ES2674361T3

ES2674361T3 - Combinación de un inhibidor de ALK y un inhibidor de CDK para el tratamiento de enfermedades celulares proliferativas

Info

Publication number: ES2674361T3
Application number: ES14766301.7T
Authority: ES
Inventors: Jennifer Leslie Harris; Nanxin LI; Timothy R. Smith
Original assignee: Novartis AG
Current assignee: Novartis AG
Priority date: 2013-08-28
Filing date: 2014-08-28
Publication date: 2018-06-29
Anticipated expiration: 2034-08-28
Also published as: WO2015031666A1; JP2016529285A; US20160361314A1; US20180318305A1; EP3038652B1; AU2014312261A1; AU2018236813A1; JP6479812B2; CA2922684A1; KR20160047521A; AU2017219093A1; CN106029099A; RU2016110874A; EP3038652A1; RU2016110874A3; BR112016004358A8; MX2016002580A

Abstract

Una combinación farmacéutica que comprende, juntos o por separado, (a) un primer agente que es (i) Compuesto A1, descrito por la Fórmula A1 a continuación:**Fórmula** o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo,**Fórmula** o (ii) Compuesto A2, descrito por la Fórmula A2 a continuación**Fórmula** o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, y (b) un segundo agente que es Compuesto B, descrito por la Fórmula B a continuación**Fórmula** o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, para uso en el tratamiento de neuroblastoma.

Description

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DESCRIPCIÓN

Combinación de un inhibidor de ALK y un inhibidor de CDK para el tratamiento de enfermedades celulares proliferativas.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a una combinación farmacéutica que comprende un inhibidor de ALK y un inhibidor de CDK; como se define en las reivindicaciones, para uso en el tratamiento de neuroblastoma

Antecedentes de la invención

Inhibidores de ALK

La quinasa del linfoma anaplásico (ALK) es un miembro de la superfamilia de receptores de insulina de las tirosina quinasas receptoras. Esta proteína comprende un dominio extracelular, un tramo hidrófobo que corresponde a una región de transmembrana de un solo pase, y un dominio de quinasa intracelular. Este desempeña un papel importante en el desarrollo del cerebro y ejerce sus efectos sobre neuronas específicas en el sistema nervioso, y normalmente se expresa en el tejido nervioso en desarrollo. Las alteraciones genéticas de ALK han sido implicadas en la oncogénesis en tumores hematopoyéticos y no hematopoyéticos. Se encontró que el gen se ha reordenado, mutado, o amplificado en una serie de tumores incluyendo linfomas anaplásicos de células grandes, neuroblastoma y cáncer de pulmón de células no pequeñas. La expresión aberrante de proteínas receptoras de ALK de longitud completa se ha reportado en neuroblastomas y glioblastomas; y proteínas de fusión ALK se han producido en linfoma de células grandes anaplásicas. Mientras que los reordenamientos cromosómicos son las alteraciones genéticas más comunes en el gen ALK, la amplificación de ALK se ha mostrado en los cánceres de mama y cánceres esofaríngeos. El desarrollo de compuestos que selectivamente se dirigen a ALK en el tratamiento de tumores positivos para ALK es por lo tanto potencialmente altamente deseable. Unos pocos inhibidores de moléculas pequeñas de la actividad de quinasa de ALK se han descrito en los últimos años, por ejemplo, en el documento WO 2008/073687 A1; algunos de los cuales están actualmente en la fase de evaluación clínica. Crizotinib, un inhibidor de la tirosina quinasa de cMET y AKT ha sido aprobado para pacientes con cáncer pulmonar avanzado de células no pequeñas ALK-positivo; inhibidores de ALK más potentes podrían seguir en breve.

Inhibidores de CDK

Las quinasas dependientes de ciclina (CDK) es una gran familia de proteínas quinasas. Las CDK regulan la iniciación, progresión, y la finalización del ciclo celular en mamíferos. La función de las CDKs es fosforilar y por lo tanto activar o desactivar ciertas proteínas, incluyendo por ejemplo, proteínas de retinoblastoma, laminas, histona H1, y componentes del huso mitótico. El paso catalítico mediado por CDKs involucra una reacción de transferencia de fosforo desde ATP al sustrato enzimático macromolecular.

El desarrollo tumoral está estrechamente asociado con alteración genética y desregulación de CDKs y sus reguladores, indicando que los inhibidores de las CDKs pueden ser terapéuticos anti-cáncer útiles. En realidad, los primeros resultados indican que las células transformadas y normales difieren en su requerimiento por ejemplo, ciclina D/CDK4/6 y que es posible desarrollar nuevos agentes antineoplásicos desprovistos de la toxicidad hospedera general observada con fármacos citotóxicos y citostáticos convencionales. Se ha encontrado que varios grupos de compuestos (revisado, por ejemplo, en Fischer, P. M. Curr. Opin. Drug Discovery Dev. 2001, 4, 623-634) poseen propiedades anti-proliferativas en virtud del antagonismo de ATP específico de la CDK. Por lo tanto, el desarrollo de monoterapias para el tratamiento de trastornos proliferativos, tales como cánceres, utilizando terapéuticos dirigidos genéricamente a CDKs, o a CDKs específicos, es potencialmente altamente deseable. Los inhibidores de CDK son conocidos y las solicitudes de patente se han presentado en dichos inhibidores; por ejemplo, WO2007/140222, WO2010/020675, y WO2011/101409.

Bonvini et al. divulgan en Haematologica, 2009, 84 (7), 944-955 que la combinación del inhibidor de CDK flavopiridol y el inhibidor de molécula pequeña ALK WHI-154 induce una apoptosis rápida en células de linfoma anaplásico de células grandes (ALCL).

Se han hecho intentos por preparar compuestos que inhiben, ya sea la ALK o CDK4/6, y un número de tales compuestos se han divulgado en la técnica. Sin embargo, en vista del número de respuestas patológicas que están mediadas por ALK y CDK4/6, sigue habiendo una necesidad continua de agentes terapéuticos efectivos y seguros y una necesidad de su uso preferente en terapia de combinación. Sorprendentemente, se ha

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encontrado que un inhibidor de ALK provoca una fuerte actividad antiproliferativa y una respuesta antitumoral in vivo en combinación con un inhibidor de CDK 4/6. La presente invención se relaciona con la terapia de combinaciones específicas para el tratamiento de enfermedades proliferativas, que son neuroblastomas.

Resumen de la invención

La presente invención se refiere a una combinación farmacéutica, por separado o conjuntamente, que comprende (1) un primer agente que es un inhibidor de ALK o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, y (2) un segundo agente que es un inhibidor de CDK o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo. La divulgación también se refiere a esta combinación farmacéutica para uso en el tratamiento de una enfermedad proliferativa.

En un aspecto, la presente invención se refiere a una composición farmacéutica, por separado o juntos, que comprende (1) un primer agente que es un inhibidor de ALK que es el Compuesto A1, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo; o Compuesto A2, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, y (2) un segundo agente que es un inhibidor de CDK que es el Compuesto B, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en donde el Compuesto A1, el Compuesto A2 y el Compuesto B son como se define en las reivindicaciones, para usar en el tratamiento del neuroblastoma.

La presente invención también proporciona realizaciones adicionales como se describe en las reivindicaciones.

La divulgación también se refiere a un método para tratar una enfermedad proliferativa, cuyo método comprende administrar a un paciente que lo necesita, una cantidad terapéuticamente efectiva de un primer agente que es un inhibidor de ALK y una cantidad terapéuticamente efectiva de un segundo agente que es un inhibidor de CDK, en donde el primer y el segundo agente se administran simultáneamente, por separado o secuencialmente.

Descripción detallada de las figuras

La figura 1 ilustra con datos hipotéticos cómo las interacciones sinérgicas potenciales en combinaciones de compuestos pueden evaluarse a partir del resultado del software CHALICE basado en el modelo de Aditividad de Loewe. La figura de la izquierda es un gráfico de Matrix de dosis, donde cada bloque individual de la matriz de 7x7 reporta el porcentaje de inhibición (muerte celular) por el tratamiento con fármacos. La inhibición mediante solo el compuesto individual de tratamiento se informó en la columna más a la izquierda para el Agente A y la fila inferior para el agente B; los datos se normalizaron para la inhibición mediante el control de vehículo, que se establece en 0 (el valor donde ambas concentraciones del Agente A y el Agente B son 0). La figura de la derecha es una representación gráfica de la matriz de exceso de Loewe, donde cada bloque individual informa el exceso de inhibición comparando los datos experimentales en la matriz de dosis con un valor de inhibición esperada generado por el modelo de aditividad de Loewe. Desde este punto, la sinergia se define como valores >0, aditivo se define como valores = 0 y el antagonismo se define como valores <0. Los bloques resaltados identifican combinaciones donde se observa sinergia en los datos experimentales.

La figura 2 muestra gráficos de matriz CHALICE demostrando los efectos de la dosis (% de inhibición) del co- tratamiento con el compuesto A1 y el compuesto B (fila superior), el compuesto A1 autocruzado (fila media) y el compuesto B auto-cruzado (fila de abajo) en la inhibición de las células de neuroblastoma humanas LAN-1.

La figura 3 muestra un diagrama de cuadros que proporciona un resumen visual de las puntuaciones de sinergia de las combinaciones de fármacos en 15 líneas celulares de neruoblastoma de la enfermedad (mutante para alk) y normales (tipo Silvestre) (véanse los datos en las Tablas 2 y 3). En este gráfico, se incluyeron las puntuaciones de sinergia generadas a partir de los inhibidores ALK, Compuestos A1 y A2, pero no el Compuesto A3. Como se utiliza en la presente, un inhibidor de ALK se refiere al Compuesto A1 o Compuesto A2, y el inhibidor de CDK4/6 se refiere al Compuesto B. Cada cuadro representa el rango de puntuaciones de sinergia de un régimen de tratamiento particular, (ALK x CDK, autocruce de ALK, o auto-cruce de CDK); la línea blanca horizontal dentro del cuadro representa la media del grupo y la línea continua vertical representa la desviación estándar de grupo. Los círculos continuos representan los valores atípicos.

Las figuras 4A, 4B y 4C muestran gráficos de dispersión que proporcionan la identificación visual de combinaciones sinérgicas "hit". Los valores de eficacia de combinación máxima se representaron frente a las puntuaciones de sinergia de combinaciones de un inhibidor de ALK y un inhibidor de CDK4/6, inhibidores de ALK se auto-cruzan, e inhibidores de CDK4/6 se autocruza en 15 líneas celulares de neruoblastoma de la enfermedad (mutante para alk) y normales (tipo Silvestre) (véanse los datos en las Tablas 2 y 3). En estos

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gráficos, se representaron sólo los datos generados con los Compuestos A1 y A2; es decir, como se utiliza en la presente, el inhibidor de ALK se refiere al Compuesto A1 o Compuesto A2, y el inhibidor de CDK4/6 se refiere al Compuesto B. La Figura 4A es un gráfico de dispersión de los datos del autocruce de los dos inhibidores de ALK, compuestos A1 y A2 en 15 líneas celulares. El gráfico muestra la eficacia del agente único preferencial para la enfermedad ALK. La figura 4B es el gráfico de dispersión de los datos del autocruce del inhibidor de CDK, el Compuesto B. El gráfico muestra la eficacia o sinergia mínima del agente único. La Figura 4C es el gráfico de dispersión de los datos de combinaciones de cualquiera de los inhibidores de ALK, los compuestos A1 y A2, con el inhibidor de CDK, Compuesto B. El gráfico muestra la interacción que conduce tanto a sinergia como a la eficacia mejorada en cuatro líneas celulares de enfermedad (Lan-5, Kelly , Lan-1, NB-1643, y dos normales (NB-1, SK-N-BE).

Las figuras 5A, 5B, 5C y 5D muestran ejemplos típicos de gráficos de combinación de fármacos y sus interpretaciones basadas en el teorema del índice de combinación de Chou y Talalay. La figura 5A es un gráfico Fa-CI para la proporción de combinación constante. CI como se define por Chou de acuerdo con la siguiente ecuación: CI = (D)i / (Dx)i + (D)2 / (Dx)2 donde (Dx)i y (Dx)2 son las concentraciones de compuestos y D2 necesarias para producir un determinado nivel de efecto antiproliferativo cuando se utiliza individualmente, mientras que (D)i y (D)2 son sus concentraciones que producen el mismo efecto antiproliferativo cuando se utilizan en combinación. El índice de combinación es una medida cuantitativa de la interacción de fármacos definida como un efecto aditivo (CI =1), antagonismo (CI> 1), o sinergia (CI <1). Fa significa que la fracción afectada se define como la fracción de células afectadas por la concentración dada de los compuestos solos o en combinación. Fa =0 está determinado con base en el control de DMSO mediante la dosis, y Fa = 1 es una respuesta completa (no quedo ninguna célula viable). Típicamente, un gráfico Fa-CI, como se usa en la presente, se utiliza para evaluar la sinergia. La figura 5B es un isobolograma clásico en ED50, ED75, 90 y ED90. (D) y (D)2 significan la concentración del fármaco 1 y fármaco 2, respectivamente. ED x se refiere a la dosis en efecto de X%, efecto del 100% significa que no quedan células viables. La Figura 5C es un isobolograma normalizado para combinación en diferentes proporciones. Los términos son como se definen en la figura 5B. La Figura 5D es un gráfico Fa-DRI (Chou y Chou, 1988; Chou y Martin, 2005) donde DRI se refiere al índice de reducción de dosis y está relacionado con CI de acuerdo con la siguiente ecuación: CI = (D)i/Dx)1 + (D)2/(Dx)2 = 1/(DRI)1 + 1/(DRI)2. DRI estima en que cantidad la dosis de cada fármaco puede ser reducida cuando los fármacos sinérgicos se administran en combinación, aún logrando el mismo efecto de tamaño a medida que cada medicamento fue administrado individualmente.

Las figuras 6A, 6B, 6C, 6D, 6E y 6F muestran los gráficos de combinación de fármacos para las combinaciones de los Compuestos A1 y B, compuesto A y compuesto B en las células NB-1643 (Enfermedad): (6A) gráfico mediana-efecto; (6B) curvas dosis-efecto; isobolograma clásico en ED50, ED75 y ED90; (6C) gráfico Fa-CI; (6D) gráfico Fa logCI; (6E) isobolograma clásico; e (6F) isobolograma conservador. Los gráficos demuestran de manera conjunta que la combinación fue sinérgica en todo el intervalo de concentración ensayado.

Las figuras 7A, 7B, 7C, 7D, 7E y 7F muestran los gráficos de combinación de fármacos para las combinaciones de los Compuestos A1 y B, compuesto A1 solo y compuesto B solo en células SH-SY5Y (Enfermedad): (7A) gráfico mediana-efecto; (7B) curvas de dosis-efecto; (7C) gráfico Fa-CI; (7D) gráfico Fa-log (CI); (7E) isobolograma clásico en ED50, ED75, y ED90; y (7F) isobolograma conservador. Las figuras 7C a 7F muestran que la combinación fue moderadamente sinérgica a baja dosis y aditiva o levemente antagónica a dosis altas.

Las figuras 8A, 8B, 9C, 8D, 8E y 8F muestran los gráficos de combinación de fármacos para los Compuestos A1 y B, compuesto A y compuesto B en las células NB1691 (Normales): (7A) gráfico mediana-efecto; (7B) curvas de dosis-efecto; (7C) gráfico Fa-CI; (7D) gráfico Fa-log (CI); (7E) isobolograma clásico en ED50, ED75, y ED90; y (7F) isobolograma conservador. Las figuras 8C a 8F demuestran que la combinación era fuertemente sinérgica en baja dosis y aditiva en dosis más altas, y antagónica en altas dosis del compuesto A1.

Las figuras 9A, 9B, 9C, 9D, 9E y 9F muestran los gráficos de combinación de fármacos para las combinaciones de Compuestos A1 y B, compuesto A y compuesto B en las células EDC1 (Normales): (9A) gráfico mediana- efecto; (9B) curvas de dosis-efecto; (9C) gráfico Fa-CI; (9D) gráfico Fa-log (CI); (9E) isobolograma clásico en ED50, ED75, y ED90; y (9F) isobolograma conservador. Las figuras 9C a 9F demuestran que la combinación fue sinérgica en todo el intervalo de concentración ensayado.

Las Figuras 10A, 10B, 10C y 10D muestran la morfología de las células SH-SY5Y en respuesta a los tratamientos con Compuesto A1, B1 o la combinación de compuestos A1 y B, cada uno a IC50 de los respectivos compuestos y 72 horas después del tratamiento: (a) vehículo; (B) tratado con Compuesto A1 solo; (C) tratado con Compuesto B solo, y (d) tratado con combinación de Compuestos A1 y B.

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Las figuras 11 A, 11 B y 11C comparan la viabilidad celular con la apoptosis de células NB1643, analizadas mediante el ensayo triplex ApoTox-GloTM, 72 horas después del tratamiento con: (a) Compuesto A1 solo; (b) Compuesto B solo, y (c) combinación de compuestos A1 y B combinados en la proporción equipotente (0, 1A /, 1,2, y 4 veces el IC50 de cada uno de los compuestos). Los resultados muestran que el tratamiento con fármaco mejora la muerte celular, pero se observa el mismo nivel de apoptosis con Compuesto A1 solo como con la combinación con Compuesto B.

Las figuras 12A, 12B y 12C muestran la viabilidad de células NB1643, analizada mediante el ensayo CTG, 72 horas después del tratamiento con: (a) Compuesto A1 solo; (b) compuesto B solo, y (c) combinación de compuestos A y B combinados en proporción equipotente. Los resultados confirmaron que el tratamiento de combinación mejora la muerte celular.

Las figuras 13A, 13B y 13C comparan la viabilidad celular con la apoptosis de células SH-SY5Y, analizadas mediante el ensayo triplex ApoTox-GloTM, 72 horas después del tratamiento con: (a) Compuesto A1 solo; (b) compuesto B solo, y (c) combinación de compuestos A1 y B combinados en la proporción equipotente (0,1/4. 1/2, 1,2, y 4 veces el IC50 de cada uno de los compuestos). Los resultados muestran que el co-tratamiento mejora la muerte celular. Las células morian pronto a la concentración más alta, de manera que la apoptosis no era detectable en aquellas concentraciones.

Las figuras 14A, 14B y 14C comparan la viabilidad celular con la apoptosis de células EBC1, analizadas mediante el ensayo triplex ApoTox-GloTM, 72 horas después del tratamiento con: (a) compuesto A1 solo; (b) compuesto B solo, y (c) combinación de compuestos A1 y B combinados en la proporción equipotente (0,1/4. 1/2, 1,2, y 4 veces el IC50 de cada uno de los compuestos). Los datos muestran poca o ninguna mejora de muerte celular o apoptosis con el co-tratamiento.

La figura 15 muestra la inmunoprecipitación western del Rb total y la expresión de pALK en células NB1643, 20 horas después del tratamiento con: vehículo; Compuesto A1 a 1/16, 1/8, 1/4 y 4 veces la dosis IC50; Compuesto B a 1/16, 1/8, 1/4 y 4 veces la dosis IC50; y la combinación de compuestos A1 y B en 1/16, 1/8, 1/4 y 4 veces la dosis IC50 de cada uno de los compuestos. El resultado muestra que el co-tratamiento reduce en gran medida la expresión de proteínas pALK en células NB1643 a partir de 1/16x de dosis de IC50.

La figura 16 muestra la inmunoprecipitación western del Rb total, fosfo-Rb S780 y fosfo-Rb S795, la expresión en células NB1643 20 horas después del tratamiento con: vehículo; Compuesto A1 a 1/16, 1/8, 1/4 y 4 veces la dosis IC50; Compuesto B a 1/16, 1/8, 1/4 y 4 veces la dosis IC50; y la combinación de compuestos A1 y B en 1/16, 1/8, 1/4 y 4 veces la dosis IC50 de cada uno de los compuestos. El resultado muestra que el co-tratamiento reduce la expresión de pRb en células NB1643 a partir de 1/16x de dosis de IC50. La combinación es más efectiva en la reducción de la expresión de pRb S780 que la expresión de pRb S795.

La figura 17 muestra la inmunoprecipitación western de ALK, pALK, Rb total, y fosfo-Rb S795, expresión en células NBEBC1 20 horas después del tratamiento con: vehículo; Compuesto A1 a 1/4, 1/2, 1 y 4 veces la dosis de IC50; el Compuesto B a 1/4, 1/2, 1 y 4 veces la dosis IC50; y la combinación de compuestos A1 y B en 1/4, 1/2, 1 y 4 veces la dosis IC50 de cada uno de los compuestos. Los resultados muestran que el co-tratamiento es más efectiva en la reducción de la expresión de proteínas pALK y pRb.

La Figura 18 muestra el volumen tumoral relativo de xenoinjertos SH-SY5Y de neuroblastomas humanos en ratones CB17 SCID con tiempo para grupos de tratamiento (1) control de vehículo, (2) compuesto A1 a 50 mg/kg, (3) compuesto B a 187.5 a 250 mg/kg, y (4) combinación del Compuesto A1 en 50 mg/kg y Compuesto B a 187,5 a 250 mg/kg. La dosis para el Compuesto B se inició en 250 mg/kg y se redujo a 187.5 mg/kg en el día 5. Los resultados muestran el tratamiento con el Compuesto A1 solo dio como resultado solamente un ligero retraso del crecimiento tumoral en comparación con el vehículo control. El tratamiento con el Compuesto B solo dio como resultado un crecimiento tumoral más lento. El co-tratamiento redujo efectivamente el tumor existente y logró la remisión total del tumor.

Las figuras 19A, 19B, 19C y 19D muestran la variabilidad del volumen tumoral con la duración del tratamiento (en semanas) para ratones individuales en cada uno de los grupos de tratamiento descritos en la Figura 18 anterior.

La figura 20 muestra la supervivencia de los ratones (en porcentaje) versus la duración del tratamiento (en semanas) en cada uno de los grupos de tratamiento descritos en la Figura 18 anterior. El día 7, dos de los ratones del grupo 4 murieron, y el día 14, un ratón del grupo del compuesto B murió. Los ratones en el grupo control y el grupo del Compuesto A1 fueron sacrificados debido al tamaño de su tumor.

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La Figura 21 son gráficos de dispersión de los efectos de fármacos combinatoriales (eficacia frente a la puntuación sinergia) de combinaciones de Compuesto A1 y el Compuesto B, y sus auto-cruces respectivos en 16 líneas celulares de neuroblastoma para enfermedad (ALK mutante) y normales (tipo Silvestre) (véanse los datos en la Tabla 10). Los hits de combinación sinérgica se identificaron por tener una puntuación de sinergia > 2 y una eficacia máxima > 100 (ver las Figuras 4A, 4B y 4C para la interpretación). La gráfica en la parte superior es el autocruzamiento del Compuesto A1 (un inhibidor de ALK), que muestra la eficacia de un único agente preferencial para la Enfermedad de ALK. La gráfica en la parte media es el auto-cruzamiento del Compuesto B (un inhibidor de CDK), que muestra una eficacia mínima de agente único o sinergia. El gráfico en la parte inferior es las combinaciones de los compuestos A1 y B, que muestra la interacción que conduce tanto a la sinergia como a una mayor eficacia en dos líneas celulares de Enfermedad (NB-1691, Lan-5) y una normal (NB-1691).

Las figuras 22A, 22B muestran los efectos de dosificación del co-tratamiento con un inhibidor de ALK y un inhibidor de CDK4/6 en la proliferación de células Kelly de neuroblastoma humano. La figura 22A muestra la matriz de dosis e isobolograma que demuestra los efectos de dosis del co-tratamiento con el Compuesto A1 (un inhibidor de ALK) y Compuesto B (un inhibidor de CDK4/6). La combinación fue moderadamente sinérgica con una puntuación de sinergia de 1.75 y el isobolograma indicó una interacción muy fuerte. La figura 22B muestra la matriz de dosis e isobolograma que demuestra los efectos de dosis del co-tratamiento con el compuesto A2 (un inhibidor de ALK) y Compuesto B. La combinación fue moderadamente sinérgica con una puntuación de sinergia de 1,48 y el isobolograma indicó una interacción muy fuerte.

Las figuras 23A, 23B, 23C y 23D muestran el efecto de dosis del co-tratamiento con un inhibidor de ALK y un inhibidor de CDK4/6 en la proliferación de células de neuroblastoma Kelly y NB-1. La figura 23A muestra la matriz de dosis y la matriz de exceso de Loewe que demuestra los efectos de dosis de co-tratamiento con el Compuesto A1 (un inhibidor de ALK) y el Compuesto B (un inhibidor de CDK4/6) en células Kelly. La combinación fue sinérgica con una puntuación de sinergia calculada de 2.51. La figura 23B muestra la matriz de dosis y la matriz de exceso de Loewe que demuestra los efectos de dosis de co-tratamiento con el Compuesto A2 (un inhibidor de ALK) y el Compuesto B en células Kelly. La combinación fue sinérgica con una puntuación de sinergia de 2.29. La figura 23C muestra la matriz de dosis y la matriz de exceso de Loewe que demuestra los efectos de dosis de co-tratamiento con el Compuesto A2 y el Compuesto B en la proliferación de células de neuroblastoma humano NB-1. La combinación no fue sinérgica. La figura 23D muestra la matriz de dosis y la matriz de exceso de Loewe que demuestra los efectos de dosis de co-tratamiento con el Compuesto A2 y el Compuesto B en la proliferación de células de neuroblastoma humano NB-1. La combinación no fue sinérgica.

Las figuras 24A, 24B, 24C, 24D, 24E y 24F muestran los efectos de dosis de co-tratamiento con un inhibidor de ALK y un inhibidor de CDK4/6 en células de neuroblastoma NB-1 y SH-SY5Y. La figura 24A muestra la matriz de dosis y la matriz de exceso de Loewe exceso que demuestra los efectos de dosis de co-tratamiento con el Compuesto A1 (un inhibidor de ALK) y el Compuesto B en la proliferación de células Kelly; la puntuación de sinergia fue de 0.820. La figura 24B muestra la matriz de dosis y la matriz de exceso de Loewe exceso que demuestra el efecto de dosis de co-tratamiento con el Compuesto A2 (un inhibidor de ALK) y el Compuesto B en células de neuroblastoma humano Kelly; la puntuación de sinergia fue de 1.52. La Figura 24C muestra la matriz de dosis y la matriz de exceso de Loewe que demuestra los efectos de dosis de co-tratamiento con el Compuesto A1 y el Compuesto B en células de neuroblastoma humano NB-1; la combinación no es sinérgica. La Figura 24D muestra la matriz de dosis y la matriz de exceso de Loewe que demuestra el efecto de dosis de co-tratamiento con el Compuesto A2 y el Compuesto B en células de neuroblastoma humano NB-1; la combinación no es sinérgica. La figura 24E muestra la matriz de dosis y la matriz de exceso de que demuestra el efecto de la dosis de co-tratamiento con el Compuesto A1 y el Compuesto B en células de neuroblastoma humano SH-SY5Y. La figura 24F muestra la matriz de dosis y la matriz de exceso de Loewe que demuestra el efecto de la dosis de co-tratamiento con los compuestos A2 y B en células de neuroblastoma humano SH-SY5Y.

Descripción detallada de la invención

Definición

Las siguientes definiciones generales se proporcionan para entender mejor la invención:

Los términos "alrededor de" o "aproximadamente" usualmente significa dentro del 20%, más preferiblemente dentro del 10%, y más preferiblemente aún dentro de 5% de un valor o rango dado. Alternativamente, especialmente en los sistemas biológicos, el término "aproximadamente" significa dentro de aproximadamente un orden de magnitud preferentemente dentro de un factor de dos de un valor dado.

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"Inhibidores de la quinasa del linfoma anaplásico (ALK)" utilizados aquí se relacionan con compuestos que inhiben la actividad quinasa de la enzima. Tales compuestos se denominarán como "inhibidores de ALK".

"Tumor o cáncer resistente a ALK" se refiere a un cáncer o un tumor que, o bien no responde favorablemente al tratamiento con inhibidores de ALK previos, o, alternativamente, presenta recaídas después de responder favorablemente a los inhibidores de ALK. El cáncer o tumor puede ser resistente o refractario al comienzo del tratamiento o pueden llegar a ser resistentes o refractario durante el tratamiento.

"Co-administrar", "co-administración" o "administración combinada" o similares pretenden abarcar la administración de los agentes terapéuticos seleccionados a un paciente individual, y pretenden incluir los regímenes de tratamiento en los que los agentes no son necesariamente administrados por la misma vía de administración o al mismo tiempo.

"Combinación" se refiere a bien sea una combinación fija en una forma de dosificación unitaria, o una combinación no fija (o kit de partes) para la administración combinada en donde un compuesto y un socio de combinación (por ejemplo, otro fármaco como se explica a continuación, también conocido como "agente terapéutico", "agente" o "co-agente") se puede administrar de forma independiente al mismo tiempo o por separado dentro de intervalos de tiempo, especialmente cuando estos intervalos de tiempo permiten que los socios de combinación muestren un efecto cooperativo por ejemplo sinergico. El término "administración combinada" o similares como se utiliza en la presente pretenden abarcar la administración del socio de combinación seleccionado a un único sujeto que lo necesite (ej., un paciente), y pretenden incluir los regímenes de tratamiento en los que los agentes no son necesariamente administrados por la misma vía de administración o al mismo tiempo. El término "combinación fija" significa que los ingredientes activos, a modo de ejemplo, un compuesto de la fórmula AI y un socio de combinación, son ambos administrados a un paciente de forma simultánea en la forma de una sola entidad o dosificación. Los términos "combinación no fija" o "kits de partes" significa que los ingredientes activos, ej., un compuesto de la formula A1 y un socio de combinación, sean ambos administrados a un paciente como entidades separadas ya sea simultáneamente, al mismo tiempo o secuencialmente sin límites de tiempo específicos, en donde dicha administración proporciona niveles terapéuticamente eficaces de los dos compuestos en el cuerpo del paciente.

"Inhibidor de la quinasa dependiente de ciclina (CDK)" como se define en la presente se refiere a una pequeña molécula que interactúa con un complejo ciclina-CDK para bloquear la actividad de la quinasa.

"Rango de dosis" se refiere a un límite superior y un límite inferior de una variación aceptable de la cantidad de agente terapéutico especificado. Típicamente, una dosis del agente en cualquier cantidad dentro del intervalo especificado puede ser administrada a los pacientes sometidos a tratamiento.

"Cantidad conjuntamente terapéuticamente efectiva" en referencia a la terapia de combinación significa la cantidad de cada uno de los socios de combinación, que se puede administrar, en conjunto, de forma independiente, al mismo tiempo o por separado dentro de intervalos de tiempo apropiados que los socios de combinación ejercen cooperativamente, efectos beneficiosos/terapéuticos para aliviar, retrasar la progresión de o inhibir los síntomas de una enfermedad en un paciente en necesidad del mismo.

El término "farmacéuticamente aceptable" se refiere a aquellos compuestos, materiales, composiciones, vehículos y/o formas de dosificación que están dentro del alcance del criterio médico, son adecuados para el contacto con los tejidos de mamíferos especialmente humanos, sin excesiva toxicidad, irritación, respuesta alérgica y otras complicaciones problemáticas acorde con una relación beneficio/riesgo razonable.

"Preparación farmacéutica" o "composición farmacéutica" se refiere a una mezcla o solución que contiene al menos un agente terapéutico para ser administrado a un mamífero de sangre caliente, por ejemplo, un ser humano con el fin de prevenir, tratar o controlar una enfermedad o afección particular que afecta al mamífero.

"Sales" (que, lo que se entiende por "o sales de los mismos" o "o una sal del mismo"), pueden estar presentes solas o en mezcla con el compuesto libre, por ejemplo el compuesto de la fórmula (I), y son preferiblemente sales farmacéuticamente aceptables. Tales sales de los compuestos de la fórmula (I) se forman, por ejemplo, como sales de adición de ácido, preferiblemente con ácidos orgánicos o inorgánicos, a partir de compuestos de la fórmula (I) con un átomo de nitrógeno básico. Ácidos inorgánicos adecuados son por ejemplo, ácidos de halógeno, tales como ácido clorhídrico, ácido sulfúrico, o ácido fosfórico. Los ácidos orgánicos adecuados son, por ejemplo, ácidos carboxílicos o ácidos sulfónicos, tales como ácido fumárico o ácido metanosulfónico. Para fines de aislamiento o purificación también es posible usar sales farmacéuticamente aceptables, por ejemplo picratos o percloratos. Para uso terapéutico, solamente se emplean sales farmacéuticamente aceptables o

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compuestos libres (cuando sea aplicable en la forma de preparaciones farmacéuticas), y estas son por lo tanto preferidas. En vista de la estrecha relación entre los nuevos compuestos en forma libre y aquellos en forma de sus sales, incluyendo aquellas sales que se pueden utilizar como intermedios, por ejemplo en la purificación o identificación de los nuevos compuestos, cualquier referencia a los compuestos libres anteriormente y en lo sucesivo, debe entenderse como refiriéndose también a las sales correspondientes, según sea apropiado y conveniente. Las sales de los compuestos de la fórmula (I) son preferiblemente sales farmacéuticamente aceptables; contra-iones adecuados que forman sales farmacéuticamente aceptables son conocidos en el campo.

"Composición farmacéutica individual" se refiere a un único portador o vehículo formulado para entregar cantidades eficaces de los dos agentes terapéuticos a un paciente. El vehículo individual está diseñado para proporcionar una cantidad efectiva de cada uno de los agentes, junto con cualquiera de los vehículos o excipientes farmacéuticamente aceptables. En algunas realizaciones, el vehículo es un comprimido, cápsula, píldora, o un parche. En otras realizaciones, el vehículo es una solución o una suspensión.

"Sujeto", "paciente" o "animal de sangre caliente" pretende incluir animales. Ejemplos de sujetos incluyen mamíferos, por ejemplo, seres humanos, perros, vacas, caballos, cerdos, ovejas, cabras, gatos, ratones, conejos, ratas y animales no humanos transgénicos. En ciertas realizaciones, el sujeto es un humano, por ejemplo, un humano que padece, está en riesgo de padecer, o potencialmente puede padecer de una enfermedad tumoral cerebral. Particularmente preferido, el sujeto o animal de sangre caliente es humano.

"Terapéuticamente efectiva" se refiere preferentemente a una cantidad de un agente terapéutico que es terapéuticamente o en un sentido más amplio también profilácticamente efectiva contra la progresión de una enfermedad proliferativa.

"Tratamiento" incluye el tratamiento profiláctico y terapéutico (incluyendo, pero no limitado a paliativo, de curado, de alivio de síntomas, y reducción de síntomas), así como el retraso de la progresión de una enfermedad o trastorno del cáncer. El término "profiláctico" significa la prevención de la aparición o recurrencia de un cáncer. El término "retraso de la progresión" como se usa en la presente significa administración de la combinación a pacientes que están en una pre-etapa o en una fase temprana del cáncer a ser tratado, una pre-forma del cáncer correspondiente se diagnostica y/o en un paciente diagnosticado con una condición bajo la cual es probable que un cáncer correspondiente se desarrolle.

Descripción de las realizaciones preferidas

La presente invención se refiere a una combinación farmacéutica que comprende, juntos o por separado, (a) un primer agente que es un inhibidor de la quinasa del linfoma anaplásico (ALK) o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo y (b) un segundo agente que es un inhibidor de las quinasas dependientes de ciclina (CDK) o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo. Tal combinación puede ser para uso simultáneo, separado o secuencial para el tratamiento de neuroblastoma.

En una realización preferida de la combinación de la invención, el inhibidor de la ALK es el Compuesto A1, que es 5-cloro-N2-(2-isopropoxi-5-metil-4-(piperidin-4-il)fenil)-N4-[2-(propano-2-sulfonil)-fenil]-pirimidina-2,4-

diamina, a continuación:

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o sales farmacéuticamente aceptables del mismo.

En otra realización preferida, el inhibidor de ALK es el Compuesto A2, que es N6-(2-isopropoxi 5-metil-4- (1- metilpiperidin-4-il) fenil) N4- (2- (isopropilsulfonil)fenil) -1H pirazolo[3,4-d] pirimidina-4,6-diamina, a continuación:

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o sales farmacéuticamente aceptables del mismo.

En otro aspecto de la presente divulgación, el inhibidor de ALK es el Compuesto A3, que es (R) -3- (1 - (2,6- dicloro-3-fluorofenil)etoxi)-5-(1-(piperidin-4-il)-1 H-pirazol-4-il) piridin-2-amina, conocido comúnmente como 5 Crizotinib y nombre comercial XALKORI®) a continuación:

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o sales farmacéuticamente aceptables del mismo.

En un aspecto de la combinación de la divulgación, el inhibidor de CDK es un inhibidor de CDK4 o CDK6. En una variación, el inhibidor de CDK es un inhibidor de CDK4. En otra variación, el inhibidor de CDK es un inhibidor 10 de CDK6. En aún otra variación, el inhibidor de CDK es un inhibidor dual de CDK4 y CDK6.

En una realización, el inhibidor de CDK es Compuesto B1, que es 7-ciclopentil-N, N-dimetil-2-((5-(piperazin-1 - il)piridin-2-il)amino)-7H-pirrolo[2,3-d]pirimidina-6-carboxamida, descrito por la fórmula siguiente:

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Las realizaciones específicas de las combinaciones farmacéuticas de la presente invención incluyen los 15 siguientes:

(1) Combinación que comprende el Compuesto A1 y el Compuesto B1;

(2) Combinación que comprende el Compuesto A2 y el Compuesto B1.

También se describe la combinación de más de dos ingredientes activos separados como se ha expuesto anteriormente, es decir, una combinación farmacéutica dentro del alcance de esta invención podría incluir tres 20 ingredientes activos o más.

A menos que se indique lo contrario, si hay una discrepancia entre la estructura de un compuesto y su nombre químico, la estructura del compuesto prevalece.

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Los compuestos A1, A2, y B, se pueden incorporar en la combinación de la presente invención, ya sea en la forma de su base libre o cualquier sal del mismo. Las sales pueden estar presentes solas o en mezcla con el compuesto libre, y son preferiblemente sales farmacéuticamente aceptables. Tales sales de los compuestos se forman, por ejemplo, como sales de adición de ácido, preferiblemente con ácidos orgánicos o inorgánicos, con un átomo de nitrógeno básico. Ácidos inorgánicos adecuados son por ejemplo, ácidos de halógeno, tales como ácido clorhídrico, ácido sulfúrico, o ácido fosfórico. Los ácidos orgánicos adecuados son, por ejemplo, ácido succínico, ácidos carboxílicos o ácidos sulfónicos, tales como ácido fumárico o ácido metanosulfónico. Para fines de aislamiento o purificación también es posible usar sales farmacéuticamente aceptables, por ejemplo picratos o percloratos. Para uso terapéutico, solamente se emplean sales farmacéuticamente aceptables o compuestos libres (cuando sea aplicable en la forma de preparaciones farmacéuticas), y estas son por lo tanto preferidas.

Se comprenden también las sales farmacéuticamente aceptables de los mismos, los racematos correspondientes, diastereoisómeros, enantiómeros, tautómeros, así como las correspondientes modificaciones cristalinas de los compuestos anteriormente descritos cuando están presentes, por ejemplo, solvatos, hidratos y polimorfos, que se describen en la presente. Los compuestos usados como ingredientes activos en las combinaciones de la presente invención pueden prepararse y administrarse como se describe en los documentos citados, respectivamente.

Farmacología y Utilidad

Se observa que los socios individuales de la combinación de la presente invención son compuestos que se sabe tienen la actividad inhibidora. Se ha encontrado ahora sorprendentemente que la combinación (s) de la presente invención y sus sales farmacéuticamente aceptables exhiben propiedades terapéuticas de cooperación beneficiosas (por ejemplo, sinérgicas) cuando se prueban in vitro en ensayos de quinasa libres de células y en ensayos celulares, e in vivo en un modelo de ratón de cáncer, y son por lo tanto útiles puesto que las hacen útiles para el tratamiento de enfermedades proliferativas, en especial cánceres. El término "enfermedad proliferativa" incluye, pero no limita a, cáncer, tumor, hiperplasia, reestenosis, hipertrofia cardiaca, trastorno inmune e inflamación.

En un aspecto, la presente invención se refiere a una combinación farmacéutica que comprende, juntos o por separado, (a) un primer agente que es un inhibidor de la quinasa del linfoma anaplásico (ALK) o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo y (b) un segundo agente que es un inhibidor de las quinasas dependientes de ciclinas (CDK) que es un compuesto (B) o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, para uso en el tratamiento de neuroblastoma. En otro aspecto, la presente divulgación proporciona el uso de una combinación farmacéutica, por separado o juntos, (a) un primer agente que es un inhibidor de la quinasa del linfoma anaplásico (ALK) o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo y (b) un segundo agente que es un inhibidor de las quinasas dependientes de ciclina (CDK) o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, para la preparación de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad proliferativa, especialmente cáncer.

En un aspecto, la presente divulgación se refiere además a un método para tratar una enfermedad proliferativa en un sujeto en necesidad del mismo, que comprende la administración a dicho sujeto de una cantidad conjuntamente terapéuticamente efectiva de una combinación farmacéutica o una composición farmacéutica, que comprende: (a) un primer agente que es un inhibidor de la quinasa del linfoma anaplásico (ALK) o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo y (b) un segundo agente que es un inhibidor de las quinasas dependientes de ciclina (CDK) o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo. De acuerdo con la presente invención, el primer agente y el segundo agente pueden administrarse ya sea juntos en una única composición farmacéutica, de forma independiente en composiciones farmacéuticas separadas, o secuencialmente.

Preferiblemente, la presente invención es útil para el tratamiento de un mamífero, especialmente seres humanos, que sufren de neuroblastoma.

Ejemplos de una enfermedad proliferativa que puede ser tratada con la combinación de la presente divulgación son por ejemplo cánceres, incluyendo, pero no limitados a, sarcoma, neutroblastoma, linfomas, cáncer de pulmón, bronquios, próstata, mama (incluyendo los cánceres de mama esporádicos y las víctimas de la enfermedad de Cowden), páncreas, gastrointestino, colon, recto, colon, adenoma colorrectal, de tiroides, hígado, conductos biliares intrahepáticos, hepatocelular, glándula suprarrenal, estómago, gástrico, glioma, glioblastoma, endometrial, melanoma, riñón, pelvis renal, vejiga urinaria, cuerpo uterino, cuello del útero, vagina, ovario, mieloma múltiple, esófago, una leucemia, leucemia mielógena aguda, leucemia mielógena crónica, lucemia linfocítica, leucemia mieloide, cerebro, un carcinoma del cerebro, cavidad oral y faringe, laringe,

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intestino delgado, linfoma no Hodgkin, melanoma, adenoma velloso del colon, una neoplasia, una neoplasia de carácter epitelial, un carcinoma de mama, carcinoma de células basales, linfoma anaplásico de células grandes, carcinoma de pulmón no microcítico, carcinoma de células escamosas, queratosis actínica, enfermedades tumorales (incluyendo tumores sólidos), un tumor del cuello o la cabeza, policitemia vera, trombocitemia esencial, mielofibrosis con metaplasia mieloide, cáncer de mama inflamatorio y enfermedad de Waldenstroem.

Ejemplos adicionales incluyen, policitemia vera, trombocitemia esencial, mielofibrosis con metaplasia mieloide, asma, EPOC, SDRA, síndrome de Loffler, neumonía eosinofílica, infestación parasitaria (en particular metazoos ) (incluyendo eosinofilia tropical), aspergilosis broncopulmonar, poliarteritis nodosa (incluyendo síndrome de Churg- Strauss), granuloma eosinofílico, trastornos relacionados con eosinófilos que afectan las vías respiratorias ocasionados por reacción a fármacos, psoriasis, dermatitis de contacto, dermatitis atópica, alopecia areata, eritema multiforme, dermatitis herpetiforme, esclerodermia, vitíligo, hipersensibilidad vasculitis, urticaria, penfigoide ampolloso, lupus eritematoso, pénfigo, epidermólisis bullosa adquirida, trastornos autoinmunes hematológicos (ej., anemia hemolítica, anemia aplásica, anemia hipoplásica congénita y trombocitopenia idiopática), lupus eritematoso sistémico, policondritis, esclerodermia, granulomatosis de Wegener, dermatomiositis, hepatitis crónica activa, miastenia gravis, síndrome de Steven- Johnson, psilosis idiopática, enfermedad autoinmune inflamatoria del intestino (ej., colitis ulcerosa y enfermedad de Crohn), oftalmopatía endocrina, enfermedad de Graves, sarcoidosis, alveolitis, neumonitis crónica por hipersensibilidad, esclerosis múltiple, cirrosis biliar primaria, uveítis (anterior y posterior), fibrosis pulmonar intersticial, artritis psoriática, glomerulonefritis, enfermedades cardiovasculares, arteriosclerosis, hipertensión, trombosis venosa profunda, accidente cerebrovascular, infarto de miocardio, angina inestable, tromboembolismo, embolia pulmonar, enfermedades trombolíticas, isquemia arterial aguda, oclusiones trombóticas periféricas, y la enfermedad arterial coronaria, lesiones por reperfusión, retinopatía, tales como retinopatía diabética o retinopatía hiperbárica inducida por oxígeno, y enfermedades caracterizadas por la presión intraocular elevada o secreción del humor acuoso ocular, tal como glaucoma.

Donde se menciona un cáncer, un tumor, una enfermedad tumoral, sarcoma, o un cáncer, también se implica la metástasis en el órgano o tejido original y/o en cualquier otra localización, alternativamente o además, cualquiera que sea la ubicación del tumor y/o metástasis.

La combinación de inhibidores de ALK y CDK4/6 de la presente invención es particularmente útil para el tratamiento de cánceres positivos a ALK, es decir, un cáncer mediado por/que depende de la quinasa del linfoma anaplásico (ALK). Los datos mostrados en la presente muestran que la combinación de la presente invención es efectiva en el tratamiento de cáncer, en particular neuroblastoma, que muestra la sobreexpresión o amplificación y/o mutación somática del gen y/o proteína de ALK.

La combinación de inhibidores de ALK y CDK4/6 de la presente invención también puede ser útil en el tratamiento de tumores o cánceres resistentes a ALK. Un mecanismo de resistencia del tumor cuando se trata con inhibidores ALK es que las mutaciones aparezcan en el gen ALK. Este mecanismo se ha demostrado en un ensayo clínico en pacientes tratados con Crizotinib con tumores positivos para ALK (en su mayoría carcinoma de pulmón de células no pequeñas). Algunas de estas mutaciones de resistencia son similares a las mutaciones encontradas en neuroblastoma. Aunque no se desea estar limitado por la teoría, se planteó la hipótesis de que estas mutaciones de resistencia conducen a la activación de ALK para promover aún más la proliferación del tumor. Por ejemplo, las mutaciones en el área T1151/L1152/C1156 y el área 11171/F1174 de aLk son similares a mutaciones de neuroblastoma. Puesto que las combinaciones del inhibidor de ALK y el inhibidor de CDK de la presente invención son eficaces en los tumores de neuroblastoma que tienen mutaciones de amplificación, las combinaciones serían eficaces en estos tumores resistentes a ALK.

En consecuencia, en una realización, la combinación de la presente invención es útil en el tratamiento de una enfermedad proliferativa que depende de la amplificación del gen de ALK. En otra realización, la combinación de la presente invención es útil en el tratamiento de una enfermedad proliferativa que depende de una mutación del gen de ALK. En aún otra realización, la combinación de la presente invención es útil en el tratamiento de una enfermedad proliferativa que depende de una mutación y la amplificación del gen de ALK.

En un aspecto de la divulgación, la enfermedad proliferativa celular se selecciona del linfoma, osteosarcoma, melanoma, un tumor de mama, renal, de próstata, colorrectal, de tiroides, de ovario, de páncreas, neuronal, de pulmón, de útero o tumor gastrointestinal, tumor resistente a ALK, cáncer de mama inflamatorio, linfoma anaplásico de células grandes, carcinoma pulmonar de células no pequeñas y neuroblastoma.

En un aspecto preferido de la divulgación, la enfermedad proliferativa celular es el linfoma anaplásico de células grandes. En otra realización preferida de la divulgación, la enfermedad proliferativa celular es el carcinoma

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pulmonar de células grandes. En aún otro aspecto preferido de la divulgación, la enfermedad proliferativa celular es el linfoma anaplásico de células grandes. De acuerdo con la invención, la enfermedad proliferativa celular es neuroblastoma. En una realización preferida, la enfermedad proliferativa celular es un tumor resistente a ALK.

Estudios in vitro e in vivo demostraron que la administración de una combinación farmacéutica de la invención dio como resultado un efecto beneficioso, por ejemplo, un efecto terapéutico sinérgico, con respecto a aliviar, retrasar la progresión o inhibir los síntomas, en comparación con una monoterapia que aplica sólo uno de los agentes (a) o agentes (b) utilizados en la combinación de la invención. El beneficio que pequeñas cantidades de los ingredientes activos se pueden utilizar, por ejemplo, que las dosis pueden ser más pequeñas y/o administradas con menor frecuencia, podría disminuir la incidencia o la gravedad de los efectos secundarios, lo que puede conducir a una mejor calidad de vida o una disminución en morbilidad. Esto está en concondancia con los deseos y requerimientos de los pacientes a ser tratados. El resultado de los estudios in vitro y in vivo se indica en la sección de Ejemplos, abajo.

Para demostrar que la combinación de un inhibidor de ALK y un inhibidor de CDK de la presente invención es particularmente adecuada para el tratamiento efectiva de enfermedades proliferativas con buen margen terapéutico y otras ventajas, los ensayos clínicos pueden llevarse a cabo de una manera conocida por la persona experta.

Los estudios clínicos adecuados son, por ejemplo, estudios de etiqueta abierta, de escalado de dosis en pacientes con enfermedades proliferativas. Tales estudios prueban en particular el sinergismo de los ingredientes terapéuticos de la combinación de la invención. Los efectos beneficiosos se pueden determinar directamente a través de los resultados de estos estudios que son conocidos como tales por un experto en la técnica. Tales estudios son, en particular, adecuados para comparar los efectos de una monoterapia utilizando los ingredientes activos y una combinación de la invención. Preferiblemente, la dosis de agente (a) se escala hasta que la Dosis Máxima Tolerada se alcanza, y el agente (b) se administra con una dosis fija. Alternativamente, el agente (a) se administra en una dosis fija y la dosis de agente (b) se escala. Cada paciente recibe dosis del agente (a) bien sea diarias o intermitentes. La eficacia del tratamiento puede determinarse en tales estudios, por ejemplo, después de 12, 18 o 24 semanas mediante evaluación de puntuaciones de síntomas cada 6 semanas.

Composición farmacéutica, administración y dosificación

Un objetivo de esta invención es proporcionar una composición farmacéutica que comprende una cantidad, que es conjuntamente terapéuticamente efectiva al combatir o prevenir enfermedades proliferativas, de cada agente socio de la combinación (a) y (b) de la invención.

En un aspecto, la presente invención se relaciona con una composición farmacéutica que comprende una combinación farmacéutica que comprende, juntos o por separado, (a) un primer agente que es un inhibidor de la quinasa del linfoma anaplásico (ALK) seleccionado del compuesto A1 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, o un compuesto A2 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, y (b) un segundo agente que es un inhibidor de las quinasas dependientes de ciclina (CDK) que es un compuesto (B) o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo y al menos un excipiente para uso en el tratamiento de neuroblastoma. Inhibidores de ALK e inhibidores de CDK que son adecuados para uso en la combinación de la invención. En una realización de referencia, tal composición farmacéutica de la presente invención es para uso en el tratamiento de una enfermedad proliferativa. De acuerdo con la presente invención, el agente (a) y el agente (b) se pueden administrar juntos en una sola composición farmacéutica, por separado en forma de dosificación unitaria combinada o en dos formas de dosificación unitarias separadas, o secuencialmente. La forma de dosificación unitaria también puede ser una combinación fija.

Las composiciones farmacéuticas para administración separada de agentes o para la administración en una combinación fija (es decir, una única composición galénica que comprende al menos dos socios de combinación (a) y (b)) de acuerdo con la invención pueden ser preparados de una manera conocida per se y son aquellas adecuadas para administración enteral, tal como administración oral o rectal, tópica, y parenteral a sujetos, incluyendo mamíferos (animales de sangre caliente), tales como seres humanos, que comprende una cantidad terapéuticamente efectiva de al menos un socio de combinación farmacológicamente activo solo, por ejemplo, como se indica anteriormente, o en combinación con uno o más vehículos farmacéuticamente aceptables o diluyentes, especialmente adecuados para la aplicación enteral o parenteral. Las composiciones farmacéuticas adecuadas contienen, por ejemplo, entre 0,1% y 99,9% aproximadamente, preferiblemente entre 1% y 60% aproximadamente de los ingredientes activos.

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Las composiciones farmacéuticas para la terapia de combinación para administración enteral o parenteral son, por ejemplo, aquellas en formas de dosificación unitaria, tales como tabletas recubiertas de azúcar, tabletas, cápsulas o supositorios, ampollas, soluciones inyectables o suspensiones inyectables. La administración tópica es, por ejemplo a la piel o el ojo, por ejemplo en forma de lociones, geles, ungüentos o cremas, o en una forma nasal o de supositorio. Si no se indica lo contrario, estas se preparan de una manera conocida per se, por ejemplo, por medio de procesos convencionales de mezcla, granulación, recubrimiento con azúcar, disolución o liofilización. Se apreciará que el contenido unitario de cada agente terapéutico contenido en una dosis individual de cada forma de dosificación no necesita por sí mismo constituir una cantidad efectiva puesto que la cantidad efectiva necesaria puede ser alcanzada por la administración de una pluralidad de unidades de dosificación.

Las composiciones farmacéuticas pueden comprender uno o más vehículos o diluyentes farmacéuticos aceptables y pueden fabricarse de manera convencional mediante la mezcla de uno o ambos socios de combinación con un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable. Ejemplos de diluyentes farmacéuticamente aceptables incluyen, pero no se limitan a, lactosa, dextrosa, manitol, y/o glicerol, y/o lubricantes y/o polietilenglicol. Ejemplos de aglutinantes farmacéuticamente aceptables incluyen, pero no se limitan a, silicato de magnesio y aluminio, almidones, tales como almidón de maíz, trigo o arroz, gelatina, metilcelulosa, carboximetilcelulosa sódica y/o polivinilpirrolidona, y, si se desea, desintegrantes farmacéuticamente aceptables incluyen, pero no se limitan a, almidones, agar, ácido algínico o una sal del mismo, tal como alginato de sodio, y/o mezclas efervescentes, o adsorbentes, colorantes, aromatizantes y edulcorantes. También es posible utilizar los compuestos de la presente invención en forma de composiciones parenteralmente administrables o en forma de soluciones de infusión. Las composiciones farmacéuticas pueden ser esterilizadas y/o pueden comprender excipientes, por ejemplo conservantes, estabilizantes, compuestos humectantes y/o emulsionantes, solubilizantes, sales para regular la presión osmótica y/o reguladores.

En particular, una cantidad terapéuticamente efectiva de cada socio de combinación de la combinación de la invención se pueden administrar simultáneamente o secuencialmente y en cualquier orden, y los componentes pueden administrarse por separado o como una combinación fija. Por ejemplo, el método para prevenir o tratar un cáncer de acuerdo con la invención puede comprender: (i) la administración del primer agente en forma libre o de sal farmacéuticamente aceptable y (ii) la administración de un segundo agente terapéutico (b) en forma libre o forma de sal farmacéuticamente aceptable, de forma simultánea o secuencialmente en cualquier orden, en cantidades conjuntamente terapéuticamente eficaces, preferiblemente en cantidades sinérgicamente eficaces, por ejemplo, en dosificaciones diarias o intermitentes correspondientes a las cantidades descritas en la presente. Los socios de combinación individuales de la combinación de la invención pueden administrarse por separado en diferentes momentos durante el curso de la terapia o concurrentemente en formas de combinación divididas o individuales. Además, el término administrar también abarca el uso de un profármaco de un socio de combinación que se convierte in vivo en el socio de combinación como tal. Por lo tanto, se debe entender que la presente invención abarca todos estos regímenes de tratamiento simultáneo o alterno y el término "administrar" se debe interpretar en consecuencia.

La dosificación efectiva de cada uno de los agentes de socio de combinación empleados en la combinación de la invención puede variar dependiendo del compuesto o composición farmacéutica particular empleada, el modo de administración, la afección a tratar, y la gravedad de la afección a tratar. Por lo tanto, el régimen de dosificación de la combinación de la invención se selecciona de acuerdo con una variedad de factores incluyendo el tipo, especie, edad, peso, sexo y estado médico del paciente; la gravedad de la afección a tratar; la vía de administración; la función renal y hepática del paciente; y el compuesto particular empleado. Un médico, clínico o veterinario de experiencia normal puede determinar fácilmente y prescribir la cantidad efectiva del fármaco requerida para prevenir, contrarrestar o detener el progreso de la afección. La precisión óptima para lograr la concentración de fármaco dentro del rango que proporcione eficacia requiere un régimen basado en la cinética de la disponibilidad del fármaco a los sitios objetivo. Esto involucra una consideración de la distribución, equilibrio, y eliminación de un fármaco.

Para los fines de la presente invención, una dosis terapéuticamente efectiva será generalmente una dosis diaria total administrada a un huésped en dosis únicas o divididas. El compuesto de la fórmula (I) se puede administrar a un huésped en un intervalo de dosificación diaria de, por ejemplo, entre 0.05 y 50 mg/kg aproximadamente de peso corporal del receptor, preferiblemente entre 0.1 y 25 mg/kg aproximadamente de peso corporal del receptor, más preferiblemente entre 0.5 y 10 mg/kg aproximadamente de peso corporal del receptor. El Agente (b) puede administrarse a un huésped en un intervalo de dosificación diaria de, por ejemplo, entre 0,001 y 1000 mg/kg aproximadamente de peso corporal del receptor, preferiblemente entre 1.0 y 100 mg/kg aproximadamente de peso corporal del receptor, y lo más preferiblemente entre 1.0 y 50 mg/kg de peso corporal del receptor. Las composiciones unitarias de dosificación pueden contener tales cantidades de submúltiplos de las mismas para constituir la dosis diaria.

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La combinación de ALKi y CDKi de la invención puede utilizarse sola o combinada con al menos otro compuesto farmacéuticamente activo para uso en estas patologías. Estos compuestos activos se pueden combinar en la misma preparación farmacéutica o en la forma de preparaciones combinadas "kit de partes" en el sentido de que los socios de combinación pueden dosificarse independientemente o mediante el uso de diferentes combinaciones fijas con cantidades distinguidas de los socios de combinación, es decir, simultáneamente o en diferentes puntos de tiempo. Las partes del kit de partes pueden entonces, por ejemplo, administrarse simultáneamente o escalonarse cronológicamente, es decir en diferentes puntos de tiempo y con intervalos de tiempo iguales o diferentes para cualquier parte del kit de partes. Ejemplos no limitantes de compuestos que se pueden citar para uso en combinación con la combinación de ALKi y CDKi de la invención incluyen fármacos de quimioterapia citotóxicos, tales como anastrozol, clorhidrato de doxorrubicina, flutamida, dexametaxona, docetaxel, cisplatino, paclitaxel, etc.

KITS

La presente divulgación se refiere además a un kit que comprende un primer compuesto seleccionado del grupo que consiste en los Compuestos A1 a A3 o sales farmacéuticamente aceptables de los mismos, y Compuesto B o sales farmacéuticamente aceptables de los mismos, y un inserto de paquete u otro etiquetado incluyendo indicaciones para el tratamiento de una enfermedad proliferativa.

La presente divulgación se refiere además a un kit que comprende un primer compuesto seleccionado de los compuestos A1-A3 o sales farmacéuticamente aceptables de los mismos, y un inserto de paquete o otro etiquetado incluyendo diretrices para el tratamiento de una enfermedad proliferativa mediante la coadministración con el Compuesto B o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

Ejemplos

Los siguientes ejemplos ilustran la invención descrita aquí. La combinación del Compuesto A1 y el Compuesto B y la combinación del Compuesto A2 y el Compuesto B son parte de la invención reivindicada. Las otras combinaciones en los ejemplos son ejemplos de referencia de la combinación de la divulgación. Los efectos beneficiosos de la combinación farmacéutica de la presente invención también se pueden determinar mediante otros modelos de prueba conocidos por los expertos en la técnica pertinente.

Ejemplo A: Identificar Combinaciones Sinérgicas basadas en el modelo de Aditividad de Loewe con el cribado de alto rendimiento

Se evaluó la interacción sinérgica de las combinaciones de fármacos con base al Modelo de Aditividad de Loewe usando el software Chalice [CombinatoRx, Cambridge MA]). Véase, Lehar J, Krueger AS, Avery W, et al., 2009, en Las combinaciones sinérgicas de fármacos tienden a mejorar la selectividad terapéuticamente relevante, Nat Biotechnol. 27:659-66. El software compara la respuesta (% de inhibición o % de reducción de la viabilidad celular) del tratamiento de fármacos de una combinación de dos agentes a la respuesta de los agentes actuando solos, frente al modelo aditivo de referencia del fármaco con una dosis igual del mismo (el Modelo de Aditividad de Loewe). Las desviaciones de los aditivos de dosis se pueden evaluar numéricamente con una "puntuación de sinergía", que cuantifica la resistencia global del efecto de combinación. Una puntuación sinergia >0 indica una combinación sinérgica. Con el fin de garantizar que solamente se seleccionaron combinaciones fuertemente sinérgicas, los criterios de aceptación se fijaron en un nivel más alto. Las combinaciones totalmente sinérgicas se definieron como aquellas que tienen tanto una puntuación sinérgica >2, una puntuación sinérgica que es dos veces mayor que el modelo de fondo (sin sinergia) predeciría, como una eficacia máxima de >100, un valor equivalente a equilibrio, tal como se determina del cálculo de inhibición del crecimiento.

Veinte líneas celulares de neuroblastoma humano completamente caracterizadas (Tabla 1) abajo se trataron con los Compuestos A1, A2, A3 y B, de forma individual, y con las siguientes combinaciones:

(1) Compuestos A1 y B;

(2) Compuestos A2 y B, y

(3) Compuestos A3 y B. Después del tratamiento, la viabilidad celular (cantidad de células viables) para cada una de las mezclas de ensayo se determinó mediante el ensayo de viabilidad celular luminiscente CellTiter-

Glo® (CTG) (Promega) se describe en la sección de Ensayo, abajo. Quince de 20 de las líneas celulares generaron datos de detección primaria de alta calidad; las otras cinco líneas celulares o bien no crecieron o produjeron datos que eran demasiado ruidosos y por lo tanto no se incluyeron en el análisis. La respuesta al tratamiento (% de reducción de la viabilidad celular) se analizó usando el software de Chalice [CombinatoRx, 5 Cambridge Ma]). La evaluación de los datos y generación de gráficos se realizó utilizando el software Microsoft Excel y el software Chalice.

Las puntuaciones de sinergia de las tres combinaciones ensayadas se muestran en la Tabla 2 y la Tabla 3. La sinergia se observó para la combinación de A1 y B en LAN1 (F1 174 L), LAN5 (R1275Q), NB-1643 (R1 275Q), NB-SD (F1 174L), y las células NB-1691 (WT). Se observa que este co-tratamiento era especialmente sinérgico 10 en células LAN-5. Se observó sinergia para la combinación de A2 y B en Kelly (F1 74L), LAN-5 (R1275Q), SK- N-BE (2) (WT), y NB-1691 (WT). La auto-combinación del Compuesto A2 en la línea celular NB-1 (ALK- amplificado) también fue identificada como probablemente sinérgica debido a la potente actividad individual de los agentes individuales de este compuesto en esta línea celular. No se observó sinergia para la combinación de A3 y B en cualquiera de las líneas celulares ensayadas.

15 Tabla 2. Puntajes de Sinergia de la Combinación A1 x B en Células de Neuroblastoma Humano

Nombre: Estado de ALK Comp A1 x Comp B Autocruce de Autocruce de



: Compuesto A1 Compuesto B

Medio: Error Efecto Medio Error Efecto Medio Error Efecto



: Combo Combo Combo

Q. CD: Max Max Max

CMP-134: WT 0.357 0.159 50.5 0.223 0.016 26.1 0.388 0.033 52.3

IMR-5: WT 0.715 0.276 79.2 0.884 0.022 79.2 0.788 0.047 82.0

KELLY: F1174L 1.311 0.229 91.8 0.900 0.412 26.1 0.255 0.397 60.5

LAN-1: F1174L 2.259 0.242 153.4 1.011 0.038 114.2 1.321 0.043 142.3

LAN-5: R1275Q 4.073 0.711 115.8 1.731 0.044 166.1 1.161 0.038 99.2

NB-1: WT Amp 1.421 0.579 172.8 1.607 0.054 181.9 1-429 0.036 111.0

NB-1643: R1275Q 2.573 0.444 129.0 1.231 0.046 151.1 0.929 0.030 76.4

BN-1691: WT 2.031 0.402 112.0 0.760 0.034 111.9 1.032 0.051 121.1

NB-SD: F1174L 2.499 0.652 128.2 0.908 0.039 141.5 1.476 0.034 98.6

NGP: WT 0.294 0.087 55.9 0.822 0.016 104.1 0.084 0.011 31.2

NLF: WT 0.202 0.070 41.3 0.152 0.082 27.1 0.122 0.124 43.9

SH-SYSY F1174L: 1.701 0.379 92.9 0.638 0.451 91.5 0.811 0.813 86.8

SK-N-AS: WT 0.615 0.150 73.1 0.374 0.231 42.4 0.503 0.273 64.7

SK-N- BE(2) WT: 0.430 0.140 77.3 0.246 0.014 25.2 0.628 0.037 64.7

SK-N-FI: WT 1.267 0.193 70.6 1.135 0.022 59.7 0.4 3 5 0.036 60.3

Media: 1.450 0.841 0.757

Media: 1.311 0.884 0.788

Los valores en NEGRILLA fueron identificados como interacción sinérgica con base en la combinación de una puntuación de Sinergia >2 y un efecto máximo de la combinación >100.

Claims

REIVINDICACIONES

5

10

1. Una combinación farmacéutica que comprende, juntos o por separado, (a) un primer agente que es

(i) Compuesto A1, descrito por la Fórmula A1 a continuación:

imagen1

o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, o

(ii) Compuesto A2, descrito por la Fórmula A2 a continuación

imagen2

y (b) un segundo agente que es

Compuesto B, descrito por la Fórmula B a continuación

imagen3

o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, para uso en el tratamiento de neuroblastoma.
2. La combinación farmacéutica para uso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el primer agente es el Compuesto A1, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo,

5 y el segundo agente es el Compuesto B, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
3. La combinación farmacéutica para uso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el primer agente es el Compuesto A2, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo,

y el segundo agente es el Compuesto B, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
4. Una composición farmacéutica que comprende una combinación farmacéutica definida en una cualquiera de 10 las reivindicaciones 1 a 3, y al menos un excipiente para uso en el tratamiento de neuroblastoma.
5. La combinación para uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, o la composición farmacéutica para uso de acuerdo con la reivindicación 4, en donde el neuroblastoma es un cáncer positivo para ALK.
6. La combinación para uso de acuerdo con la reivindicación 5, o la composición farmacéutica para uso de 15 acuerdo con la reivindicación 5, en donde el cáncer depende de una mutación del gen ALK.
7. La combinación para uso de acuerdo con la reivindicación 5, o la composición farmacéutica para uso de acuerdo con la reivindicación 5, en donde el cáncer depende de una amplificación del gen ALK.
8. La combinación para uso de acuerdo con la reivindicación 6, en donde la mutación del gen ALK es R1275Q.

Gráfica de Inhibición Datos Experimentales

Curvas de un Único agente

Matriz de Dosis

imagen4

Curvas de un Único agente

Conc. Agente B

Gráfica de inhibición en Exceso Comparación de los datos experimentales frente al modelo aditivo de dosis

Exceso de Loewe

Osl

I

C

:o

’u

<

(U

-M

£Z

<U

w

<

Csl

0

10 30 31 33 21 -23

0

15 33 37 33 20 -22

0

6 25 31 32 15 -10

1

5 y 20 20 15 -5

0

1 , ¿1 -3 4 12 -10

^1 0 2 8 12 -5

0

1 3 -2 5 10 -7

Área en donde se observa sinergia en los datos experimentales

.079 .71

Conc. Agente B
6.4

en

J_

CT>

CT>

ro

II

:o

u

JD

(D

T3

"5

>

FIG.1

Antagonismo

Observado

imagen5

Matriz de Dosis

Exceso de Loewe | . |LAN-1|

ro

lT¡

i

-

CT)

<

LO"

o

-

+-■

CjO

Lñ

co

d)

O

13

Q.

-

E

o

o-

65

67 68 76 76 81 88

54

44 40 39 54 66 77

11

27 22 27 45 58 71

4

25 -1 37 34 34 52

6

0 11 19 25 45 55

6

7 37 23 49 43 60

0

15 -2 18 34 38 49

II

Q.

E

o o

2

5 6 13 14 18 26

-3

5 2 -2 10 18 26

2

15 6 1 9 14 22

3

21 -11 17 1 -9 4

6

-3 3 2 -6 3 7

6

4 29 5 18 1 12

0

13 -9 I 4 -4 1

.066 .59 5.3

Compuesto B (¡J-M)
0 .066 .59 5.3

Compuesto B (|¿M)

Matriz de Dosis | . |LAN—11 Exceso de Loewe | . |LAN—11

en

S LO to

OJ 0

Q.

E

o

o

65

77 63 68 61 73 77

34

3 34 48 47 53 67

15

-22 13 8 20 42 73

1

-11 -7 29 28 46 62

6

-15 21 -8 27 25 63

7

-5 30 -17 21 1 51

0

7 6 1 15 34 65

LO

LO

cr>

4

17 2 7 0 11 14

-5

-37 -6 5 0 -3 5

5

-33 -1 -8 -7 -6 12

-1

-13 -9 23 12 3 1

6

-16 20 -11 13 -15 2

7

-5 30 -19 9 -39 -9

0

7 6 -1 5 -5 4
0 .066 Compuesto

Matriz de Dosis | . |LAN—11
5.4 Al (|iM)
0 .066 .59 5.4

Compuesto A1 (^M)

Exceso de Loewe | . |LAN—11

) 5.4

56 63 57 53 47 85 59

-

45 14 55 63 36 56 56

en co lO "

30 19 35 26 42 45 48

o - tn CO CU CO - =5 O

18 36 36 49 32 46 64

22

18 22 21 42 50 57

a • £ ■

6 23 4 25 24 56 64

o u o-

0 6 22 18 30 45 56

en

tn c_D <U co.

Q °

E o

U o-
0 .066 .59 5.4

Compuesto B (|xM)

3

11 5 1 -6 32 4

-1

-32 9 17 -12 6 3

-5

-16 -1 -12 0 -2 -4

-4

12 10 19 -6 -1 11

9

4 4 -5 6 4 4

0

13 -11 1 -12 10 12

0

0

9 -4 -5 -1 3

FIG.2
0 .066 .59 5.4

Compuesto B (|»M)
3.5-

UJ

LO

3-
2.5-

CU

T3

imagen6

2 1.5-

cu

tUD

i_

(D

C

lo

1-

imagen7
0.5-

imagen8

imagen9

Conteo Media Desv. Est. Vlrs. Atípicos

COMBO ENFERMEDAD

SELJF COMBO NORMAL SELF

ALK x CDK4/6

ALK x ALK CDK4/6 x CDK4/6 ALK x CDK4/6 ALK x ALK CDK4/6 x CDK4/6

7

7

7

8 8 8
2.25879

1.01121 1.1611 0.522618 0.567048 0.468938
0.945082

0.399011 0.431052 0.620052 0.36963 0.319542

1

0 0 1 0 0

FIG.3

imagen10

Gráfica Fa-CI

Para la proporción constante en la combinación Isobologramas a EDjq , ED75 , V EDgQ

imagen11

Isobolograma Normalizado

Para proporciones no constantes de la combinación

imagen12

FIG.5C

Gráfica Fa-DRI

imagen13

Fa

FIG.5D

-P2*

UJ

imagen14

FIG.6A

imagen15

FIG.6B

imagen16

FIG.6C

-P*

-p*

imagen17

imagen18

FIG.6D FIG.6E

imagen19

FIG.6F

imagen20

FIG.7A

-P*

ui
4.0

"d

« 3.0-

CD

2 2.0- I

> 1.0- 0-

®CpdB

1
4.0

imagen21

FIG.7B

imagen22

Efecto Pardal

FIG.7C

-P2*

CTi

imagen23

imagen24

Compuesto B (nM)

FIG.7D

FIG.7E

4000 ^ 3000

o 2000 ~

S 1000^

Q.

E o u

xED50 +ED75 ®ED90

imagen25

500000 100000015000002000000 Compuesto B (nM)

FIG.7F

-P*

imagen26

FIG.8A

1.0-i
0.8-

O 4—* u

0.6-

(D M— LU

0.4-
0.2i

imagen27

®---

x (CpdA! +B) + CpdA -| «CpdB

5000 10Ó00 15000 20000

Dosis (nM)

FIG.8B

imagen28

FIG.8C

-p*

00

imagen29

FIG.8D

imagen30

Compuesto B (nM)

FIG.8E

x ED50 +ED75 ®ED90

imagen31

200000 400000 600000 800000 Compuesto B (nM)

FIG.8F

imagen32

imagen33

FIG.9A FIG.9B

-P2*

LD

imagen34

FIG.9C

1.0-1

un

O

imagen35

0-
-1.0-
-2.0-
-3.0-

imagen36
0.2 0.4 0.6 0.8

Efecto Parcial

FIG.9D

imagen37

O

4—'

C/l

<U

13

Q_

E

o

u

imagen38

o

imagen39

FIG.9E

x ED50 +ED75 ®ED90

3000 6000 9000 12000

Compuesto B (nW)

FIG.9F

a

|

o .

A *

FIG.10A

imagen40

FIG.10B

Comp. B CI50 Comp. Al CI50 + Comp. BCI50

imagen41

FIG.10C FIG.10D

Cambio a partir del UTC

U1

NJ

imagen42

Compuesto A1 (fiM)

FIG.1 1A

u

i—

=)

Cl

O

a

<

~o

ro

T3

*U

X

O

-t—'

O

3

"aj

-o

.i ro

tí

^ !s

- 5

lo

E

Viabilidad (GF-AFC) Apoptosis (Caspasa 3/7)
0.8
0.6
0.4
0.2

0

>>

&&~ÍS-

Viabilidad (GF-AFC)

0 1000 2000 3000

Compuesto B (nM)

FIG. 11 B

T1.8
-1.6
-1.4

1.2

-1
0.8
-0.6
-0.4
-0.2

0

4000

Apoptosis (Caspasa 3/7)

imagen43

u

en

f—

\r>

ID

O

"<ü "O

Q- O Q-

~

<

nj Cl

T3 03 TC

03

[u

O

X

O

£

4-J O

OJ

4~>

u

CJ

Combinación Al y B, nM Al

Al: 1/4 1/2 1 2

B: 1/4 1/2 1 2

4 veces CI50 F I G . 1 1 C

4 veces 050

m

3)

NJ

o

O)

co

o

Cambio a partir del UTC (Citotoxicidad/Apoptosis)

U1

u>

u

I-

"á>

“O

nj

o

E

imagen44

200 400 600 800 1000

Compuesto Al, pM

FIG.12A

imagen45

Viabilidad (CTG)

Combinación Al y 8, nM Al

Al: 1/41/2 1 2

B: 1/41/2 1 2

FIG.12C

Compuesto B, nM

FIG.12B

imagen46

4 veces CISO 4 veces CISO

Ln

Viabilidad (GF-AFC) Apoptosis (Caspasa 3/7)

-O- Viabilidad (GF-AFC)

Apoptosis (Caspasa 3/7)

imagen47

FIG.13A

imagen48

imagen49

imagen50

=> o

E o

<TJ ±L O O

Combinación Al y B, nM Al

A1: 1/4 1/2 1 2

B; 1/4 1/2 1 2

4 veces CI50 _ , _

4 veces CI50 Fl G . 1 3 C

m

o> oí

NJ

O

O)

C0

O

Cambio a partir del UTC (Citotoxicidad/Apoptosis)

4 veces CI50

Cambio a partir del UTC (Viabilidad)

O O O O ^

ofo^bibo^io^

imagen51

ro b oo Ko 4^. Cambio a partir del UTC (Citotoxicidad/Apoptosis)

8102-90-61

10899ZH3

Dosis del Fármaco (CI50)

tALK 220 kDa tALK 140 kDa +

P-ALK Tyr 1604 220 kDa + P-ALK Tyr 1604 140 kDa

P-ALK Tyr 1604 80 kDa

imagen52

P-ALK Tyr 1278 220 kDa ■+ P-ALK Tyr 1278 140 kDa ^

P-ALK Tyr 1278 80 kDa ^

imagen53

CTRL CpdA1 CpdB Combinación

FIG.15

imagen54

Fármaco (CI50)

ALK 220 kDa ALK 140 kDa

P-ALK Tyr 1604220 kDa P-ALKTyr 1604140 kDa

P-ALK Tyr 1278 140 kDa

tRb P-Rb S795

GAPDH

CNI tT C\| --f- 04

imagen55

CTRL CpdA1 CpdB

Combinación

FIG.17

imagen56

o

imagen57

Grupo 2 - Compuesto Al a

50mg/kg OD

M Grupo 3 - Compuesto B a
187.5—250mg/kg OD

Grupo 4 - Compuesto Al 50mg-/kg

+ Compuesto B 187.5-250 mg/kg DO

imagen58

Tiempo (Semanas)

FIG.18

imagen59

FIG.19A

imagen60

Volumen del Tumor (cm3) Volumen del Tumor (cm3)

1.0

imagen61
0.1

i------1-------1-------1--------r

1 2 3 4 5

Tiempo (Semanas)

FIG.19B

n

6

imagen62

100% 80% H

oj

'<_)

c

a>

>

>

a»

Q-

Z5

LO

s°

o'v

60% -

40% -

20%-

0 1

© Control

▲ Grupo 2 ■ Grupo 3 ♦ Grupo 4

i--------1---------1-----------1---------1---------1---------1-----------1---------1

4 5 6 7 8 9 10 11 12

Tiempo (Semanas)

FIG.20

Eficacia Máxima de la Combinación

Comp Al xCompAI

200

180

160

140

120

100

80

60

40

20

0

200

180

160

140

120

100

80

60

40

20

0

200

180

160

140

120

100

80

60

40

20

0

imagen63

0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4

Color por Enfermedad ALK

□ ENFERMEDAD ■ NORMAL

Forma por línea Celular

□ 415-IMDM O CHP-134 A IMR-5

V KELLY < LAN—1 > LAN-5 = NB-1 D NB-1643 * NB-1691 83 NB-SD ☆ NLF O SK-SY5Y

□ SK-N-AS O SK—N—BE(2 O SK-N-FI

Puntaje de Sinergia

FIG. 21

Inhibición (%)

CTl

U)

<

O

+->

l/l

(U

3

Q.

E

o

u

OO

Csl -

CNI

Csl

O

LO

Csl

O

o

o

40

32 40 41 43 47 51 50 54

17

23 27 35 30 44 51 54 52

10

-5 21 13 28 29 38 44 48

-6

-19 0 9 -1 25 34 41 47

-9

-22 -11 -9 1 9 26 27 34

-7

-5 -14 9 9 12 31 37 38

-18

-22 -4 -2 -5 15 37 39 24

-8

12 -20 17 -3 21 19 36 52

-7

-18 -8 6 23 11 29 35 31

.0074

.066

.6
5.4

Compuesto B

Compuesto Al

Isobolograma

c.

imagen64

imagen65

Compuesto B
5.4fj,M

imagen66

en

Ul
5.358

50 52 53 56 58 63 66 76 90 5.358 1 3 3 6 9 14 17 23 -0

1.786

45 51 53 55 54 60 69 74 93 1.786 -2 4 6 8 7 13 21 21 3

^ 0.596

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Compuesto Al

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Inhibición (%)

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0.033-

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1 en i C_aI 1 en i CO -22 OO 1 CaJ 20
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0.893-

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0.033-

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0.298-

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2.679-

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Matriz de Dosis |SH-SY5Y Matriz de Exceso de Loewe |SH_SY5Y