trazador y el agente terapeutico. El volumen predeterminado de distribucion tambien puede ser mas pequeno o mas grande que el volumen de distribucion observado del trazador, en cuyo caso, puede utilizarse una correlacion entre el volumen de distribucion del trazador y el volumen de distribucion del agente terapeutico para convertir la distribucion del trazador observada a una distribucion de agente terapeutico. Asf, monitorizando la distribucion del trazador, puede cesarse la infusion cuando el volumen predeterminado de distribucion es alcanzado, independientemente de las movilidades relativas del trazador y el agente terapeutico en el tejido. Una determinacion de si el trazador tiene o no una movilidad que es sustancialmente similar a un agente terapeutico, o una determinacion de como el volumen de distribucion de un trazador se correlaciona con el volumen de distribucion del agente terapeutico puede ser determinada, por ejemplo, por estudios en animales que comparan el volumen de distribucion de un agente terapeutico radiomarcado (determinado, por ejemplo, por QAR) con respecto al volumen de distribucion determinado por MRI o CT para un trazador coinfundido (veanse, Ejemplos 1 y 2).

El termino “protema” se refiere a protemas, polipeptidos y fragmentos de los mismos. Ejemplos de protemas incluyen albuminas, tales como albumina de suero humano o bovino; inmunoglobulinas tales como IgG; metaloprotemas tales como ferritina, hemoglobina y mioglobina; glicoprotemas, lipoprotemas; transferrina; protemas de recubrimiento viral; y enzimas tales como acetiltransferasas.

Los materiales, metodos y ejemplos divulgados son solamente ilustrativos. Se divulgan aqrn los siguientes Ejemplos.

III. Ejemplos

Se divulga un metodo para administracion mejorada por conveccion de un agente terapeutico que provee una solucion que comprende el agente terapeutico y un trazador, administrando la solucion a un tejido solido por infusion intersticial por conveccion, monitorizando la distribucion del trazador a medida que se mueve a traves del tejido solido, y cesando la administracion de la solucion al tejido solido cuando el agente terapeutico esta distribuido en un volumen determinado dentro del tejido solido. El movimiento del trazador a traves del tejido solido puede ser monitorizado por una tecnica de imagenes tal como imagenes por resonancia magnetica (tal como MRI) o rayos X, por ejemplo, tomograffa computarizada (CT). Si se puede asumir, o se sabe que el trazador tiene una movilidad en el tejido solido que es sustancialmente similar al agente terapeutico, la administracion puede cesar cuando se observa que el trazador alcanza un volumen o region de distribucion predeterminados, o alcanza o excede las fronteras del tejido diana. La administracion tambien puede cesarse antes de que las fronteras del tejido objetivo sean alcanzadas por el trazador si se espera o se sabe que el agente terapeutico tiene una movilidad mayor en el tejido que el trazador. Por ejemplo, cuando se ha establecido una correlacion entre las movilidades del trazador y el agente terapeutico, la administracion puede ser cesada cuando la distribucion observada del trazador corresponde con una distribucion deseada del agente terapeutico.

Si el trazador no tiene una movilidad que sea sustancialmente similar al agente terapeutico, o no puede asumirse que tiene una movilidad sustancialmente similar al agente terapeutico (por ejemplo, porque el agente es altamente toxico y la administracion del agente danara tejidos sensibles tales como tejido cerebral por fuera del tejido diana) el volumen de distribucion del trazador que se observa puede ser convertido a un volumen de distribucion del agente terapeutico utilizando una correlacion entre los dos previamente establecida. Asf, la monitorizacion del volumen de distribucion para el trazador puede ser utilizada para determinar si el agente terapeutico ha alcanzado el volumen predeterminado de distribucion, y, por ejemplo, se ha administrado sustancialmente solo al tejido diana.

El trazador puede comprender un quelato metalico, en un ejemplo, el trazador comprende un quelato metalico conjugado al agente terapeutico, y, en otros, el trazador comprende un quelato metalico conjugado a una molecula

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portadora. Aunque la conjugacion tfpicamente se refiere a la formacion de un enlace covalente entre el quelato metalico y el agente terapeutico o la molecula portadora, otros tipos de enlaces (por ejemplo, ionico, dipolo-dipolo o van der Waals) pueden ser suficientes en algunos ejemplos.

Un quelato metalico es un complejo de un ion metalico y un grupo quelatante de metales (un grupo de atomos que sirve para enlazar el ion metalico. Ejemplos de grupos quelatantes incluyen aminas naturales y sinteticas, porfirinas, acidos aminocarboxflicos, acidos iminocarboxflicos, eteres, tioles, fenoles, glicoles y alcoholes, poliaminas, acidos poliaminocarboxflicos, acidos poliiminocarbox^licos, acidos aminopolicarbox^licos, acidos iminopolicarboxflicos, acidos nitrilocarbox^licos, acidos dinitrilopolicarboxflicos, acidos polinitrilopolicarbox^licos, etilendiaminatetraacetatos, dietilendiaminapenta o tetraacetatos, polieteres, politioles, criptandos, polieter fenolatos, polieter tioles, eteres de tioglicoles o alcoholes, poliaminofenoles, bien sea adclicos, macrodclicos, dclicos, macrobidclicos o polidclicos, u otros ligandos similares que producen quelatos o cipratos metalicos estables (incluyendo sepulcratos, sacrofaginas y eteres corona).

Ejemplos espedficos de grupos quelantes de metales incluyen acido 1,4,7,10-tetraazaolododecanotetraacetico (DOTA), acido 1,4,7,10-tetraazaciclododecano-1,4,7-triacetico (DO3A), acido 1-oxa-4,7,10-triazaciclododecano- triacetico (DOXA), acido 1,4,7-triazaciclononanetriacetico (NOTA), acido 1,4,8,11-tetraazaciclotetradecanotetraacetico (TETA), DOTA-N(2-aminoetil)amida y DOTA-N-(2-aminofenetill)amida, BOPTA, HP-DO3A, DO3MA, DTPA, y diversos derivados de los mismos. Se proveen ejemplos adicionales en Caravan et al., Chem. Rev., 99: 2293-2352 (1999) y Patentes de los Estados Unidos Nos. 5,246,692, 5,292,868 y 5,434,287. Un ejemplo particularmente divulgado de un grupo quelante de metales es acido 2-(p-isotiocianotobencil)-6-metildietilenetriamina pentaacetico (1B4M). Puesto que es ventajoso para la generacion de imagenes en vivo seleccionar un grupo quelante de metales capaz de enlazarse fuertemente a un ion metalico, se desea una alta constante de estabilidad para el quelato metalico.

lones metalicos de los quelatos metalicos pueden ser iones paramagneticos si el agente para la generacion de imagenes va a utilizarse como un agente de contraste para MRI. lones metalicos adecuados incluyen los que tienen numeros atomicos de 22-29 (inclusive), 42, 44 y 58-70 (inclusive) y tienen estados de oxidacion de +2 o +3. Ejemplos de tales iones metalicos son cromo (Ill), manganeso (II), hierro (II), hierro (Ill), cobalto (II), mquel (II), cobre (II), praseodimio (Ill), neodimio (Ill), samario (Ill), gadolinio (Ill), terbio (Ill), disprosio (Ill), holmio (Ill), erbio (Ill) e iterbio (III).

Si el agente de generacion de imagenes macromolecular va a utilizarse como un agente de contraste para rayos X, el ion metalico puede ser seleccionado de los iones de W, Bi, Hg, Os, Pb, Zr, lantanidos, y combinaciones de los mismos. Si se desea un agente de contraste combinado para MRI/rayos X, el ion metalico puede ser seleccionado de los iones lantanido paramagnetico. Si se desea un agente de generacion de imagenes radiograficas, el metal puede ser radioactivo, tal como los isotopos radioactivos de In, Tc, Y, Re, Pb, Cu, Ga, Sm, Fe, o Co.

Pueden utilizarse agentes quelantes bifuncionales para formar conjugados de un quelato metalico y un agente terapeutico o una molecula portadora. Un agente quelante bifuncional es una molecula capaz de formar un enlace con otra molecula, tal como una protema o un dendnmero, y tambien capaz de formar un quelato metalico enlazandose a un ion metalico. Agentes quelantes bifuncionales apropiados incluyen por lo tanto un grupo reactivo y un grupo quelante metalico, tal como los descritos previamente.

El grupo reactivo de un agente quelante bifuncional es un grupo de atomos que experimental una reaccion con otra molecula para formar un enlace, tal como un enlace covalente. Ejemplos de grupos reactivos incluyen grupos de acido carboxflico, grupos amina diazotiazable, N-hidroxisuccinimidilo, esteres, aldetudos, cetonas, antndridos, antndridos mixtos, haluros de acilo, maleimidas, hidracinas, benzimidatos, nitrenos, isotiocianatos, azidas, sulfonamidas, bromoacetamidas, yodoacetamidas, carbodiimidas, sulfonilcloruros, hidroxidos, tioglicoles, o cualquier grupo reactivo conocido en el arte como util para la formacion de conjugados. Si, por ejemplo, el agente terapeutico o molecula portadora es una protema o un dendnmero que tiene grupos amino de superficie, el grupo reactivo puede ser un grupo funcional capaz de experimentar reaccion con un grupo amina.

Ejemplos espedficos de agentes quelantes bifuncionales incluyen derivados bifuncionales de acido dietilenetriaminapentaacetico (DTPA) tales como los divulgados en la Patente de los Estados Unidos No. 5,434,287 de Gansow et al. Otros ejemplos incluyen quelatos de acido dietilenetriaminapentaacetico polisustituido tales como los descritos por Gansow et al., en la Patente de los Estados Unidos No. 5,246,692. Tambien son utiles agentes quelantes que comprenden acido 1,4,7,10-Tetraazaciclododecano-N,N',N",N"'-tetraacetico (DOTA) y sus derivados. Ejemplos de derivados de DOTA bifuncionales se proveen en la Patente de los Estados Unidos No. 5,428,154 de Gansow et al. y referencias en la misma.

Pueden preparase trazadores haciendo reaccionar una molecula terapeutica o una molecula portadora con el grupo reactivo de un agente quelante bifuncional y luego hacer reaccionar el grupo quelante de metales del agente quelante bifuncional con un ion metalico.

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Alternativamente, se hace reaccionar un ion metalico con el grupo quelante de metales del agente quelante bifuncional antes de hacer reaccionar el grupo reactivo del agente quelante bifuncional con un grupo de superficie del dendnmero. La quelacion de metales se lleva a cabo tipicamente en una solucion, y de manera deseable evita el uso de acidos o bases fuertes.

Los metodos para hacer reaccionar agentes quelantes bifuncionales con otras moleculas (tales como protemas, agentes terapeuticos y dendnmeros) para formar conjugados, y para formar quelantes metalicos de los mismos, son bien conocidos. Por ejemplo, metodos para formar conjugados de quelatos metalicos de protema se divulgan en las Patentes de los Estados Unidos Nos. 5,246,692, 5,292, 868, 5,364,613, 5,434,287 y 6,274,713, y en la Patente Europea EP0882454. Metodos para formar conjugados de quelatos metalicos de dendnmeros se divulgan, por ejemplo, en la Patente de los Estados Unidos No. 5,834,020 y en la Publicacion PCT WO 93/06868.

En otras realizaciones, donde se utiliza generacion de imagenes por rayos X (tal como CT) para monitorizar CED, el trazador puede comprender un material radioopaco. Los materiales radioopacos tambien pueden ser utilizados para marcar protemas (tales como albuminas) y dendnmeros (tales como dendnmeros DAB). Los materiales radioopacos adecuados son bien conocidos y se incluyen compuestos de yodo, compuestos de bario, compuestos de galio, compuestos de talio. Ejemplos espedficos de materiales radioopacos incluyen bario, diatrizoato, aceite etiodizado, citrato de galio, acido iocarnico, acido iocetamico, iodamida, iodipamida, acido iodoxamico, iogulamida, iohexol, iopamidol, acido iopanoico, acido ioprocemico, acido iosefamico, acido ioserico, iosulamida meglumina, acido iosumetico, iotasul, acido iotetrico, acido iofalamico, acido iotroxico, acido ioxaglico, acido ioxotrizoico, ipodato, meglumina, metrizamida, metrizoato, propiliodona y cloruro talioso.

Cuando el trazador comprende una molecula portadora, la molecula portadora puede ser cualquier molecula diferente al agente terapeutico. En algunos ejemplos, la molecula portadora se selecciona de tal manera que el trazador tendra una movilidad (u otra propiedad relacionada con el movimiento y eliminacion desde el tejido) en un tejido solido que es comparable al agente terapeutico. Ejemplos de moleculas portadoras adecuadas incluyen protemas y dendnmeros.

Ejemplos particulares de protemas incluyen albuminas tales como albumina de suero humano y albumina de suero bovino.

Los dendnmeros son moleculas altamente ramificadas, frecuentemente esfericas sintetizadas por secuencias de reaccion reiterativas que empiezan a partir de una molecula nucleo que tiene multiples grupos reactivos. Tipos particulares de dendnmeros incluyen dendnmeros de polialquilenimina y dendnmeros de poliamidoamina. Ejemplos y metodos particulares para producir dendnmeros de poliamidoamina, entre otros tipos, se proveen en las Patentes de los Estados Unidos Nos. 4,507,466, 4,558,120, 4,568,737, 4,694,064, 4,737,550 y 4,837,599.

Los dendnmeros de poliamidoamina (PAMAM) estan disponibles comercialmente, por ejemplo, de Aldrich (Milwaukee, WI). Ejemplos de dendnmeros de polialquilenimina incluyen polipropilenimina, polibutilenimina, u otros dendnmeros que tienen ramificaciones de cadena alquilo C3 o superiores, tales como ramificaciones de cadenas alquilo C3-C10, que se extienden desde una molecula central. Ejemplos de moleculas centrales adecuadas incluyen amomaco, etilendiamina, propilendiamina, diaminobutano y otras poliaminas tales como tris-aminoemilamina, cicleno, hexaazaciclooctadecano, 1,5-diaminopentano, tetilenetriamina, trietileneteframina, 1,4,8,11-tetraazaundecano, 1,5,8,12-tetraazaundodecano, y 1,5,9, 13-tetraazatridecano.

Un ejemplo particular de un dendnmeros de polipropilenimina es un dendnmero de polipropilenimina con un nucleo diaminobutano (dendnmero DAB). Ejemplos de dendnmeros de polipropilenimina incluyen aquellos con moleculas centrales tales como amomaco, etilendiamina, propilendiamina, o alguna otra poliamina. Tfpicamente, la superficie del dendnmero de polipropilenimina tendra uno o mas grupos amino. Sin embargo, algunos o todos los grupos amino de superficie pueden ser modificados, por ejemplo, para proveer otros grupos reactivos o grupos cargados, hidrofflicos y/o hidrofobos sobre la superficie.

Un ejemplo particular de un dendnmero DAB es el dendnmero de polipropilenimina tetraamina, Generacion 1 [DAB- Am-4; N,N,N',N'-tetrakis(3-aminopropil)-1,4-butanediaminapolypropilenimine tetramina]. La DAB-Am-4 denota un dendnmero de polipropilenimina con nucleo de diaminobutano que tiene 4 grupos amino sobre su superficie. Ejemplos adicionales incluyen dendnmero de polipropilenimina octaamina, Generacion 2.0 [DAB-Am-8; 4,17-bis(3-aminopropil)- 8,13-bis[3-[bis(3-aminopropil)-amino] propil]-4, 8,13,17-tetraazaeicosane-1,20-diamina], que tiene 8 grupos amino sobre su superficie; dendnmeros de polipropilenimina hexadecaamina, Generacion 3.0 [DAB-Am-16; [-

CH2CH2N(CH2)3N[(CH2)3NH2]2]2]2]2], que tiene 16 grupos amino sobre su superficie; dendnmero de polipropilenimina dotriacontaamina, Generacion 4.0 [DAB-Am-32; [-CH2CH2N(CH2)3N[(CH2)3NH2]2]2]2]2]2], que tiene 32 grupos amino sobre su superficie; dendnmero de polipropilen tetrahexacontaamina, Generacion 5.0 [DAB-Am-64; [-

CH2CH2N(CH2)3N[(CH2)3NH2]2]2]2]2]2], que tiene 64 grupos amino sobre su superficie; y dendnmeros DAB-Am de generacion superior tal como DAB-Am-128, DAB-Am-256, y DAB-Am-512.

Los dendnmeros DAB-Am de generaciones 1.0, 2.0, 3.0, 4.0 y 5.0 estan disponibles comercialmente en Aldrich

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(Milwaukee, WI). Los dendnmeros DAB-Am tambien pueden ser sintetizados a partir de un nucleo iniciador de diaminobutano de acuerdo con los metodos divulgados en Womer, y Mulhaupt, Angew Chem., Int. Ed. Engl, 32: 13061308, 1993. Tambien se describen metodos similares en de Brabander-van den Berg y Meijer (Angew Chem., Int. Ed. Engl, 32: 1308, 1993). Los dendnmeros de polipropilenimina que tienen otros nucleos iniciadores, tales como amornaco, etilendiamina, propilendiamina, y otras poliaminas pueden ser sintetizados de acuerdo con estos metodos. Pueden utilizarse esquemas similares para sintetizar dendnmeros de polibutilenimina y polialquilenimina superiores.

Agentes terapeuticos incluyen agentes antineoplasicos, compuestos radioyodados, toxinas (incluyendo toxinas protemicas), farmacos citostaticos o citoltticos, factores neurotroficos, citoquinas, enzimas y agentes para lesiones diana de sitios espedficos. Los agentes terapeuticos tambien incluyen cualquier molecula terapeutica que es direccionada selectivamente a una celula que expresa un antfgeno en particular, por ejemplo, una inmunotoxina (vease, por ejemplo, Laske et al., "Tumor regression with regional distribution of the taargeted toxin TF-CRM107 in patients with malignant brain tumors," Nature Medicine, 3: 1362-1368, 1997). Ejemplos de agentes terapeuticos antineoplasicos incluyen: aminoglutetimida, azatioprina, sulfato de bleomicina, busulfan, carmustina, clorambucil, cisplatino, ciclofosfamida, ciclosporina, citarabidina, dacarbazina, dactinomicina, daunorrubicina, doxorrubicina, taxol, etoposido, fluorouracilo, interferon-alfa, lomustina, mercaptopurina, metotrexato, mitotano, procarbazina HCl, tioguanina, sulfato de vinblastina y sulfato de vincristina.

Las inmunotoxinas combinan la toxicidad de protemas vegetales y bacterianas naturales con la capacidad de enlazamiento espedfica del tejido a los anticuerpos, mas particularmente anticuerpos monoclonales. Por ejemplo, toxinas tales como protema antiviral de fitolaca, toxina del colera, toxina pertusis, ricina, gelonina, abrina, exotoxina de la difteria, o exotoxina de las Pseudomonas pueden ser conjugadas a un anticuerpo. Las unidades estructurales de toxinas tambien pueden ser radionuclidos emisores de alta energfa tales como cobalto-60.

Se han establecido numerosas tecnicas adecuada para enlazar diversas moleculas (incluyendo toxinas y unidades estructurales para imagenes por MR o CT) a anticuerpos. La yodacion, por ejemplo, puede ser lograda utilizando el metodo de la cloramina-T descrito por S. Mills, et al., 123I-Radiolabeling of Monoclonal Antibodies for In Vivo Procedures, Hybridoma 5: 265-275 (1986). Esta tecnica puede ser utilizada para efectuar la yodacion para hacer que el anticuerpo sea radioopaco, o para unir un radionuclido, tal como 125I o 131I. Existe una serie de tecnicas para enlazar diversas moleculas, tales como moleculas pequenas, enzimas y protemas, a anticuerpos. Por ejemplo, pueden conjugarse muchos compuestos que contienen acido carboxflico (tales como metotrexato) a inmunoglobulinas a traves de un intermediario de ester activo, formado, por ejemplo, haciendo reaccionar el compuesto con N-hidroxisuccinimida y diciclohexilcarbodiimida (vease, por ejemplo, Deguchi, et al., "Effect of Methotrexate-Monoclonal Anti-Prostatic Acid Phosphatase Antibody Conjugate on Human Prostate Tumor," Cancer Res. 46: 3751-3755 (1986)). Otros agentes terapeuticos, tales como clorambucil, se enlazaran directamente a los anticuerpos a pH bajo (vease, por ejemplo, Ghose, et al., "Immunochemotherapy of Human Malignant Melanoma with Chloroambucil-Carrying Antibody," Europ. J. Cancer 11: 321-326 (1975)). Farmacos que contienen aminoazucares tales como adriamicinay daunomicina pueden ser enlazados covalentemente a anticuerpos por oxidacion con peryodato del farmaco, seguida por enlazamiento del farmaco oxidado a la inmunoglobulina y reduccion subsecuente del producto con borohidruro de sodio [vease, por ejemplo, Hurwitz, et al., "The Covalent Binding of Daunomycin and Adriamycin to Antibodies," Cancer Res. 35: 11751181 (1975)].

Tambien existen tecnicas convencionales para enlazar otras protemas a anticuerpos. Por ejemplo, pueden introducirse grupos tiol libres al anticuerpo haciendo reaccionar el anticuerpo con N-succinimidil-3-(2-pyridilditio)propionato (SPDP) para introducir grupos disulfuro de 2-piridilo, los cuales pueden ser reducidos entonces con ditiotreitol para dejar grupos tiol libres. La protema que va a ser enlazada del anticuerpo es incubada entonces con SPDP. Al mezclar la protema modificada con SPDP con el anticuerpo que contiene los grupos tiol libres, se enlazan los dos materiales.

Pueden emplearse otras tecnicas conocidas, tales como el uso de espaciadores de dextrano T-10 para incrementar el numero de unidades estructurales de farmaco enlazadas a moleculas de anticuerpo, asf como pueden mezclarse metodos de anfudrido para conjugacion de farmacos. El compuesto 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil) carbodiimida clorhidrato (ECDI) puede ser utilizado para enlazar farmacos que contienen amino a grupos carboxilo de anticuerpos. Alternativamente, puede utilizarse glutaraldehfdo para entrecruzamiento entre grupos amino libres del anticuerpo y grupos amino en el compuesto que va a ser conjugado al mismo.

Tambien pueden enlazarse radionuclidos y unidades estructurales para imagenes a los anticuerpos haciendo reaccionar los agentes quelantes bifuncionales discutidos mas arriba con un anticuerpo. Aun otras tecnicas adecuadas incluyen el metodo de yodogeno divulgado en M. Pimm, et al., "In Vivo Localization of Anti-Osteogenic Sarcoma 791 T Monoclonal Antibody," Int. J. Cancer 30: 75 (1982), y yodacion directa con yoduro de sodio radioactivo.

Independientemente de si el trazador esta comprendido del agente terapeutico o de una molecula portadora, el trazador se administra en una cantidad suficiente para producir diferencias detectables en la intensidad de la imagen del tejido solido utilizando bien sea MRI o CT o ambos. Para MRI, tales diferencias pueden ser detectadas en una imagen sopesada T1 o T2tomada algun tiempo despues de que se administra el agente para imagenes. La diferencia puede ser debida bien sea a un incremento o a un descenso en la intensidad del tejido solido con respecto al tejido

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circundante cuando se compara a una imagen del tejido solido obtenida antes de la administracion del agente. En ejemplos particulares, puede proveerse una diferencia detectable en la intensidad de imagen por MRI administrando entre aproximadamente 0.001 mmol Gd/kg y aproximadamente 0.10 mmol Gd/kg, por ejemplo, administrando entre aproximadamente 0.003 mmol Gd/kg y aproximadamente 0.03 mmol Gd/kg. La generacion de imagenes puede comenzar en cualquier momento desde aproximadamente 1 minuto hasta aproximadamente 2 horas despues de la administracion, tal como entre aproximadamente 3 minutos y 60 minutos despues de la administracion.

Durante la CED, la solucion administrada al tejido solido puede ser administrada a una rata entre 0.1 pL/minuto y 15 pL/minuto.

Ejemplo 1

Este ejemplo describe la preparacion y caracterizacion de un trazador que comprende una protema conjugada a un quelato metalico, y su uso en la siguiente CED, en tiempo real e in vivo, en el bulbo raqmdeo de primates utilizando MRI.

Se conjugo acido 2-(p-isotiocianotobenzil)-6-metildietilen amina pentaacetico (1B4M) [vease, Brechbiel y Gansow, Bioconjug Chem, 2:187-194 (1991)] a albumina de suero humano (HSA) por modificacion de un metodo descrito previamente [vease, Mirzadeh et al., "Radiometal labeling of immunoproteins: covalent linkage of 2-(4- isotiocyanatobenzil) dietilenetriaminapentaacetico acid ligands to immunoglobulin," Bioconjug Chem 1:59-65 (1990)]. En resumen, se disolvieron de 100 a 150 mg de HSA en 20 ml de bicarbonato de sodio 50 mM, NaCl 0.15 M a pH 8.5. A esta solucion, se agregaron 45 mg de 1B4M disueltos en 1 ml de H2O (relacion inicial de ligando a HSA de 30). La mezcla de reaccion se hizo rotar a temperatura ambiente durante la noche. El ligando sin reaccionar o libre fue separado entonces del conjugado de HSA por centrifugacion. La relacion del ligando final a HSA (CL/HSA)f fue determinada entonces espectrofotometricamente [vease, Pippin et al, "Spectrophotometric method for the determination of a bifunctional DTPA ligand in DTPA-monoclonal antibody conjugates," Bioconjug Chem 3:342-334 (1992)]. El volumen final del HSA-1B4M purificado fue ajustado para administrar una concentracion de aproximadamente 10 mg/mL de HSA.

Se hizo reaccionar entonces Gd (III) con el HSA-1B4M a una relacion molar inicial de 2:1 (Gd/1B4M) utilizando una solucion estandar de Gd (III) [Gd(NOa)2] a 6.42x10'3 M. El pH de la solucion de Gd (III) fue ajustada a 4.5 hasta 5.0 utilizando NH4OAc 5 My fue agregado al HSA-1B4M gota a gota con mezcla de la reaccion. La mezcla se dejo transcurrir durante 5 a 6 horas a temperatura ambiente con rotacion. El Gd (III) sin reaccionar fue eliminado agregando 0.5 ml de solucion 0.1 M de EDTA, seguida por centrifugacion. La concentracion final de albumina fue determinada espectrofotometricamente midiendo la absorbancia a 280 nm. El porcentaje de incorporacion de Gd (III) fue determinado repitiendo la medicion del numero de agentes quelantes sobre la protema y tomando nota del descenso debido a su ocupacion por Gd (III). Cada molecula de HSA estaba enlazada a 5 moleculas de Gd. Una solucion madre del conjugado de Gd-albumina (28 mg/ml) en solucion salina regulada con fosfato fue infundida entonces a los animales. Se cree que la formula del conjugado es albumina-(Gd-1B4M)5.

La relativa carencia de toxicidad del conjugado Gd-albumina fue demostrada en ratas. Todas las investigaciones con animales fueron llevadas a cabo de acuerdo con las grnas de los National Institutes of Health sobre el uso de animales en investigacion, y fueron aprobadas por el Animal Care and Use Committee of the National Institute of Neurological Disorders and Stroke. Se anestesiaron ratas masculinas adultas (Sprague-Dawley; n = 12) que pesaban entre 300 a 400 gramos con isofluorano (2%) y se colocaron en un marco estereotactico Kopf. Se hizo una incision sagital a traves de la piel a nivel del craneo. Se coloco una broca de perforacion sobre la region frontal derecha. Se coloco estereotacticamente una canula de calibre 32 unida a una jeringa Hamilton de 25 pl llena con albumina enlazada a Gd en el estriato derecho. Las coordenadas para la colocacion de la punta de la canula en el estriato fueron 0.5 mm antes del bregma, 2.8 mm a la derecha de la lmea media, y 5 mm por debajo del nivel de la duramadre.

Para distribuir la infusion utilizando conveccion, se utilizo un aparato de infusion no normalizado, hermetico a gases que habfa sido descrito en detalle previamente (vease, Lonser et al., "Direct convective delivery of macromolecules to the spinal cord," J Neurosurg 89:616-622 (1998)). En resumen, el aparato consiste de una bomba de jeringa Harvard que genera un gradiente de presion continuo que es trasmitido a traves de una grna hidraulica que esta unida al embolo de la jeringa de infusion. Utilizando este sistema, se administraron 10 pL de Gd-albumina a una rata de 0.5 pL/minuto en el estriato.

Despues de terminar la infusion, los animales se dejaron despertar. Se observaron diariamente en cuanto a deficits clmicos y se sometieron a eutanasia al final del penodo de observacion (3 a 60 dfas). Despues de la eutanasia, los cerebros fueron retirados inmediatamente y congelados a -70°C. Los cerebros fueron cortados entonces en corona en secciones en serie de 20 pm de espesor sobre un criostato a -18°C hasta -20°C. Se cortaron secciones de tejido a traves del cerebro completo. Las secciones fueron tenidas con hematoxilina y eosina, azul rapido de Luxol y Nissl. Se llevo a cabo inmunohistoqmmica para la protema fibrilarmente acida del glial.

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Las caractensticas en MRI del conjugado de Gd-albumina tambien fueron demostradas en primates. De nuevo, toda la investigacion en animales fue Nevada a cabo de acuerdo con las gmas del National Institutes of Health sobre el uso de animales en investigacion, y fue aprobada por el Animal Care and Use Committee of the National Institute of Neurological Disorders and Stroke. Tres primates Rhesus adultos (Macaca mulatta) experimentaron la CED del conjugado Gd-albumina a la region pontino del bulbo raqrndeo. Despues de que la anestesia habfa sido inducida en los animales, fueron intubados, y recibieron anestesia endotraqueal general con halotano. Se monitorizaron la temperatura del animal, el ritmo cardiaco, la saturacion de oxfgeno, las respuestas electrocardiograficas y el PCO2 tidal final. La cabeza del animal fue asegurada entonces en un marco de estereotaxia Kopf. Utilizando una tecnica esteril, se hizo una incision en la piel en lmea media desde el aspecto anterior al posterior del vertex del craneo del animal. Se colocaron retractores autorretenedores dentro de la herida para exponer el craneo subyacente. Se coloco una broca de perforacion (1.0 cm) sobre el punto de entrada determinado estereotacticamente, y se hizo una incision en la duramadre subyacente. La canula de grna externa (vease, figura 1; diametro externo 0.027 pulgadas; diametro interno 0.020 pulgadas) fue colocada estereotacticamente a traves de la abertura en la duramadre a lo largo de la trayectoria diana hasta un nivel de 1.5 cm por encima de la diana en el pontino deseada. La canula de grna externa fue asegurada en su lugar con metilmetacrilato. La canula interna (vease, figura 1; diametro externo 0.014 pulgadas; diametro interno 0.006 pulgadas), despues de ser conectada al aparato de infusion, fue colocada entonces a traves de la canula de grna externa a la diana (vease, figura 1). El animal fue colocado entonces en el escaner de MR para estudios de generacion de imagenes durante la infusion.

De nuevo, para distribuir la infusion hacia el bulbo raqrndeo utilizando conveccion, se utilizo un sistema de administracion fuera de norma que era hermetico a gases sin volumen muerto. Se utilizo una bomba de jeringa Harvard para generar presion continua a lo largo de la infusion. Durante la infusion, la presion fue trasmitida desde la bomba hasta una jeringa Hamilton de vidrio, hermetica a gases, llena con la infusion (250 |jL de volumen total) que estaba conectada a una tubuladura de polieteretercetona (PEEK) (diametro externo 0.23; diametro interno 0.050 pulgadas). La tubuladura PEEK fue conectada directamente a la canula de infusion interna que estaba colocada directamente dentro de la region pontino del bulbo raqrndeo. Las infusiones fueron llevadas a cabo a ratas entre 0.25 a 1.0 jl/minuto.

Se llevo a cabo el MRI en tiempo real del conjugado Gd-albumina (vease figura 3). Despues de la colocacion de la canula de infusion, se obtuvieron imagenes de MR sopesadas T1 en corona para determinar la localizacion precisa de la canula interna (figura 3A). Una vez que se confirmo la colocacion de la canula, se iniciaron las infusiones y se obtuvieron imagenes de MR sopesadas en T1 (1.5 Tesla) (espesor de la seccion de 1 a 1.5 mm; espaciamiento de 0 mm) en 3 planos (sagital, axial, y en corona) a intervalos de aproximadamente 20 a 40 minutos hasta terminar las infusiones (figura 3B-H). Las imagenes de MR fueron analizadas en una Sun Workstation. Se calcularon volumenes tridimensionales de distribucion (Vd) utilizando como un umbral para segmentacion las desviaciones estandar del valor 2 de intensidad de senal por encima de la senal de lmea base media de la region anatomica no infusionada circundante (figuras 4 y 5). Para determinar la homogeneidad de la infusion sobre la Vd infundida, se obtuvieron perfiles de lmea a traves del centro de la infusion como se ve en las imagenes de corona (figuras 6 y 7). La validez y exactitud de estos metodos para calcular Vd y la homogeneidad a partir de imagenes de MR fueron confirmadas utilizando autorradiografia cuantitativa (QAR) como se describe en el Ejemplo 2 mas adelante.

Tambien se llevo a cabo la generacion de imagenes postinfusion. Dos primates experimentaron imagenes de MR en los dfas 0, 1, 2, 4, y 7 despues de la infusion de Gd-albumina (vease, por ejemplo, la figura 8 que muestra las imagenes del dfa 0, 1 y 2). Se obtuvieron las imagenes de MR sopesadas T1 (1.5 Tesla) (espesor de seccion 1 mm; espaciamiento de 0 mm) en 3 planos (sagital, axial, y de corona). Se calculo la Vd tridimensional y se determino la homogeneidad de la infusion como se describio previamente.

Los primates tambien fueron observados a diario con respecto a dificultades medicas o neurologicas a lo largo del penodo de estudio (18 a 35 dfas). Cada animal fue sometido a grabacion en video postoperatorio durante las 48 horas siguientes a la terminacion de la infusion y durante las 24 horas del sometimiento a eutanasia.

Despues del sacrificio, los cerebros de los animales fueron perfusionados con solucion salina regulada con fosfato seguida por formalina al 10%. Los bulbos raqrndeos fueron cortados de manera coronaria en secciones en serie de 20 jm de espesor. Las secciones de tejido a lo largo del bulbo raqrndeo completo fueron procesadas histologicamente, y se tineron secciones representativas de cada bloque de tejido con hematoxilina y eosina, azul rapido de Luxol y Nissl. Se llevo a cabo inmunohistoqmmica para la protema fibrilarmente acida de glial.

Se llevaron a cabo analisis estadfsticos con Stat View 5.0 (Abacus, Berkley, CA).

El HSA utilizado en este ejemplo fue obtenido de Sigma (St. Louis, MO). El Gd (III) fue obtenido de Aldrich (Milwaukee, WI). La bomba de jeringa (modelo 22) fue obtenida de Harvard Apparatus (S. Natick, MA). La jeringa Hamilton, y la tubuladura PEEK fueron obtenidos de Thompson Instruments (Springfield, MA). Las canulas de silica y metilmetacrilato fueron obtenidas de Plastics One (Roanoke, VA). El marco de estereotaxia (modelo 1504) fue obtenido de Kopf (Tujunga, CA). La Sun Work Station y el software fueron adquiridos de Sun Microsystems, Inc. (Palo Alto, CA). El software Stat View 5.0 fue obtenido de Abacus Concepts (Berkeley, CA).

A la vez que el Gd es una unidad estructural para imagenes excelentes para MRI, es neurotoxico en su estado libre. Asf, un constructo estable en el cual el Gd esta unido permanentemente a la albumina (u otra protema, dendnmero o agente terapeutico) es deseable. Despues de la smtesis, se encontro que el conjugado Gd-albumina permaneda soluble, no se agregaba, y el Gd permaneda completamente enlazado.

5 Los experimentos con ratas confirmaron la seguridad de este compuesto (n=12). Como se describio mas arriba, cada rata fue sometida a CED de 10 pl de albumina enlazada a Gd al estriato unilateralmente. Ninguno de los animales exhibio deficits clmicos con observacion extendida (hasta 60 dfas), y el analisis histologico revelo arquitectura de tejidos normales con gliosis minima limitada a la region inmediata circundante a la canula de infusion despues de la infusion (n=12).

10 Para demostrar la factibilidad de distribuir de manera predecible una molecula grande en un volumen relevante clmicamente al bulbo raqrndeo a la vez que se utiliza la generacion de imagenes de MR para monitorizar su distribucion in vivo, los cerebros de los primates Rhesus (Macaca mulatta; n=3) (Tabla 1) fueron sometidos a generacion de imagenes durante la administracion por conveccion de alumina enlazada a Gd a la region de pontino.

Tabla 1. Administracion mejorada por conveccion de albumina enlazada a gadolinio al bulbo raqrndeo de primate

Animal numero

Volumen total infundido (pL) Penodo de supervivencia (dfas)

1

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15

Las imagenes en tiempo real (a intervalos de 20 a 40 minutos) durante la administracion de la infusion mostro que la region anatomica infundida con albumina enlazada a Gd era claramente distinguible del tejido no infundido circundante (figura 2). La region de pontino que circunda la punta de la canula llenada de manera balanceada con el volumen creciente de infusion (Vi) hasta la region anatomica circundante estaba casi llena con la infusion (figura 3).

20 Los analisis volumetricos de la region infundida a diversos puntos en tiempo durante la infusion revelaron que el volumen de distribucion (Vd) de la albumina enlazada a Gd se incremento linealmente con Vi (R2=0.94) (figura 4), y la relacion Vd:Vi con respecto a los volumenes infundidos fue de 8.7 ± 1.2 (media ± S.D.) (figuras 4 y 5). La concentracion de la infusion administrada en el tejido fue homogenea. Los perfiles de lmea en seccion transversal a traves de la region infundida (figura 6) formaron un patron en forma de cuadrado (figura 7), indicativa de una concentracion 25 relativamente uniforme a lo largo de la region con una cafda de gradiente aguda en los bordes (figura 6). Por lo tanto, la imagen observada representa una administracion uniforme de una infusion a una region bien definida y demuestra que la imagen puede ser utilizada para determinar cuando un agente terapeutico ha sido administrado de manera uniforme a sustancialmente solo el tejido diana, bien sea directamente (por ejemplo, cuando el trazador esta unido al agente terapeutico) o a traves de alguna correlacion entre el volumen de imagen observado y el volumen en el cual el 30 agente terapeutico esta distribuido (por ejemplo, cuando el trazador y el agente terapeutico no estan enlazados y las movilidades del trazador y del agente terapeutico son disfmiles).

Para determinar las caractensticas de la infusion en puntos en el tiempo despues de la terminacion de la infusion, se llevaron a cabo MRI postinfusion (en los dfas 1, 2, 4 y 7 despues de la infusion; n=2). Los MRI de la region infundida revelaron un incremento en Vd (comparado con el Vd inmediatamente despues de la terminacion de la infusion) 35 partiendo en el dfa 1 postinfusion (figura 8). El incremento en el dfa 1 postinfusion en Vd fue de 35% para el animal 2 y 41% para el animal 3. Estos incrementos permanecieron relativamente estables hasta que la intensidad del conjugado Gd-albumina se confundio con el de los tejidos normales circundantes (dfas 7 postinfusion, no mostrado). Los perfiles de lmea en seccion transversal a traves de la region infundida sobre las imagenes de MR postinfusion (dfas postinfusion 1 y 2) continuo teniendo un patron en forma de cuadrado (datos no mostrados) indicativo de una 40 concentracion uniforme continuada en la region de infusion.

Como se menciono anteriormente, se establecieron la seguridad y potencial para la toxicidad a los tejidos de CED de conjugados de Gd-albumina en el bulbo raqrndeo. Los primates infundidos fueron seguidos mediante examenes clmicos en serie (hasta 35 dfas) y fueron sometidos a analisis histologicos de la region infundida en el momento de la eutanasia. Ningun animal tema deficit neurologico detectable despues de la infusion a traves del penodo de 45 observacion. El examen somero del cerebro y el bulbo raqrndeo revelo peso normal y ninguna evidencia de edema. Las secciones del bulbo raqrndeo tenidas con azul rapido Luxol, Nissl y hematoxilina y eosina, revelo arquitectura normal de tejido. La tincion de protema acida fibrilarmente de glial revelo gliosis minima limitada a la region que circunda inmediatamente el tracto de la canula.

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Tal como se describe en los antecedentes, la administracion por CED se basa en un flujo en volumen para distribuir sustancias dentro de los espacios intersticiales del CNS. A diferencia de la administracion intraventricular, que se basa en la difusion, la conveccion no esta limitada por el peso molecular, concentracion o difusividad de la infusion. Ademas, debido a que la administracion por conveccion distribuye directamente las moleculas dentro del parenquima puede ser utilizada para dirigirse a regiones seleccionadas del CNS de manera que evita la barrera sangre-bulbo raqrndeo, la cual limita la distribucion y eficacia de agentes administrados por via sistemica. Estudios previos han demostrado que las propiedades de la administracion por conveccion pueden ser utilizadas para distribuir moleculas pequenas y grandes de manera homogenea en volumenes clmicamente relevantes de una manera segura y reproducible dentro de la medula espinal y el cerebro. Este ejemplo demuestra que el MRI puede ser combinado con CED para proveer un metodo novedoso para la administracion de farmacos que incluye monitorizacion en tiempo real in vivo de la distribucion de la infusion dentro del bulbo raqrndeo para alcanzar la administracion a sustancialmente solo el tejido diana.

Las imagenes por MR en tiempo real revelaron que Vd se incremento linealmente (R2=0.94) con un Vi creciente, y la relacion Vd:Vi global fue de 8.7 ± 1.2. Esta relacion refleja la distribucion de sustancias dentro de los espacios intersticiales, y es significativamente mas alta que los estudios previos que utilizaron CED de sustancias similares dentro de la materia gris del cerebro (Vd:Vi; 5.0 ± 0.2) y los tractos de materia blanca de la medula espinal (Vd:Vi; 4.4 ± 0.5). Esto indica que el espacio intersticial del bulbo raqrndeo es pequeno en comparacion con aquellas otras regiones del CNS, puesto que la distribucion esta relacionada inversamente con el tamano del espacio extracelular de la region infundida. Una reduccion del espacio intersticial puede ser un resultado de los tractos de materia blanca densamente empacados que existen en esta region del CNS. Aprovechando la ventaja de la disposicion apretada de fibras en esta region y la relacion Vd:Vi grande, porciones clmicamente relevantes de tejido en esta region fueron llenadas rapidamente.

Las imagenes por MR revelaron la expansion de Vd en el dfa 1 postinfusion, y la estabilizacion del Vd expandido en estudios por imagenes subsecuentes (infusion visible a lo largo del dfa 4 postinfusion). Aparentemente, la distribucion por conveccion de la infusion puede continuar despues de la terminacion de la administracion de la infusion, puesto que la expansion no puede ser explicada por fuerzas difusoras para el trazador de albumina de alto peso molecular. Adicionalmente, la expansion de la distribucion continua aparentemente solo hasta que el gradiente de presion que impulsa la infusion se disipa, puesto que la expansion observada en las primeras imagenes postinfusion permanece estable en tiempos posteriores.

La distribucion de la infusion fue homogenea. El analisis de la intensidad de la infusion sobre las imagenes de MR revelaron uniformidad y una cafda aguda en los bordes de la region infundida. Este perfil de concentracion en forma de cuadrado se mantuvo a lo largo del penodo de mejora fuerte visible en las imagenes de MR postinfusion (a lo largo del dfa 2 postinfusion) (figura 7). Esto subraya la capacidad de la tecnica divulgada para proveer la distribucion controlable de moleculas en una concentracion altamente uniforme sustancialmente dentro de la region diana, manteniendo esta uniformidad a lo largo de un penodo extendido de tiempo (con este compuesto trazador), y evitando la administracion no direccionada, heterogenea de compuestos asociados con la administracion sistemica o intratecal. En otras palabras, la administracion controlable a sustancialmente solo el tejido diana es posible.

Se cree que la CED de macromoleculas al bulbo raqrndeo seguida por MRI tiene una aplicacion amplia en la investigacion y tratamiento de condiciones del bulbo raqrndeo. Un ejemplo de un trastorno espedfico que puede ser tratado con cEd de agentes terapeuticos es los gliomas en pontino difusos. Estos neoplasmas afectan primariamente a ninos jovenes, y son uniformemente fatales puesto que no son seccionables quirurgicamente, y los agentes quimioterapeuticos no pueden ser administrados de manera exitosa utilizando tecnicas convencionales debido a las limitaciones de estos metodos. La CED acoplada con MRI (u otras tecnicas de imagenes) permiten la administracion directa y predecible de agentes terapeuticos a estas u otras lesiones del bulbo raqrndeo. La capacidad demostrada de coinfundir trazadores para imagenes subrogados o directamente compuestos terapeuticos marcados permite visualizacion en tiempo real de la administracion de farmacos en esta y otras regiones del CNS. Asf, la administracion en regiones empleando CED de esta manera se demostrana util en el estudio y tratamiento de una variedad de trastornos del CNS.

Ejemplo 2

La administracion mejorada por conveccion (CED) permite la distribucion de agentes terapeuticos en volumenes grandes de cerebro en concentraciones relativamente uniformes. Este modo de administracion de farmacos ofrece gran potencial para el tratamiento de muchos trastornos neurologicos, incluyendo tumores cerebrales, enfermedades neurodegenerativas y trastornos de ataques. La eficacia del tratamiento y la prevencion de toxicidad indeseada utilizando la metodologfa de CED, sin embargo, depende de que el agente terapeutico infundido sea distribuido de una manera direccionada a la region diana, a la vez que se minimiza la administracion a tejido no diana, y en concentraciones que estan en el rango terapeutico. Como se demostro mas arriba en el Ejemplo 1, se pueden utilizar MRI para visualizar el proceso de CED.

En este ejemplo, se confirma y monitoriza en tiempo real la administracion exacta y uniforme de agentes terapeuticos

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durante CED con la tecnica de imagenes no invasiva de tomograffa computarizada de rayos X (CT). La tecnica CT tambien es comparada a la tecnica por MRI. Los trazadores que comprenden albumina conjugada a acido iopanoico para CT y a un quelato con metal gadolinio para MRI fueron preparados e investigados en cuanto a su utilidad como trazadores subrogados durante la distribucion por conveccion de una macromolecula. Los trazadores fueron infundidos a los hemisferios cerebrales de monos, y se midieron los volumenes de distribucion utilizando CT y MRI. Los volumenes de distribucion medidos por imagenes fueron comparados con los volumenes de tejido medidos por autorradiograffa cuantitativa (QAR) utilizando 14C-albumina infusionada con los trazadores. La correlacion de concentracion del trazador en los estandares de homogenizado de cerebro y unidades Hounsfeld de CT tambien demostraron que el CT puede ser utilizado para cuantificar la concentracion de la infusion durante CED. De manera similar, se demostro la utilidad de MRI para cuantificar la concentracion de infusion en tejido. Los efectos a largo plazo del trazador subrogado para CT (acido iopanoico-albumina) sobre el comportamiento del animal, histologfa de los tejidos y toxicidad parenquimal despues de la infusion cerebral tambien fueron establecidos.

Los ejemplos descritos mas adelante demuestran que la distribucion controlada y predecible de una macromolecula a volumenes significativos clmicamente en el cerebro es posible utilizando CDE en combinacion con generacion de imagenes, tales como generacion de imagenes en serie. Tambien confirman que las dimensiones espaciales de la distribucion en tejidos pueden ser definidas con exactitud in vivo durante la infusion utilizando trazadores subrogados y tecnicas de generacion de imagenes convencionales, y demuestran que el uso de trazadores subrogados radiograficos es un metodo practico y seguro para establecer volumenes de tratamiento durante la microinfusion intersticial a flujo alto del CNS. El metodo divulgado puede ser utilizado para monitorizar, en tiempo real, la geometna del volumen distribuido y para revelar baja resistencia del tejido y flujo preferencial a lo largo de tractos de fibra y retroflujos asociados con ratas de infusion rapidas y tamanos de cateter mas grandes, los cuales pueden producir una administracion no uniforme del agente terapeutico y administracion por fuera del tejido diana. El uso de un trazador para determinar de manera no invasiva las concentraciones en tejido in vivo tambien provee informacion importante que puede ser utilizada para establecer eficacia y neurotoxicidad dependientes de la dosis.

Se conjugo acido Iopanoico (una unidad estructural para generacion de imagenes por rayos X) a BSA (IPA-BSA) y HSA (IP-HSA) (Sigma Chemical Co.) mediante la adicion lenta del ester activo de N-hidroxisulfosuccinimida del acido iopanoico en DMSO (1.5 mL de solucion de 140 mg/mL) a 10 ml de BSA (10 mg/mL en HEPES 0.07M, pH 8.5). Despues de mezclar aproximadamente durante 5 horas a temperatura ambiente, se retiro el precipitado por centrifugacion. El sobrenadante fue filtrado (0.22 jM), purificado por diafiltracion contra solucion salina regulada con fosfato (PBS) (pH 7.2, NaCl 0.15 M) utilizando una camara provista con una membrana YM10 (Amicon, Millipore Corp., Bedford, Massachusetts), y concentrado por centrifugacion (Centricon 10K) hasta aproximadamente 70 mg/ml con una relacion tfpica IP:albumina de 40-45 (determinada midiendo las absorbancias en UV a 315 nm vs. 280 nm).

Se sintetizo un conjugado de albumina-Gd-DTPA como se describio previamente en Ogan et al, "Albumin labeled with Gd-DTPA: An intravascular contrast-enhancing agent for magnetic resonance blood pool imaging: preparation and characterization," Invest Radiol 22:665-671 (1987) [published erratum appears in Invest Radiol 1988 Dec;23(12):961]. Esta preparacion tema 26 ligandos de DTPA enlazado cada molecula de albumina y tema un peso molecular calculado de 78 kDa.

El putamen en seis monos Rhesus adultos (8-10 kg) fue escogido para la conveccion unilateral de IPA-BSA (n=3) o albumina-Gd-DTPA (n=3). La anestesia fue inducida con ketamina (10 mg/kg), xilazina (0.5 mg/kg), y tiopental sodico (1 mg/kg). Los animales fueron asegurados en un marco de estereotaxia para monos (Kopf Instruments, Tujunga, California). Una aguja de punta roma metalica Hamilton de calibre 32 conectada a una jeringa Hamilton de 250 jl (Thompson Instruments, Chantilly, Virginia) fue insertada estereotacticamente en el centro del putamen derecho (anteroposterior 15.5 mm, mediolateral 12 mm y dorsoventral 24.5 mm con respecto a los canales timpanicos y el seno sagital medio)15. Despues de un retraso de 90 minutos, la infusion comenzo a 1.0 jl/min.

Para CT, se infundieron 130 jl, 200 jl y 235 jl de la mezcla de trazadores IPA-BSA/14C-BSA (35-55 de acido Iopanoico/BSA, 61.3-80.4 mg/ml de 14C-BSA). Para MRI, se infundieron 130 jl, 185 jl y 230 jl de una mezcla de albumina-Gd-DTPA (Gd (III) 0.76 mM, HSA 0.03 mM) y 14C-BSA. Despues de la infusion, los animales se sometieron a generacion de imagenes por CT o MRI, e inmediatamente despues de ello fueron sometidos a eutanasia mediante sobredosis de pentotal. Los cerebros completos fueron retirados y almacenados a -80°C durante una semana antes del analisis.

La generacion de imagenes por CT fue llevada a cabo en una unidad Helical CT (General Electric Medical Systems, Milwaukee, Wisconsin). El IPA-BSA de imagenes utilizando un DFOV de 13.0-19.0 cm, 120 kV, 200-280 mA, un espesor de seccion de 3.0 mm, y una matriz 512.

El MRI se llevo a cabo en una unidad de 1.5-Tesla (General Electric Medical Systems, Milwaukee, Wisconsin). Las imagenes de corona y de axial fueron obtenidas a una relacion TR/TE de 15.4/6.3 mseg, un FOV de 10 x 10 mm, un espesor de seccion de 1.0 mm con un espaciamiento de 0.0 mm y una matriz nex 256 x 192/4.

Se coinfusiono BSA metilado en 14C (American Radiolabeled Chemicals, Inc., St Louis, Missouri) con cada trazador.

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Despues del sacrificio, el cerebro fue congelado a -70°C, se obtuvieron secciones en criostato de 20 pm de espesor sobre laminas de vidrio recubiertas con colageno, y se expusieron a una placa de imagenes fosforescentes (Fuji Medical Systems, Stamford, Connecticut) junto con estandares de plastico de 14C (American Radiolabeled Chemicals, Inc., St. Louis, Missouri) a temperatura ambiente. Despues de una semana, la placa de generacion de imagenes fue barrida digitalmente en el FujiFilm BAS5000 Bio-imaging Analyzer. Las imagenes fueron calibradas utilizando una correlacion previamente establecida entre los estandares plasticos de 14C y secciones de cerebro de rata de 20 pm que conteman 14C. El volumen de tejido de distribucion (Tvd) fue definido como el volumen que contema >10% de la radioactividad pico en el sitio de infusion. Las areas de secciones que abarcan la region perfundida fueron sumadas y multiplicadas por el espaciamiento entre las secciones. Se obtuvieron perfiles del 14C-BSA a traves de la infusion en secciones correspondiente al centro de la infusion.

Las imagenes de CT y MRI fueron analizadas en el paquete de software MEDx (Sensor Systems, Inc., Sterling, Virginia) ejecutado en una Sun Worstation (Sun Microsystems, Inc., Palo Alto, California). Los volumenes tridimensionales (3D) de distribucion, Vd, fueron definidos como la relacion del volumen de tejido perfundido dividido por el volumen de infusion. Fueron medidas mediante segmentacion de volumenes utilizando dos umbrales diferentes. Vd(1) fue calculado como el volumen de distribucion de CT y MRI que contema al menos 10% del incremento total en la intensidad de senal debida a la adicion del agente de contraste. Una region rectangular de interes (ROI) sobre el area de infusion fue definida y en el sitio correspondiente en el hemisferio contralateral, y se midio la intensidad de senal maxima perfundida (pico) y la intensidad de senal maxima no perfundida (fondo). Se utilizo una intensidad de senal de lmea base mas 10% de esta diferencia para obtener el valor de umbral para la segmentacion de volumen. Para definir una tecnica mas simple para calcular el volumen sometido a generacion de imagenes, se calculo Vd(2) usando, como el umbral para segmentacion, el valor de intensidad de senal que era dos desviaciones estandar por encima de la intensidad de senal de lmea base media. Para determinar la homogeneidad del contraste en el volumen de distribucion, se obtuvieron perfiles de lmea a traves del centro de la infusion como se ve en las imagenes de corona.

Se prepararon estandares in vitro como sigue. Se homogenizo cerebro de rata en PBS (1:1 v/v) y gelatina al 2%. Se agregaron 14C-albumina e ioxilano (Oxilan-R) en diversas concentraciones. Los estandares fueron congelados durante la noche a -80°C, barridos utilizando CT y seccionados a 20 pm. Se barrieron las secciones en el sistema de imagenes de fosforo tal como se describe mas arriba. Utilizando una rejilla 3x3-e superpuesta sobre la imagen CT y la correspondiente imagen QAR, se generaron pares coincidentes de valores de densidad de senal CT Hounsfeld y QAR en cada concentracion y se llevo a cabo un analisis por regresion.

La seguridad y toxicidad del trazador de CT fue investigada en ratas Sprague-Dawley (n=3 por grupo) que fueron infusionadas en un marco estereotactico (Kopf Instruments, Tujunga, California) con 5 pl de IPA-HSA (81.3 mg/ml, 3545 IPA por HSA) a 0.5 pl/min en el putamen (A 0.5 mm, L 3.5 mm, y D 5.5 mm con respecto a la bregma y a la duramadre), y se sacrificaron despues de 7, 14 y 39 dfas o cuando aparecieron signos de toxicidad. Los animales fueron examinados diariamente en cuanto a evidencia en el comportamiento producida por toxicidad. En el momento del sacrificio, se recolectaron los cerebros, se congelaron, se seccionaron a 20 pm y se tineron con hematoxilina y eosina y anticuerpo de protema acida fibrilarmente anti-glial (GFAP).

Para establecer la aparicion de trazadores subrogados utilizando barrido por CT o MRI, los animales fueron sometidos a barrido inmediatamente despues de la CED de los trazadores al putamen. Las areas perfundidas fueron visibles claramente sobre CT y MRI despues de las infusiones (figuras 9 y 10). La forma de la infusion siguio las fronteras anatomicas de los ganglios basales, con alguna dispersion hacia la materia blanca adyacente de la corona radiata despues de volumenes mayores de infusion. Las infusiones no se extendieron hacia el tracto optico contiguo (figura 11). Las regiones perfundidas, particularmente aquellas sobre MRI teman perfiles de distribucion relativamente uniformes y gradientes de concentracion por etapas en la interfase entre el volumen de infusion y el parenquima circundante (figura 13). La resolucion anatomica fue superior con MRI, con el cual la distribucion en los nucleos y en los tractos de materia blanca transversos pudo ser identificada. Hubo mas variabilidad de intensidad de senal dentro de los volumenes CT (figura 12), indicando que sena posible incrementar la concentracion de IPA:BSA para diferenciar mejor entre cerebro no perfundido y perfundido.

Para demostrar que el volumen sometido a generacion de imagenes refleja exactamente el volumen distribuido en el tejido, los volumenes con generacion de imagenes fueron comparados a los medidos por autorradiografia cuantitativa (QAR). Primero, el volumen de perfusion radiactiva sobre QAR fue definido como aquel que contema al menos 10% de la radioactividad pico en las areas perfundidas. A continuacion, se calcularon los volumenes de distribucion desde CT y MRI con base en aquellas porciones de la imagen que contema al menos 10% del incremento total en la intensidad de senal debido a la adicion del agente de contraste [Vd(1)]. Los volumenes de distribucion de [Vd(2)] tambien fueron calculados contando solamente aquellos voxeles que tienen valores de intensidad de senal mayores a dos desviaciones estandar por encima de la intensidad de voxel media en el cerebro no perfundido. Los Vd(1) y Vd(2) medios para el trazador CT fueron 3.44 ± 0.74 y 4.51 ± 1.31, respectivamente, comparados con 4.26 ± 0.24 utilizando los resultados de QAR. Las Vd(1) y Vd(2) medias para el trazador MRI fueron 2.55 ± 0.44 y 2.62 ± 0.28, respectivamente, en comparacion con la distribucion en tejido de 3.86 ± 1.05 medida por QAR.

Tambien se demostro la distribucion uniforme. La uniformidad en las concentraciones en las regiones perfundidas fue

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similar entre las mediciones de QAR y las derivadas de CT y MRI. Los perfiles de lmea a traves de las areas en seccion transversal (figuras 12 y 13) muestran una concentracion relativamente uniforme en la region perfundida con gradientes por etapas en sus bordes, demostrando de nuevo la capacidad del metodo divulgado para administrar infusiones a sustancialmente solo el tejido diana.

Para demostrar que la concentracion en tejido de la albumina (y los agentes terapeuticos) puede predecirse sobre la base de las imagenes de CT, se establecio la relacion entre las unidades Hounsfeld sobre imagenes CT y la concentracion de albumina marcada con 14C. Utilizando un homogenizado de cerebro en estandares in vitro que conteman tanto la albumina marcada con 14C y el trazador subrogado, la relacion entre unidades Hounsfeld de CT y la radioactividad fue lineal con un valor de r2 que excede de 0.995 (figura 14). Esta grafica demuestra que si la concentracion relativa de un agente terapeutico y un trazador CT son conocidas, la concentracion de agente terapeutico en una porcion particular del tejido perfundido puede determinarse a partir de la intensidad en la imagen (en unidades CT Hounsfeld) del trazador en esa porcion.

La carencia relativa de neurotoxicidad del trazador subrogado acido iopanoico-albumina fue demostrada despues de una infusion por conveccion sencilla en el cerebro de rata. No hubo cambios en comportamiento a 7, 14 y 39 dfas despues de la infusion. Los animales sometidos a autopsia, fueron visibles marcas en el trazo de la aguja a 7 y 14 dfas, pero habfan desaparecido a los 39 dfas. Se noto edema en el sitio de infusion en 1/3 animales sacrificados despues de 7 dfas pero estaba resuelto completamente a los 14 dfas. No se presento hemorragia en el sitio de infusion. La tincion con GFAP fue minima en el borde de la infusion y a lo largo del trazo de la aguja a 14 dfas, pero no hubo diferencia en la tincion con GFAP entre los hemisferios tratado y no tratado a los 39 dfas. Particularmente, no hubo evidencia de proliferacion astrocftica reactiva circundando el area infundida.

Se demostro la distribucion y visualizacion predecible y controlable de una molecula administrada a volumenes significativos clmicamente en el cerebro de primates utilizando conveccion. Despues de la coinfusion de una mezcla de albumina marcada con 14C y albumina marcada para visualizacion sobre CT o MRI, las imagenes de CT y MRI mostraron volumenes discretos de perfusion por contraste en el estriato y la geometna de las regiones perfundidas correspondientes cercanamente a la distribucion que era evidente a partir de las imagenes de QAR correspondientes demostrando que la administracion a sustancialmente solo el tejido diana puede alcanzarse a traves de la monitorizacion de la infusion con una tecnica por imagenes. La distribucion de la perfusion en tejidos cubrio la region diana (el estriato). A volumenes de infusion mas grandes (230 jL y 235 jL) se detecto flujo hacia los tractos de materia blanca adyacentes por ambas tecnicas de imagenes, pero no se detecto flujo inferiormente en el tracto optico por MRI. Los volumenes radiograficos de distribucion obtenidos por CT fueron similares a los volumenes obtenidos por QAR para todos los volumenes testados, mientras que los volumenes de distribucion medios por MRI fueron consistentemente mas pequenos. Asf, puede ser deseable cesar la administracion en un tiempo mas temprano cuando se sigue una infusion utilizando la tecnica de MRI. Independientemente, una vez que se establece una correlacion entre la distribucion observada por MRI y la distribucion observada por QAR, la correlacion puede ser utilizada para determinar cuando una infusion ha alcanzado el tejido diana. Ademas, estos resultados demuestran que la distribucion uniforme mostrada en los perfiles de lmea CT/MRI se correlaciona con la distribucion de concentracion uniforme mostrada por QAR, y que las imagenes por CT/MRI por sf mismas pueden ser utilizadas para monitorizar la concentracion de los agentes terapeuticos durante la CED.

La administracion de agentes terapeuticos a volumenes diana grandes (y sustancialmente solo a aquellos volumenes diana) del cerebro ofrece gran potencial para el tratamiento de muchos trastornos neurologicos, incluyendo enfermedades neurodegenerativas, trastornos de ataques y tumores cerebrales. Para enfermedades tales como enfermedad de Parkinson y esclerosis temporal mesial, en los cuales los volumenes de putamen humano, caudata, airugdalas e hipocampos normales vanan de 1.5 a 7.5 ml, las areas diana potenciales pueden ser perfundidas completamente infundiendo 0.4 ml durante un penodo de 7 horas, o 1.9 ml durante el trascurso de 32 horas, asumiendo una rata de flujo de 1 jl/min y un volumen de distribucion igual a 4. Mientras que la administracion intratumoral de macromoleculas ha sido llevada a cabo con seguridad en humanos con astrocitomas de grado alto, la naturaleza infiltrante difusamente de los astrocitomas requiere areas grandes de direccionamiento de la terapia del cerebro, tal vez hemisferios completos. Esto puede ser logrado teoricamente combinando la distribucion anatomica de cateteres de infusion multiple para direccionar efectivamente un area perfundida mucho mas grande. En tal situacion, los metodos divulgados que incorporan imagenes pueden ser utilizados para seguir la administracion y ayudar a confirmar que todas las areas fueron perfundidas, y evitar algunas areas que reciben dosis multiples desde los cateteres multiples.

Para demostrar la efectividad de cualquier agente utilizando conveccion, deseablemente se confirma que la concentracion del agente esta en el rango terapeutico. Dadas las concentraciones uniformes despues de la administracion por conveccion y la correlacion lineal entre la concentracion de yodo y las unidades Hounsfeld, es ventajoso utilizar CT para medir la concentracion de trazador en cada voxel de tejido, la cual desde luego puede ser correlacionada con la concentracion del agente terapeutico. Sin embargo, la intensidad de la mejora en el tejido (por ejemplo, por Gd-DTPA) no siempre puede ser una prediccion completamente exacta de la concentracion, puesto que la relacion de la concentracion de gadolinio al grado de mejora es compleja y bimodal, con una intensidad de senal que se eleva hasta un pico y luego cae a medida que la concentracion de gadolinio se incrementa (vease, Wang et al,

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"Magnetic resonance imaging contrast enhancement versus tissue gadolinium concentration," Invest Radiol 25 Suppl 1:S44-45 (1990)). Sin embargo, en la practica, como aqm, el rango de concentracion de gadolinio durante la administracion por conveccion era limitado, y dentro de este rango se espera una relacion aproximadamente lineal entre la concentracion de gadolinio y la intensidad de la senal.

Una ventaja de la administracion regional directa es la capacidad de direccionar areas anatomicas espedficas del cerebro, asf como el potencial de direccionar la terapia a poblaciones celulares espedficas. Adicionalmente, diferencias estructurales en el tejido (materia gris versus materia blanca adyacente) conforman la distribucion lograda con conveccion a las estructuras anatomicas no esfericas de interes. Sin embargo, incluso con un direccionamiento anatomico optimo utilizando tecnicas neuroquirurgicas estereotacticas modernas, la anisotropfa del cerebro puede llevar a una distribucion por conveccion del farmaco en areas por fuera de la diana prevista. Tambien es posible que pueda ocurrir el escape de farmaco de regreso a lo largo del trazo de la aguja con altas ratas de infusion (retroflujo). La administracion inadvertida de farmaco hacia el CSF puede ocurrir si el movimiento retrogrado del farmaco alcanza el espacio superaracnoide. La distribucion de la monitorizacion del trazador (tales como trazadores subrogados) durante la infusion de farmaco permite la identificacion de distribucion inesperada o fuga retrograda a lo largo del cateter, permitiendo medidas correctivas tales como el ajuste de la rata de infusion o el reposicionamiento de la punta del cateter. Por estas razones, un metodo radiografico o por resonancia magnetica para seguir la distribucion de la perfusion durante la conveccion, de tal manera que los parametros de infusion puedan ser optimizados para perfundir solamente la region direccionada, es util. Adicionalmente, la medicion de los volumenes de distribucion en diferentes regiones del cerebro o tumor provee datos utiles para modelar la anisotropfa del cerebro y su influencia sobre la distribucion del farmaco durante la CED. Tales mediciones de volumenes de distribucion se utilizan subsecuentemente para predecir patrones de la administracion del farmaco por CED en sujetos que estan recibiendo terapia.

En principio, la administracion por conveccion de macromoleculas que no interactuan con las superficies celulares o la matriz extracelular viajara dentro del espacio extravascular independientemente del peso molecular y se distribuiran extensamente a una concentracion de tejido uniforme. La desaparicion de la molecula con el tiempo representa los efectos combinados del reconsumo capilar, degradacion biologica, y perdida por conveccion natural y difusion lenta. La distribucion medida por la coinfusion del trazador subrogado con una macromolecula terapeutica, si ambas son similares en tamano, representa una indicacion confiable de la distribucion de esa macromolecula. Sin embargo, las diferencias en carga electrica, conformacion molecular, enlazamiento al receptor, consumo celular y degradacion en el espacio extracelular afectan la distribucion final de cada molecula. No obstante, el conocimiento del movimiento en el tejido de un farmaco con respecto al movimiento del trazador subrogado (una correlacion) permite el calculo de la distribucion del farmaco a partir del conocimiento de la distribucion del trazador subrogado.

La seguridad del trazador por CT fue examinada, y no se observo evidencia de toxicidad directa o reaccion inmunologica en los cerebros de las ratas perfundidas por conveccion con IPA-HAS. El acido iopanoico ha sido utilizado para generacion de imagenes de la vesfcula biliar, y solamente se ha asociado con efectos colaterales raros (insuficiencia renal aguda, trombocitopenia aguda) [vease, Berk et al, "Oral cholecystography with iopanoic acid," N Engl J Med 290:204-210 (1974); Curradi et al. "Acute thrombocytopenia following oral cholecystography with iopanoic acid," Clin Toxicol 18:221-224 (1981)]. El acido iopanoico no es conocido por ser neurotoxico en el tratamiento clmico [vease, Rapoport and Levitan, "Neurotoxicity of X-ray contrast media: Relation to lipid solubility and blood-brain barrier permeability," Am J Roentgenol Radium Ther Nucl Med 122:186-193 (1974)]. Sin embargo, el iopanoato de sodio utilizado en cultivo de tejidos a 1 mM produjo la muerte inmediata de explantes de ganglios simpaticos, mientras que a 0.1 mM produjo la vacuolizacion de fibroblastos. No se presento toxicidad con acido iopanoico a 0.01 mM (Kormano and Hervonen, "Use of tissue culture to examina neurotoxicity of contrast media," Radiology 120:727-729 (1976)). Si se disocia completamente el conjugado IPA:HSA utilizado aqm tendna una concentracion de acido iopanoico de aproximadamente 0.017 mM. Sin embargo, el enlace amida que une el acido iopanoico a la albumina es susceptible de degradacion solamente por procesamiento intracelular, y por lo tanto, no se considera que libere acido propanoico libre hacia el parenquima. La ausencia de neurotoxicidad en los animales perfundidos con el conjugado de |PA:HSA indica que la disociacion del compuesto no ocurre, u ocurre tan lentamente que no plantea un riesgo sustancial de toxicidad parenquimal.

La capacidad de visualizar la distribucion por conveccion y de determinar la concentracion en tejido de un trazador en la region perfundida mejora grandemente la utilidad potencial de la CED. El analisis de la eficacia y toxicidad del tratamiento utilizando esta metodologfa de administracion se beneficia de la confirmacion de que la infusion esta localizada en la region diana, y que las concentraciones estan en el rango terapeutico, y no en el toxico. Adicionalmente, el seguimiento en tiempo real, no invasivo del volumen de infusion permite el control de la infusion sustancialmente solo a la region de interes (por ejemplo, el tejido diana). Como se demuestra aqm, los agentes de contraste radiograficos y para resonancia magnetica, utilizados como trazadores subrogados en las modalidades de generacion de imagenes por CT y MRI estandar, proveen una herramienta practica para establecer volumenes de tratamiento durante la microinfusion a alto flujo. La correlacion altamente lineal entre unidades Hounsfeld en imagenes CT y la concentracion de agente generador de imagenes por CT en estandares de tejido cerebral demuestra un medio para la determinacion de concentraciones in vivo a partir de imagenes por CT obtenidas durante la CED en pacientes.

En este ejemplo, se demuestra la CED que incorpora el uso de un trazador subrogado basado en yodo e imagenes por (CT) tomograficas computarizadas.

Cuatro primates (Macaca mulatta) experimentaron la CED de diversos volumenes (volumen total de 90 a 150 |jl) de iopamidol (777 Da) en la materia blanca cerebral combinada con la generacion de imagenes por CT durante y despues 5 de la infusion (hasta 5 dfas postinfusion), asf como autorradiograffa cuantitativa (QAR). Se utilizaron la observacion clmica (<20 semanas) e histopatolog^a para evaluar la seguridad y la toxicidad.

La generacion de imagenes por CT en tiempo real del trazador durante la infusion revelo una region claramente definida de perfusion. El volumen de distribucion (Vd) se incremento linealmente (R2=0.97) con volumen creciente de infusion (Vi). La relacion global Vd:Vi fue de 4.1 ± 0.7 (media ± S.D.). La distribucion de la infusion fue homogenea. La 10 QAR reconfirmo la exactitud de la distribucion en las imagenes para una molecula pequena (sacarosa; 359 Da) y una grande (dextrano; 70 kDa). La distribucion de infusion fue identificable hasta 72 horas despues de la infusion. Ninguno de los animales tuvo evidencia clmica o histopatologica de toxicidad.

La generacion de imagenes por CT in vivo, en tiempo real, de CED utilizando iopamidol parece ser segura, factible y adecuada para monitorizar la administracion por conveccion de moleculas tanto pequenas como grandes.

15 Ejemplo 4

Este ejemplo describe la preparacion y caracterizacion de un trazador que comprende un dendnmero conjugado a un quelato metalico, y su uso en seguir, en tiempo real e in vivo, la CED en el bulbo raqrndeo de primates utilizando MRI.

Se sintetizo un dendnmero DAB-Am64-(1B4M-Gd)64 de acuerdo con el metodo descrito en Kobayashi et al., Cancer Research, 61: 4966-4970, 2001. Se obtiene un dendnmero de polipropilenimina diaminobutilo (DAB), Generacion 5.0 20 (DAB-Am-64) de Aldrich Chemical Company (Milwaukee, WI). Este dendnmero tema 64 grupos amino primarios

terminales y un peso molecular de 7,168. El dendnmero es concentrado a 10 mg/ml y diafiltrado contra regulador de fosfato 0.1 M a pH 9. El dendnmero de DAB-Am-64 se hace reaccionar con un exceso de 64 veces de 1B4M a 40°C, y la solucion de reaccion se mantiene a pH 9 con NaOH 1M durante un tiempo de reaccion de 48 horas. Se agrego una cantidad igual adicional de 1B4M despues de 24 horas en forma de solido. La preparacion se purifica entonces 25 por diafiltracion utilizando Centricon 30 (Amicon, Cambridge MA).

Aproximadamente 3 mg de DAB-Am-64-(1B4M-Gd)64 se mezclan con 10 jmol de Gd(III) citrato (Nakarai, Tokyo, Japon) en regulador de citrato 0.3 M durante 2 horas a 40°C. Se elimina el exceso de Gd(III) en DAB-Am-64-(1B4M)64 por diafiltracion utilizando Centricon 30 a la vez que simultaneamente se cambia el regulador a PBS 0.05 M a pH 7.4.

La toxicidad del conjugado Gd-dendnmero es investigado en ratas. Se anestesian ratas macho adultas (Sprague- 30 Dawley; n=12) con pesos entre 300 a 400 gramos con isofluorano (2%) y se colocan en un marco estereotactico Kopf. Se hace una incision sagital a traves del cuero cabelludo hasta el nivel del craneo. Se coloca una broca de perforacion sobre la region frontal derecha. Una canula de calibre 32 unida a una jeringa Hamilton de 25 jl llena con el conjugado Gd-dendnmero se coloca estereotacticamente en el estriato derecho. Las coordenadas para la colocacion de la punta de la canula en el estriato son 0.5 mm anterior al bregma, 2.8 mm a la derecha de la lmea media, y 5 mm por debajo 35 del nivel de la duramadre.

Para distribuir la infusion utilizando conveccion, se usa un aparato fuera de norma, hermetico a gases para infusion que fue descrito en el Ejemplo 1. Utilizando ese sistema, se administran 10 jL de Gd-albumina a una rata de 0.5 jL/minuto en el estriato.

Despues de la terminacion de la infusion, los animales se dejaron despertar. Se observaron diariamente en cuanto a 40 deficits clmicos, y se sometieron a eutanasia al final del penodo de observacion (3 a 60 dfas). Despues de la eutanasia, los cerebros son retirados inmediatamente y congelados a -70°C. Los cerebros son cortados entonces en corona en secciones en serie de 20 jm de espesor sobre un criostato a -18°C hasta -20°C. Se cortan las secciones de tejido a lo largo del cerebro completo. Las secciones son tenidas con hematoxilina y eosina, azul rapido de Luxol y Nissl. Se lleva a cabo inmunohistoqmmica para la protema acida fibrilarmente glial.

45 Las caractensticas por MRI del conjugado Gd-dendnmero se investigan en primates. Varios primates Rhesus adultos (Macaca mulatta) experimentaron CED del conjugado Gd-dendnmero en la region pontino del bulbo raqrndeo. Despues de que se indujo anestesia en los animales, son intubados, y se da anestesia endotraqueal general con halotano. La temperatura del animal, la rata cardiaca, la saturacion de oxfgeno, las respuestas electrocardiograficas y el PCO2 tidal final son monitorizados. La cabeza del animal es asegurada entonces en un marco de estereotaxia Kopf. 50 Utilizando una tecnica esteril, se hace una incision de piel en la lmea media desde el punto anterior al posterior del vertex del craneo del animal. Se colocan retractores autorretenedores dentro de la herida para exponer el craneo subyacente. Se coloca una broca de perforacion, (1.0 cm) sobre el punto de entrada determinado estereotacticamente, y se hace una incision sobre la duramadre subyacente. La canula de grna externa (vease, figura 1; diametro externo

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0.027 pulgadas; diametro interno 0.020 pulgadas.) se coloca estereotacticamente a traves de la abertura dural a lo largo de la trayectoria diana a un nivel de 1.5 cm por encima del pontino diana deseado. La canula de grna externa es asegurada entonces en su lugar con metilmetacrilato. La canula interna (vease, figura 1; diametro externo 0.014 pulgadas; diametro interno 0.006 pulgadas.), despues de ser conectada al aparato de infusion, se coloca entonces a traves de la canula de grna externa hacia la diana (vease, figura 1). El animal es colocado entonces en el escaner de MR para estudios de generacion de imagenes durante la infusion.

De nuevo, para distribuir la infusion dentro del bulbo raqrndeo utilizando conveccion, se utilizo el sistema de administracion fuera de norma que fue descrito arriba. Se ejecuta la MRI en tiempo real del conjugado Gd-dendnmero. Despues de la colocacion de la canula de infusion, se obtienen imagenes de MR sopesadas T1 de corona para determinar la localizacion precisa de la canula interna. Una vez que se confirma la colocacion de la canula, se inician las infusiones y se obtienen imagenes de MR sopesadas T1 (1.5 Tesla) (espesor de seccion de 1 a 1.5 mm; espaciamiento de 0 mm) en 3 planos (sagital, axial, y de corona) a intervalos de aproximadamente 20 a 40 minutos hasta que se termina la infusion. Las imagenes de MR son analizadas en una Sun Workstation. Se calculan volumenes tridimensionales de distribucion (Vd) utilizando un umbral para segmentacion que es 2 veces la desviacion estandar del valor de intensidad de senal por encima de la senal de lmea base media para la region anatomica no infundida circundante. Para determinar la homogeneidad de la infusion sobre la Vd infundida, se obtienen perfiles de lmea a traves del centro de la infusion como se ve en las imagenes de corona. La validez y exactitud de estos metodos para calcular Vd y la homogeneidad a partir de imagenes de MR se confirman utilizando autorradiografia cuantitativa (QAR) como se describio en el Ejemplo 2.

Tambien se lleva a cabo la generacion de imagenes postinfusion. Varios primates experimentaron generacion de imagenes por MR en los dfas 0, 1, 2, 4, y 7 despues de la infusion del conjugado Gd-dendnmero. Se obtuvieron imagenes de MR sopesadas T1 (1.5 Tesla) (espesor de seccion 1 mm; espaciamiento de 0 mm) en 3 planos (sagital, axial, y de corona). Se calculo la Vd tridimensional y la homogeneidad de la infusion se determino como se describio previamente.

Los primates tambien fueron observados diariamente en cuanto a dificultades medicas o neurologicas a lo largo del penodo de estudio (18 a 35 dfas). Cada animal fue sometido a videograbacion postoperacion durante 48 horas despues de la terminacion de la infusion y durante 24 horas despues de la eutanasia.

Despues del sacrificio, los cerebros de los animales fueron perfundidos con solucion salina regulada con fosfato seguida porformalina al 10%. Los bulbos raqmdeos son cortados entonces por via de corona en secciones en serie de 20 pm de espesor. Las secciones de tejido a lo largo del bulbo raqrndeo son procesadas histologicamente, y se tinen secciones representativas de cada bloque de tejido con hematoxilina y eosina, azul rapido Luxol y Nissl. Se lleva a cabo inmunohistoqmmica para la protema acida fibrilarmente glial.

Se llevo a cabo analisis estadfstico con Stat View 5.0 (Abacus, Berkley CA).

Ejemplo 5

El metodo divulgado aqu involucra la administracion de un agente terapeutico a un tejido diana de un sujeto por CED y utilizando generacion de imagenes para seguir la administracion. Al seguir la administracion utilizando imagenes es posible administrar el agente terapeutico a sustancialmente solo el tejido diana. En general, cualquier agente terapeutico puede ser administrado de acuerdo con el metodo, y el agente puede ser administrado en una dosis que es terapeuticamente efectiva.

Un agente terapeutico o una composicion que comprende el agente terapeutico pueden ser administrados en cualquier dosificacion que alcance su proposito pretendido (una dosis terapeuticamente efectiva). Las cantidades y regfmenes para la administracion de las moleculas terapeuticas pueden ser determinadas facilmente por las personas con experiencia normal en el arte clmico del tratamiento de enfermedades. Las cantidades efectivas para uso terapeutico dependeran, desde luego, de la severidad de la enfermedad y del peso y el estado general de salud del paciente. Tfpicamente, las dosificaciones utilizadas in vitro pueden proveer una grna util en las cantidades utiles para la administracion in situ de la composicion farmaceutica, y pueden utilizarse modelos animales para determina dosificaciones efectivas para el tratamiento de trastornos particulares. Se describen diversas consideraciones, por ejemplo, en Gilman et al., eds., Goodman and Gilman: The Pharmacological Bases of Therapeutics, 8th ed., Pergamon Press, (1990); y Remington's Pharmaceutical Sciences, 17th ed., Mack Publishing Co., Easton, Pa., (1990).

Como se describio mas arriba, las dosis efectivas del agente terapeutico variaran dependiendo del agente terapeutico, la naturaleza y severidad de la condicion que va a ser tratada, la edad y condicion del paciente y otros factores clmicos. Asf, la determinacion final del regimen de tratamiento apropiado sera hecha por el medico tratante. Tfpicamente, el rango de dosis variara desde aproximadamente 0.1 pg/kg de peso corporal hasta aproximadamente 100 mg/kg de peso corporal. Otros rangos adecuados incluyen dosis desde aproximadamente 1 pg/kg a 10 mg/kg de peso corporal. La concentracion del trazador puede ser tan pequena como pueda ser detectada por MRI y/o CT, o dentro de un rango

que corresponde a las dosificaciones del agente terapeutico dadas mas arriba.

Las preparaciones farmaceuticas pueden comprender solamente un tipo de molecula terapeutica, o pueden estar compuestos de una combinacion de varios tipos de moleculas terapeuticas. Para CED, las formulaciones comprenden usualmente fluidos inyectables e incluyen fluidos farmaceuticos y fisiologicamente aceptables tales como agua, 5 solucion salina fisiologica, soluciones salinas balanceadas, dextrosa acuosa, glicerol y similares como vehnculo.

Ejemplo 6

Ademas para tratar desordenes del cerebro, el metodo por CED divulgado puede ser utilizado para tratar otros organos. Por ejemplo, la CED seguida por generacion de imagenes puede ser utilizada para tratar anormalidades de la piel, musculos (incluyendo el corazon), pulmones, rinon, hngado, pancreas, prostata, estomago, intestinos, colon y 10 organos sexuales tales como el utero, testfculos u ovarios. En un ejemplo, las condiciones del corazon caracterizadas por un ritmo irregular pueden ser tratadas por ablacion selectiva de celulas responsables de la generacion o conduccion de senales electricas aberrantes. Adicionalmente, el tratamiento selectivo de tumores localizados en cualquiera de los organos listados mas arriba puede lograrse mediante el metodo divulgado, beneficiandose de la capacidad demostrada de los metodos para administrar agentes terapeuticos a sustancialmente solo el tejido diana, 15 lo cual evita efectos toxicos indeseados en el tejido.

Claims (11)

1. 5

   10

   15

   20

   25

   30

   35

   40

   Reivindicaciones

   1. El uso de una solucion que contiene un trazador y un agente terapeutico para la manufactura de una solucion de medicamento para administrar a un tejido cerebral solido diana por infusion intersticial por conveccion a la vez que monitoriza la distribucion de la solucion de medicamento generando imagenes del trazador en la solucion de medicamento

   caracterizado porque la generacion de imagenes es por una tecnica de generacion de imagenes por MRI o CT y porque el trazador es

   (i) un quelato metalico de un ion metalico paramagnetico conjugado a una molecula portadora consistente de una albumina, un dendnmero de polialquilenimina, o un dendnmero de poliamidoamina; o

   (ii) un agente de contraste para CT yodado o

   (iii) un agente de contraste para CT yodado conjugado con el agente terapeutico o con una albumina.
2. 2. El uso de una solucion que contiene un trazador y un agente terapeutico como se reivindica en la reivindicacion 1, en donde la monitorizacion de la distribucion de la solucion y la generacion de imagenes del trazador comprende llevar a cabo MRI.
3. 3. El uso de una solucion que contiene un trazador y un agente terapeutico como se reivindica en la reivindicacion 1, en donde la monitorizacion de la distribucion de la solucion y la generacion de imagenes del trazador comprende llevar a cabo CT.
4. 4. El uso de una solucion que contiene un trazador y un agente terapeutico como se reivindica en las reivindicaciones 2 o 3, en donde el trazador es un quelato metalico de un ion lantanido paramagnetico.
5. 5. El uso de una solucion que contiene un trazador y un agente terapeutico como se reivindica en la reivindicacion 1, en donde el trazador es un quelato metalico de un ion metalico paramagnetico conjugado a una albumina de suero, preferiblemente el trazador es una albumina de suero conjugada a uno o mas quelatos 1B4M de ion gadolinio (III).
6. 6. El uso de una solucion que contiene un trazador y un agente terapeutico como se reivindica en la reivindicacion 1, en donde el trazador es seleccionado para tener una movilidad en el tejido solido que es sustancialmente similar al agente terapeutico.
7. 7. El uso de una solucion que contiene un trazador y un agente terapeutico como se reivindica en la reivindicacion 3, en donde el trazador es acido iopanoico o iopamidol, acido iopanoico o iopamidol conjugados a dicho agente terapeutico, o acido iopanoico conjugado a una albumina.
8. 8. El uso de una solucion que contiene un trazador y un agente terapeutico como se reivindica en la reivindicacion 1, en donde el trazador es un agente de contraste para CT por rayos X yodado conjugado al agente terapeutico.
9. 9. El uso de una solucion que contiene un trazador y un agente terapeutico como se reivindica en la reivindicacion 1, en donde el trazador es un agente de contraste para CT por rayos X yodado conjugado a una albumina.
10. 10. El uso de una solucion que contiene un trazador y un agente terapeutico como se reivindica en la reivindicacion 1, que comprende adicionalmente cesar la administracion de la solucion al tejido diana cuando la solucion es distribuida en un volumen predeterminado segun lo indica la imagen del trazador, calculando una correlacion entre un volumen de distribucion obtenido a partir de la imagen del trazador y un volumen de distribucion para el agente terapeutico, y utilizando la imagen del trazador y la correlacion para determinar si el agente terapeutico ha llenado un volumen predeterminado.
11. 11. El uso de una solucion que contiene un trazador y un agente terapeutico como se reivindica en la reivindicacion 1, en donde la monitorizacion comprende adicionalmente medir una intensidad de senal del trazador en el tejido diana y usar la intensidad de senal del trazador para calcular una concentracion del agente terapeutico en el tejido diana.