ES2810229B2 - Proteina recombinante de nannochloropsis gaditana - Google Patents

Description

DESCRIPCIÓN

PROTEINA RECOMBINANTE DE NANNOCHLOROPSIS GADITANA

SECTOR DE LA TÉCNICA

La invención pertenece al campo de la biomedicina, en particular al uso de una proteína recombinante de N. gaditana también conocida como Microchloropsis gaditana (Fawley, Jameson, & Fawley, 2015), la cual purificada, posee un efecto anti-proliferativo de células tumorales.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

La terapia contra el cáncer ha experimentado importantes avances que se han producido con una celeridad inusitada. El arsenal terapéutico se ha intensificado en eficacia contando con los citostáticos o lo que se conoce comúnmente como "quimioterapia", fármacos de diferentes mecanismos de acción que inducen la apoptosis o muerte celular pero de escasa especificidad para atacar exclusivamente la célula tumoral, afectando también a células sanas. Recientemente aparecen las nuevas terapias dirigidas contra un objetivo concreto, una proteína o un receptor de membrana ubicada en la célula tumoral. Las primeras terapias anti-diana introducidas fueron anticuerpos monoclonales de administración intravenosa, sin embargo en los últimos años hemos asistido a un verdadero "boom" con el desarrollo de una nueva familia de terapias dirigidas orales, llamadas inhibidores de tirosinquinasa. Estas novedades en apoyo a la cirugía y la oncorradiología con sus avances espectaculares de los últimos años han contribuido de forma muy importante a una mejora del control de la enfermedad o en la calidad de vida de los pacientes.

Aun así, sigue existiendo la necesidad de proveer de nuevas terapias que induzcan la apoptosis o muerte celular o impidan el crecimiento tumoral, y que presenten una alta especificidad frente a células tumorales.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere al uso de una proteína recombinante como inhibidor del crecimiento tumoral, en concreto al uso de la proteína UCA01 recombinante, que es una proteína que sumerge a la célula en un periodo de inactividad mitótica en el caso de células tumorales. De esta forma impide el crecimiento tumoral, además de prevenir su aparición.

La UCA01 previene la aparición tumoral debido a tres factores, su capacidad antioxidante, aumento de la actividad de la proteína p53 y la protección de la degradación de las mitocondrias. En concreto, en la presente invención se demuestra por primera vez la actividad biológica de la proteína UCA01 recombinante extraída de la microalga (N. gaditana). Se hace notar que la proteína UCA01 silvestre estaba, con anterioridad a la presente invención, inicialmente clasificada como "hypothetical protein” (proteína hipotética) en el NCBI (Accession: XM_005854224.1).

En concreto, los autores de la presente invención, han demostrado, por primera vez, que la proteína UCA01 recombinante obtenida a partir de N. gaditana, reduce el crecimiento celular de líneas celulares tumorales (HepG2 y Caco-2) sin afectar el crecimiento de las células no tumorales ensayadas (Ea.hy926). Esta inhibición es además directamente proporcional a la concentración de UCA01 ensayada en el caso de emplear la línea celular de adenocarcinoma de colon, de modo que, conforme se incrementaba la concentración de la proteína, mayor era la inhibición del crecimiento tumoral. Sin embargo, este efecto no se observó sobre el crecimiento de la línea celular no tumoral empleada (Ea.hy926). Por lo que, se deduce que la proteína UCA01 recombinante de N. gaditana de la invención tiene un efecto anti-proliferativo (citotóxico) selectivo ya que sólo actúa sobre las células tumorales ensayadas.

Por último, resulta importante destacar, en virtud de lo dicho anteriormente, que la actividad de la proteína recombinante de la invención (UCA01) como antitumoral proporciona una herramienta para luchar contra el cáncer, basado en una proteína procedente de una microalga. Esta inhibición tiene lugar a concentraciones bajas, en comparación con otros ensayos de actividad biológica en otras proteínas, lo que indica un nuevo método y una nueva fuente de obtención de la UCA01, eficiente, ya que las cantidades necesarias para llevar a cabo su actividad antitumoral han sido mínimas.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

Figura 1: Dominios funcionales de prohibitina 1 (Theiss & Sitaraman, 2011).

Figura 2: (a) Cebadores diseñados para la amplificación del ADN complementario de N. gaditana, con las enzimas de restricción usadas para crear extremos cohesivos con el plásmido pET28a; (b) Confirmación de la amplificación en gel de Agarosa; (c) Confirmación de la secuenciación por homología en Blast del 100% con homólogos UCA 01; (d) Matriz de porcentaje de identidad, creada por Clustal 2. 1, en primer lugar, Proteína UCA01, comparada secuenciaciones de NCBI: con prohibitina de N. gaditana y varias de prohibitinas humanas.

Figura 3: Gel SDS-PAGE al 10%; líneas 3, 5 y 7 expresión de la UCA01 de N. gaditana por la bacteria E. coli, Rosseta gami (DE3).

1: 0,4 mM de IPTG

2: No inducido

3: 0,6 mM de IPTG

4: No hay muestra.

5: 0,8 mM de IPTG

6: No inducido

7: 1 de mM de IPTG

8: No inducido

Figura 4: Imagen del gel SDS-PAGEal 10% del proceso de purificación de la UCA01.

M.: Marcador de peso molecular (Kda)

A: No inducido sin purificar

B: Inducido sin purificar

C: Primer paso de la muestra inducida por la columna de afinidad

D: Paso de lavado

E: Elución 1

F: Elución 2

Dentro del cuadro encontraremos la banda perteneciente a la proteína UCA01

Figura 5: Efecto antiproliferativo de la proteína UCA01 recombinante de N. gaditana. Se evaluó el efecto sobre las líneas celulares: HepG2 (carcinoma del hígado)/ 24 horas; Caco-2 (adenocarcinoma de colon)/ 24horas y EA.hy926 (endotelio)/ 6 y 72 horas. Se representa la media ± desviación estándar de la media (SEM). Estadístico empleado: t-student comparando cada valor con el control con DMSO.

DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN

Definiciones

Una “proteína recombinante’’ es una proteína que ha sido producida en una célula hospedadora, de especie distinta a la célula original, que ha sido transformada con el ácido nucleico que codifica la proteína.

La expresión “inhibir la proliferación" se refiere a cualquier método que disminuye la capacidad de crecimiento celular.

"Prohibitina", también conocida como PHB, es una proteína que en los humanos está codificada por el gen PHB. El gen PHB también se ha descrito en animales, hongos, plantas y eucariotas unicelulares. Las prohibitinas se dividen en dos clases, denominadas prohibitinas Tipo I y Tipo II, según su similitud con los genes de las levaduras PHB1 y PHB2, respectivamente. Cada organismo tiene al menos una copia de cada tipo de gen de prohibitina (Mishra, Murphy, & Murphy, 2006; Van Aken et al., 2007).

El término “micmalga” hace referencia a algas microscópicas, que generalmente se encuentran en los sistemas de agua dulce y marina, que viven tanto en la columna de agua como en los sedimentos (V.thurman, 2007). Son especies unicelulares, que pueden organizarse en cadenas o grupos. Dependiendo de la especie, sus tamaños pueden variar desde unos pocos micrómetros (^m) hasta unos pocos cientos de micrómetros (Thrush, Hewitt, Gibbs, Lundquist, & Norkko, 2006). Las microalgas, capaces de realizar la fotosíntesis, son importantes para la vida en la tierra; producen aproximadamente la mitad del oxígeno atmosférico y utilizan simultáneamente el dióxido de carbono del gas de efecto invernadero para crecer foto autotróficamente. Las microalgas, junto con las bacterias, forman la base de la red alimenticia y proporcionan energía para todos los niveles tróficos por encima de ellas (Thrush et al., 2006).

DESCRIPCIÓN

PROTEÍNA RECOMBINANTE DE LA INVENCIÓN.

Los autores de la presente invención han demostrado, por primera vez, apoyándose en los datos mostrados por el NCBI, que la proteína recombinante UCA01 extraída de la microalga (N. gaditana), clasificada hasta el momento como “hypothetical protein” (proteína hipotética) en el NCBI (Accession: XM_005854224.1), comparte dominios comunes con las proteínas de la superfamilia SPFH (stomatin, prohibitin, flotillin, and HflK/C) (figura 2), en concreto con la prohibitina. Sin embargo, dicha homología de la proteína UCA01 se reduce únicamente a un 56,36% (clustal W) con la prohibitina homologa humana (figura 2), lo cual, a priori, no permitiría deducir que tuviese las mismas funciones que la prohibitina humana. De hecho, cuando se comparó con varias prohibitinas humanas (GenBank: S85655.1, GenBank: L14272.1, GenBank: BC095460.1, GenBank: BT007411.1) la homología encontrada fue respectivamente del 56,34 % y del 56,22%, porcentajes aún pequeños que, de nuevo, no permitían deducir que tuviese las mismas funciones que la prohibitina humana. Por lo tanto, con el fin de determinar y aclarar dichas funciones, la proteína recombinante UCA01 fue extraída de la microalga Nannochlompsis gaditana Lubian CMP 572 (Fernández-Acero et al., 2018), clonada y purificada. En concreto, la proteína UCA01 recombinante de la presente invención, que presenta la secuencia nucleotídica SEQ ID NO 1:

SEQ ID NO 1:

ATGTCTCCAGCAGGACCGCTGGGAGCCTTGCTAGGTGTGACGGGCATCCTTTACGCCG GGTACAATAGTTTTTACACGGTGGAGGGTGGGCACCGAGCTCTGTTGTTCAACAGATTA ATCGGTGTGAAAGAAGAAGTGTACATGGAGGGAATGCATTTTATGATTCCCTGGTTCGA CATGCCCATCATTTACGACATCCGCCCCAAGCCCCGGATGATCCAGTCCTTGACAGGAA GCAAAGACATGCAAATGGTCAACATCACCATCCGCGTTTTGTCTAAGCCCGACTCGGCT CAACTCCGCTGGATCTTCCGCACCTTGGGTCGCGACTACGACGAGCGTGTCCTCCCTT CCATCGTCAACGAGGTCTCCAAGGCCGTGGTGGCCAAGTACAACGCCGCGGAGCTCTT GACGAAGCGTGAGATGGTCTCCACCCAAATCCGGTTGCAGTTGGAGAAGCGTGCGAAG GAGTTTCGGATCGTCCTGGACGACGTGTCGATCACCCACTTGACCTTCTCCCGGGAGT ACACGAACGCGGTCGAGGCCAAGCAAGTTGCTCAACAGGAAGCCGAGCGCGCGAAAT ATGTGGTAATGAAAGCGAACCAAGAAAAGGAAGCCATCATTATCAAAGCGGAGGGAGA GGCCCAATCCGCTGCTCTGGTGGGTAAGGCCATTCGAGAGAATCCTGCTTTTATCAAGC TGCGCAAAATCGACGCAGCCAGGGACATTGCGAATGTCGTGTCCTCTTCGGGTCAGAA GGTCTATCTGTCTGCGGACTCCCTCTTGTTGAATATGTACTCGGGCGACGAAGAGAAGT CTGGAAAGAAGCGGTAGGCGGCCGCACTCGAGCACCACCACCACCACCAC,

de la cual se obtuvo la siguiente secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO 2):

MSPAGPLGALLGVTGILYAGYNSFYTVEGGHRALLFNRLIGVKEEVYMEGMHFMIPWFDMPI IYDIRPKPRMIQSLTGSKDMQMVNITIRVLSKPDSAQLRWIFRTLGRDYDERVLPSIVNEVSK AVVAKYNAAELLTKREMVSTQIRLQLEKRAKEFRIVLDDVSITHLTFSREYTNAVEAKQVAQQ EAERAKYWMKANQEKEAINKAEGEAQSAALVGKAIRENPAFIKLRKIDAARDIANWSSSGQ KVYLSADSLLLNMYSGDEEKSGKKRAAALEHHHHHH,

se sintetizo a partir de la microalga Nannochloropsis gaditana Lubian CMP 572 (Fernández-Acero et al., 2018). Para esto, una vez se analizó el proteoma de esta microalga, se diseñaron cebadores para amplificar la zona deseada de la región del ADN complementario, evitando así amplificar los exones presentes en la secuencia original del ADN de N. gaditana. Posteriormente, se ligó el ADN complementario con el plásmido Pet-28a usando las enzimas de corte Ndel y SalI, uniendo de esta forma el plásmido junto con el ADN complementario, introduciéndose en la cepa Top10 de E. coli, usada como cepa de almacenamiento de la construcción.

Una vez fue confirmada mediante PCR en la cepa Top10 de E. coli, los fragmentos obtenidos fueron aislados y secuenciados. La secuencia así obtenida presentó un 100% de homología y cobertura con la "hypothetical protein” en el NCBI (Accession: XM_005854224.1) de N gaditana (figura 2). Esta construcción presente en la cepa Top10, se utilizó para transformar la cepa Rosetta gami de E.coli, para ser usada como cepa de expresión, (DE3). La proteína UCA01 fue expresada usando IPTG como método de inducción de la expresión y confirmada en un gel SDS-page de acrilamida (figura 3).

Tras la producción de la proteína recombinante en la célula hospedadora, se hizo pasar el lisado celular por una columna de afinidad para su purificación. La proteína de fusión con la etiqueta quedó retenida en la columna mientras que las otras proteínas y otros contaminantes fueron afluidos a través de ésta. Es decir, esta proteína fue purificada con columnas de afinidad a la histidina His Spin Trap (GE Healtcare), gracias a la cola de polihistidina N-terminal (6 histidinas) presente en el plásmido Pet-28a y añadidas a la proteína.

A partir de dicha clonación y purificación los autores de la presente invención demostraron, por primera vez, la actividad antitumoral de esta proteína recombinante de N. gaditana en la línea tumoral hepática HepG2 y la línea tumoral de cáncer de colon Caco-2, demostrando que inhibía la proliferación así como la viabilidad celular de estas líneas tumorales. Además, este efecto mantiene una correlación directamente proporcional a la concentración de la UCA01 recombinante, donde a mayor concentración de esta, mayor inhibición, o lo que es lo mismo, menor viabilidad celular de la línea tumoral.

Por tanto, un primer aspecto de la invención se refiere a una proteína recombinante obtenible por un procedimiento que comprende:

a) integrar un inserto con una secuencia nucleotídica que comprende o consiste en la SEQ ID NO. 1, en una construcción genética o un vector de expresión,

b) opcionalmente, transformar un hospedador con la construcción genética o con el vector de expresión del paso (a), donde dicho hospedador es una cepa de almacenamiento de la construcción,

c) transformar un hospedador con la construcción genética o con el vector de expresión del paso (a) o del paso (b), donde dicho hospedador es una cepa de inducción de la expresión,

d) inducir la expresión de la proteína recombinante,

e) extraer la proteína recombinante, y

f) opcionalmente, purificar la proteína recombinante

Se hace notar que el paso a) anteriormente expuesto se puede, alternativamente, llevar a cabo insertando una secuencia nucleotídica variante que presente una identidad de, al menos, un 80% con la SEQ ID NO: 1.

El término "identidad", tal y como se utiliza en esta memoria, hace referencia a la proporción de aminoácidos o nucleótidos idénticos entre dos secuencias aminoácidicas o nucleotidicas que se comparan.

El término "homología", tal y como se utiliza en esta memoria, hace referencia a la semejanza entre dos estructuras debida a una ascendencia evolutiva común, y más concretamente, a la semejanza entre los aminoácidos de dos o más proteínas o secuencias aminoacídicas.

Puesto que dos proteínas se consideran homólogas si tienen el mismo origen evolutivo o si tienen función y estructura similares, en general, se asume que valores superiores de similitud o identidad del 30% indican estructuras homólogas. Podemos considerar, por tanto, que porcentajes de identidad de, al menos, un 80%, incluirán las regiones activas conservadas.

En una realización más preferida de este aspecto de la invención, la secuencia nucleotídica del paso a) presentará una identidad de, al menos, un 90% con la SEQ ID NO: 1. En otra realización más preferida de este aspecto de la invención, la secuencia nucleotídica del paso a) presentará una identidad de, al menos, un 95% con la SEQ ID NO: 1. En una realización aún más preferida de este aspecto de la invención, la secuencia nucleotídica del paso a) presentará una identidad de, al menos, un 98% o un 99% con la SEQ ID NO: 1.

El diseño del vector de expresión o la construcción génica de la invención está basado en técnicas de ingeniería genética, donde dicho vector de expresión o la construcción génica de la invención pueden comprender, además de la secuencia nucleotídica SEQ ID NO. 1 o cualquier variante de la misma, elementos que regulan la expresión de dicha secuencia. Dichos elementos reguladores incluyen promotores y potenciadores. Los promotores se encuentran típicamente posicionados en posición 5’ con respecto al sitio de iniciación de la transcripción o traducción. Los potenciadores son capaces de influenciar la expresión de genes cuando se encuentran en posición 5’ o 3 ’con respecto al ADNc o cuando se encuentran formando parte de un intrón. Secuencias reguladoras incluyen, además de promotores, secuencias que facilitan la traducción, señales de procesamiento para los intrones, codones de terminación, secuencias señales, sitios internos de unión al ribosoma (IRES) y señales de poliadenilación.

El vector de expresión o la construcción génica de la invención que comprende la secuencia nucleotídica SEQ ID NO. 1, debe estar operativamente acoplada con una secuencia que regule la expresión de dicha secuencia nucleotídica SEQ ID NO. 1. El experto en la materia advertirá que el tipo de vector adecuado para la expresión de los ácidos nucleicos y construcciones génicas de la invención, dependerá del organismo en el que se desee expresar el polinucleótido de la invención.

En una realización preferida de este aspecto de la invención, el vector de expresión es el vector prelinealizado pET28- Luci.

Un segundo aspecto de la invención, se refiere a células u organismos hospedadores como cepas inductoras de la expresión que comprenden el vector de expresión o la construcción génica, tal como se han definido estos en la invención. En principio, cualquier tipo de organismo hospedador conocido para el experto en la materia puede ser usado en la presente invención, tales como una cepa bacteriana (Escheríchia coli, Bacillus subtilis y similares), una cepa de levadura (Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris, Kluyvemmyces lactis, Hansenula polymorpha y similares), una planta transgénica (dicotiledoneas o monocotildoneas), una célula de insecto, por ejemplo, baculovirus, una célula de mamífero (células COS, CHO, C127, HeLa y similares) y un transgénico no humano (por ejemplo, un ratón, una vaca, una cabra, un conejo, un cerdo, etc.).

En otra realización preferida de este aspecto de la invención, las bacterias de expresión son células de Escherichia coli químicamente competentes, que posee un genotipo adecuado para la transformación y la expresión de proteínas, y cuyo genoma se conoce (Genome sequences of Eschenchia coli B strains REL606 and BL21(DE3). Jeong H, et al. J Mol Biol 2009 Dec 11).

Una bacteria competente, se caracteriza por tener una pared bacteriana debilitada y por tanto tiene más facilidad para captar un ADN foráneo mediante un proceso de choque térmico o eléctrico (transformación). Para la producción de la proteína se utilizan bacterias de expresión. En esta memoria, las bacterias de expresión son aquellas que poseen la maquinaria necesaria para sobrexpresar el cDNA insertado y producir la proteína recombinante.

En otra realización preferida del primer aspecto de la invención, la integración de la secuencia nucleotídica SEQ ID NO: 1 del paso (a) se realiza mediante un proceso de ligación.

Para la realización del proceso de ligación, la mezcla de inserto: plásmido fue resuspendida en el producto In-Fusion Dry-Down pellet (Clontech). In-Fusion Dry-Down pellet es un liofilizado que contiene la enzima In-Fusion, la cual favorece la unión del inserto al plásmido gracias a la homología en la secuencia nucleotídica presente en ambos.

Por tanto, en otra realización preferida de la invención, en la ligación se emplea un liofilizado que comprende la enzima In-Fusion. Ésta es una ADN polimerasa de Poxvirus con actividad exonucleasa 3'-5', que es capaz de unir moléculas de ADN de cadena simple que presentan secuencias cortas y homólogas en sus extremos, tales como un producto de PCR amplificado y un vector.

En otra realización preferida, el inserto del paso a) del primer aspecto de la invención se sintetiza empleando los cebadores de secuencia nucleotídica SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 4.

Un tercer aspecto de la invención, se refiere a una proteína que comprende la secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 2, o a la proteína recombinante de la invención, para su uso como medicamento; o, alternativamente, a una proteína que comprende la secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 2 o a la proteína recombinante de la invención para su uso en la elaboración de un medicamento.

Se hace notar que el tercer aspecto de la invención no hace únicamente referencia a la secuencia aminoacídica que comprende o consiste en la SEQ ID NO: 2, sino también a variantes de la misma, que presenten una identidad de, al menos, un 90% con la SEQ ID NO:2. Preferiblemente, que presenten una identidad de, al menos, un 95% con la SEQ ID NO:2. Más preferiblemente, que presenten una identidad de, al menos, un 98% o un 99% con la SEQ ID NO:2 (de aquí en adelante a estas variantes se les denominará "variantes de la proteína recombinante de la invención”).

Un cuarto aspecto de la invención, se refiere a una proteína que comprende la secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 2 o variantes de la misma, para su uso en el tratamiento del cáncer o el tratamiento de desórdenes de la proliferación celular no deseada, o un medicamento antiangiogénico.

Un quinto aspecto de la invención lo constituye un método para el tratamiento del cáncer, de los desórdenes de la proliferación celular y la angiogénesis no deseada, en el que se administra una composición farmacéutica que comprende una cantidad efectiva de al menos una proteína que comprende o consiste en la secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 2 o variantes de la misma, a un individuo que lo necesita. La administración de dicha composición farmacéutica se constituye en un método para tratar o prevenir un tumor sólido en un sujeto, tal y como un tumor o cáncer colorectal, esófago, pulmón, próstata, mama, páncreas e hígado, donde el método comprende la administración de una composición que comprende una proteína que comprende o consiste en la secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 2 o variantes de la misma en una cantidad efectiva, para disminuir o bloquear el crecimiento de la célula tumoral. En una realización de la invención, la composición puede ser administrada a pacientes con tumores sólidos, tal y como un tumor o cáncer colorectal, esófago, pulmón, próstata, mama, páncreas e hígado, bloqueando la proliferación de la célula de cáncer, incluso en presencia de estímulos inflamatorios.

Adicionalmente, los datos aportados en esta invención indican que la proteína recombinante de SEQ ID NO 2 es efectiva en bloquear el crecimiento de la célula de cáncer. Más específicamente, los resultados demuestran que la proteína recombinante facilita la muerte de la célula cancerígena. Es por ello que la invención también provee un método para la inhibición del desarrollo de tumores asociados a la inflamación y sus metástasis, que comprende la administración de la proteína recombinante a un sujeto que lo necesita. Dentro de los tumores asociados a la inflamación y sus metástasis se encuentran, por ejemplo, los siguientes tipos de cáncer: colorectal, esófago, pulmón, próstata, mama, páncreas e hígado.

Asimismo, la administración de la proteína recombinante de SEQ ID NO 2 puede emplearse, de manera profiláctica, para prevenir el desarrollo de cáncer asociado a la inflamación crónica, como por ejemplo en la enfermedad de Crohn, colitis ulcerativa, pancreatitis, cirrosis, etc. Por tanto, es también un objeto de la presente invención, un método para la prevención del cáncer asociado a inflamación crónica que se caracteriza porque se administra la proteína recombinante de SEQ ID NO 2 o una variante de la misma o una composición que comprende dicha proteína a un individuo que lo necesita.

En cuanto a la dosis y esquema de tratamiento a seguir con las composiciones que comprenden la proteína recombinante de SEQ ID NO 2 o variantes de la misma, un experto en la materia puede fácilmente determinar la dosis y esquema de tratamiento (profiláctico o terapéutico). Las cantidades efectivas pueden variar en dependencia de la potencia relativa de las composiciones individuales, y puede ser calculada basada en el peso molecular de la proteína recombinante in vitro o en estudios animales. Por ejemplo, dado el peso molecular del compuesto (estructura química) y una dosis experimental efectiva (CI50) se puede calcular rutinariamente una dosis en mg/Kg de peso. En general las dosis son de 0,2-4 mg/Kg de peso.

Por otro lado, un sexto aspecto de la invención se refiere a composiciones farmacéuticas que comprenden al menos una proteína que comprende la secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 2 o variantes de la misma, y excipientes o vehículos farmacéuticamente aceptables.

La invención también provee compuestos para el diagnóstico del cáncer que comprenden al menos una de las proteínas que comprende la secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 2 o variantes de la misma, y un agente para imagen seleccionado dentro del grupo compuesto por un grupo fluorescente, un grupo no fluorescente, una partícula semiconductora fluorescente, un agente paramagnético o superparamagnético, y un radioisótopo.

Otro aspecto de la presente invención es una combinación farmacéutica que comprenda al menos una de las proteínas que comprende la secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 2 o variantes de la misma, con al menos un agente de tratamiento, como los medicamentos anticancerígenos y las hormonas. En una realización de la invención, en dicha combinación dichas proteínas están conjugadas directamente al agente de tratamiento mediante enlaces covalentes. En otros casos, la proteína está conjugada al agente de tratamiento por un elemento acoplador.

La invención también comprende las combinaciones farmacéuticas donde al menos una de las proteínas que comprende la secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 2 o variantes de la misma, se combina con cualquier tipo de tratamiento quimioterapéutico o de radioterapia. Los elementos que forman estas combinaciones pueden ser administrados, a los individuos que lo necesitan, en el curso de un tratamiento médico, de forma secuencial o simultánea. En una materialización de la invención, dicho fármaco específico para la quimioterapia estándar se selecciona entre cisplatino y 5-FU. En dicha combinación farmacéutica los agentes y fármacos que forman parte de la misma se pueden administrar de forma simultánea, separada o secuencial en el curso de un mismo tratamiento.

Cualquiera de las proteínas, composiciones de cualquiera de los aspectos arriba mencionados pueden ser administradas por cualquier vía de administración incluyendo parenteral, por ejemplo: inyección intravenosa, intramuscular, o subcutánea, así como por vía tópica para lograr su efectividad terapéutica.

Los siguientes ejemplos sirven para ilustrar la presente invención pero no deben limitar la misma.

EJEMPLOS

Desarrollo Experimental.

Una vez comprobada la amplificación de esta proteína se procedió a realizar la proteína recombinante, siguiendo los pasos siguientes.

Aislamiento de ARN total de N. gaditana

Se aisló ARN total mediante NucleoSpin RNA® (Macherey-Nagel) siguiendo las indicaciones del fabricante. De modo resumido. Se verifico la calidad del ARN aislado, siguiendo las indicaciones del Kit Agilent RNA 6000 Nano©.

Síntesis de ADN complementario mediante RT-PCR

Para realizar este procedimiento se siguieron las indicaciones del estuche comercial qScript® (Quanta Biosciences). El protocolo de reacción utilizado fue el siguiente: 1 ^L del ARN aislado (1-10 ^g de ARN total), 14 ^L de agua libre de nucleasas, 4 ^L de la mezcla de rea cción qScript (5X) y 1 jL de la retrotranscriptasa qScript; para un volumen final de 20 jL. Se mezcló suavemente en el vortex y luego se centrifugó durante 10 seg. Posteriormente se colocaron en un termociclador bajo el siguiente programa, 1 ciclo a 22°C por 5 min., 1 ciclo a 42°C durante 30 min., un ciclo a 85°C por 5 min. con una parada a 4°C.

Amplificación mediante PCR

Para este procedimiento se siguieron las indicaciones del estuche comercial Phusion Flash High-Fidelity PCR Master Mix (Thermo Scientific). Las condiciones de la reacción fueron las siguientes: 25 jL de 2X Phusion Flash PCR Master Mix, 2,5 jL del primer 10 jM Prohi-F: 5’-GGCATATGTCTCCAGCAGGACCGCTGG-3’ (sitio de corte para Ndel) (SEQ ID NO 3), 2,5 |jL del primer 10 |jM Prohi-R: 5’-GGGTCGACCTACCGCTTCTTTCCAGACTTC-3’ (sitio de corte para Salí) (SEQ ID NO 4), 2 jL de cDNA (65 ng/jL) y 18 jL de agua, para un volumen total de reacción de 50 jL . Con la amplificación con los primers Prohi-F y Prohi-R se obtiene un fragmento de 834 pb (GenBank XM_005854224.1). El programa del termociclador fue el siguiente: desnaturalización inicial a 98°C por 10 seg, seguida de 30 ciclos a 98°C por 1 seg, 72°C por 5 seg, 72°C por 15 seg, un ciclo de extensión final a 72°C por 3 min y parada a 4°C. El producto amplificado fue visualizado mediante un gel de agarosa al 1% corrido durante 1 h a 110 V y teñido con Gel-Red (figura 2).

Purificación del fragmento amplificado.

Este procedimiento se llevó a cabo siguiendo las instrucciones del estuche comercial GeneJET Gel Extraction Kit (Thermo Scientific). Para ello se siguió el siguiente protocolo: una vez cortada la banda, se pesó y se añadió un volumen de Binding Buffer en relación al peso de la banda (relación 1:1, peso:volumen). Posteriormente se incubó la mezcla a 60oC hasta que la banda de gel estuviese totalmente disuelta. Luego se transfirió la solución de gel solubilizado a una columna de purificación GeneJET, se centrifugó por 1 min (12.000 rpm) y se descartó el líquido resultante. Después se añadieron 700 jL del Wash Buffer en la columna, se centrifugó por 1 min (12.000 rpm) y se descartó el líquido resultante. Se centrifugó nuevamente durante 1 min (12.000 rpm) para eliminar los residuos del Wash Buffer. La elución se realizó con 40 jL de Elution Buffer, se dejó incubar durante al menos 1 min y se centrifugó durante 1 min (12.000 rpm). El fragmento purificado a partir de las bandas de gel fue visualizado mediante un gel de agarosa al 1% corrido durante 1 h a 110 V y teñido con Gel-Red.

Digestión con enzimas de restricción.

A fin de linealizar el vector pET28a (Novagen) para ligarlo al fragmento UCA01 se procedió a realizar la siguiente reacción: 7 ^l de pET28 (2 ^g), 10 ^l de 10X Buffer D, 2 ^l de Ndel (10 U/ ^l), 2^l de Salí (10U / ^l) y 79 ^l de agua, para un volumen total de reacción de 100 ^l. Se incubo durante 4 h a 73 °C. Luego se añadieron 11 ^l de buffer FastAp 10X, 2 ^l de fosfatasa alcalina (1 U/ ^l) y se incubo 1 h a 37°C. Con el fragmento UCA01 se procedió a realizar la siguiente reacción: 20 jL del fragmento de ADN amplificado y purificado (31,1 ng/|jL), 10 |^jL de 10X Buffer D, 2 |^jL de Ndeí (10U/jiL), 2 |^jL de Salí (10U/jiL) y 66 |^jL de agua. Volumen total de reacción de 100 jL. Se incubó durante 4 h a 37°C.

Limpieza de los fragmentos.

Posteriormente se purificó el fragmento y el plásmido cortado haciendo uso del kit comercial GeneJET Gel Extraction Kit (Thermo Scientific). Para ello se siguió el siguiente protocolo: se añadió directamente a la mezcla de restricción un volumen de Binding Buffer en relación al volumen de cada reacción (relación 1:1, volumen:volumen), 100 jL en este caso. Luego se transfirió la solución a una columna de purificación GeneJET, se centrifugó por 1 min (12.000 rpm) y se descartó el líquido resultante. Posteriormente se añadieron otros 100 jL de Binding Buffer en la columna, se centrifugó por 1 min (12.000 rpm) y se descartó el líquido resultante. Después se añadieron 700 jL del Wash Buffer en la columna, se centrifugó por 1 min (12.000 rpm) y se descartó el líquido resultante. Se centrifugó nuevamente durante 1 min (12.000 rpm) para eliminar los residuos del Wash Buffer. La elución se realizó con 40 jL de Elution Buffer se dejó incubar durante al menos 1 min y se centrifugó durante 1 min (12.000 rpm). El fragmento y el plásmido cortados y purificados fueron visualizados mediante un gel de agarosa al 1% corrido durante 1 h a 110 V y teñido con Gel-Red.

Ligación

Se procedió a mezclar 3 jL del vector (pET28a (+), 5369 pb) (12,8 ng/^l) con 10 jL del fragmento UCA01 /16,4 ng/^l), respectivamente. Se incubó durante 5 min a 70oC y luego en hielo por 15 min. Posteriormente se añadieron 5 jL de 5X Rapid Ligation Buffer, 1 jL de la enzima ADN ligasa T4 (5U/jL) (Thermo Scientific) y 13 jL de agua libre de nucleasas. Volumen total de reacción de 25 jL. Posteriormente se incubó a 22oC durante una hora 1 h.

Transformación

Para el procedimiento de transformación se utilizaron células competentes E. coli Rosseta gami (DE3) y se siguió el siguiente protocolo: se añadieron 5 ^L de la mezcla de ligación en 50 ^L de las células competentes, se mezcló con la pipeta suavemente y se incubó en hielo durante 20 min. Luego se aplicó un choque de térmico de 42°C durante exactamente 45 seg, para luego incubar inmediatamente en hielo durante 5 min. Posteriormente se añadieron 200 ^L de medio LB y se incubó durante 1 h a 37°C con agitación de 200 rpm. Después se sembraron placas de medio sólido (medio LB / kanamicina, 50 ^g/ml) con la mezcla de reacción y se incubó durante la noche a 37°C.

Aislamiento de ADN plasmídico

Para realizar este procedimiento se siguieron las indicaciones del estuche comercial GeneJET Miniprep Kit (Thermo Scientific) de acuerdo al siguiente protocolo. Se centrifugaron (5000 rpm por 10 min) 4,5 mL del cultivo de los clones positivos (medio LB/kanamicina, 50 ^g/ml) y el pellet de células fue mezclado con 250 ^L de solución de resuspensión, Posteriormente se añadieron 250 ^L de solución de lisis mezclando vigorosamente y mediante inversión (4-6 veces) hasta que la solución se tornó viscosa y ligeramente clara. Este procedimiento no debe exceder los 5 min de duración para evitar la desnaturalización del ADN plasmídico supercondensado. Luego se añadieron 350 ^L de solución neutralizante y se mezcló mediante inversión 4-6 veces. Después se centrifugó por 5 min (12.000 rpm). El sobrenadante fue transferido a una columna GeneJET siendo cuidadosos de no transferir el precipitado blanco. Se centrifugó por 1 min (12.000 rpm) y se descartó el líquido resultante. Posteriormente se añadieron 500 ^L de solución de lavado a la columna GeneJET, se centrifugó durante 1 min (12.000 rpm) y se descartó el líquido resultante. El paso anterior se realizó por duplicado. Se centrifugó nuevamente durante 1 min (12.000 rpm) a fin de eliminar residuos de la solución de lavado. Luego se transfirió la columna GeneJET a un tubo de 1,5 mL limpio y se añadieron 50 ^L de tampón de elución en el centro de la columna. Se incubó durante 2 min a temperatura ambiente y se centrifugó durante 2 min (12.000 rpm).

Colony PCR

La reacción se llevó a cabo de la misma forma que para amplificar los respectivos fragmentos.

Inducción de la expresión

Se utilizó un cultivo overnight de E. coli Rosseta gami (DE3) transformado con el vector pET28- Luci (gen completo) y con pET28, respectivamente, a una temperatura de 37 °C. Posteriormente se inoculó medio fresco LB-kanamicina (50 ^g/mL) (dilución 1:50). Se incubó a 37 °C con agitación (250 rpm) hasta alcanzar una OD ⁶⁰⁰ entre 0,5-0,6. Para inducir la expresión proteica se añadió IPTG hasta a una concentración de 1mM y se incubó a 37 °C con agitación (250 rpm) durante 2,5- 3 h. Se tomó 1 mL del cultivo inducido y se mezcló con 350 ^L de buffer de resuspensión bajo condiciones nativas (50 mM NaH ² PO ⁴ --H ² O, 300 mM NaCl, 10 mM imidazol, pH 8.0). Se congeló (nitrogeno líquido) y se descongeló (37 oC) cuatro veces. Luego se sónico (60% de amplitud) y se centrifugó durante 20 min a 8000 rpm. Del sobrenadante se tomó la fracción soluble y el pellet restante fue resuspendido en 350 ^L de buffer de solubilización bajo condiciones nativas. El resultado fue visualizado mediante SDS-PAGE al 10% corrido a 200 V durante 45 min y teñido con azul de Coomasie (figura 3).

Purificación de la proteína recombinante

Para realizar este procedimiento se siguieron las indicaciones del estuche comercia1 His Spin Trap (GE Healtcare), las cuales tienen una afinidad por la histidina, separando de esta forma la proteína recombinante gracias a la cola de polihistidina añadida en el extremo N-terminal, donde fueron añadidas 6 histidinas para poder realizar la purificación por afinidad, cambiando de esta forma la secuencia natural presente en N. gaditana (Accession: XM_005854224.1). Según el protocolo de purificación bajo condiciones desnaturalizantes. Pare ello se cultivó un volumen de 50 mL (E. coli Rosseta gami (DE3)), los cuales fueron inducidos tal y como se explicó anteriormente. Posteriormente se centrifugó a 10.000 rpm durante 10 min a fin de recolectar el pellet celular. Luego se añadió 1 mL de binding buffer para resuspender el pellet obtenido a partir de 50 mL de cultivo. Posteriormente se realizó una lisis mecánica mediante el uso de un sonicador (60% de amplitud en intervalos de 5 seg en hielo). A fin de clarificar el lisado se centrifugó a 15.000 g durante 10 min para recolectar el sobrenadante. Luego, cada columna His Spin Trap fue invertida y agitada repetidamente a fin de resuspender el medio de almacenaje de las mismas. Se abrió la tapa un cuarto de giro y se removió el sello inferior. Se colocó la columna en un tubo limpio de 2 mL y se centrifugó por 30 seg a 100 g, luego de lo cual se desechó la tapa. Para equilibrar la columna se añadieron 600 ^L de binding buffer y se centrifugó por 30 seg a 100 g. A continuación, se añadieron hasta 600 ^L de la muestra por vez, centrifugando por 30 seg a 100 g cada vez. La columna puede ser utilizada varias veces siempre y cuando su capacidad no sea sobrepasada (600 ^L). Para el lavado se añadieron 600 ^L del binding buffer y se centrifugó por 30 seg a 100 g. Este procedimiento se realizó por duplicado). Por último, se eluyó, añadiendo por duplicado, 200 ^L del buffer de elución (500 mM de imidazol) y centrifugando por 30 seg a 100 g. Los primeros 200 ^L de elución contienen la mayoría de la proteína purificada (figura 4). Esta purificación pudo ser realizada debido a la cola de polyhistidina unida a la proteína, aportada por el plásmido pET28a.

Actividad Biológica

Las muestras liofilizadas se disolvieron inicialmente con dimetilsulfóxido (DMSO) a pH=2, y posteriormente, para su aplicación a cultivos celulares, se diluyeron en medio de cultivo DMEM (ATCC) suplementado con 100 U/mL penicilina y 100 ^g/mL streptomicina (PAN Biotech), hasta obtener una concentración final de DMSO menor de 0.5%. Se purificaron 6 muestras con un contenido entre 1.2-2.74 ^g de proteína (total = 10.46 ^g de proteína).

Líneas celulares

Todas las líneas celulares se obtuvieron de la colección certificada americana ATCC (American Type Culture Collection) y se emplearon las siguientes:

• la línea celular epitelial de adenocarcinoma colorectal humano: Caco-2 (ATCC® HTB-37).

• la línea celular de carcinoma hepatocelular humano: HepG2 (ATCC®-HB-8065). • la línea celular endotelial humana EA.hy926 (ATCC® CRL-2922™).

Las líneas celulares crecieron y se mantuvieron a 37°C y 5% de CO ² en el medio recomendado por la ATCC. Para la línea celular Caco-2 se empleó el medio EMEM y para las líneas celulares HepG2 y EA.hy926 el medio DMEM. Estos medios se suplementaron con 10% suero fetal bovino (FBS), y 100 U/mL de penicilina y 100 ^g/ml de estreptomicina.

Evaluación de la viabilidad celular para evaluar el efecto antiproliferativo

La evaluación de la actividad antiproliferativa en las células en contacto con la prohibitina se llevó a cabo en las líneas celulares humanas Caco-2, HepG2 y EA.hy926. Para ello, las células se sembraron en placas de 96 pocillos y se incubaron con un rango entre 0.7 y 0.003 ^g/mL de prohibitina a 37°C y 5% de CO ² a distintos tiempos de contacto. El tiempo de contacto en las dos líneas tumorales HepG2 y Caco-2 fue de 24 h, mientras que en la línea celular no tumoral EAhy.926 los tiempos de contacto fueron 6 h y 72 h. Trascurrido el período de incubación se evaluó la viabilidad celular mediante un ensayo fluori-colorimétrico con el reactivo alamarBlue® (invitrogen). La fluorescencia se midió a Aexcitación/Aemisión de 540 nm/590 nm mediante un espectrofluorímetro de placas Fluostar Optima (BMG Labtechnologies). Dada la relación directa entre unidades de fluorescencia y la viabilidad celular, el cálculo de la viabilidad se realizó respecto a las células control con la cantidad equivalente de DMSO en las muestras, mediante la siguiente fórmula:

% Viabilidad = (Unidades de Fluorescencia muestra/ Unidades de Fluorescencia control) x 100

En los gráficos de la figura 5 se observa que la proteína prohibitina recombinante purificada mostró capacidad antiproliferativa sobre las células cancerosas HepG2 y Caco-2 al observarse una reducción significativa de la proliferación tras el tratamiento con prohibitina. En el caso de Caco-2 se observó un efecto dosis dependiente, de modo que a mayor concentración de prohibitina mayor efecto antiproliferativo. En el caso de la línea HepG2 no se observó un efecto dependiente de la dosis. La aplicación de prohibitina sobre la línea no tumoral Eahy.926 a dos tiempos (6 y 72 h) no redujo la viabilidad celular. Por lo que, a priori parece ser que la prohibitina tenga un efecto selectivo y sólo actúe sobre células tumorales.

Referencias

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http://bioinfo.ut.ee/prímer3-0.4.0/

Claims (3)

REIVINDICACIONES

1. - Una composición farmacéutica que comprende una proteína que consiste en la secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 2.

2. - Una composición farmacéutica según la reivindicación anterior, para su uso en terapia.

3. - Una composición farmacéutica según la reivindicación 1, para su uso en la prevención o tratamiento del cáncer colorrectal o hepático.