ES2933629B2 - METHOD FOR EARLY DETECTION OF LIVER DAMAGE USING BONE MORPHOGENETIC PROTEIN 2 (BMP2) IN LIQUID BIOPSY - Google Patents
METHOD FOR EARLY DETECTION OF LIVER DAMAGE USING BONE MORPHOGENETIC PROTEIN 2 (BMP2) IN LIQUID BIOPSY Download PDFInfo
- Publication number
- ES2933629B2 ES2933629B2 ES202130777A ES202130777A ES2933629B2 ES 2933629 B2 ES2933629 B2 ES 2933629B2 ES 202130777 A ES202130777 A ES 202130777A ES 202130777 A ES202130777 A ES 202130777A ES 2933629 B2 ES2933629 B2 ES 2933629B2
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- bmi
- bmp2
- value
- diabetes
- serum
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 17
- 238000011528 liquid biopsy Methods 0.000 title claims description 9
- 108010049931 Bone Morphogenetic Protein 2 Proteins 0.000 title description 84
- 206010067125 Liver injury Diseases 0.000 title description 19
- 231100000234 hepatic damage Toxicity 0.000 title description 13
- 230000008818 liver damage Effects 0.000 title description 13
- 238000001514 detection method Methods 0.000 title description 11
- 102000008143 Bone Morphogenetic Protein 2 Human genes 0.000 title 2
- 102100024506 Bone morphogenetic protein 2 Human genes 0.000 claims description 98
- 208000008338 non-alcoholic fatty liver disease Diseases 0.000 claims description 47
- HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N cholesterol Chemical compound C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N 0.000 claims description 44
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 claims description 39
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 claims description 28
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 claims description 22
- 235000012000 cholesterol Nutrition 0.000 claims description 22
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 claims description 15
- 206010016654 Fibrosis Diseases 0.000 claims description 14
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 claims description 14
- 239000008103 glucose Substances 0.000 claims description 14
- 230000004761 fibrosis Effects 0.000 claims description 12
- 230000007863 steatosis Effects 0.000 claims description 12
- 231100000240 steatosis hepatitis Toxicity 0.000 claims description 12
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 10
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 10
- 150000003626 triacylglycerols Chemical class 0.000 claims description 7
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims description 6
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims description 6
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 claims description 6
- 238000003119 immunoblot Methods 0.000 claims description 3
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 claims description 3
- 230000003902 lesion Effects 0.000 claims description 3
- 238000005259 measurement Methods 0.000 claims description 3
- 238000003118 sandwich ELISA Methods 0.000 claims description 3
- 101000762366 Homo sapiens Bone morphogenetic protein 2 Proteins 0.000 claims 16
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 16
- 239000000090 biomarker Substances 0.000 description 14
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 12
- 208000019423 liver disease Diseases 0.000 description 12
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 10
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 9
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 9
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 9
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 8
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 8
- 238000007477 logistic regression Methods 0.000 description 8
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 7
- 238000012317 liver biopsy Methods 0.000 description 7
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 7
- 102100036475 Alanine aminotransferase 1 Human genes 0.000 description 6
- 108010082126 Alanine transaminase Proteins 0.000 description 6
- 108010003415 Aspartate Aminotransferases Proteins 0.000 description 6
- 102000004625 Aspartate Aminotransferases Human genes 0.000 description 6
- GFABNNMTRVBLPZ-QRPNPIFTSA-N azanium;5-[[(4s)-4-amino-4-carboxybutanoyl]amino]-2-nitrobenzoate Chemical compound N.OC(=O)[C@@H](N)CCC(=O)NC1=CC=C([N+]([O-])=O)C(C(O)=O)=C1 GFABNNMTRVBLPZ-QRPNPIFTSA-N 0.000 description 6
- 231100000753 hepatic injury Toxicity 0.000 description 6
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 5
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 5
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 4
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 4
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 4
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 4
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 4
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 4
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 4
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 4
- 102000007350 Bone Morphogenetic Proteins Human genes 0.000 description 3
- 108010007726 Bone Morphogenetic Proteins Proteins 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000002313 adhesive film Substances 0.000 description 3
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 3
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 3
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 3
- 229940112869 bone morphogenetic protein Drugs 0.000 description 3
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 230000001587 cholestatic effect Effects 0.000 description 3
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 3
- 208000019425 cirrhosis of liver Diseases 0.000 description 3
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 3
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 3
- 230000013632 homeostatic process Effects 0.000 description 3
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 3
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 3
- 238000004393 prognosis Methods 0.000 description 3
- 239000013074 reference sample Substances 0.000 description 3
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 3
- 238000012066 statistical methodology Methods 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- 238000007473 univariate analysis Methods 0.000 description 3
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 3
- 108020004206 Gamma-glutamyltransferase Proteins 0.000 description 2
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 2
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 2
- 206010022489 Insulin Resistance Diseases 0.000 description 2
- XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N Iron Chemical compound [Fe] XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000000585 Mann–Whitney U test Methods 0.000 description 2
- 238000000692 Student's t-test Methods 0.000 description 2
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 2
- 208000026594 alcoholic fatty liver disease Diseases 0.000 description 2
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 2
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 2
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 2
- 230000007882 cirrhosis Effects 0.000 description 2
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 2
- DDRJAANPRJIHGJ-UHFFFAOYSA-N creatinine Chemical compound CN1CC(=O)NC1=N DDRJAANPRJIHGJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 229940096118 ella Drugs 0.000 description 2
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 2
- 230000006870 function Effects 0.000 description 2
- 102000006640 gamma-Glutamyltransferase Human genes 0.000 description 2
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 2
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 2
- 230000009716 hepatic expression Effects 0.000 description 2
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 2
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 2
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 2
- 206010053219 non-alcoholic steatohepatitis Diseases 0.000 description 2
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 2
- 201000002793 renal fibrosis Diseases 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 2
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 2
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- 238000012706 support-vector machine Methods 0.000 description 2
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 2
- 208000001072 type 2 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 2
- OOLLAFOLCSJHRE-ZHAKMVSLSA-N ulipristal acetate Chemical compound C1=CC(N(C)C)=CC=C1[C@@H]1C2=C3CCC(=O)C=C3CC[C@H]2[C@H](CC[C@]2(OC(C)=O)C(C)=O)[C@]2(C)C1 OOLLAFOLCSJHRE-ZHAKMVSLSA-N 0.000 description 2
- XJOTXKZIRSHZQV-RXHOOSIZSA-N (3S)-3-amino-4-[[(2S,3R)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[(2S)-2-[[(2S,3S)-1-[[(1R,6R,12R,17R,20S,23S,26R,31R,34R,39R,42S,45S,48S,51S,59S)-51-(4-aminobutyl)-31-[[(2S)-6-amino-1-[[(1S,2R)-1-carboxy-2-hydroxypropyl]amino]-1-oxohexan-2-yl]carbamoyl]-20-benzyl-23-[(2S)-butan-2-yl]-45-(3-carbamimidamidopropyl)-48-(hydroxymethyl)-42-(1H-imidazol-4-ylmethyl)-59-(2-methylsulfanylethyl)-7,10,19,22,25,33,40,43,46,49,52,54,57,60,63,64-hexadecaoxo-3,4,14,15,28,29,36,37-octathia-8,11,18,21,24,32,41,44,47,50,53,55,58,61,62,65-hexadecazatetracyclo[32.19.8.26,17.212,39]pentahexacontan-26-yl]amino]-3-methyl-1-oxopentan-2-yl]carbamoyl]pyrrolidin-1-yl]-1-oxo-3-phenylpropan-2-yl]amino]-3-(1H-imidazol-4-yl)-1-oxopropan-2-yl]amino]-3-hydroxy-1-oxobutan-2-yl]amino]-4-oxobutanoic acid Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](NC(=O)[C@@H]1CCCN1C(=O)[C@H](Cc1ccccc1)NC(=O)[C@H](Cc1cnc[nH]1)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O)[C@@H](C)O)C(=O)N[C@H]1CSSC[C@H](NC(=O)[C@@H]2CSSC[C@@H]3NC(=O)[C@@H]4CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](Cc5ccccc5)NC(=O)[C@@H](NC1=O)[C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](Cc1cnc[nH]1)NC3=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N2)C(=O)NCC(=O)N4)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O XJOTXKZIRSHZQV-RXHOOSIZSA-N 0.000 description 1
- XMTQQYYKAHVGBJ-UHFFFAOYSA-N 3-(3,4-DICHLOROPHENYL)-1,1-DIMETHYLUREA Chemical compound CN(C)C(=O)NC1=CC=C(Cl)C(Cl)=C1 XMTQQYYKAHVGBJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- YPMOAQISONSSNL-UHFFFAOYSA-N 8-hydroxyoctyl 2-methylprop-2-enoate Chemical compound CC(=C)C(=O)OCCCCCCCCO YPMOAQISONSSNL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000007082 Alcoholic Fatty Liver Diseases 0.000 description 1
- 208000022309 Alcoholic Liver disease Diseases 0.000 description 1
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 description 1
- 102100022525 Bone morphogenetic protein 6 Human genes 0.000 description 1
- 208000032928 Dyslipidaemia Diseases 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 208000004930 Fatty Liver Diseases 0.000 description 1
- 206010016262 Fatty liver alcoholic Diseases 0.000 description 1
- 206010068715 Fibrodysplasia ossificans progressiva Diseases 0.000 description 1
- 206010019695 Hepatic neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 206010019799 Hepatitis viral Diseases 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 101000899390 Homo sapiens Bone morphogenetic protein 6 Proteins 0.000 description 1
- 206010020772 Hypertension Diseases 0.000 description 1
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 1
- 206010023126 Jaundice Diseases 0.000 description 1
- 208000017170 Lipid metabolism disease Diseases 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 208000001145 Metabolic Syndrome Diseases 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 206010028851 Necrosis Diseases 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 208000008589 Obesity Diseases 0.000 description 1
- 102000004887 Transforming Growth Factor beta Human genes 0.000 description 1
- 108090001012 Transforming Growth Factor beta Proteins 0.000 description 1
- 102100029469 WD repeat and HMG-box DNA-binding protein 1 Human genes 0.000 description 1
- 101710097421 WD repeat and HMG-box DNA-binding protein 1 Proteins 0.000 description 1
- 230000003187 abdominal effect Effects 0.000 description 1
- 201000000690 abdominal obesity-metabolic syndrome Diseases 0.000 description 1
- 208000020560 abdominal swelling Diseases 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 230000002293 adipogenic effect Effects 0.000 description 1
- 210000000577 adipose tissue Anatomy 0.000 description 1
- 208000037883 airway inflammation Diseases 0.000 description 1
- 230000002491 angiogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000000434 anti-fibrogenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000013528 artificial neural network Methods 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 description 1
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 238000004422 calculation algorithm Methods 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 230000024245 cell differentiation Effects 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 230000010001 cellular homeostasis Effects 0.000 description 1
- 210000001175 cerebrospinal fluid Anatomy 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000002192 cholecystectomy Methods 0.000 description 1
- 229940107161 cholesterol Drugs 0.000 description 1
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 1
- 238000012937 correction Methods 0.000 description 1
- 229940109239 creatinine Drugs 0.000 description 1
- 238000003066 decision tree Methods 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 230000003111 delayed effect Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 238000013399 early diagnosis Methods 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 208000010706 fatty liver disease Diseases 0.000 description 1
- 230000009795 fibrotic process Effects 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 229960001031 glucose Drugs 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 210000004024 hepatic stellate cell Anatomy 0.000 description 1
- 208000006454 hepatitis Diseases 0.000 description 1
- 206010073071 hepatocellular carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 231100000844 hepatocellular carcinoma Toxicity 0.000 description 1
- 210000003494 hepatocyte Anatomy 0.000 description 1
- 102000018511 hepcidin Human genes 0.000 description 1
- 108060003558 hepcidin Proteins 0.000 description 1
- 229940066919 hepcidin Drugs 0.000 description 1
- 238000010562 histological examination Methods 0.000 description 1
- 230000003284 homeostatic effect Effects 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000009545 invasion Effects 0.000 description 1
- 229910052742 iron Inorganic materials 0.000 description 1
- 208000010729 leg swelling Diseases 0.000 description 1
- 238000012417 linear regression Methods 0.000 description 1
- 208000018191 liver inflammation Diseases 0.000 description 1
- 208000014018 liver neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 210000005228 liver tissue Anatomy 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 238000002483 medication Methods 0.000 description 1
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 1
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 1
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 1
- 201000006417 multiple sclerosis Diseases 0.000 description 1
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 description 1
- 230000017074 necrotic cell death Effects 0.000 description 1
- 238000001151 non-parametric statistical test Methods 0.000 description 1
- 238000001422 normality test Methods 0.000 description 1
- 235000020824 obesity Nutrition 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 201000008482 osteoarthritis Diseases 0.000 description 1
- 210000005009 osteogenic cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000012188 paraffin wax Substances 0.000 description 1
- 238000001769 parametric statistical test Methods 0.000 description 1
- 230000035790 physiological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 230000004983 pleiotropic effect Effects 0.000 description 1
- 208000007232 portal hypertension Diseases 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 230000002250 progressing effect Effects 0.000 description 1
- 238000000751 protein extraction Methods 0.000 description 1
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 1
- 238000007637 random forest analysis Methods 0.000 description 1
- 238000007634 remodeling Methods 0.000 description 1
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 206010039073 rheumatoid arthritis Diseases 0.000 description 1
- 210000003296 saliva Anatomy 0.000 description 1
- 231100000241 scar Toxicity 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 1
- 210000002784 stomach Anatomy 0.000 description 1
- 239000012089 stop solution Substances 0.000 description 1
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 description 1
- 238000012353 t test Methods 0.000 description 1
- 210000001138 tear Anatomy 0.000 description 1
- ZRKFYGHZFMAOKI-QMGMOQQFSA-N tgfbeta Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CCSC)C(C)C)[C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 ZRKFYGHZFMAOKI-QMGMOQQFSA-N 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 230000000476 thermogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000000451 tissue damage Effects 0.000 description 1
- 231100000827 tissue damage Toxicity 0.000 description 1
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 1
- 208000019553 vascular disease Diseases 0.000 description 1
- 201000001862 viral hepatitis Diseases 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
- C07K14/51—Bone morphogenetic factor; Osteogenins; Osteogenic factor; Bone-inducing factor
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/74—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving hormones or other non-cytokine intercellular protein regulatory factors such as growth factors, including receptors to hormones and growth factors
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Toxicology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Description
DESCRIPCIÓNDESCRIPTION
MÉTODO DE DETECCIÓN TEMPRANO DE DAÑO HEPÁTICO MEDIANTE LA METHOD FOR EARLY DETECTION OF LIVER DAMAGE BY MEANS OF
PROTEÍNA MORFOGENÉTICA ÓSEA 2 (BMP2) EN BIOPSIA LÍQUIDA BONE MORPHOGENETIC PROTEIN 2 (BMP2) IN LIQUID BIOPSY
OBJETO DE LA INVENCIÓNOBJECT OF THE INVENTION
El objeto de la presente invención comprende el uso de biomarcadores, combinaciones de biomarcadores, métodos de cribado y dispositivos de análisis para el seguimiento de la respuesta a tratamiento, el diagnóstico y la prognosis de pacientes con enfermedades hepáticas crónicas. The object of the present invention comprises the use of biomarkers, combinations of biomarkers, screening methods and analysis devices for monitoring the response to treatment, diagnosis and prognosis of patients with chronic liver diseases.
En este sentido, la invención se refiere al uso de biomarcadores para la detección temprana de daño hepático utilizando la proteína BMP2, asociado a enfermedades hepáticas crónicas, como la enfermedad del hígado graso no alcohólico, la hepatopatía alcohólica y las enfermedades colestásicas. In this sense, the invention relates to the use of biomarkers for the early detection of liver damage using the BMP2 protein, associated with chronic liver diseases, such as non-alcoholic fatty liver disease, alcoholic liver disease, and cholestatic diseases.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓNBACKGROUND OF THE INVENTION
Las Proteínas Morfogenéticas Óseas (en inglés, Bone Morphogenetic Proteins, BMP) forman un amplio grupo de factores de crecimiento secretados altamente conservados. Originalmente fueron identificadas como factores de crecimiento y diferenciación de células osteogénicas. Sin embargo, en estudios posteriores se ha demostrado que ejercen efectos pleiotrópicos en varios tejidos regulando diferentes procesos fisiológicos de la homeostasis celular, considerándose polipéptidos multifuncionales con un rango de acción mucho más amplio. Las proteínas BMP siguen participando durante el estado adulto en la homeostasis de un gran número de órganos y tejidos. De hecho, a día de hoy, más de 20 BMP humanas han sido identificadas y se han ido agrupando en subfamilias, basándose en su semejanza estructural y en funciones conocidas que ejercen [1,2]. Bone Morphogenetic Proteins (BMPs) are a large group of highly conserved secreted growth factors. They were originally identified as osteogenic cell growth and differentiation factors. However, subsequent studies have shown that they exert pleiotropic effects in various tissues, regulating different physiological processes of cellular homeostasis. They are considered multifunctional polypeptides with a much broader range of action. BMP proteins continue to participate in the homeostasis of a large number of organs and tissues throughout adulthood. In fact, to date, more than 20 human BMPs have been identified and grouped into subfamilies based on their structural similarity and known functions [1,2].
Las proteínas BMP juegan un papel fundamental para el correcto desarrollo y la homeostasis de un gran número de órganos y sistemas en la fase embrionaria y post-natal. Por ello un gran número de patologías de origen variable han sido asociadas a defectos en sus vías de señalización. Además de desórdenes que afectan al hueso (ej: fibrodisplasia osificante progresiva) y articulaciones (ej: artritis reumatoide y osteoartritis), las proteínas BMP también participan en enfermedades no relacionadas con el esqueleto, incluyendo la esclerosis múltiple, inflamación de las vías respiratorias y enfermedades vasculares [3-6]. Igualmente, algunos componentes de la familia BMP, como sus receptores, han sido relacionados con la predisposición a determinados tipos de cáncer [7]. Asimismo, las proteínas BMP también están implicadas en la progresión de la fibrosis renal [8]. Recientemente, se ha demostrado que algunas proteínas BMP están implicadas en la función del tejido adiposo, regulando procesos adipogénicos y termogénicos [9]. Sin embargo, la implicación de estos factores de crecimiento en patologías hepáticas apenas ha sido estudiada. BMP proteins play a fundamental role in the correct development and homeostasis of a large number of organs and systems during the embryonic and postnatal phases. Therefore, a large number of pathologies of variable origin have been associated with defects in their signaling pathways. In addition to disorders affecting bone (e.g., fibrodysplasia ossificans progressiva) and joints (e.g., rheumatoid arthritis and osteoarthritis), BMP proteins are also involved in diseases unrelated to the skeleton, including multiple sclerosis, airway inflammation, and vascular diseases [3-6]. Likewise, some components of the BMP family, such as their receptors, have been linked to a predisposition to certain types of cancer [7]. Furthermore, BMP proteins are also implicated in the progression of renal fibrosis [8]. Recently, some BMP proteins have been shown to be involved in adipose tissue function, regulating adipogenic and thermogenic processes [9]. However, the involvement of these growth factors in liver pathologies has barely been studied.
Las enfermedades hepáticas aparecen cuando el hígado ha sufrido daño durante largos periodos de tiempo. Esto da lugar a la formación de un tejido cicatrizante (fibrosis) con el objetivo de reparar el daño, pero que limita la capacidad funcional del hígado. Cabe destacar que previo a la formación de fibrosis tiene lugar un proceso inflamatorio con el fin de compensar y resolver el daño producido. Cuando los procesos fibróticos se mantienen en el tiempo, se van haciendo más graves y pueden causar lesiones hepáticas. En la clínica, el estadío de la fibrosis se evalúa siguiendo una escala de F0 a F4, donde F0 es el estadío más leve, sin fibrosis, y F4 el más severo, denominado cirrosis. Liver diseases occur when the liver has suffered damage over long periods of time. This leads to the formation of scar tissue (fibrosis) intended to repair the damage, but which limits the liver's functional capacity. It is important to note that prior to the formation of fibrosis, an inflammatory process occurs to compensate for and resolve the damage. When fibrotic processes persist over time, they become more severe and can cause liver damage. Clinically, the stage of fibrosis is assessed using a scale from F0 to F4, where F0 is the mildest stage, without fibrosis, and F4 the most severe, called cirrhosis.
Existen diferentes causas por las que se genera un daño crónico en el hígado incluyendo las hepatitis víricas, las enfermedades autoinmunes, enfermedades colestásicas o el consumo abusivo de algunos medicamentos, drogas o alcohol. Sin embargo, la principal enfermedad hepática crónica en el mundo occidental es la enfermedad de hígado graso no alcohólico (EHGNA). Esta enfermedad se considera la expresión hepática del síndrome metabólico, y por tanto se asocia con obesidad, dislipemia, diabetes e hipertensión arterial que son las principales características de este síndrome. Mientras que la mayoría de los pacientes con EHGNA presentan la enfermedad de manera asintomática con un simple depósito de grasa en el hepatocito (esteatosis, ESNA), el 20% de los individuos acaban desarrollando inflamación hepática crónica o esteatohepatitis no alcohólica (EHNA) con estadíos variables de fibrosis concomitante que a su vez puede conducir hacia estados más graves de enfermedad hepática como cirrosis, hipertensión portal e incluso carcinoma hepatocelular [10]. There are several causes of chronic liver damage, including viral hepatitis, autoimmune diseases, cholestatic diseases, and the overuse of certain medications, drugs, or alcohol. However, the main chronic liver disease in the Western world is non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD). This disease is considered the hepatic expression of metabolic syndrome and is therefore associated with obesity, dyslipidemia, diabetes, and high blood pressure, which are the main characteristics of this syndrome. While most patients with NAFLD present with the disease asymptomatically, with simple fat deposits in the hepatocytes (steatosis, NASF), 20% of individuals eventually develop chronic liver inflammation or non-alcoholic steatohepatitis (NASH) with varying stages of concomitant fibrosis, which in turn can lead to more severe liver disease such as cirrhosis, portal hypertension, and even hepatocellular carcinoma [10].
Los síntomas de enfermedad hepática son muy variados y entre ellos se incluyen la hinchazón del abdomen y las piernas, los cambios en el color de las heces y la ictericia. Puesto que la enfermedad hepática es asintomática en sus estadíos iniciales, el diagnóstico de la misma suele ser tardío lo cual tiene como consecuencia un peor pronóstico. Por ello, un diagnóstico y tratamiento temprano son de gran importancia para prevenir la progresión de la enfermedad a estadíos más avanzados. The symptoms of liver disease are varied and include abdominal and leg swelling, changes in stool color, and jaundice. Because liver disease is asymptomatic in its early stages, diagnosis is often delayed, resulting in a worse prognosis. Therefore, early diagnosis and treatment are of great importance to prevent the disease from progressing to more advanced stages.
En este sentido, la búsqueda de biomarcadores que permitan un diagnóstico temprano y no invasivo de la enfermedad hepática está siendo clave en el desarrollo de nuevas herramientas diagnósticas, ya que, tradicionalmente, la biopsia hepática es la única forma de confirmar el diagnóstico de lesión hepática. Esta técnica permite determinar la gravedad, el daño estructural (inflamación, necrosis, fibrosis) y proporcionar información sobre el pronóstico de la enfermedad. El problema es que al ser un método invasivo no exento de riesgos para el paciente, la búsqueda de marcadores eficaces y no invasivos es crucial para el diagnóstico de las diferentes fases de enfermedades hepáticas In this sense, the search for biomarkers that allow for early, noninvasive diagnosis of liver disease is key to the development of new diagnostic tools, since, traditionally, liver biopsy is the only way to confirm the diagnosis of liver injury. This technique allows determining the severity and structural damage (inflammation, necrosis, fibrosis) and provides information on the prognosis of the disease. The problem is that, as an invasive method, it is not without risks for the patient, so the search for effective, noninvasive markers is crucial for the diagnosis of the different stages of liver disease.
El papel de las proteínas BMP en las enfermedades hepáticas apenas ha sido investigado. En concreto, se ha demostrado que la proteína BMP2 ejerce un papel importante, junto a BMP6, en el control de la homeostasis del hierro regulando la expresión hepática de hepcidina [11]. Asimismo, se ha estudiado el mecanismo del alcohol como inductor de lesiones hepáticas a través de BMP2 en modelos murinos con hígado graso alcohólico [12]. Otro estudio reflejó que BMP2 tiene efectos antifibrogénicos, ya que bloquea la activación de las células estelares hepáticas, fundamentales en el desarrollo de fibrosis [13]. Por último, BMP2 también se ha asociado al crecimiento y a la capacidad angiogénica, de migración e invasión de células tumorales hepáticas [14-16]. The role of BMP proteins in liver diseases has barely been investigated. Specifically, it has been shown that the BMP2 protein plays an important role, together with BMP6, in controlling iron homeostasis by regulating hepatic expression of hepcidin [11]. Likewise, the mechanism of alcohol as an inducer of liver injury through BMP2 has been studied in murine models of alcoholic fatty liver [12]. Another study showed that BMP2 has antifibrogenic effects, since it blocks the activation of hepatic stellate cells, which are essential in the development of fibrosis [13]. Finally, BMP2 has also been associated with the growth and angiogenic capacity, migration and invasion of liver tumor cells [14-16].
Los biomarcadores, moléculas (péptidos, proteínas, fragmentos de material genético) presentes en diferentes fluidos corporales (sangre, líquido cefalorraquídeo, orina, lágrimas o saliva) derivados de la afectación tisular, pueden ser utilizados para establecer la gravedad y la evolución de las lesiones en diferentes órganos y patologías. Sin embargo, su uso en la determinación del daño hepático es relativamente reciente. No hay todavía constancia de su uso para establecer el estadío de la lesión hepática. Biomarkers, molecules (peptides, proteins, fragments of genetic material) present in various bodily fluids (blood, cerebrospinal fluid, urine, tears, or saliva) derived from tissue damage, can be used to determine the severity and progression of injuries in different organs and pathologies. However, their use in determining liver damage is relatively recent. There is still no evidence of their use in establishing the stage of liver injury.
Por todo ello, el objeto de esta invención es un método de detección temprano y no invasivo basado en biopsia líquida de la proteína BMP2 en estadíos iniciales para mejorar el manejo y evolución de los pacientes con daño hepático crónico. Therefore, the object of this invention is an early and noninvasive detection method based on liquid biopsy of the BMP2 protein in early stages to improve the management and evolution of patients with chronic liver damage.
DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓNDESCRIPTION OF THE INVENTION
Los siguientes términos de la invención se definen a continuación de forma detallada. The following terms of the invention are defined in detail below.
El término “lesión hepática o daño hepático” tal y como se utiliza en la presente memoria, se refiere a una afectación del hígado que produzca remodelación y/o destrucción celular o tisular en enfermedades hepática y está causado por la enfermedad del hígado graso no alcohólico, las enfermedades colestásicas y el hígado graso alcohólico. The term “liver injury or liver damage” as used herein refers to an affectation of the liver that produces remodeling and/or cellular or tissue destruction in liver diseases and is caused by non-alcoholic fatty liver disease, cholestatic diseases and alcoholic fatty liver disease.
“Gravedad” o “extensión” o “magnitud” de la lesión son términos que se usan indistintamente. “Severity” or “extent” or “magnitude” of the injury are terms that are often used interchangeably.
“Ensayo” se refiere a cualquier método generalmente conocido en la técnica para detectar una lesión hepática o cualquier otro método estándar para la detección de biomarcadores. “Assay” refers to any method generally known in the art for detecting liver injury or any other standard method for detecting biomarkers.
“Muestra” o “muestra biológica” se refiere a sangre. “Sample” or “biological sample” refers to blood.
“Muestra biológica” y “biopsia líquida” son sinónimos y se emplean indistintamente en la presente memoria. “Biological sample” and “liquid biopsy” are synonyms and are used interchangeably in this specification.
El término “BMP2” como se utiliza en esta memoria se refiere a la proteína Morfogenética Ósea 2 (número UniProtKB P12643). The term “BMP2” as used herein refers to Bone Morphogenetic Protein 2 (UniProtKB number P12643).
Los términos "péptido", "polipéptido" y "proteína" se usan aquí de manera intercambiable. The terms "peptide," "polypeptide," and "protein" are used interchangeably herein.
El término "cantidad" tal y como se utiliza en la presente memoria, se refiere, pero no se limita, a la cantidad absoluta o relativa de las proteínas, así como a cualquier otro valor o parámetro relacionado con los mismos o que pueda derivarse de éstos, ya sea por medida directa o indirecta. The term "quantity" as used herein refers to, but is not limited to, the absolute or relative amount of the proteins, as well as any other value or parameter related to them or that can be derived from them, whether by direct or indirect measurement.
El término "comparación", tal y como se utiliza en la presente memoria, se refiere, pero no se limita, a la comparación de la cantidad de los productos de expresión de las proteínas de la muestra biológica a analizar, también llamada muestra biológica problema, con una cantidad de las proteínas de una o varias muestras de referencia deseable. La muestra de referencia puede ser analizada, por ej emplo, simultánea o consecutivamente, junto con la muestra biológica problema manualmente o asistida por ordenador. The term "comparison," as used herein, refers to, but is not limited to, comparing the amount of protein expression products in the biological sample to be analyzed, also known as the biological test sample, with a desirable amount of proteins in one or more reference samples. The reference sample may be analyzed, for example, simultaneously or consecutively, along with the biological test sample, manually or with computer assistance.
El término "individuo", tal y como se utiliza en la presente memoria, se refiere a animales, preferentemente mamíferos, y más preferentemente, humanos. El término "individuo" no pretende ser limitativo en ningún aspecto, pudiendo ser éste de cualquier edad, sexo y condición física. The term "individual," as used herein, refers to animals, preferably mammals, and more preferably humans. The term "individual" is not intended to be limiting in any way and may be of any age, sex, or physical condition.
En la presente memoria el término “soporte sólido” se refiere a todos los tipos de inmunoensayo, ya sean realizados sobre una superficie, por ej emplo, de vidrio, o una nanopartícula recubierta de anticuerpo. As used herein, the term “solid support” refers to all types of immunoassay, whether performed on a surface, e.g., glass, or an antibody-coated nanoparticle.
El término "inmunoensayo", tal y como se utiliza en la presente memoria, se refiere a cualquier técnica analítica que se basa en la reacción de la conjugación de un anticuerpo con un antígeno. Ejemplos de inmunoensayos pueden ser inmunoblot, ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA), inmunoensayo ELLA inmunoensayo lineal (LIA), radioinmunoensayo (RIA), inmunofluorescencia, x-map o chips de proteína. The term "immunoassay," as used herein, refers to any analytical technique based on the conjugation reaction of an antibody with an antigen. Examples of immunoassays include immunoblot, enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), ELLA immunoassay, linear immunoassay (LIA), radioimmunoassay (RIA), immunofluorescence, X-map, or protein chips.
El término "compuesto marcador", tal y como se utiliza en la presente memoria, se refiere a un compuesto capaz de dar lugar a una señal cromogénica, fluorogénica, radiactiva o quimioluminiscente que permita la detección y cuantificación de la cantidad de anticuerpos frente a BMP2. The term "label compound" as used herein refers to a compound capable of giving rise to a chromogenic, fluorogenic, radioactive or chemiluminescent signal that allows the detection and quantification of the amount of antibodies against BMP2.
A lo largo de la descripción y las reivindicaciones, la palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros obj etos, ventaj as y características de la invención se desprenderán en parte de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Throughout the description and claims, the word "comprise" and its variations are not intended to exclude other technical features, additives, components, or steps. For those skilled in the art, other objects, advantages, and characteristics of the invention will be apparent partly from the description and partly from practice of the invention.
Cualquier otro término empleado en la presente memoria tendrá el significado habitual del sector de la técnica al que se refiere la presente invención. Any other term used herein shall have the usual meaning of the technical sector to which the present invention relates.
La presente invención se refiere a un método de detección de individuos con enfermedad de hígado graso no alcohólico (EHGNA) en estadio de fibrosis F0 que comprende: The present invention relates to a method for detecting individuals with non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD) in fibrosis stage F0 comprising:
i. determinar el nivel de BMP2 en una biopsia líquida tomada de un individuo, siendo dicha biopsia líquida una muestra de sangre, i. determining the level of BMP2 in a liquid biopsy taken from an individual, said liquid biopsy being a blood sample,
y, and,
i. introducir dicho valor de BMP2 en uno o más de las siguientes ecuaciones junto con las medidas de los siguientes parámetros empleados en la práctica clínica: i. enter said BMP2 value into one or more of the following equations along with measurements of the following parameters used in clinical practice:
probabilidad de EHGNA = 1 / (1 exp (-7.013 1.064 (Mediana BMP2) 1.009 (Sexo) 0.030 (Edad) 1.619 (IMC 25-30) 1.302 (IMC>30) 1.368 (Diabetes) 0.004 (Glucosa) 0.014 (Colesterol total) 0.005 y-GT), probability of NAFLD = 1 / (1 exp (-7.013 1.064 (Median BMP2) 1.009 (Sex) 0.030 (Age) 1.619 (BMI 25-30) 1.302 (BMI>30) 1.368 (Diabetes) 0.004 (Glucose) 0.014 (Total Cholesterol) 0.005 y-GT),
donde los parámetros se sustituyen en función de: where the parameters are replaced based on:
Mediana BMP2: 0, BMP2 en suero < 96.84 pg/ml, y 1, BMP2 en suero > 96.84 pg/ml. Median BMP2: 0, serum BMP2 < 96.84 pg/ml, and 1, serum BMP2 > 96.84 pg/ml.
Sexo: 0, sexo femenino y 1, sexo masculino. Sex: 0, female and 1, male.
Edad: valor en años. Age: value in years.
IMC 25-30: 0, IMC < 25, y 1, IMC 25-30. BMI 25-30: 0, BMI < 25, and 1, BMI 25-30.
IMC > 30: 0, IMC < 30, y 1, IMC > 30. BMI > 30: 0, BMI < 30, and 1, BMI > 30.
Diabetes: 0, diabetes no y 1, diabetes sí. Diabetes: 0, no diabetes and 1, yes diabetes.
Glucosa: valor en mg/dl Glucose: value in mg/dl
Colesterol total: valor en mg/dl y Total cholesterol: value in mg/dl and
y-GT: valor en UI/L; y-GT: value in IU/L;
probabilidad del primer estadio de primer estadio de la EHGNA, esteatosis simple (ESNA) = 1 /( 1 exp (-7.429 1.232 (Mediana BMP2) 0.812 (Sexo) 0.032 (Edad) 1.662 (IMC 25-30) 1.132 (IMC>30) 0.894 (Diabetes) 0.007 (Glucosa) 0.015 (Colesterol total) - 0.002 (Triglicéridos) 0.006<y>-GT), probability of first stage of first stage of NAFLD, simple steatosis (NSA) = 1 /( 1 exp (-7.429 1.232 (Median BMP2) 0.812 (Sex) 0.032 (Age) 1.662 (BMI 25-30) 1.132 (BMI>30) 0.894 (Diabetes) 0.007 (Glucose) 0.015 (Total cholesterol) - 0.002 (Triglycerides) 0.006<y>-GT),
donde los parámetros se sustituyen en función de: where the parameters are replaced based on:
Mediana BMP2: 0, BMP2 en suero < 95.69 pg/ml, y 1, BMP2 en suero > 95.69 pg/ml. Sexo: 0, sexo femenino y 1, sexo masculino. Median BMP2: 0, serum BMP2 < 95.69 pg/ml, and 1, serum BMP2 > 95.69 pg/ml. Sex: 0, female and 1, male.
Edad: valor en años. Age: value in years.
IMC 25-30: 0, IMC < 25, y 1, IMC 25-30. BMI 25-30: 0, BMI < 25, and 1, BMI 25-30.
IMC > 30: 0, IMC < 30, y 1, IMC > 30. BMI > 30: 0, BMI < 30, and 1, BMI > 30.
Diabetes: 0, diabetes no y 1, diabetes si. Diabetes: 0, no diabetes and 1, diabetes yes.
Glucosa: valor en mg/dl Glucose: value in mg/dl
Colesterol total: valor en mg/dl Total cholesterol: value in mg/dl
Triglicéridos: valor en mg/dl y Triglycerides: value in mg/dl and
Y-GT: valor en UI/L; Y-GT: value in IU/L;
probabilidad la lesión más temprana de la EHGNA, grado 1 de esteatosis simple de (G1 ESNA) = 1 / (1 exp (-6.964 1.531 (Mediana BMP2) 0.687 (Sexo) 0.037 (Edad) 1.633 (IMC 25-30) 0.573 (IMC>30) 0.015 (Colesterol total) -0.112 (AST) 0.083 (ALT)), probability of the earliest NAFLD lesion, grade 1 simple steatosis (G1 ESNA) = 1 / (1 exp (-6.964 1.531 (Median BMP2) 0.687 (Sex) 0.037 (Age) 1.633 (BMI 25-30) 0.573 (BMI>30) 0.015 (Total cholesterol) -0.112 (AST) 0.083 (ALT)),
donde los parámetros se sustituyen en función de: where the parameters are replaced based on:
Mediana BMP2: 0, BMP2 en suero < 94,24 pg/ml, y 1, BMP2 en suero > 94,24 pg/ml. Sexo: 0, sexo femenino y 1, sexo masculino. Median BMP2: 0, serum BMP2 <94.24 pg/ml, and 1, serum BMP2 >94.24 pg/ml. Sex: 0, female and 1, male.
Edad: valor en años. Age: value in years.
IMC 25-30: 0, IMC < 25, y 1, IMC 25-30. BMI 25-30: 0, BMI < 25, and 1, BMI 25-30.
IMC > 30: 0, IMC < 30, y 1, IMC > 30. BMI > 30: 0, BMI < 30, and 1, BMI > 30.
Colesterol total: valor en mg/dl Total cholesterol: value in mg/dl
AST: valor en Ul/L y AST: value in Ul/L and
ALT: valor en Ul/L ALT: value in Ul/L
donde el resultado de uno o más de dichas ecuaciones indica la probabilidad de que individuo padezca enfermedad del hígado graso no alcohólico en estadio de fibrosis F0 (EHGNA), la segunda que se encuentre en el estadio de esteatosis (ESNA) y la tercera que se encuentre en estatosis G1 (ESNA G1). where the result of one or more of these equations indicates the probability that the individual suffers from non-alcoholic fatty liver disease in fibrosis stage F0 (NAFLD), the second that they are in steatosis stage (ESNA) and the third that they are in G1 stage (ESNA G1).
La lesión hepática o daño hepático, está causado por: la enfermedad del hígado graso no alcohólico.. Liver injury, or liver damage, is caused by non-alcoholic fatty liver disease.
En una realización preferida del método de la invención, la biopsia líquida es una muestra biológica de sangre In a preferred embodiment of the method of the invention, the liquid biopsy is a biological sample of blood.
La detección del nivel de los biomarcadores puede realizarse por cualquier medio conocido en el estado de la técnica. The detection of biomarker levels can be performed by any means known in the state of the art.
En una realización particular, la detección se realiza mediante un inmunoensayo. In a particular embodiment, the detection is performed by means of an immunoassay.
En una realización preferida, el inmunoensayo es un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas o ELISA (Enzyme-Linked lmmunoSorbent Assay). El ELISA se basa en la premisa de que un inmunorreactivo (antígeno o anticuerpo) puede ser inmovilizado en un soporte sólido, poniendo después ese sistema en contacto con una fase fluida que contiene el reactivo complementario que puede unirse a un compuesto marcador. Existen diferentes tipos de ELISA: ELISA directo, ELISA indirecto o ELISA sándwich. In a preferred embodiment, the immunoassay is an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). ELISA is based on the premise that an immunoreactant (antigen or antibody) can be immobilized on a solid support, and then this system is brought into contact with a fluid phase containing the complementary reagent that can bind to a marker compound. There are different types of ELISA: direct ELISA, indirect ELISA, or sandwich ELISA.
En otra realización preferente, el método de la invención supone disponer la muestra biológica del paciente en contacto con un dispositivo de estado sólido que contiene un sustrato con una superficie activada en la que se inmoviliza, en áreas discretas de dicha superficie, uno o más anticuerpos específicos para BMP2. In another preferred embodiment, the method of the invention involves placing the patient's biological sample in contact with a solid-state device containing a substrate with an activated surface on which one or more antibodies specific for BMP2 are immobilized in discrete areas of said surface.
Los niveles de referencia pueden ser determinadas por cualquier método conocido en el estado de la técnica a partir de una muestra biológica de referencia. Estas pueden ser analizadas simultánea o consecutivamente, j unto a la muestra biológica del individuo problema. Reference levels can be determined by any method known in the art using a reference biological sample. These can be analyzed simultaneously or consecutively, along with the biological sample from the test subject.
Las cantidades de referencia adecuadas pueden ser determinadas por cualquier medio conocido en el estado de la técnica a partir de una muestra de referencia que puede ser analizada, por ej emplo, simultánea o consecutivamente, j unto con la muestra biológica problema. Así, por ej emplo, pero sin limitarnos, la muestra de referencia pueden ser los controles negativos, esto es, las cantidades detectadas de BMP2 por cualquier medio conocido en el estado de la técnica en muestras de individuos sanos. Suitable reference quantities can be determined by any means known in the art from a reference sample that can be analyzed, for example, simultaneously or consecutively, together with the biological sample in question. Thus, for example, but not limited to, the reference sample can be the negative controls, that is, the quantities of BMP2 detected by any means known in the art in samples from healthy individuals.
Una realización preferida de la presente invención, comprende además llevar a cabo una metodología estadística con cada uno de los valores del nivel de un biomarcador y producir un valor de salida con significación estadística que indica si el individuo tiene daño hepático temprano. A preferred embodiment of the present invention further comprises performing a statistical methodology with each of the values of the level of a biomarker and producing an output value with statistical significance indicating whether the individual has early liver damage.
La significación estadística se obtiene mediante la comparación del nivel de un biomarcador de la muestra biológica del sujeto con la muestra biológica de referencia empleando una metodología estadística. Statistical significance is obtained by comparing the level of a biomarker in the subject's biological sample with the reference biological sample using statistical methodology.
La metodología estadística se puede seleccionar entre: una prueba estadística paramétrica, como la prueba T de Student (t-test), una prueba estadística no paramétrica como la Prueba U de Mann-Whitney y un algoritmo clasificador del grupo. Este último comprende: un clasificador de árbol de decisión, clasificador de regresión logística, clasificador de vecino más cercano, clasificador de red neuronal, modelo de mezcla gaussiano (GMM), Máquina de Vector de Soporte (SVM) clasificador, clasificador de centroide más cercano, clasificador de regresión lineal, clasificador lineal de análisis discriminante (LOA), clasificador de análisis discriminante cuadrático (QDA) y clasificador de bosque aleatorio y combinaciones de los anteriores. The statistical methodology can be selected from: a parametric statistical test, such as the Student t-test (t-test), a non-parametric statistical test such as the Mann-Whitney U test, and a group classifier algorithm. The latter comprises: a decision tree classifier, logistic regression classifier, nearest neighbor classifier, neural network classifier, Gaussian mixture model (GMM), Support Vector Machine (SVM) classifier, nearest centroid classifier, linear regression classifier, linear discriminant analysis (LOA) classifier, quadratic discriminant analysis (QDA) classifier, and random forest classifier, and combinations of the above.
El rendimiento de los resultados de los métodos estadísticos aplicados utilizados de acuerdo con la presente invención se puede describir mejor por sus características de funcionamiento del receptor (ROC). La curva ROC aborda tanto la sensibilidad (el número de verdaderos positivos) como la especificidad (número de verdaderos negativos) del ensayo. Por lo tanto, los valores de sensibilidad y especificidad para los biomarcadores de la invención son una indicación del rendimiento del ensayo. The performance of the results of the applied statistical methods used in accordance with the present invention can best be described by their receiver operating characteristics (ROC). The ROC curve addresses both the sensitivity (the number of true positives) and specificity (the number of true negatives) of the assay. Therefore, the sensitivity and specificity values for the biomarkers of the invention are an indication of the assay's performance.
En otra realización preferida del método de la invención, la edad del individuo es mayor o igual a 20 años, preferentemente igual o mayor a 30 años, más preferentemente mayor de 45 años. In another preferred embodiment of the method of the invention, the age of the individual is greater than or equal to 20 years, preferably equal to or greater than 30 years, more preferably greater than 45 years.
Otro aspecto de la presente invención se refiere al uso de un kit o dispositivo que comprende los elementos necesarios para cuantificar el nivel de BMP2. Another aspect of the present invention relates to the use of a kit or device comprising the elements necessary to quantify the level of BMP2.
En una realización preferida, el kit de la presente invención comprende los anticuerpos anti-BMP2. Preferentemente, el dispositivo de la invención comprende al menos un anticuerpo anti-BMP2. In a preferred embodiment, the kit of the present invention comprises anti-BMP2 antibodies. Preferably, the device of the invention comprises at least one anti-BMP2 antibody.
El dispositivo puede ser un inmunoensayo seleccionado entre: inmunoblot, ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA), inmunoensayo ELLA, inmunoensayo lineal (LIA), radioinmunoensayo (RIA), inmunofluorescencia, x-map. o chips de proteína The device may be an immunoassay selected from: immunoblot, enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), ELLA immunoassay, linear immunoassay (LIA), radioimmunoassay (RIA), immunofluorescence, X-map, or protein chips.
En una realización preferida, el inmunoensayo es un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas o ELISA (Enzyme-Linked lmmunoSorbent Assay). El ELISA se basa en la premisa de que un inmunorreactivo (antígeno o anticuerpo) puede ser inmovilizado en un soporte sólido, poniendo luego ese sistema en contacto con una fase fluida que contiene un reactivo complementario que puede unirse a un compuesto marcador. Existen diferentes tipos de ELISA: ELISA directo, ELISA indirecto o ELISA sándwich. In a preferred embodiment, the immunoassay is an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). ELISA is based on the premise that an immunoreactant (antigen or antibody) can be immobilized on a solid support, and then this system is brought into contact with a fluid phase containing a complementary reagent that can bind to a marker compound. There are different types of ELISA: direct ELISA, indirect ELISA, or sandwich ELISA.
En otra realización preferida, el dispositivo de la invención comprende anticuerpos secundarios, controles positivos y negativos. El dispositivo además puede incluir, sin ningún tipo de limitación, tampones, soluciones de extracción de proteínas, agentes para prevenir la contaminación e inhibidores de la degradación de las proteínas. In another preferred embodiment, the device of the invention comprises secondary antibodies, positive and negative controls. The device may also include, but is not limited to, buffers, protein extraction solutions, agents to prevent contamination, and protein degradation inhibitors.
El kit puede comprender soporte sólido o chip de proteínas, que comprende anticuerpos anti-BMP2. The kit may comprise solid support or protein chip, comprising anti-BMP2 antibodies.
Por otro lado, el dispositivo puede incluir todos los soportes y recipientes necesarios para su puesta en marcha y optimización. Preferentemente, el dispositivo comprende además las instrucciones para llevar a cabo los métodos de la invención. Furthermore, the device may include all the supports and containers necessary for its implementation and optimization. Preferably, the device also includes instructions for carrying out the methods of the invention.
Los autores de la presente invención han demostrado que la detección del nivel de proteínas BMP2 de manera cuantitativa de forma no invasiva permite detectar de manera temprana el daño hepático. The authors of the present invention have demonstrated that non-invasive quantitative detection of BMP2 protein levels allows for early detection of liver damage.
BREVE DESCRIPCIÓN DEL CONTENIDO DE LAS FIGURAS BRIEF DESCRIPTION OF THE CONTENT OF THE FIGURES
Figura 1. A. Muestra los niveles en suero de BMP2 en suj etos con hígado normal y pacientes con EHGNA. B. Curva ROC con respecto a la discriminación de diagnóstico de EHGNA. El ej e de abscisas está representado como 1- valor de especificidad. Figure 1. A. Shows serum BMP2 levels in subjects with normal livers and patients with NAFLD. B. ROC curve for NAFLD diagnostic discrimination. The abscissa is represented as 1-specificity value.
Figura 2. A. Muestra los niveles en suero de BMP2 en suj etos con hígado normal y pacientes con esteatosis simple (ESNA). B. Curva ROC con respecto a la discriminación de diagnóstico de ESNA. El ej e de abscisas está representado como 1- valor de especificidad. Figure 2. A. Shows serum BMP2 levels in subjects with normal livers and patients with simple steatosis (ESNA). B. ROC curve for ESNA diagnostic discrimination. The abscissa is represented as 1-specificity value.
Figura 3. A. Muestra los niveles en suero de BMP2 en suj etos con hígado normal y pacientes con ESNA grado 1 (G1 ESNA). B. Curva ROC con respecto a la discriminación de diagnóstico de ESNA grado 1 (G1 ESNA). El ej e de abscisas está representado como 1- valor de especificidad. Figure 3. A. Shows serum BMP2 levels in subjects with normal livers and patients with ESNA grade 1 (G1 ESNA). B. ROC curve for diagnostic discrimination of ESNA grade 1 (G1 ESNA). The abscissa axis is represented as 1-specificity value.
DESCRIPCIÓN DE UN MODO DE REALIZACIÓN DE LA INVENCIÓN DESCRIPTION OF AN EMBODIMENT OF THE INVENTION
El siguiente ejemplo ilustra la realización preferida de la invención, pero no debe interpretarse como limitativa o restrictiva de la presente invención. The following example illustrates the preferred embodiment of the invention, but should not be construed as limiting or restricting the present invention.
A n á lis is de los n ¡veles de la proteí n a BMP2 e n muestras de pacie ntes co n EHGNA Analysis of BMP2 protein levels in samples from patients with NAFLD
Un ej emplo en el que la invención es de utilidad es en pacientes con diferentes estadios de EHGNA. Los pacientes con EHGNA pueden servir como patologia ej emplar en donde la invención es aplicable. An example where the invention is useful is in patients with different stages of NAFLD. Patients with NAFLD can serve as an exemplary pathology where the invention is applicable.
Los autores de la presente invención han analizado la expresión de BMP2 en individuos sanos y en individuos con EHGNA. Han encontrado una serie de biomarcadores que les permiten la detección temprana del daño hepático. Asi, la presente invención proporciona un método de obtención de datos útiles para la detección temprana de daño hepático en individuos con EHGNA. The authors of the present invention have analyzed BMP2 expression in healthy individuals and in individuals with NAFLD. They have found a series of biomarkers that allow for the early detection of liver damage. Thus, the present invention provides a method for obtaining data useful for the early detection of liver damage in individuals with NAFLD.
Procedimientos experimentales Experimental procedures
DISEÑO DEL ESTUDIO STUDY DESIGN
Se ha partido de un estudio transversal retrospectivo en el que se incluyeron las muestras biológicas (biopsia hepática y suero) pertenecientes a la colección de muestras (número de referencia C.0002717) cuyo responsable es el Dr. Carmelo Garcia Monzón del Hospital Universitario Santa Cristina. Las muestras biológicas de los pacientes se obtuvieron tras la firma de un consentimiento informado especifico aprobado por el Comité Ético de Investigación Clinica institucional. Esta cohorte de pacientes con EHGNA ha sido validada y acreditada [17]. A retrospective cross-sectional study was carried out, which included biological samples (liver biopsy and serum) from the sample collection (reference number C.0002717), managed by Dr. Carmelo Garcia Monzón of the Santa Cristina University Hospital. Biological samples were obtained from patients after signing a specific informed consent form approved by the institutional Clinical Research Ethics Committee. This cohort of patients with NAFLD has been validated and accredited [17].
1. Su ¡ etos del estudio 1. Your Study Goals
Los 141 pacientes incluidos en el estudio acudieron al Hospital Universitario Santa Cristina para la realización de una colecistectomia laparoscópica programada y accedieron, mediante la firma de un consentimiento informado por escrito, a que se les practicara una biopsia hepática percutánea durante la intervención quirúrgica. The 141 patients included in the study attended the Santa Cristina University Hospital for a scheduled laparoscopic cholecystectomy and agreed, by signing a written informed consent form, to undergo a percutaneous liver biopsy during the surgical procedure.
Criterios de inclusión: Inclusion criteria:
- Edad entre 18 y 75 años. - Age between 18 and 75 years.
- Ausencia de un consumo significativo de alcohol (hombres < 20 gramos al día y muj eres < 10 gramos al día), según la evaluación de un detallado cuestionario a los pacientes y familiares. - Absence of significant alcohol consumption (men < 20 grams per day and women < 10 grams per day), as assessed by a detailed questionnaire for patients and family members.
- Signos histológicos de esteatosis simple o esteatohepatitis según criterios internacionalmente aceptados [18]. Se incluyen también pacientes que mostraban una biopsia hepática histológicamente normal, los cuales se considerarán como grupo control. - Firma previa de un consentimiento informado por escrito aprobado por el Comité Ético de Investigación Clínica institucional. - Histological signs of simple steatosis or steatohepatitis according to internationally accepted criteria [18]. Patients with a histologically normal liver biopsy were also included and will be considered as a control group. - Prior signature of written informed consent approved by the institutional Clinical Research Ethics Committee.
De todos ellos se registraron diferentes variables demográficas (edad, sexo y raza) y antropométricas (talla, peso, índice de masa corporal, y perímetro de cintura y cadera). Different demographic variables (age, sex and race) and anthropometric variables (height, weight, body mass index, and waist and hip circumference) were recorded for all of them.
2. Variables de estudio en las biopsias hepáticas de pacientes con EHGNA en el citado estudio 2. Study variables in liver biopsies of patients with NAFLD in the aforementioned study
Análisis de variables histológicas. Analysis of histological variables.
Parte del tejido hepático obtenido de la biopsia se fijó e incluyó en parafina para su estudio histológico mediante una tinción de hematoxilina-eosina y una tinción con tricómico de Masson. Secciones de biopsias teñidas con hematoxilina-eosina y tricómico de Masson fueron evaluadas por un único patólogo experto en histopatología hepática teniendo en cuenta los criterios publicados por Kleiner y col. [18]. De esta manera, se determinó el diagnóstico histológico de cada biopsia hepática. Los pacientes se han dividido en dos grupos: hígado normal y EHGNA. Sin embargo, ninguno de ellos mostró fibrosis hepática tras el análisis histológico; es decir, todos los pacientes presentaron un estadío de fibrosis F0. Part of the liver tissue obtained from the biopsy was fixed and embedded in paraffin for histological examination using hematoxylin-eosin and Masson's trichome staining. Biopsy sections stained with hematoxylin-eosin and Masson's trichome staining were evaluated by a single pathologist expert in liver histopathology according to the criteria published by Kleiner et al. [18]. In this way, the histological diagnosis of each liver biopsy was determined. Patients were divided into two groups: normal liver and NAFLD. However, none of them showed liver fibrosis after histological analysis; that is, all patients presented fibrosis stage F0.
3. Variables de estudio en el suero de pacientes con EHGNA en el citado estudio 3. Study variables in the serum of patients with NAFLD in the aforementioned study
Todas las variables bioquímicas se determinaron en muestras de suero almacenadas a -80o C procedentes de la sangre recogida en ayunas en el momento de la biopsia hepática que se realizó a todos los pacientes de estudio. All biochemical variables were determined in serum samples stored at -80°C from blood collected on an empty stomach at the time of liver biopsy performed on all study patients.
Determinación de variables bioquímicas. Determination of biochemical variables.
Se determinaron los niveles de glucosa, creatinina, insulina, colesterol (LDL, HDL y VLDL), triglicéridos y enzimas hepáticas. Asimismo, se calculó el índice de resistencia a la insulina utilizando el modelo homeostático HOMA (HOMA-IR= insulina (mU/ml) X glucosa (mmol/L) /22.5). Glucose, creatinine, insulin, cholesterol (LDL, HDL, and VLDL), triglycerides, and liver enzyme levels were determined. The insulin resistance index was also calculated using the HOMA homeostatic model (HOMA-IR = insulin (mU/ml) X glucose (mmol/L) /22.5).
A continuación, la Tabla 1 muestra los datos demográficos, metabólicos, bioquímicos e Table 1 below shows the demographic, metabolic, biochemical and
histopatológicos de la cohorte de estudio. histopathological data of the study cohort.
Tabla 1: Características de los pacientes del estudio Table 1: Characteristics of the study patients
Los datos están expresados como la media±desviación estándar o como número de casos (%). Abreviaturas: HN, hígado normal; EHGNA, pacientes con enfermedad del hígado graso no alcohólico; HOMA-IR, índice de resistencia a la insulina; ALT, alanino aminotransferasa; AST, aspartato aminotransferasa; a-GT, gamma-glutamiltransferasa.Data are expressed as mean ± standard deviation or as number of cases (%). Abbreviations: HN, normal liver; NAFLD, patients with nonalcoholic fatty liver disease; HOMA-IR, insulin resistance index; ALT, alanine aminotransferase; AST, aspartate aminotransferase; α-GT, gamma-glutamyltransferase.
Determinación de los niveles de las proteínas BMP. Determination of BMP protein levels.
Los autores de la presente invención han determinado los niveles proteicos de BMP2 en individuos sanos y en individuos con EHGNA. Para la detección y cuantificación de BMP2 soluble en las muestras de suero de los pacientes incluidos en el estudio, se realizaron inmunoensayos ELISA (Cusabio) específicos para BMP2 (CSB-E04507h). Los ensayos se realizaron siguiendo las indicaciones del fabricante. Todos los reactivos estaban a temperatura ambiente media hora antes de ser usados y los viales con reactivos liofilizados fueron centrifugados antes de su reconstitución. The present inventors determined BMP2 protein levels in healthy individuals and in individuals with NAFLD. To detect and quantify soluble BMP2 in the serum samples of the patients included in the study, BMP2-specific ELISA immunoassays (Cusabio) (CSB-E04507h) were performed. The assays were performed according to the manufacturer's instructions. All reagents were kept at room temperature for half an hour before use, and the vials containing lyophilized reagents were centrifuged before reconstitution.
Tanto el anticuerpo conjugado con biotina como la solución de avidina y peroxidasa requirieron una dilución 1:100 para obtener una concentración final de uso (1X). Para ello se preparó un volumen final de 11 ml de cada reactivo diluyendo 110 p,l de los mismos en sus correspondientes diluyentes. Para la solución de lavado cuyo stock tenía una concentración 25X, se diluyeron 80 ml en un volumen final de 2 litros de agua destilada. Both the biotin-conjugated antibody and the avidin-peroxidase solution required a 1:100 dilution to obtain a final concentration for use (1X). To do this, a final volume of 11 ml of each reagent was prepared by diluting 110 µl of them in their corresponding diluents. For the wash solution, whose stock had a concentration of 25X, 80 ml were diluted in a final volume of 2 liters of distilled water.
Para la preparación del patrón, el vial se centrifugó a 9183 g durante 30 segundos antes de ser reconstituido con 1ml de diluyente de muestra. Así se obtuvo la solución stock de la cual se hicieron siete diluciones 1:2 sucesivas. Como blanco se usó el diluyente de muestra. Las concentraciones de las diluciones se encuentran descritas en la tabla 2 en unidades de pg/ml. To prepare the standard, the vial was centrifuged at 9183 g for 30 seconds before being reconstituted with 1 ml of sample diluent. This gave the stock solution, from which seven successive 1:2 dilutions were made. The sample diluent was used as the blank. The concentrations of the dilutions are described in Table 2 in units of pg/ml.
Tabla 2: Esquema de la distribución de las diluciones de BMP2 en el k it Table 2: Schematic of the distribution of BMP2 dilutions in the kit
En cada ensayo, se utilizó una placa de 96 pocillos y se usaron 100 p,l de patrón y 50 p,l de muestra por pocillo. Se incubó la placa durante dos horas a 370C y cubierta con una lámina adhesiva. Pasado el tiempo de incubación, se retiró todo el líquido de los pocillos y sin lavarlos se añadieron 100 p,l a cada pocillo de la solución de anticuerpo anti-BMP2 conjugado con biotina. Se incubó a 370C durante una hora, con la placa cubierta con una lámina adhesiva. A continuación, se realizaron dos lavados. Cada lavado consta de los siguientes pasos: aspiración de los pocillos, lavado con 200 p,l de solución de lavado, reposo de 2 minutos y aspiración de la solución de lavado. Tras el último lavado se debe retirar totalmente el líquido remanente. Una vez realizados los lavados, se añadieron 100 p,l por pocillo de la solución de avidina-peroxidasa y se incubó a 370C durante una hora cubriendo la placa con una lámina adhesiva. Posteriormente se realizaron cinco lavados, se añadieron 90 p,l de la solución con el sustrato y se incubó durante 30 minutos a 370C protegido de la luz. In each assay, a 96-well plate was used, and 100 µl of standard and 50 µl of sample were added per well. The plate was incubated for two hours at 37°C and covered with an adhesive film. After the incubation time, all liquid was removed from the wells, and without washing, 100 µl of the biotin-conjugated anti-BMP2 antibody solution was added to each well. The plate was incubated at 37°C for one hour with the plate covered with an adhesive film. Two washes were then performed. Each wash consisted of the following steps: aspiration of the wells, washing with 200 µl of wash solution, standing for 2 minutes, and aspiration of the wash solution. After the final wash, all remaining liquid must be removed. After washing, 100 µl of the avidin-peroxidase solution was added per well and incubated at 37°C for one hour, covering the plate with an adhesive film. Five washes were then performed, then 90 µl of the substrate solution was added, and the plate was incubated for 30 minutes at 37°C, protected from light.
Iniciada la reacción y detectada mediante colorimetría, se añadieron 50 p,l por pocilio de la solución de detención de reacción y se agitó suavemente la parte inferior de la placa para facilitar el correcto mezclado de ambas soluciones. Finalmente, se midió la intensidad de color con el espectrofotómetro (DYNEX Spectra MR) a una longitud de onda de 450nm con una corrección de 540nm. Once the reaction had been initiated and detected colorimetrically, 50 µl of the reaction stop solution was added per well, and the bottom of the plate was gently shaken to facilitate proper mixing of both solutions. Finally, the color intensity was measured using a spectrophotometer (DYNEX Spectra MR) at a wavelength of 450 nm with a 540 nm correction.
Análisis estadístico Statistical analysis
Para obtener los valores cuantitativos de BMP2 de las muestras de suero de los pacientes mediante la técnica de ELISA, las absorbancias de las muestras se extrapolaron de una curva patrón realizada en paralelo (ajustada mediante una curva logística de 4 parámetros, 4PL). Una vez obtenidas las concentraciones del biomarcadorBMP2 en suero, se realizó un test de normalidad (D'Agostino-Pearson). Las variables categóricas se presentan como porcentaj es y las variables continuas se muestran como media ± desviación estándar si se distribuyen normalmente o como mediana (rango intercuartílico) si no se distribuyen normalmente. La significación para las diferencias intergrupales se evaluó mediante la prueba U de Mann-Whitney para variables continuas. Se utilizaron análisis de regresión logística para confeccionar modelos explicativos sobre el papel de los biomarcadores ante determinados parámetros clínicos. El valor pronóstico de los niveles de los biomarcadores a los distintos tiempos tras el ingreso hospitalario se evaluó mediante las curvas de Características Operativas del Receptor (ROC). To obtain quantitative BMP2 values from patient serum samples using ELISA, sample absorbances were extrapolated from a standard curve run in parallel (fitted using a 4-parameter logistic curve, 4PL). Once serum BMP2 biomarker concentrations were obtained, a normality test (D'Agostino-Pearson) was performed. Categorical variables are presented as percentages, and continuous variables are shown as mean ± standard deviation if normally distributed or as median (interquartile range) if nonnormally distributed. Significance for intergroup differences was assessed using the Mann-Whitney U test for continuous variables. Logistic regression analyses were used to develop explanatory models on the role of biomarkers in relation to specific clinical parameters. The prognostic value of biomarker levels at different times after hospital admission was assessed using Receiver Operating Characteristics (ROC) curves.
Resultados Results
Se midieron los niveles de BMP2 en sueros de suj etos con hígado normal (HN) (n=75) y de pacientes con EHGNA (n=65). BMP2 levels were measured in serum of subjects with normal liver (NL) (n=75) and patients with NAFLD (n=65).
Los niveles de BMP2 en suero de pacientes con EHGNA aumentaron significativamente en comparación con individuos sanos, según su diagnóstico histológico (p=0.0331). Los datos están expresados como pg/ml, y están representados como mediana (rango intercuartílico, RIQ) (Figura 1A): Serum BMP2 levels in patients with NAFLD were significantly increased compared with healthy individuals, as determined by histological diagnosis (p=0.0331). Data are expressed as pg/ml and represented as median (interquartile range, IQR) (Figure 1A):
Valor de la mediana de BMP2 en suero (pg/ml): HN = 72,45 (RIQ = 51,44 -121,2); EHGNA = 136.1 (RIQ = 95,71 -202,5). Median serum BMP2 value (pg/ml): HN = 72.45 (IQR = 51.44 -121.2); NAFLD = 136.1 (IQR = 95.71 -202.5).
A continuación, los valores de BMP2 se clasificaron entre aquellos por debaj o de la mediana de los valores de BMP2 de la toda la cohorte asignándoles un valor de 0 y aquellos por encima de la mediana a los que se les asignó un valor de 1, siendo la mediana de la cohorte 96.84 (pg/ml de BMP2 circulante). BMP2 values were then categorized into those below the median BMP2 values of the entire cohort by assigning a value of 0 and those above the median by assigning a value of 1, with the cohort median being 96.84 (pg/ml of circulating BMP2).
Se realizó un análisis univariante para la predicción de presencia de EHGNA como variable dependiente y BMP2 clasificado en función de la mediana como variable independiente. El resultado mostró que la variable BMP2 tiene una significancia de p=0,012 en este modelo, con un Odds ratio (OR) de 2,4 (IC 95%: 1,215 - 4,740). A univariate analysis was performed to predict the presence of NAFLD as the dependent variable and BMP2 classified according to the median as the independent variable. The results showed that BMP2 was significant at p=0.012 in this model, with an odds ratio (OR) of 2.4 (95% CI: 1.215–4.740).
Asimismo, se diseñó un modelo predictivo de regresión logística multivariante en el que se combinó la concentración de BMP2 en suero (clasificada en función de la mediana) con otros parámetros utilizados en la práctica habitual en la clínica (edad, sexo, diabetes, colesterol total, etc.) como variables independientes. En este modelo, la variable BMP2 es significativa estadísticamente (p=0,011) con un OR igual a 2,899 (IC 95%: 1,281 - 6,563). La probabilidad pronóstica de este modelo de regresión logística presenta una curva ROC con un área baj o la curva de 0,809 (IC 95%: 0,735 - 0,884) (Figura 1B). Además, se desarrolló una fórmula específica para la aplicación clínica del modelo predictivo. El cálculo de la probabilidad de que un paciente tenga un diagnóstico de EHGNA se ajusta a la siguiente ecuación: A multivariate logistic regression predictive model was also designed, combining serum BMP2 concentration (classified according to the median) with other parameters commonly used in clinical practice (age, sex, diabetes, total cholesterol, etc.) as independent variables. In this model, the BMP2 variable was statistically significant (p=0.011) with an OR of 2.899 (95% CI: 1.281–6.563). The prognostic probability of this logistic regression model presents a ROC curve with an area under the curve of 0.809 (95% CI: 0.735–0.884) (Figure 1B). In addition, a specific formula was developed for the clinical application of the predictive model. The calculation of the probability that a patient has a diagnosis of NAFLD is adjusted to the following equation:
probabilidad de EHGNA = 1 / (1 exp (-7.013 1.064 (Mediana BMP2) 1.009 (Sexo) 0.030 (Edad) 1.619 (IMC 25-30) 1.302 (IMC>30) 1.368 (Diabetes) 0.004 (Glucosa) 0.014 (Colesterol total) 0.005 y-GT), probability of NAFLD = 1 / (1 exp (-7.013 1.064 (Median BMP2) 1.009 (Sex) 0.030 (Age) 1.619 (BMI 25-30) 1.302 (BMI>30) 1.368 (Diabetes) 0.004 (Glucose) 0.014 (Total Cholesterol) 0.005 y-GT),
donde los parámetros se sustituyen en función de: where the parameters are replaced based on:
Mediana BMP2: 0, BMP2 en suero < 96.84 pg/ml, y 1, BMP2 en suero > 96.84 pg/ml. Sexo: 0, sexo femenino y 1, sexo masculino. Median BMP2: 0, serum BMP2 < 96.84 pg/ml, and 1, serum BMP2 > 96.84 pg/ml. Sex: 0, female and 1, male.
Edad: valor en años. Age: value in years.
IMC 25-30: 0, IMC < 25, y 1, IMC 25-30. BMI 25-30: 0, BMI < 25, and 1, BMI 25-30.
IMC > 30: 0, IMC < 30, y 1, IMC > 30. BMI > 30: 0, BMI < 30, and 1, BMI > 30.
Diabetes: 0, diabetes no y 1, diabetes sí. Diabetes: 0, no diabetes and 1, diabetes yes.
Glucosa: valor en mg/dl Glucose: value in mg/dl
Colesterol total: valor en mg/dl Total cholesterol: value in mg/dl
y-GT: valor en UI/L y-GT: value in UI/L
A continuación, se analizó la diferencia entre los niveles de BMP2 en muestras de suero de suj etos con hígado normal (HN) (n=75) y de pacientes con esteatosis simple (ESNA) (n=56), el primer estadío de la EHGNA. Next, the difference between BMP2 levels in serum samples from subjects with normal liver (NL) (n=75) and patients with simple steatosis (NSS) (n=56), the first stage of NAFLD, was analyzed.
Los niveles de BMP2 aumentaron en el suero de pacientes con ESNA respecto a los suj etos con hígado normal según su diagnóstico histológico (p=0.0552). Los datos están expresados como pg/ml, y están representados como mediana (rango intercuartílico, RIQ) (Figura 2A): BMP2 levels were increased in the serum of patients with ESNA compared to subjects with histologically normal livers (p=0.0552). Data are expressed as pg/ml and represented as median (interquartile range, IQR) (Figure 2A):
Valor medio de BMP2 en suero (pg/ml): HN = 72,45 (RIQ = 51,44 - 121,2); ESNA = 134.4 (RIQ = 95.69-202,5). Mean serum BMP2 value (pg/ml): HN = 72.45 (IQR = 51.44–121.2); ESNA = 134.4 (IQR = 95.69–202.5).
A continuación, los valores de BMP2 se clasificaron entre aquellos por debaj o de la mediana de los valores de BMP2 de la cohorte asignándoles un valor de 0 y aquellos por encima de la mediana a los que se les asignó un valor de 1, siendo la mediana de la cohorte 95.69 (pg/ml de BMP2 circulante). BMP2 values were then categorized into those below the median BMP2 values of the cohort by assigning a value of 0 and those above the median by assigning a value of 1, with the cohort median being 95.69 (pg/ml of circulating BMP2).
Se realizó un análisis univariante para la predicción de presencia de EHGNA como variable dependiente y BMP2 clasificado en función de la mediana como variable independiente. El resultado mostró que la variable BMP2 tiene una significancia de p=0,007 en este modelo, con un Odds ratio (OR) de 2,7 (IC 95%: 1,320 - 5,523). A univariate analysis was performed to predict the presence of NAFLD as the dependent variable and BMP2 classified according to the median as the independent variable. The results showed that BMP2 was significant at p=0.007 in this model, with an odds ratio (OR) of 2.7 (95% CI: 1.320–5.523).
Asimismo, se diseñó un modelo predictivo de regresión logística multivariante en el que se combinó la concentración de BMP2 en suero (clasificada en función de la mediana) con otros parámetros utilizados en la práctica habitual en la clínica (edad, sexo, diabetes, colesterol total, etc.) como variables independientes. En este modelo, la variable BMP2 es estadísticamente significativa (p=0,005) con un OR igual a 3,428 (IC 95%: 1,455 - 8.076). La probabilidad pronóstica de este modelo de regresión logística presenta una curva ROC con un área baj o la curva de 0,802 (IC 95%: 0,724 - 0,881) (Figura 2B). Por último, se desarrolló una fórmula específica para la aplicación clínica del modelo predictivo. El cálculo de la probabilidad de que un paciente tenga un diagnóstico de ESNA se ajusta a la siguiente ecuación: A multivariate logistic regression predictive model was also designed, combining serum BMP2 concentration (classified according to the median) with other parameters commonly used in clinical practice (age, sex, diabetes, total cholesterol, etc.) as independent variables. In this model, the BMP2 variable was statistically significant (p=0.005) with an OR of 3.428 (95% CI: 1.455–8.076). The prognostic probability of this logistic regression model presents a ROC curve with an area under the curve of 0.802 (95% CI: 0.724–0.881) (Figure 2B). Finally, a specific formula was developed for the clinical application of the predictive model. The calculation of the probability that a patient has a diagnosis of NAES is adjusted to the following equation:
probabilidad de ESNA = 1 /( 1 exp (-7.429 1.232 (Mediana BMP2) 0.812 (Sexo) 0.032 (Edad) 1.662 (IMC 25-30) 1.132 (IMC>30) 0.894 (Diabetes) 0.007 (Glucosa) 0.015 (Colesterol total) - 0.002 (Triglicéridos) 0.006 y-GT), probability of ESNA = 1 /( 1 exp (-7.429 1.232 (Median BMP2) 0.812 (Sex) 0.032 (Age) 1.662 (BMI 25-30) 1.132 (BMI>30) 0.894 (Diabetes) 0.007 (Glucose) 0.015 (Total Cholesterol) - 0.002 (Triglycerides) 0.006 y-GT),
donde los parámetros se sustituyen en función de: where the parameters are replaced based on:
Mediana BMP2: 0, BMP2 en suero < 95.69 pg/ml, y 1, BMP2 en suero > 95.69 pg/ml. Sexo: 0, sexo femenino y 1, sexo masculino. Median BMP2: 0, serum BMP2 < 95.69 pg/ml, and 1, serum BMP2 > 95.69 pg/ml. Sex: 0, female and 1, male.
Edad: valor en años. Age: value in years.
IMC 25-30: 0, IMC < 25, y 1, IMC 25-30. BMI 25-30: 0, BMI < 25, and 1, BMI 25-30.
IMC > 30: 0, IMC < 30, y 1, IMC > 30. BMI > 30: 0, BMI < 30, and 1, BMI > 30.
Diabetes: 0, diabetes no y 1, diabetes sí. Diabetes: 0, no diabetes and 1, diabetes yes.
Glucosa: valor en mg/dl Glucose: value in mg/dl
Colesterol total: valor en mg/dl Total cholesterol: value in mg/dl
Triglicéridos: valor en mg/dl Triglycerides: value in mg/dl
y-GT: valor en UI/L y-GT: value in UI/L
Por último, se analizó la diferencia entre los niveles de BMP2 en sueros de suj etos con hígado normal (HN) (n=75) y de pacientes con grado 1 de esteatosis simple (G1 ESNA) (n=41), la lesión más temprana de la EHGNA. Finally, the difference between BMP2 levels in serum of subjects with normal liver (NL) (n=75) and patients with grade 1 simple steatosis (G1 ESNA) (n=41), the earliest lesion of NAFLD, was analyzed.
Los niveles proteicos de BMP2 aumentaron en suero de pacientes con grado 1 de ESNA respecto a los suj etos con hígado normal según su diagnóstico histológico (p=0.0416). Los datos están expresados como pg/ml, y están representados como mediana (rango intercuartílico, RIQ) (Figura 3A): BMP2 protein levels were elevated in serum of patients with ESNA grade 1 compared to subjects with histologically normal livers (p=0.0416). Data are expressed as pg/ml and represented as median (interquartile range, IQR) (Figure 3A):
Valor medio de BMP2 en suero (pg/ml): HN = 72,45 (RIQ = 51,44 -121,2); EHGNA = 132,8 (RIQ = 95,69-202,5). Mean serum BMP2 value (pg/ml): HN = 72.45 (IQR = 51.44 -121.2); NAFLD = 132.8 (IQR = 95.69-202.5).
A continuación, los valores de BMP2 se clasificaron entre aquellos por debaj o de la mediana de los valores de BMP2 de la cohorte asignándoles un valor de 0 y aquellos por encima de la mediana a los que se les asignó un valor de 1, siendo la mediana de la cohorte 94,24 (pg/ml de BMP2 circulante). BMP2 values were then categorized into those below the median BMP2 values of the cohort by assigning a value of 0 and those above the median by assigning a value of 1, with the cohort median being 94.24 (pg/ml circulating BMP2).
Se realizó un análisis univariante para la predicción de presencia de EHGNA como variable dependiente y BMP2 clasificado en función de la mediana como variable independiente. El resultado mostró que la variable BMP2 tiene una significancia de 0.004 en este modelo, con un Odds ratio (OR) de 3.231 (IC 95%: 1,446 - 7,218). A univariate analysis was performed to predict the presence of NAFLD as the dependent variable and BMP2 classified according to the median as the independent variable. The results showed that the BMP2 variable had a significance of 0.004 in this model, with an odds ratio (OR) of 3.231 (95% CI: 1.446–7.218).
Asimismo, se diseñó un modelo predictivo de regresión logística multivariante en el que se combinó la concentración de BMP2 en suero (clasificada en función de la mediana) con otros parámetros utilizados en la práctica habitual en la clínica (edad, sexo, diabetes, colesterol total, etc.) como variables independientes. En este modelo, la variable BMP2 es estadísticamente significativa (p=0,002) con un OR igual a 4,624 (IC 95%: 1,720 - 12,427). La probabilidad pronóstica de este modelo de regresión logística presenta una curva ROC con un área baj o la curva de 0.812 (IC 95%: 0,724 - 0, 899) (Figura 3B). Además, desarrollamos una fórmula correspondiente para la aplicación clínica del modelo predictivo. Para ello, el cálculo de la probabilidad de que un paciente tenga un diagnóstico de grado 1 de ESNA se ajusta a la siguiente ecuación: A multivariate logistic regression predictive model was also designed, combining serum BMP2 concentration (classified according to the median) with other parameters commonly used in clinical practice (age, sex, diabetes, total cholesterol, etc.) as independent variables. In this model, the BMP2 variable was statistically significant (p=0.002) with an OR of 4.624 (95% CI: 1.720–12.427). The prognostic probability of this logistic regression model presented a ROC curve with an area under the curve of 0.812 (95% CI: 0.724–0.899) (Figure 3B). In addition, we developed a corresponding formula for the clinical application of the predictive model. To do this, the calculation of the probability that a patient has a grade 1 diagnosis of ESNA was adjusted to the following equation:
probabilidad de G1 ESNA = 1 / (1 exp (-6.964 1.531 (Mediana BMP2) 0.687 (Sexo) 0.037 (Edad) 1.633 (IMC 25-30) 0.573 (IMC>30) 0.015 (Colesterol total) -0.112 (AST) 0.083 (ALT)), donde los parámetros se sustituyen en función de: probability of G1 ESNA = 1 / (1 exp (-6.964 1.531 (Median BMP2) 0.687 (Sex) 0.037 (Age) 1.633 (BMI 25-30) 0.573 (BMI>30) 0.015 (Total Cholesterol) -0.112 (AST) 0.083 (ALT)), where parameters are substituted based on:
Mediana BMP2: 0, BMP2 en suero < 94,24 pg/ml, y 1, BMP2 en suero > 94,24 pg/ml. Sexo: 0, sexo femenino y 1, sexo masculino. Median BMP2: 0, serum BMP2 <94.24 pg/ml, and 1, serum BMP2 >94.24 pg/ml. Sex: 0, female and 1, male.
Edad: valor en años. Age: value in years.
IMC25-30:0, IMC<25, y1, IMC25-30. BMI25-30:0, BMI<25, and1, BMI25-30.
IMC > 30: 0, IMC < 30, y 1, IMC > 30. BMI > 30: 0, BMI < 30, and 1, BMI > 30.
Colesterol total: valor en mg/dl Total cholesterol: value in mg/dl
AST: valor en UI/L AST: value in IU/L
ALT: valor en UI/L BIBLIOGRAFÍA ALT: value in UI/L BIBLIOGRAPHY
1. Carreira, A.C., et al.,Bone Morphogenetic Proteins: structure, biological function and therapeutic applications.Arch Biochem Biophys, 2014. 561: p. 64-73. 1. Carreira, A.C., et al., Bone Morphogenetic Proteins: structure, biological function and therapeutic applications. Arch Biochem Biophys, 2014. 561: p. 64-73.
2. Wozney, J.M., et al.,Novel regulators of bone formation: molecular clones and activities.Science, 1988. 242(4885): p. 1528-34. 2. Wozney, J.M., et al., Novel regulators of bone formation: molecular clones and activities. Science, 1988. 242(4885): p. 1528-34.
3. Morrell, N.W., et al.,Targeting BMP signalling in cardiovascular disease and anaemia.Nat Rev Cardiol, 2016. 13(2): p. 106-20. 3. Morrell, N.W., et al.,Targeting BMP signaling in cardiovascular disease and anaemia. Nat Rev Cardiol, 2016. 13(2): p. 106-20.
4. Rosendahl, A., et al.,Activation of bone morphogenetic protein/Smad signaling in bronchial epithelial cells during airway inflammation.Am J Respir Cell Mol Biol, 2002. 27(2): p. 160-9. 4. Rosendahl, A., et al., Activation of bone morphogenetic protein/Smad signaling in bronchial epithelial cells during airway inflammation. Am J Respir Cell Mol Biol, 2002. 27(2): p. 160-9.
5. Salazar, V.S., L.W. Gamer, and V. Rosen,BMP signalling in skeletal development, disease and repair.Nat Rev Endocrinol, 2016. 12(4): p. 203-21. 5. Salazar, V.S., L.W. Gamer, and V. Rosen,BMP signaling in skeletal development, disease and repair. Nat Rev Endocrinol, 2016. 12(4): p. 203-21.
6. Voumvourakis, K.I., et al.,TGF-beta/BMPs: crucial crossroadin neural autoimmune disorders.Neurochem Int, 2011. 59(5): p. 542-50. 6. Voumvourakis, K.I., et al.,TGF-beta/BMPs: crucial crossroadin neural autoimmune disorders.Neurochem Int, 2011. 59(5): p. 542-50.
7. Singh, A. and R.J. Morris,The Yin and Yang of bone morphogenetic proteins in cancer.Cytokine Growth Factor Rev, 2010. 21(4): p. 299-313. 7. Singh, A. and R.J. Morris,The Yin and Yang of bone morphogenetic proteins in cancer. Cytokine Growth Factor Rev, 2010. 21(4): p. 299-313.
8. Munoz-Felix, J.M., et al.,TGF-beta/BMP proteins as therapeutic targets in renal fibrosis. Where have we arrived after25 years oftrials and tribulations?Pharmacol Ther, 2015. 156: p. 44-58. 8. Munoz-Felix, J.M., et al.,TGF-beta/BMP proteins as therapeutic targets in renal fibrosis. Where have we arrived after25 years of trials and tribulations? Pharmacol Ther, 2015. 156: p. 44-58.
9. Whittle, A.J., et al.,BMP8B increases brown adipose tissue thermogenesis through both central and peripheral actions.Cell, 2012. 149(4): p. 871-85. 9. Whittle, A.J., et al., BMP8B increases brown adipose tissue thermogenesis through both central and peripheral actions. Cell, 2012. 149(4): p. 871-85.
10. Mundi, M.S., et al.,Evolution ofNAFLD and Its Management.Nutr Clin Pract, 2020. 10. Mundi, M.S., et al., Evolution of NAFLD and Its Management. Nutr Clin Pract, 2020.
35(1): p. 72-84. 35(1): p. 72-84.
11. Wang, C.Y., et al.,Iron, erythropoietin, and inflammation regulate hepcidin in Bmp2-deficient mice, but serum iron fails to induce hepcidin in Bmp6-deficient mice.Am J Hematol, 2019. 94(2): p. 240-248. 11. Wang, C.Y., et al., Iron, erythropoietin, and inflammation regulates hepcidin in Bmp2-deficient mice, but serum iron fails to induce hepcidin in Bmp6-deficient mice. Am J Hematol, 2019. 94(2): p. 240-248.
12. Roeb, E., etal.,TIMP expression in toxic and cholestatic liver injury in rat.J Hepatol, 1997. 27(3): p. 535-44. 12. Roeb, E., etal., TIMP expression in toxic and cholestatic liver injury in rat. J Hepatol, 1997. 27(3): p. 535-44.
13. Chung, Y.H., et al.,BMP-2 restoration aids in recovery from liver fibrosis by attenuating TGF-beta1 signaling.Lab Invest, 2018. 98(8): p. 999-1013. 13. Chung, Y.H., et al., BMP-2 restoration aids in recovery from liver fibrosis by attenuating TGF-beta1 signaling. Lab Invest, 2018. 98(8): p. 999-1013.
14. Wu, G., et al.,High Levels ofBMP2 Promote Liver Cancer Growth via the Activation of Myeloid-Derived Suppressor Cells.FrontOncol, 2020. 10: p. 194. 14. Wu, G., et al.,High Levels ofBMP2 Promote Liver Cancer Growth via the Activation of Myeloid-Derived Suppressor Cells.FrontOncol, 2020. 10: p. 194.
15. Wu, J.B., et al.,Effects of siRNA-targeting BMP-2 on the abilities of migration and invasion of human liver cancer SMMC7721 cells and its mechanism.Cancer Gene Ther, 2011. 18(1): p. 20-5. 15. Wu, J.B., et al., Effects of siRNA-targeting BMP-2 on the abilities of migration and invasion of human liver cancer SMMC7721 cells and its mechanism. Cancer Gene Ther, 2011. 18(1): p. 20-5.
16. Zuo, W.H., et al.,Promotive effects of bone morphogenetic protein 2 on angiogenesis in hepatocarcinoma via múltiple signal pathways.Sci Rep, 2016. 6: p. 16. Zuo, W.H., et al., Promotive effects of bone morphogenetic protein 2 on angiogenesis in hepatocarcinoma via multiple signal pathways. Sci Rep, 2016. 6: p.
37499. 37499.
17. Garcia-Monzon, C., et al.,Prevalence and risk factors for biopsy-proven nonalcoholic fatty liver disease and non-alcoholic steatohepatitis in a prospective cohort of adult patients with gallstones.Liver Int, 2015. 35(8): p. 1983-91. 17. Garcia-Monzon, C., et al., Prevalence and risk factors for biopsy-proven nonalcoholic fatty liver disease and non-alcoholic steatohepatitis in a prospective cohort of adult patients with gallstones. Liver Int, 2015. 35(8): p. 1983-91.
18. Kleiner, D.E., et al.,Design and validation of a histological scoring system for nonalcoholic fatty liver disease.Hepatology, 2005. 41(6): p. 1313-21. 18. Kleiner, D.E., et al., Design and validation of a histological scoring system for nonalcoholic fatty liver disease. Hepatology, 2005. 41(6): p. 1313-21.
Claims (3)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| ES202130777A ES2933629B2 (en) | 2021-08-10 | 2021-08-10 | METHOD FOR EARLY DETECTION OF LIVER DAMAGE USING BONE MORPHOGENETIC PROTEIN 2 (BMP2) IN LIQUID BIOPSY |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| ES202130777A ES2933629B2 (en) | 2021-08-10 | 2021-08-10 | METHOD FOR EARLY DETECTION OF LIVER DAMAGE USING BONE MORPHOGENETIC PROTEIN 2 (BMP2) IN LIQUID BIOPSY |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2933629A1 ES2933629A1 (en) | 2023-02-10 |
| ES2933629B2 true ES2933629B2 (en) | 2025-03-31 |
Family
ID=85158955
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES202130777A Active ES2933629B2 (en) | 2021-08-10 | 2021-08-10 | METHOD FOR EARLY DETECTION OF LIVER DAMAGE USING BONE MORPHOGENETIC PROTEIN 2 (BMP2) IN LIQUID BIOPSY |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| ES (1) | ES2933629B2 (en) |
-
2021
- 2021-08-10 ES ES202130777A patent/ES2933629B2/en active Active
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| ES2933629A1 (en) | 2023-02-10 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| ES2674570T3 (en) | MCAM as a biomarker for liquid homeostasis | |
| Ramesh et al. | Urinary netrin-1 is an early predictive biomarker of acute kidney injury after cardiac surgery | |
| EP3540440B1 (en) | Methods and uses for evaluating renal injury and renal status | |
| DK2734542T3 (en) | PATOLOGIBIOMARKØRASSAY | |
| CN102460174B (en) | Clinical diagnosis of liver fibrosis using a novel panel of low-abundance human plasma protein biomarkers | |
| ES2794448T3 (en) | Procedures for the diagnosis and prognosis of sepsis | |
| Giannakopoulos et al. | Factor XI is a substrate for oxidoreductases: enhanced activation of reduced FXI and its role in antiphospholipid syndrome thrombosis | |
| Huang et al. | Quantitative proteomic analysis identified paraoxonase 1 as a novel serum biomarker for microvascular invasion in hepatocellular carcinoma | |
| Mehrsai et al. | The relationship between serum and urinary Fetuin-A levels and kidney stone formation among kidney stone patients | |
| Kobayashi et al. | Serum apolipoprotein A2 isoforms in autoimmune pancreatitis | |
| Yang et al. | Hepatoma-derived growth factor predicts disease severity and survival in pulmonary arterial hypertension | |
| Zoheiry et al. | Serum markers of epithelial mesenchymal transition as predictors of HCV-induced liver fibrosis, cirrhosis and hepatocellular carcinoma | |
| WO2017042416A1 (en) | Method for separating the fraction joined to glycosaminoglycans and uses thereof | |
| Zhang et al. | Serum levels of alpha-smooth muscle actin and c-Met as biomarkers of the degree of severity of Henoch–Schonlein purpura nephritis | |
| WO2015140317A1 (en) | New markers for the assessment of the risk for development of a cardiovascular disorder | |
| ES2933629B2 (en) | METHOD FOR EARLY DETECTION OF LIVER DAMAGE USING BONE MORPHOGENETIC PROTEIN 2 (BMP2) IN LIQUID BIOPSY | |
| Li et al. | Serum secretory phospholipase A2 group IB correlates with the severity of membranous nephropathy | |
| RU2573985C2 (en) | Using prosomatostatin in diagnostics | |
| Smedbråten et al. | Collectin liver 1 and collectin kidney 1 of the lectin complement pathway are associated with mortality after kidney transplantation | |
| WO2014023820A1 (en) | Diagnostic of heart failure | |
| CN111537719A (en) | Application of serum Sparcl1 protein in the diagnosis of nonalcoholic steatohepatitis | |
| Hemken et al. | Development and analytical performance of a new ARCHITECT automated dipeptidyl peptidase-4 immunoassay | |
| Tammen et al. | Oncopeptidomics–a commentary on opportunities and limitations | |
| EP3311164B1 (en) | Methods and compositions for diagnosis and prognosis of appendicitis and differentiation of causes of abdominal pain | |
| ES3036835T3 (en) | Biomarker, methods, and compositions thereof for evaluation or management of kidney function or diagnosing or aid in diagnosing kidney dysfunction or kidney disease |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| BA2A | Patent application published |
Ref document number: 2933629 Country of ref document: ES Kind code of ref document: A1 Effective date: 20230210 |
|
| FG2A | Definitive protection |
Ref document number: 2933629 Country of ref document: ES Kind code of ref document: B2 Effective date: 20250331 |