ES2628100T3

ES2628100T3 - Composiciones que comprenden matriz extracelular descelularizada obtenida a partir de tejido cardíaco

Info

Publication number: ES2628100T3
Application number: ES09818438.5T
Authority: ES
Inventors: Karen Christman; Jennifer Singelyn; Jessica Dequach
Original assignee: University of California Berkeley; University of California San Diego UCSD
Current assignee: University of California Berkeley; University of California San Diego UCSD
Priority date: 2008-09-30
Filing date: 2009-09-30
Publication date: 2017-08-01
Anticipated expiration: 2029-09-30
Also published as: EP3246038A1; GB201107203D0; WO2010039823A3; EP2349292A2; CN102227225A; US12090175B2; DK2349292T3; AU2009298560B2; WO2010039823A2; US20110189140A1; AU2009298560A1; EP2349292B1; HUE033504T2; GB2476624A; EP2349292A4; CN102227225B; CN106178118A; CA2741770A1; PL2349292T3; EP3246038B1

Abstract

Una composición líquida que comprende matriz extracelular descelularizada derivada de tejido cardíaco, en donde la composición es adecuada para administración a través de un catéter de aguja sin obstruir el catéter, en donde la matriz extracelular descelularizada se puede obtener mediante un método que comprende: (a) procesar una muestra de tejido cardíaco que tiene un componente de matriz extracelular y un componente de matriz no extracelular para separar el componente de matriz no extracelular para obtener matriz extracelular descelularizada; (b) liofilizar y pulverizar la matriz extracelular descelularizada en un polvo; (c) producir una composición que comprende el polvo de matriz extracelular descelularizada en un líquido; (d) digerir la matriz extracelular descelularizada en la composición de la etapa (c) con una enzima degradadora de la matriz a pH 1-6; y (e) neutralizar el pH de la matriz extracelular descelularizada digerida de la etapa (d) para producir la composición líquida; en donde la composición líquida se convierte en un gel a temperatura corporal.

Description

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Se describe una matriz biomimética obtenida de tejido cardíaco nativo. En algunos casos, una matriz se asemeja al ambiente cardíaco in vivo en que contiene muchas o todas las señales químicas nativas que se encuentran en la ECM cardíaca natural. En algunos casos, a través de reticulación o adición de otros materiales se pueden imitar también las propiedades mecánicas del miocardio sano adulto o embrionario. Como se describe en esta memoria, la ECM cardíaca se puede aislar y transformar en un gel usando un procedimiento simple y económico, que es susceptible de ampliarse para su traducción clínica.

En algunos casos, una composición como se proporciona en la presente invención puede comprender una matriz y células añadidas o incorporadas exógenamente. Las células pueden ser cualquier variedad de células. En algunos casos, las células son una variedad de células cardíacas o cardiovasculares que incluyen, pero no se limitan a: células madre, progenitores, cardiomiocitos, células vasculares, y fibroblastos obtenidos de fuentes autólogas o alogénicas.

La invención proporciona así una disolución que se convierte en un gel preparado a partir de matriz extracelular cardíaca descelularizada nativa, que se puede usar para soportar cardiomiocitos neonatales aislados o cardiomiocitos derivados de células madre progenitoras in vitro y actuar como un armazón gelificante in situ, proporcionando una matriz natural para mejorar la retención y supervivencia celulares en la pared del ventrículo izquierdo. Un armazón creado a partir de ECM cardíaca es muy adecuado para el trasplante de células en el miocardio, ya que se aproxima más completamente al ambiente in vivo en comparación con los materiales actualmente disponibles.

Una composición que comprende ECM cardíaca y células añadidas exógenamente se puede preparar cultivando las células en la ECM. Además, cuando se añaden proteínas tales como factores de crecimiento a la matriz extracelular, las proteínas se pueden añadir a la composición, o las moléculas proteicas pueden estar unidas de forma covalente

o no covalente a una molécula en la matriz. La unión covalente de proteína a moléculas de matriz se puede lograr mediante procedimientos estándar de unión covalente de proteínas conocidos en la técnica. La proteína puede estar covalentemente enlazada o unida a una o más moléculas de la matriz.

Cuando se administra una composición que comprende la ECM cardiaca descelularizada y células exógenas, las células pueden ser de fuentes celulares para tratar el miocardio que incluyen fuentes alogénicas, xenogénicas, o autógenas. En consecuencia, mediante una composición de la presente invención se pueden administrar células madre embrionarias no humanas, células madre derivadas de fetos o adultos, células madre pluripotentes inducidas, cardiomiocitos progenitores, cardiomiocitos fetales y neonatales, miofibroblastos, mioblastos, células mesenquimales, células parenquimatosas, células epiteliales, células endoteliales, células mesoteliales, fibroblastos, células madre hematopoyéticas, células progenitoras derivadas de la médula ósea, células esqueléticas, macrófagos, adipocitos, y cardiomiocitos expandidos autotrasplantados. En algunos casos, las células de la presente invención se pueden cultivar ex vivo y en el entorno de la placa de cultivo diferenciarse ya sea directamente a células del músculo cardíaco, o a células de la médula ósea que pueden convertirse en células del músculo cardíaco. Las células cultivadas se trasplantan después al mamífero, ya sea con la composición o en contacto con el armazón y otros componentes.

Las células madre adultas son además otra especie de células que pueden formar parte de una composición de la presente invención. Se cree que las células madre adultas funcionan generando otras células madre (por ejemplo, las apropiadas al miocardio) en un nuevo sitio, o se diferencian directamente a un cardiomiocito in vivo. También pueden diferenciarse en otros linajes después de la introducción a órganos tales como el corazón. El mamífero adulto proporciona fuentes para células madre adultas en células precursoras endoteliales circulantes, células derivadas de la médula ósea, tejido adiposo, o células de un órgano específico. Se sabe que las células mononucleares aisladas de aspirado de médula ósea se diferencian en células endoteliales in vitro y se detectan en los vasos sanguíneos recién formados después de inyección intramuscular. Por tanto, el uso de células de aspirado de médula ósea puede producir células endoteliales in vivo como un componente de la composición. Otras células que se pueden utilizar son células madre mesenquimales administradas con citoquinas activadoras. Se ha demostrado que subpoblaciones de células mesenquimales se diferencian hacia líneas celulares miogénicas cuando se exponen a citoquinas in vitro.

Cardiomiocitos derivados de células madre embrionarias no humanas pueden cultivarse en una composición de la presente invención que comprende una matriz cardíaca. En algunos casos, cardiomiocitos derivados de ESCs cultivados en presencia de una composición de la presente invención proporcionan una morfología más similar a in vivo. En algunos casos, cardiomiocitos derivados de ESCs cultivados en presencia de una composición de la presente invención proporcionan marcadores de maduración aumentados.

Se proporciona también un sistema de administración de fármacos que comprende una matriz extracelular cardíaca descelularizada para administrar células, fármacos, moléculas, o proteínas en un sujeto para tratar tejidos u órganos defectuosos, enfermos, dañados o isquémicos. El material biocompatible de la invención que comprende la matriz extracelular cardíaca descelularizada sola o en combinación con otros componentes se puede usar como un bloque de conducción no destructivo para el tratamiento de arritmias. Por tanto, el material biocompatible de la invención puede usarse para trasplantar células, o inyectarse solo para incorporar células nativas u otros agentes terapéuticos endógenos citoquinales, o actuar como un vehículo de administración de agente terapéutico exógeno.

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revestimiento para un injerto vascular de polímeros sintéticos. En algunos casos, la composición incluye un antibacteriano o se podrían incluir agentes antibacterianos.

Los métodos de la presente invención pueden comprender administrar la composición como un dispositivo de reparación de heridas. Por ejemplo, después de la ablación cardíaca, la composición puede administrarse para mejorar la cicatrización.

En un caso, una composición comprende una perla de alginato que está revestida con una composición de ECM como se describe en la presente memoria.

En algunos casos, la composición es inyectable. Una composición inyectable puede ser, sin limitación, un polvo, líquido, partículas, fragmentos, gel, o emulsión. La composición inyectable se puede inyectar en un corazón o en muchos casos inyectarse en el ventrículo izquierdo, ventrículo derecho, aurícula izquierda, aurícula derecha, o válvulas de un corazón. Las composiciones de la invención pueden incorporar, por ejemplo sin limitación, células endoteliales, del músculo liso, progenitores cardíacos, miofibroblastos, células madre, y cardiomiocitos.

Los métodos para producir las composiciones de la presente invención pueden incluir descelularizar tejido de cualquier animal o humano de edad por métodos bien conocidos en la técnica.

En algunos casos, una composición de la presente invención comprende ECM y un polímero sintético o natural. Por ejemplo, una composición de la presente invención comprende un polímero natural tal como colágeno, quitosano, alginato, glicosaminoglicanos, fibrina, o ácido hialurónico. En otro ejemplo, una composición de la presente invención comprende un polímero sintético, por ejemplo sin limitación, poli(etilenglicol), poli(ácido glicólico), poli(ácido láctico), polihidroxiácidos, poli(dioxanona), poli(caprolactona), poliortoésteres, polianhídridos, polifosfacenos, poliaminoácidos, pseudo-poliaminoácidos, polímeros conductores (tales como poli(acetileno), poli(pirrol), poli(anilina)), o poliuretano o sus copolímeros potenciales. En algunos casos, una composición de la presente invención comprende ECM y tanto un polímero natural como un polímero sintético. Una composición de la presente invención puede ser un material múltiple enlazando una ECM y otro material polimérico, por ejemplo, mediante reacción con aminas, tioles libres, o péptidos cortos que se pueden ensamblar con la ECM.

Los métodos para la administración de una composición que comprende una ECM pueden incluir, pero sin limitarse

a: inyección directa durante la cirugía; inyección directa a través de la pared torácica; administración a través de un catéter en el miocardio a través del endocardio; administración a través de vasos coronarios; y administración a través de catéter con balón de infusión. Una composición se puede administrar también en una formulación sólida, tal como un injerto o parche o asociada con un armazón celular. Las dosis y la frecuencia variarán dependiendo de las necesidades del paciente y del juicio del médico.

En algunos casos, una composición puede ser un revestimiento. Un revestimiento puede comprender una ECM de cualquier tejido, por ejemplo músculo cardíaco, músculo esquelético, pericardio, hígado, tejido adiposo, y cerebro. Se puede usar un revestimiento para aplicaciones de cultivo de tejidos, tanto de investigación como clínicas. El revestimiento se puede usar para revestir, por ejemplo sin limitación, armazones/materiales sintéticos u otros productos biológicos, o implantes. En algunos casos, un revestimiento se texturiza o modela. En algunos casos, un método para producir un revestimiento incluye adsorción o enlace químico. Se puede formar un gel fino o revestimiento adsorbido usando una forma de disolución de ECM de la composición. En algunos casos, una composición de la presente invención se configura para sellar agujeros en el corazón tales como defectos de septo.

Las composiciones pueden usarse como revestimiento para productos biológicos, dispositivos médicos o dispositivos de administración de fármacos.

La matriz extracelular consiste en una red compleja, específica de tejidos, de proteínas y polisacáridos, que ayudan a regular el crecimiento, supervivencia y diferenciación celulares. A pesar de la naturaleza compleja de la ECM natural, los estudios celulares in vitro tradicionalmente evalúan el comportamiento de las células sobre revestimientos con componentes ECM individuales, lo que plantea limitaciones al traducir los hallazgos de estudios celulares in vitro al entorno in vivo. Normalmente, las proteínas de matriz purificadas de diversas fuentes animales se adsorben en sustratos de cultivo celular para proporcionar un sustrato proteico para la fijación celular y para modificar el comportamiento celular. Sin embargo, estos enfoques no proporcionarían una representación exacta del microambiente complejo. Se han usado revestimientos más complejos, tales como una combinación de proteínas individuales, y aunque estas señales combinatorias han demostrado que afectan al comportamiento celular, no es tan completa como in vivo. Para una matriz más natural, se han usado matrices derivadas de células. Matrigel es un sistema complejo; sin embargo, se deriva del sarcoma de ratón y no imita a ningún tejido natural. Aunque muchos componentes de la ECM son similares, cada tejido u órgano tiene una composición única, y una fuente derivada naturalmente y específica de un tejido puede resultar ser una mejor imitación del microambiente celular.

La matriz extracelular (ECM) consiste en una red compleja, específica de tejidos, de proteínas y polisacáridos, que ayudan a regular el crecimiento, supervivencia y diferenciación celulares. A pesar de la naturaleza compleja de la ECM muscular, los estudios celulares in vitro tradicionalmente evalúan el comportamiento de las células musculares en revestimientos de componentes ECM individuales, lo que plantea limitaciones al traducir los hallazgos de estudios celulares in vitro al entorno in vivo. La superación de esta limitación es importante para las terapias

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mediadas por células, que dependen de células cultivadas y expandidas que conservan el comportamiento de las células nativas con el tiempo.

En la presente memoria se describe una composición que comprende ECM que se obtiene de músculo esquelético y cardíaco de porcino. La composición se puede desarrollar para revestir sustratos para una variedad de aplicaciones. En algunos casos, la ECM de la composición retiene una mezcla compleja de componentes ECM específicos de músculo tras la disolución. En algunos casos, los revestimientos de la presente invención pueden emular de manera más apropiada la ECM de músculo nativo in vitro.

La Figura 2 ilustra el área miofibrilar media de cardiomiocitos que era significativamente mayor cuando se cultivaron en ECM cardíaca en comparación con el revestimiento estándar de gelatina. La Figura 3 ilustra que el número medio de cardiomiocitos fue significativamente mayor en ECM cardíaca en comparación con el revestimiento estándar de gelatina. Como se ilustra en la Figura 4, la desmoplaquina, una proteína de unión intracelular, se localizó específicamente entre cardiomiocitos y formó desmosomas organizados el día 112 en ECM cardíaca, pero no en gelatina.

Como se describe en la presente memoria, se puede crear una matriz de músculo esquelético de la misma manera o de manera similar a la ECM cardíaca. Aunque no según la presente invención, la matriz de músculo esquelético se pudo inyectar en músculo esquelético para ingeniería del tejido muscular esquelético. La Figura 5 ilustra mioblastos esqueléticos cultivados en matriz de músculo esquelético como se describe en la presente memoria, que demostró un aumento del tamaño de los miotubos, mayor diferenciación, y tenía más núcleos por miotubo que los mioblastos cultivados en colágeno. Usando un ensayo de migración transwell, in vitro, los mioblastos esqueléticos migran específicamente hacia la matriz del músculo esquelético como se ilustra en la Figura 6.

La invención se ilustra adicionalmente mediante los ejemplos siguientes, que no deben interpretarse en modo alguno como limitaciones impuestas sobre el alcance de la misma. Es evidente para los expertos en la técnica que son posibles diversas modificaciones y cambios y se consideran dentro del alcance de la presente invención siempre que estén dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas.

Ejemplo 1

Diversos estudios para tratar el MI han investigado la inyección de células directamente en la pared del infarto, aunque muchos estudios han mostrado tasas de supervivencia deficientes. El objetivo de este estudio es examinar el uso de un gel como plataforma de crecimiento para la adhesión, crecimiento, maduración y administración celulares in vivo. Se prevé que un gel compuesto de tejido de matriz extracelulular cardíaca nativa puede ayudar en la regeneración de tejido cardíaco promoviendo la supervivencia celular.

A ratas hembra Sprague Dawley se les aplicó la eutanasia y sus corazones se descelularizaron usando un procedimiento modificado de Ott et al. (Nature Medicine, 14(2), 213, 2008). Los corazones descelularizados se liofilizaron después, se rehidrataron, se pulverizaron, y se liofilizaron de nuevo para formar un polvo seco. La ECM se digirió entonces mínimamente en pepsina y se neutralizó, como se modificó a partir de Freytes et al. (Biomaterials

29: 1630, 2008).

Más específicamente, las ratas Sprague Dawley hembra adultas fueron heparinizadas y anestesiadas intraperitonealmente con pentobarbital. Se cortó la aorta y la arteria pulmonar y se extrajo el corazón. La aorta se canalizó y se unió a un sistema de Langendorff modificado.

El corazón se descelularizó usando una técnica modificada publicada previamente. Brevemente, los vasos coronarios del corazón se perfundieron por vía retrógrada con una disolución de dodecilsulfato sódico al 1% y PBS durante 24 horas y después una disolución de triton al 1% en PBS durante 30 minutos. Una vez completada la descelularización, el corazón se enjuagó con agua desionizada y se liofilizó en un liofilizador.

Los corazones congelados se rehidrataron con agua y luego se sumergieron en nitrógeno líquido. Una vez congelados, las corazones se aplastaron sistemáticamente dentro de un aparato de bola y copa a 70 psi (482,65 kPa) durante 10 segundos. Las partículas de corazón pulverizadas se liofilizaron después. Una vez seco, el tejido cardíaco liofilizado se combinó con pepsina al 1% y se mezcló con HCl 0,01 M a una concentración de 10 mg/mL. La disolución se agitó a temperatura ambiente durante 48 horas para permitir la disolución del tejido de la matriz extracelular. Después de 48 horas, la disolución de HCl se dividió en alícuotas en tubos Eppendorf sobre hielo y se neutralizó con NaOH 0,1 N a pH 7,4.

A través de los métodos descritos anteriormente, se ha formado un gel nativo de ECM cardíaca de rata. La gelificación exitosa de geles de 2,5-8 mg/mL se produjo en 15 minutos, como se confirma por la mayor naturaleza viscosa del material. Se observó mayor rigidez con geles de mayor densidad.

La disolución neutralizada se diluyó a la concentración con 1 x PBS, se distribuyó en una placa de 96 pocillos a 50 L por pocillo, y después se transfirió a una incubadora a 37C y CO2 al 5%. Después de que se había formado el gel, 100 L de células cardiomiocitos nenonatales aisladas 2d se pipetearon en la parte superior del gel a 60.000 células por pocillo. Después de varios días se examinaron las células para detectar la adherencia a los geles.

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Después de que el tejido de la matriz extracelular cardíaca se había descelularizado, pulverizado y digerido, se formó un gel una vez que la disolución se había llevado a condiciones fisiológicas (pH = 7,4, 37C). Los geles formados con mayores concentraciones de tejido de ECM en disolución eran más rígidos y más opacos que los geles formados con concentraciones más pequeñas de ECM. Las células en placas de cultivo sobre geles fueron capaces de adherirse y sobrevivir sobre los geles.

La siembra de cardiomiocitos en placas sobre los geles de ECM cardíaca a 1x104 mostró una supervivencia y adherencia satisfactorias de las células a la ECM. Las células se cultivaron en la ECM durante un período de hasta cuatro días.

Se inyectaron cien mL de disolución de ECM cardíaca (7 mg/mL) a través de una aguja de 30G en la pared libre del LV de una rata anestesiada. El presente estudio muestra que la matriz extracelular de corazón nativa se puede aislar, disolverse y auto-ensamblarse en un gel cuando se lleva a pH y temperatura fisiológicos. Puesto que el gel contiene todos los componentes de la matriz extracelular nativa, aunque estén revueltos, se prevé que esta matriz permite la adherencia y crecimiento satisfactorios de cardiomiocitos in vitro y también una vez inyectada in vivo. Además, se cree que un gel compuesto de la matriz obtenida originalmente de los ventrículos cardíacos soporta el crecimiento de cardiomiocitos más satisfactoriamente que otras matrices tales como geles de colágeno o de fibrina, ya que imita más completamente el entorno cardíaco in vivo.

Un gel inyectable puede conformarse potencialmente en cualquier forma tridimensional y mejorar la supervivencia del trasplante celular dentro del corazón. Los cardiomiocitos inyectados o células que pueden diferenciarse en cardiomiocitos pueden ayudar a la regeneración del tejido del corazón, mejorar el rendimiento cardíaco. El método desarrollado para crear una plataforma de geles de ECM cardíaca nativa con concentración y rigidez variadas proporciona también una plataforma in vitro para el crecimiento celular y como un armazón de ingeniería in situ para generación. La ECM nativa proporciona el ambiente complejo apropiado cuando se inyecta in vivo para aumentar la retención celular y promover la regeneración tisular para ingeniería del tejido miocárdico.

Ejemplo 2

Se han cultivado típicamente cardiomiocitos sobre superficies revestidas con una o posiblemente varias proteínas de matriz extracelular (ECM). Sin embargo, in vivo, existen cardiomiocitos en un medio extracelular altamente complejo; una ECM que imita más completamente este ambiente nativo puede ser beneficiosa para la supervivencia de los cardiomiocitos en cultivo. En esta memoria se describe el uso de ECM cardíaca nativa que se ha disuelto como un revestimiento para cultivo celular de cardiomiocitos neonatales.

Se extrajeron corazones de ratas Sprague-Dawley y se descelularizaron usando un sistema de Langendorff modificado (modificado de Ott et al., 2008). Los corazones descelularizados se liofilizaron, rehidrataron y pulverizaron tras congelación en N2 líquido. La ECM se digirió mínimamente en pepsina en HCl 0,01 M. Después de 48 horas, se añadió ácido acético 0,01 M para producir la concentración final de 1 mg/ml.

Se cosecharon miocitos cardíacos a partir de ventrículos recién disecados de ratas Sprague-Dawley de 1 a 2 días usando un estuche de aislamiento (Cellutron, Highland Park, NJ). El sobrenadante inicial se desechó, pero las subsiguientes digestiones de 20 minutos se colaron y suspendieron en DMEM suplementado con M199 al 17%, suero equino al 10%, suero bovino fetal al 5%, y penicilina/estreptomicina al 1%. Después del aislamiento, el sobrenadante se pre-sembró en placas de poli(estireno) de cultivo tisular para aumentar la pureza de los cardiomiocitos a través de la adherencia selectiva de fibroblastos.

Se adsorbió 1 mg/ml de ECM cardíaca nativa o colágeno I (Sigma, St. Louis, MO) sobre cubreobjetos de vidrio durante una hora a 37C. Se sembraron en placas cardiomiocitos neonatales aislados a una densidad de 200.000/cm2 y se cambió el medio a bajo mantenimiento sérico después de 24 horas (DMEM, M199 al 18,5%, HS al 5%, FBS al 1% y antibióticos). Los cultivos celulares se mantuvieron a 37C y CO2 al 5%, se monitorizaron diariamente, y se intercambiaron medios de mantenimiento de nueva aportación cada 2-3 días.

Los cardiomiocitos se adhirieron a la ECM nativa adsorbida, y formaron una capa parcialmente confluente. Inicialmente, los cardiomiocitos se adherían con una densidad similar al revestimiento de colágeno.

Ambos cultivos celulares comenzaron a latir espontáneamente el día 3 después de sembrarlos en placas. Los cardiomiocitos cultivados en colágeno comenzaron a separarse el día 12 y dejaron de latir el día 14. Sin embargo, los cardiomiocitos cultivados en la ECM cardíaca nativa formaron fibrillas claramente definidas, que latieron a la misma velocidad hasta el día 28.

Este estudio demostró que el uso de ECM cardíaca nativa para cultivo de cardiomiocitos es útil porque imita más completamente las condiciones in vivo. El estudio también prevé que los cardiomiocitos neonatales se adhieren y continúan funcionando más tiempo en la ECM cardíaca nativa que en el típico revestimiento de colágeno. Este nuevo revestimiento superficial es beneficioso para el cultivo de cardiomiocitos derivados de células madre así como progenitores cardíacos.

Ejemplo 3

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La electroforesis en gel revela una digestión incompleta de ECM cardíaca nativa mediante HCl 0,01 M. Las digestiones de ECM cardíaca en HCl 0,1 M mostraron una mayor degradación. Así, se demostró que las condiciones ácidas más fuertes mejoran la digestión y gelificación de las disoluciones de ECM cardíaca. La comparación de la ECM cardíaca con colágeno de cola de rata demuestra la presencia de diversos péptidos adicionales en la ECM cardíaca.

Se usó microscopía electrónica de barrido para visualizar la estructura de la forma de gel de matriz extracelular cardíaca. Los geles se fijaron con glutaraldehído al 2,5% durante 2 horas, seguido por una serie de enjuagues con etanol (30-100%), y se secaron por puntos críticos. Las muestras se revistieron con cromo mediante pulverización catódica antes de la formación de imágenes.

Se inyectó con éxito ECM nativa disuelta a una concentración de 6 mg/mL de ECM cardíaca a través de una aguja de 30G en la pared libre de LV de rata, creando un armazón gelificado in situ, al que los cardiomiocitos se adhieren y proliferan.

Ejemplo 5

Se probaron in vitro las propiedades quimioatractivas de la disolución de ECM descelularizada cardíaca usando un estuche de ensayo de migración disponible comercialmente. En resumen, células endoteliales de arteria coronaria humana (HCAECs) y células de músculo liso aórtico de rata (RASMCs) fueron privadas de suero y se evaluó la migración hacia la matriz, colágeno, pepsina, y suero bovino fetal. Las RASMCs muestran una migración significativa hacia la matriz, mientras que las HCAECs muestran una tendencia. Así, las señales bioquímicas de la matriz tienen propiedades quimioatractivas que podrían promover la infiltración celular in vivo.

In vivo, se cuantificó la formación de arteriolas dentro de la región inyectada para evaluar la formación neovascular. La densidad de arteriolas fue significativamente mayor a los 11 días después de la inyección, en comparación con 4 horas después de la inyección.

Ejemplo 6

Se ha demostrado que varios tipos de células preservan la función cardíaca cuando se inyectan en la pared miocárdica después de un MI. Sin embargo, un tratamiento acelular podría eliminar las complicaciones de una deficiente supervivencia celular y de la respuesta inmune, común con las terapias celulares.

Se indujo infarto de miocardio en ratas usando un modelo de isquemia-reperfusión de 25 min, mediante la oclusión de la arteria descendente anterior izquierda. Al cabo de una semana se calculó la función basal post-MI a partir de imágenes por resonancia magnética MRI.

Se descelularizó ECM miocárdica de porcino en pequeños trozos, en SDS al 1% durante varios días, seguido de un enjuague DI durante la noche, liofilización y molienda para crear un polvo. La digestión se realizó en HCl 0,1 M con pepsina para crear una forma disuelta del material.

La ECM disuelta se llevó a pH 7,4 usando NaOH 1 M y se diluyó con PBS para ser 6 mg/mL antes de la inyección. Tras la cirugía del MI, los animales se distribuyeron al azar en dos grupos y se inyectó ECM o disolución salina en la pared libre de LV de ratas Sprague Dawley hembra a través de una aguja de 30G, dos semanas después de la cirugía de infarto.

4 semanas después de la cirugía de inyección (6 semanas después del MI), la función cardíaca se evaluó de nuevo mediante MRI (imágenes por resonancia magnética).

Los animales inyectados con ECM mostraron una función preservada (según se evaluó basándose en la fracción de eyección) a las 6 semanas, mientras que los animales inyectados con disolución salina no mantuvieron la función cardíaca. El volumen diastólico final y el volumen sistólico final también se preservaron en los animales inyectados con ECM.

Ejemplo 7

Actualmente, las células madre y otros tipos de células están en ensayos clínicos para el tratamiento de la insuficiencia cardíaca mediante administración a través de un catéter de 27G en la pared del miocardio. Se descelularizó tejido ventricular de porcino usando detergentes SDS, y se procesó para formar una forma disuelta de la matriz, y se neutralizó a pH fisiológico y se diluyó a 6 mg/mL para inyección.

Dos cerdos Yorkshire recibieron un infarto de miocardio inducido por bobina y fueron inyectados con matriz miocárdica sola o con células a los dos meses después del infarto.

Derivados de explantes cardíacos fetales se pre-etiquetaron con DiI, una mancha citoplasmática, para identificación histológica. Se utilizó un cóctel pro-supervivencia, que demuestra que mejora la supervivencia de las hESCs en un modelo de roedor.

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pepsina en condiciones de baja acidez y después se diluyó usando ácido acético 0,1 M para llevarla a la concentración deseada de 1 mg/ml. Se usó electroforesis vertical en geles de poli(acrilamida) y se demostró una mezcla compleja de fragmentos peptídicos en cada tipo de tejido, que varió de un tejido a otro. Esto demuestra que existen componentes específicos de tejido en la ECM descelularizada.

Estos revestimientos se pueden aplicar a superficies de la misma manera que los revestimientos típicos de una sola proteína. Cultivando células en revestimientos específicos de tejidos que imitan el microambiente de la matriz extracelular in vivo, hubo un mejor control de la supervivencia y morfología celular, y diferenciación aumentada.

Se cultivaron neuronas corticales de rata en matriz cerebral y se compararon con un revestimiento estándar de poli-llisina. Las neuronas corticales de rata sobrevivieron y conservaron su morfología ramificada más tiempo en un revestimiento de matriz cerebral en comparación con el revestimiento estándar. También se observó una mayor diferenciación porcentual y mayor anchura de miotubo cuando se cultivaron mioblastos esqueléticos en un revestimiento de matriz de músculo esquelético en comparación con el revestimiento estándar de colágeno. Finalmente, los cardiomiocitos derivados de células madre embrionarias humanas mostraron mayor organización y maduración, incluyendo la formación de uniones célula-célula cuando se sembraron en placas sobre un revestimiento de matriz cardíaca en comparación con el típico revestimiento de gelatina.

Estos estudios indican la importancia de usar imitadores de matriz extracelular para cultivo celular, con implicaciones para muchos estudios celulares in vitro, que incluyen la promoción de la maduración y diferenciación de células madre.

Ejemplo 10

En este caso, se investiga el uso del gel que se describe en la presente memoria en donde el gel se prepara a partir de ECM nativa de músculo esquelético descelularizado. Tales ECM no están de acuerdo con la invención. El gel puede actuar como un armazón de gelificación in situ, proporcionando una matriz natural de músculo esquelético para mejorar la regeneración de tejido en un modelo de lesión de pierna. La ventaja es que la ECM de músculo esquelético tiene componentes similares a la matriz hallada in vivo, y puede proporcionar una plataforma adecuada para la ingeniería y regeneración de tejidos, incorporación de células, y administración celular.

Se descelularizó músculo esquelético de porcino. El tejido se cortó en rodajas para ser de 2 mm de espesor y se enjuagó con agua desionizada, después se agitó en dodecilsulfato sódico (SDS) al 1% en PBS hasta descelularizar. El tejido descelularizado se enjuagó después en agua desionizada para asegurar la separación de los detergentes. Se seccionaron trozos de tejido descelularizado y se tiñeron usando hematoxilina y eosina para asegurar la separación de las células. El tejido descelularizado se liofilizó después y se molió para formar un polvo fino.

La ECM de músculo esquelético se digirió después en pepsina en condiciones de baja acidez, y luego se neutralizó a pH fisiológico o casi fisiológico a través de la adición de hidróxido sódico y 10X PBS. La disolución neutralizada de ECM de músculo esquelético se diluyó después con PBS a la concentración deseada de 6 mg/ml y se dejó gelificar en placas de 96 pocillos a 37C. La gelificación satisfactoria se confirmó mediante inspección visual del material.

ECM nativa de músculo esquelético disuelta a una concentración de 6 mg/ml se inyectó satisfactoriamente a través de una aguja de 25G en músculo femoral de pata de rata creando un armazón gelificado. La gelificación se produjo en 10-15 minutos. Se extirpó el músculo y la ECM y se seccionó y tiñó usando hematoxilina y eosina para confirmar la gelificación satisfactoria de la ECM de músculo esquelético en el músculo.

También se puede usar ECM de músculo esquelético para suministrar células, tales como mioblastos esqueléticos u otros tipos de células relevantes de músculo en la ECM.

Realizaciones preferidas de la presente invención se han mostrado y descrito en la presente memoria.

Claims

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