ES2910201B2 - Hidrogel lipidico, procedimiento de preparacion y uso del mismo - Google Patents
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Description
vesículas.
Fig. 11. Muestra una imagen de tres geles formados a distinto pH y/o composición: gel de HSPC a pH 11.5, un gel de HSPC a pH 2.5 y un gel de HSPC/DOPS 20:1 a pH 7. Los tres geles han sido formados a un 5% de concentración de lípido siguiendo el protocolo descrito en el ejemplo 1 de la presente invención. Se observa un comportamiento de gel rígido a simple vista ya que los geles no se mueven por el efecto de la gravedad dentro de los eppendorf.
Fig. 12. Muestra una imagen con tres geles de HSPC/DOTAP formados a 5% de lípido. Las relaciones molares HSPC/DOTAP son de 3:1, 20:1 y 80:1. Se ve como el gel 20:1 es el más rígido, mientras que el 3:1 fluye más fácilmente con el tiempo al girar el eppendorf. En la imagen también se muestran las diferencias en la estructura lipídica mediante microscopia confocal: el gris corresponde a los lípidos y el negro al agua.
Fig. 13. Simulación del proceso de digestión gástrica para un gel de HSPC/DOTAP a pH 2 de acuerdo con el ejemplo 5. En la imagen de la izquierda se puede ver el momento en que se añadieron 0.5 mL de gel a la solución ácida. En las fotos de la derecha se muestra el estado del gel después de 2 horas en agitación a 37 °C.
EJEMPLOS
A continuación, se ilustrará la invención mediante unos ensayos realizados por los inventores, que pone de manifiesto la efectividad del producto de la invención.
Ejemplo 1: Preparación de hidrogeles lipídicos de acuerdo con la presente invención
Ejemplo 1.1.: Hidrogeles de composición HSPC/DOTAP con un 5% en peso total de lípidos y con proporciones molares HSPC/DOTAP 80:1, 20:1 y 3:1.
Materiales
Se adquirieron fosfatidilcolina de soja hidrogenada (HSPC) y 1,2-dioleoil-3-trimetilamonio-propano (DOTAP) de Lipoid GmbH (Ludwigshafen, Alemania). El
cloroformo fue adquirido a Merck (Darmstadt, Alemania). 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfoserina (DOPS) fue adquirido en Lipoid GmbH.
Preparación de los geles lipídicos
En primer lugar, se formó una dispersión acuosa de HSPC y DOTAP (la relación molar entre dichos lípidos se fijó en 3:1, 20:1 y 80:1) para ello los lípidos se disolvieron en cloroformo y seguidamente el disolvente fue evaporado mediante rotavapor para formar una película lipídica y se adicionó agua hasta tener una concentración total de lípidos del 5% en peso. A continuación, el pH se ajustó a 7 añadiendo una disolución de NaOH al 0,1% en peso. Para formar los geles, la dispersión acuosa de lípidos se almacenó primero a -20 °C en un frasco cerrado durante dos horas para congelar completamente la muestra. Después, las muestras se calentaron a 70 °C durante 10 minutos hasta que toda la dispersión se aclaró. Los geles se dejaron enfriar a temperatura ambiente y se almacenaron 24h en la nevera (5°C) antes de cualquier medición. La gelificación y la ausencia de separación de agua se confirmaron dando la vuelta a los viales.
Ejemplo 1.2.: Hidrogeles de composición HSPC/DOPS con un 5% en peso total del lípidos y con proporciones molares HSPC/DOPS 80:1, 20:1 y 3:1
Los hidrogeles de composición HSPC/DOPS se prepararon siguiendo la misma metodología que en el ejemplo 1.1., pero utilizando DOPS en lugar de DOTAP.
Ejemplo 1.3.: Hidrogel que comprende como lípido únicamente el fosfolípido HSPC al 5% en peso.
Este hidrogel se preparó como en los casos anteriores, pero utilizando únicamente HSPC como lípido y ajustando el pH a 2,5 en un caso y a 11,5 en otro (se prepararon dos geles de la misma composición a distintos pH).
Ejemplo 2.: Estudio de microscopia confocal de los geles
Esta técnica nos permite observar la microestructura del gel y cómo se organiza en el medio acuoso. Se puede detectar la formación de estructuras con distintas morfologías y tamaños, así como la interconexión entre dichas estructuras en la matriz del gel.
Se realizaron ensayos de microscopía confocal de fluorescencia con los hidrogeles siguientes preparados en el ejemplo 1: HSPC/DOTAP en proporción 80:1,20:1 y 3:1; y HSPC/DOPS en proporción 20:1.
2.1. Procedimiento del ensayo
Con el objetivo de marcar la parte lipídica de los geles se utilizó la sonda fluorescente 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(lissamine rhodamine B sulfonyl) (ammonium salt) de Avanti Polar Lipids Inc. (Alabaster, AL, USA). La concentración final de la sonda fue 0,005% en peso en todas las muestras para tener suficiente intensidad fluorescente sin interferir en la estructura del gel.
Se utilizó un microscopio confocal Zeiss LSM 880 equipado con un láser DPSS de 561 nm para excitación de la Rodamina B. Las imágenes se obtuvieron utilizando un objetivo 10X 0.4NA y un objetivo 63X 1.4NA de inmersión en glicerol. Las imágenes se procesaron usando el software ImageJ 1.52d (J. Schindelin, et al. Nat. Methods. 9 (2012) 676).
2.2. Resultados y conclusiones
La organización de los lípidos formando la microestructura del gel de HSPC/DOTAP y HSPC/DOTAP se pueden ver en la Figura 1 y Figura 2 respectivamente. Los lípidos aparecen en escala de gris, mientras que el agua aparece de color negro.
En la Figura 1, las imágenes de menor magnificación (arriba) permiten ver como los lípidos se organizan en agregados interconectados ocupando gran parte del espacio, como es esperable en un gel. Las imágenes de mayor magnificación (abajo) muestran como esos dominios de lípidos están formados por agregados de láminas lipídicas (indicadas con flechas) y partículas esféricas tipo vesículas que rondan los 5 - 20 nm de diámetro.
La figura 2 muestra con más detalle la estructura del gel de HSPC/DOTAP 3:1 que aparece en la figura 3D. Aquí se aprecian claramente esas láminas y vesículas interconectadas.
En la figura 3 se muestra una imagen del gel de HSPC/DOPS 20:1 donde se aprecian también esas láminas y vesículas interconectadas.
Ejemplo 3. Estudio reológico de los geles
12
La reología permite describir las propiedades macroscópicas del gel. En el estudio reológico que describimos más abajo, se determina la respuesta del material a un estrés oscilatorio, determinando las variables módulo elástico (G') y módulo viscoso (G"). En los materiales que tienen un comportamiento gel la elasticidad, medida con G', será mayor que la energía disipada o comportamiento viscoso, determinado por G’’ para un rango de frecuencias determinado.
Se realizaron ensayos con los hidrogeles siguientes preparados en el ejemplo 1: HSPC/DOTAP en proporción 80:1,20:1 y 3:1; y HSPC/DOPS en proporción 20:1
3.1. Procedimiento del ensayo
Se estudió el comportamiento reológico de los geles realizando ensayos oscilatorios con un reómetro de esfuerzo controlado AR-G2 (TA Instruments), equipado con un sistema de control de temperatura Peltier. Las mediciones fueron realizadas por la Unidad de Líquidos Nanoestructurados (U12) de CIBER-BBN, en el ICTS NANBIOSIS. Se utilizó geometría cono-placa de 40 mm de diámetro, ángulo de cono de 4 ° y un espacio de 105 ^m. Las muestras se evaluaron a 25 ° C y se evitó el secado de las muestras utilizando una trampa de disolvente. Antes de cada medición oscilatoria, los geles se cortaron previamente a 10 s-1 durante 10 s para obtener condiciones homogéneas. Luego, la muestra se sometió a una deformación por cizallamiento sinusoidal mientras se medía la respuesta al esfuerzo en cada punto. Los datos se analizaron utilizando el software TRIOS (TA Instruments, EE. UU.). El comportamiento viscoelástico de la muestra se describió mediante el módulo complejo G* = ?y donde t es el esfuerzo cortante y y es la deformación cortante. Con el ángulo de fase 5 entre la respuesta de oscilación aplicada y la resultante, el software determinó el módulo elástico G ’y el módulo viscoso G’’ del vector G * de la siguiente manera:
G’= G*cos 5
G’’= G*sin 5
El módulo elástico G'está relacionado con la energía almacenada, mientras que el módulo viscoso G’’ representa la energía disipada.
3.2. Resultados y conclusiones
En estos ensayos se mide el módulo elástico (G’) y el módulo viscoso (G’’) de la muestra aplicando una deformación fija en un intervalo de frecuencias. De este modo
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se puede ver cómo se comporta el material en función del tiempo que dura la deformación aplicada.
3.2.1. Prueba del comportamiento gel
En las figuras 4 y 5 se puede ver que, en todos los geles, el modulo elástico (G’) es superior al viscoso (G’’) en todo el rango de frecuencias. Esto es indicativo que el material tiene un comportamiento macroscópico de tipo gel. Cómo es esperable en estos materiales, G’ y G’’ aumentan a frecuencias altas (deformaciones rápidas) ya que la estructura interna de la muestra tiene menos tiempo para adaptarse a la deformación aplicada y por lo tanto hay una mayor resistencia a esta.
En la Tabla 1 se muestran las diferencias en los valores de G’ y G’’ de la Figura 5 para los geles de HSPC/DOPS y HSPC/DOTAP en relación molar 20:1. Se ve como el gel de DOTAP es el más resistente a la deformación, ya que presenta unos valores de G’ y G’’ mayores. Así mismo, el gel de DOTAP tiene un ángulo de fase (ratio G’’/G’) menor a frecuencias bajas, indicando un mayor predominio del comportamiento elástico de la estructura en comparación con el gel de DOPS. De este modo se puede deducir que, en función de la composición lipídica utilizada, se pueden obtener geles con propiedades reológicas distintas, manteniendo una estructura formada por vesículas y láminas interconectadas. Este hecho permite una gran versatilidad de aplicación, ya que es posible preparar materiales de diferente comportamiento reológico en función del uso final. Además, se ha comprobado que, utilizando las composiciones lipídicas mencionadas, no es necesaria la presencia de otro tipo de moléculas para la obtención del gel.
Tabla 1. Valores de G’ y G’’ de distintos geles en función de la frecuencia
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3.2.2. Estabilidad con el pH
El mismo comportamiento de gel se puede observar en la Figura 6 cuando los geles son preparados a pH ácido, neutro y básico (3, 6,5 y 10,5 respectivamente). Las diferentes combinaciones que han sido probadas se muestran en la tabla 2.
Tabla 2. Distintas composiciones de geles con su rango de estabilidad frente al pH
3.2.3. Estabilidad con el tiempo
Con relación a la estabilidad, se ha comprobado que estos geles son estables a lo largo del tiempo. La figura 7 muestra como el mismo comportamiento reológico de gel se mantiene al cabo de 3 meses en un gel de HSPC/DOTAP 20:1 guardado a 5 °C en un recipiente hermético.
Ejemplo 4. Estudios de dispersión de rayos X
La dispersión de rayos X es una técnica analítica que mide las intensidades de rayos X dispersados en una muestra en función del ángulo de dispersión. A partir de la ley de Bragg, se entiende que con la disminución del ángulo de dispersión, se analizan características estructurales cada vez más grandes.
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Se observa una señal a ángulos pequeños en ingles SAXS (Small Angle X-ray Scattering) cuando el material contiene características estructurales en la escala de nanómetros, generalmente, en el rango de entre 1 y 100 nm. Por otra parte, la dispersión de rayos X de ángulo amplio, en ingles WAXS (Wide Angle X-ray Scattering), analiza las estructuras en el material en una escala de longitud mucho más pequeña como distancias interatómicas y menores.
En nuestros experimentos estas técnicas nos permiten detectar la nanoestructura de la bicapa lipídica de las láminas y vesículas que forman el gel (SAXS) así como el empaquetamiento lateral entre los lípidos (WAXS).
Se realizaron ensayos con los hidrogeles siguientes preparados en el ejemplo 1:
HSPC/DOTAP en proporción 80:1,20:1 y 3:1 y HSPC/DOPS en proporción 80:1,20:1 y 3:1.
4.1. Procedimiento del ensayo
Las medidas de dispersión de rayos X se realizaron con radiación de sincrotrón en la línea de luz BL11-NCD-SWEET del ALBA (Cerdanyola del Vallés, Barcelona, España). Las muestras se cargaron en un capilar de vidrio de 1,5 mm y se colocaron en una cámara Linkam, que se utiliza para controlar la temperatura a 25°C. Las muestras se alinearon con el haz de rayos X con una energía de 12,4 keV. Las medidas a ángulo pequeño (SAXS) se adquirieron utilizando un detector Pilatus 1M colocado a 2,71 m de la muestra y las de ángulo ancho (WAXS) se adquirieron utilizando un detector Rayonix LX255-HS colocado a 0,134 m. Los espectros se recogieron con un tiempo de adquisición de 5s.
4.2. Resultados y conclusiones
Con tal de estudiar la organización de la estructura lipídica a nivel molecular se utilizó una técnica de dispersión de rayos X mediante radiación de sincrotrón. En la Figura 8 y la Figura 9 se puede ver el patrón de dispersión a ángulos pequeños (SAXS) y grandes (WAXS) de los geles de HSPC/DOTAP y HSPC/DOPS respectivamente. Las relaciones molares utilizadas han sido 80:1, 20:1 y 3:1.
Se puede apreciar como el patrón de SAXS (Fig 8A y Fig 9A) tiene una banda principal centrada en q = 1 nm-1 seguida por dos armónicos muy pequeños situados sobre q= 2,4 y 3,6 nm-1. Este tipo de patrón es característico de sistemas formados por bicapas lipídicas con muy poca correlación. Así este patrón de dispersión es compatible con un
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sistema formado mayoritariamente por vesículas unilamelares y láminas lipídicas donde la distancia entre bicapas es variable entorno a los 6 nm. Si por el contrario fuese un sistema multilamelar, donde la mayoría de lípidos están organizados en bicapas poco separadas con distancias regulares entre ellas, se obtendría un patrón de dispersión con bandas estrechas y equidistantes.
El patrón de WAXS permite estudiar el empaquetamiento lateral de las moléculas que forman las bicapas lipídicas. En las Figuras 8B y 9B se puede ver en el espectro una pequeña banda centrada en 15 nm-1 correspondiente a una separación lateral entre moléculas lipídicas de 4,2 nm, que correspondería con un empaquetamiento ortorrómbico o hexagonal. Es importante mencionar que la banda ancha de poca intensidad que aparece sobre 20-22 nm-1 se debe probablemente a la señal producida por el agua de la muestra y por lo tanto no debe ser considerada.
Ejemplo 5. Ensayos de estabilidad gástrica
La capacidad de los geles de ser estables a distintos pH, incluso ácidos y básicos extremos, permite un rango aplicativo muy amplio. Por ejemplo, se pueden emplear en aplicaciones gástricas donde el pH puede oscilar entre 1 y 4. El gel HSPC/DOTAP 20:1 se sometió a una incubación que simulaba la digestión gástrica. En este ensayo se preparó una solución salina a pH 2 con HCl y NaCl y a continuación se añadió el gel, que se dejó agitando en vaivén a 37 °C durante 2 horas. Se observó (Figura 13) cómo una parte del gel se rompió en fragmentos más pequeños a causa de la agitación, pero sin disolverse y manteniendo la apariencia de gel. Esto permitiría el uso de gel como agente de administración controlada de fármacos o como potencial protector gástrico.
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BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
Fig. 1. Imágenes de microscopía confocal de los geles HSPC/DOTAP, magnificaciones x10 (A, B y C) y x63 (D, E y F). Muestra 3:1 (A y D), muestra 20:1 (B y E) y muestra 80:1 (C y F). La señal de fluorescencia (zonas claras) surge de la fase lipídica debido a la incorporación de la sonda fluorescente y las zonas oscuras corresponden con el agua. Las flechas indican las estructuras laminares.
Fig. 2. Ampliación imagen gel HSPC/DOTAP 3:1. Las flechas indican las estructuras laminares.
Fig. 3. Estructura del gel HSPC/DOPS 20:1. Las flechas indican las estructuras laminares.
Fig. 4. Ensayo oscilatorio con barrido de frecuencia donde se compara un gel de HSPC/DOTAP con distintas relaciones molares.
Fig. 5. Ensayo oscilatorio con barrido de frecuencia donde se compara un gel de HSPC/DOTAP con un gel de HSPC/DOPS.
Fig. 6. Comportamiento reológico de los geles a distinto pH.
Fig. 7. Estabilidad de un gel de HSPC/DOPS 20:1 con el tiempo.
Fig. 8. Espectros de SAXS (A) y WAXS (B) de geles de HSPC/DOTAP a distintas relaciones molares
Fig. 9. Espectros de SAXS (A) y WAXS (B) de geles de HSPC/DOPS a distintas relaciones molares
Fig. 10. Muestra una imagen de microscopía confocal del hidrogel preparado en el ejemplo 1 con una composición lipídica HSPC/DOTAP del 5% en peso (relación molar HSPC/DOTAP 3:1) y 95% de agua. En dicha imagen se pueden observar las láminas y vesículas que forman la red tridimensional. En las zonas marcadas por un círculo se pueden apreciar las láminas plegadas entrelazadas con estructuras compatibles con
vesículas.
Fig. 11. Muestra una imagen de tres geles formados a distinto pH y/o composición: gel de HSPC a pH 11.5, un gel de HSPC a pH 2.5 y un gel de HSPC/DOPS 20:1 a pH 7. Los tres geles han sido formados a un 5% de concentración de lípido siguiendo el protocolo descrito en el ejemplo 1 de la presente invención. Se observa un comportamiento de gel rígido a simple vista ya que los geles no se mueven por el efecto de la gravedad dentro de los eppendorf.
Fig. 12. Muestra una imagen con tres geles de HSPC/DOTAP formados a 5% de lípido. Las relaciones molares HSPC/DOTAP son de 3:1, 20:1 y 80:1. Se ve como el gel 20:1 es el más rígido, mientras que el 3:1 fluye más fácilmente con el tiempo al girar el eppendorf. En la imagen también se muestran las diferencias en la estructura lipídica mediante microscopia confocal: el gris corresponde a los lípidos y el negro al agua.
Fig. 13. Simulación del proceso de digestión gástrica para un gel de HSPC/DOTAP a pH 2 de acuerdo con el ejemplo 5. En la imagen de la izquierda se puede ver el momento en que se añadieron 0.5 mL de gel a la solución ácida. En las fotos de la derecha se muestra el estado del gel después de 2 horas en agitación a 37 °C.
EJEMPLOS
A continuación, se ilustrará la invención mediante unos ensayos realizados por los inventores, que pone de manifiesto la efectividad del producto de la invención.
Ejemplo 1: Preparación de hidrogeles lipídicos de acuerdo con la presente invención
Ejemplo 1.1.: Hidrogeles de composición HSPC/DOTAP con un 5% en peso total de lípidos y con proporciones molares HSPC/DOTAP 80:1, 20:1 y 3:1.
Materiales
Se adquirieron fosfatidilcolina de soja hidrogenada (HSPC) y 1,2-dioleoil-3-trimetilamonio-propano (DOTAP) de Lipoid GmbH (Ludwigshafen, Alemania). El
cloroformo fue adquirido a Merck (Darmstadt, Alemania). 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfoserina (DOPS) fue adquirido en Lipoid GmbH.
Preparación de los geles lipídicos
En primer lugar, se formó una dispersión acuosa de HSPC y DOTAP (la relación molar entre dichos lípidos se fijó en 3:1, 20:1 y 80:1) para ello los lípidos se disolvieron en cloroformo y seguidamente el disolvente fue evaporado mediante rotavapor para formar una película lipídica y se adicionó agua hasta tener una concentración total de lípidos del 5% en peso. A continuación, el pH se ajustó a 7 añadiendo una disolución de NaOH al 0,1% en peso. Para formar los geles, la dispersión acuosa de lípidos se almacenó primero a -20 °C en un frasco cerrado durante dos horas para congelar completamente la muestra. Después, las muestras se calentaron a 70 °C durante 10 minutos hasta que toda la dispersión se aclaró. Los geles se dejaron enfriar a temperatura ambiente y se almacenaron 24h en la nevera (5°C) antes de cualquier medición. La gelificación y la ausencia de separación de agua se confirmaron dando la vuelta a los viales.
Ejemplo 1.2.: Hidrogeles de composición HSPC/DOPS con un 5% en peso total del lípidos y con proporciones molares HSPC/DOPS 80:1, 20:1 y 3:1
Los hidrogeles de composición HSPC/DOPS se prepararon siguiendo la misma metodología que en el ejemplo 1.1., pero utilizando DOPS en lugar de DOTAP.
Ejemplo 1.3.: Hidrogel que comprende como lípido únicamente el fosfolípido HSPC al 5% en peso.
Este hidrogel se preparó como en los casos anteriores, pero utilizando únicamente HSPC como lípido y ajustando el pH a 2,5 en un caso y a 11,5 en otro (se prepararon dos geles de la misma composición a distintos pH).
Ejemplo 2.: Estudio de microscopia confocal de los geles
Esta técnica nos permite observar la microestructura del gel y cómo se organiza en el medio acuoso. Se puede detectar la formación de estructuras con distintas morfologías y tamaños, así como la interconexión entre dichas estructuras en la matriz del gel.
Se realizaron ensayos de microscopía confocal de fluorescencia con los hidrogeles siguientes preparados en el ejemplo 1: HSPC/DOTAP en proporción 80:1,20:1 y 3:1; y HSPC/DOPS en proporción 20:1.
2.1. Procedimiento del ensayo
Con el objetivo de marcar la parte lipídica de los geles se utilizó la sonda fluorescente 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(lissamine rhodamine B sulfonyl) (ammonium salt) de Avanti Polar Lipids Inc. (Alabaster, AL, USA). La concentración final de la sonda fue 0,005% en peso en todas las muestras para tener suficiente intensidad fluorescente sin interferir en la estructura del gel.
Se utilizó un microscopio confocal Zeiss LSM 880 equipado con un láser DPSS de 561 nm para excitación de la Rodamina B. Las imágenes se obtuvieron utilizando un objetivo 10X 0.4NA y un objetivo 63X 1.4NA de inmersión en glicerol. Las imágenes se procesaron usando el software ImageJ 1.52d (J. Schindelin, et al. Nat. Methods. 9 (2012) 676).
2.2. Resultados y conclusiones
La organización de los lípidos formando la microestructura del gel de HSPC/DOTAP y HSPC/DOTAP se pueden ver en la Figura 1 y Figura 2 respectivamente. Los lípidos aparecen en escala de gris, mientras que el agua aparece de color negro.
En la Figura 1, las imágenes de menor magnificación (arriba) permiten ver como los lípidos se organizan en agregados interconectados ocupando gran parte del espacio, como es esperable en un gel. Las imágenes de mayor magnificación (abajo) muestran como esos dominios de lípidos están formados por agregados de láminas lipídicas (indicadas con flechas) y partículas esféricas tipo vesículas que rondan los 5 - 20 nm de diámetro.
La figura 2 muestra con más detalle la estructura del gel de HSPC/DOTAP 3:1 que aparece en la figura 3D. Aquí se aprecian claramente esas láminas y vesículas interconectadas.
En la figura 3 se muestra una imagen del gel de HSPC/DOPS 20:1 donde se aprecian también esas láminas y vesículas interconectadas.
Ejemplo 3. Estudio reológico de los geles
La reología permite describir las propiedades macroscópicas del gel. En el estudio reológico que describimos más abajo, se determina la respuesta del material a un estrés oscilatorio, determinando las variables módulo elástico (G') y módulo viscoso (G"). En los materiales que tienen un comportamiento gel la elasticidad, medida con G', será mayor que la energía disipada o comportamiento viscoso, determinado por G’’ para un rango de frecuencias determinado.
Se realizaron ensayos con los hidrogeles siguientes preparados en el ejemplo 1: HSPC/DOTAP en proporción 80:1,20:1 y 3:1; y HSPC/DOPS en proporción 20:1
3.1. Procedimiento del ensayo
Se estudió el comportamiento reológico de los geles realizando ensayos oscilatorios con un reómetro de esfuerzo controlado AR-G2 (TA Instruments), equipado con un sistema de control de temperatura Peltier. Las mediciones fueron realizadas por la Unidad de Líquidos Nanoestructurados (U12) de CIBER-BBN, en el ICTS NANBIOSIS. Se utilizó geometría cono-placa de 40 mm de diámetro, ángulo de cono de 4 ° y un espacio de 105 ^m. Las muestras se evaluaron a 25 ° C y se evitó el secado de las muestras utilizando una trampa de disolvente. Antes de cada medición oscilatoria, los geles se cortaron previamente a 10 s-1 durante 10 s para obtener condiciones homogéneas. Luego, la muestra se sometió a una deformación por cizallamiento sinusoidal mientras se medía la respuesta al esfuerzo en cada punto. Los datos se analizaron utilizando el software TRIOS (TA Instruments, EE. UU.). El comportamiento viscoelástico de la muestra se describió mediante el módulo complejo G* = ?y donde t es el esfuerzo cortante y y es la deformación cortante. Con el ángulo de fase 5 entre la respuesta de oscilación aplicada y la resultante, el software determinó el módulo elástico G ’y el módulo viscoso G’’ del vector G * de la siguiente manera:
G’= G*cos 5
G’’= G*sin 5
El módulo elástico G'está relacionado con la energía almacenada, mientras que el módulo viscoso G’’ representa la energía disipada.
3.2. Resultados y conclusiones
En estos ensayos se mide el módulo elástico (G’) y el módulo viscoso (G’’) de la muestra aplicando una deformación fija en un intervalo de frecuencias. De este modo
se puede ver cómo se comporta el material en función del tiempo que dura la deformación aplicada.
3.2.1. Prueba del comportamiento gel
En las figuras 4 y 5 se puede ver que, en todos los geles, el modulo elástico (G’) es superior al viscoso (G’’) en todo el rango de frecuencias. Esto es indicativo que el material tiene un comportamiento macroscópico de tipo gel. Cómo es esperable en estos materiales, G’ y G’’ aumentan a frecuencias altas (deformaciones rápidas) ya que la estructura interna de la muestra tiene menos tiempo para adaptarse a la deformación aplicada y por lo tanto hay una mayor resistencia a esta.
En la Tabla 1 se muestran las diferencias en los valores de G’ y G’’ de la Figura 5 para los geles de HSPC/DOPS y HSPC/DOTAP en relación molar 20:1. Se ve como el gel de DOTAP es el más resistente a la deformación, ya que presenta unos valores de G’ y G’’ mayores. Así mismo, el gel de DOTAP tiene un ángulo de fase (ratio G’’/G’) menor a frecuencias bajas, indicando un mayor predominio del comportamiento elástico de la estructura en comparación con el gel de DOPS. De este modo se puede deducir que, en función de la composición lipídica utilizada, se pueden obtener geles con propiedades reológicas distintas, manteniendo una estructura formada por vesículas y láminas interconectadas. Este hecho permite una gran versatilidad de aplicación, ya que es posible preparar materiales de diferente comportamiento reológico en función del uso final. Además, se ha comprobado que, utilizando las composiciones lipídicas mencionadas, no es necesaria la presencia de otro tipo de moléculas para la obtención del gel.
Tabla 1. Valores de G’ y G’’ de distintos geles en función de la frecuencia
3.2.2. Estabilidad con el pH
El mismo comportamiento de gel se puede observar en la Figura 6 cuando los geles son preparados a pH ácido, neutro y básico (3, 6,5 y 10,5 respectivamente). Las diferentes combinaciones que han sido probadas se muestran en la tabla 2.
Tabla 2. Distintas composiciones de geles con su rango de estabilidad frente al pH
3.2.3. Estabilidad con el tiempo
Con relación a la estabilidad, se ha comprobado que estos geles son estables a lo largo del tiempo. La figura 7 muestra como el mismo comportamiento reológico de gel se mantiene al cabo de 3 meses en un gel de HSPC/DOTAP 20:1 guardado a 5 °C en un recipiente hermético.
Ejemplo 4. Estudios de dispersión de rayos X
La dispersión de rayos X es una técnica analítica que mide las intensidades de rayos X dispersados en una muestra en función del ángulo de dispersión. A partir de la ley de Bragg, se entiende que con la disminución del ángulo de dispersión, se analizan características estructurales cada vez más grandes.
Se observa una señal a ángulos pequeños en ingles SAXS (Small Angle X-ray Scattering) cuando el material contiene características estructurales en la escala de nanómetros, generalmente, en el rango de entre 1 y 100 nm. Por otra parte, la dispersión de rayos X de ángulo amplio, en ingles WAXS (Wide Angle X-ray Scattering), analiza las estructuras en el material en una escala de longitud mucho más pequeña como distancias interatómicas y menores.
En nuestros experimentos estas técnicas nos permiten detectar la nanoestructura de la bicapa lipídica de las láminas y vesículas que forman el gel (SAXS) así como el empaquetamiento lateral entre los lípidos (WAXS).
Se realizaron ensayos con los hidrogeles siguientes preparados en el ejemplo 1:
HSPC/DOTAP en proporción 80:1,20:1 y 3:1 y HSPC/DOPS en proporción 80:1,20:1 y 3:1.
4.1. Procedimiento del ensayo
Las medidas de dispersión de rayos X se realizaron con radiación de sincrotrón en la línea de luz BL11-NCD-SWEET del ALBA (Cerdanyola del Vallés, Barcelona, España). Las muestras se cargaron en un capilar de vidrio de 1,5 mm y se colocaron en una cámara Linkam, que se utiliza para controlar la temperatura a 25°C. Las muestras se alinearon con el haz de rayos X con una energía de 12,4 keV. Las medidas a ángulo pequeño (SAXS) se adquirieron utilizando un detector Pilatus 1M colocado a 2,71 m de la muestra y las de ángulo ancho (WAXS) se adquirieron utilizando un detector Rayonix LX255-HS colocado a 0,134 m. Los espectros se recogieron con un tiempo de adquisición de 5s.
4.2. Resultados y conclusiones
Con tal de estudiar la organización de la estructura lipídica a nivel molecular se utilizó una técnica de dispersión de rayos X mediante radiación de sincrotrón. En la Figura 8 y la Figura 9 se puede ver el patrón de dispersión a ángulos pequeños (SAXS) y grandes (WAXS) de los geles de HSPC/DOTAP y HSPC/DOPS respectivamente. Las relaciones molares utilizadas han sido 80:1, 20:1 y 3:1.
Se puede apreciar como el patrón de SAXS (Fig 8A y Fig 9A) tiene una banda principal centrada en q = 1 nm-1 seguida por dos armónicos muy pequeños situados sobre q= 2,4 y 3,6 nm-1. Este tipo de patrón es característico de sistemas formados por bicapas lipídicas con muy poca correlación. Así este patrón de dispersión es compatible con un
sistema formado mayoritariamente por vesículas unilamelares y láminas lipídicas donde la distancia entre bicapas es variable entorno a los 6 nm. Si por el contrario fuese un sistema multilamelar, donde la mayoría de lípidos están organizados en bicapas poco separadas con distancias regulares entre ellas, se obtendría un patrón de dispersión con bandas estrechas y equidistantes.
El patrón de WAXS permite estudiar el empaquetamiento lateral de las moléculas que forman las bicapas lipídicas. En las Figuras 8B y 9B se puede ver en el espectro una pequeña banda centrada en 15 nm-1 correspondiente a una separación lateral entre moléculas lipídicas de 4,2 nm, que correspondería con un empaquetamiento ortorrómbico o hexagonal. Es importante mencionar que la banda ancha de poca intensidad que aparece sobre 20-22 nm-1 se debe probablemente a la señal producida por el agua de la muestra y por lo tanto no debe ser considerada.
Ejemplo 5. Ensayos de estabilidad gástrica
La capacidad de los geles de ser estables a distintos pH, incluso ácidos y básicos extremos, permite un rango aplicativo muy amplio. Por ejemplo, se pueden emplear en aplicaciones gástricas donde el pH puede oscilar entre 1 y 4. El gel HSPC/DOTAP 20:1 se sometió a una incubación que simulaba la digestión gástrica. En este ensayo se preparó una solución salina a pH 2 con HCl y NaCl y a continuación se añadió el gel, que se dejó agitando en vaivén a 37 °C durante 2 horas. Se observó (Figura 13) cómo una parte del gel se rompió en fragmentos más pequeños a causa de la agitación, pero sin disolverse y manteniendo la apariencia de gel. Esto permitiría el uso de gel como agente de administración controlada de fármacos o como potencial protector gástrico.
Claims (18)
1. - Hidrogel lipídico nanoestructurado formado por red tridimensional de láminas y vesículas interconectadas, caracterizado porque comprende:
- entre un 3% y un 30% en peso de lípidos, donde los lípidos comprenden al menos un fosfolípido zwitteriónico,
- entre un 70% y un 97% en peso de agua
y donde el hidrogel no comprende polímeros, tensoactivos, ácidos grasos, ni alcoholes grasos.
2. - Hidrogel lipídico según la reivindicación 1, donde el fosfolípido zwitteriónico es seleccionado de la lista que comprende: fosfatidilcolinas, y fosfatidiletanolaminas.
3. - Hidrogel lipídico según la reivindicación 2, donde el fosfolípido zwitteriónico es fosfatidilcolina de soja hidrogenada.
4. - Hidrogel lipídico según cualquiera de las reivindicaciones anteriores 1 a 3, donde los lípidos comprenden, además del fosfolípido zwitteriónico, un lípido aniónico o catiónico.
5. - Hidrogel lipídico según la reivindicación 4, donde la proporción molar entre el fosfolípido zwitteriónico y el lípido aniónico o catiónico está entre 100:1 y 3: 1
6. - Hidrogel lipídico según la reivindicación 5, donde la proporción molar entre el fosfolípido zwitteriónico y el lípido aniónico o catiónico es 20:1.
7. - Hidrogel lipídico, según cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6, donde el lípido catiónico es 2-dioleoil-3-trimetilamonio propano.
8. - Hidrogel lipídico, según cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6, donde el lípido aniónico es 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfoserina.
9. - Hidrogel lipídico, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, que comprende además un principio activo.
10. - Hidrogel lipídico, según la reivindicación 9, donde el principio activo es un esfingolípido, colesterol, un antioxidante, un antibiótico, un antiinflamatorio, una proteína o combinaciones de los mismos.
11. - Hidrogel lipídico, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, caracterizado donde la proporción en peso lípidos:agua es 5:95.
12. - Procedimiento de preparación de un hidrogel lipídico nanoestructurado según se define en las reivindicaciones 1 a 11, que comprende las etapas de:
- dispersión de los lípidos en agua sin intervención de polímeros, tensoactivos, alcoholes grasos ni ácidos grasos,
- formación del hidrogel a partir de la dispersión lipídica obtenida en la etapa anterior caracterizado porque el procedimiento se lleva a cabo sin intervención de polímeros, tensoactivos, alcoholes grasos ni ácidos grasos, comprendiendo la formación del hidrogel las siguientes subetapas:
- ajuste del pH de la dispersión lipídica entre 2 y 13,
- congelación de la dispersión con pH ajustado a una temperatura igual o inferior a -20°C durante un periodo de tiempo de igual o superior a 1 minuto.
- descongelación y calentamiento de la dispersión a una temperatura comprendida entre 5°C y 90°C,
- enfriamiento a temperatura ambiente de la dispersión gelificada procedente de la etapa anterior.
13. - Procedimiento de preparación de un hidrogel lipídico según la reivindicación 12, donde la dispersión de los lípidos en agua se realiza mezclando los lípidos correspondientes en un disolvente orgánico y evaporación del mismo en rotavapor seguido de desecación y posterior hidratación mediante adición del agua en el rango de concentraciones especificadas en condiciones de agitación y a temperatura ambiente.
14. - Procedimiento de preparación de un hidrogel lipídico según las reivindicaciones 12 o 13, donde el disolvente orgánico es cloroformo.
15.- Procedimiento de preparación de un hidrogel lipídico según cualquiera de las reivindicaciones 12 a 14 donde el ajuste del pH de la dispersión lipídica se realiza con una solución de hidróxido sódico o ácido clorhídrico.
16.- Uso de un hidrogel lipídico nanoestructurado según se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 para la liberación de principios activos o como protector de piel y mucosas.
17. - Uso, según reivindicación 16, como protector gástrico.
18. - Uso, según reivindicación 16 o 17, mediante aplicación cutánea, mucosa, ocular o mediante administración oral.
Priority Applications (6)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| ES202031135A ES2910201B2 (es) | 2020-11-11 | 2020-11-11 | Hidrogel lipidico, procedimiento de preparacion y uso del mismo |
| EP21891289.7A EP4245297A4 (en) | 2020-11-11 | 2021-11-11 | LIPID HYDROGEL, PRODUCTION METHOD AND USE THEREOF |
| CN202180088128.6A CN116669706A (zh) | 2020-11-11 | 2021-11-11 | 脂质水凝胶，及其制备方法和用途 |
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