ES2909649B2 - Procedimiento de espectrometria de analitos multiparametrica asistida por hidrodinamica - Google Patents
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Description
DESCRIPCIÓN
PROCEDIMIENTO DE ESPECTROMETRÍA DE ANALITOS MULTIPARAMÉTRICA
ASISTIDA POR HIDRODINÁMICA
OBJETO DE LA INVENCIÓN
El objeto de la presente invención es un procedimiento de espectrometría de analitos multiparamétrica asistida por hidrodinámica, que hace uso de un dispositivo de tipo microcapilar suspendido resonante, y que permite obtener tres parámetros de los analitos simultáneamente: masa, tamaño e índice de refracción, que permiten clasificar inequívocamente los analitos fluyentes en tiempo real a partir del desplazamiento de la frecuencia de resonancia del microcapilar resonante y su cambio de reflectividad.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
La clasificación y caracterización de alto rendimiento de micro y nanopartículas individuales en entornos fisiológicos es de especial interés en muchos campos diferentes, como el control ambiental, los ensayos clínicos, la nanotoxicología o la biología celular. A estos efectos, se ha demostrado que el uso de dispositivos microfluídicos es una técnica robusta para la clasificación pasiva de partículas, que funciona con un rendimiento de hasta 107 partículas/min, simplemente aprovechando las fuerzas ejercidas por el fluido en movimiento sobre la partícula.
Estas fuerzas hidrodinámicas dependen de la forma y el tamaño de las partículas, lo que finalmente da lugar a que éstas se muevan junto con el fluido. A pesar de que estos dispositivos permiten el análisis de partículas basado en las propiedades geométricas, los dispositivos microfluídicos estáticos no pueden discernir partículas en los casos en los que estas presentan la misma forma, pero están compuestas de materiales diferentes. Por lo tanto, es necesario combinarlo con otras técnicas (por ejemplo, métodos ópticos que miden el índice de refracción) para discernir entre partículas de idéntica forma.
Por otra parte, los resonadores nanomecánicos han demostrado ser una poderosa herramienta de análisis, ya que pueden medir múltiples propiedades físicas (fuerza, masa, rigidez, etc.) con una sensibilidad extremadamente alta, al poder registrar los cambios en la frecuencia de resonancia mecánica de una estructura vibratoria.
Sin embargo, esta alta sensibilidad se ve perjudicada por las fuerzas de rozamiento viscosas cuando el dispositivo se sumerge en líquido debido a la masa de líquido desplazada durante el ciclo de oscilación. Los resonadores de microcanal suspendidos (SMR, Suspended MicroChannel Resonators) se desarrollaron para analizar partículas en entornos líquidos, superando los problemas anteriormente descritos mediante la fusión de la microfluídica y la nanomecánica.
El enfoque SMR consiste en un resonador nanomecánico con un microcanal interno integrado, que permite que el resonador vibre en un entorno gaseoso o de vacío, mientras que las partículas se caracterizan en el líquido que fluye a través del microcanal. Dado que las fuerzas de rozamiento viscosas se reducen notablemente al colocar el líquido en el interior del resonador, se mejora la resolución de la masa boyante, alcanzando hasta 10 attogramos en los dispositivos de última generación que funcionan en vacío.
Entre los dispositivos SMR, los resonadores microcapilares transparentes (TMR, Transparent Microcapillary Resonator) no sólo combinan un resonador nanomecánico con un canal microfluídico, sino que también permiten la medida de las propiedades ópticas de las partículas que fluyen en su interior. Estos dispositivos han demostrado ser una alternativa interesante a los SMR para la detección de masas, introduciendo una nueva fuente de información sobre la partícula basada en su caracterización óptica. Lo que hace de esta técnica de detección de partículas mecáno-óptica una técnica muy fiable para la clasificación de partículas, incluso en casos de partículas de masas similares.
Concretamente, se conoce el documento US2012/0118063A1, que describe un método para determinar la masa boyante y la deformabilidad de una célula. El método incluye la introducción de la célula en un resonador de microcanal que comprende un estrechamiento cerca de un extremo en el resonador. Se monitorea un primer cambio de frecuencia en el resonador, estando relacionado con la masa boyante de la célula. El tiempo de tránsito de la célula a través del estrechamiento se mide monitoreando un segundo cambio de frecuencia como resultado de un cambio en la ubicación de la célula a medida que pasa a través del estrechamiento, con lo que se determina la deformabilidad de la partícula medida y el tiempo de tránsito.
En los trabajos del estado de la técnica todavía es necesario disponer de información previa sobre el tamaño de las partículas, adquirida por otras técnicas, para calcular algunos parámetros de éstas, como, por ejemplo, el índice de refracción, o bien es necesario medir cada partícula
dos veces en líquidos de distintas propiedades para obtener parámetros como, por ejemplo, la densidad de masa. En particular, la densidad se ha revelado como un parámetro interesante para la caracterización del ciclo de vida de las células en trabajos anteriores utilizando SMR, debido a la relación de la densidad celular con la actividad.
Además, las técnicas actuales requieren la medición de la masa boyante de la misma partícula en dos medios de densidad diferente para medir su densidad, lo que reduce drásticamente el rendimiento de la medición.
DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN
Es objeto de la presente invención un procedimiento de espectrometría de analitos multiparamétrica asistida por hidrodinámica, que hace uso de un dispositivo de tipo microcapilar suspendido, particularmente de un resonador microcapilar transparente (TMR, Transparent Microcapillary Resonator). Por el interior del dispositivo circula un fluido con unos analitos de interés en suspensión, y con el procedimiento, se logran obtener tres parámetros medidos simultáneamente: masa boyante, tamaño de la partícula e índice de refracción. Estos parámetros se obtienen mediante la medida del desplazamiento de frecuencia y cambio de reflectividad del dispositivo TMR medidos en distintos instantes de tiempo. Este procedimiento permite clasificar inequívocamente los analitos fluyentes en tiempo real.
El procedimiento propuesto permite la medición de parámetros intensivos, como la densidad de masa, para el desarrollo de la espectrometría de analitos en tiempo real en líquidos. Concretamente, se propone el uso del enfoque hidrodinámico de analitos para obtener partículas ordenadas y con una posición conocida cuando pasan por la zona libre del dispositivo TMR. Conocer previamente la posición de los analitos dentro del tubo facilita el análisis de las señales de desplazamiento mecánico de la frecuencia y cambio en reflectividad causados por el paso de una partícula fluyente a través del TMR, lo que finalmente permite conocer el tamaño de los analitos.
Esta medición del diámetro de partícula se adquiere simultáneamente a la masa boyante y la reflectividad, lo que permite una técnica de caracterización de analitos de triple parámetro de alto rendimiento, así como el cálculo de parámetros intensivos, como la densidad de masa.
Como se ha indicado, el procedimiento hace uso de un dispositivo de análisis de muestras de tipo resonador micro capilar transparente (TMR, Transparent Microcapillary Resonator) que
comprende: un sustrato; una estructura alargada hueca transparente, de tipo tubo capilar, que tiene dos extremos, entre los cuales circula un fluido con unos analitos de interés en suspensión; dos soportes, acoplados a los extremos del tubo capilar; un módulo de vibración, preferentemente un dispositivo piezoeléctrico, acoplado al sustrato, adaptado para producir vibraciones en éste; un láser que emite un haz de luz hacia el tubo capilar; y un fotorreceptor adaptado para recibir el haz de luz que atraviesa el tubo capilar.
El procedimiento objeto de la presente invención, que hace uso del dispositivo descrito, comprende una serie de etapas descritas a continuación.
En primer lugar, se acciona el láser, que emite un haz de luz que incide sobre el tubo capilar que contiene una muestra de interés, siendo la muestra un fluido con unos analitos en suspensión. El haz de luz atraviesa el tubo capilar, es reflejado por el sustrato y recogido por el fotorreceptor.
La siguiente etapa consiste en generar una primera señal mediante el fotorreceptor y amplificar y filtrar dicha primera señal. Después, se divide la señal amplificada y filtrada en una componente modulada y una componente no modulada.
Se procesa la componente no modulada de la señal, para obtener una medida de la reflectividad del tubo capilar de manera continua en el tiempo, cuando una partícula pasa por la zona iluminada por el haz láser produce un cambio en la señal de reflectividad (potencia reflejada). A partir de este cambio en la potencia reflejada se obtiene la diferencia de tiempo entre los puntos de entrada y salida de la partícula a la zona iluminada (AT).
A continuación, se procesa la componente modulada de la señal para obtener una señal mecánica de referencia (Tt) del cambio de frecuencia de resonancia en función del tiempo causada por el paso de la partícula. La máxima variación en frecuencia depende de la masa boyante de la partícula, y la variación en el tiempo depende de la velocidad (la velocidad se obtiene como la inversa del tiempo de tránsito multiplicada por la longitud del tubo capilar).
Cuando una partícula pasa a través del tubo capilar, la frecuencia de resonancia baja debido a la masa añadida. En documentos del estado de la técnica únicamente se analizaba la máxima variación en la frecuencia de resonancia y potencia reflejada, en la presente solicitud se ajustan ambas curvas guardando el tiempo que tarda en pasar: Tt y AT. Se conoce exactamente la longitud suspendida del tubo capilar, entendiéndose esta como la longitud del tubo capilar
comprendida entre los soportes. Al conocer distancia y el tiempo que tarda en recorrer dicho espacio, se puede calcular con mucha precisión la velocidad de la partícula.
A partir de la longitud del tubo capilar, siendo esta longitud comprendida entre los dos soportes del dispositivo, la señal mecánica y la señal óptica, se puede calcular del tamaño de la partícula como:
_ AT
9partícula Lcapilar ^
l t
DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
Para complementar la descripción que se está realizando y con objeto de ayudar a una mejor comprensión de las características de la invención, de acuerdo con un ejemplo preferente de realización práctica de la misma, se acompaña como parte integrante de dicha descripción, un juego de dibujos en donde con carácter ilustrativo y no limitativo, se ha representado lo siguiente:
Figura 1.- Muestra una vista esquemática de un resonadores microcapilares transparentes (TMR, Transparent Microcapillary Resonator) del estado de la técnica de medida mecano-óptica.
Figura 2.- Muestra una vista de sección del tubo capilar posicionado entre dos soportes y atravesado por el haz de luz del láser, y en la parte inferior una gráfica con la señal de la frecuencia de resonancia de una partícula que atraviesa el tubo capilar.
Figura 3.- Muestra una gráfica en la que se representan la señal óptica y la señal mecánica de una partícula.
Figura 4.- Muestra unas mediciones experimentales de la densidad de masa de las células individuales MCF-7 (cuadrados), que corresponden a las células epiteliales humanas de mama.
Figura 5.- Muestra la distribución del tamaño de las partículas medida para una muestra de 67 partículas de PMMA y 192 partículas de Sílice.
REALIZACIÓN PREFERENTE DE LA INVENCIÓN
Se describe a continuación, con ayuda de las figuras 1 a 3, una realización preferente del procedimiento de espectroscopía de analitos multiparamétrica asistida por hidrodinámica.
El procedimiento de la invención, hace uso de un dispositivo (12) de tipo resonador microcapilar transparente (TMR), mostrado en una vista general en la figura 1 y una vista en detalle en la figura 2, y comprende: un sustrato; una estructura alargada hueca transparente, de tipo tubo capilar que tiene dos extremos (3, 4), por la que circula un fluido con unos analitos de interés suspendidos; unos soportes (2), acoplados a los extremos del tubo capilar; un dispositivo piezoeléctrico, acoplado al sustrato y en contacto con el tubo capilar, adaptado para producir vibraciones en el tubo capilar; un láser (1) que emite un haz de luz; y un fotorreceptor (6) adaptado para recibir el haz de luz que atraviesa el tubo capilar antes de alcanzar el fotorreceptor (6).
Los analitos pueden ser tanto entidades biológicas, como a células o bacterias, o partículas inorgánicas de interés.
Tal y como se muestra en la figura 1, el haz de luz proveniente de un láser (1) atraviesa un divisor de haz (5). Después del divisor de haz (5) la luz se enfoca en el tubo capilar (12) a través de un objetivo de microscopio (11). Dicho haz, se refleja en el sustrato, vuelve a atravesar el tubo capilar y el objetivo de microscopio (11) hasta alcanzar el divisor de haces (5), el cual lo desvía hacia el fotorreceptor (6) que recoge el haz de luz modificado debido al paso a través del tubo capilar y genera una señal asociada tanto al movimiento del tubo capilar como a las propiedades del tubo capilar transparente y aquello que lo esté atravesando en ese momento.
El tubo capilar es de 44 ^m de diámetro exterior y 34 ^m de diámetro interior, y es obtenido mediante elongación local de un tubo capilar de sílice fundido de 350 ^m de diámetro exterior con un grosor de pared de 50 ^m. El sustrato es de silicio y los soportes (2) son unas almohadillas poliméricas fotolitografiadas, obteniendo una región suspendida del tubo capilar de 500 ^m de longitud, en la que el tubo capilar puede oscilar mecánicamente en un modo similar al de las cuerdas de una guitarra, como un resonador.
Los modos mecánicos del tubo capilar se excitan mediante un actuador piezoeléctrico, mientras que su frecuencia de resonancia se sigue en tiempo real mediante un sistema de lectura interferométrica y un amplificador de bloqueo (9) (lock-in amplifier), tal y como se muestra en la figura 1.
Este sistema interferométrico también permite el seguimiento de la potencia de la luz reflejada por el tubo capilar para obtener información sobre las propiedades ópticas de los analitos en flujo analizando en tiempo real la luz dispersada.
Además, el tubo capilar se presuriza mediante una primera bomba de presión de nitrógeno (10), que permite controlar el flujo estableciendo una diferencia de presión controlado a través de una resistencia microfluídica (8).
Por último, el extremo de salida (4) del tubo capilar está conectado a una segunda bomba de nitrógeno (7), lo que permite establecer una diferencia de presión mínima de 5 mbar entre el extremo de entrada (3) del tubo capilar y la salida de la resistencia microfluídica (8). La resistencia microfluídica (8) permite controlar mejor el flujo. Esto permite controlar la velocidad a la que pasan las partículas de interés o analitos por el tubo capilar suspendido.
Por su parte, el procedimiento objeto de la presente invención, que hace uso del dispositivo (12) descrito, comprende las etapas de:
- accionamiento del láser (1), que emite un haz de luz que incide sobre el tubo capilar que contiene una muestra y es recogido por el fotorreceptor (6),
- generación de una primera señal mediante el fotorreceptor (6) y amplificación y filtrado de la primera señal,
- división de la señal amplificada y filtrada en una componente modulada y una componente no modulada,
- procesado de la componente no modulada (DC) de la señal, mediante un procesador para obtener una medida de la reflectividad de la muestra en el interior del tubo capilar en cada instante de tiempo;
- detección del paso de la partícula por una zona iluminada por el láser (1), y ajuste a una doble gaussiana. Los centros de ambas gaussianas (puntos 1 y 3 de la curva discontinua de la figura 3) marcan el paso de cada extremo de la partícula por el centro de la zona iluminada, siendo la diferencia entre estos puntos el valor AT. Asimismo, entre los puntos 1 y 3 de la curva discontinua existe un valor máximo (punto 2 en la curva discontinua de la figura 3), correspondiente al centro de la partícula pasando por el centro de la zona iluminada, del que se puede obtener el valor del máximo cambio en reflectividad;
- procesado de la componente modulada para obtener una señal mecánica de referencia (Tt ) del cambio de frecuencia de resonancia en función del tiempo. Se mide el cambio de frecuencia de resonancia en función del tiempo. Cuando una partícula pasa
a través del tubo capilar, la frecuencia de resonancia baja debido a la masa añadida. Se ajusta una curva guardando el tiempo que tarda en pasar, curva inferior (señal mecánica) de la figura 3. Se conoce exactamente la longitud suspendida del tubo capilar (500 ^m) ya que se fabrica mediante litografía. Al conocer distancia recorrida y tiempo, se puede calcular con mucha precisión la velocidad de la partícula;
- cálculo del tamaño de la partícula como:
_ AT
9partícula Lcapilar
l t
En la figura 2 se muestra una vista en detalle del dispositivo (12), en el que una partícula fluye a través de una región libre del tubo capilar comprendida entre los soportes (2), desplazando la señal de la frecuencia de resonancia. La amplitud de esta caída (Af) depende de la masa boyante de la partícula, mientras que su anchura (tiempo de tránsito, Tt) depende de la velocidad de la partícula.
Suponiendo una velocidad constante, los analitos que fluyen, cuyo diámetro es muy pequeño en comparación con la longitud de la región suspendida del tubo capilar, prueban el modo mecánico siguiendo su perfil. Por lo tanto, la señal de desplazamiento de frecuencia rastreada en el amplificador de bloqueo (9) en función del tiempo para el enésimo modo mecánico puede escribirse como:
Af
r ) Pn
/n (0 ~ f n0 V'n cosh [ÍZ.-2M-W ft,j_ eos r ( 2 t - 2 t 0+ t
l
2
tT +
Siendo fn(t), la frecuencia del n-ésimo modo de flexión en función del tiempo, f n0 la frecuencia de resonancia natural del modo mecánico del resonador, ^ n,max el valor de la forma del modo mecánico normalizado en su máxima amplitud, t 0 el tiempo en que la partícula está en el centro de la región suspendida
el valor propio del modo (los cuatro primeros valores propios son =4.7300,7.8532,10.9956,14.1372).
Las líneas discontinuas de la figura 2 muestran el desplazamiento de frecuencia inducido por una partícula en los cuatro primeros modos de flexión del dispositivo (12). Sin limitar la generalidad de lo anterior, se analiza el modo fundamental. Ajustar los desplazamientos de
frecuencia temporal a la Ec.1 permite obtener ya sea la masa boyante de la partícula o la velocidad de la misma, que se obtiene directamente como el inverso del tiempo de tránsito multiplicado por la longitud de la región suspendida del tubo capilar.
El movimiento de la partícula es el resultado de la fuerza ejercida por el líquido sobre la superficie de la partícula. Por lo tanto, a continuación se analiza la dependencia de la fuerza hidrodinámica del tamaño de la partícula, lo que permitirá clasificar los analitos por sus radios.
Para demostrarlo experimentalmente, se introduce una suspensión acuosa y homogénea de micropartículas en el dispositivo (12). Si las partículas sólo se sometieran a las fuerzas de arrastre del fluido en la dirección del flujo, seguirían una distribución aleatoria en la dirección radial del tubo. Sin embargo, dentro de un flujo laminar, cada partícula también sufre un desplazamiento ortogonal a la dirección del flujo.
Esta es la consecuencia del equilibrio entre dos fuerzas de sustentación ejercidas por el fluido sobre la partícula en movimiento: gradiente de cizalladura (centrífugo) y sustentación inducida por la pared (centrípeta). Para calcular la posición de equilibrio de las partículas se realizan simulaciones de elementos finitos para calcular la fuerza neta en la dirección y sobre las partículas esféricas de 6,8 ^m y 12,4 ^m de diámetro nominal.
Se simula un tubo cilíndrico cuyas dimensiones imitan la región suspendida experimental del tubo capilar y se establece una diferencia de presión entre sus extremos (3, 4). Las simulaciones revelan que la fuerza dominante es siempre centrífuga, por lo que en esta configuración la posición de equilibrio es el contacto con la pared del tubo capilar. Por lo tanto, las partículas distribuidas aleatoriamente introducidas en el tubo capilar estarán sujetas a fuerzas de sustentación, haciendo que todas las partículas se precipiten en la pared del tubo capilar. Una vez precipitadas, la fuerza de empuje y arrastre de la partícula alcanza un estado estable. Este equilibrio entre las fuerzas hidrodinámicas produce que las partículas atraviesen la zona suspendida con una velocidad constante, permitiendo ajustar los resultados de cambio en frecuencia a Ec. 1. Esta posición de las partículas también ha sido corroborada mediante la inspección óptica con una cámara CCD (dispositivo de carga acoplada, del inglés Charge-Coupled Device).
El dispositivo (12) y el sistema de medida (9) también permiten seguir en función del tiempo la potencia de la luz reflejada (señal óptica) por el dispositivo (12). Por lo tanto, cuando una partícula pasa por debajo de la región iluminada por el láser (1), produce una disminución de
esta señal óptica debido a la luz dispersa, que puede utilizarse para obtener información adicional sobre la partícula.
Esta caída de la señal óptica, tal y como se muestra en la figura 3, consiste en un doble pico cuyo máximo local corresponde a la partícula situada en el centro del haz del láser (1) mientras que sus mínimos locales corresponden a la luz dispersada por los bordes de la partícula: cuando cada uno de ellos se encuentra alineado con el centro de la zona iluminada. Por lo tanto, dada la velocidad de la partícula obtenida al ajustar la señal mecánica, el diámetro de la partícula puede calcularse midiendo la diferencia de tiempo entre los dos mínimos locales de la señal óptica.
Como se muestra en la figura 5, se obtiene una distribución de tamaños de 11±2 ^m para las partículas de PMMA y 7±2 ^m para las partículas de sílice, estos valores reproducen los resultados obtenidos mediante el análisis de imágenes de microscopio electrónico de barrido (SEM, Scanning Electron Microscope) de las mismas poblaciones 12,4±0,2 ^m para las partículas de PMMA y 6,8±0,4 ^m para las partículas de sílice.
Por lo tanto, este procedimiento objeto de invención permite la medición simultánea de tres parámetros diferentes e independientes de cada partícula individual (masa boyante, velocidad de los analitos y cambio de reflectividad, — AR) con un rendimiento extremadamente alto, hasta
trescientas analitos por minuto. Cuando se traza en un diagrama de dispersión tridimensional, la mezcla de analitos anterior puede discernirse sin ambigüedades realizando un discernimiento de analitos altamente fiable basado en tres parámetros independientes.
Además, la densidad de masa se ha demostrado como un parámetro interesante para la caracterización del ciclo de vida celular debido a la relación de la densidad celular con su actividad. Se sabe que la densidad celular varía durante el ciclo de vida celular. Esto es particularmente importante en las células humanas, donde la densidad permanece constante durante todo el ciclo de vida, excepto durante la mitosis, cuando las células experimentan un rápido aumento de volumen celular con la correspondiente disminución de su densidad de masa.
Por lo tanto, hay una dependencia del tamaño de la densidad de masa, las células más grandes muestran una densidad menor. Se mide la densidad de las células de adenocarcinoma de mama humano MCF-7 (valor medio de 1,11 ± 0,08 g-mL-1), células de
mama epiteliales humanas, como prueba de concepto de la capacidad de esta técnica mecano-óptica para caracterizar las células patológicas.
Como se desprende de las mediciones experimentales, mostradas en la figura 4, se observa una dependencia de la densidad con su tamaño, lo que concuerda con los resultados obtenidos en trabajos anteriores. La línea discontinua representa un ajuste de los valores experimentales, mostrando la dependencia del tamaño de la densidad medida. Este resultado demuestra la capacidad del procedimiento de invención y abre la puerta a estudios individuales del ciclo celular.
En conclusión, en la presente solicitud se describe un procedimiento de espectroscopia de analitos multiparamétricas utilizando resonadores micro capilares suspendidos, simplemente siguiendo un modo de resonancia mecánico flexural (preferentemente el modo fundamental) y la potencia reflejada por el resonador.
La medición simultánea de la masa boyante y la velocidad mediante el seguimiento de la frecuencia mecánica del dispositivo, así como el cambio en reflectividad medido mediante la señal óptica, permiten la distinción entre poblaciones de analitos. Del mismo modo, mediante la combinación de los resultados de estas medidas pueden obtenerse otros parámetros físicos de interés como el tamaño o la densidad de los analitos que fluyen a través del dispositivo con un alto rendimiento. Estos parámetros han demostrado ser muy interesantes para la caracterización de entidades biológicas tales como células.
Claims (3)
1. - Procedimiento de espectrometría de analitos asistida por hidrodinámica, que hace uso de un dispositivo (12) de tipo resonador microcapilar transparente (TMR), que comprende un sustrato; un tubo capilar transparente con dos extremos (3, 4), por el que circula un fluido con uno o más analitos en suspensión; unos soportes (2), acoplados a los extremos (3, 4) del tubo capilar; un módulo piezoeléctrico, acoplado al sustrato y en contacto con el tubo capilar, adaptado para producir vibraciones en el tubo capilar; un láser (1) que emite un haz de luz; y un fotorreceptor (6) adaptado para recibir el haz de luz que atraviesa el tubo capilar antes de alcanzar el fotorreceptor (6); en el que el procedimiento comprende las etapas de:
- accionamiento del láser (1), que emite un haz de luz que incide sobre el tubo capilar y es recogido por el fotorreceptor (6),
- generación de una primera señal mediante el fotorreceptor (6) y amplificación y filtrado de la primera señal,
- división de la señal amplificada y filtrada en una componente modulada y una componente no modulada,
- procesado de la componente no modulada de la señal, y obtención de una medida de la reflectividad de los analitos en cada instante de tiempo,
- detección del paso de los analitos por una zona del tubo capilar iluminada por el láser (1), y obtención de unos puntos de paso de los extremos de los analitos por el centro de la zona iluminada, mediante la medida de reflectividad, AT, y
- procesado de la componente modulada y obtención de una señal mecánica de referencia (Tt) del cambio de frecuencia de resonancia de los analitos en función del tiempo.
2. - El procedimiento de la reivindicación 1, que comprende adicionalmente una etapa final de cálculo del tamaño de los analitos según una expresión:
_ AT
9partícula Lcapilar
11
donde AT es la señal óptica, Tt es la señal mecánica de referencia, y Lcapüar es una longitud libre del tubo capilar comprendida entre los soportes (2).
3. - El procedimiento de la reivindicación 1, que comprende adicionalmente una etapa de cálculo de la velocidad de la partícula como cociente entre LcapUar y la señal mecánica de referencia (Tt), siendo Lcapüar una longitud suspendida del tubo capilar comprendida entre los soportes (2).
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