ES2913121B2 - Metodo para determinar la evolucion del dano cerebral agudo y composicion farmaceutica para su tratamiento - Google Patents

Description

DESCRIPCIÓN

MÉTODO DE PARA DETERMINAR LA EVOLUCIÓN DEL DAÑO CEREBRAL AGUDO

Y COMPOSICIÓN FARMACÉUTICA PARA SU TRATAMIENTO

Objeto de la invención

El objeto de la presente invención comprende el uso de combinaciones de biomarcadores SAA1 y S100P para determinar la evolución a largo plazo del daño cerebral agudo, así como el uso de un dispositivo para medir el producto de expresión de dichos biomarcadores.

Antecedentes de la invención

El daño cerebral agudo es originado por causas muy diferentes siendo las más frecuentes el traumatismo que afecta al sistema nervioso, la lesión isquémica o la hemorrágica. El traumatismo craneoencefálico (TCE) es un tipo de daño cerebral agudo y supone una de las principales causas de mortalidad y discapacidad en los menores de 40 años en los países de nuestro entorno. Supone un elevado coste económico, social y familiar por las discapacidades, graves y múltiples, que se concentran en los pacientes supervivientes.

De forma global la incidencia de los traumatismos craneoencefálicos no ha parado de crecer. En Europa se calcula que aproximadamente un millón de pacientes al año van a ser ingresados por esta causa, y de estos aproximadamente 75000 fallecen. Aunque la mayor discapacidad se ha relacionado con los derivados de accidentes de tráfico en gente joven, las causas de TCE son muy variadas y su epidemiología ha cambiado con los cambios producidos en las sociedades avanzadas. Por ello, hay una necesidad urgente de herramientas de detección mejoradas, tanto la detección temprana de la gravedad del TCE como para el conocimiento temprano del pronóstico de los pacientes.

El traumatismo craneoencefálico es una entidad nosológica compleja, de difícil clasificación dados los diferentes mecanismos lesionales, variedad en la gravedad, diferente respuesta del individuo a la lesión dado la gran variedad de edades en las que se presenta y el diferente patrón lesional producido por la interacción mecanismointensidad-edad del sujeto que recibe la lesión. En las últimas décadas, se ha producido un gran avance en la fisiopatología y en los mecanismos moleculares del daño cerebral. Sin embargo, estos avances no se han reflejado en una mejoría en la evolución final del TCE apreciada en los muchos ensayos clínicos realizados hasta la fecha [1 y 2]. Una de las posibilidades por la que esto sucede puede ser por la inexactitud en la clasificación del TCE debido a la heterogeneidad que presenta esta enfermedad [1]. Por otro lado, todavía no se conocen con exactitud todas las vías y los mecanismos por los que se produce el daño tras un traumatismo, tanto desde el punto de vista de la lesión aguda, como los mecanismos que condicionarían una lesión diferida o continuada en el tiempo y si esos mecanismos son similares en los diferentes tipos lesionales a los que nos enfrentamos en los pacientes que han sufrido un TCE.

La lesión inicial producirá pues, una primera oleada de muerte celular y disfunción axonal, determinada por el impacto, deformación, alteración de membrana celular, daños celulares metabólicos irreversibles y/o excitotoxicidad. La afectación cerebral por la lesión cerebral primaria se desarrolla de una forma extraordinariamente rápida y es poco probable que se consigan tratamientos farmacológicos efectivos para esta primera fase. La aplicación temprana de tratamientos basados en la neuroprotección podría tener una aplicación en la mejora de los resultados en estos pacientes, sin embargo, hasta ahora no existe ningún tratamiento farmacológi

cerebral agudo.

Los traumatismos sistémicos asocian además una situación de disfunción sistémica y la inducción de un estado de respuesta inflamatoria sistémica que podría incrementar el daño inflamatorio local cerebral asociado al traumatismo craneal. Estas alteraciones van a ser determinantes principales potencialmente modificables de discapacidad y mala evolución funcional. A pesar de la frecuencia de la lesión secundaria y de su importancia en el pronóstico final de los pacientes, esta es con frecuencia infradiagnosticada. Existen diferentes medios para diagnosticar la gravedad de la lesión inicial y la evolución de los pacientes afectados de daño cerebral agudo, como las pruebas de imagen que suelen ser muy inexactas y la medición de biomarcadores.

Tras la lesión cerebral, los biomarcadores pueden ser detectados en el líquido cefalorraquídeo o en el torrente sanguíneo. Generalmente, la extracción de sangre periférica es el método más comúnmente utilizado, ya que es una práctica no invasiva y rentable. En las células sanguíneas o en el suero se pueden determinar los cambios en los perfiles de expresión de determinadas proteínas o genes. En el contexto del traumatismo craneoencefálico, los biomarcadores podrían ser útiles para diagnosticar la gravedad de la lesión, monitorizar la respuesta a un tratamiento o pronosticar el alcance de la lesión. La identificación de marcadores de este tipo de lesión puede establecer estrategias para minimizar el daño que se ha producido, evitar su efecto deletéreo, así como establecer implicaciones pronósticas y de manejo posterior del paciente.

En los últimos años, varios biomarcadores séricos han sido evaluados como marcadores de diagnóstico y pronóstico de traumatismo craneoencefálico (TCE). Entre estos, los más estudiados son las proteínas S-1 ÜÜp, GFAP, NSE y UCH-L1 [3, 4, 5, 6]. Sin embargo, la presente invención se refiere a una combinación de biomarcadores para determinar a largo plazo la evolución de la lesión o daño cerebral agudo.

Además, en la actualidad no existe ningún tratamiento farmacológico aprobado para el tratamiento de pacientes con dichas lesiones. La presente invención también se refiere a una composición farmacéutica para tratar las secuelas producidas por una lesión cerebral aguda y mejorar la evolución a largo plazo del individuo. Experimentos realizados en modelos animales con daño cerebral agudo han demostrado que este compuesto mejora las habilidades neuroconductuales de dichos animales.

Por todo ello, el objeto de esta invención es un método para determinar la evolución del daño cerebral agudo a largo plazo en individuos que han sufrido lesiones cerebrales agudas, así como el uso de un dispositivo para detectar el nivel de los biomarcadores y una composición farmacéutica para el tratamiento del daño cerebral agudo.

Descripción de la invención

Los siguientes términos de la invención se definen a continuación de forma detallada:

“Lesión o daño cerebral” se refiere a cualquier afectación del sistema nervioso central que produzca destrucción celular o tisular.

“Lesión cerebral aguda” o “daño cerebral agudo”: daño en el Sistema Nervioso Central (SNC) que comienza de manera brusca, cursa con manifestaciones clínicas intensas y evoluciona de forma relativamente rápida y breve. La lesión cerebral aguda se selecciona entre: un traumatismo craneoencefálico, un ictus isquémico, una hemorragia intracerebral espontánea, una hemorragia subaracnoidea espontánea, un estatus epiléptico y una infección del sistema nervioso central.

“Traumatismo craneoencefálico (TCE)” o “trauma craneal” se refiere a cualquier lesión o daño cerebral agudo causado sobre los componentes craneales, encefálicos o meníngeos por un impacto traumático, originando déficit neurológico de diferente gravedad según localización y extensión.

“Largo plazo” se refiere a la presencia de secuelas de al menos 6 meses tras el momento en el que ocurrió la causa del daño cerebral agudo.

“Progresión” o “evolución” de la lesión son sinónimos y se usan indistintamente.

“Lesión intracraneal” se refiere a la lesión producida en el encéfalo o sus cubiertas.

“Gravedad” o “intensidad” o “extensión” de la lesión son términos que se usan indistintamente.

“Ensayo” se refiere a cualquier método generalmente conocido en la técnica para detectar una lesión cerebral aguda, como un ELISA o cualquier otro método estándar para la detección de biomarcadores.

El término "inmunoensayo", tal y como se utiliza en la presente descripción, se refiere a cualquier técnica analítica que se basa en la reacción de la conjugación de un anticuerpo con un antígeno.

El término “anticuerpo” se refiere a una inmunoglobulina que reconoce específicamente un epítopo en un objetivo determinado por las características de unión de los dominios variables de inmunoglobulina de las cadenas pesada y ligera (VHS y VLS), más específicamente las regiones que determinan la complementariedad (CDRs). Se conocen en la técnica muchas formas de anticuerpos potenciales, que pueden incluir, pero no limitado a, una pluralidad de anticuerpos monoclonales intactos o mezclas policlonales que comprenden anticuerpos monoclonales intactos, fragmentos de anticuerpo (por ejemplo Fab, Fab’, y fragmentos Fv, anticuerpos lineales anticuerpos monocatenarios y anticuerpos multiespecíficos que comprenden fragmentos de anticuerpos), fragmentos variables monocatenarios (scFvs), anticuerpos multiespecíficos, anticuerpos quiméricos, anticuerpos humanizados y proteínas de fusión que comprenden los dominios necesarios para el reconocimiento de un epítopo dado en un objetivo.

“Muestra” o “muestra biológica” se refiere a cualquier fluido, tejido o células de un organismo preferiblemente de sangre, suero, plasma, LCR, saliva, fluido lacrimal, orina o tejido, obtenidos mediante cualquier método conocido por un experto en la materia, útil para realizar un ensayo o método de detección para identificar lesiones cerebrales agudas. Preferiblemente, la muestra es una muestra de plasma sanguíneo, lágrimas, saliva, líquido cefalorraquídeo LCR o de orina tomada de un individuo. La muestra se trata de acuerdo con procedimientos generalmente conocidos para mantener o hacer que sean factibles para el análisis de biomarcadores.

El término “biomarcador” en el contexto de la presente invención, se refiere a una molécula presente en una muestra biológica de un paciente, cuyos niveles pueden ser indicativos de daño cerebral agudo. Tales moléculas pueden incluir proteínas o ácidos nucleicos y derivados de los mismos.

La expresión “producto de expresión” se refiere a un biomarcador y puede ser tanto un ácido nucleico como una proteína.

El término “SAA1” como se utiliza aquí se refiere a la proteína amiloide sérico A1 (número UniProt P0DJI8), o al gen que codifica dicha proteína (número de acceso GenBank: 6288).

El término “S100P” como se utiliza aquí se refiere a la proteína B de unión a calcio S100 (número UniProt P04271), o al gen que codifica dicha proteína (número de acceso GenBank: 6285).

Los términos “oligonucleótido” y "ácido nucleico" se usan aquí de manera intercambiable, refiriéndose a formas poliméricas de nucleótidos de cualquier longitud, tanto ribonucleótidos (ARN) como desoxirribonucleótidos (ADN).

El término “sonda” se refiere a una molécula que es capaz de unirse específicamente a una molécula diana de manera que la molécula diana se pueda detectar como una consecuencia de dicha unión específica. Las sondas que se pueden utilizar en la presente invención incluyen, por ejemplo, anticuerpos, aptámeros, fagos y oligonucleótidos.

El “nivel” de un biomarcador se refiere a la cantidad, nivel de expresión o concentración del biomarcador dentro la muestra. Este nivel puede ser un nivel relativo en comparación con otro biomarcador o con una muestra previa.

El término "proteína" se refieren a una forma polimérica de aminoácidos de cualquier longitud, que pueden ser codificantes o no codificantes, química o bioquímicamente modificados.

El término "cantidad", tal y como se utiliza en la descripción, se refiere, pero no se limita, a la cantidad absoluta o relativa de las proteínas, así como a cualquier otro valor o parámetro relacionado con los mismos o que pueda derivarse de éstos. Dichos valores o parámetros comprenden valores de intensidad de la señal obtenidos a partir de cualquiera de las propiedades físicas o químicas de dichas proteínas mediante medida directa o indirecta.

El término "comparación", tal y como se utiliza en la descripción, se refiere, pero no se limita, a la comparación de la cantidad de los productos de expresión de las proteínas o de la muestra biológica a analizar, también llamada muestra biológica problema, con una cantidad de las proteínas de una o varias muestras de referencia deseable. La muestra de referencia puede ser analizada, por ejemplo, simultánea o consecutivamente, junto con la muestra biológica problema.

El valor de referencia puede ser un intervalo de valores considerados por el experto en la materia como un nivel normal para el biomarcador en un individuo sano. El experto en la materia apreciará que los valores de control para un biomarcador se pueden calcular por el usuario analizando el nivel del biomarcador en una muestra de un individuo sano o por referencia a valores típicos proporcionados por el fabricante del ensayo utilizado para determinar el nivel del biomarcador en la muestra.

El término "individuo", tal y como se utiliza en la descripción, se refiere a animales, preferiblemente mamíferos, y más preferiblemente, humanos. El término "individuo" no pretende ser limitativo en ningún aspecto, pudiendo ser éste de cualquier edad, sexo y condición física.

El término "compuesto marcador", tal y como se utiliza en la presente descripción, se refiere a un compuesto capaz de dar lugar a una señal cromogénica, fluorogénica, radiactiva o quimioluminiscente que permita la detección y cuantificación de la cantidad de anticuerpos frente a SAA1 y S100p.

La palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y características de la invención se desprenderán en parte de la descripción y en parte de la práctica de la invención.

Los términos “pronóstico” y “evolución” así como sus variaciones gramaticales son sinónimos en la presente memoria y se pueden usar de forma intercambiable.

Cualquier otro término empleado en la presente memoria tendrá el significado habitual del sector de la técnica al que se refiere la presente invención.

La presente invención se refiere a un método para determinar la evolución del daño cerebral agudo a largo plazo en individuos, que comprende:

a. determinar el producto de expresión de los biomarcadores SAA1 y S100P en una muestra biológica tomada de un individuo y,

b. establecer la significación estadística de la concentración del producto de expresión de los biomarcadores de la etapa a,

donde el producto de expresión de SAA1 se obtiene de una muestra biológica tomada entre las 24h y 1 semana tras la lesión que produce el daño cerebral agudo.

Otra realización adicional del método de la invención comprende, en la etapa a) determinar el producto de expresión de los biomarcadores SAA1 y S100P en una muestra biológica del individuo.

El producto de expresión de un biomarcador puede ser un ácido nucleico y/o una proteína. Se puede cuantificar el ácido nucleico, la proteína y combinaciones de ambas.

La etapa b) del método de la invención, puede ser total o parcialmente automatizada sin depender del juicio de un especialista, como un médico o un técnico de laboratorio.

La significación estadística que implique la determinación de la evolución del daño cerebral agudo a largo plazo se obtiene en base al resultado de la concentración del producto de expresión de cada biomarcador. Para obtener una determinación altamente precisa, se prefiere que la determinación se lleve a cabo después de comparar el valor detectado obtenido con el valor detectado usando una concentración de referencia. La concentración de referencia puede ser obtenida a partir de una muestra biológica de referencia, obtenida de un individuo sano, o de un individuo que no sufra una lesión cerebral aguda.

Las concentraciones de referencia pueden ser determinadas por el método de la presente invención a partir de una muestra biológica de referencia que puede ser analizada, por ejemplo, simultánea o consecutivamente, junto con la muestra biológica del individuo problema.

El método de la invención puede comprender además llevar a cabo una metodología estadística con cada uno de los valores del producto de expresión de cada biomarcador de la etapa a) del método y producir un valor de salida con significación estadística que indica si la evolución del daño cerebral del individuo es favorable o desfavorable a largo plazo.

La significación estadística se obtiene mediante la comparación del nivel del producto de expresión de la muestra biológica del individuo con la muestra biológica de referencia empleando una metodología estadística.

La metodología estadística puede ser una metodología estadística seleccionada entre una prueba de D’Agostino-Pearson y un algoritmo clasificador del grupo seleccionado entre un clasificador de árbol de decisión, clasificador de regresión logística, clasificador de vecino más cercano, clasificador de red neurona!, modelo de mezcla gaussiano (GMM), Máquina de Vector de Soporte (SVM) clasificador, clasificador de centroide más cercano, clasificador de regresión lineal, clasificador lineal de análisis discriminante (LOA), clasificador de análisis discriminante cuadrático (QDA) y clasificador de bosque aleatorio.

El rendimiento de los resultados de los métodos estadísticos aplicados utilizados de acuerdo con la presente invención se puede describir mejor por sus características de funcionamiento del receptor (ROC). La curva ROC aborda tanto la sensibilidad (el número de verdaderos positivos) como la especificidad (número de verdaderos negativos) del ensayo. Por lo tanto, los valores de sensibilidad y especificidad para los biomarcadores de la invención son una indicación del rendimiento del ensayo. Por ejemplo, si una combinación de biomarcadores tiene un valor de sensibilidad y especificidad del 80%, de cada 100 individuos, 80 se identificarán correctamente a partir de la determinación de la presencia de la combinación particular de biomarcadores como positivos para la enfermedad y un determinado pronóstico, mientras que de cada 100 individuos que no tienen la enfermedad, 80 darán un ensayo con precisión negativa para la enfermedad y un determinado pronóstico.

Se prefiere que la sensibilidad del método sea superior al 80%, preferiblemente el 100%, y que la especificidad sea de más del 80%, preferiblemente del 100%.

Un modelo de clasificación estadística adecuado, como la regresión logística, se puede derivar para una combinación de biomarcadores. Además, la ecuación de regresión logística se puede extender para incluir otras variables (clínicas) tales como la edad y el sexo del individuo también. Tal como se ha descrito en el párrafo anterior, la curva ROC se puede utilizar para acceder al rendimiento de la discriminación entre individuos y controles mediante el modelo de regresión logística. Por lo tanto, la ecuación de regresión logística se puede utilizar separada o combinada con otras características clínicas para ayudar en la toma de decisiones clínicas. Aunque una ecuación de regresión logística es un procedimiento estadístico común utilizado en dichos casos y se prefiere en el contexto de la presente invención, también pueden utilizarse otros procedimientos matemáticos/estadísticos, arboles de decisión o aprendizaje automático.

Un objetivo conveniente para cuantificar la precisión de diagnóstico de un ensayo de laboratorio es expresar su rendimiento en un solo número. La medida global más común es el área bajo la curva (AUC) del gráfico ROC. El área bajo la curva ROC es una medida de la probabilidad de que la medición percibida permitirá la identificación correcta de una afección. Los valores oscilan típicamente entre 1,0 (separación perfecta de los valores de ensayo de los dos grupos) y 0,5 (sin diferencia de distribución aparente entre los dos grupos de valores de ensayo), cualquier resultado por debajo de 0,5 se considera peor que una estimación aleatoria. El área no depende solo de una parte particular del gráfico, tal como el punto más próximo a la diagonal o la sensibilidad con un 90% de especificidad, sino del gráfico entero. Esta es una expresión cuantitativa y descriptiva de cuan cerca está el gráfico ROC del perfecto (área = 1,0). En el contexto de la presente invención, las dos condiciones diferentes pueden ser si el daño cerebral agudo de un paciente evoluciona de forma favorable o no.

El método de la invención puede comprender poner la muestra biológica del paciente en contacto con un dispositivo que comprende un sustrato que tiene una superficie activada en la que se inmoviliza, en áreas discretas de dicha superficie activada, uno o más anticuerpos específicos para SAA1 y S100P de tal forma que se utiliza un dispositivo para cada anticuerpo, o un dispositivo para más de uno.

En otra realización preferente el método de la invención comprende extraer los ácidos nucleicos de la muestra del paciente y realizar un análisis de los mismos con oligonucleótidos específicos para detectar uno o más de los biomarcadores SAA1, TLR4 y/o S100p.

En una realización adicional el método de la invención comprende clasificar un individuo con el valor de al menos un marcador seleccionado entre: edad, temperatura, una determinada GCS (escala de coma de Glasgow), GOS (Glasgowoutcome scale), GOSE (Glasgow outcome scale extended), NIHSS (National institute of Health Stroke Scale), A2DS2 (Age, Atrial fibrillation, Dysphagia, Sex, Stroke Severity) Rankin y Rankin modificado, índice de Barthel, Fisher score o escala WFNS (World Federation of Neurosurgical Societies).

La muestra biológica para llevar a cabo el método de la invención se selecciona entre sangre, suero, plasma, líquido cefalorraquídeo, saliva, fluido lacrimal, tejidos, células, orina y combinaciones de estos.

En una realización particular la muestra biológica se selecciona entre sangre, plasma suero y combinaciones de estos.

El daño cerebral agudo puede estar causado por un traumatismo craneoencefálico (abierto o cerrado) y la patología vascular cerebral, de tipo isquémico o hemorrágico, preferentemente traumatismo craneoencefálico abierto o cerrado.

En una realización particular el daño cerebral agudo está causado por un traumatismo craneoencefálico abierto o cerrado.

La determinación de la evolución del daño cerebral a largo plazo significa determinar la probabilidad de que disminuyan o desaparezcan las secuelas clínicas del daño cerebral agudo, siendo posibles mecanismos de daño cerebral agudo:

1- El daño causado por procesos intracraneales tales como el desarrollo de hematomas intracraneales espontáneos o postraumáticos (hematoma epidural, hematoma subdural, contusión cerebral y hematoma intracerebral espontáneo o postraumático), la hemorragia subaracnoidea (espontanea o postraumática), la lesión axonal difusa, la hemorragia intraventricular, el edema cerebral, la hipertensión intracraneal, la herniación cerebral, la hipoxia-isquemia cerebral, el status epiléptico y la infección aguda del sistema nervioso central.

2- El daño que se produce en el sistema nervioso central derivado de procesos extracraneales tales como hipotensión arterial sistémica, anemia, hipovolemia, hipoxemia, anoxia, parada cardiorrespiratoria, hiponatremia, hipernatremia, hipertermia, hiperglucemia e hipoglucemia.

Empleando el método de la invención podemos determinar la probabilidad de que un individuo tenga una evolución favorable. Esto significa que al final del seguimiento, obtenga una puntuación en los scores habitualmente utilizados en la práctica clínica (incluidos, pero no solo: Escala de Ramkin modificada, Glasgow Outcome Scale y Glasgow Outcome Scale Extended) tal que cualquier experto en la materia reconozca dicho resultado como “buen pronóstico”.

La determinación del producto de expresión de los biomarcadores para determinar la evolución del daño cerebral agudo a largo plazo se puede realizar en cualquier momento desde que ocurra la causa del daño cerebral agudo hasta 6 meses después del momento de la lesión, preferentemente 1 hora después de dicha causa, más preferentemente, 12h después, aún más preferentemente 24h y aún más preferentemente 72h después de la causa del daño cerebral agudo.

Independientemente de la causa del daño cerebral agudo, los procesos fisiológicos que dan lugar a las secuelas postraumáticas y el daño cerebral a largo plazo son comunes a todas ellas. La presente invención sirve para el pronóstico de las secuelas postraumáticas a largo plazo de pacientes que han sufrido cualquier tipo de daño cerebral agudo.

El individuo puede ser un humano de entre 1 y 90 años, ambos incluidos, preferentemente, 5 y 80 años, más preferentemente 10 y 70 años, aún más preferentemente 20 y 60 años, estando ambos límites incluidos en todos los casos.

Adicionalmente, el método de la invención puede usarse para determinar la eficacia de un tratamiento con composiciones farmacéuticas en la evolución a largo plazo del daño cerebral agudo. Este uso requeriría determinar la concentración del producto de expresión de los biomarcadores de la invención en una muestra biológica de un individuo tratado con una composición farmacéutica, y comparar los niveles de biomarcadores con aquellos de un control sano o con niveles del mismo paciente antes del tratamiento con el fármaco, en donde, una disminución del nivel indica la efectividad del tratamiento farmacológico. La comparación se puede realizar mediante cualquiera de los métodos estadísticos mencionados anteriormente.

El resultado obtenido en el método estadístico se puede complementar mediante la combinación del resultado obtenido en el método del párrafo anterior con un marcador de los siguientes: edad, temperatura, una determinada GCS, GOS, GOSE, NIHSS, A2DS2, Rankin y Rankin modificado, índice de Barthel, Fisher score o WFNS.

Otro aspecto de la presente invención se refiere al uso de un dispositivo que comprende los elementos necesarios para detectar y cuantificar la cantidad de producto de expresión de uno o más de los biomarcadores seleccionados entre: SAA1, S100P y TLR4 para determinar la evolución del daño cerebral agudo a largo plazo en individuos a partir de una muestra biológica in vitro tomada de un paciente, en donde la muestra se pone en contacto con el dispositivo sobre el que se han inmovilizado sondas específicas para cada uno de los biomarcadores.

El dispositivo puede comprender un sustrato que tiene una superficie activada sobre la que se inmovilizan las sondas para SAA1 y S100B en áreas discretas de dicha superficie activada. El uso del dispositivo también puede comprender la determinación de la eficacia de un tratamiento con composiciones farmacéuticas en la determinación de la evolución del daño cerebral agudo a largo plazo en individuos.

El sustrato puede ser cualquier superficie que pueda soportar una o más sondas, pero preferiblemente es un chip. Un chip es un sustrato plano que puede estar, por ejemplo, basado en un mineral o en un polímero, pero es preferiblemente de cerámica. Cuando se identifican los diversos biomarcadores/proteínas de la invención será evidente para un experto en la materia que además de identificar la proteína de longitud completa, es posible la identificación de un fragmento o varios fragmentos de una proteína, siempre que esto permita una identificación precisa de la proteína.

La detección de la cantidad de expresión de SAA1 y S100P puede realizarse por cualquier medio conocido en el estado de la técnica, preferentemente un inmunoensayo.

Dentro de inmunoensayo se incluye: ensayo de aglutinación de látex, fluoroinmunoensayo (método FIA), inmunoensayo enzimático (método EIA), método de radioinmunoensayo (método RIA), inmunoensayo lineal (LIA), inmunoensayo quimioluminiscente (CLIA), x-map o chips de proteína y método de transferencia Western. Los ejemplos de métodos de medición preferidos incluyen el método FIA y el método EIA (incluido el método ELISA). Estos métodos permiten una detección altamente sensible, rápida y simple. El método FIA usa un anticuerpo marcado con fluorescencia y detecta un complejo antígeno-anticuerpo (complejo inmune) usando fluorescencia como señal. Por otro lado, el método EIA utiliza un anticuerpo marcado con enzimas y detecta un complejo inmune utilizando el desarrollo del color o la luminiscencia basada en la reacción enzimática como señal.

El ELISA (Enzyme-Linked immunoSorbent Assay) se basa en la premisa de que un inmunorreactivo (antígeno o anticuerpo) puede ser inmovilizado en un soporte sólido, poniendo luego ese sistema en contacto con una fase fluida que contiene el reactivo complementario que puede unirse a un compuesto marcador. Existen diferentes tipos de ELISA: ELISA directo, ELISA indirecto o ELISA sándwich.

El método ELISA tiene muchas ventajas, como alta sensibilidad de detección, alta especificidad, rendimiento cuantitativo marcado, operación simple e idoneidad para el tratamiento simultáneo de muchas muestras. A continuación, se muestra un ejemplo del método de operación específico para usar el método ELISA. En primer lugar, el anticuerpo anti-SAA1 se inmoviliza sobre un soporte insoluble. Específicamente, por ejemplo, la superficie de una microplaca está inmunizada (recubierta) por un anticuerpo anti-SAA1. El anticuerpo así en fase sólida se pone en contacto con la muestra y la proteína SAA1. Como resultado de esta operación, el anticuerpo en fase sólida se une a la proteína SAA1 para formar un complejo inmune. Después de eliminar uniones no específicas mediante lavados, el color se desarrolla mediante la reacción de la enzima con un sustrato.

El dispositivo de la presente invención puede comprender al menos uno de los anticuerpos seleccionados entre anti-SAA1 y anti- S100P .

El dispositivo comprende anticuerpos secundarios, controles positivos y negativos. El dispositivo además puede incluir, sin ningún tipo de limitación, tampones, soluciones de extracción de proteínas, agentes para prevenir la contaminación, e inhibidores de la degradación de las proteínas.

El dispositivo puede ser un chip de ADN, para detectar daño cerebral agudo en individuos y su evolución a largo plazo, que comprende oligonucleótidos o microarreglos de canal único diseñados a partir de una secuencia conocida o un ARN mensajero (ARNm) de al menos uno de los genes SAA1 y S100p.

Preferiblemente, el dispositivo comprende las parejas de oligonucleótidos capaces de detectar el ARNm de cualquiera de los genes SAA1 y S100p.

Así, las sondas de oligonucleótidos pueden ser de entre 10 y 100 nucleótidos, más preferiblemente, de entre 20 y 70 nucleótidos, y aún más preferiblemente, de entre 24 y 50 nucleótidos. Para la cuantificación de la expresión génica, preferiblemente se emplean aproximadamente unos 40 oligonucleótidos por gen.

La sonda es cada una de las muestras del chip. La diana es la muestra a analizar: ARN mensajero, ARN total, o un fragmento de una amplificación por PCR (Reacción en cadena de la polimerasa).

Por otro lado, el dispositivo puede incluir todos los soportes y recipientes necesarios para su puesta en marcha y optimización además de las instrucciones para llevar a cabo el método de la invención.

Otro aspecto adicional de la invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende al menos un principio activo que es un agente modulador de los niveles de expresión de al menos uno de los biomarcadores seleccionados entre SAA1, S100P y TLR4, para su uso en el tratamiento del daño cerebral agudo logrando una evolución favorable del daño cerebral agudo.

En una realización particular, el daño cerebral agudo está causado por un traumatismo craneoencefálico abierto o cerrado.

En una realización particular, la composición comprende uno o más agentes moduladores de todos los biomarcadores SAA1, S100P y TLR4, simultáneamente.

En otra realización particular, la composición comprende uno o más agentes moduladores de los biomarcadores SAA1 y TLR4, simultáneamente.

En otra realización particular, la composición comprende uno o más agentes moduladores los biomarcadores SAA1 y S100P, simultáneamente.

En otra realización particular, la composición comprende uno o más agentes moduladores de los biomarcadores TLR4 y S100P, simultáneamente.

En otra realización particular el agente modulador es el etil-(6R)-6-(N-(2-cloro-4-fluorofenil)sulfamoil)ciclohex-1-eno-1-carboxilato para su uso en el tratamiento del daño cerebral agudo, disminuyendo la gravedad y/o número de secuelas a largo plazo.

La composición farmacéutica de la invención puede comprender adicionalmente, al menos uno o más de los siguientes:

- un excipiente farmacéuticamente aceptable,

- un aditivo farmacéuticamente aceptable, y

- un segundo principio activo.

La composición farmacéutica de la invención se puede emplear como tratamiento subsiguiente o simultáneo con otras terapias.

La composición farmacéutica de la invención se puede administrar a un individuo por vía tópica, intranasal, rectal, intraperitoneal, oral, subcutánea o intramuscular.

La composición farmacéutica puede tener cualquier formulación seleccionada del grupo que consiste en un comprimido, una pastilla, un polvo, un granulado, una cápsula, una suspensión, una solución, una emulsión, un jarabe, una solución acuosa esterilizada, una solución no acuosa, una suspensión, una emulsión, un secante por congelación, un supositorio y una inyección.

Estos agentes se pueden fabrican por un procedimiento conocido, por ejemplo, un procedimiento general de mezclado, granulación, fabricación de azúcar, disolución o liofilización. Por ejemplo, la composición farmacéutica para su administración oral se puede preparar mezclando un ingrediente activo con un vehículo sólido, granulando la mezcla, añadiendo un aditivo apropiado si fuera necesario, y, a continuación, formulando la mezcla o el granulado en forma de un comprimido o una gragea.

El excipiente farmacéuticamente aceptable puede incluir, en particular, un relleno, por ejemplo, azúcar, tal como lactosa, sacarosa, manitol o sorbitol, un agente de celulosa y/o fosfato de calcio, tal como fosfato tricálcico o hidrogenofosfato de calcio, y un agente de acoplamiento, por ejemplo, pastas de almidón que usan almidones de maíz, trigo, arroz o patata, gelatina, tragacanto, metilcelulosa y/o polivinilpirrolidona, y si fuera necesario, un agente disgregante, por ejemplo, los almidones mencionados anteriormente, carboximetilalmidón, polivinilpirrolidona reticulada, agar o ácido algínico o una sal del mismo, por ejemplo, alginato de sodio.

Los aditivos farmacéuticamente aceptables incluyen, en particular, un agente de control de flujo y un lubricante, por ejemplo, ácido silícico, talco, ácido esteárico o su sal, por ejemplo, estearato de magnesio, o calcio y/o polietilenglicol. Se proporciona un recubrimiento gastrorresistente apropiado a un núcleo de gragea, y, en particular, una solución de azúcar concentrada que incluye goma arábiga, talco, polivinilpirrolidona, polietilenglicol y/o dióxido de titanio en un disolvente orgánico apropiado o una mezcla de disolventes, o se usa una solución agitada, o, para formar el recubrimiento gastrorresistente, se puede usar una solución con agente de celulosa apropiado, tal como ftalato de acetilcelulosa o ftalato de hidroxipropilmetilcelulosa.

Otros excipientes farmacéuticamente aceptables para administración por vía oral incluyen agentes encapsulantes y cápsulas rellenadas en seco fabricadas de gelatina, y cápsulas selladas blandas fabricadas de gelatina y un plastificante, tal como glicerol o sorbitol. La cápsula rellenada en seco puede incluir un ingrediente activo en forma particulada, por ejemplo, un relleno, tal como lactosa, un agente de acoplamiento, tal como almidones, y/o un modificador, como talco o estearato de magnesio, y una mezcla con un estabilizante si fuera apropiado. En la cápsula blanda, el principio activo se disuelve o suspende en un líquido apropiado, por ejemplo, aceite fijo, aceite de vaselina o polietilenglicol líquido, y se puede añadir un estabilizante en el mismo.

Una composición farmacéutica para su administración parenteral puede incluir una solución acuosa estéril, una solución no acuosa, una suspensión, una emulsión, un agente de liofilización. La composición para su administración parenteral puede ser una inyección eficaz por diversos procedimientos, por ejemplo, intravenoso, intrarterial, intramuscular, intraperitoneal, intranasal, intradérmico y subcutáneo, preferentemente el procedimiento intravenoso. El líquido necesario para la administración parenteral es preferentemente una solución acuosa isotónica o una suspensión que se puede preparar a partir de un agente de liofilización que incluya el ingrediente activo solo o en combinación con un vehículo farmacéuticamente aceptable antes de su uso. La composición farmacéutica se puede esterilizar y/o puede incluir aditivos, tales como conservantes, estabilizantes, agentes humectantes y/o emulsionantes, solubilizantes, sales para controlar la presión osmótica y/o tampones.

En particular, como la solución no acuosa y la suspensión, se pueden usar propilenglicol, polietilenglicol, grasas vegetales, tales como aceite de oliva, éster inyectable, tal como oleato de etilo y similares. Si la composición se administra como supositorio, los excipientes que pueden usarse son witepsol, macrogol, tween 61, manteca de cacao, laurina, gelatina de glicerol y similares.

En un aspecto de la presente invención, la composición farmacéutica se puede administrar con un intervalo de administración variable, a modo de ejemplo de 1 a 3 veces por semana, en particular, de 1 a 2 veces por semana.

En la dosis y el intervalo de administración de la composición farmacéutica pueden variar dependiendo de diversos factores, por ejemplo, condiciones individuales, tales como disponibilidad y duración del ingrediente activo, un procedimiento de administración, sexo, edad y peso de los individuos gravedad de las enfermedades y similares. La vía de administración específica y la dosis se pueden seleccionar por un experto en la materia según condiciones tales como la edad, el peso, el grado de actividad de la enfermedad y el estado físico.

El individuo es preferentemente un mamífero, más preferentemente un humano o un animal doméstico, a modo de ejemplo un perro o un gato, aunque se puede tratar otros sujetos alternativos, en el curso de la investigación sobre enfermedades. La dosis de la composición que se administrará a un sujeto depende de la especie y el tamaño del sujeto, la naturaleza de la afección que se está tratando y puede ser determinada fácilmente por un experto en la materia.

En un aspecto de la presente invención, se puede usar dicho agente modulador para la indicación reivindicada administrando a un individuo una dosis de 0,1 mg/kg/día a 1000 mg/kg/día, específicamente una dosis de 1 mg/kg/día a 500 mg/kg/día, preferentemente una dosis de 3 mg/kg/día a 100 mg/kg/día. más preferentemente 3 mg/kg/día, de agente modulador.

Una sola administración de la composición farmacéutica puede ser suficiente para lograr una disminución de la gravedad y / o número de secuelas, pero en realizaciones alternativas, se puede administrar más de una dosis de la composición farmacéutica. Por ejemplo, una primera dosis puede ser seguida por una dosis de refuerzo después de una semana, dos semanas, tres semanas, cuatro semanas, un mes, dos meses, tres meses, cuatro meses, cinco meses, seis meses o intervalos más largos.

La invención se ilustra mediante los siguientes ejemplos que describen de forma detallada los objetos de la invención. Estos ejemplos no deben ser considerados como limitativos del alcance de la invención sino como ilustrativos de la misma.

Figura 1: Niveles de producto de expresión de marcadores individuales SAA1, S100P y TLR4 de pacientes que han sufrido un TCE. Los gráficos de puntos son muestras individuales con niveles séricos promedio en función del pronóstico.

Figura 2: Curvas ROC con respecto a la discriminación entre pronóstico favorable o desfavorable a largo plazo (6 meses) para SAA1 (72h), S100P (24h) y TLR4 (72h) en el rendimiento de marcadores individuales, (izquierda, centro y derecha, respectivamente). El eje de abscisas está representado como 1- valor de especificidad.

Figura 3: Combinación de marcadores para la prognosis a largo plazo de pacientes que han sufrido daño cerebral agudo, TCE. Curva de características operativas del receptor (ROC) con respecto a la discriminación entre pronóstico favorable o desfavorable para un modelo predictivo basado en los biomarcadores SAA1 y S100P en combinación. AUC = 0,931 (95% CI: 0,827 - 1,000). El eje de abscisas está representado como 1 - valor de especificidad.

Figura 4: Expresión de ARNm de TLR4 en muestras de leucocitos extraídas de sangre en sujetos sanos (controles) y en pacientes a 24 h, 72 h y 7 días después del TCE.

Figura 5: Correlación existente entre la proteína SAA1 y el ARNm de TLR4 en los mismos pacientes a las 72 h tras el traumatismo craneoencefálico.

Figura 6: Expresión sérica de SAA1 en un modelo murino de traumatismo craneoencefálico. En el panel superior (A) se muestran los niveles séricos de SAA1 a partir de muestras de sangre a 1 y 7 días tras el traumatismo. En el panel inferior (B) se muestran los niveles de SAA1 en el cerebro a 1 y 7 días en los hemisferios ipsilateral y contralateral.

Figura 7: Expresión sérica y cerebral de SAA1 en un modelo murino de traumatismo craneoencefálico en presencia o ausencia de un bloqueante del receptor TLR4 en el suero y en el parénquima cerebral 24 horas después de la lesión, por ELISA (A y B) y Western Blot (C).

Figura 8: Efectos del bloqueo del receptor TLR4 con TAK₂42 en el pronóstico de los animales sometidos a TCE.

Los siguientes ejemplos están destinados a ilustrar aspectos destacables de la invención y no deben interpretarse como restrictivos para la invención o cualquier aspecto de la misma.

Ejemplo 1: Aná lis is de las proteínas SAA1, S100B y de la expresión de ARNm de TLR4 en muestras de pacientes que han su frido un traum atism o craneoencefálico (TCE):

MATERIALES Y MÉTODOS

Los pacientes con TCE pueden servir como patología ejemplar en donde la invención es aplicable.

Este estudio de cohorte prospectivo observacional se realizó en 34 pacientes ingresados de forma consecutiva en el Hospital la Paz dentro de las 24 horas posteriores al TCE. Se realizó en el Servicio de Neurocirugía del Hospital Universitario la Paz entre enero de 2017 y diciembre de 2018. Se incluyeron en el estudio los sujetos con edades comprendidas entre 15 y 85 años que mostraron evidencia clínica de traumatismo craneoencefálico cerrado, pérdida de consciencia, puntuación en la GCS postresucitación inferior a 15 y lesiones cerebrales confirmadas por la presencia de hallazgos anormales en la neuroimagen.

La lesión leve se definió como GCS de 13-15, la lesión moderada se definió con un GCS de 9 a 12 y la lesión grave con puntuación en la GCS de 3 a 8 (independientemente de los hallazgos de la Tomografía computerizada, TC).

Los criterios de exclusión fueron: presencia de enfermedad neurológica o deterioro cognitivo previo, incapacidad para realizar una tomografía computerizada craneal, recoger muestras biológicas o completar un seguimiento adecuado del paciente.

Definición de los parámetros clínicos al ingreso

Las variables clínicas y demográficas de los pacientes incluidos se recogieron prospectivamente al ingreso. Esto incluyó edad, sexo, raza, estado socioeconómico y educación, fecha, hora y causa de la lesión e historial médico.

Evaluación de la gravedad clínica intracraneal: El grado de disfunción neurológica del paciente se evaluó mediante la puntuación en la Escala de Coma de Glasgow (GCS). En cuanto a la puntuación GCS, se determinó la mejor puntuación total y en cada una de sus subescalas tras resucitación no quirúrgica en la mejor extremidad. Si se administró medicación sedorrelajante, se intentó realizar una ventana de sedación en las primeras 6 horas para determinar la mejor puntuación. A los componentes no evaluables, se les asignó una puntuación de 1. Se asignó una nueva puntuación tras la existencia de deterioro clínico dentro de las 6 horas tras el ingreso hospitalario. Los pacientes se clasificaron según el nivel de conciencia en leves (puntuación GCS 13-15), moderada (puntuación GCS 9-12) y grave (puntuación GCS 3-8). Para el análisis, se utilizó la peor evaluación al final del período de 6 horas. Se consideró deterioro neurológico si hubo una disminución de 2 puntos en la puntuación en la GCS o una tomografía computerizada (TC) de control peor que la del ingreso.

Insultos sistémicos secundarios: la hipotensión se definió como la presencia o ausencia de cualquier episodio de presión arterial sistólica <90 mmHg, incluida parada cardiorrespiratoria dentro de las primeras 6 horas después del evento traumático. La hipoxemia se estableció como una pO2 ≤ 60 mmHg, parada cardiorrespiratoria o saturación de oxígeno <90%.

Pronóstico: la evolución final o deterioro funcional se determinó mediante la escala de evolución de Glasgow extendida (GOSE) a los 6 meses después del trauma mediante un cuestionario sobre calidad de vida y/o visita de seguimiento en el servicio de neurocirugía. Con un propósito estadístico, el resultado obtenido en GOSE se dicotomizó según la puntuación obtenida en favorable (8/7/6) vs. desfavorable (5/4/3/2/1).

Mediciones de biomarcadores en suero

Se tomaron muestras de sangre venosa a las 24 h, 72 h y 7 días tras el ingreso. Se dejó coagular la sangre y tras centrifugación a 2500 r.p.m., 10 minutos, se separan el suero de las células sanguíneas. El suero se almacenó a -80°C hasta su posterior análisis. Para establecer nuestros propios intervalos de referencia, se incluyó un grupo control compuesto por 8 voluntarios sanos. Los niveles séricos de S100P se analizaron mediante un inmunoensayo quimioluminiscente (CLIA) (Liaison® S100, Diasorin, Saluggia, Italia). Se utilizó un kit ELISA para la determinación de las concentraciones de SAA1 (Human SAA Elisa kit second generation, EL10015L, Anogen, Mississauga, Canadá). En todos los casos se siguieron las instrucciones del fabricante.

El investigador desconocía los hallazgos clínicos y neuroradiológicos durante la medición de los niveles de biomarcadores.

Medición del ARNm de TLR4 en muestras de leucocitos

Se tomaron muestras de sangre venosa a las 24 h, 72 h y 7 días tras el ingreso. Para establecer nuestros propios intervalos de referencia, se incluyó un grupo control compuesto por 8 voluntarios sanos. El ARN total de las células sanguíneas obtenidas siguiendo el protocolo anteriormente descrito se extrajo utilizando un kit específico de extracción de ARN (QIAamp® RNA Blood Mini Kit, 52304, Qiagen, Alemania). Posteriormente, el ADN complementario (ADNc) se sintetizó con un kit de síntesis de ADNc (iScript cDNA synthesis kit, 52304, Biorad, USA) y la PCR a tiempo real realizó con el dispositivo QuantStudio 5 PCR system (Applied Biosystems, USA). La expresión del gen TLR4 se analizó usando sondas Taqman® (sonda FAM, Hs00152939_m1). La expresión del ARNm de TLR4 se normalizó frente a la expresión del ARNr 18S eucariota (sonda VIC, 4310893E) en las mismas muestras, y se calculó mediante el método NA Ct.

Análisis estadístico

La normalidad de la distribución de datos se evaluó mediante la prueba de D’Agostino-Pearson. Las variables categóricas se presentan como porcentajes y las variables continuas se muestran como media ± desviación estándar si se distribuyen normalmente o como mediana (rango intercuartílico) si no se distribuyen normalmente. La significación para las diferencias intergrupales se evaluó mediante la prueba U de Mann-Whitney para variables continuas. Se utilizaron análisis de regresión logística para confeccionar modelos explicativos sobre el papel de los biomarcadores ante determinados parámetros clínicos. El valor pronóstico de los niveles de los biomarcadores a los distintos tiempos tras el ingreso hospitalario se evaluó mediante las curvas de Características Operativas del Receptor (ROC).

Los datos se analizaron con el paquete estadístico GraphPad versión 8.0 y SPSS Statistics versión 21. Un valor de p <0.05 se consideró significativo.

Aprobación del estudio

El estudio se realizó de acuerdo a los estándares éticos del comité de revisión institucional (Comité Ético de Investigación Clínica del Hospital Universitario la Paz) y según la Declaración de Helsinki de 1964 y sus enmiendas posteriores. Se obtuvo el consentimiento informado por escrito de todos los participantes antes de la inclusión en el estudio.

RESULTADOS

La combinación de SAA1 y S00B determina la evolución del daño cerebral agudo en individuos a largo plazo.

Tabla 1: Resultados de la expresión de biomarcadores y su división en pacientes según el nivel de gravedad determinado por la escala GCS

La Tabla 1 muestra los valores detectados en cada uno de los tiempos analizados (24, y 72 horas) para los biomarcadores SAA1, S100P y TLR4. Los biomarcadores S100p y SAA1 se midieron a nivel de proteína y TLR4 a nivel de ARNm, los valores de referencia comprendieron la medición de dichos biomarcadores en pacientes sanos, es decir, sin TCE. Los valores obtenidos a nivel de ARNm se muestran en proporción al valor de referencia, en cambio los valores de proteína se muestran en μg/mL de muestra de sangre tanto en los individuos que han padecido el TCE como en los valores de referencia de los acientes sanos.

La práctica habitual en la clínica comprende la medición de marcadores en un plazo de 24h tras la lesión. Sin embargo, en la presente invención, los resultados obtenidos con la medición del marcador SAA1 a 72 h se obtienen unos resultados más eficaces para la separación de pacientes en leves y moderados-graves que habiéndolo medido a 24h (Figura 1 panel superior).

Además, se observó un aumento significativo en los niveles séricos de SAA1 a las 24h (mediana = 280; rango intercuartílico, (RIQ) = 73.41 - 404.4), 72 horas (mediana = 381.2; RIQ = 161.9 - 642.9) y 7 días después del trauma (mediana = 313.2; RIQ = 117.8 -500.4). Se alcanzó un pico a las 72 h, que se mantuvo significativamente elevado 1 semana después de la lesión.

Para determinar la relación del nivel de expresión de los biomarcadores con el nivel de consciencia de los pacientes y su clasificación en leves y moderados-graves se ha empleado la escala del coma de Glasgow (GCS). Esta escala es la más ampliamente utilizada para la evaluación de la severidad clínica intracraneal en pacientes con TCE (Teasdale and Jennet, 1974). Sin embargo, se han hecho escasas menciones con relación a diferentes tiempos de medida de los biomarcadores post-TCE.

Primero, clasificamos a los pacientes de acuerdo con la escala de coma de Glasgow (GCS) en dos grupos: por un lado, TCE severos (GCS 3-8) y moderados (GCS 9-13) y, por otro, TCE leves (GCS 14-15).

La Figura 1 muestra los niveles de expresión de los biomarcadores de pacientes individuales a 24, 48 y 72 horas divididos según su clasificación de la escala GCS en leves y moderados-graves. Se encontraron diferencias significativas a las 72h después del TCE entre los grupos leves y moderados-severos En los otros 2 tiempos (24h y 7 días) se puede observar una tendencia a que aquellos pacientes clasificados como moderados-graves tienen una mayor cantidad de SAA1. En el caso de S100P también se observa la tendencia de que los pacientes clasificados como moderados-severos a los 3 tiempos tienen mayor expresión.

Para evaluar si los niveles de los 3 biomarcadores después de un TCE podían discriminar entre pacientes con evolución favorable o desfavorable a largo plazo se tuvo en cuenta la puntuación obtenida en la escala GOSE, se calculó la curva ROC de cada uno de estos biomarcadores individualmente (Figura 2).

El área bajo la curva (AUC) demostró que los niveles de SAA1 72 h después del TCE (Figura 2, izquierda) pueden discriminar entre el pronóstico favorable y desfavorable de los pacientes (AUC = 0,864, IC 95%: 0,726 - 1,000). Con la especificidad establecida al 100%, SAA1 mostró una sensibilidad del 46,2%. También evaluamos la sensibilidad de SAA1 en un rango de especificidad del 90-95%. En este caso, SAA1 alcanzó un 69,2% y 53,8% de sensibilidad respectivamente (Tabla 2).

Respecto a S100P, el área bajo la curva (AUC) demostró que los niveles de dicho biomarcador a las 24h después de un TCE (Figura 2, centro) pueden discriminar entre el pronóstico favorable y desfavorable de los pacientes (AUC = 0,753, IC 95%: 0,568 -0,937). Con la especificidad establecida al 100%, S100P mostró una sensibilidad del 21,1%. También evaluamos la sensibilidad de S100P en un rango de especificidad del 90-95%. En este caso, S100P alcanzó un 42.9% y 35,7% de sensibilidad respectivamente (Tabla 2).

En conclusión, el nivel de SAA1 o S100P en sangre discrimina a los pacientes de acuerdo con la gravedad del TCE y su medición después de la lesión es capaz de determinar la prognosis de los pacientes 6 meses después del TCE, En el caso de TLR4, la medición de este marcador únicamente no es capaz de determinar la prognosis de los pacientes a largo plazo (Tabla 2 y Figura 2).

En la Tabla 2 se muestran los valores AUC en el pronóstico de los pacientes a largo plazo mediante la medición individual de los biomarcadores a 24 y 72h, así como la combinación de S100p y SAA1.

Tabla 2 Valores AUC para la determinación del daño cerebral agudo en individuos empleando diferentes marcadores a distintos tiempos.

El siguiente paso fue determinar si mediante la combinación de los marcadores individuales S100P y SAA1 podríamos obtener una mejor determinación de la evolución del daño cerebral agudo a largo plazo que con ambos biomarcadores por separado (figura 3 y tabla 2). El modelo comprendió dos biomarcadores: SAA1 a las 72 h y S100p a las 24 h. El área bajo la curva (AUC) demostró que la combinación de los niveles de S100P a las 24h y SAA1 a las 72h después de un TCE (Figura 3) pueden discriminar entre la evolución favorable y desfavorable de los pacientes mejor que cada uno de dichos biomarcadores por separado (AUC = 0,931, IC 95%: 0,827 - 1,000). Con la especificidad establecida al 100%, la combinación mostró una sensibilidad del 50,0%. También evaluamos la sensibilidad de la combinación en un rango de especificidad del 90-95%. En este caso, se alcanzó un 75,0% y 58,3% de sensibilidad respectivamente (Tabla 2).

Además, desarrollamos una fórmula correspondiente para la aplicación clínica del modelo predictivo. El cálculo de la probabilidad de que un paciente tenga un buen pronóstico (P^bp), se realizó mediante una regresión logística binaria que incluye factores de regresión para todos los dos marcadores que forman parte del modelo predictivo: P^bp = 1/(1 exp (-5,846 0,008 * [SAA1] 3,618 * [S1000]), donde [SAA1] es la concentración de SAA1 obtenida en el suero del paciente a las 72 h después del trauma y [S100P] es la concentración de S100P obtenida en el suero del paciente 24 h después del trauma causante del daño cerebral agudo. Por ejemplo, observamos un paciente (#11) con los siguientes niveles de suero para los dos marcadores incluidos en el modelo predictivo: [SAA1] = 250,49 μg/mL y [S100P] = 0,67 μg/mL. Así, la probabilidad de tener un buen pronóstico podría calcularse con P_BP = 1/(1 exp (-5,846 0,008 * 250,49 3,618 * 0,67) = 0,81 y, por lo tanto, un 81% de tener un buen pronóstico. Esto es, que, al finalizar el seguimiento, habrá un 81% de probabilidades de que obtenga una puntuación en los scores habitualmente utilizados en la práctica clínica de “buen pronóstico”. En este caso concreto el paciente tiene un 81% de posibilidades de obtener una puntuación de 8/7/6 en la escala GOSE a los 6 meses tras el traumatismo craneoencefálico.

Correlación entre los niveles de expresión de SAA1 y TLR4

SAA1 es capaz de señalizar a través de receptores tipo Toll 2/4 (TLR2/4) en diferentes células. Para examinar si SAA1 es relevante para la inflamación después de TCE, estudiamos la expresión de TLR4 en leucocitos de pacientes 24 h, 72 h y 7 días después del TCE. Como en el caso de SAA1, observamos un aumento en el ARNm de TLR4 a las 24 horas (mediana = 10.51; rango intercuartílico (IQR) = 2.26 - 28.15), 72 horas (mediana = 11.24; IQR = 2.42 - 15.34) y 7 días post-TBI (mediana = 9.74; IQR = 2.42 -15.34) (Figura 4). Se obtuvieron diferencias significativas tanto a las 24 h como a las 72 h. A continuación, examinamos la posible relación entre la expresión de TLR4 y los niveles séricos de SAA1. Se encontró una correlación positiva a las 72 h post-TBI (coeficiente de Pearson = 0.6395, p <0.05) (Figura 5). Por lo tanto, los niveles séricos de SAA1, la expresión de TLR4 y la gravedad y el pronóstico de los pacientes están mecánicamente vinculados.

Ejemplo 2: Aná lis is de la proteína SAA1 en m uestras séricas de modelos experim entales m urinos de traum atism o craneoencefálico.

MATERIALES Y MÉTODOS

1. Modelo experimental de TCE.

Se ha explorado si la expresión sérica y cerebral de SAA1 en un modelo preclínico de daño cerebral denominado “Closed head injury” o TCE cerrado.

2. Validación de los modelos: los modelos han sido validados mediante análisis funcional e histológico y marcadores propios de lesión cerebral traumática.

3. Análisis de la expresión de SAA1: se analizó la expresión sérica y cerebral de SAA1 a nivel de proteína mediante el uso de ELISA.

4. Comprobación del potencial efecto beneficioso del tratamiento con el bloqueante de TLR4 (TAK-242).

Modelo de TCE cerrado

El modelo de TCE cerrado consiste en dejar caer un peso sobre el cráneo del ratón. Los procedimientos y metodología se adaptaron a partir de la bibliografía existente [7]. La lesión se produjo en el hemisferio derecho, entre las suturas sagital y lambdoidea, por una pesa de 50 g que caía desde una altura de 34 cm para producir TCE severo. El ratón mantenía la cabeza en una superficie dura para minimizar la disipación de energía y provocar una lesión focal. Una hora antes de someter los animales al trauma, se les trataba con 0.05 mg/kg de buprenorfina de forma subcutánea para analgesia. Los ratones fueron anestesiados con isoflurano inhalado antes del impacto y se les administró oxígeno después del TCE hasta que la respiración volvió a la normalidad. La evaluación de la severidad de la lesión se hizo mediante el test NSS (del inglés, Neurological Severity Score), adaptado y modificado de la bibliografía [7]. Este test consiste en la evaluación de parámetros neurológicos y de comportamiento, en el cual el valor de 10 significa un deterioro total. Los animales fueron sometidos al test 1 hora y 24 horas después de sufrir el trauma. Se consideró TCE grave los ratones que obtuvieron una puntación de 6-8 en el NSS. Aquellos que obtenían una puntuación de 9 o 10 en el test de 1 hora fueron sacrificados inmediatamente para evitar su sufrimiento, tal como dictaminan las Guías para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio. Los ratones fueron tratados justo después del test de 1 hora con el compuesto TAK₂42 a una concentración de 3 mg/kg vía intraperitoneal.

Detección de SAA1 por ELISA

Los ratones fueron anestesiados con ketamina (100 mg/kg) y xilacina (10 mg/kg) para sacrificarlos, y la sangre se obtuvo mediante punción intracardiaca. La sangre de depositó en tubos tratados con EDTA y se centrifugó a 2500 rpm durante 10 minutos para obtener el suero. En el caso de los cerebros, la corteza de los hemisferios ipsilateral y contralateral fue disgregada en el tampón de lisis RIPA. Los niveles de la proteína SAA1 fueron determinados por un kit específico de ELISA (núm. ref. DY2948, R&D Systems) y siguiendo las indicaciones del fabricante.

Western Blot

La corteza cerebral de los cerebros de ratón fue disgregada con el tampón de lisis RIPA. Se corrieron 30 μg de proteína en geles SDS-PAGE y se transfirieron a membranas Immobilon-P. Las membranas fueron incubadas con el anticuerpo anti-SAA1/A2 (concentración 1:1000; núm. ref. AF2948, R&D Systems) y anti-p-actina (concentración 1:50.000; núm. ref. A3854, Sigma-Aldrich) siguiendo el protocolo marcado por el fabricante. Se utilizaron anticuerpos secundarios conjugados a peroxidasa (concentración 1: 5.000; núm. ref. sc-2354, Santa Cruz Biotechnology) para detectar las proteínas por quimioluminiscencia. La intensidad de las bandas fue cuantificada con el programa Scion Image (RRID: SCR_008673).

Análisis estadístico

Los datos se representaron con la media ± desviación estándar. El análisis de normalidad en la distribución de los datos se hizo mediante el test de normalidad D’Agostino-Pearson. Las diferencias entre más de dos grupos con un factor independiente, fueron analizadas por ANOVA de 1 vía seguido del test post-hoc de Tukey; los experimentos con dos variables independientes fueron sometidos a ANOVA de dos vías seguido del test post-hoc de Sidak. Los animales fueron asignados aleatoriamente a cada grupo antes de someterles al TCE. Todos los análisis estadísticos y la representación de los gráficos se realizaron con el programa GraphPad Prism 6.0 (GraphPad Software Inc., RRID:SCR_002798).

RESULTADOS

La expresión sérica y cerebral de SAA1 está aumentada 24 horas después del trauma en ratones.

Como modelo experimental de TCE en ratones utilizamos el modelo denominado "closed head injury” (CHI). Como se observó en humanos, detectamos un aumento significativo de SAA1 en plasma 24 horas después del trauma, que casi se redujo a niveles de control 1 semana después de la lesión en ratones (Figura 6A).

En el cerebro, SAA1 también se elevó en el hemisferio ipsilateral al daño 1 día después de la lesión, cuya acumulación desapareció después de 7 días. No detectamos cambios en los niveles de proteína en el lado contralateral (Figura 6B), lo que indica que la proteína SAA1 contribuye a la evolución del daño en el hemisferio afectado por el trauma.

El tratamiento con un bloqueante del receptor TLR4, reduce los niveles de SAA1 y mejora el pronóstico de los ratones.

Los ratones sometidos al modelo de TCE se trataron 1 hora después del trauma con el bloqueante del receptor TLR4 TAK-242 (3 mg/kg) vía intraperitoneal. En primer lugar, evaluamos los posibles cambios en SAA1 en el suero obtenido de la sangre de una punción intracardiaca y en el parénquima cerebral 24 horas después de la lesión. Observamos en ambos casos que el antagonismo de TLR4 produjo una reducción significativa en los niveles de proteína en comparación con los animales no tratados; casi alcanzó niveles de control en el tejido cerebral (Figura 7A y B).

Para confirmar estos hallazgos, realizamos análisis de Western blot de la proteína SAA1. El Western blot del tejido cerebral reveló que SAA1 no está presente en los cerebros de animales no lesionados (Figura 7C izquierda). Los niveles de SAA1 aumentaron en el lado ipsilateral de los ratones sometidos a TBI, mientras que eran indetectables en el hemisferio contralateral. Además, el tratamiento de los animales con TAK-242 disminuyó la acumulación de SAA1 en el parénquima cerebral del hemisferio lesionado (Figura 7C, derecha).

Por último, exploramos los posibles efectos del bloqueo del receptor TLR4 en el pronóstico de los animales sometidos a TCE. Utilizamos la prueba de puntuación de gravedad neurológica (NSS), que evalúa las habilidades neurológicas, motoras y conductuales en ratones después de un TCE (24). Una puntuación de 10 puntos representa un deterioro neurológico total, mientras que 0 puntos significa una función normal. Una hora después del TCE, detectamos que los animales obtuvieron un NSS entre 6 y 8. Después de la prueba de 1 hora, los animales se trataron con TAK-242 (3 mg/kg) y el NSS se evaluó nuevamente 24 horas después de la lesión. En estas condiciones, encontramos que los animales tratados con TAK-242 mejoraron significativamente las habilidades neuroconductuales en comparación con los animales salinos (Figura 8).

Referencias

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2. Menon DK, Maas AI (2015). Traumatic brain injury in 2014. Progress, failures and new approaches for TBI research. Nature reviews. Neurology 11:71-72.

3. Welch, Robert D et al. “Ability of Serum Glial Fibrillary Acidic Protein, Ubiquitin C-Terminal Hydrolase-L1, and S100B To Differentiate Normal and Abnormal Head Computed Tomography Findings in Patients with Suspected Mild or Moderate Traumatic Brain Injury.” Journal of neurotrauma vol. 33,2 (2016): 203-14. doi:10.1089/neu.2015.4149

4. Lewis, Lawrence M et al. “Utility of Serum Biomarkers in the Diagnosis and Stratification of Mild Traumatic Brain Injury.” Academic emergency medicine: official journal of the Society for Academic Emergency Medicine vol. 24,6 (2017): 710-720. doi:10.1111/acem.13174.

5. Olivecrona, Zandra et al. “Association of ICP, CPP, CT findings and S-100B and NSE in severe traumatic head injury. Prognostic value of the biomarkers.” Brain injury vol.

29,4 (2015): 446-54. doi:10.3109/02699052.2014.989403.

6. Takala, Riikka S K et al. “Glial Fibrillary Acidic Protein and Ubiquitin C-Terminal Hydrolase-L1 as Outcome Predictors in Traumatic Brain Injury.” World neurosurgery vol.

87 (2016): 8-20. doi:10.1016/j.wneu.2015.10.066.

7. Flierl, Michael A et al. “Mouse closed head injury model induced by a weight-drop device.” Nature protocols vol. 4,9 (2009): 1328-37. doi:10.1038/nprot.2009.148.

Claims (18)

REIVINDICACIONES

1. Método para determinar la evolución del daño cerebral agudo a largo plazo en individuos, que comprende:

a. determinar el producto de expresión de los biomarcadores SAA1 y S100p en una muestra biológica tomada del individuo y,

b. establecer la significación estadística de la concentración del producto de expresión de los biomarcadores de la etapa a,

donde el producto de expresión de SAA1 se obtiene de una muestra biológica tomada entre las 24h y 1 semana tras la lesión que produce el daño cerebral agudo.

2. Método según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende en la etapa a) determinar el producto de expresión de los biomarcadores SAA1 y S100P en una muestra biológica del individuo.

3. Método según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el producto de expresión del biomarcador es un ácido nucleico y/o una proteína.

4. Método según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende además llevar a cabo una metodología estadística con cada uno de los valores del producto de expresión del biomarcador y producir un valor de salida con significación estadística que indica si la evolución del daño cerebral del individuo es favorable o desfavorable a largo plazo.

5. Método según la reivindicación anterior, en el que la metodología estadística se selecciona entre la prueba de D’Agostino-Pearson y un algoritmo clasificador del grupo seleccionado entre un clasificador de árbol de decisión, clasificador de regresión logística, clasificador de vecino más cercano, clasificador de red neuronal, modelo de mezcla gaussiano (GMM), Máquina de Vector de Soporte (SVM) clasificador, clasificador de centroide más cercano, clasificador de regresión lineal, clasificador lineal de análisis discriminante (LOA), clasificador de análisis discriminante cuadrático (QDA) y clasificador de bosque aleatorio.

6. Método según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende poner la muestra biológica del paciente en contacto con un dispositivo que comprende un sustrato que tiene una superficie activada en la que se inmoviliza, en áreas discretas de dicha superficie activada, uno o más anticuerpos específicos para SAA1, y S100P, de tal forma que se utiliza un dispositivo para cada anticuerpo, o un dispositivo para más de uno.

7. Método según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende extraer los ácidos nucleicos de la muestra del paciente y realizar un análisis de los mismos con oligonucleótidos específicos para detectar uno o más de los biomarcadores SAA1, y S100p.

8. Método según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende clasificar a un individuo con el valor de al menos un marcador seleccionado entre: edad, temperatura, una determinada GCS, GOS, NIHSS, A2DS2, Rankin y Rankin modificado, índice de Barthel, Fisher score o WFNS.

9. Método según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la muestra biológica se selecciona entre sangre, suero, plasma, líquido cefalorraquídeo, saliva, fluido lacrimal, tejidos, células, orina y combinaciones de estos.

10. Método según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la causa del daño cerebral agudo se selecciona entre traumatismo craneoencefálico abierto, traumatismo craneoencefálico cerrado y la patología vascular cerebral, de tipo isquémico o hemorrágico.

11. Método según la reivindicación anterior, en el que el daño cerebral agudo está causado por un traumatismo craneoencefálico abierto o cerrado.

12. Método según una de las reivindicaciones anteriores, en el que el individuo es un humano de entre 1 y 90 años, ambos incluidos.

13. Uso de un dispositivo para la realización del método definido en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, que comprende los elementos necesarios para detectar y cuantificar la cantidad de producto de expresión de uno o más de los biomarcadores seleccionados entre: SAA1 yS100p.

14. Uso según la reivindicación anterior, en el que el dispositivo es un inmunoensayo seleccionado entre ensayo de aglutinación de látex, FIA, EIA, RIA, LIA, CLIA, X-map, Western Blot y ELISA, preferentemente un ELISA, FIA y EIA.

15. Uso según la reivindicación anterior, en el que el ELISA se selecciona entre ELISA directo, ELISA indirecto y ELISA sándwich.

16. Uso según una de las reivindicaciones 13 a 15, en el que el dispositivo comprende anticuerpos secundarios, controles positivos y negativos, tampones, soluciones de extracción de proteínas, y agentes para prevenir la contaminación e inhibidores de la degradación de las proteínas.

17. Uso según la reivindicación 13, en el que el dispositivo comprende un chip de ADN, que comprende oligonucleótidos o microarreglos de canal único diseñados a partir de una secuencia conocida o un ARNm de al menos uno de los biomarcadores SAA1, S100p y TLR4.

18. Uso según una cualquiera de las reivindicaciones 13 a 17, en el que el dispositivo comprende todos los soportes y recipientes necesarios para su puesta en marcha y optimización, además las instrucciones para llevar a cabo el método de la invención.