ES2927913B2 - Composición que comprende una combinación de las furanocumarinas psoraleno y angelicina y su uso en terapia - Google Patents
Composición que comprende una combinación de las furanocumarinas psoraleno y angelicina y su uso en terapia Download PDFInfo
- Publication number
- ES2927913B2 ES2927913B2 ES202130415A ES202130415A ES2927913B2 ES 2927913 B2 ES2927913 B2 ES 2927913B2 ES 202130415 A ES202130415 A ES 202130415A ES 202130415 A ES202130415 A ES 202130415A ES 2927913 B2 ES2927913 B2 ES 2927913B2
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- composition
- cells
- psoralen
- angelicin
- treatment
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- ZCCUUQDIBDJBTK-UHFFFAOYSA-N psoralen Chemical compound C1=C2OC(=O)C=CC2=CC2=C1OC=C2 ZCCUUQDIBDJBTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims description 123
- 239000000203 mixture Substances 0.000 title claims description 87
- XDROKJSWHURZGO-UHFFFAOYSA-N isopsoralen Natural products C1=C2OC=CC2=C2OC(=O)C=CC2=C1 XDROKJSWHURZGO-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims description 62
- VXGRJERITKFWPL-UHFFFAOYSA-N 4',5'-Dihydropsoralen Natural products C1=C2OC(=O)C=CC2=CC2=C1OCC2 VXGRJERITKFWPL-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims description 61
- MLMVLVJMKDPYBM-UHFFFAOYSA-N pseudoisopsoralene Natural products C1=C2C=COC2=C2OC(=O)C=CC2=C1 MLMVLVJMKDPYBM-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims description 60
- KZJWDPNRJALLNS-VJSFXXLFSA-N sitosterol Chemical compound C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CC[C@@H](CC)C(C)C)[C@@]1(C)CC2 KZJWDPNRJALLNS-VJSFXXLFSA-N 0.000 title claims description 58
- 229950005143 sitosterol Drugs 0.000 title claims description 58
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 title description 8
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 99
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims description 81
- 210000005087 mononuclear cell Anatomy 0.000 claims description 73
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 49
- 208000009329 Graft vs Host Disease Diseases 0.000 claims description 47
- 208000024908 graft versus host disease Diseases 0.000 claims description 47
- 230000001640 apoptogenic effect Effects 0.000 claims description 36
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims description 31
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 claims description 23
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims description 23
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims description 21
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims description 21
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 claims description 17
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 claims description 16
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims description 15
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 claims description 14
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 claims description 12
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 claims description 11
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims description 8
- 208000012657 Atopic disease Diseases 0.000 claims description 5
- 206010025323 Lymphomas Diseases 0.000 claims description 4
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 claims description 4
- 208000011231 Crohn disease Diseases 0.000 claims description 3
- 201000004681 Psoriasis Diseases 0.000 claims description 3
- 206010067584 Type 1 diabetes mellitus Diseases 0.000 claims description 3
- 201000006417 multiple sclerosis Diseases 0.000 claims description 3
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 claims description 3
- 206010039073 rheumatoid arthritis Diseases 0.000 claims description 3
- 201000000596 systemic lupus erythematosus Diseases 0.000 claims description 3
- 206010009900 Colitis ulcerative Diseases 0.000 claims description 2
- 208000022559 Inflammatory bowel disease Diseases 0.000 claims description 2
- 206010052779 Transplant rejections Diseases 0.000 claims description 2
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 claims description 2
- 229940102223 injectable solution Drugs 0.000 claims description 2
- 201000000306 sarcoidosis Diseases 0.000 claims description 2
- 208000027866 inflammatory disease Diseases 0.000 claims 1
- QXKHYNVANLEOEG-UHFFFAOYSA-N Methoxsalen Chemical compound C1=CC(=O)OC2=C1C=C1C=COC1=C2OC QXKHYNVANLEOEG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 72
- 229940027041 8-mop Drugs 0.000 description 65
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 22
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 22
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 22
- 210000004443 dendritic cell Anatomy 0.000 description 22
- CRMBVHJMQTYDMJ-QZTJIDSGSA-N furanocoumarin Natural products CC(C)OC(C)(C)[C@H](O)COc1c2C=CC(=O)Oc2c(OC[C@@H](O)C(=C)C)c3occc13 CRMBVHJMQTYDMJ-QZTJIDSGSA-N 0.000 description 19
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 19
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 19
- 230000000735 allogeneic effect Effects 0.000 description 18
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 18
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 18
- 230000004044 response Effects 0.000 description 16
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 14
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 14
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 13
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 13
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 13
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 12
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 12
- 102000006354 HLA-DR Antigens Human genes 0.000 description 11
- 108010058597 HLA-DR Antigens Proteins 0.000 description 11
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 10
- 210000003289 regulatory T cell Anatomy 0.000 description 10
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 10
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 9
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 9
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 9
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 9
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 9
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 9
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 8
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 8
- 102100036301 C-C chemokine receptor type 7 Human genes 0.000 description 7
- 108010083702 Chemokine CCL21 Proteins 0.000 description 7
- 102000006435 Chemokine CCL21 Human genes 0.000 description 7
- 101000716065 Homo sapiens C-C chemokine receptor type 7 Proteins 0.000 description 7
- 230000006870 function Effects 0.000 description 7
- 210000000936 intestine Anatomy 0.000 description 7
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 7
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 7
- WOVKYSAHUYNSMH-RRKCRQDMSA-N 5-bromodeoxyuridine Chemical compound C1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C(Br)=C1 WOVKYSAHUYNSMH-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 6
- 102000004121 Annexin A5 Human genes 0.000 description 6
- 108090000672 Annexin A5 Proteins 0.000 description 6
- 102100035793 CD83 antigen Human genes 0.000 description 6
- 101000946856 Homo sapiens CD83 antigen Proteins 0.000 description 6
- 101000914484 Homo sapiens T-lymphocyte activation antigen CD80 Proteins 0.000 description 6
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 6
- 102100027222 T-lymphocyte activation antigen CD80 Human genes 0.000 description 6
- 210000000013 bile duct Anatomy 0.000 description 6
- 238000003501 co-culture Methods 0.000 description 6
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 6
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 6
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 6
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 6
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 6
- 210000004988 splenocyte Anatomy 0.000 description 6
- 108010012236 Chemokines Proteins 0.000 description 5
- 102000019034 Chemokines Human genes 0.000 description 5
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 5
- 101001057504 Homo sapiens Interferon-stimulated gene 20 kDa protein Proteins 0.000 description 5
- 101001055144 Homo sapiens Interleukin-2 receptor subunit alpha Proteins 0.000 description 5
- 101000738771 Homo sapiens Receptor-type tyrosine-protein phosphatase C Proteins 0.000 description 5
- 102100026878 Interleukin-2 receptor subunit alpha Human genes 0.000 description 5
- 102100037422 Receptor-type tyrosine-protein phosphatase C Human genes 0.000 description 5
- 206010042971 T-cell lymphoma Diseases 0.000 description 5
- 208000027585 T-cell non-Hodgkin lymphoma Diseases 0.000 description 5
- 230000037338 UVA radiation Effects 0.000 description 5
- 230000003110 anti-inflammatory effect Effects 0.000 description 5
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 5
- 210000002615 epidermis Anatomy 0.000 description 5
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 5
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 5
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 5
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 description 5
- 230000000770 proinflammatory effect Effects 0.000 description 5
- BGEBZHIAGXMEMV-UHFFFAOYSA-N 5-methoxypsoralen Chemical compound O1C(=O)C=CC2=C1C=C1OC=CC1=C2OC BGEBZHIAGXMEMV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 4
- 238000011746 C57BL/6J (JAX™ mouse strain) Methods 0.000 description 4
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 4
- WZUVPPKBWHMQCE-UHFFFAOYSA-N Haematoxylin Chemical compound C12=CC(O)=C(O)C=C2CC2(O)C1C1=CC=C(O)C(O)=C1OC2 WZUVPPKBWHMQCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 4
- 108700018351 Major Histocompatibility Complex Proteins 0.000 description 4
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 4
- 210000002798 bone marrow cell Anatomy 0.000 description 4
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 4
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 4
- 230000008378 epithelial damage Effects 0.000 description 4
- 238000011134 hematopoietic stem cell transplantation Methods 0.000 description 4
- 230000002519 immonomodulatory effect Effects 0.000 description 4
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 4
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 4
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 4
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 4
- 230000001617 migratory effect Effects 0.000 description 4
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 description 4
- 230000008569 process Effects 0.000 description 4
- 230000020382 suppression by virus of host antigen processing and presentation of peptide antigen via MHC class I Effects 0.000 description 4
- WOVKYSAHUYNSMH-UHFFFAOYSA-N BROMODEOXYURIDINE Natural products C1C(O)C(CO)OC1N1C(=O)NC(=O)C(Br)=C1 WOVKYSAHUYNSMH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102100036846 C-C motif chemokine 21 Human genes 0.000 description 3
- YLQBMQCUIZJEEH-UHFFFAOYSA-N Furan Chemical group C=1C=COC=1 YLQBMQCUIZJEEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 101000713085 Homo sapiens C-C motif chemokine 21 Proteins 0.000 description 3
- 208000001718 Immediate Hypersensitivity Diseases 0.000 description 3
- 229950004398 broxuridine Drugs 0.000 description 3
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 3
- -1 combination Substances 0.000 description 3
- 230000000139 costimulatory effect Effects 0.000 description 3
- 150000004775 coumarins Chemical class 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 3
- 210000002216 heart Anatomy 0.000 description 3
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 3
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 3
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 3
- 229960004469 methoxsalen Drugs 0.000 description 3
- SQBBOVROCFXYBN-UHFFFAOYSA-N methoxypsoralen Natural products C1=C2OC(=O)C(OC)=CC2=CC2=C1OC=C2 SQBBOVROCFXYBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000010232 migration assay Methods 0.000 description 3
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 3
- 238000001126 phototherapy Methods 0.000 description 3
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 3
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 3
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 3
- 230000003614 tolerogenic effect Effects 0.000 description 3
- ORHBXUUXSCNDEV-UHFFFAOYSA-N umbelliferone Chemical compound C1=CC(=O)OC2=CC(O)=CC=C21 ORHBXUUXSCNDEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000003442 weekly effect Effects 0.000 description 3
- PFFGIQUVLUEURV-UHFFFAOYSA-N 4,5'-Dimethylangelicin Chemical compound CC1=CC(=O)OC2=C1C=CC1=C2C=C(C)O1 PFFGIQUVLUEURV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108700012813 7-aminoactinomycin D Proteins 0.000 description 2
- YXHLJMWYDTXDHS-IRFLANFNSA-N 7-aminoactinomycin D Chemical compound C[C@H]1OC(=O)[C@H](C(C)C)N(C)C(=O)CN(C)C(=O)[C@@H]2CCCN2C(=O)[C@@H](C(C)C)NC(=O)[C@H]1NC(=O)C1=C(N)C(=O)C(C)=C2OC(C(C)=C(N)C=C3C(=O)N[C@@H]4C(=O)N[C@@H](C(N5CCC[C@H]5C(=O)N(C)CC(=O)N(C)[C@@H](C(C)C)C(=O)O[C@@H]4C)=O)C(C)C)=C3N=C21 YXHLJMWYDTXDHS-IRFLANFNSA-N 0.000 description 2
- CJIJXIFQYOPWTF-UHFFFAOYSA-N 7-hydroxycoumarin Natural products O1C(=O)C=CC2=CC(O)=CC=C21 CJIJXIFQYOPWTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000208838 Asteraceae Species 0.000 description 2
- 206010003694 Atrophy Diseases 0.000 description 2
- 238000011725 BALB/c mouse Methods 0.000 description 2
- 102000009410 Chemokine receptor Human genes 0.000 description 2
- 108050000299 Chemokine receptor Proteins 0.000 description 2
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 2
- 238000008157 ELISA kit Methods 0.000 description 2
- 241000220485 Fabaceae Species 0.000 description 2
- 108010017213 Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 2
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 2
- 102100022297 Integrin alpha-X Human genes 0.000 description 2
- 108090000978 Interleukin-4 Proteins 0.000 description 2
- 102000043131 MHC class II family Human genes 0.000 description 2
- 108091054438 MHC class II family Proteins 0.000 description 2
- 206010028124 Mucosal ulceration Diseases 0.000 description 2
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 2
- PCWZKQSKUXXDDJ-UHFFFAOYSA-N Xanthotoxin Natural products COCc1c2OC(=O)C=Cc2cc3ccoc13 PCWZKQSKUXXDDJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002617 apheresis Methods 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 230000037444 atrophy Effects 0.000 description 2
- 229960002045 bergapten Drugs 0.000 description 2
- KGZDKFWCIPZMRK-UHFFFAOYSA-N bergapten Natural products COC1C2=C(Cc3ccoc13)C=CC(=O)O2 KGZDKFWCIPZMRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 2
- 210000001772 blood platelet Anatomy 0.000 description 2
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 2
- 230000012292 cell migration Effects 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 238000011284 combination treatment Methods 0.000 description 2
- 239000003246 corticosteroid Substances 0.000 description 2
- 229960001334 corticosteroids Drugs 0.000 description 2
- ZYGHJZDHTFUPRJ-UHFFFAOYSA-N coumarin Chemical compound C1=CC=C2OC(=O)C=CC2=C1 ZYGHJZDHTFUPRJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 2
- YQGOJNYOYNNSMM-UHFFFAOYSA-N eosin Chemical compound [Na+].OC(=O)C1=CC=CC=C1C1=C2C=C(Br)C(=O)C(Br)=C2OC2=C(Br)C(O)=C(Br)C=C21 YQGOJNYOYNNSMM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 2
- 238000010195 expression analysis Methods 0.000 description 2
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 2
- 102000054766 genetic haplotypes Human genes 0.000 description 2
- 244000144993 groups of animals Species 0.000 description 2
- 210000003958 hematopoietic stem cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 2
- 230000008975 immunomodulatory function Effects 0.000 description 2
- 230000006882 induction of apoptosis Effects 0.000 description 2
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 230000008595 infiltration Effects 0.000 description 2
- 238000001764 infiltration Methods 0.000 description 2
- 210000004969 inflammatory cell Anatomy 0.000 description 2
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 2
- 229920006008 lipopolysaccharide Polymers 0.000 description 2
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 2
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 2
- 210000001165 lymph node Anatomy 0.000 description 2
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 2
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 2
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 2
- 230000036544 posture Effects 0.000 description 2
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 2
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 2
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 2
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 2
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 2
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 2
- 238000000528 statistical test Methods 0.000 description 2
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 2
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- HFTAFOQKODTIJY-UHFFFAOYSA-N umbelliferone Natural products Cc1cc2C=CC(=O)Oc2cc1OCC=CC(C)(C)O HFTAFOQKODTIJY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- 230000004580 weight loss Effects 0.000 description 2
- WBYWAXJHAXSJNI-VOTSOKGWSA-M .beta-Phenylacrylic acid Natural products [O-]C(=O)\C=C\C1=CC=CC=C1 WBYWAXJHAXSJNI-VOTSOKGWSA-M 0.000 description 1
- NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 2,3-bis(butanoylsulfanyl)propyl butanoate Chemical compound CCCC(=O)OCC(SC(=O)CCC)CSC(=O)CCC NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BUNGCZLFHHXKBX-UHFFFAOYSA-N 8-methoxypsoralen Natural products C1=CC(=O)OC2=C1C=C1CCOC1=C2OC BUNGCZLFHHXKBX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010000830 Acute leukaemia Diseases 0.000 description 1
- 241000208173 Apiaceae Species 0.000 description 1
- DBMJZOMNXBSRED-UHFFFAOYSA-N Bergamottin Natural products O1C(=O)C=CC2=C1C=C1OC=CC1=C2OCC=C(C)CCC=C(C)C DBMJZOMNXBSRED-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CQRCVBFZOCBKJH-FYZOBXCZSA-N CC(O)=O.OCC[C@](O)(C)CC(O)=O Chemical compound CC(O)=O.OCC[C@](O)(C)CC(O)=O CQRCVBFZOCBKJH-FYZOBXCZSA-N 0.000 description 1
- 108010017158 CCR7 Receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000004428 CCR7 Receptors Human genes 0.000 description 1
- 102000017420 CD3 protein, epsilon/gamma/delta subunit Human genes 0.000 description 1
- 108050005493 CD3 protein, epsilon/gamma/delta subunit Proteins 0.000 description 1
- 210000001266 CD8-positive T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000006820 DNA synthesis Effects 0.000 description 1
- 102100039620 Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor Human genes 0.000 description 1
- 101000713106 Homo sapiens C-C motif chemokine 19 Proteins 0.000 description 1
- 101000946889 Homo sapiens Monocyte differentiation antigen CD14 Proteins 0.000 description 1
- 101000946843 Homo sapiens T-cell surface glycoprotein CD8 alpha chain Proteins 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 102100035877 Monocyte differentiation antigen CD14 Human genes 0.000 description 1
- 238000009193 PUVA therapy Methods 0.000 description 1
- 229930040373 Paraformaldehyde Natural products 0.000 description 1
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 1
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 1
- 238000000692 Student's t-test Methods 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- 102100034922 T-cell surface glycoprotein CD8 alpha chain Human genes 0.000 description 1
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 1
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 1
- 208000025865 Ulcer Diseases 0.000 description 1
- 206010047642 Vitiligo Diseases 0.000 description 1
- 235000009754 Vitis X bourquina Nutrition 0.000 description 1
- 235000012333 Vitis X labruscana Nutrition 0.000 description 1
- 235000014787 Vitis vinifera Nutrition 0.000 description 1
- 240000006365 Vitis vinifera Species 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 230000016571 aggressive behavior Effects 0.000 description 1
- 238000011316 allogeneic transplantation Methods 0.000 description 1
- 108010004469 allophycocyanin Proteins 0.000 description 1
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 1
- 238000000540 analysis of variance Methods 0.000 description 1
- 230000007503 antigenic stimulation Effects 0.000 description 1
- 230000001363 autoimmune Effects 0.000 description 1
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000009674 basal proliferation Effects 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- 230000006399 behavior Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 239000010836 blood and blood product Substances 0.000 description 1
- 229940125691 blood product Drugs 0.000 description 1
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 1
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 238000001516 cell proliferation assay Methods 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 208000024207 chronic leukemia Diseases 0.000 description 1
- 210000001072 colon Anatomy 0.000 description 1
- 238000004590 computer program Methods 0.000 description 1
- 238000012937 correction Methods 0.000 description 1
- 229960000956 coumarin Drugs 0.000 description 1
- 235000001671 coumarin Nutrition 0.000 description 1
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 1
- 102000003675 cytokine receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010057085 cytokine receptors Proteins 0.000 description 1
- 238000004163 cytometry Methods 0.000 description 1
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 1
- 230000007850 degeneration Effects 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 1
- BFMYDTVEBKDAKJ-UHFFFAOYSA-L disodium;(2',7'-dibromo-3',6'-dioxido-3-oxospiro[2-benzofuran-1,9'-xanthene]-4'-yl)mercury;hydrate Chemical compound O.[Na+].[Na+].O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC(Br)=C([O-])C([Hg])=C1OC1=C2C=C(Br)C([O-])=C1 BFMYDTVEBKDAKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 1
- 230000003828 downregulation Effects 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 239000012997 ficoll-paque Substances 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 208000014951 hematologic disease Diseases 0.000 description 1
- 238000007490 hematoxylin and eosin (H&E) staining Methods 0.000 description 1
- 231100000086 high toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 238000007489 histopathology method Methods 0.000 description 1
- 210000002663 immature myeloid dendritic cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000002865 immune cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 230000003308 immunostimulating effect Effects 0.000 description 1
- 230000001506 immunosuppresive effect Effects 0.000 description 1
- 239000003018 immunosuppressive agent Substances 0.000 description 1
- 229940124589 immunosuppressive drug Drugs 0.000 description 1
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 1
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 239000013067 intermediate product Substances 0.000 description 1
- 238000010212 intracellular staining Methods 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 235000021374 legumes Nutrition 0.000 description 1
- 231100000636 lethal dose Toxicity 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 230000003211 malignant effect Effects 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 210000003798 mature myeloid dendritic cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 230000037353 metabolic pathway Effects 0.000 description 1
- 230000002297 mitogenic effect Effects 0.000 description 1
- 210000004877 mucosa Anatomy 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 238000001543 one-way ANOVA Methods 0.000 description 1
- 229940105626 oxsoralen-ultra Drugs 0.000 description 1
- 230000000242 pagocytic effect Effects 0.000 description 1
- 239000012188 paraffin wax Substances 0.000 description 1
- 229920002866 paraformaldehyde Polymers 0.000 description 1
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 1
- 102000013415 peroxidase activity proteins Human genes 0.000 description 1
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000002215 photochemotherapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003504 photosensitizing agent Substances 0.000 description 1
- 229920000515 polycarbonate Polymers 0.000 description 1
- 239000004417 polycarbonate Substances 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- CBIDRCWHNCKSTO-UHFFFAOYSA-N prenyl diphosphate Chemical compound CC(C)=CCO[P@](O)(=O)OP(O)(O)=O CBIDRCWHNCKSTO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 238000004393 prognosis Methods 0.000 description 1
- 230000000750 progressive effect Effects 0.000 description 1
- 230000009696 proliferative response Effects 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 239000002510 pyrogen Substances 0.000 description 1
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 1
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 1
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000011519 second-line treatment Methods 0.000 description 1
- 210000005212 secondary lymphoid organ Anatomy 0.000 description 1
- JXOHGGNKMLTUBP-HSUXUTPPSA-N shikimic acid Chemical compound O[C@@H]1CC(C(O)=O)=C[C@@H](O)[C@H]1O JXOHGGNKMLTUBP-HSUXUTPPSA-N 0.000 description 1
- JXOHGGNKMLTUBP-JKUQZMGJSA-N shikimic acid Natural products O[C@@H]1CC(C(O)=O)=C[C@H](O)[C@@H]1O JXOHGGNKMLTUBP-JKUQZMGJSA-N 0.000 description 1
- 208000017520 skin disease Diseases 0.000 description 1
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- WBYWAXJHAXSJNI-VOTSOKGWSA-N trans-cinnamic acid Chemical compound OC(=O)\C=C\C1=CC=CC=C1 WBYWAXJHAXSJNI-VOTSOKGWSA-N 0.000 description 1
- 238000011277 treatment modality Methods 0.000 description 1
- FMHHVULEAZTJMA-UHFFFAOYSA-N trioxsalen Chemical compound CC1=CC(=O)OC2=C1C=C1C=C(C)OC1=C2C FMHHVULEAZTJMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960000850 trioxysalen Drugs 0.000 description 1
- 230000036269 ulceration Effects 0.000 description 1
- 230000003827 upregulation Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/33—Heterocyclic compounds
- A61K31/335—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin
- A61K31/365—Lactones
- A61K31/366—Lactones having six-membered rings, e.g. delta-lactones
- A61K31/37—Coumarins, e.g. psoralen
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K41/00—Medicinal preparations obtained by treating materials with wave energy or particle radiation ; Therapies using these preparations
- A61K41/0057—Photodynamic therapy with a photosensitizer, i.e. agent able to produce reactive oxygen species upon exposure to light or radiation, e.g. UV or visible light; photocleavage of nucleic acids with an agent
- A61K41/0066—Psoralene-activated UV-A photochemotherapy (PUVA-therapy), e.g. for treatment of psoriasis or eczema, extracorporeal photopheresis with psoralens or fucocoumarins
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61N—ELECTROTHERAPY; MAGNETOTHERAPY; RADIATION THERAPY; ULTRASOUND THERAPY
- A61N5/00—Radiation therapy
- A61N5/06—Radiation therapy using light
- A61N5/0613—Apparatus adapted for a specific treatment
- A61N5/062—Photodynamic therapy, i.e. excitation of an agent
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
- A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Dermatology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Radiology & Medical Imaging (AREA)
- Pathology (AREA)
- Transplantation (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Medicines Containing Plant Substances (AREA)
Description
DESCRIPCIÓN
Composición que comprende una combinación de las furanocumarinas psoraleno y angelicina y su uso en terapia
CAMPO TÉCNICO
La presente invención se refiere a una nueva composición que comprende una mezcla de dos furanocumarinas, específicamente psoraleno y angelicina, así como los usos médicos de dicha composición, más concretamente el uso de dicha composición para el tratamiento de enfermedades de base inmunológica, tales como por ejemplo, enfermedades autoinmunes, principalmente mediadas por linfocitos T, hipersensibilidades atópicas, Enfermedad Injerto contra Huésped (EICH), rechazo de órganos en trasplantes
o linfomas. Adicionalmente, la presente invención se refiere a un procedimiento ex vivo/in vitro para la generación de células apoptóticas, preferiblemente autólogas, útiles en procedimientos de fotoféresis extracorpórea (FEC). Por lo tanto, la presente invención se engloba dentro del campo técnico de la medicina, más concretamente, del sector destinado al tratamiento de enfermedades de base inmunológica, enfermedades autoinmunes, hipersensibilidades atópicas y EICH, entre otras.
ESTADO DE LA TÉCNICA
El término furanocumarina se aplica colectivamente a un gran número de compuestos que poseen el núcleo benzo-2-pirona (cumarina), con un anillo furánico unido en las posiciones 6 y 7 para las furanocumarinas lineales, y 7 y 8 para las angulares. Estos compuestos están presentes en las familias vegetales Leguminosas, Moráceas, Meliáceas, Compuestas, Solanáceas, Rutáceas, Umbelíferas y Apiáceas.
Desde el descubrimiento de estos compuestos vegetales, se ha realizado una extensa investigación sobre el interés terapéutico de los mismos, así como de otras biomoléculas relacionadas estructuralmente.
Las furanocumarinas están siendo empleadas en clínica en la terapia denominada PUVA (de sus siglas "psoraleno” y "luz UVA”) y en la terapia denominada fotoaféresis extracorpórea (FEC). La terapia PUVA está siendo empleada a nivel clínico para el tratamiento de enfermedades cutáneas como el vitÍligo o la psoriasis (Saurat y col., Dermatológica. 1988, 177, 218-224; Westerhof y Nieuweboer-Krobotova, Arch Dermatol.
1997, 133, 1525-1528) y consiste en la aplicación de una irradiación corporal total al paciente con luz ultravioleta (UVA) tras la administración de la furanocumarina, proceso que se repite varias veces a la semana. Las furanocumarinas más comúnmente utilizadas para esta modalidad de fotoquimioterapia incluyen el 8-metoxipsoraleno u 8-MOP (también llamado metoxaleno o xantotoxina), 5-metoxipsoraleno (o bergapteno), angelicina (o isopsoraleno), 4,5’-dimetilangelicina y 4,5’,8-trimetilpsoraleno. Algunas de las furanocumarinas de uso comercial empleadas para PUVA son Oxsoralen-Ultra®, Meladinine®, Deltasoralen®, Geroxalen®, Metoxalen® y Trioxalen®, entre otras.
Por otro lado, la FEC se trata de una terapia inmunomoduladora que combina la leucoaféresis (extracción de la fracción leucocitaria de la sangre del paciente) con la fototerapia. Tras la separación de un plasma rico en leucocitos, se tratan dichos leucocitos ex vivo/in vitro con un agente fotosensibilizante, como por ejemplo, la furanocumarina 8-MOP juntó con radiación UVA y posteriormente, Ios leucocitos tratados de dicha manera se reinfunden de nuevo en el paciente. Actualmente esta modalidad de tratamiento es considerada una terapia inmunomoduladora segura, con escasos efectos secundarios y múltiples aplicaciones clínicas y está siendo utilizada para el tratamiento de diferentes enfermedades mediadas por linfocitos T, tales como como episodios de rechazó de trasplantes de órganos sólidos (corazón, riñón, hígado o pulmón), linfoma T cutáneo, Enfermedad Injertó contra Huésped (EICH) o distintas enfermedades autoinmunes como diabetes tipo 1, enfermedad de Crohn, lupus eritematoso sistémico, esclerosis múltiple o artritis reumatoide (Marques y Adamski J Clin Apheresis. 2014, 29: 228-234), entre otras.
Así, por ejemplo, en el caso de pacientes diagnosticados de hemopatías malignas, el trasplante alogénico de células progenitoras hematopoyéticas (TPH) es el tratamiento de elección. Sin embargó, los resultados a largó plazo se ven limitados por la elevada toxicidad del procedimiento, que condiciona una importante morbi-mortalidad relacionada con el trasplante. Dicha morbi-mortalidad está en gran parte relacionada con el desarrollo de la EICH, que se produce como consecuencia de la agresión inmunológica por parte de las células linfoides infundidas contra Ios órganos del huésped, principalmente piel, hígado e intestino. Aproximadamente el 30-50% de Ios pacientes que reciben un TPH de un donante familiar desarrollan EICH aguda, aunque este porcentaje se incrementa hasta
el 40-80% en aquellos pacientes que reciben un TPH de un donante no emparentado (Hurley y col. Biol Blood Marrow Transplant. 2003, 9(10): 610-615; Petersdorf y col. Blood. 1998, 92(10): 3515-3520). Además, hasta un 80% de pacientes con EICH aguda presentan recaída tras remisión completa o refractariedad a la primera línea de tratamiento, habitualmente corticoides. En diversos estudios se ha descrito que únicamente un 38% de enfermos se encuentran vivos y en remisión a las 6 semanas de haber recibido tratamiento con corticoides por EICH (Arai y col. Biol Blood Marrow Transplant. 2002, 8(3): 155-160). La ausencia de respuesta a la primera línea de tratamiento condiciona un pronóstico aún más grave y, aunque con algunos fármacos se han descrito un elevado porcentaje de respuestas, a largo plazo el porcentaje de pacientes vivos es únicamente del 5-15% debido a recidivas o progresión de la EICH o al desarrollo de complicaciones infecciosas en el contexto del tratamiento inmunosupresor (Weisdorf y col. Blood. 1990, 75(4): 1024-1030; Przepiorka y col. Blood. 2000, 95(1): 83 89).
La FEC es una técnica inmunomoduladora excelentemente tolerada que se ha demostrado eficaz en el tratamiento de la EICH, tanto aguda como crónica, aunque representa un tratamiento de segunda línea. A pesar que existen en la naturaleza otras furanocumarinas, actualmente el protocolo de la FEC únicamente se está llevando a cabo mediante la administración de la furanocumarina 8-MOP como agente fotoquimioterapéutico para el tratamiento de la EICH.
En este sentido, son conocidas en el estado de la técnica diversas patentes relacionadas con la FEC basadas en la administración de la furanocumarina 8-MOP para el tratamiento de la EICH, enfermedades atópicas o autoinmunes, rechazo de trasplantes, etc. La patente EP2443922B1 hace referencia a un método in vitro de generación de linfocitos con actividad reguladora (Treg) que comprende incubar leucocitos autólogos CD4+ con células mononucleares apoptóticas autólogas obtenidas a partir de sangre periférica por un procedimiento de FEC, empleando en dicho procedimiento derivados de psoraleno fotoactivables, como el 8-MOP, y luz UVA como fotoactivador. Dicha patente describe también el uso de los linfocitos Treg obtenidos para el tratamiento de un paciente con EICH. En la solicitud de patente internacional W09736581A1 se divulga el tratamiento de infecciones de las células mononucleares por medio de FEC empleando 8-MOP y luz UVA. La fracción de sangre tratada se reinfunde en el paciente para modular la función de los monocitos y/o estimular la respuesta inmunológica del paciente contra la población de células infectadas. En la solicitud de patente internacional WO03045979A2 se hace referencia al tratamiento con células apoptóticas obtenidas, por ejemplo, a partir de linfocitos T, de individuos con predisposición a sufrir una enfermedad atópica o autoinmune, así como de individuos con EICH. Al igual que en las divulgaciones anteriores, las células apoptóticas se obtienen mediante FEC y son tratadas con 8-MOP u otros derivados del mismo por sustitución, y radiación UVA. Adicionalmente, Zheng y col. (Zheng y col. Biochem Biophys Res Commun. 2010; 395: 540-546) describen una estrategia terapéutica para evitar el rechazo de un trasplante cardiaco que comprende la aplicación de FEC a las células inmunes del donante. Se tratan los leucocitos obtenidos de la sangre del donante con 8-MOP, sometiendo después la mezcla a radiación UVA. Estas células tratadas se exponen a la acción fagocítica de las células dendríticas inmaduras del receptor. Los autores demuestran que las células dendríticas que han incorporado las células tratadas retienen su fenotipo inmaduro con una baja capacidad de estimular las células T “naive” del receptor y, al ser infundidas en este último, promueven la supervivencia al trasplante en ausencia de tratamiento con fármacos inmunosupresores, induciendo además la generación de células T reguladoras CD4+CD25altoFoxp3+.
A pesar de la existencia de dichos tratamientos combinados de FEC y 8-MOP, sigue existiendo la necesidad de desarrollar nuevos tratamientos más eficaces y/o con menos efectos secundarios para tratar pacientes que tienen enfermedades autoinmunes, principalmente mediadas por linfocitos T, hipersensibilidades atópicas o EICH, y para los que los tratamientos existentes no son tan efectivos como podrían ser de otro modo, pueden tener efectos secundarios graves, o son difíciles de administrar a los niveles en los que cada tratamiento se administra por sí mismo.
DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN
El presente documento se refiere a una composición que comprende la combinación de dos furanocumarinas, psoraleno y angelicina, así como a la combinación per se de psoraleno y angelicina. Asimismo el presente documento se refiere al uso de dicha composición o de dicha combinación, preferiblemente donde dicha composición es una composición farmacéutica, para el tratamiento de una amplia variedad de trastornos o enfermedades de base inmunológica, sin limitación, enfermedades autoinmunes preferentemente mediadas por linfocitos T, enfermedad de injerto contra huésped (EICH), trasplante de órganos sólidos y/o tejidos, linfoma de células T, entre otras; donde dicho tratamiento es un tratamiento combinado con FEC, en el que la sangre de un paciente, o parte de ella, que es sometida a tratamiento con la composición o con la combinación de la invención, se expone a una luz de una longitud de onda que activa los compuestos fotoactivables que conforman la composición y la combinación de la invención.
Por lo tanto, en un primer aspecto, el presente documento se refiere a una composición, preferiblemente una composición farmacéutica, a partir de aquí se le llamará composición de la invención, que comprende una combinación de psoraleno y angelicina. Alternativamente, la presente invención también se refiere a la combinación per se de psoraleno y angelicina, que a partir de aquí también se le llamará combinación de la invención.
Tal y como se ha mencionado anteriormente, el término furanocumarina se aplica colectivamente a un gran número de compuestos que poseen el núcleo benzo-2-pirona (cumarina), con un anillo furánico unido en las posiciones 6 y 7 para las furanocumarinas lineales, y 7 y 8 para las angulares. Estos compuestos están presentes en las familias vegetales Leguminosas, Moráceas, Meliáceas, Compuestas, Solanáceas, Rutáceas, Umbelíferas y Apiáceas. Las furanocumarinas tienen un origen mixto, donde el núcleo cumarínico deriva de la ruta del ácido siquímico, pasando por el ácido trans-cinámico y finalizando con la umbeliferona. El anillo furánico proviene de la vía acetato-mevalonato, cuyo producto intermedio, el dimetilalilpirofosfato, se une a la umbeliferona para generar las furanocumarinas lineales (denominadas comúnmente psoralenos) y las angulares (denominadas angelicinas).
El psoraleno (C11H6O3 - Fórmula I) está estructuralmente relacionada con la cumarina por la adición de un anillo de furano, y puede ser considerado como un derivado de la umbeliferona.
Por otro lado la angelicina o isopsoraleno (C11H6O3 - Fórmula II) puede considerarse, estructuralmente como una benzapira-2-ona fusionada con una fracción de furano en la posición 7,8.
Ambos compuestos, psoraleno y angelicina, se producen de forma natural en ciertas especies de plantas de las familias Apiaceae, Leguminosae y Fabaceae, entre otras. Así, la composición y la combinación de la invención se puede preparar a partir de los compuestos psoraleno y angelicina obtenidos comercialmente o por síntesis o a partir de un proceso de purificación a partir de las semillas de las plantas que los contienen. En una realización más preferida, el psoraleno y la angelicina que comprenden la composición farmacéutica o la combinación de la presente invención se obtienen comercialmente.
El término "combinación” "composición” o "composición farmacéutica", utilizados indistintamente a lo largo de esta memoria, hacen referencia a cualquier sustancia usada para prevención, diagnóstico, alivio, tratamiento o curación de las enfermedades en el ser humano o en los animales. La composición farmacéutica de la invención puede utilizarse tanto sola, como en combinación con otros compuestos o composiciones farmacéuticas. Adicionalmente, los términos composición, composición farmacéutica, combinación y medicamento se utilizan en esta invención de manera indistinta. En el contexto de la presente invención la composición farmacéutica o el medicamento se caracterizan por comprender psoraleno y angelicina en una cantidad terapéuticamente activa. En la presente invención la expresión "cantidad terapéuticamente efectiva" se refiere a la cantidad de la combinación de psoraleno y angelicina calculada para producir el efecto deseado y, en general, vendrá determinada, para el caso de una composición terapéutica, por las características propias de los compuestos, la ruta, forma y frecuencia de administración de los mismos, y otros factores, incluyendo la edad, estado del paciente, así como la severidad de la alteración o trastorno.
En una realización particular, el psoraleno puede estar presente en la composición de la invención en un rango de concentración seleccionado de entre cualquiera de los siguientes: 50 a 700 ng/mL, 150 a 650 ng/mL, 200 a 600 ng/mL, 300 a 500 ng/mL, 200 a 400 ng/mL, y 250 a 350 ng/mL, más preferiblemente 200 a 400 ng/mL y de 250 a 350 ng/mL, más preferiblemente aún, entre 280 a 320 ng/mL y más preferiblemente todavía de 300 ng/mL.
En otra realización particular, la angelicina puede estar presente en la composición de la invención en un rango de concentración seleccionado de entre cualquiera de los siguientes: 50 a 1120 ng/mL, 150 a 1000 ng/mL, 200 a 900 ng/mL, 3250 a 800 ng/mL, 300 a 700 ng/mL, 350 a 600 ng/mL, 400 a 500 ng/mL y 450 a 490 ng/mL, más preferiblemente de 400 a 500 ng/mL, más preeriblemtne aún de 450 a 490 ng/mL, y más preeriblemtne todavía 480 ng/mL.
En otra realización más preferida, la proporción de psoraleno y angelicina presente en la composición de la invención está en un rango de 1:1 a 1:3,4; preferiblemente de 1:1 a 1:2, más preferiblemente de 1:1,2 a 1:1,8, más preferiblemente aún de 1:1,5 a 1: 1,6.
Alternativamente, las concentraciones y ratios de psoraleno y angelicina en la composición de la invención, se extrapolan de igual manera al uso de ambas moléculas en combinación, sin tener que formar parte de la composición de la invención.
El término "vehículo", al igual que el “excipiente”, hace referencia a una sustancia que se emplea en la composición farmacéutica o medicamento para diluir cualquiera de los componentes de la presente invención comprendidos en ella hasta un volumen o peso determinado. La función del vehículo es facilitar la incorporación de otros elementos, permitir una mejor dosificación y administración o dar consistencia y forma a la composición. Cuando la forma de presentación es líquida, el vehículo farmacológicamente aceptable es el diluyente. Los vehículos farmacéuticamente aceptables que pueden ser utilizados en la composición farmacéutica de la presente invención son los vehículos conocidos por los expertos en la materia.
Así pues, en una realización particular la composición de la invención comprende además uno o más excipientes o vehículos farmacéuticamente aceptables.
El término "farmacológicamente aceptable" o “farmacéuticamente aceptable”, utilizados indistintamente a lo largo del presente documento, se refieren a que el compuesto al que hace referencia esté permitido y evaluado, es decir es fisiológicamente tolerable y seguro, de modo que su administración no cause daño a los organismos a los que se administra. Preferiblemente, tal como se usa en el presente documento, la expresión "farmacéuticamente aceptable" significa que ha sido aprobado por una agencia reguladora del gobierno de estado o federal o que está enumerado en la Farmacopea Estadounidense u otra farmacopea generalmente reconocida para su uso en animales y más particularmente en seres humanos. Por tanto, la composición de la invención se encuentra libre de pirógenos y endotoxinas.
En otra realización particular, la composición de la invención se caracteriza porque es una solución acuosa.
En otra realización particular, la composición de la invención se caracteriza porque es una solución inyectable.
El psoraleno y la angelicina son compuestos fotoactivables o fotoactivos, lo que indica que en su estado natural se encuentran inactivos, pero que tras ser expuestos a luz de una longitud de onda específica se activan y ejercen su función terapéutica o efecto deseado en una célula diana (es decir, preferiblemente un cambio celular predeterminado). A efectos de la presente invención, dichos compuestos fotoactivables son activados preferiblemente por radiación de luz ultravioleta (UVA) de longitud de onda larga, por ejemplo, a una longitud de onda dentro del intervalo de 315 a 400 nm. La exposición a la luz UVA se lleva a cabo durante una duración temporal suficiente para administrar aproximadamente una dosis de 1-2 J/cm2 a la población celular. Cuando se activan, dichos compuestos farmacéuticos fotoactivables pueden efectuar cambios celulares que incluyen, pero no se limitan a, la apoptosis, la reorientación de las vías metabólicas, la regulación ascendente de ciertos genes, la regulación descendente de ciertos genes, la secreción de citoquinas, la alteración de las respuestas de los receptores de citoquinas, o combinaciones de los mismos.
Un aspecto particular incluye la presencia de un segundo medicamento en la composición de la invención. Dicho segundo medicamento puede formar parte de la composición o puede proporcionarse como una composición separada para la administración al mismo tiempo o en momentos diferentes.
En un segundo aspecto, la presente memoria se refiere a la composición farmacéutica de la invención para su uso como medicamento, preferiblemente, en combinación con un tratamiento de FEC. Alternativamente, la presente memoria también se refiere a la combinación de psoraleno y angelicina, combinación de la invención, para su uso como medicamento, preferiblemente, en combinación con un tratamiento de FEC.
En otro aspecto, la presente memoria se refiere a la composición farmacéutica de la invención para su uso en la prevención y/o tratamiento de una amplia variedad de trastornos o enfermedades de base inmunológica, sin limitación, enfermedades autoinmunes preferentemente mediadas por linfocitos T, EICH, trasplante de órganos sólidos y/o tejidos, linfoma de células T, entre otras, preferiblemente en combinación con un tratamiento de FEC. Alternativamente, la presente memoria también se refiere a la combinación de psoraleno y angelicina, combinación de la invención, para su uso en la prevención y/o tratamiento de una amplia variedad de trastornos o enfermedades de base inmunológica, sin limitación, enfermedades autoinmunes preferentemente mediadas por linfocitos T, EICH, trasplante de órganos sólidos y/o tejidos, linfoma de células T, entre otras, preferiblemente en combinación con un tratamiento de FEC.
Todas las definiciones mencionadas a lo largo del presente documento, aplican tanto al segundo como al tercer aspecto de la presente invención, así como a la combinación de psoraleno y angelicina, combinación de la invención.
A efectos de la presente memoria, un procedimiento o tratamiento de fotoaféresis extracorpórea (FEC), también conocido como fototerapia extracorpórea, se refiere a un tratamiento de una población de células que se ha sometido a un tratamiento con un compuesto o composición que comprende al menos un compuesto fotoactivable y luz UVA, capaz de activar dicho compuesto/composición. Preferentemente la población de células es de un órgano o tejido; más preferentemente, la población de las células es una población de células de la sangre, más preferentemente, la población celular es una población de células mononucleares de sangre periférica (MNCs). La FEC se usa algunas veces para referirse a un procedimiento en el que una población celular se ha sometido a un procedimiento inductor de apoptosis con luz UVA en presencia de al menos un agente fotoactivable, que a efectos de la presente invención se refiere a los componentes de la composición de la invención, el psoraleno y la angelicina. Una vez dicha población celular es sometida al tratamiento FEC es reinfundida nuevamente al sujeto o paciente.
A efectos de la presente memoria, las enfermedades o trastornos inmunológicos o de base inmunológica son preferentemente enfermedades autoinmunes mediadas por linfocitos T, que incluyen, sin limitación, trastornos como diabetes tipo 1, enfermedad de Crohn, lupus eritematoso sistémico, psoriasis, esclerosis múltiple, artritis reumatoide y tiroidosis, entre otros. Adicionalmente, dentro de las enfermedades de base inmunológica que se benefician del tratamiento con la composición de la presente invención se encuentran también la enfermedad de injerto contra huésped, los trasplantes de órganos sólidos y/o tejidos, tales como los trasplantes de corazón, riñón, hígado, pulmón, médula ósea, etc., las leucemias agudas y crónicas, los linfomas T cutáneos y las enfermedades atópicas que incluyen patologías inflamatorias crónicas tales como como sarcoidosis, enfermedad inflamatoria crónica del intestino y colitis ulcerosa, entre otras.
Así, a efectos de la presente invención, la composición de la invención se utiliza para el tratamiento ex vivo/in vitro de dichas patologías, mediante un procedimiento de leucoaféresis y fototerapia. Así, una muestra de sangre extraída de un sujeto que padece cualquiera de las patologías mencionadas anteriormente, en la que se aíslan las células mononucleares se pone en contacto con la composición de la invención y se somete a la radiación UVA para activar el psoraleno y la angelicina de la composición de la invención. Posteriormente, dichos leucocitos son reinfundidos al sujeto nuevamente.
Tal y como se muestra en los Ejemplos incluidos en el presente documento, tanto a nivel in vitro, como in vivo, se demuestra una eficacia terapéutica significativamente mayor del tratamiento con la composición de la invención, que comprende la combinación de psoraleno y angelicina, frente al tratamiento exclusivamente con el psoraleno 8-MOP. Todos los resultados mostrados en los Ejemplos evidencian una mayor efectividad in vitro de la composición de la invención frente a 8-MOP, en cuanto a determinadas funciones inmunomoduladoras, lo que confiere un mayor potencial terapéutico del uso de la composición de la invención en combinación con FEC. Por otro lado, los resultados in vivo mostrados en la presente memoria (Ejemplo 7) demuestran que la composición de la invención posee una eficacia terapéutica mayor a la del 8-MOP en la reversión de la EICH murina aguda mediante FEC.
En otro aspecto, la presente memoria se refiere a un procedimiento ex vivo/in vitro de generación de células apoptóticas, de aquí en adelante, procedimiento ex vitro/in vitro de la invención, en donde dicho procedimiento comprende:
a) Aislar la población de células de interés a partir de muestra biológica de sangre aislada de un sujeto, preferentemente las células de interés son células mononucleares;
b) Incubar las células aisladas en la etapa a) con la composición de la invención o con la combinación de la invención;
c) Irradiar las células de la etapa b) con luz UVA, y
d) Aislar las células obtenidas en la etapa c).
Este procedimiento de producción ex vivo/in vitro ofrece varias ventajas frente a los procedimientos conocidos en el estado de la técnica, inducidos por fármacos. Es importante destacar que se evitan los posibles efectos tóxicos y no naturales de los fármacos utilizados. Además, existen ventajas de la generación ex vivo/in vitro de células apoptóticas frente a la utilización in vivo de las mismas incluyendo, sin limitación, un mayor control frente al número, la actividad y la función de estas células. Este control terapéutico proporciona mejores protocolos de tratamiento al paciente.
A efectos de la presente memoria, el término "células apoptóticas", incluye células que presentan, o presentarán, una o más propiedades fenotípicas y/o funcionales que caracterizan el mecanismo de apoptosis. Una célula apoptótica puede comprender cualquier célula que esté en la fase de inducción, la fase efectora en la que se fragmenta el ADN, o la fase de destrucción nuclear y citoplásmica.
Los términos "in vitro" y "ex vivo” se refieren a que el procedimiento de la invención se realiza fuera del cuerpo del sujeto. Es decir, se realiza en una muestra biológica de un sujeto.
A efectos de la presente memoria, el término "muestra biológica” puede incluir, sin limitación, sangre completa o sus derivados tales como suero, plasma, plaquetas, eritrocitos y leucocitos. También la muestra puede incluir células únicas o una pluralidad o fragmentos de las mismas. Preferentemente, la muestra proviene de suero o plasma sanguíneo, células mononucleares de sangre periférica (MNCs) o sobrenadantes del cultivo de MNCs. Mas preferentemente, la muestra biológica son MNCs. La muestra puede ser obtenida de un paciente mediante punción venosa o cualquier otro procedimiento clínico conocido en el estado de la técnica.
Un "población celular" incluye generalmente un tipo celular encontrado en sangre. El término puede incluir uno o más tipos de células sanguíneas, específicamente, los eritrocitos, las plaquetas, y los leucocitos. Una población celular puede comprender subtipos de leucocitos, por ejemplo, linfocitos T, células dendríticas, linfocitos B, etc. En una realización particular, una población celular puede comprender una mezcla o reserva de tipos celulares. Alternativamente, una población celular puede comprender un tipo sustancialmente purificado de células, por ejemplo, linfocitos T o células dendríticas.
Los términos "sujeto" o "paciente" se usan intercambiablemente y se refieren a un animal, preferentemente a un mamífero y más preferentemente a un ser humano.
En la etapa a) del procedimiento ex vitro/in vitro de la invención, a partir de una muestra biológica aislada de un sujeto, mediante procedimientos conocidos por cualquier experto en la materia, se procede al aislamiento de la fracción o población de células de interés, que son preferiblemente células mononucleares de sangre periférica, para ser sometidas posteriormente a un tratamiento específico con la composición de la invención y luz UVA, para obtener las células apoptóticas de la invención. Dicho procedimiento de obtención de las células apoptóticas es un procedimiento in vitro/ex vivo, es decir, es un procedimiento que se lleva a cabo extracorpóreamente, fuera del cuerpo del sujeto, donante o receptor, y es compatible con dicho sujeto, donante, o receptor, respectivamente. Dicha población celular se puede preparar a partir de sustancialmente cualquier tipo de célula de mamífero incluyendo líneas celulares cultivadas. Por ejemplo, una población celular se puede preparar a partir de un tipo celular derivado del propio cuerpo del sujeto mamífero o a partir de una línea celular establecida. Específicamente, una población celular se puede preparar a partir de leucocitos de la sangre compatible con la del sujeto mamífero, más específicamente, de los propios leucocitos del sujeto e incluso más específicamente, de los propios linfocitos T del sujeto. La población celular se puede preparar extracorpóreamente antes de la administración al sujeto, donante, o receptor. Así, en una realización, la muestra biológica de la sangre del sujeto, de la
sangre del receptor, o de la sangre del donante se puede retirar, por ejemplo por venopunción, y al menos una parte de las células mononucleares de la misma se puede someter extracorpóreamente a las condiciones que inducen apoptosis.
Una vez obtenida la muestra de sangre periférica, ésta debe tratarse para aislar las células mononucleares. Cualquiera de los métodos existentes en el estado de técnica para aislar células mononucleares de sangre periférica o de sus hemoderivados puede emplearse en la puesta en práctica de la presente invención, por ejemplo, mediante centrifugación en Ficoll-Hypaque (GE Healthcare Bio-Science), Percoll, sacarosa, etc., así como cualquier otra técnica conocida y utilizada por aquellos de habilidad ordinaria en la técnica.
Una vez se tienen aisladas las células mononucleares, se procede en la etapa b) del procedimiento ex vitro/in vitro de la invención a la incubación de dichas células en presencia de la composición de la invención o de la combinación de la invención, que comprende los dos compuestos fotoactivables, el psoraleno y la angelicina y, de forma simultánea, se somete a la exposición a luz UVA. Los niveles en cuanto a concentración y tiempo de tratamiento apropiados para la inducción de apoptosis en la población celular y el tipo de tratamiento elegido para inducir apoptosis, exposición a luz UVA tal y como se indica en la presente invención, son fácilmente determinables por aquellos expertos en la técnica. Así, la población celular a la que se ha añadido la composición de la invención o la combinación de la invención, se trata con una luz de una longitud de onda que activa los compuestos fotoactivables psoraleno y angelicina. La etapa de tratamiento que activa la composición de la invención se lleva a cabo preferentemente usando luz ultravioleta (UVA) de longitud de onda larga, por ejemplo, a una longitud de onda dentro del intervalo de 315 a 400 nm. La exposición a luz UVA durante el tratamiento de fotoaféresis tiene una duración temporal suficiente para administrar aproximadamente de 1-2 J/cm2 a la población celular. El aparato de FEC útil en la invención incluye cualquier dispositivo utilizado para llevar a cabo dicha terapia.
Procedimientos para la detección y cuantificación de apoptosis son útiles para determinar la presencia y el nivel de apoptosis en la población celular sometida al tratamiento con la composición de la invención y la irradiación con luz UVA. El número de células apoptóticas en una población celular requerido para obtener el beneficio clínico en un sujeto puede variar dependiendo de la fuente de las células, la afección del sujeto, la
edad y el peso del sujeto y otros factores relevantes, que son fácilmente determinables mediante procedimientos conocidos.
En una realización particular del del procedimiento ex vitro/in vitro de la invención, este se caracteriza porque las células apoptóticas son autólogas.
En otra realización particular del procedimiento ex vivo/in vitro de la presente invención, éste se caracteriza por que las células apoptóticas autólogas son leucocitos.
En otra realización particular del procedimiento ex vivo/in vitro de la presente invención, éste se caracteriza por que las etapas de incubación e irradiación se llevan a cabo durante un tiempo calculado de forma automática por el dispositivo fotoactivador de FEC y en condiciones suficientes para generar las células apoptóticas.
Otro aspecto de la presente invención se refiere a las células apoptóticas, de ahora en adelante, célula apoptótica de la invención, obtenidas u obtenibles por el método de producción ex vivo/in vitro de células apoptóticas de la invención.
En una realización preferida, las células apoptóticas de la invención son útiles como medicamento. En otra realización más preferida, las células apoptóticas de la invención son útiles en la prevención y/o tratamiento de una amplia variedad de trastornos o enfermedades de base inmunológica, sin limitación, enfermedades autoinmunes preferentemente mediadas por linfocitos T, enfermedad de injerto contra huésped (EICH), trasplante de órganos sólidos y/o tejidos, linfoma de células T, entre otras, , preferiblemente en combinación con un tratamiento de FEC, tal y como se ha descrito a lo largo del presente documento.
Otro aspecto de la presente invención se refiere a un método de prevención y/o tratamiento de una amplia variedad de trastornos o enfermedades de base inmunológica, sin limitación, enfermedades autoinmunes preferentemente mediadas por linfocitos T, enfermedad de injerto contra huésped (EICH), trasplante de órganos sólidos y/o tejidos, linfoma de células T, preferiblemente en combinación con un tratamiento de FEC, tal y como se ha descrito a lo largo del presente documento, en un sujeto, de aquí en adelante, método de prevención y/o tratamiento de la presente invención, en el que dicho método comprende:
a) Contactar una muestra biológica aislada de dicho sujeto con la composición o la combinación de la invención;
b) Irradiar la muestra biológica de la etapa a) con un dispositivo fotoactivador, tal y como se ha descrito a lo largo del presente documento, y
c) Reinfundir la muestra biológica aislada irradiada de la etapa b) a dicho sujeto.
En una realización preferida método de prevención y/o tratamiento de la presente invención, la muestra biológica aislada es tal y como se ha definido en el presente documento. Preferiblemente es una muestra biológica aislada de sangre, y más preferiblemente una muestra biológica que comprende células mononucleares de sangre periférica.
Todos los términos utilizados en el método de prevención y/o tratamiento de la presente invención se han descrito previamente a lo largo del presente documento y aplican mutatis mutandis a dicho método de prevención y/o tratamiento de la invención.
A lo largo de la descripción y las reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o etapas. Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y características de la invención se desprenderán en parte de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Los siguientes ejemplos y dibujos se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de la presente invención.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
Figura 1. Muestra las fórmulas estructurales de las furanocumarinas psoraleno y angelicina, componentes de la composición PSA de la presente descripción. Ambos compuestos se clasifican como furanocumarinas, psoraleno con estructura lineal y angelicina con estructura angular.
Figura 2. Muestra el análisis de la inducción de apoptosis de células mononucleares humanas de sangre periférica (MNCs) tras someterse a un tratamiento con las furanocumarinas 8-MOP y PSA (psoraleno y angelicina - composición de la invención) y luz UVA. Las MNCs se incubaron con las concentraciones indicadas de cada furanocumarina en combinación con luz UVA (2 J/cm2). Tras incubación durante 48 horas a 37qC, se midieron los porcentajes totales de células apoptóticas (porcentaje de células anexina-V+ 7AAD- (apoptosis temprana) sumado al porcentaje de células anexina-V+ 7AAD+ (apoptosis tardía) mediante citometría de flujo. Los datos representan la media ± desviación estándar de 12 experimentos independientes. El porcentaje de apoptosis aumentó significativamente, ***p<0,001, comparado con los niveles de apoptosis alcanzados tras el tratamiento con 8-MOP y luz UVA en cada condición, respectivamente. En el eje X se indica la concentración de psoraleno expresada en ng/mL, tanto para el caso del 8-MOP, como para la concentración de dicho compuesto en la composición PSA de la invención. Hay que tener en cuenta que la relación psoraleno:angelilcina para la composición ensayada mostrada en la presente figura es de 1:1,6.
Figura 3. Muestra el análisis del tratamiento in vitro con distintas furanocumarinas y luz UVA en la proliferación de MNCs tras cultivos mixtos con células dendríticas mieloides (DCs) alogénicas. Las MNCs tratadas con las distintas furanocumarinas (300 ng/mL de 8-MOP o PSA (composición de la invención: 300 ng/mL de psoraleno y 480 ng/mL de angelicina)) y luz UVA (2 J/cm2) fueron utilizadas como células respondedoras en cultivos mixtos de leucocitos en presencia de DCs inmaduras (íDCs) (A) o DCs maduras (mDCs) (B) estimuladoras y previamente irradiadas para impedir su proliferación. Tras co-cultivo durante 5 días a 37qC, la proliferación de las MNCs se determinó mediante incorporación de bromo-desoxiuridina (BrdU). Como control, también se muestra la proliferación basal de íDCs o mDCs irradiadas, o de las MNCs sin estimular con DCs. Los datos representan la media ± desviación estándar de 3 experimentos independientes realizados por triplicado para cada condición experimental. El nivel de proliferación de las MNCs disminuyó de forma significativa comparado con las MNCs no tratadas previamente con ninguna furanocumarina (-PSOR), **p<0,01, o disminuyó significativamente comparado con las MNCs tratadas previamente con 8-MOP, ap<0,05, respectivamente.
Figura 4. Muestra el análisis de los niveles de citoquínas pro-inflamatorias y anti inflamatorias obtenidas en co-cultivos de íDCs o mDCs con MNCs alogénicas pre tratadas con las diferentes furanocumarinas (300 ng/mL de 8-MOP o PSA (composición de la invención: 300 ng/mL de psoraleno y 480 ng/mL de angelicina)) y luz UVA (2 J/cm2). El sobrenadante de cultivos mixtos de íDCs o mDCs y MNCs tratadas con las distintas furanocumarinas y luz UVA fue recogido y analizado para determinar los niveles de diferentes citoquínas pro-inflamatorias (IFNy, IL-2 e IL-12p70) (A) y anti-inflamatorias (IL-10 y TGFp) (B) mediante kits de ELISA. Los datos se muestran como el cambio porcentual (media ± desviación estándar) de la concentración de cada citoquina referida al control, que se normalizó al 100%, y se obtuvieron en tres experimentos independientes, cada uno realizado por triplicado. El nivel de cada citoquina disminuyó significativamente, *p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001 o aumentó significativamente, #p<0,05, ##p<0,01, ###p<0,001, en comparación con las condiciones en ausencia de furanocumarinas (-PSOR), respectivamente. El nivel de cada citoquina disminuyó significativamente, ap<0,05, aap<0,01, aaap<0,001 o aumentó significativamente, 5p<0,05, 555p<0,001, en comparación con el tratamiento con 8-MOP, respectivamente.
Figura 5. Muestra el análisis del nivel de migración de íDCs (A) o mDCs (B) tras su co cultivo con MNCs pretratadas con las distintas furanocumarinas (300 ng/mL de 8-MOP o PSA (composición de la invención: 300 ng/mL de psoraleno y 480 ng/mL de angelicina)) y luz UVA (2 J/cm2) en respuesta a la quimioquina CCL21. Las íDCs o mDCs co-cultivadas con MNCs pretratadas con las diferentes furanocumarinas y luz UVA fueron sometidas a ensayos de migración en respuesta a la quimioquina CCL21 o en respuesta a medio de cultivo sin quimioquina como control negativo (Medio). El nivel de migración de íDCs o mDCs se analizó mediante citometría de flujo. Los datos representan la media ± desviación estándar obtenidos en cuatro experimentos independientes realizados por triplicado. El nivel de migración de DCs en respuesta a CCL21 aumentó de forma significativa, ♦♦♦p<0,001. El nivel de migración aumentó significativamente, ###p<0,001 o disminuyó significativamente, ***p<0,001 en comparación con íDCs o mDCs co-cultivadas con MNC sin pretratar con furanocumarina (-PSOR), respectivamente. Además, el nivel de migración de íDCs o mDCs aumentó significativamente, 5p<0,05 o disminuyó significativamente, aaap<0,001, en comparación con el tratamiento con 8-MOP, respectivamente.
Figura 6. Muestra el análisis mediante citometría de flujo del nivel de expresión de moléculas co-estímuladoras y de maduración de DCs, MHC de clase II y receptores de quimioquinas en íDCs o mDCs tras su co-cultivo con MNCs alogénicas pretratadas con furanocumarinas (300 ng/mL de 8-MOP o PSA (composición de la invención: 300 ng/mL de psoraleno y 480 ng/mL de angelicina)) y luz UVA (2 J/cm2). (A) Las íDCs o mDCs fueron co-cultivadas en cultivos mixtos con MNCs conjuntamente con las MNC pretratadas con furanocumarinas y luz UVA y se analizaron posteriormente para determinar la expresión de moléculas co-estímuladoras y de maduración características de DCs mieloides (CD80, CD83 y CD86) y del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) de clase II (HLA-DR) mediante citometría de flujo. Para el análisis de las diferentes poblaciones celulares, las íDCs y mDCs con expresión positiva de los marcadores CD45, BDCA-1 y HLA-DR fueron seleccionadas. Para las íDCs (columna izquierda), los números insertados en los histogramas representan el porcentaje de células BDCA-1+ CD83baj0, mientras que para las mDCs (columnas del centro), los
porcentajes representan la población celular BDCA-1+ con una alta expresión de CD80, CD83 y CD86, respectivamente. Para el análisis de expresión de HLA-DR (columna derecha), los números insertados en los histogramas representan los valores medios de intensidad de fluorescencia de la población de mDCs BDCA-1+ HLA-DRalt0. (B) Los diagramas de bandas de puntos muestran la expresión del receptor de quimioquinas CCR7 en íDCs (panel izquierdo) o mDCs (panel derecho) y positivas para la expresión de CD45, BDCA-1 y HLA-DR después de ser co-cultivadas con MNCs pretratadas con las distintas furanocumarinas y luz UVA. Los números insertados en los paneles representan los valores medios de intensidad de fluorescencia de la expresión de CCR7 para cada condición. Los datos mostrados son representativos de tres experimentos independientes.
Figura 7. Muestra el análisis mediante citometría de flujo de los niveles de células T reguladoras (Treg) inducidos tras co-cultivo con íDCs previamente co-cultivadas con MNCs pretratadas con furanocumarinas (300 ng/mL de 8-MOP o PSA (composición de la invención: 300 ng/mL de psoraleno y 480 ng/mL de angelicina)) y luz UVA (2 J/cm2). Las MNCs alogénicas pretratadas con furanocumarinas y luz UVA fueron co-cultivadas con íDCs durante 5 días a 37qC. Posteriormente, las mismas íDCs fueron lavadas y co cultivadas con células T CD3+ autólogas para analizar el nivel de diferenciación hacia células Treg. (A) Los números insertados en los histogramas representan los porcentajes de células Treg CD3+ CD4+ CD25+ CD127- FoxP3+ o (B) células Treg CD3+ CD8+ CD25+ FoxP3+, respectivamente.
Los datos mostrados son representativos de tres experimentos independientes.
Figura 8. Muestra el porcentaje de supervivencia y grado clínico de ratones con EICH aguda y tratados mediante FEC con 8-MOP (300 ng/mL), PSA (composición de la invención: 300 ng/mL de psoraleno y 480 ng/mL de angelicina) y luz UVA (2 J/cm2), o sin tratar con furanocumarinas (-PSOR). (A) Los ratones de la cepa C57BL/6J fueron trasplantados con células de médula ósea y esplenocitos alogénícos de ratones de la cepa BALB/c para inducirles EICH aguda. Posteriormente, los ratones C57BL/6J trasplantados fueron tratados con cuatro infusiones semanales de esplenocitos aislados a partir de distintas cohortes de ratones C57BL/6J sin tratar (-PSOR) o tratados mediante FEC con las distintas furanocumarinas (8-MOP o PSA) y luz UVA. La supervivencia de los ratones C57BL/6J con EICH aguda aumentó significativamente en comparación con el grupo de animales no tratado (-PSOR), ***p<0,001, o en comparación con los tratados con 8-MOP, ap<0,05, respectivamente. Como control también se muestra el porcentaje de supervivencia de los animales C57BL/6J solamente irradiados (Control irradiación) o
trasplantados solamente con células de médula ósea (Control trasplante MO). Las curvas de supervivencia son representadas como estimaciones Kaplan-Meier y analizadas mediante el test estadístico Mantel-Cox. (B) El grado clínico de EICH aguda para cada grupo experimental fue calculado utilizando un sistema de puntuación clínica consistente en cinco variables individuales (pérdida de peso, postura, actividad, textura del pelaje e integridad de la piel, índice máximo=10). El grado clínico de EICH disminuyó de forma significativa en comparación con el grupo de animales no tratados (-PSOR), ***p<0,001, o en comparación con los tratados con 8-MOP, ap<0,05, respectivamente. Los distintos grupos experimentales se constituyeron con un total de 16 animales/grupo y muestran los resultados de 10 experimentos independientes.
Figura 9. Muestra imágenes del daño histopatológico asociado a EICH aguda en los principales órganos diana de la enfermedad (piel, hígado e intestino) de los diferentes grupos de animales tratados mediante FEC con 8-MOP (300 ng/mL), PSA (composición de la invención: 300 ng/mL de psoraleno y 480 ng/mL de angelicina) y luz UVA (2 J/cm2),
o sin tratar con furanocumarina (-PSOR) mediante tinción con hematoxilina y eosina (H&E). El nivel de daño histopatológico fue evaluado por un anatomo-patólogo experto en áreas distantes de muestras de piel, hígado e intestino de los animales de los distintos grupos experimentales el día 30 post-trasplante. Las imágenes mostradas de tinción H&E de los distintos órganos (aumento x100) son representativas de cinco animales por grupo experimental.
EJEMPLOS
A continuación, se ilustrará la invención mediante unos ensayos realizados por los inventores, en los que pone de manifiesto la efectividad del producto de la invención. Los siguientes ejemplos sirven para ilustrar la invención y no deben ser considerados como limitativos del alcance de la misma.
MATERIALES Y MÉTODOS
Células y reactivos empleados.
Se aislaron MNCs de sangre periférica humana heparinizada, obtenida de voluntarios sanos después de la firma del consentimiento informado, usando un gradiente de densidad en Ficoll-Paque (Sigma-Aldrich, St. Louís, Missouri, Estados Unidos). El Comité
Ético del Hospital Clínico Universitario Virgen de la Arrixaca (Murcia) aprobó los protocolos utilizados para la obtención y tratamiento de las muestras humanas. Las MNCs se cultivaron en medio de cultivo RPMI1640 (Gibco Invitrogen, Paisley, Escocia) suplementado con penicilina/estreptomicina (PAA Laboratories, Pasching, Austria), L-glutamina (PAA Laboratories) y suero fetal bovino (FBS) al 10% (Gibco Invitrogen) (medio de cultivo completo). Los monocitos se purificaron a partir de muestras de sangre periférica humana utilizando un cóctel de enriquecimiento de monocitos humanos (StemCell Technologies, Grenoble, Francia) siguiendo el protocolo del fabricante.
Para la diferenciación de células dendríticas mieloides inmaduras (íDCs), los monocitos se resuspendieron a 1x106 células/ml y se cultivaron en un medio de cultivo completo que contenía 50 ng/ml de GM-CSF (Invitrogen) y 25 ng/ml de IL-4 (Invitrogen) en placas de cultivo de 6 pocilios de fondo plano. Se agregaron las citoquinas GM-CSF e IL-4 al cultivo cada 3 días, durante 7 días. El día 7, más del 95% de las células eran CD14- CD11c+ CD1a+ BDCA-1+.
Las células dendríticas mieloides maduras (mDCs) se obtuvieron a partir de íDCs cultivadas durante 6 días como se ha descrito anteriormente y tras su posterior estimulación con 200 ng/ml de lipopolísacárido (LPS) (Sigma-Aldrich) durante 24 horas adicionales.
Para los ensayos de inducción in vitro de células T CD4+ y CD8+ reguladoras, las células T CD3+ de la fracción de MNCs de muestras de sangre periférica se purificaron utilizando anticuerpos anti-CD3 humano conjugados con microesferas magnéticas (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Alemania) siguiendo las instrucciones del fabricante.
Tratamiento in vitro con las distintas furanocumarinas y luz UVA.
Las MNCs se incubaron en PBS suplementado con diferentes concentraciones de furanocumarinas (ver ejemplos a continuación), específicamente con la combinación de las furanocumarinas de la invención (PSA), y con 8-MOP, que es la furanocumarina utilizada en clínica. Dicho tratamiento se llevó a cabo en oscuridad a temperatura ambiente y las MNCs se irradiaron posteriormente con luz UVA utilizando una cámara de irradiación UVA (Dr. Grobel UV-Elektroník GmbH, Ettlingen, Alemania) a una dosis final de 2 J/cm2 y medida con un radiómetro equipado con un detector de radiación UVA (Dr.
Grobel UV-Elektronik GmbH). La dosis de luz UVA y la concentración de furanocumarinas empleadas fueron equivalentes a las utilizadas en los procedimientos clínicos de FEC. Tras el tratamiento con furanocumarinas y luz UVA, las MNCs se resuspendieron en medio de cultivo completo.
Las MNCs control no tratadas fueron incubadas con PBS sin furanocumarinas e irradiadas con luz UVA en las mismas condiciones. Todas las furanocumarinas utilizadas en los ejemplos descritos aquí, 8-MOP, psoraleno y angelicina, fueron obtenidos de Therakos (Uvadex™, Pennsylvania, Estados Unidos) y Sigma-Aldrich, respectivamente.
Análisis por citometría de flujo.
Las células se incubaron en oscuridad a 40C durante 30 minutos con anticuerpos monoclonales conjugados con fluorescencia y específicos para los marcadores de superficie CDIa, CD14, HLA-DR (eBioscience, San Diego, California, Estados Unidos), CD3, CD8, CD25, CD80, CD83, CD86, CD127, CD197 (CCR7) (BioLegend, San Diego, California, Estados Unidos), CD1c (BDCA-1), CD11c (Miltenyi Biotec), CD4 (Beckman Coulter, Fullerton, California, Estados Unidos) y CD45 (Immunostep, Salamanca, España).
Para la tinción intracelular del factor de transcripción FoxP3, las células se fijaron y permeabilizaron previamente utilizando el kit PerFix-nc (Beckman Coulter) y el anticuerpo monoclonal anti-FoxP3 conjugado con aloficocianina (eBioscience).
Posteriormente al mareaje con anticuerpos y lavados, las células se adquirieron usando un eitómetro de flujo Beckman Coulter Navios y finalmente, se analizaron con los programas de análisis Kaluza (Beckman Coulter) e Infinieyt (Cytognos, Salamanca, España). La fluorescencia basal no específica de las células se midió utilizando anticuerpos monoclonales de isotipo y fluorocromo específico.
Para la detección de apoptosis en MNCs después del tratamiento con las furanocumarinas y luz UVA, se utilizaron los reactivos anexina-V y 7-AAD conjugadas con fieoeritrina (BD Bioscienees, San Diego, California, Estados Unidos) siguiendo las instrucciones del fabricante.
Ensayos de migración celular en cámaras de tipo transwell.
Las MNCs fueron incubadas con las diferentes furanocumarinas y se irradiaron con luz UVA como se describió anteriormente. Posteriormente, estas MNC se cultivaron a 37qC con íDCs o mDCs alogénicas en medio de cultivo completo en una proporción de 5:1. Tras 5 días de co-cultivo, las iDC o mDC fueron aisladas y resuspendidas en medio de cultivo RPMI1640 suplementado con un 0,5% de albúmina sérica bovina (BSA) (Sigma-Aldrich) (medio de migración) y se sometieron a ensayos de migración a través de un filtro de policarbonato con un tamaño de poro de 5 .^m (transwells; Corning Costar, Cambridge, Massachusetts, Estados Unidos) en placas de cultivo de 24 pocilios. Se añadieron iDC o mDC a la cámara superior del transwell (3x105 células en 100 ql de medio de migración) mientras que la cámara inferior contenía 200 ng/ml de la quimioquina CCL21 (Invitrogen) en 600 ql de medio de migración o sólo medio de migración como control de migración espontánea.
El número de células que migraron a la cámara inferior tras incubación de 3 horas a 37qC se determinó en un citómetro de flujo (Beckrnan Coulter Navios). La migración celular se calculó como porcentaje de las células añadidas inicialmente a la cámara superior de cada transwell.
Ensayos de proliferación celular y análisis de secreción de citoquinas.
Las MNCs tratadas previamente con las diferentes furanocumarinas y luz UVA, y las íDCs o mDCs alogénicas fueron utilizadas en cultivos mixtos de linfocítos (MLCs) como células respondedoras y estimuladoras, respectivamente, en proporción 5:1 durante 5 días a 37qC. Para evitar la proliferación de las íDCs o mDCs estimuladoras, éstas se irradiaron previamente en un irradiador de rayos X Yxlon Smart 200E (Yxlon International GmbH, Hamburgo, Alemania) con una dosis total de 30 Gy.
La proliferación celular se determinó usando un kit colorimétrico ELISA bromodesoxiuridina (BrdU) (Roche Diagnostics, Mannheim, Alemania) basado en la medición de la incorporación de BrdU durante la síntesis de ADN en células en proliferación. Brevemente, se añadió reactivo de mareaje BrdU a los pocilios 16 horas antes de la determinación. Posteriormente, las células se fijaron, se desnaturalizó el ADN y se incubaron con un anticuerpo anti-BrdU conjugado con peroxídasa. Tras el lavado y la
adición del sustrato, se midió la absorbancia a 450 nm con un lector de placas Tecan Infinite M200Pro (Tecan, Mannedorf, Suiza). Todos los experimentos fueron realizados por triplicado.
Para cuantificar las citoquinas liberadas en los MLCs, se recolectaron los sobrenadantes de cultivo el día 5 antes de la adición de BrdU y se congelaron a -80oC hasta su posterior análisis. Los niveles de IFNy, IL-2, IL-12p70, IL-10 y TGFp humanos se midieron mediante kits de ELISA específicos (eBioscience), siguiendo las instrucciones y protocolos recomendados por el fabricante.
Inducción in vitro de células T CD4+ y CD8+ reguladoras.
Las MNCs tratadas previamente con las distintas furanocumarinas y luz UVA se cultivaron en MLC con íDCs alogénicas en medio de cultivo completo a 37oc durante 5 días en una proporción de 5:1 en placas de cultivo de 96 pocilios de fondo redondo. Posteriormente, las mismas íDCs fueron aisladas y cultivadas con células T CD3+ autólogas a 37oC durante 5 días adicionales en una proporción de 1:5. Finalmente, se midieron los niveles de las células T reguladoras CD4+ y CD8+ inducidas mediante citometría de flujo tal y como se ha descrito anteriormente.
Modelo murino de EICH aguda,
Se realizó un trasplante alogénico de células progenitoras hematopoyéticas o TPH alogénico con disparidad completa en el sistema mayor de histocompatibilidad H2 murino consistente en trasplantar células de médula ósea y esplenocitos de ratones BALB/c donantes (haplotipo H2d) en ratones receptores (haplotipo H2b) de 10 semanas de edad previamente irradiados con una dosis potencialmente letal de 10 Gy dividida en dos dosis de 5 Gy espaciadas 24 horas y a una intensidad de 1 Gy/mínuto (días -1 y 0). El día 0, los ratones C57BL/6J receptores se trasplantaron por vía intravenosa con 1x107 células de médula ósea y 1,5x107 esplenocitos de ratones BALB/c donantes para inducir la EICH aguda.
Para realizar el tratamiento de los distintos grupos de animales mediante FEC, los días 7, 14, 21 y 28 post-trasplante los animales recibieron una infusión intravenosa adicional de 1x107 esplenocitos pretratados con las distintas furanocumarinas (8-MOP (300 ng/mL) o PSA (composición de la invención: 300 ng/mL de psoraleno y 480 ng/mL de angelicina) y luz UVA (2 J/cm2), los cuales fueron previamente aislados a partir de distintas cohortes de ratones C57BL/6J trasplantados en las mismas condiciones y en el día 12 post-trasplante. El grupo control de animales no tratado mediante FEC (-PSOR) recibió la misma dosis semanal de esplenocitos pretratados con luz UVA pero sin furanocumarinas. La supervivencia de los animales post-trasplante se controló diariamente, mientras que el grado clínico de EICH se evaluó utilizando un sistema de puntuación formado por cinco parámetros individuales (pérdida de peso, postura, actividad, textura del pelaje e integridad de la piel). A cada parámetro individual se le da una puntuación entre 0 y 2, siendo la puntuación total máxima un valor de 10.
Los diferentes grupos experimentales (-PSOR, 8-MOP y PSA) estuvieron formados por un total de 16 animales. Los datos de supervivencia y grado clínico de EICH aguda fueron analizados con los test estadísticos Mantel-Cox y T de Student, respectivamente.
El análisis histopatológico de la EICH aguda se realizó en al menos dos áreas distantes de los principales órganos diana de la enfermedad, fundamentalmente hígado, intestino (colon) y piel.
Para la valoración de la piel se utilizaron los siguientes criterios: grado 0 (normal), grado I (degeneración vacuolar de células del estrato basal de la epidermis), grado II (espongiosis y presencia de células apoptóticas dispersas individuales en la epidermis basal), grado III (separación de la unión dermo-epitelial) y grado IV (ulceración difusa y severa, destrucción extensa de la epidermis).
En el caso del hígado fue la siguiente: grado 0 (normal), grado I (daño epitelial y destrucción de <25% de los ductos biliares), grado II (daño epitelial y destrucción de 25-49% de los ductos biliares), grado III (daño epitelial y destrucción de 50-74% de los ductos biliares) y grado IV (daño epitelial y destrucción de >75% de los ductos biliares).
Para intestino se utilizó la siguiente valoración: grado 0 (normal), grado I (presencia de células apoptóticas dispersas individuales y de infiltrado de células inflamatorias en la base de las criptas intestinales), grado II (aplanamiento de vellosidades intestinales, presencia de criptas explosivas), grado III (ulceración focal de la mucosa) y grado IV (ulceración difusa y severa de la mucosa).
Análisis estadístico.
Los datos se analizaron estadísticamente mediante análisis de la varianza (ANOVA) de una vía, seguido de corrección post hoc de Bonferroni para comparaciones múltiples. Para todos los estudios se consideró significativo un valor de p menor de 0,05. Todos los valores se expresaron como media ± desviación estándar. Las curvas de supervivencia fueron representadas como estimaciones Kaplan-Meier y analizadas mediante el test estadístico Mantel-Cox. Para los análisis se utilizaron los programas informáticos GraphPad Prism (GraphPad Software, San Diego, California, Estados Unidos) y Microsoft Excel (Microsoft, Redmond, Washington, Estados Unidos).
Ejemplo 1, Análisis de la actividad apoptótica de la composición de la invención
Como se ha mencionado a lo largo del presente documento, las furanocumarinas son compuestos inductores de apoptosis tras irradiación con luz UVA. Teniendo esto en cuenta, se analizó la efectividad in vitro de la mezcla de las furanocumarinas psoraleno y angelicina (PSA) de la invención en la inducción de apoptosis de MNCs, obtenidas como se ha descrito previamente. Se utilizó una mezcla de psoraleno y angelicina (PSA) en una proporción de 1:1,6 y se comparó su efectividad con la mostrada por el compuesto 8-m o p .
Las MNCs fueron incubadas in vitro en presencia de furanocumarinas en un rango de concentraciones que va de 0 ng/ml a 700 ng/ml de 8-MOP, más concretamente se ensayaron concentraciones de 0 ng/mL, 50 ng/mL, 100 ng/mL, 200 ng/mL, 300 ng/mL, 400 ng/mL, 500 ng/mL, 600 ng/mL y 700 ng/mL de 8-MOP; y para el caso del tratamiento con la composición PSA de la invención las dosis ensayadas de psoraleno y angelicina variaron de entre 0 ng/mL a 700 ng/mL de psoraleno y de entre 0 ng/mL a 1120 ng/mL de angelicina manteniendo siempre una proporción 1:1,6 entre ambas moléculas (ver Figura 2) por lo que las concentraciones ensayadas de ambos componentes en la composición de la invención fueron: 50 ng/mL psoraleno 80 ng/mL angelicina, 100 ng/mL psoraleno 160 ng/mL angelicina, 200 ng/mL psoraleno 320 ng/mL angelicina, 300 ng/mL psoraleno 480 ng/mL de angelicina, 400 ng/mL de psoraleno 640 ng/mL de angelicina, 500 ng/mL de psoraleno 800 ng/mL de angelicina, 600 ng/mL de psoraleno 960 ng/mL de angelicina, y 700 ng/mL psoraleno 1120 ng/mL angelicina. Dichos tratamientos se llevaron a cabo en combinación con la irradiación con luz UVA (dosis de 2 J/cm2 calculada de forma automática por el irradiador de luz UVA). Tras 48 horas de cultivo, se determinaron los porcentajes totales de células apoptóticas mediante la unión de anexina-V y 7-AAD (anexina-V+/7AAD- (apoptosis temprana) y anexina-V+/7AAD+ (apoptosis tardía)) mediante citometría de flujo, tal y como se ha explicado previamente.
Los resultados obtenidos ponen de manifiesto que la incubación de MNCs con 8-MOP y luz UVA (a una dosis de 2 J/cm2) produjo un aumento progresivo dosis-dependiente del porcentaje de células apoptóticas, desde un valor basal de apoptosis tras 48 horas del 34% hasta un valor máximo de 59,7% a la concentración de 500 ng/ml. Sin embargo, la mezcla de furanocumarinas PSA de la invención fue más eficiente en la inducción de apoptosis que 8-MOP, obteniendo un porcentaje de células apoptóticas del 72% con la composición PSA de la invención que comprende una concentración de 500 ng/mL de psoraleno más 800 ng/mL de angelicina, siendo significativas las diferencias con 8-MOP desde una concentración de 50 ng/mL de psoraleno más 80 ng/mL de angelicina (*** p<0,001) (Figura 2).
Ejemplo 2. Análisis de la proliferación de MNCs tras cultivo mixto con DCs alogénicas
Es conocido que la unión de las furanocumarinas al ADN previene la respuesta proliferativa de las células T humanas en respuesta a una estimulación mitogénica o antigénica. Para analizar la capacidad de la mezcla de furanocumarinas PSA de la invención para inducir la función tolerogénica de células dendríticas en cultivo, se llevaron a cabo cultivos mixtos de células dendríticas inmaduras (íDCs) o maduras (mDCs) con MNCs alogénicas previamente tratadas in vitro con la mezcla PSA de la invención (composición de la invención: 300 ng/mL de psoraleno y 480 ng/mL de angelicina) o con 8-MOP (300 ng/mL) junto con luz UVA (2 J/cm2), o ausencia de tratamiento (solamente luz UVA, -PSOR).
Las íDCs o mDCs alogénicas fueron previamente irradiadas con rayos X (30 Gy) para evitar su proliferación. Tras ello se determinó la incorporación de bromo-desoxiuridina (BrdU) al ADN de las células en estado proliferativo.
Tal y como se puede observar en la Figura 3, los resultados obtenidos ponen de manifiesto que la ausencia de tratamiento con la furanocumarina (-PSOR), y tras su estimulación alogénica con íDCs o mDCs, da lugar a una elevada proliferación de las MNCs. Sin embargo, las MNCs pre-tratadas con 8-MOP o PSA más luz UVA y co cultivadas con íDCs o mDCs mostraron una reducción significativa de su proliferación respecto a MNCs no tratadas (**p<0,01). Cuando se emplearon mDCs como células estimuladoras de la proliferación, este grado de inhibición fue mayor y estadísticamente significativo cuando las MNCs fueron tratadas con PSA y luz UVA respecto al obtenido con 8-MOP (ap<0,05). Los datos representan la media ± desviación estándar de 3 experimentos independientes, analizando cada condición por triplicado.
Ejemplo 3. Análisis de las concentraciones de citoquinas tras el co-cultivo de DCs y MNCs alogénicas pretratadas con PSA y luz UVA.
Para analizar los factores solubles que podrían estar involucrados en los mecanismos inmunomoduladores y en la inducción de tolerancia periférica tras la FEC, se determinaron los niveles de diferentes citoquinas pro-inflamatorias y anti-inflamatorias en cultivos mixtos de MNCs pretratadas con 8-MOP (300 ng/mL) o PSA (composición de la invención: 300 ng/mL de psoraleno y 480 ng/mL de angelicina) más luz UVA (2 J/cm2) en un contexto alogénico con íDCs o mDCs.
Los sobrenadantes de dichos co-cultivos fueron recogidos y utilizados para la cuantificación de los niveles de las citoquinas pro-inflamatorias IFNy, IL-2 e IL-12 y las citoquinas anti-inflamatorias IL-10 y TGFp mediante técnicas de ELISA, tal y como se ha descrito previamente.
La secreción de citoquinas pro-inflamatorias IFNy, IL-2 e IL-12 fue significativamente menor cuando las MNCs del co-cultivo con íDCs o mDCs fueron pretratadas con 8-MOP o PSA y luz UVA respecto a los niveles detectados en ausencia de tratamiento con furanocumarina (-PSOR) (*p <0,05, **p <0,01 o ***p <0,001, respectivamente), siendo dicha producción significativamente aún menor cuando se trataron los cultivos con PSA en lugar de 8-MOP (ap <0,05, aap <0,01 o aaap <0,001, respectivamente) (Figura 4).
Por el contrarío, los niveles detectados de las citoquinas anti-inflamatorias TGFp e IL-10 fueron significativamente mayores cuando las MNCs fueron pretratadas con PSA respecto a MNCs sin tratar (#p <0,05, ##p <0,01 o ###p <0,001, respectivamente), o con PSA respecto a 8-MOP (5p <0,05 o 555p <0,001, respectivamente) (Figura 4). Los datos muestran la media ± desviación estándar de la concentración de cada citoquina normalizada respecto al control (-PSOR) de 3 experimentos independientes, analizando cada condición por triplicado.
Ejemplo 4. Migración de DCs tras su co-cuIíív o con MNCs pretratadas con PSA y luz UVA en respuesta a la quimioquina CCL21
Para un mejor conocimiento de los mecanismos implicados en la adquisición de tolerancia periférica mediante FEC, se analizó si el co-cultivo in vitro de íDCs o mDCs junto con MNCs pretratadas con furanocumarinas y luz UVA podría alterar su capacidad migratoria en respuesta a la quimioquina CCL21.
Las íDCs o mDCs fueron recogidas tras su co-cultivo durante 5 días con las MNCs pretratadas con las distintas furanocumarinas y luz UVA y, a continuación, se utilizaron en los ensayos in vitro de migración en transwell en respuesta a la quimioquina CCL21 durante 3 horas a 37qC, utilizando medio de cultivo sin quimioquina como control de migración espontánea.
Los resultados mostrados en la Figura 5 evidencian que las íDCs que fueron previamente co-cultivadas con MNCs sin tratar con furanocumarina no mostraron un aumento de migración en respuesta a la quimioquina CCL21, mientras que las que estuvieron en contacto con MNCs pretratadas previamente con 8-MOP o PSA y luz UVA mostraron un aumento significativo de su capacidad migratoria (###p <0,001). Adicionalmente, el tratamiento con PSA dio lugar a un aumento de la migración significativamente mayor que el tratamiento con 8-MOP (5p <0,05).
Por el contrarío, la migración de mDCs en respuesta a CCL21, que aumentó significativamente respecto a cuando la quimioquina estuvo ausente, disminuyó de forma significativa tras su co-cultivo con MNCs pretratadas con furanocumarinas y luz UVA (***p<0,001), siendo significativamente menor con PSA respecto a 8-MOP (aaap <0,001) (Figura 5). La migración fue cuantificada mediante citometría de flujo, y los datos representados como la media ± desviación estándar de 4 experimentos independientes, analizando cada condición por duplicado.
Estos resultados demuestran que el tratamiento con la mezcla PSA de la invención es más efectiva que el tratamiento con 8-MOP, específicamente respecto a la capacidad de migración de íDCs tolerogénicas a los ganglios linfáticos en respuesta a quimioquinas, así como en la capacidad de disminuir la migración de mDCs, que poseen una función inmunoestimuladora de la respuesta T efectora.
Ejemplo 5. Análisis de expresión de moléculas co-estimuladoras o de maduración, MHC de clase II y receptores de quimioquinas en DCs tras su co-cultivo con MNCs alogénicas pretratadas con PSA y luz UVA.
Para evaluar si las MNCs pretratadas con la combinación de furanocumarinas PSA de la invención y luz UVA podría afectar a la generación de DCs con un fenotipo tolerogénico tras su co-cultivo, se analizó in vitro el perfil de expresión de marcadores de maduración o con función co-estimuladora característico de las DCs, tanto en íDCs como mDCs, siendo dichos marcadores CD80, CD83, CD86 y de la molécula del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) de clase II HLA-DR.
Para el análisis de las distintas poblaciones celulares, las íDCs y las mDCs fueron seleccionadas por su positividad para los marcadores CD45, BDCA-1 y HLA-DR. En el caso de las íDCs se analizó el porcentaje de la población con el fenotipo BDCA-1 CD83baj0, mientras que en las mDCs se analizaron los porcentajes o la media de intensidad de fluorescencia de las poblaciones BDCA-1 CD80alt0, BDCA-1 CD83alt0, BDCA-1 CD86alt0 y BDCA-1+ HLA-DRalt0.
Por otro lado, el análisis de la expresión del receptor de quimioquinas CCR7 se llevó a cabo en las poblaciones de íDCs o mDCs con el fenotipo CD45+ BDCA-1+ HLA-DR+. Los datos muestran un resultado representativo de un total de tres experimentos independientes.
En la Figura 6A se puede observar que el fenotipo de las íDCs tras su co-cultivo con MNCs pretratadas con PSA y luz UVA no mostró cambios significativos de la expresión de CD80, CD86 o HLA-DR, aunque hubo una acumulación de íDCs expresando bajos niveles de CD83. Aunque está descrito que las íDCs expresan bajos niveles de CCR7, receptor de las quimioquinas CCL19 y CCL21 e implicado en la migración de las DCs a
los ganglios linfáticos, tras su co-cultivo con MNCs pretratadas con furanocumarinas y luz UVA, esta expresión se vio aumentada, aumento que fue mayor en el caso del tratamiento con PSA que con 8-MOP (Figura 6B).
Además, se observó una disminución del porcentaje de mDCs expresando altos niveles de CD80, CD83, CD86 y HLA-DR, que fue algo más acusada con PSA que con 8-MOP, así como una disminución de la media de intensidad de fluorescencia de la expresión de HLA-DR y CCR7, que fue más acusada con el tratamiento con PSA que con 8-MOP (Figura 6).
En conjunto, estos resultados sugieren que las íDCs tras su contacto con MNCs pretratadas con furanocumarinas mantienen su fenotipo inmaduro y adquieren un comportamiento más migratorio en respuesta a quimioquinas como consecuencia de un aumento de la expresión de su receptor CCR7, mientras que las mDCs pierden parte de sus moléculas co-estimuladoras y presentadoras de antígeno, así como su potencial migratorio a órganos linfoides secundarios.
Ejemplo 6. Inducción de células Treg tras co-cultivo con DCs previamente co cultivadas con MNCs pretratadas con la composición de la invención y luz UVA.
Estudios recientes han mostrado que la infusión de células apoptóticas en un procedimiento de FEC aumenta los porcentajes de células T reguladoras, siendo este hecho el más clínicamente relevante. Por ello, se analizó si las íDCs que habían estado previamente en contacto con MNCs alogénicas apoptóticas tras el tratamiento con la combinación de furanocumarinas PSA de la invención y luz UVA eran capaces de inducir in vitro, más eficientemente que 8-MOP, la diferenciación de diferentes subpoblaciones de células T reguladoras. Para ello se analizaron los niveles de las células T reguladoras con el fenotipo CD3+CD4+CD25+CD127-FoxP3+ y CD3+CD8+CD25+FoxP3+ mediante citometría de flujo. Los datos muestran un resultado representativo de un total de tres experimentos independientes.
Los resultados mostrados en la Figura 7 evidencian que las íDCs previamente cocultívadas con MNCs pretratadas con PSA y luz UVA estimularon un aumento de los niveles de células T CD4 reguladoras, desde un valor basal del 1,76% en ausencia de tratamiento con furanocumarina (-Psor) a un valor del 4,95% con 8-MOP, y de forma significativa, a un 6,69% con PSA. Utilizando el mismo protocolo de co-cultivos se observó que las íDCs que previamente habían sido co-cultivadas con MNCs apoptóticas por acción de las furanocumarinas y luz UVA fueron capaces de inducir la diferenciación de células T CD8 con fenotipo regulador, desde un valor basal de 0,02% en ausencia de tratamiento con furanocumarina a un valor de 0,27% con 8-MOP y 0,22% con PSA.
En conjunto, estos resultados sugieren que la mezcla de furanocumarinas PSA de la invención posee una mayor efectividad in vitro que 8-MOP en cuanto a determinadas funciones inmunomoduladoras, lo cual confiere un mayor potencial terapéutico a la FEC.
Ejemplo 7. Procedimiento terapéutico para la realización de la FEC mediante las células apoptóticas generadas tras el tratamiento de las mismas con PSA y luz u v a .
La puesta a punto del procedimiento ex vivo de generación de células apoptóticas para la posterior aplicación de las mismas al método de FEC se llevó a cabo en un modelo murino experimental de EICH aguda, basándonos en estudios previos (Gatza y coI., Blood 112, 2008, 1515-1521; Marques y Adarnski, J Clin Apheresis. 2014, 29, 228-234). La EICH aguda murina se realizó como se ha descrito previamente.
Para llevar a cabo el análisis de la curva de supervivencia post-trasplante, así como el grado clínico de EICH aguda, el día 30 post-trasplante los ratones de los diferentes grupos fueron sacrificados y sus diferentes órganos (piel, hígado e intestino) fueron fijados con paraformaldehído, incluidos en parafina y teñidos con hematoxilina y eosina.
Los resultados mostrados en la Figura 8 ponen de manifiesto que el tratamiento mediante FEC con 8-MOP o con la combinación PSA de la invención, dio lugar a un aumento significativo de la supervivencia y a una reducción del grado clínico de EICH aguda respecto al grupo de animales no tratado con furanocumarinas (-PSOR) (***p<0,001). Por otro lado, los animales tratados semanalmente con la combinación PSA de la invención mostraron un aumento significativo de su supervivencia respecto a los tratados con 8-MOP, obteniéndose una supervivencia del 68,75% en comparación con un 37,5% con 8-MOP a día 45 post-trasplante (ap <0,05).
Las imágenes mostradas en la Figura 9 son representativas de un total de 5 animales por grupo experimental (aumento: 100x). El grado histopatológico de EICH aguda fue determinado de forma ciega en diferentes áreas distantes de cada órgano por un patólogo experimentado, siguiendo criterios publicados previamente (Gatza y col., Blood 112, 2008, 1515-1521; Hill y col., Blood 1997, 90, 3204-3213). Tal y como se muestra en dicha figura, el tratamiento mediante FEC con 8-MOP o con la combinación PSA de la invención dio lugar a una disminución del grado histopatológico de EICH aguda respecto al grupo de animales no tratado (-PSOR), siendo aún menor con PSA que con 8-MOP. En el caso de la piel, los animales sin tratar con furanocumarina (-PSOR) muestran un grado IV de EICH aguda caracterizado por la separación de la unión dermo-epitelial y destrucción extensa de la epidermis, mientras que los tratados mediante FEC con 8-MOP
o PSA solamente se observan células apoptóticas dispersas en el estrato basal de la epidermis y cierto grado de espongiosis (grado ll-III o grado II, respectivamente). En hígado, los animales no tratados (-PSOR) muestran una destrucción casi total de todos los ductos biliares y una elevada infiltración leucocitaria epitelial (grado IV), mientras que los animales tratados mediante FEC con 8-MOP o PSA se observa una menor destrucción de ductos biliares y menor infiltración leucocitaria (grado III-lV o grado III, respectivamente). Finalmente, el intestino de los animales sin tratar (-PSOR) muestra una destrucción masiva de la mucosa, con denudación y atrofia de las vellosidades (grado Vl), mientras que los animales tratados mediante FEC con 8-MOP o PSA muestran un cierto grado de atrofia y células apoptóticas dispersas en la base de las criptas intestinales (grado III o grado ll, respectivamente). En la Tabla 1 se muestra un resumen de los hallazgos histopatológicos obtenidos en los distintos grupos experimentales.
Tabla 1. Grado histopatológico de EICH.
Estos resultados in vivo demuestran que la composición PSA de la invención que comprende psoraleno y angelicina, posee una eficacia terapéutica mayor a la del 8-MOP en la reversión de la EICH murina aguda mediante FEC.
Claims (12)
1. Composición que comprende una combinación de psoraleno y angelicina, para su uso en el tratamiento de enfermedades de base inmunológica, mediante fotoaféresis extracorpórea.
2. Composición para su uso según la reivindicación 1, en la que las enfermedades de base inmunológica se seleccionan de la lista que consiste en enfermedades autoinmunes mediadas por linfocitos T, episodios de rechazo de trasplantes de órganos sólidos y/o tejidos, linfomas T cutáneos, enfermedad de injerto contra huésped y enfermedades atópicas.
3. Composición para su uso según la reivindicación 2, en donde las enfermedades autoinmunes mediadas por linfocitos T se seleccionan de la lista que consiste en diabetes tipo 1, enfermedad de Crohn, lupus eritematoso sistémico, psoriasis, esclerosis múltiple, artritis reumatoide y tiroidosis; y las enfermedades atópicas incluyen preferiblemente enfermedades inflamatorias que se seleccionan de la lista que consiste en sarcoidosis, enfermedad inflamatoria crónica del intestino y colitis ulcerosa.
4. Composición para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizada porque la concentración de psoraleno se encuentra en un rango de entre 50 a 700 ng/mL, y la concentración de angelicina se encuentra en un rango de entre 50 a 1120 ng/mL.
5. Composición para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizada porque la proporción de psoraleno y angelicina se encuentra en un rango de 1:1 a 1:3,4.
6. Composición para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizada porque adicionalmente dicha composición comprende uno o más excipientes farmacéuticamente aceptables.
7. Composición para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizada porque es una solución acuosa.
8. Composición para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizada porque es una solución inyectable.
9. Procedimiento ex vivo/in vitro de generación de células apoptóticas que comprende:
a) Aislar la población de células mononucleares a partir de muestra biológica de sangre aislada de un sujeto,
b) Incubar las células mononucleares de la etapa anterior con una composición tal y como se define según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8;
c) Irradiar las células de la etapa b) con un dispositivo fotoactivador.
d) Aislar las células irradiadas de la etapa c).
10. Procedimiento según la reivindicación 9, en donde las células apoptóticas son autólogas.
11. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 9 a 10, en donde las células apoptóticas son leucocitos.
12. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11, en donde el dispositivo fotoactivador irradia luz UVA.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| ES202130415A ES2927913B2 (es) | 2021-05-07 | 2021-05-07 | Composición que comprende una combinación de las furanocumarinas psoraleno y angelicina y su uso en terapia |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| ES202130415A ES2927913B2 (es) | 2021-05-07 | 2021-05-07 | Composición que comprende una combinación de las furanocumarinas psoraleno y angelicina y su uso en terapia |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2927913A1 ES2927913A1 (es) | 2022-11-11 |
| ES2927913B2 true ES2927913B2 (es) | 2023-07-27 |
Family
ID=84083682
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES202130415A Active ES2927913B2 (es) | 2021-05-07 | 2021-05-07 | Composición que comprende una combinación de las furanocumarinas psoraleno y angelicina y su uso en terapia |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| ES (1) | ES2927913B2 (es) |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1990055A3 (en) * | 2001-11-29 | 2011-11-16 | Therakos, Inc. | Methods for pretreating a subject with extracorporeal photopheresis and/or apoptotic cells |
| EP1951036A4 (en) * | 2005-11-02 | 2009-05-27 | Therakos Inc | USE OF APIVOTIC CELLS EX VIVO FOR GENERATING REGULATORY T CELLS |
| CN109316463B (zh) * | 2018-08-03 | 2021-03-19 | 暨南大学 | 一种复合纳米粒及其制备方法和应用 |
| CN112007114B (zh) * | 2019-05-29 | 2022-05-13 | 湖北梦阳药业股份有限公司 | 一种治疗白细胞减少症药物及其制备方法和用途 |
| KR20220061106A (ko) * | 2019-08-02 | 2022-05-12 | 코이트 헬스 오와이 | 전신적으로 적용하는 항생제의 항균 작용을 강화하는 방법 |
-
2021
- 2021-05-07 ES ES202130415A patent/ES2927913B2/es active Active
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| ES2927913A1 (es) | 2022-11-11 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| KR102917032B1 (ko) | 소분자 절제 화합물을 이용한 암 면역 요법에 대한 면역 세포 활성의 생체외 향상 방법 | |
| KR20170138534A (ko) | 치료적 혼주된 혈액 아폽토시스 세포 제제 및 이의 용도 | |
| ES2581277T3 (es) | Composición mejorada para inhibir la proliferación de células tumorales | |
| JP2024019229A (ja) | 進行したがんを有する被験体のための活性化樹状細胞組成物および免疫療法処置に関する方法 | |
| ES2660577T3 (es) | Células que expresan características y propiedades citolíticas de Th1 | |
| Bojanic et al. | Extracorporeal photopheresis as an immunomodulatory treatment modality for chronic GvHD and the importance of emerging biomarkers | |
| Alaniz et al. | Low molecular weight hyaluronan preconditioning of tumor-pulsed dendritic cells increases their migratory ability and induces immunity against murine colorectal carcinoma | |
| Zheng et al. | Uptake of donor lymphocytes treated with 8-methoxypsoralen and ultraviolet A light by recipient dendritic cells induces CD4+ CD25+ Foxp3+ regulatory T cells and down-regulates cardiac allograft rejection | |
| ES2927913B2 (es) | Composición que comprende una combinación de las furanocumarinas psoraleno y angelicina y su uso en terapia | |
| JP7591564B2 (ja) | 変形性関節症を治療するための治療用アポトーシス細胞 | |
| BR112015014270B1 (pt) | co-diferenciação de monócitos a partir de doadores alogênicos | |
| TW202206591A (zh) | 體外增殖自然殺手細胞及自然殺手t細胞之方法 | |
| JP2010508364A (ja) | 樹状細胞腫瘍注射治療及び関連するワクチン | |
| RU2372936C1 (ru) | Способ получения аутологичной вакцины для лечения туберкулеза | |
| KR20230160305A (ko) | 패혈증의 새로운 치료 | |
| HK40072988A (en) | Activated dendritic cell compositions and immunotherapeutic treatments for subjects with advanced cancers | |
| Nguyen et al. | Cardiac dyskinesis in acute allograft rejection: evaluation by in situ sonomicrometry and the role of inducible nitric oxide synthase | |
| Bowers | Generating Memory T cell Responses to Cancer: Three Approaches towards a Cure | |
| HK1258885B (en) | Methods relating to activated dendritic cell compositions for subjects with advanced cancers |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| BA2A | Patent application published |
Ref document number: 2927913 Country of ref document: ES Kind code of ref document: A1 Effective date: 20221111 |
|
| FG2A | Definitive protection |
Ref document number: 2927913 Country of ref document: ES Kind code of ref document: B2 Effective date: 20230727 |