ES2694706B2 - Procedimiento para incrementar la produccion de glucosinolatos en cultivos celulares - Google Patents
Procedimiento para incrementar la produccion de glucosinolatos en cultivos celulares Download PDFInfo
- Publication number
- ES2694706B2 ES2694706B2 ES201730836A ES201730836A ES2694706B2 ES 2694706 B2 ES2694706 B2 ES 2694706B2 ES 201730836 A ES201730836 A ES 201730836A ES 201730836 A ES201730836 A ES 201730836A ES 2694706 B2 ES2694706 B2 ES 2694706B2
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- culture medium
- process according
- glucosinolates
- concentration
- plant cells
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims description 28
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 24
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 title claims description 16
- 125000004383 glucosinolate group Chemical group 0.000 claims description 54
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 claims description 51
- GEWDNTWNSAZUDX-UHFFFAOYSA-N methyl 7-epi-jasmonate Natural products CCC=CCC1C(CC(=O)OC)CCC1=O GEWDNTWNSAZUDX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 48
- GEWDNTWNSAZUDX-WQMVXFAESA-N (-)-methyl jasmonate Chemical compound CC\C=C/C[C@@H]1[C@@H](CC(=O)OC)CCC1=O GEWDNTWNSAZUDX-WQMVXFAESA-N 0.000 claims description 47
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 42
- FMGBNISRFNDECK-UHFFFAOYSA-N coronatine Natural products CCC1CC1(C(O)=O)NC(=O)C1=CC(CC)CC2C(=O)CCC12 FMGBNISRFNDECK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 25
- 229920000858 Cyclodextrin Polymers 0.000 claims description 23
- FMGBNISRFNDECK-HUJGMYITSA-N coronatin Chemical compound CC[C@@H]1C[C@@]1(C(O)=O)NC(=O)C1=C[C@H](CC)C[C@@H]2C(=O)CC[C@H]12 FMGBNISRFNDECK-HUJGMYITSA-N 0.000 claims description 23
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 21
- 229940097362 cyclodextrins Drugs 0.000 claims description 20
- 241000219198 Brassica Species 0.000 claims description 9
- 235000011331 Brassica Nutrition 0.000 claims description 9
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 7
- HFHDHCJBZVLPGP-UHFFFAOYSA-N schardinger α-dextrin Chemical class O1C(C(C2O)O)C(CO)OC2OC(C(C2O)O)C(CO)OC2OC(C(C2O)O)C(CO)OC2OC(C(O)C2O)C(CO)OC2OC(C(C2O)O)C(CO)OC2OC2C(O)C(O)C1OC2CO HFHDHCJBZVLPGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 claims description 4
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 claims description 4
- 238000000926 separation method Methods 0.000 claims description 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 39
- 235000011299 Brassica oleracea var botrytis Nutrition 0.000 description 25
- 235000017647 Brassica oleracea var italica Nutrition 0.000 description 24
- 240000003259 Brassica oleracea var. botrytis Species 0.000 description 24
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 17
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 14
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 12
- 239000005712 elicitor Substances 0.000 description 10
- SUVMJBTUFCVSAD-UHFFFAOYSA-N sulforaphane Chemical compound CS(=O)CCCCN=C=S SUVMJBTUFCVSAD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 8
- 230000000975 bioactive effect Effects 0.000 description 7
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 7
- 241000219193 Brassicaceae Species 0.000 description 6
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 6
- IIAGSABLXRZUSE-HOWGQALGSA-N 4-Methoxyglucobrassicin Natural products S(=O)(=O)(O/N=C(/S[C@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](CO)O1)\Cc1c2c(OC)cccc2[nH]c1)O IIAGSABLXRZUSE-HOWGQALGSA-N 0.000 description 5
- SUVMJBTUFCVSAD-JTQLQIEISA-N 4-Methylsulfinylbutyl isothiocyanate Natural products C[S@](=O)CCCCN=C=S SUVMJBTUFCVSAD-JTQLQIEISA-N 0.000 description 5
- 240000007124 Brassica oleracea Species 0.000 description 5
- DNDNWOWHUWNBCK-PIAXYHQTSA-N [(2s,3r,4s,5s,6r)-3,4,5-trihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl] (1z)-2-(1h-indol-3-yl)-n-sulfooxyethanimidothioate Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1S\C(=N/OS(O)(=O)=O)CC1=CNC2=CC=CC=C12 DNDNWOWHUWNBCK-PIAXYHQTSA-N 0.000 description 5
- IIAGSABLXRZUSE-KYKLFQSUSA-N [(2s,3r,4s,5s,6r)-3,4,5-trihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl] (1z)-2-(4-methoxy-1h-indol-3-yl)-n-sulfooxyethanimidothioate Chemical compound C1=2C(OC)=CC=CC=2NC=C1C\C(=N\OS(O)(=O)=O)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O IIAGSABLXRZUSE-KYKLFQSUSA-N 0.000 description 5
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 5
- JRJLFQURIXLQJD-YCLXMMFGSA-N glucobrassicin Natural products OC[C@@H]1O[C@H](SC(=NOS(=O)(=O)O)[C@H](O)[C@H](O)Cc2c[nH]c3ccccc23)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O JRJLFQURIXLQJD-YCLXMMFGSA-N 0.000 description 5
- 235000015487 sulforaphane Nutrition 0.000 description 5
- 229960005559 sulforaphane Drugs 0.000 description 5
- RUQCCAGSFPUGSZ-OBWQKADXSA-N Glucoraphanin Natural products C[S@](=O)CCCCC(=NS(=O)(=O)O)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O RUQCCAGSFPUGSZ-OBWQKADXSA-N 0.000 description 4
- 206010020649 Hyperkeratosis Diseases 0.000 description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 4
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 4
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 4
- 230000036541 health Effects 0.000 description 4
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 4
- 150000002540 isothiocyanates Chemical class 0.000 description 4
- 229930000223 plant secondary metabolite Natural products 0.000 description 4
- YGSDEFSMJLZEOE-UHFFFAOYSA-N salicylic acid Chemical compound OC(=O)C1=CC=CC=C1O YGSDEFSMJLZEOE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000894007 species Species 0.000 description 4
- GMMLNKINDDUDCF-JRWRFYLSSA-N [(2s,3r,4s,5s,6r)-3,4,5-trihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl] (1e)-5-[(r)-methylsulfinyl]-n-sulfooxypentanimidothioate Chemical compound C[S@@](=O)CCCC\C(=N/OS(O)(=O)=O)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GMMLNKINDDUDCF-JRWRFYLSSA-N 0.000 description 3
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 3
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 3
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 3
- DNDNWOWHUWNBCK-NMIPTCLMSA-N indolylmethylglucosinolate Chemical class O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1S\C(=N\OS(O)(=O)=O)CC1=CNC2=CC=CC=C12 DNDNWOWHUWNBCK-NMIPTCLMSA-N 0.000 description 3
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 3
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 3
- OYYJOBIUXKENQW-USACIQFYSA-N neoglucobrassicin Natural products COn1cc(CC(=NS(=O)(=O)O)SC[C@H]2O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]2O)c3ccccc13 OYYJOBIUXKENQW-USACIQFYSA-N 0.000 description 3
- 235000017807 phytochemicals Nutrition 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 210000001938 protoplast Anatomy 0.000 description 3
- 230000004044 response Effects 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 3
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 2
- CSMYCLLHRFFFLG-ABVFHMHLSA-N 4-Hydroxyglucobrassicin Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1S\C(=N\OS(O)(=O)=O)CC1=CNC2=CC=CC(O)=C12 CSMYCLLHRFFFLG-ABVFHMHLSA-N 0.000 description 2
- CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N Ascorbic acid Chemical compound OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1O CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000011302 Brassica oleracea Nutrition 0.000 description 2
- 235000003899 Brassica oleracea var acephala Nutrition 0.000 description 2
- 235000011301 Brassica oleracea var capitata Nutrition 0.000 description 2
- 235000001169 Brassica oleracea var oleracea Nutrition 0.000 description 2
- 244000308180 Brassica oleracea var. italica Species 0.000 description 2
- 241000218980 Brassicales Species 0.000 description 2
- FMGBNISRFNDECK-CZSBRECXSA-N Coronatine Chemical compound CC[C@H]1C[C@]1(C(O)=O)NC(=O)C1=C[C@H](CC)C[C@@H]2C(=O)CC[C@H]12 FMGBNISRFNDECK-CZSBRECXSA-N 0.000 description 2
- CSMYCLLHRFFFLG-IRHMCKRBSA-N DS-7-methylsulfanylheptylGL Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1SC(=NOS(O)(=O)=O)CC1=CNC2=CC=CC(O)=C12 CSMYCLLHRFFFLG-IRHMCKRBSA-N 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 description 2
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 2
- PVNIIMVLHYAWGP-UHFFFAOYSA-N Niacin Chemical compound OC(=O)C1=CC=CN=C1 PVNIIMVLHYAWGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229940123237 Taxane Drugs 0.000 description 2
- LUKBXSAWLPMMSZ-OWOJBTEDSA-N Trans-resveratrol Chemical compound C1=CC(O)=CC=C1\C=C\C1=CC(O)=CC(O)=C1 LUKBXSAWLPMMSZ-OWOJBTEDSA-N 0.000 description 2
- PKKMITFKYRCCOL-JMZFCNQTSA-N [(2s,3r,4s,5s,6r)-3,4,5-trihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl] (1z)-2-(1-methoxyindol-3-yl)-n-sulfooxyethanimidothioate Chemical compound C12=CC=CC=C2N(OC)C=C1C\C(=N\OS(O)(=O)=O)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O PKKMITFKYRCCOL-JMZFCNQTSA-N 0.000 description 2
- CSMYCLLHRFFFLG-WVGMDVCISA-N [(2s,3r,4s,5s,6r)-3,4,5-trihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl] (1z)-2-(4-hydroxy-1h-indol-3-yl)-n-sulfooxyethanimidothioate Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1S\C(=N/OS(O)(=O)=O)CC1=CNC2=CC=CC(O)=C12 CSMYCLLHRFFFLG-WVGMDVCISA-N 0.000 description 2
- 208000029560 autism spectrum disease Diseases 0.000 description 2
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 2
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 2
- -1 coronatine mimics octadecanoid Chemical class 0.000 description 2
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 description 2
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 2
- 239000012737 fresh medium Substances 0.000 description 2
- 230000035784 germination Effects 0.000 description 2
- 125000002791 glucosyl group Chemical group C1([C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O1)CO)* 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 201000005202 lung cancer Diseases 0.000 description 2
- 208000020816 lung neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 description 2
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 2
- FJKROLUGYXJWQN-UHFFFAOYSA-N papa-hydroxy-benzoic acid Natural products OC(=O)C1=CC=C(O)C=C1 FJKROLUGYXJWQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 2
- 230000035790 physiological processes and functions Effects 0.000 description 2
- 230000037039 plant physiology Effects 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 2
- LXNHXLLTXMVWPM-UHFFFAOYSA-N pyridoxine Chemical compound CC1=NC=C(CO)C(CO)=C1O LXNHXLLTXMVWPM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 2
- 238000012552 review Methods 0.000 description 2
- 229960004889 salicylic acid Drugs 0.000 description 2
- 230000001932 seasonal effect Effects 0.000 description 2
- 229930000044 secondary metabolite Natural products 0.000 description 2
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 2
- 230000035882 stress Effects 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 108010058651 thioglucosidase Proteins 0.000 description 2
- 235000018991 trans-resveratrol Nutrition 0.000 description 2
- 235000013311 vegetables Nutrition 0.000 description 2
- PRPINYUDVPFIRX-UHFFFAOYSA-N 1-naphthaleneacetic acid Chemical compound C1=CC=C2C(CC(=O)O)=CC=CC2=C1 PRPINYUDVPFIRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- 241000219194 Arabidopsis Species 0.000 description 1
- 241000219195 Arabidopsis thaliana Species 0.000 description 1
- 206010003805 Autism Diseases 0.000 description 1
- 208000020706 Autistic disease Diseases 0.000 description 1
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 1
- 235000011303 Brassica alboglabra Nutrition 0.000 description 1
- 235000004221 Brassica oleracea var gemmifera Nutrition 0.000 description 1
- 244000308368 Brassica oleracea var. gemmifera Species 0.000 description 1
- 241000409707 Brassiceae Species 0.000 description 1
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 description 1
- ZKQDCIXGCQPQNV-UHFFFAOYSA-N Calcium hypochlorite Chemical compound [Ca+2].Cl[O-].Cl[O-] ZKQDCIXGCQPQNV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010009944 Colon cancer Diseases 0.000 description 1
- ZZZCUOFIHGPKAK-UHFFFAOYSA-N D-erythro-ascorbic acid Natural products OCC1OC(=O)C(O)=C1O ZZZCUOFIHGPKAK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000002353 D-glucosyl group Chemical group C1([C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O1)CO)* 0.000 description 1
- 244000024675 Eruca sativa Species 0.000 description 1
- 235000014755 Eruca sativa Nutrition 0.000 description 1
- 241000206602 Eukaryota Species 0.000 description 1
- 102000005720 Glutathione transferase Human genes 0.000 description 1
- 108010070675 Glutathione transferase Proteins 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- NWBJYWHLCVSVIJ-UHFFFAOYSA-N N-benzyladenine Chemical compound N=1C=NC=2NC=NC=2C=1NCC1=CC=CC=C1 NWBJYWHLCVSVIJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000004960 NAD(P)H dehydrogenase (quinone) Human genes 0.000 description 1
- 108020000284 NAD(P)H dehydrogenase (quinone) Proteins 0.000 description 1
- 244000061176 Nicotiana tabacum Species 0.000 description 1
- 235000002637 Nicotiana tabacum Nutrition 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- 206010060862 Prostate cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000000236 Prostatic Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 241000589516 Pseudomonas Species 0.000 description 1
- 241000589615 Pseudomonas syringae Species 0.000 description 1
- 102000006936 Quinone Reductases Human genes 0.000 description 1
- 108010033005 Quinone Reductases Proteins 0.000 description 1
- 244000088415 Raphanus sativus Species 0.000 description 1
- 235000006140 Raphanus sativus var sativus Nutrition 0.000 description 1
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 1
- 229930182558 Sterol Natural products 0.000 description 1
- 241001493533 Streptophyta Species 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 241001116500 Taxus Species 0.000 description 1
- 241001674343 Taxus x media Species 0.000 description 1
- JZRWCGZRTZMZEH-UHFFFAOYSA-N Thiamine Natural products CC1=C(CCO)SC=[N+]1CC1=CN=C(C)N=C1N JZRWCGZRTZMZEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001464837 Viridiplantae Species 0.000 description 1
- 229930003268 Vitamin C Natural products 0.000 description 1
- 235000009392 Vitis Nutrition 0.000 description 1
- 241000219095 Vitis Species 0.000 description 1
- 235000014787 Vitis vinifera Nutrition 0.000 description 1
- 240000006365 Vitis vinifera Species 0.000 description 1
- 230000036579 abiotic stress Effects 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- FYGDTMLNYKFZSV-DZOUCCHMSA-N alpha-D-Glcp-(1->4)-alpha-D-Glcp-(1->4)-D-Glcp Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O[C@@H]2[C@H](OC(O)[C@H](O)[C@H]2O)CO)[C@H](O)[C@H]1O FYGDTMLNYKFZSV-DZOUCCHMSA-N 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 1
- 235000000183 arugula Nutrition 0.000 description 1
- WHGYBXFWUBPSRW-FOUAGVGXSA-N beta-cyclodextrin Chemical class OC[C@H]([C@H]([C@@H]([C@H]1O)O)O[C@H]2O[C@@H]([C@@H](O[C@H]3O[C@H](CO)[C@H]([C@@H]([C@H]3O)O)O[C@H]3O[C@H](CO)[C@H]([C@@H]([C@H]3O)O)O[C@H]3O[C@H](CO)[C@H]([C@@H]([C@H]3O)O)O[C@H]3O[C@H](CO)[C@H]([C@@H]([C@H]3O)O)O3)[C@H](O)[C@H]2O)CO)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]3O[C@@H]1CO WHGYBXFWUBPSRW-FOUAGVGXSA-N 0.000 description 1
- 238000004166 bioassay Methods 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 230000004790 biotic stress Effects 0.000 description 1
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 1
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 1
- 210000000481 breast Anatomy 0.000 description 1
- FAPWYRCQGJNNSJ-UBKPKTQASA-L calcium D-pantothenic acid Chemical compound [Ca+2].OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC([O-])=O.OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC([O-])=O FAPWYRCQGJNNSJ-UBKPKTQASA-L 0.000 description 1
- 229960002079 calcium pantothenate Drugs 0.000 description 1
- 238000011088 calibration curve Methods 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000021466 carotenoid Nutrition 0.000 description 1
- 150000001747 carotenoids Chemical class 0.000 description 1
- 239000005018 casein Substances 0.000 description 1
- BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N casein, tech. Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CC(C)C)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(C(C)O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(COP(O)(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 description 1
- 241000902900 cellular organisms Species 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000013375 chromatographic separation Methods 0.000 description 1
- 210000001072 colon Anatomy 0.000 description 1
- 208000029742 colonic neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 1
- 125000004122 cyclic group Chemical group 0.000 description 1
- 239000007857 degradation product Substances 0.000 description 1
- 238000001784 detoxification Methods 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 235000018927 edible plant Nutrition 0.000 description 1
- 238000000132 electrospray ionisation Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 1
- 229930003935 flavonoid Natural products 0.000 description 1
- 150000002215 flavonoids Chemical class 0.000 description 1
- 235000017173 flavonoids Nutrition 0.000 description 1
- 235000012055 fruits and vegetables Nutrition 0.000 description 1
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 1
- 238000012239 gene modification Methods 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 230000005017 genetic modification Effects 0.000 description 1
- 235000013617 genetically modified food Nutrition 0.000 description 1
- 235000002532 grape seed extract Nutrition 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000000589 high-performance liquid chromatography-mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 229930005346 hydroxycinnamic acid Natural products 0.000 description 1
- DEDGUGJNLNLJSR-UHFFFAOYSA-N hydroxycinnamic acid group Chemical class OC(C(=O)O)=CC1=CC=CC=C1 DEDGUGJNLNLJSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000010359 hydroxycinnamic acids Nutrition 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 1
- 230000006882 induction of apoptosis Effects 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 229960000367 inositol Drugs 0.000 description 1
- CDAISMWEOUEBRE-GPIVLXJGSA-N inositol Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)[C@@H]1O CDAISMWEOUEBRE-GPIVLXJGSA-N 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- 230000000366 juvenile effect Effects 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 1
- 235000021073 macronutrients Nutrition 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 230000000442 meristematic effect Effects 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- 239000002366 mineral element Substances 0.000 description 1
- 239000008164 mustard oil Substances 0.000 description 1
- 229930014626 natural product Natural products 0.000 description 1
- 239000006199 nebulizer Substances 0.000 description 1
- 210000000653 nervous system Anatomy 0.000 description 1
- 229960003512 nicotinic acid Drugs 0.000 description 1
- 235000001968 nicotinic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000011664 nicotinic acid Substances 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 150000002885 octadecanoids Chemical class 0.000 description 1
- 229920001542 oligosaccharide Polymers 0.000 description 1
- 150000002923 oximes Chemical class 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- IZJDOKYDEWTZSO-UHFFFAOYSA-N phenethyl isothiocyanate Chemical compound S=C=NCCC1=CC=CC=C1 IZJDOKYDEWTZSO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000002989 phenols Chemical class 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001766 physiological effect Effects 0.000 description 1
- 229930000184 phytotoxin Natural products 0.000 description 1
- 239000003123 plant toxin Substances 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 230000003449 preventive effect Effects 0.000 description 1
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 235000008160 pyridoxine Nutrition 0.000 description 1
- 239000011677 pyridoxine Substances 0.000 description 1
- 230000001172 regenerating effect Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 1
- CDAISMWEOUEBRE-UHFFFAOYSA-N scyllo-inosotol Natural products OC1C(O)C(O)C(O)C(O)C1O CDAISMWEOUEBRE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000024053 secondary metabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000007226 seed germination Effects 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 1
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 1
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 1
- 235000003702 sterols Nutrition 0.000 description 1
- 150000003432 sterols Chemical class 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- DKPFODGZWDEEBT-QFIAKTPHSA-N taxane Chemical class C([C@]1(C)CCC[C@@H](C)[C@H]1C1)C[C@H]2[C@H](C)CC[C@@H]1C2(C)C DKPFODGZWDEEBT-QFIAKTPHSA-N 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 235000019157 thiamine Nutrition 0.000 description 1
- KYMBYSLLVAOCFI-UHFFFAOYSA-N thiamine Chemical compound CC1=C(CCO)SCN1CC1=CN=C(C)N=C1N KYMBYSLLVAOCFI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960003495 thiamine Drugs 0.000 description 1
- 239000011721 thiamine Substances 0.000 description 1
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 1
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 1
- 230000004614 tumor growth Effects 0.000 description 1
- 229910021642 ultra pure water Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000012498 ultrapure water Substances 0.000 description 1
- 235000019154 vitamin C Nutrition 0.000 description 1
- 239000011718 vitamin C Substances 0.000 description 1
- 229940011671 vitamin b6 Drugs 0.000 description 1
- 230000031143 xenobiotic glucuronidation Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/04—Plant cells or tissues
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Botany (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
DESCRIPCIÓN
Procedimiento para incrementar la producción de glucosinolatos en cultivos celulares
La presente invención se encuentra dentro del campo de la biotecnología y la farmacia, y se refiere a un procedimiento para incrementar la producción de glucosinolatos a partir de cultivos de células vegetales mediante la adición al medio de cultivo de coronatina (un análogo estructural y funcional del precursor octadecanoide del jasmonato de metilo) o jasmonato de metilo y, opcionalmente, ciclodextrinas.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
El brócoli (Brassica olerácea var. italica) también conocido como brécol, o bróculi, es una planta comestible que pertenece a la familia de las brasicáceas o crucíferas, al igual que la col, las coles de Bruselas, la coliflor, el rábano, el repollo y la rúcula.
Las plantas pertenecientes a la familia Brassicaceae (crucíferas) se caracterizan por poseer una gran cantidad de compuestos fitoquímicos, apareciendo la mayor concentración de estos en un estado fisiológico juvenil (en forma de brote), a diferencia del estado fisiológico adulto con menor contenido fitoquímico, debido a la dilución de estos compuestos provocada por el crecimiento de los diferentes tejidos. Dentro de esta familia de plantas, el brócoli (Brassica oleracea var. italica) se caracteriza por ser una hortaliza con efectos beneficiosos para la salud, cuya producción mundial (junto con la coliflor) ha ido incrementando en las últimas décadas alcanzando una producción mundial de 24.175.000 de toneladas.
Durante las últimas décadas, se ha prestado especial atención a los compuestos bioactivos naturales con potencial para el tratamiento y la prevención de enfermedades humanas. Los compuestos bioactivos presentes en frutas y hortalizas, son productos del metabolismo secundario de los vegetales, que se encuentran en cantidades pequeñas en las plantas, con respecto a otros macronutrientes, pero que contribuyen significativamente a la regulación de los mecanismos de protección frente a situaciones de estrés y tienen propiedades biológicas de interés para la prevención de algunas enfermedades en los humanos que los consumen. Además, contribuyen al
mantenimiento de los tejidos corporales, aumentan la resistencia a las infecciones, regulan el correcto desarrollo del sistema nervioso e intervienen en el crecimiento, y resultan beneficiosos para la síntesis de enzimas en el hígado (Hooper, L., & Cassidy, A. (2006). A review of the health care potential of bioactive compounds. Journal of the Science of Food and Agriculture, 86(12), 1805-1813) .
Entre los compuestos bioactivos del brócoli, cabe destacar los glucosinolatos y los compuestos fenólicos (flavonoides y ácidos hidroxicinámicos), además de otros nutrientes como carotenoides, esteroles, vitamina C, contenido en fibra y elementos minerales esenciales para la salud. Los glucosinolatos, también llamados tioglucósidos, son metabolitos secundarios aniónicos nitrógeno-azufrados que se encuentran casi exclusivamente en plantas de la familia Brassicaceae (cruciferas), entre ellas el brócoli, donde alcanzan la mayor concentración, es decir, son los compuestos bioactivos por excelencia del brócoli. El esqueleto básico de los glucosinolatos (P-D-tioglugósido-N-hidroxisulfato) consiste en un grupo p-D-tioglucosa, una oxima sulfonada y una cadena lateral derivada de los aminoácidos metionina, fenilalanina, o triptófano con una cadena lateral variable. La estructura química de los glucosinolatos y su contenido pueden variar entre especies y entre variedades dentro de la misma especie. En la actualidad se conocen más de 120 tipos de glucosinolatos en las cruciferas, siendo los más abundantes en brócoli la glucorafanina (80%), la glucobrasicina (8%), la 4-metoxi-glucobrasicina (4%) y la 1-metoxi-glucobrasicina (4%). Entre los compuestos de degradación de los glucosinolatos se encuentran los isotiocianatos comúnmente denominados "aceites de mostaza”, siendo el sulforafano el principal isotiocianato encontrado en el brócoli.
Los glucosinolatos son compuestos beneficiosos para la salud humana (ya que en algunos casos pueden ofrecer protección frente a algunos tipos de cáncer como el de pulmón, mama, colon y próstata Jeffery EH, Araya M. 2009. Physiological effects of broccoli consumption. Phytochemistry Reviews 8 (1): 283-298.). Sin embargo, estos metabolitos no son bioactivos en el animal que los consume hasta que han sido hidrolizados a isotiocianatos por la enzima mirosinasa. De hecho, los isotiocianatos son agentes preventivos del cáncer debido a su capacidad para inducir enzimas de fase II de desintoxicación tales como las quinonareductasas y las glutation-S-transferasas. El sulforafano, que es el producto de hidrólisis del glucosinolato glucorafanina es un mono-inductor muy potente del metabolismo de la fase II. Induce
la apoptosis e inhibe el crecimiento tumoral durante las fases de iniciación, promoción y progresión (Mi LX, Wang XT, Govind S, Hood BL, Veenstra TD, Conrads TP, Saha DT, Goldman R, Chung FL. 2007. The role of protein binding in induction of apoptosis by phenethylisothiocyanate and sulforaphane in human non-small lung cancer cells. Cancer Research 67: 6409-6416). También, recientemente se ha descrito el tratamiento con sulforafano en varios tipos de autismo con resultados positivos, observándose una mejoría significativa en pacientes que consumían brócoli de manera regular frente a aquellos que no lo consumían (Singh K, L. Connors S, A. Macklin E, D. Smith K, W. Fahey J, Talalay P, W. Zimmerman A. 2014. Sulforaphane treatment of autism spectrum disorder (ASD). PNAS. vol. 111 no.43, 15550-15555).
Los glucosinolatos son metabolitos secundarios que van a ser sintetizados y almacenados por las células vegetales para responder a diferentes estreses a los que se ven sometidas, de modo que su producción en células vegetales es aumentada por moléculas señalizadoras o elicitores que actúan como mensajeros químicos en la planta para contrarrestar el estrés biótico o abiótico al que se ve sometido la planta. El cultivo de células vegetales constituye una prometedora alternativa para la producción de compuestos naturales difíciles o poco rentables de preparar por síntesis química o que suponen graves agresiones al medio ambiente al recurrir a la fuente natural.
En este sentido, el cultivo in vitro de células vegetales ha abierto nuevos caminos como fuente renovable de compuestos bioactivos de gran valor añadido debido a las ventajas que presenta su utilización:
- son independientes de factores geográficos, estacionales y ambientales.
- constituyen sistemas de producción estables ya que aseguran la obtención continua de compuestos con calidad y productividad uniformes
- los requerimientos de espacio para el desarrollo de la producción son reducidos. - el proceso de purificación de los compuestos de interés es más fácil y se optimiza cuando éste se libera al medio de cultivo y se puede realizar a gran escala.
- permite obtener nuevos compuestos que no son sintetizados por las plantas de forma natural.
Hasta la fecha, no existen estudios previos donde se utilicen los cultivos celulares de brócoli para la producción de metabolitos de interés. Sin embargo, la adición exógena
de diversos elicitores (ácido salicílico o jasmonato de metilo (MJ)) a pellas de brócoli se ha usado con anterioridad para mejorar su composición fitoquímica. En este sentido Baenas et al., 2014 (Baenas, N.; García-Viguera, C.; Moreno, D.A. Biotic elicitors effectively increase the glucosinolates content in brassicaceae sprouts. J. Agric. Food Chem. 2014, 62, 1881-1889) mostraron que MJ provocó un aumento de la cantidad total de glucosinolatos en brotes de Brassica olerácea var. italica, correspondiendo la mayor producción a los glucosinolatos indólicos y glucorafanina, mientras que ácido salicílico produjo un menor aumento de la cantidad de glucosinolatos totales en estos brotes. Además, se ha descrito que una concentración de 250 pM de MJ aplicada a pellas de brócoli produjo un aumento tanto de glucosinolatos como de sus productos de degradación entre un 10 y un 300% (Ku KM, Jeffery EH, Juvik JA (2013) Influence of seasonal variation and methyl jasmonate mediated induction of glucosinolate biosynthesis on quinone reductase activity in broccoli florets. J Agric Food Chem 61: 9623-9631). Sin embargo, concentraciones menores de MJ (5-100 pM) no parecieron tener efecto en el contenido de glucosinolatos, a excepción de un incremento del 10% de indol-glucosinolatos cuando se aplicaba MJ a una concentración de 10 pM (Pérez-Balibrea S, Moreno DA, García-Viguera C (2011) Improving the phytochemical composition of broccoli sprouts by elicitation. Food Chem 129: 35-44).
Por otra parte, Alvárez et al. (2008) (Alvarez, S., He, Y., Chen, S. (2008). Comparative Investigations of the Glucosinolate-Myrosinase System in Arabidopsis Suspension Cells and Hypocotyls. Plant Cell Physiol. 49(3), 324-333) mostraron que suspensiones celulares de Arabidopsis thaliana derivadas de hipocótilo sintetizaron 7 glucosinolatos diferentes, entre los que se encontraron glucosinolatos indólicos o glucorafanina, algunos de los cuales estuvieron presentes en mayor cantidad que en el tejido de vegetal que dio origen a la suspensión celular. En conjunción a esto, este grupo mostró que la elicitación del cultivo celular con MJ provocó un considerable aumento de la producción de glucosinolatos, demostrando también un aumento de la actividad mirosinasa en suspensiones celulares A. thaliana tratadas con MJ.
Sin embargo, en ningún caso de describe el uso de coronatina o MJ como estimulador de la producción de glucosinolatos en cultivos celulares de brócoli. En ese sentido, se ha observado que la coronatina, una toxina producida por Pseudomonas syringae (Weiler, E. W., Kutchan, T. M., Gorba, T., Brodschelm, W., Niesel, U., & Bublitz, F. (1994). The Pseudomonas phytotoxin coronatine mimics octadecanoid signalling
molecules of higher plants. FEBS letters, 345(1), 9-13), es un análogo estructural de la forma activa el jasmonato de metilo (JA-Ile) y ha resultado ser un potente elicitor para la producción de taxanos y trans-resveratrol en cultivos celulares de Taxus sp y Vitis vinífera, respectivamente (Onrubia, M., Moyano, E., Bonfill, M., Cusidó, R. M., Goossens, A., & Palazón, J. (2013). Coronatine, a more powerful elicitor for inducing taxane biosynthesis in Taxus media cell cultures than methyl jasmonate. Journal of plant physiology, 170(2), 211-219; Almagro, L., Belchí-Navarro, S., Martínez-Márquez, A., Bru, R., & Pedreño, M. A. (2015). Enhanced extracellular production of transresveratrol in Vitis vinifera suspension cultured cells by using cyclodextrins and coronatine. Plant Physiology and Biochemistry, 97, 361-367).
DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN
El incremento de la síntesis de glucosinolatos se ejemplifica en cultivos celulares de Brassica oleracea variedad italica cv Chronos, una de las especies productoras de glucosinolatos más importantes. Los autores de la presente invención han observado que estableciendo cultivos de células vegetales y adicionando al medio de cultivo coronatina o jasmonato de metilo, se incrementa el rendimiento de producción y extracción de glucosinolatos.
Jasmonato de metilo Coronatina
Por tanto, un primer aspecto de la presente invención es el incremento de la producción de glucosinolatos, que comprende:
a. la adición de coronatina o jasmonato de metilo a un medio de cultivo,
b. poner en contacto células vegetales potencialmente productoras de glucosinolatos con el medio de cultivo de (a),
c. la incubación de las células vegetales del paso b) en el medio de cultivo del paso a), d. la separación de los glucosinolatos obtenidos tras el paso c) del cultivo celular.
Se entiende por células vegetales potencialmente productoras de glucosinolatos, cualquier línea celular capaz de producir glucosinolatos, bien de forma natural o tras modificación genética.
Cualquier tejido o célula vegetal capaz de producir glucosinolatos puede ser empleado en la invención. Esto incluye aquellas células procedentes de un organismo que, aunque no posean de forma natural la capacidad de sintetizar glucosinolatos, ha adquirido dicha capacidad mediante procesos de manipulación genética.
En una realización preferida de la invención, son tejidos o células vegetales procedentes de plantas de especies del orden Brassicales. En otra realización más preferida pertenecen a la familia Brassicaceae. En otra realización aún más preferida, pertenecen al género Brassica, en otra realización particular de la invención, pertenecen a la especie Brassica oleracea L. var. italica cv Chronos.
También se entienden como células vegetales potencialmente productoras de glucosinolatos aquellas que provienen de vitroplantas, órganos o tejidos de dichas vitroplantas, preferiblemente hojas de vitroplantas.
El término” planta” u "organismo” incluye partes, tejidos, células o protoplastos procedentes de la planta o del organismo, cultivos de células, cultivos de tejidos, callos, óvulos, embriones y semillas procedentes en última instancia de la planta o el organismo.
Taxonómicamente Brassica oleracea L. var. italica cv Chronos se define como un organismo celular, que pertenece al supereino Eukaryota, reino Viridiplantae, phylum Streptophyta, orden Brassicales, familia Brassicaceae, tribu Brassiceae, género Brassica.
El término "cultivo de células” en esta memoria, hace referencia a un cultivo de células aisladas del mismo o diferente tipo de tejido, o una colección de tales células organizadas en partes de una planta o en tejidos (cultivos tisulares). Tipos de cultivos
de este tipo son, por ejemplo, cultivos de protoplastos, callos (grupos de células vegetales indiferenciadas capaces de regenerar una planta completa) y células vegetales que están aisladas de plantas o partes de las plantas, tales como embriones, protoplastos, células meristemáticas, polen, hojas, raíces, anteras, pistilos, flores, semillas, vainas o vástagos de las plantas.
En otra realización preferida de la presente invención, la concentración de jasmonato de metilo es de entre 5 y 500 micromoles/por litro de medio de cultivo. Más preferiblemente la concentración de jasmonato de metilo es de entre 25 y 150 micromoles/L medio de cultivo y aún más preferiblemente de entre 75 y 125 micromoles/L medio de cultivo.
En otra realización preferida de la presente invención, la concentración de coronatina es de entre 0.1 y 100 micromoles/por litro de medio de cultivo. Más preferiblemente la concentración de coronatina es de entre 0.5 y 50 micromoles/L medio de cultivo y aún más preferiblemente de entre 0.75 y 10 micromoles/L medio de cultivo.
Opcionalmente, en la etapa a) se pueden adicionar, además del coronatina o jasmonato de metilo, ciclodextrinas al medio de cultivo.
Las ciclodextrinas son oligosacáridos cíclicos y se obtienen a partir de la degradación del almidón. A veces también son llamadas cicloamilosas. Presentan un exterior hidrofílico y una cavidad interior hidrofóbica donde pueden atrapar moléculas orgánicas no polares. Para cambiar las propiedades físicas y químicas de las ciclodextrinas se han desarrollado diversos derivados. Unos de los más utilizados son los derivados parcialmente metilados que tienen una solubilidad en agua hasta 150 veces superior a la del producto de partida.
Así, en otra realización preferida de la invención, las ciclodextrinas se eligen del grupo que comprende ciclodextrina metilada aleatoriamente (CDMA).
Preferiblemente, el grado de sustitución por metilos por unidad de glucosa (anhidra) de la CDMA es de entre 1 y 3. En particular, el grado de sustitución por metilos por unidad de glucosa (anhidra) de la CDMA es de 2. En otra realización preferida de este
aspecto de la invención un maltooligosacárido cíclico constituido por 7 unidades de D-glucosa unidas por enlaces glucosídicos de tipo a (1^ 4) (P-ciclodextrinas).
En otra realización preferida de este aspecto de la invención la concentración de ciclodextrinas es de entre 6,5 y 130 g/L medio de cultivo. Más preferiblemente la concentración de ciclodextrinas es de entre 10 y 100 g/L medio de cultivo y aún más preferiblemente es de entre 50 y 75 g/L medio de cultivo.
En otra realización preferida de la invención, la concentración celular es de entre 10 g peso fresco (pf)/l, 1g peso seco (ps)/l y 300 gpf/l, 15 gps/l. Más preferiblemente, la concentración celular es de entre 100 gpf/l, 5 gps/l y 250g pf/l, 10 gps/l.
Otro aspecto de la invención se refiere al uso de una composición, de ahora en adelante composición de la invención, que comprende coronatina o jasmonato de metilo para incrementar la producción de glucosinolatos en células vegetales con el potencial de producir glucosinolatos.
En una realización preferida, la composición de la invención comprende, además de coronatina o jasmonato de metilo, ciclodextrinas.
Otro aspecto de la invención se refiere al uso de un medio de cultivo, de ahora en adelante medio de cultivo de la invención, que comprende coronatina o jasmonato de metilo para incrementar la producción de glucosinolatos y en células vegetales con el potencial de producir glucosinolatos.
A lo largo de la descripción y las reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y características de la invención se desprenderán en parte de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Los siguientes ejemplos y figuras se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de la presente invención.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
FIG. 1: Gráfica que muestra la producción total de glucosinolatos en cultivos celulares de B. olerácea var. italica cv Chronos en respuesta a los diferentes elicitores tras 168 h de incubación.
FIG. 2: Gráfica que muestra la producción de 4-hidroxi-glucobrasicina, glucobrasicina, 4-metoxi-glucobrasicina y neoglucobrasicina por suspensiones celulares de B. olerácea var. italica cv Chronos en respuesta a diferentes elicitores tras 168 h de incubación.
EJEMPLOS
A continuación se ilustrará la invención mediante unos ensayos realizados por los inventores, que pone de manifiesto el efecto del uso de coronatina o jasmonato de metilo y opcionalmente, ciclodextrinas en la producción de glucosinolatos mediante la utilización de suspensiones celulares de B. olerácea L. var italica. cv Chronos.
Preparación y mantenimiento de material vegetal
Línea celular: Brassica olerácea L. var. italica cv Chronos
Para la inducción de callos de brócoli se utilizaron vitroplantas que se obtuvieron por germinación in vitro de semillas.
Germinación in vitro de semillas de brócoli
El objetivo fundamental de la germinación de semillas in vitro es la obtención de plantas estériles para su utilización en la inducción de líneas celulares de los diferentes órganos de la planta: raíz, tallo y hoja.
Para obtener las vitroplantas de brócoli se utilizaron semillas que se sometieron a un proceso de desinfección con etanol al 70% durante 1 minuto y a continuación, se sumergieron durante 15-20 minutos en una disolución de hipoclorito cálcico al 7% que contenía Tween 20 al 0,1%. Transcurrido este tiempo, las semillas se lavaron tres veces con agua destilada estéril trabajando a partir de este lavado y en las etapas siguientes en la cabina de flujo laminar.
Las semillas desinfectadas se transfirieron a tubos que contenían el medio de cultivo basado en el descrito por Murashige y Skoog (1962) (Murashige, T., &Skoog, F. (1962). A revised medium for rapid growth and bio assays with tobacco tissue cultures. Physiologia plantarum, 15(3), 473-497), suplementado con pantotenato cálcico (1mg/l),
mioinositol (100 mg/l), biotina (0,01 mg/l), piridoxina (1 mg/l), tiamina (1 mg/l), ácido nicotínico (1 mg/l) e hidrolizado de caseína (250 mg/L). Como fuente carbonada se utilizó sacarosa (30 g/l). Este medio se ajusta a pH 6,0 y se esteriliza mediante la aplicación de calor húmedo (autoclave) durante 20 minutos a 1.2 atmósferas de sobrepresión, adquiriendo la consistencia sólida mediante la adición de agar purificado (6,2 g/l) cuando el medio se enfría.
Obtención de callos y mantenimiento de suspensiones celulares de brócoli Los hipocótilos de las vitroplantas se utilizaron como fuente de explanto. Las placas Petri con los explantos se mantuvieron bajo un fotoperiodo de 16 horas de luz, 8 horas de oscuridad a una irradiancia de 17,4 w/m2 a 25 °C, observándose al cabo de 2-3 semanas la aparición de microcallos que se transfirieron a matraces de 250 mL de capacidad que contenían 100 ml del medio de cultivo anteriormente descrito suplementado con ácido naftalenacético (1 mg/l) y benciladenina (10 mg/l).
Las suspensiones celulares se iniciaron, a partir de callos friables, en matraces de 250 ml de capacidad que contenían 80 ml de medio cultivo sin agar. Las células en medio líquido se mantuvieron en un agitador orbital a 100 rpm, en las mismas condiciones de luz y Ta y se subcultivaron cada 17 días.
Elicitación de las células
En cada experiencia de elicitación se tomaron, en condiciones de esterilidad, entre 90 y 240 g de peso fresco de células por litro que habían sido previamente lavadas con medio fresco y filtradas. Utilizando esta densidad celular, las células se repartieron en matraces que contenían el medio fresco suplementado
- solo con jasmonato de metilo (en adelante, MJ) a una concentración 100 micromolar. - solo con coronatina (en adelante, Cor) a una concentración 1 micromolar
- sólo con una B-ciclodextrina metilada aleatoriamente con un grado de sustitución por metilos de entre 1,6 y 1,9 (en adelante, CDMA) a una concentración de 62,4 g/l.
- con ciclodextrinas anteriormente mencionadas (CDMA) a una concentración 62,5 g/l y con jasmonato de metilo (MJ) a una concentración 100 micromolar.
- con ciclodextrinas anteriormente mencionadas (CDMA) a una concentración 62,5 g/l y con coronatina (Cor) a una concentración 1 micromolar.
El jasmonato de metilo se esteriliza aparte del medio por filtración, disuelto en etanol, y posteriormente se mezcla con el resto del medio estéril. La concentración final de etanol en el medio de cultivo es de 0,2% en volumen.
Los matraces se incubaron en las mismas condiciones descritas anteriormente para su mantenimiento en medio líquido durante 168 horas.
Muestreo y preparación de muestras para análisis
Los cultivos incubados con elicitores se recogieron cada cierto tiempo para su análisis. Las células fueron separadas del medio por filtración realizando un ligero vacío, y se utilizaron para la extracción de los compuestos y posterior análisis por HPLC acoplado a un espectrómetro de masas.
Análisis de glucosinolatos
Una vez realizados los experimentos de elicitación, la extracción de los compuestos presentes en las células de brócoli, se realizó añadiendo 4,5 mL de metanol al 70% a 0,2 g de material vegetal previamente liofilizado. A continuación, las muestras se incubaron en un baño a 73°C durante 20 minutos. Durante el tiempo de incubación las muestras se agitan vigorosamente cada 5 minutos, con el fin de favorecer la eficiencia del proceso de extracción. Transcurrido ese tiempo las muestras se dejaron enfriar en hielo. Posteriormente las muestras se centrifugaron 15 minutos a 10000 rpm y 4°C. Se guardó el sobrenadante y el precipitado se resuspendió en 3 ml de metanol al 70%, para después agitar y volver a centrifugar 15 min, a 10000 rpm y 4°C. Tras la centrifugación, se mezclaron ambos sobrenadantes y se concentraron en un rotavapor. El residuo seco se resuspendió en 2 ml de agua ultrapura y se filtró a través de membranas inorgánicas de 0,22 pm de poro para su análisis por HPLC-MS.
La identificación y cuantificación de los glucosinolatos se realizó en un cromatógrafo (Agilent Series 1200, Agilent Technologies) acoplado a un detector espectrómetro de masas triple cuadrupolo (MS/MS), con fuente de ionización por electrospray (ESI) operando en modo negativo. Para ello, se utilizó nitrógeno como gas nebulizador a una presión de 60 psi y ajustándose el flujo a 13 L/ min. La temperatura y el voltaje del capilar se mantuvieron a 350 °C y 4 kV, respectivamente. La separación cromatográfica se realizó en una columna Luna C18 (250 mm * 46 mm, tamaño de partícula de 5 m; con precolumna C18-ODS (4 * 30 mm).
El tiempo de retención de los diferentes glucosinolatos y la respuesta del detector a la concentración de los mismos (curva de calibrado para cuantificación) se determinó usando patrones externos.
EJEMPLO 1: Elicitación de células de brócoli (Brassica olerácea L. variedad italica cv Chronos) con coronatina (Cor), jasmonato de metilo (MJ) y/o ciclodextrinas (CDMA)
Las suspensiones de Brassica olerácea L. variedad italica cv Chronos se trataron con: - controles sin CDMA, MJ ni Cor
- con MJ (100 micromoles/l)
- con Cor (1 micromol/l)
- con CDMA (62,5 g/l)
- con CDMA (62,5 g/l) y MJ (100 micromoles/l)
- con CDMA (62,5 g/l) y Cor (1 micromol/l)
Los experimentos se llevaron a cabo por triplicado en matraces de 250 ml de capacidad conteniendo 100 ml de medio de cultivo. Al cabo de 168 horas, se recolectaron las células, se pesaron y se determinó la cantidad total de glucosinolatos en el interior celular. El resultado del experimento se muestra en la Tablas A y B y Figura 1 y 2.
Cuando el cultivo se elicitó solo con MJ o Cor, se observó una acumulación de glucosinolatos por unidad de biomasa superior a cualquiera de los tratamientos realizados.
Por otro lado se observó que no existían diferencias significativas con los distintos tratamientos tras 168 horas de elicitación en la producción de glucosinolatos.
Además, la producción de glucobrasicina y 4-metoxi-glucobrasicina representó más del 85% del total de los glucosinolatos producidos alcanzando valores máximos de 996.68 ± 46.30 y 865.70 ± 39.16 pg/g ps, respectivamente en el tratamiento sólo con MJ siendo los valores alcanzados tras el tratamiento con coronatina de 1185.96 ± 111.06 y 843.35 ± 101.28 pg/g ps de glucobrasicina y 4-metoxi-glucobrasicina, respectivamente
TABLA A: Producción de glucosinolatos en pg/gps de B. olerácea var italica cv Chronos tras 168 horas de incubación.
Densidad celular: 12 g ps/l
Control: medio de cultivo sin elicitores
MJ: tratamiento con 100 micromoles/l
Cor: tratamiento con 1 micromol/l
CDMA: tratamiento con 62,5 g/l
CDMA+MJ: tratamiento con 62,5 g/l de CDMA combinado con 100 micromoles/l de MJ CDMA+Cor: tratamiento con 62,5 g/l de CDMA combinado con 1 micromol/l de Cor
TABLA B: Producción de glucobrasicina, 4-metoxi-glucobrasicina, 4-hidroxiglucobrasicina y neoglucobrasicina en pg/g PS de B. olerácea var italica cv Chronos tras 168 horas de incubación.
Densidad celular: 12 g ps/l
Control: medio de cultivo sin elicitores
MJ: tratamiento con 100 micromoles/l
Cor: tratamiento con 1 micromol/l
CDMA: tratamiento con 62,5 g/l
CDMA+MJ: tratamiento con 62,5 g/l de CDMA combinado con 100 micromoles/l de MJ CDMA+Cor: tratamiento con 62,5 g/l de CDMA combinado con 1micromol/l de Cor
Claims (20)
1. Procedimiento para incrementar la producción de glucosinolatos en cultivos celulares, que comprende:
a. la adición de coronatina o jasmonato de metilo a un medio de cultivo,
b. poner en contacto células vegetales potencialmente productoras de glucosinolatos con el medio de cultivo del paso (a),
c. la incubación de las células del paso (b) en el medio de cultivo del paso (a), y d. la separación de los glucosinolatos obtenidos tras el paso (c) del cultivo celular, y donde las células vegetales potencialmente productoras de glucosinolatos del paso (b) son células vegetales procedentes de plantas del género Brassica.
2. Procedimiento según reivindicación 1, donde las células vegetales potencialmente productoras de glucosinolatos son células vegetales procedentes de B. olerácea var italica.
3. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1-2, donde las células vegetales potencialmente productoras de glucosinolatos proceden de vitroplantas.
4. Procedimiento según la reivindicación 3, donde las células vegetales potencialmente productoras de glucosinolatos proceden de hojas de vitroplantas.
5. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1-4, donde la etapa a) comprende la adición de jasmonato de metilo al medio de cultivo y donde la concentración de jasmonato de metilo en el medio de cultivo del paso (a) es de entre 5 y 500 micromoles/ litro.
6. Procedimiento según reivindicación 5, donde la concentración de jasmonato de metilo en el medio de cultivo del paso (a) es de entre 25 y 150 micromoles/ litro.
7. Procedimiento según reivindicación 6, donde la concentración de jasmonato de metilo en el medio de cultivo del paso (a) es de entre 75 y 125 micromoles/ litro.
8. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1-4, donde la etapa a) comprende la adición de coronatina al medio de cultivo y donde la concentración de coronatina en el medio de cultivo del paso (a) es de entre 0.1 y 100 micromoles/ litro.
9. Procedimiento según reivindicación 8, donde la concentración de coronatina en el medio de cultivo del paso (a) es de entre 0.5 y 50 micromoles/ litro.
10. Procedimiento según reivindicación 9, donde la concentración de coronatina en el medio de cultivo del paso (a) es de entre 0.75 y 10 micromoles/ litro.
11. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 donde además se añaden ciclodextrinas al medio de cultivo en el paso (a).
12. Procedimiento según reivindicación 11, donde las ciclodextrinas se seleccionan del grupo que comprende ciclodextrina metilada aleatoriamente.
13. Procedimiento según la reivindicación 12 donde la ciclodextrina metilada aleatoriamente tiene un grado de sustitución por metilos de entre 1 y 3.
14. Procedimiento según la reivindicación 13 donde la ciclodextrina metilada aleatoriamente es dimetilada.
15. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 11 a 14 donde la ciclodextrina es una p-ciclodextrina.
16. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 11 a 15 donde la concentración de ciclodextrinas en el medio de cultivo del paso (a) es de entre 6,5 g/l y 130 g/l.
17. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 11 a 16 donde la concentración de ciclodextrinas en el medio de cultivo del paso (a) es de entre 10 g/l y 100 g/l.
18. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 11 a 17 donde la concentración de ciclodextrinas en el medio de cultivo del paso (a) es de entre 50 g/l y 75 g/l.
19. Uso de un medio de cultivo que comprende coronatina o jasmonato de metilo para incrementar la producción de glucosinolatos en células vegetales potencialmente productoras de los mismos, donde las células vegetales potencialmente productoras de glucosinolatos son células vegetales procedentes de plantas que se seleccionan del género Brassica.
20. Uso de una composición según la reivindicación 19 donde la composición o el medio de cultivo además comprende ciclodextrinas.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| ES201730836A ES2694706B2 (es) | 2017-06-23 | 2017-06-23 | Procedimiento para incrementar la produccion de glucosinolatos en cultivos celulares |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| ES201730836A ES2694706B2 (es) | 2017-06-23 | 2017-06-23 | Procedimiento para incrementar la produccion de glucosinolatos en cultivos celulares |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2694706A1 ES2694706A1 (es) | 2018-12-26 |
| ES2694706B2 true ES2694706B2 (es) | 2021-06-22 |
Family
ID=64746707
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES201730836A Active ES2694706B2 (es) | 2017-06-23 | 2017-06-23 | Procedimiento para incrementar la produccion de glucosinolatos en cultivos celulares |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| ES (1) | ES2694706B2 (es) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP3707993A1 (en) * | 2019-03-12 | 2020-09-16 | Perpetuum CropScience BVBA | Producing isothiocyanates from callus suspension cultures |
-
2017
- 2017-06-23 ES ES201730836A patent/ES2694706B2/es active Active
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| ES2694706A1 (es) | 2018-12-26 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP2025041769A (ja) | インビトロ培養物のバイオマス由来の標準化植物抽出物、その調製方法及び使用 | |
| Sudha et al. | Antioxidant properties of paddy straw mushroom [Volvariella volvacea (Bull. ex Fr.)] Sing | |
| Sharma | Brassinosteroids application responses in fruit crops-a review | |
| Feng et al. | Effects of 5-aminolevulinic acid on chlorophyll, photosynthesis, soluble sugar and flavonoids of Ginkgo biloba | |
| Abd El-Sadek et al. | Novel application of Spirulina platensis extract as an alternative to the expensive plant growth regulators on Capparis cartilaginea (Decne.) | |
| ES2694706B2 (es) | Procedimiento para incrementar la produccion de glucosinolatos en cultivos celulares | |
| Lama et al. | Metabolic responses to in vitro in drought-tolerant in a Cucurbita pepo L. elicited by salicylic acid and zinc oxide nanoparticles | |
| Talebi | Changes in plant secondary metabolite profiles in response to environmental stresses | |
| Raifa et al. | Increasing the active constituents of sepals of roselle (Hibiscus sabdariffa L.) plant by applying gibberellic acid and benzyladenine | |
| André et al. | Effects of plant growth regulators and carbohydrates on callus induction and proliferation from leaf explant of Lippia multiflora Moldenke (Verbenacea) | |
| da Silva et al. | Influence of light quality and some growth regulators in inducing the production of Podophyllotoxin, a bioactive compound against cancer, in adventitious roots formed in the leaves of Hyptis suaveolens | |
| Amin et al. | Effect of Spirulina platensis extract on growth, phenolic compounds and antioxidant activities of Sisymbrium irio callus and cell suspension cultures | |
| Kirakosyan et al. | The production of dianthrones and phloroglucinol derivatives in St. John’s Wort | |
| Al-Khateeb | Enhancing the growth of date palm (Phoenix Dactylifera) in vitro tissue by adding date syrup to the culture medium | |
| ES2625491T3 (es) | Uso de las ciclodextrinas para la producción y extracción de fitoesteroles en cultivos celulares | |
| Karlik et al. | Production of Nutraceuticals using plant cell and tissue culture | |
| Alfredo et al. | Mexican crops of agroalimentary importance | |
| Vázquez-Flota et al. | In vitro plant cell culture as the basis for the development of a Research Institute in México: Centro de Investigación Científica de Yucatán | |
| Adil et al. | Adventitious roots formation for enhanced and sustainable production of antioxidants in Brassica oleracea var. acephala (Brassicaceae) | |
| Chaudhary et al. | Induction of anthocyanin pigment in callus cultures of Solanum melongena L. in response to plant growth regulators and light | |
| Luo et al. | Distribution of glucosinolates and antioxidants in different leaf-layers of Kale (Brassica oleracea var. acephala DC.) | |
| Raj et al. | Epoxy Carotenoid and Its Importance: A Review | |
| Piovan et al. | Somatic embryogenesis and glucosinolate/myrosinase system in vulnerable Brassica repanda subsp. glabrescens (Poldini) Gómez-Campo | |
| Hussein et al. | The effect of some treatments on development, growth and differentiation of chinese clove (Dianthus chinensis L) callus and the accumulation of some secondary compounds | |
| Smith | Vaccinium species (small-fruited berries): in vitro culture and the production of food colorants and phytochemicals |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PC2A | Transfer of patent |
Effective date: 20180710 Owner name: UNIVERSIDAD DE MURCIA Effective date: 20180710 |
|
| BA2A | Patent application published |
Ref document number: 2694706 Country of ref document: ES Kind code of ref document: A1 Effective date: 20181226 |
|
| FG2A | Definitive protection |
Ref document number: 2694706 Country of ref document: ES Kind code of ref document: B2 Effective date: 20210622 |