ES2976595B2 - Mutante de piruvato deshidrogenasa y metodo para producir l-aminoacido usando el mismo - Google Patents

Description

[0001] DESCRIPCIÓN

[0004] MUTANTE DE PIRUVATO DESHIDROGENASA Y MÉTODO PARA PRODUCIR

[0006] L-AMINOÁCIDO USANDO EL MISMO

[0008] CAMPO TÉCNICO

[0009] La presente descripción se refiere al campo de la biotecnología, y específicamente se refiere a un mutante de piruvato deshidrogenasa, un polinucleótido que codifica el mutante, una célula huésped que contiene el mutante, y un método para producir L-aminoácidos usando el mutante.

[0011] ANTECEDENTES

[0012] El complejo multienzimático de piruvato deshidrogenasa (PDHC) es un grupo de enzimas limitantes de la velocidad. EnCorynebacterium glutamicum,el PDHC cataliza la descarboxilación oxidativa irreversible del piruvato generado en el proceso de glucólisis en acetil-CoA, que vincula la oxidación aeróbica de los azúcares con el ciclo del ácido tricarboxílico y la fosforilación oxidativa, y es una enzima clave para el ciclo del ácido tricarboxílico. El PDHC está compuesto por piruvato deshidrogenasa (E1p), dihidrolipoamida acetiltransferasa (E2p) y dihidrolipoamida deshidrogenasa (E3p). La enzima difiere de la fosforilasa en que tiene formas tanto inactivas (fosforiladas) como activas (desfosforiladas). Existe una pluralidad de moduladores alostéricos que regulan la conversión de las dos formas de la enzima y se ven afectados por la actividad hormonal.

[0013] Sobre todo, la enzima E1p está codificada por el genaceE.Se ha observado que el debilitamiento de la expresión de AceE puede mejorar el rendimiento de L-aminoácidos enCorynebacterium.En el documento CN106715687A también se indica que cualquier mutación de aminoácidos en las posiciones de 190 a 205 o de 415 a 440 de AceE puede mejorar el rendimiento de L-lisina porCorynebacterium glutamicum.Por el momento no se han indicado nuevos sitios de mutación.

[0015] BREVE DESCRIPCIÓN

[0016] En función de los resultados de la predicción de la estructura de AceE, en la presente divulgación se ha llevado a cabo una mutagénesis de saturación en la posición 217 y se observó que algunos de los mutantes pueden aumentar significativamente el rendimiento de L-lisina en las células huésped, completando así la presente divulgación.

[0017] Un objetivo de la presente descripción es proporcionar un nuevo mutante de piruvato deshidrogenasa, una célula huésped que contenga el mutante, y un método para producir L-lisina usando la célula huésped que contiene el mutante.

[0018] En el primer aspecto, la presente divulgación proporciona un nuevo mutante de piruvato deshidrogenasa, donde el mutante es el siguiente:

[0019] 1) un mutante en el que una secuencia de aminoácidos se expone en SEQ ID NO:1 y la posición 217 de SEQ ID NO:1 es cualquiera de alanina, ácido aspártico, ácido glutámico, leucina y prolina;

[0020] 2) un polipéptido que presenta más del 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o más de homología con la SEQ ID NO:1 y la posición 217 correspondiente a SEQ ID NO:1 es cualquiera de alanina, ácido aspártico, ácido glutámico, leucina y prolina; o 3) un mutante en el que se añaden o se suprimen uno o más aminoácidos en ambos extremos de un polipéptido expuesto en la SEQ ID NO:1 y la posición 217 correspondiente a SEQ ID NO:1 es cualquiera de alanina, ácido aspártico, ácido glutámico, leucina y prolina; preferiblemente, se añaden o se suprimen 1, 2, 3, 4, 5 o 6 aminoácidos en ambos extremos del polipéptido expuesto en la SEQ ID NO:1.

[0021] En el segundo aspecto, la presente descripción proporciona un polinucleótido codificante que codifica el mutante de piruvato deshidrogenasa.

[0022] En el tercer aspecto, la presente descripción proporciona un casete de expresión que contiene el nucleótido codificante del mutante de piruvato deshidrogenasa. El nucleótido codificante está ligado operativamente a un promotor.

[0023] En el cuarto aspecto, la presente descripción proporciona un vector que contiene el nucleótido codificante del mutante de piruvato deshidrogenasa, en particular, un vector de expresión.

[0024] En el quinto aspecto, la presente descripción proporciona una célula huésped que contiene el nucleótido codificante del mutante de piruvato deshidrogenasa.

[0025] Asimismo, la célula huésped incluye, pero sin carácter limitativo, microorganismos del géneroEscherichia,géneroErwinia,géneroSerratia,géneroProvidencia,géneroEnterobacteria,géneroSalmonella,géneroStreptomyces,géneroPseudomonas,géneroBrevibacteriumy del géneroCorynebacterium.Opcionalmente, la célula huésped esCorynebacterium glutamicumoEscherichia coli.Preferiblemente, la célula huésped incluye, aunque sin carácter limitativo, ATCC13032 deCorynebacterium glutamicum,ATCC13869 deCorynebacterium glutamicum,ATCC 14067 deCorynebacterium glutamicum,y cepas derivadas de estas.

[0026] En el sexto aspecto, la presente divulgación proporciona el uso del mutante de piruvato deshidrogenasa o su nucleótido codificante en la producción de un L-aminoácido.

[0027] Preferiblemente, el L-aminoácido se selecciona del grupo que consiste en L-lisina, L-treonina, L-metionina, L-isoleucina, L-valina, L-leucina y L-alanina.

[0028] En el séptimo aspecto, la presente divulgación proporciona un método para producir un L-aminoácido, donde el método comprende el cultivo de la célula huésped según el quinto aspecto para que la célula huésped produzca un L-aminoácido, y además comprende una etapa de aislamiento y extracción o recuperación del L-aminoácido a partir de un medio.

[0029] Además, el L-aminoácido incluye, aunque sin carácter limitativo, L-lisina, L-treonina, L-metionina, L-isoleucina L-valina, L-leucina y L-alanina; más preferentemente, el L-aminoácido es L-lisina.

[0030] El mutante de piruvato deshidrogenasa proporcionado en la presente descripción puede mejorar el rendimiento y la tasa de conversión de L-aminoácidos en cepas, y no inhibe el crecimiento de las cepas mientras mejora el rendimiento, lo que proporciona una nueva estrategia para la producción de L-aminoácidos a gran escala.

[0032] DESCRIPCIÓN DETALLADA

[0033] Definiciones de términos

[0034] Cuando se utiliza en combinación con el término «que incluye(n)» en las reivindicaciones y/o en la memoria descriptiva, el término «un/a» puede referirse a «uno/a», o referirse a «uno/a o más», «al menos uno/a» y «uno/a o más de uno/a».

[0035] Según se utiliza en las reivindicaciones y en la memoria descriptiva, el término «que incluye(n)», «que presenta(n)», «que comprende(n)» o «que contiene(n)» pretende ser inclusivo o abierto, y no excluye elementos o métodos y etapas adicionales o no citados.

[0036] A lo largo del documento de solicitud, el término "aproximadamente" significa que un valor incluye la desviación estándar del error provocado por el dispositivo o método empleado para medir el valor.

[0037] Es aplicable al contenido descrito en el presente documento que el término «o» se define solo como alternativas e «y/o», pero el término «o» usado en las reivindicaciones se refiere a «y/o» a menos que se indique expresamente lo contrario como únicamente alternativas o exclusión mutua entre alternativas.

[0038] El «intervalo numérico» seleccionado/opcional/preferido, cuando se utiliza en las reivindicaciones o en la memoria descriptiva, no solo incluye los puntos finales numéricos en ambos extremos del intervalo, sino también todos los números naturales cubiertos entre los puntos finales numéricos anteriores con respecto a estos puntos finales numéricos.

[0039] El término «piruvato deshidrogenasa» utilizado en el presente documento se refiere a una de las enzimas que componen el complejo multienzimático de piruvato deshidrogenasa (PDHC), y participa en la conversión de piruvato en acetil-CoA. Tal y como se utiliza en el presente documento, la piruvato deshidrogenasa no se limita específicamente siempre que tenga una actividad correspondiente, y puede ser una piruvato deshidrogenasa derivada de un microorganismo del géneroCorynebacterium,específicamente,Corynebacterium glutamicum,pero no se limita a esta. Por ejemplo, la piruvato deshidrogenasa puede ser una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:1 o una secuencia de aminoácidos que presenta al menos un 75 %, específicamente al menos un 80 %, más específicamente un 85 %, e incluso más específicamente un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % o más homología con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:1. La proteína E1p que presenta una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:1 puede estar codificada por el genaceEque presenta una secuencia de polinucleótidos de la SEQ ID NO:2, pero no se limita a esta. Además, si una secuencia de aminoácidos tiene una homología con la secuencia anterior y tiene sustancialmente la misma o una correspondiente actividad de la proteína de la SEQ ID NO:1, es evidente que una secuencia de aminoácidos con una deleción, modificación, sustitución o adición debe encuadrarse dentro del alcance de la presente divulgación. En la presente descripción, cualquier secuencia de polinucleótidos que codifique la piruvato deshidrogenasa puede encuadrarse dentro del alcance de la presente divulgación. Por ejemplo, la secuencia de polinucleótidos puede ser una secuencia de polinucleótidos que presenta al menos un 75 %, específicamente al menos un 80 %, más específicamente un 85 %, e incluso más específicamente un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % o más homología con la secuencia de polinucleótidos de la SEQ ID NO:2. Además, en función de la degeneración de codones o considerando los codones preferidos por los organismos para expresar la proteína, la secuencia de polinucleótidos que codifica la proteína puede presentar diversas variantes en la región codificante hasta el punto de no alterar la secuencia de aminoácidos de la proteína expresada a partir de la región codificante.

[0040] El mutante de piruvato deshidrogenasa de la presente descripción puede incluir polipéptidos que presentan una secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO:1, y cuyo aminoácido correspondiente a la posición 217 de la SEQ ID NO:1 es cualquiera seleccionado del grupo que consiste en alanina, ácido aspártico, ácido glutámico, leucina y prolina.

[0041] Asimismo, el mutante de piruvato deshidrogenasa de la presente descripción puede incluir no solo un polipéptido que presenta la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:1, sino también un mutante de piruvato deshidrogenasa que presenta un 75 % o más, específicamente 80 % o más, más específicamente 85 % o más, e incluso más específicamente 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % o más de homología con el polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:1, siempre que sus aminoácidos correspondientes a la posición 217 de SEQ ID NO:1 sean cualquiera seleccionado del grupo que consiste en alanina, ácido aspártico, ácido glutámico, leucina y prolina, y sus actividades se debilitan significativamente en comparación con la actividad de la piruvato deshidrogenasa de tipo silvestre. Es evidente que las secuencias de aminoácidos que presentan sustancialmente la misma o una correspondiente actividad biológica del polipéptido que presenta la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:1 también deberían encuadrarse dentro del alcance de la presente divulgación. Todos los expertos en la materia saben que entre una y varias sustituciones, deleciones, adiciones y reemplazos de aminoácidos realizados en la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO:1 permiten secuencias de aminoácidos que presentan sustancialmente la misma o una correspondiente actividad biológica del polipéptido que presenta la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:1.

[0042] El término «polinucleótido» utilizado en el presente documento se refiere a un polímero compuesto por nucleótidos. El polinucleótido puede estar en forma de un fragmento individual, o puede ser una parte constituyente de una estructura de secuencia de nucleótidos más grande, que se deriva de una secuencia de nucleótidos que se ha aislado al menos una vez en cantidad o concentración, y podría reconocerse, manipularse y recuperarse de la secuencia y su secuencia de nucleótidos componente mediante un método de biología molecular estándar (por ejemplo, usando un vector de clonación). Cuando una secuencia de nucleótidos está representada por una secuencia de ADN (es decir, A, T, G, C), también incluye una secuencia de ARN (es decir, A, U, G, C), donde «U» sustituye a «T». Dicho de otro modo, «polinucleótido» se refiere a un polímero de nucleótidos retirado de otros nucleótidos (un fragmento individual o un fragmento completo), o puede ser una parte constituyente o componente de una estructura de nucleótidos más grande, tal como un vector de expresión o una secuencia policistrónica. Los polinucleótidos incluyen secuencias de ADN, ARN y ADNc.

[0043] Específicamente, el polinucleótido codificante del mutante de piruvato deshidrogenasa de la presente descripción incluye un polinucleótido expuesto en la SEQ ID NO:2, y polinucleótidos que presentan mutaciones en las posiciones 649 a 651. Asimismo, el polinucleótido de la presente divulgación incluye además cualquier polinucleótido que presenta un 75%o más, específicamente 80%o más, más específicamente un 85%o más, e incluso más específicamente un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % o más homología con el polinucleótido expuesto en la SEQ ID NO:2.

[0044] El término «homología» utilizado en el presente documento se refiere a un porcentaje de identidad entre dos porciones polinucleotídicas o polipeptídicas. La homología entre secuencias de una fracción y la otra fracción se puede determinar mediante una técnica conocida en la materia. Por ejemplo, la homología se puede determinar alineando directamente la información de secuencia de dos moléculas de polinucleótidos o dos moléculas de polipéptidos usando un programa informático accesible. Ejemplos del programa informático pueden incluir BLAST (NCBI), CLC Main Workbench (CLC bio) y MegAlignTM (DNASTAR Inc.), etc. Además, la homología entre polinucleótidos se puede determinar mediante las siguientes etapas: hibridar los polinucleótidos con la condición de formar una cadena doble estable entre las regiones homólogas, desensamblar con una nucleasa específica de cadena simple y luego realizar la determinación del tamaño en los fragmentos desensamblados.

[0045] El término «tipo silvestre», según se utiliza en el presente documento, se refiere a un objeto que se puede encontrar en la naturaleza. Por ejemplo, una secuencia de polipéptidos o polinucleótidos presente en un organismo que puede aislarse de una fuente en la naturaleza y que no ha sido modificada intencionalmente por el ser humano en el laboratorio es de origen natural. Según se utiliza en el presente documento, «de origen natural» y «de tipo silvestre» son sinónimos. En algunas formas de realización, la piruvato deshidrogenasa de tipo silvestre en la presente descripción se refiere a un polipéptido con una secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO:1.

[0046] El término «mutante» utilizado en el presente documento se refiere a un polinucleótido o polipéptido que, con respecto al polinucleótido o polipéptido «de tipo silvestre» o «comparativo», contiene alternancia(s) (es decir, sustitución, inserción y/o deleción) de polinucleótido(s) en una o más (p. ej., varias) posiciones, donde la sustitución se refiere a un reemplazo de un nucleótido distinto por un nucleótido que ocupa una posición; la deleción se refiere a la eliminación de un nucleótido que ocupa cierta posición; y la inserción se refiere a una adición de un nucleótido después del nucleótido adyacente e inmediatamente después de la posición ocupada.

[0047] En algunas formas de realización, la «mutación» empleada en el presente documento es una «sustitución» provocada por una sustitución de una o más bases en uno o más nucleótidos por otra base diferente, que también se denomina mutación de reemplazo de base o mutación puntual.

[0048] El término «expresión» utilizado en el presente documento incluye cualquier etapa que implica la producción de ARN y proteínas, incluyendo, sin carácter limitativo: transcripción, modificación postranscripcional, traducción, modificación postraduccional y secreción.

[0049] El término «vector» utilizado en el presente documento se refiere a una construcción de ADN que contiene secuencias de ADN ligadas operativamente a secuencias de control apropiadas, con el fin de expresar un gen de interés en un huésped adecuado. «Vector de expresión recombinante» se refiere a una estructura de ADN usada para expresar, por ejemplo, un polinucleótido que codifica un polipéptido deseado. El vector de expresión recombinante puede incluir, por ejemplo: i) una colección de elementos genéticos que presentan un efecto regulador sobre la expresión génica, tales como promotores y potenciadores; ii) una estructura o secuencia codificante que se transcribe en ARNm y se traduce en una proteína; y iii) subunidades transcripcionales que transcriben y traducen adecuadamente las secuencias de iniciación y terminación. Los vectores de expresión recombinantes se construyen de cualquier manera adecuada. La naturaleza del vector no es crítica, y se puede utilizar cualquier vector, incluidos plásmidos, virus, fagos y transposones. Los vectores potenciales utilizados en el presente documento incluyen, pero sin carácter limitativo, secuencias de ADN cromosómicas, no cromosómicas y sintéticas, tales como plásmidos bacterianos, ADN de fagos, plásmidos de levaduras y vectores derivados de combinaciones de plásmidos y ADN de fagos, y ADN de virus tales como vaccinia, adenovirus, avipoxvirus, baculovirus, SV40 y pseudorrabia.

[0050] El término «célula huésped» usado en el presente documento se refiere a cualquier tipo de célula que implica la transformación, transfección, transducción o similar del mutante de piruvato deshidrogenasa o el vector de expresión de la presente descripción. El término «célula huésped recombinante» abarca una célula huésped que es distinta de la célula parental tras la introducción de un elemento de iniciación de la transcripción o un vector de expresión recombinante. La célula huésped recombinante se consigue específicamente mediante transformación.

[0051] El término «transformación» utilizado en el presente documento tiene el significado generalmente entendido por un experto en la materia, a saber, un proceso de introducción de un ADN exógeno en un huésped. Los métodos para la transformación incluyen cualquier método para introducir un ácido nucleico en una célula. Estos métodos incluyen, pero sin carácter limitativo, electroporación, precipitación con fosfato de calcio, precipitación con cloruro de calcio, microinyección, un método de polietilenglicol (PEG), un método de DEAE-dextrano, un método de liposomas catiónicos y un método de acetato de litio-DMSO.

[0052] La célula huésped de la presente descripción puede ser una célula procariota o una célula eucariota, siempre que las células incluyan el mutante de piruvato deshidrogenasa de la presente divulgación. En algunas formas de realización, la célula huésped se refiere a una célula procariota. Específicamente, la célula huésped se deriva de microorganismos adecuados para la producción por fermentación de aminoácidos, ácidos orgánicos, materiales de base biológica o compuestos farmacéuticos, que pueden incluir cepas tales comoEscherichia, Erwinia, Serratia, Providencia, Enterobacteria, Salmonella, Streptomyces, Pseudomonas, BrevibacteriumyCorynebacterium,pero no se limitan a estas. Opcionalmente, la célula huésped puede serCorynebacterium glutamicum.Preferiblemente, la célula huésped puede ser ATCC 13032 deCorynebacterium glutamicum,ATCC 13869 deCorynebacterium glutamicum, ATCC 14067 deCorynebacterium glutamicum,y cepas derivadas de estas1. A modo de ejemplo, la cepa derivada puede ser cualquier cepa, siempre que la cepa sea capaz de producir L-aminoácidos.

[0053] A modo de ejemplo, la célula huésped es una célula huésped que produce lisina. En algunas formas de realización, la célula huésped que produce lisina puede ser una cepa derivada que expresa la aspartato quinasa que alivia la inhibición por retroalimentación basada en la ATCC 13032 deCorynebacterium glutamicum.Además, la célula huésped que produce lisina también puede ser otros tipos de cepas que presentan la capacidad de producir lisina.

[0054] En algunas formas de realización, la célula huésped que produce lisina puede incluir, además, pero sin carácter limitativo, uno o más genes seleccionados de los siguientes genes que tienen una expresión atenuada o reducida:

[0055] a. genadhEque codifica etanol deshidrogenasa;

[0056] b. genackAque codifica acetato quinasa;

[0057] c. genptaque codifica fosfato acetiltransferasa;

[0058] d. genldhAque codifica lactato deshidrogenasa;

[0059] e. genfocAque codifica transportador de formiato;

[0060] f. genpflBque codifica piruvato formiato liasa;

[0061] g. genpoxBque codifica piruvato oxidasa;

[0062] h. genthrAque codifica aspartato quinasa I/homoserina deshidrogenasa I como enzima bifuncional;

[0063] i. genthrBque codifica homoserina quinasa;

[0064] j. genldcCque codifica lisina descarboxilasa; y

[0065] k. gencadAque codifica lisina descarboxilasa.

[0066] En algunas formas de realización, las células huésped que producen lisina pueden incluir, además, pero sin carácter limitativo, uno o más genes seleccionados de los siguientes genes que están potenciados o sobreexpresados:

[0067] a. gendapAque codifica dihidrodipiridina sintasa, que alivia la inhibición por retroalimentación de la lisina;

[0068] b. gendapBque codifica dihidrodipicolinato reductasa;

[0069] c. genddhque codifica diaminopimelato deshidrogenasa;

[0070] d.dapDque codifica tetrahidrodipicolinato succinilasa ydapEque codifica succinildiaminopimelato desacilasa;

[0071] e. genasdque codifica aspartato-semialdehído deshidrogenasa;

[0072] f. genppcque codifica fosfoenolpiruvato carboxilasa;

[0073] g. genpntABque codifica niacinamida adenina dinucleótido transhidrogenasa; y h. genlysEque codifica la proteína de transporte de lisina.

[0074] A modo de ejemplo, las células huésped son células huésped que producen treonina. En algunas formas de realización, las células huésped que producen treonina pueden ser cepas que expresan la aspartato quinasa LysC que alivia la inhibición por retroalimentación basada en la ATCC 13032 deCorynebacterium glutamicum.En otras formas de realización, las células huésped que producen treonina también pueden ser otros tipos de cepas que presentan la capacidad de producir treonina.

[0075] En algunas formas de realización, uno o más genes seleccionados de los siguientes genes se potencian o sobreexpresan en las células huésped que producen treonina:

[0076] a. genthrABCque codifica el operón de treonina;

[0077] b. genhomque codifica homoserina deshidrogenasa, que alivia la inhibición por retroalimentación;

[0078] c. gengapque codifica gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa;

[0079] d. genpycque codifica piruvato carboxilasa;

[0080] e. genmqoque codifica malato : quinona oxidorreductasa;

[0081] f. gentktque codifica transcetolasa;

[0082] g. gengndque codifica 6-fosfogluconato deshidrogenasa;

[0083] h. genthrEque codifica el transportador de treonina; e

[0084] i. genenoque codifica enolasa.

[0085] A modo de ejemplo, las células huésped son células huésped que producen isoleucina. En algunas formas de realización, las células huésped que producen isoleucina son cepas que producen L-isoleucina mediante la sustitución del aminoácido en la posición 323 de la L-treonina deshidratasa codificada por el genilvAcon alanina. En otras formas de realización, las células huésped que producen isoleucina también pueden ser otros tipos de cepas que presentan la capacidad de producir isoleucina.

[0086] A modo de ejemplo, las células huésped son células huésped que producen O-acetilhomoserina. En algunas formas de realización, las células huésped que producen O-acetilhomoserina son cepas que producen O-acetilhomoserina mediante la inactivación de O-acetilhomoserina(tiol)-liasa. En otras formas de realización, las células huésped que producen O-acetilhomoserina también pueden ser otros tipos de cepas que presentan la capacidad de producir O-acetilhomoserina.

[0087] A modo de ejemplo, las células huésped son células huésped que producen metionina. En algunas formas de realización, las células huésped que producen metionina son cepas que producen metionina mediante la inactivación de los reguladores transcripcionales de metionina y cisteína. En otras formas de realización, las células huésped que producen metionina también pueden ser otros tipos de cepas que presentan la capacidad de producir metionina.

[0088] El término «L-aminoácido» usado en el presente documento se refiere a todos los L-aminoácidos que se pueden producir a partir de diferentes fuentes de carbono a través de piruvato. Más específicamente, el L-aminoácido puede incluir L-lisina, L-treonina, L-metionina, L-isoleucina, L-valina, L-leucina o L-alanina, e incluso más específicamente, L-lisina y L-valina.

[0089] El término «cultivo» utilizado en el presente documento puede ser el cultivo llevado a cabo mediante métodos convencionales en la técnica, incluyendo, pero sin carácter limitativo, cultivo en placas de pocillos, cultivo con agitación, cultivo por lotes, cultivo continuo, cultivo semicontinuo, etc. Además, pueden ajustarse de forma adecuada varias condiciones de cultivo, tales como la temperatura, el tiempo y el valor de pH del medio según las situaciones reales.

[0090] A menos que se defina de otro modo en la invención o se indique claramente por el contexto, todos los términos técnicos y científicos utilizados en el presente documento tienen los mismos significados que normalmente entiende un experto en la materia a la que pertenece la presente divulgación.

[0092] Ejemplos

[0093] Otros objetivos, características y ventajas de la presente divulgación se harán evidentes a partir de la siguiente descripción detallada. Sin embargo, debe apreciarse que la descripción detallada y los ejemplos específicos (aunque indican los ejemplos específicos de la presente descripción) se proporcionan simplemente con fines ilustrativos, ya que, después de leer la descripción detallada, serán evidentes para un experto en la materia diversas alteraciones y modificaciones realizadas dentro del espíritu y alcance de la presente divulgación.

[0094] Todas las técnicas experimentales y los métodos experimentales utilizados en los ejemplos, a menos que se especifique lo contrario, son técnicas y métodos convencionales. Por ejemplo, los métodos experimentales para los cuales no se indican condiciones específicas en los siguientes ejemplos se realizan generalmente de acuerdo con condiciones convencionales, tales como las descritas por Sambrooket al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual(Nueva York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989), o aquellas recomendadas por los fabricantes. Todos los materiales, reactivos, etc., utilizados en los ejemplos, a no ser que se especifique lo contrario, están disponibles comercialmente.

[0096] Ejemplo 1. Construcción del plásmido de edición pCas9gRNA-aceE217

[0097] Después de un análisis intensivo de la enzima AceE, la presente descripción predijo que la posición 217 podría ser el sitio que afectó a su actividad, por lo que se mutó este sitio para un estudio posterior. Posteriormente, de acuerdo con el método de clonación documentado de Goldengate (WANG, Yu,et al.Expanding targeting scope, editing window, and base transition capability of base editing inCorynebacterium glutamicum.Biotechnology and bioengineering, 2019, 116:3016-3029), se construyó un plásmido pCas9gRNA dirigido al codón del residuo de aminoácido en la posición 217 en el genaceE,y la región de unión al ADN diana del ARNsg fue CCAACTGTGTCCATGGGTCT. El método específico fue el siguiente: Se desnaturalizó y se hibridó 217-F/217-R para obtener un producto de ADN bicatenario con extremos pegajosos, que después se sometió a clonación Goldengate (kit de montaje Golden Gate de NEB®, #E1601) con el plásmido pCas9gRNA-cco® (en referencia a CN112111469B) para obtener el plásmido pCas9gRNA-aceE217. Este plásmido expresó la proteína Cas9 y el ARNsg dirigido a la región de mutación dirigida al sitio. Los cebadores utilizados para construir el plásmido anterior se enumeraron en la Tabla 1.

[0098] Los cebadores utilizados en los ejemplos de la presente divulgación se enumeraron en la Tabla 1 que se muestra a continuación.

[0101]

[0102]

[0103]

[0106] Ejemplo 2. Construcción de mutante con una mutación de codón del aminoácido en la posición 217 en el gen aceE de Corynebacterium glutamicum

[0107] LaCorynebacterium glutamicumde tipo silvestre no pudo producir lisina, pero laCorynebacterium glutamicumfue capaz de producir lisina tras la introducción de mutaciones puntuales enlysC, pycyhom.En el presente Ejemplo, se utilizó ATCC13032 como cepa original. En primer lugar, se construyó una cepa productora de lisina. Es decir, en la cepa ATCC13032 deCorynebacterium glutamicum,se introdujo una mutación puntual T311I (que libera la inhibición por retroalimentación de la enzima) en el genlysCpara la aspartato quinasa, use introdujo una mutación puntual P458S (que libera la inhibición por retroalimentación de la enzima) en el genpycpara la piruvato carboxiquinasa, y se introdujo una mutación puntual V59A (que debilita la actividad de la enzima) en el genhompara la homoserina deshidrogenasa con el fin de obtener la cepa AHP-3 de alta producción de lisina.

[0108] Posteriormente, se utilizó un sistema de edición del genoma CRISPR/Cas9 basado en la recombinación monocatenaria (en referencia a la patente CN112111469A para el proceso de construcción del plásmido básico) para realizar la mutación de saturación en el sitio 217 de la piruvato deshidrogenasa (codificada por el genaceE)enCorynebacterium glutamicum.Primero se prepararon células competentes de la cepa AHP-3 de alta producción de lisina, y el plásmido pRecT como plásmido auxiliar para la recombinación se transformó mediante electroporación en una cepa AHP-3 productora de L-lisina deCorynebacterium glutamicumpara obtener la cepa AHP-3-pRecT. Se prepararon células competentes a partir de la cepa AHP-3-pRecT mediante el método documentado (Ruan Y, Zhu L, Li Q. Improving the electro-transformation efficiency ofCorynebacterium glutamicumby weakening its cell wall and increasing the cytoplasmic membrane fluidity. BiotechnolLett. 2015;37:2445-52.) para obtener las células competentes AHP-3-pRecT.

[0109] Para realizar 19 mutaciones distintas del tipo silvestre en el codón del aminoácido en la posición 217 en el genaceE,se diseñaron ADN monocatenarios de S217A, S217C, S217D, S217E, S217F, S217G, S217H, S217I, S217K, S217L, S217M, S217N, S217P, S217Q, S217R, S217T, S217V, S217W y S217Y (Tabla 1) como plantillas recombinantes para la construcción de mutantes. Se transformaron por electroporación 1 pg del plásmido pCas9gRNA-aceE 217 y 10 pg de ADN monocatenario en las células competentes AHP-3-pRecT preparadas anteriormente, se añadieron a 1 ml de medio TSB precalentado a 46 °C, se incubaron a 46 °C durante 6 min, se incubaron a 30 °C durante 3 h, se recubrieron en una placa TSB en la que se añadieron 5 pg/ml de cloranfenicol, 15 pg/ml de kanamicina e IPTG 0,05 mM, y se cultivaron durante 2 días para obtener clones. Los ingredientes (g/l) del medio TSB fueron los siguientes: glucosa, 5 g/l; levadura en polvo, 5 g/l; peptona de soja, 9 g/l; urea, 3 g/l; ácido succínico, 0,5 g/l; K2HPO4AH2O, 1 g/l; MgSO4-7H2O, 0,1 g/l; biotina, 0,01 mg/l; vitamina B1, 0,1 mg/l; y MOPS, 20 g/l. Los monoclones obtenidos anteriormente se identificaron mediante PCR de colonias utilizando un cebador específico S217-jd-F/aceE-jd-R (Tabla 1), respectivamente. Los clones correctos se confirmaron mediante secuenciación para obtener finalmente nueve mutantes de S217A, S217C, S217D, S217E, S217G, S217L, S217P, S217T y S217V, mientras que los otros diez mutantes no se obtuvieron.

[0110] Los plásmidos pRecT ypCas9gRNA-aceE217 se perdieron de las cepas resultantes anteriores con el mutante de codón del aminoácido en la posición 217 en el genaceE. El proceso específico fue el siguiente: los monoclones se cultivaron durante la noche a 37 °C en un medio líquido TSB sin la resistencia; después, los monoclones se sembraron en estrías en una placa de medio sólido TSB sin la resistencia; posteriormente, las bacterias monoclonales cultivadas se sembraron en estrías en tres placas sólidas (TSB 5 pg/ml de cloranfenicol, TSB 15 pg/ml de kanamicina, y TSB) respectivamente, y se cultivaron a 30 °C durante 24 h para obtener las cepas que no crecieron en placas de cloranfenicol y kanamicina, pero que pudieron crecer en placas TSB, que eran cepas mutantes de las que se perdieron dos plásmidos y se denominaron SCgL46 a SCgL54, respectivamente, y los mutantes correspondientes fueron S217A, S217C, S217D, S217E, S217G, S217L, S217P, S217T y S217V, respectivamente.

[0112] Ejemplo 3. Efecto de la mutación en la posición 217 del gen aceE en Corynebacterium glutamicum sobre la síntesis de L-lisina

[0113] Para analizar cómo la mutación del aminoácido en la posición 217 del genaceEenCorynebacterium glutamicumafectó a la producción de L-lisina por tinciones de alta producción de lisina, se realizaron pruebas de fermentación en las cepas SCgL46 a SCgL54, respectivamente. La cepa AHP-3 de tipo silvestre se utilizó como control. Los ingredientes del medio de fermentación fueron los siguientes: glucosa 80 g/l; sulfato de amonio, 20 g/l; urea, 5 g/l; KH<2>PO<4>, 1 g/l; K<2>HPO<4>AH<2>O, 1,3 g/l; MOPS, 42 g/l; CaC<h>, 0,01 g/l; FeSO<4>-7H<2>O, 0,01 g/l; MnSO<4>H<2>O, 0,01 g/l; ZnSO<4>7H<2>O, 0,001 g/l; CuSO<4>, 0,0002 g/l; N iClA^O, 0,00002 g/l; MgSO<4>-7H<2>O, 0,25 g/l; ácido protocatecúico, 0,03 g/l; biotina, 0,0002 g/l; vitamina B1, 0,0001 g/l; y pH inicial 7,2. En primer lugar, las cepas se inocularon en un medio líquido TSB y se cultivaron durante 8 h. Los cultivos se inocularon como semillas en una placa de 24 pocillos que contenía 800 pl de medio de fermentación en cada pocillo con una DO<600>inicial controlada a aproximadamente 0,1, y se cultivaron a 30 °C durante 21 h. La velocidad de rotación del agitador de placas fue de 800 rpm. Se fijaron tres muestras para cada cepa. Tras la fermentación, se detectaron el rendimiento de L-lisina y el consumo de glucosa, y se calculó la tasa de conversión azúcar-ácido de la glucosa en L-lisina.

[0114] Los resultados fueron los que se muestran en la Tabla 2. Todos los rendimientos de L-lisina de los mutantes S217C, S217G, S217T y S217V fueron menores que los de la cepa de control de tipo silvestre, mientras que todos los rendimientos de L-lisina de los mutantes S217A, S217D, S217E, S217L y S217P fueron mayores que los de la cepa de control de tipo silvestre. Por consiguiente, las mutaciones en estos sitios de aminoácidos tenían mejores perspectivas de aplicaciones en la producción de L-lisina y derivados de la misma.

[0115] Tabla 2

[0117]

[0119] AceE(SEQ ID NO:1):

[0120]

[0121]

[0123] Todas las características técnicas descritas en la presente memoria descriptiva se pueden combinar de cualquier manera combinada. Cada una de las características técnicas descritas en la presente memoria descriptiva puede sustituirse por otras características que tengan los mismos efectos, equivalentes o similares. Por lo tanto, a menos que se indique específicamente, cada una de las características descritas en el presente documento es solo un ejemplo de una serie de características equivalentes o similares.

[0124] Además, con las descripciones anteriores de la presente divulgación, las características clave de la presente descripción resultan evidentes para un experto en la técnica. Se pueden hacer muchas modificaciones a la invención sin apartarse del espíritu y alcance de la presente divulgación, con el fin de adaptar la invención a diversos propósitos y condiciones de aplicación. Por consiguiente, también se pretende que tales modificaciones se encuadren dentro del alcance de las reivindicaciones anexas.

Claims (12)

1. REIVINDICACIONES

1. Un mutante de piruvato deshidrogenasa, donde el mutante es cualquiera seleccionado del grupo que consiste en:

1) un mutante en el que una secuencia de aminoácidos se expone en SEQ ID NO:1 y la posición 217 de SEQ ID NO:1 ha mutado a cualquiera de alanina, ácido aspártico, ácido glutámico, leucina y prolina; y

2) un mutante en el que se añaden o se suprimen 1, 2, 3, 4, 5 o 6 aminoácidos en ambos extremos de un polipéptido expuesto en SEQ ID NO:1 y la posición 217 correspondiente a SEQ ID NO:1 es cualquiera de alanina, ácido aspártico, ácido glutámico, leucina y prolina.

2. Un nucleótido codificante del mutante de piruvato deshidrogenasa según la reivindicación 1.

3. Un casete de expresión que contiene el nucleótido codificante del mutante de piruvato deshidrogenasa según la reivindicación 2.

4. Un vector que contiene el nucleótido codificante del mutante de piruvato deshidrogenasa según la reivindicación 2.

5. El vector según la reivindicación 4, donde el vector es un vector de expresión.

6. Una célula huésped que contiene el nucleótido codificante del mutante de piruvato deshidrogenasa según la reivindicación 2.

7. Una célula huésped que contiene el nucleótido codificante según la reivindicación 2 o el vector según la reivindicación 4, donde la célula huésped es un microorganismo deEscherichia, Erwinia, Serratia, Providencia, Enterobacteria, Salmonella, Streptomyces, Pseudomonas, BrevibacteriumoCorynebacterium.

8. La célula huésped según la reivindicación 7, donde la célula huésped es una cepa ATCC13032 deCorynebacterium glutamicum,una cepa ATCC13869 deCorynebacterium glutamicum,o una cepa ATCC 14067 deCorynebacterium glutamicum.

9. Uso del mutante de piruvato deshidrogenasa según la reivindicación 1 o un nucleótido codificante del mismo en la producción de un L-aminoácido.

10. El uso según la reivindicación 9, donde el L-aminoácido se selecciona del grupo que consiste en L-lisina, L-treonina, L-metionina, L-isoleucina, L-valina, L-leucina y L-alanina.

11. Un método para producir un L-aminoácido, que comprende el cultivo de la célula huésped según la reivindicación 7 u 8 para que la célula huésped produzca un L-aminoácido, y que además comprende una etapa de aislamiento y extracción o recuperación del L-aminoácido a partir de un medio.

12. El método según la reivindicación 11, donde el L-aminoácido se selecciona del grupo

que consiste en L-lisina, L-treonina, L-metionina, L-isoleucina, L-valina, L-leucina y L-alanina.