ES3014978T3 - Methods of using pd-l1 expression in treatment decisions for cancer therapy - Google Patents

Abstract

Se describen métodos para detectar la expresión de PD-L1 en células cancerosas circulantes en el cribado, la monitorización, el tratamiento y el diagnóstico del cáncer en sujetos. Los métodos se basan en el análisis de la expresión de PD-L1 en una o más células tumorales circulantes (CTC), células de transición epitelial a mesenquimal (EMTCTC), células similares a macrófagos asociadas al cáncer (CAML) y células endoteliales vasculares asociadas al cáncer (CAVE) aisladas de un sujeto con cáncer. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Métodos para utilizar la expresión de PD-L1 en las decisiones de tratamiento para la terapia contra el cáncer

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

El cáncer es la segunda causa principal de muerte en los Estados Unidos, y el 42 % de los hombres y el 38 % de las mujeres desarrollarán cáncer a lo largo de sus vidas [51-54]. La inmunoterapia aprovecha el propio sistema inmunológico del paciente para atacar el cáncer, independientemente de su origen. El sistema inmunológico está regulado por una red de controles y equilibrios que evolucionaron para atacar invasores externos, como bacterias y virus. Sin embargo, el cáncer puede evadir el sistema inmunológico mediante la expresión de proteínas, como PD-L1 y PD-L2, que inhiben la capacidad del sistema inmunológico para atacar las células cancerígenas.

En particular, las interacciones entre las células tumorales y las células T implican el contacto entre los complejos principales de histocompatibilidad (MHC) presentes en las células tumorales y el receptor de células T (TCR) de las células T [54]. Tras el contacto entre el MHC y el receptor de células T, las células T se activan y las células tumorales son destruidas.

Las células tumorales pueden evadir la inmunovigilancia de las células T si expresan la proteína de punto de control inmunológico PD-L1 en su superficie. Cuando está presente, PD-L1 se une a PD-1, expresado por las células T, bloqueando su activación y, por lo tanto, suprimiendo la inmunovigilancia de las células T.

Se han desarrollado inhibidores de puntos de control inmunológico que pueden bloquear la interacción entre PD-L1 y PD-1. Estos medicamentos permiten que el mecanismo de inmunovigilancia de las células T vuelva a funcionar con normalidad, logrando que las células tumorales sean destruidas mediante la respuesta inmunitaria normal en el sujeto.

El bloqueo de CTLA-4 en las células T puede tener un efecto similar. La primera terapia inmunológica basada en CTLA-4 fue aprobada por la FDA para el melanoma en 2011. El ritmo de aprobaciones de terapias inmunológicas por parte de la f Da aumentó en 2014 y, para finales de 2016, había 18 aprobaciones de inmunoterapias para melanoma, cáncer de pulmón no microcítico (NSCLC), carcinoma de células renales (RCC), cáncer de cabeza y cuello, cáncer de vejiga y linfoma de Hodgkin [55-59]. Actualmente, hay más de 100 ensayos clínicos abiertos de inmunoterapia, lo que indica un potencial de eficacia amplia en múltiples tipos de tumores.

La clave para el uso efectivo de los inhibidores de puntos de control inmunológico es determinar si un paciente con cáncer responderá a estos medicamentos. Si se administra un anticuerpo que se une a PD-L1 o PD-1, actuando como inhibidor de puntos de control inmunológico, a un paciente cuyas células tumorales no expresan PD-L1, el tratamiento será ineficaz. Dado que los tratamientos basados en anticuerpos son muy costosos, es importante contar con al menos algún indicio de que el paciente responderá al tratamiento.

Obtener células cancerosas mediante biopsias tumorales para estudios de expresión de PD-L1 presenta serias desventajas, como el dolor y la incomodidad para los pacientes, la imposibilidad de examinar más que un área aislada del tumor y el potencial de que los perfiles de expresión proteica cambien con el tiempo en el microambiente tumoral.

Las biopsias basadas en sangre son una mejora respecto a las biopsias de tejido, ya que permiten realizar un seguimiento secuencial en tiempo real de las células desprendidas del tumor o que se liberan de otra manera. Las muestras de sangre se pueden obtener con mayor facilidad y frecuencia de los pacientes. Además, se pueden monitorear los cambios en los perfiles de expresión proteica a lo largo del tiempo. Las células tumorales circulantes (CTCs) son un tipo de célula asociada al cáncer que se puede aislar fácilmente de la sangre periférica y utilizar como sustituto de las células tumorales obtenidas mediante biopsias de tejido [1-4]. Las CTCs son células tumorales desprendidas de tumores sólidos hacia el torrente sanguíneo. Se pueden encontrar CTCs en la sangre de pacientes con carcinomas, sarcomas, neuroblastomas y melanomas.

La identificación de tipos celulares adicionales que puedan obtenerse a partir de biopsias basadas en sangre será crítica para desarrollar aún más el uso de esta técnica en la identificación de pacientes con cáncer que se beneficiarán del tratamiento con inhibidores de puntos de control inmunológico.

La presente invención está dirigida a proporcionar métodos de cribado de un sujeto con cáncer para la susceptibilidad a inhibidores de puntos de control inmunológico y métodos de monitoreo de la expresión de PD-L1 en un sujeto con cáncer.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN

En un primer aspecto, la invención se refiere a un método de cribado de un sujeto con cáncer para la susceptibilidad a un inhibidor de punto de control inmunológico, que comprende: analizar células macrófagas asociadas al cáncer (CAMLs) y células tumorales circulantes de transición epitelial a mesenquimal (EMTCTCs) aisladas de un sujeto con cáncer para la expresión de PD-L1, en el que cuando se detecta la expresión de PD-L1, se considera que el sujeto es susceptible a un inhibidor de punto de control inmunológico, o se predice que el sujeto responderá al tratamiento con un inhibidor de punto de control inmunológico, o se selecciona la administración de una cantidad terapéuticamente efectiva de un inhibidor de punto de control inmunológico como tratamiento para el sujeto, o se identifica al sujeto como un sujeto para recibir un tratamiento con inhibidor de punto de control inmunológico.

En un segundo aspecto, la invención se refiere a un método de monitoreo de la expresión de PD-L1 en un sujeto con cáncer, que comprende: (a) analizar CAMLs y EMTCTCs aisladas en un primer punto temporal de un sujeto con cáncer para la expresión de PD-L1, (b) analizar CAMLs y EMTCTCs aisladas en un segundo punto temporal de un sujeto con cáncer para la expresión de PD-L1, y (c) comparar la expresión de PD-L1 analizada en las células aisladas en el primer y el segundo punto temporal.

Otras realizaciones se definen en las reivindicaciones adjuntas.

En aspectos particulares de esta realización, el paciente está recibiendo tratamiento para el cáncer.

En aspectos particulares de esta realización, el paciente está tomando un inhibidor de puntos de control inmunológico.

En ciertas de las realizaciones y aspectos relevantes definidos anteriormente, el inhibidor de puntos de control inmunológico es uno o más de un antagonista de PD-L1, un antagonista de PD-1 y un antagonista de CTLA-4.

En ciertas de las realizaciones y aspectos relevantes definidos anteriormente, el inhibidor de puntos de control inmunológico inhibe uno o más de (i) la unión entre PD-L1 y PD-1, (ii) la unión de PD-L1 con sus ligandos, (iii) la unión de PD-1 con sus ligandos, y (iv) la unión de CTLA-4 con sus ligandos.

En ciertas de las realizaciones y aspectos relevantes definidos anteriormente, el inhibidor de puntos de control inmunológico es un anticuerpo, como un anticuerpo monoclonal. En aspectos particulares, el inhibidor de puntos de control inmunológico es un anticuerpo humano, un anticuerpo humanizado o un anticuerpo quimérico.

Ejemplos de inhibidores específicos de puntos de control inmunológico incluyen, pero no se limitan a, uno o más de los siguientes: Nivolumab (Opdivo), Ipilimumab (Yervoy), Pembrolizumab (Keytruda), Atezolizumab (Tecentriq), Tremelimumab y Durvalumab (MED 14736).

En ciertas de las realizaciones y aspectos relevantes definidos anteriormente, el análisis para la expresión de PD-L1 puede realizarse mediante uno o más de la detección de la expresión de la proteína PD-L1 o la detección de la producción de ARNm de PD-L1. La expresión de la proteína PD-L1 puede detectarse, por ejemplo, mediante inmunohistoquímica (IHC). La IHC puede realizarse mediante tinción de membrana, tinción citoplasmática o una combinación de ambas. La IHC puede realizarse utilizando un anticuerpo anti-PD-L1, es decir, un anticuerpo con especificidad de unión para PD-L1. La expresión de la proteína PD-L1 puede detectarse como una intensidad de tinción débil mediante<i>H<c>, intensidad de tinción moderada o intensidad de tinción fuerte. La expresión de la proteína PD-L1 también puede detectarse como una intensidad de tinción baja mediante IHC, intensidad de tinción moderada o intensidad de tinción alta. La expresión de la proteína PD-L1 también puede detectarse como inducible de una intensidad de tinción baja a una intensidad de tinción alta, o inducible de una intensidad de tinción baja a una intensidad de tinción moderada, o inducible de una intensidad de tinción moderada a una intensidad de tinción alta. La expresión de la proteína PD-L1 puede detectarse como cualquier tinción de las células aisladas.

En ciertos aspectos, la IHC se realiza mediante tinción por inmunofluorescencia (IF), utilizando uno o más anticuerpos con especificidad de unión a PD-L1. La unión del anticuerpo anti-PD-L1 a PD-L1 puede detectarse mediante un compuesto fluorescente conjugado al anticuerpo anti-PD-L1, o mediante un anticuerpo secundario conjugado con una etiqueta detectable y con especificidad de unión al anticuerpo anti-PD-L1. Las etiquetas detectables adecuadas incluyen fluoróforos.

En ciertas de las realizaciones y aspectos relevantes definidos anteriormente, la expresión de PD-L1 se detecta cuando su nivel es mayor al nivel de expresión de PD-L1 en una población de células estromales de un sujeto de la misma especie que no tiene cáncer.

En ciertas de las realizaciones y aspectos relevantes definidos anteriormente, las CTCs, EMTCTCs, CAMLs y CAVEs se aíslan a partir de sangre obtenida del sujeto con cáncer. En ciertos aspectos, la sangre es sangre periférica.

En ciertas de las realizaciones y aspectos relevantes definidos anteriormente, el sujeto con cáncer puede estar recibiendo tratamiento con uno o más de un agente dirigido, quimioterapia o radioterapia.

En ciertas de las realizaciones y aspectos relevantes definidos anteriormente, el cáncer es de pulmón, mama, próstata, páncreas, melanoma, vejiga, riñón, cabeza y cuello, colorrectal, hígado, ovario, neuroblastoma, sarcoma, osteosarcoma, esófago, cerebro y sistema nervioso central (SNC), laringe, bronquios, cavidad oral y faringe, estómago, testículo, tiroides, cuello uterino o cuerpo uterino. El cáncer puede ser un tumor sólido, como un tumor sólido de cáncer en estadio I, II, III o IV. El tumor sólido puede ser un carcinoma, sarcoma, neuroblastoma o melanoma.

Ejemplos de cáncer de pulmón incluyen, entre otros, el carcinoma de pulmón no microcítico (NSCLC).

En ciertas de las realizaciones y aspectos relevantes definidos anteriormente, al menos una EMTCTC o CAML exhibe al menos un foco de RAD50.

Lo anterior ha delineado de manera amplia las características y ventajas técnicas de la presente invención para que la descripción detallada que sigue se comprenda mejor. Se describirán aquí características y ventajas adicionales de la invención, las cuales forman parte de las reivindicaciones de la invención. Debe ser apreciado por parte de los expertos en la materia que cualquier concepción y realización específica divulgada aquí puede ser fácilmente utilizada como base para modificar o diseñar otras estructuras para llevar a cabo los mismos propósitos de la presente invención. Asimismo, se debe entender por parte de los expertos en la materia que dichas construcciones equivalentes no se apartan del espíritu y alcance de la invención, tal como se establece en las reivindicaciones adjuntas. Las características novedosas que se consideran características de la invención, tanto en cuanto a su organización como a su método de operación, junto con otros objetos y ventajas, se comprenderán mejor a partir de la siguiente descripción cuando se considere en relación con las figuras adjuntas. Se entiende expresamente, sin embargo, que cualquier descripción, figura, ejemplo, etc., se proporciona únicamente con fines de ilustración y descripción y de ninguna manera pretende definir los límites de la invención.

Parte de la invención es la evaluación de CAMLs y EMTCTCs. Todas las demás células se presentan únicamente con fines ilustrativos.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

Figura 1. La biopsia basada en sangre identifica y clasifica subtipos de células circulantes mediante DAPI, citoqueratina, EpCAM y CD45; posteriormente, se utiliza la técnica de apagado de fluorescencia QUAS-R para volver a teñir las células con RAD50 y PD-L1. (Fig. 1A) Un ejemplo de un clúster de células EMTCTC, débilmente positivo para citoqueratina, negativo para EpCAM y negativo para CD45. Escala del recuadro = 90 pm. (Fig. 1B) Las muestras son apagadas mediante QUAS-R, donde los fluoróforos son apagados sin dañar los epítopos proteicos [13]. Las muestras se vuelven a teñir con PD-L1, RAD50 y PD-1. Escala del recuadro = 90 pm. (Fig. 1C) La expresión de PD-L1 se mide trazando la célula en el software Zen, el cual calcula la intensidad promedio de cada célula o clúster celular. Escala del recuadro = 35 pm. (Fig. 1D) Los focos de RAD50 (en rojo) se enumeran en cada núcleo (en cian). Escala del recuadro = 35 pm.

Figura 2. Imágenes individuales y ampliadas de DAPI, citoqueratina y CD45 de la Figura 3. (Fig. 2A) PDCCTC con una señal de citoqueratina filamentosa, núcleos patológicamente anormales y sin CD45. La flecha blanca indica un leucocito típico positivo para DAPI y CD45. (Fig. 2B) EMTCTC con una señal de citoqueratina difusa, sin CD45 y núcleos anormales. (Fig. 2C) CAML con múltiples núcleos agregados y una célula agrandada que es positiva tanto para CD45 como para citoqueratina. Tamaño del recuadro = 65 pm.

Figura 3. Porcentaje de muestras con células que pudieron ser utilizadas para cuantificar PD-L1 en el punto de referencia inicial (T0) y después de la inducción de radioterapia (T1). Las biopsias basadas en sangre incluyen dos subtipos de células tumorales circulantes y células estromales circulantes. Las biopsias estándar solo tienen los puntos de referencia iniciales, y solo el 22% de esas muestras contenían una cantidad suficiente de tumor para su análisis por PD-L1. La tinción marrón corresponde a PD-L1 y la azul a hematoxilina. Una biopsia basada en sangre identificó células tumorales EMT en el 49% de las muestras iniciales y en el 66% de las muestras post-terapia. Además, las células estromales circulantes (CAMLs) estuvieron presentes en el 81% de las muestras iniciales y en el 100% de las muestras de seguimiento. Azul = DAPI, Verde = Citoqueratina, Púrpura = CD45. Tamaño del recuadro = 65 pm.

Figura 4. Prueba y comparación de los clones IHC PD-L1 clínicamente aprobados de DAKO y el clon BBB PD-L1. (Fig. 4A) Clon 22c3 de la muestra del paciente ID# 8, que mostró una puntuación de 1+ en el 10% del tumor. (Fig. 4B) Clon 28-8 de la muestra paralela del paciente ID# 8, que mostró una puntuación de 2+ en el 20% del tumor. (Fig. 4C) Se utilizó un clon PD-L1 optimizado para BBBs para determinar el número de células positivas para PD-L1 y la intensidad de cada célula encontrada en los microfiltros CellSieveTM. Sl = cuartil de intensidad de píxel, % = porcentaje de células positivas para el cuartil de intensidad máxima de píxel, N/A = muestra no disponible para probar.

Figura 5. Determinación de los umbrales para puntuar la expresión de PD-L1 en células circulantes. Se determinó la señal de PD-L1 de cada célula BBB (n = 374) utilizando Zen Blue y se restó su fondo relativo para cada imagen. La desviación estándar del fondo (n = 373) se utilizó como umbral para una puntuación IHC de BBB de 0 (26% de todas las células). Dos veces la desviación estándar se utilizó como umbral para una puntuación IHC de BBB de 1 (42% de todas las células). Dos veces el fondo se utilizó como umbral para una puntuación IHC de BBB de 2 (22% de todas las células). Todas las intensidades restantes de 2X-6X fondo se puntuaron como >3 (10% de todas las células).

Figura 6. Cambios dinámicos en la formación de RAD50 loci dentro del núcleo y la regulación al alza de PD-L1 en células analizadas tanto en células tumorales circulantes como en células estromales a lo largo del tratamiento utilizando un enfoque de biopsia basada en sangre. (Fig. 6A) La formación de focos de RAD50 puede ser contada con precisión y se observó un aumento claro en los loci de RAD50 después de la inducción de radioterapia. Esto sugiere que tanto EMTCTC como CAMLs se originan en el sitio de radiación. (Fig. 6B) PD-L1 puede ser evaluado tanto en EMTCTCs como en CAMLs originados en el sitio primario del tumor. Barras de error = error estándar.

Figura 7. Cambios promedio en PD-L1 y RAD50 en cada paciente individual antes y después de la inducción de radioterapia, separados por tipo celular. (Fig. 7A y 7B) En las células CAML, se observó un aumento de RAD50 en el 59% de los pacientes, el 15% de los pacientes no tuvo cambios y el 27% de los pacientes no tuvieron CAMLs en uno de los puntos de tiempo. En las EMTCTCs, se observó un aumento de RAD50 en el 44% de los pacientes, el 2% de los pacientes no tuvo cambios, y el 54% de los pacientes no tuvieron EMTCTCs en uno de los puntos de tiempo. (Fig. 7C y 7D) En las células CAML, se observó un aumento promedio de PD-L1 en el 51% de los pacientes, una disminución en el 22%, y el 27% de los pacientes no tuvieron CAMLs en uno de los puntos de tiempo. En las EMTCTCs, se observó un aumento promedio de PD-L1 en el 29% de los pacientes, una disminución en el 17%, y el 54% de los pacientes no tuvieron EMTCTCs en uno de los puntos de tiempo.

Figura 8. Evaluación y seguimiento de la expresión de PD-L1 en EMTCTCs (Fig. 8B y 8D) y CAMLs (Fig. 8A y 8C) en cada paciente durante la inducción de radioterapia. La célula con la expresión más alta de cada paciente se clasificó de 0 a 3 (negativa, baja, media o alta). Surgieron tres patrones distintos: pacientes con células de baja expresión que se volvieron de alta expresión tras la inducción de radioterapia, pacientes con células circulantes de alta expresión de PD-L1 de forma constante y pacientes con células de expresión baja constante, n=35.

Figura 9. Comparación de la supervivencia libre de progresión (PFS) de los pacientes según la expresión alta/baja de PD-L1 o la formación de RAD50 loci antes y después de la radioterapia. (Fig. 9A) PFS de pacientes con alta expresión de PD-L1 (2-3 BBB IHC) frente a pacientes con baja expresión de p D-L1 (0-1 BBB IHC) en el momento T0, Pf S media de 16 frente a >24 meses. (Fig. 9B) PFS de pacientes con alta expresión de PD-L1 frente a pacientes con baja expresión de PD-L1 en el momento T1, PFS media de 16 frente a 18 meses, p=0.958. (Fig. 9C) PFS de pacientes que promediaron <1 RAD50 loci por célula circulante en T0, PFS media de 19 frente a 18 meses, p=0.246. (Fig. 9D) PFS de pacientes que promediaron <1 RAD50 loci por célula circulante en T1, PFS mediana de 10 frente a 19 meses, p=0.034.

Figura 10. Imágenes confocales de RAD50 dentro de los núcleos de un grupo de EMTCTCs de la Figura 1, tomadas de arriba hacia abajo. Para verificar que los loci RAD50 están dentro del área nuclear de las células, se sacaron imágenes de las EMTCTCs de la Figura 3 en un microscopio confocal Zeiss. Fig. 10A - parte superior del grupo imagenada hasta Fig. 10G. Parte inferior del grupo. Todos los focos de RAD50 se encuentran localizados dentro de la estructura nuclear, verificando que los focos de RAD50 son un componente específico nuclear.

Figura 11. Ejemplos representativos de CAVEs positivas para citoqueratina que tiñen positivo para cm 1 (Fig. 11C), CD146 (Fig. 11B), Vimentina (Fig. 11B) y CD144 (Fig. 11C), confirmando su origen endotelial. Todas las CAVEs son negativas para CD45 (Fig. 11A) y negativas para CD14 (Fig. 11B). Esta CAVE parece negativa para EpCAM (Fig. 11A), aunque se ha encontrado que algunas CAVEs expresan EpCAM.

Figura 12. Porcentajes de CTC y CAVEs en una muestra de 116 pacientes por etapa.

Figura 13. Porcentaje de cada marcador EC en la población de CAVE (n=119 muestras).

Figura 14. Imagen de un grupo celular identificado como CAVEs mediante tinción. Tinción adicional ilustra la capacidad de la inmunoterapia combinada, PD-L1 y CXCR4.

Figura 15. Imágenes de un CAML teñido para inmunoterapia combinada, PD-L1 y CCR5.

Figura 16. Imágenes de un CAML teñido para PD-L1 y CCR5. No hay tinción para PD-L1.

Figura 17. Imágenes de un CAML teñido para PD-L1. (Fig. 17A) Tinción de PD-L1 antes del tratamiento con pembrolizumab. (Fig. 17B) Tinción de PD-L1 después de un mes de tratamiento con pembrolizumab.

Figura 18. Imágenes de un CAML teñido para núcleo, PD1, vimentina y CD45.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA REALIZACIÓN PREFERIDA

I. Definiciones

Tal como se usa en este documento, "un" o "una" puede significar uno o más. Tal como se usa en este documento, cuando se utiliza en conjunto con la palabra "que comprende", las palabras "un" o "una" pueden significar uno o más de uno. Tal como se usa en este documento, "otro" puede significar al menos un segundo o más. Además, a menos que el contexto requiera lo contrario, los términos singulares incluyen pluralidades y los términos plurales incluyen el singular.

Tal como se usa en este documento, "aproximadamente" se refiere a un valor numérico, que incluye, por ejemplo, números enteros, fracciones y porcentajes, ya sea que se indique explícitamente o no. El término "aproximadamente" generalmente se refiere a un rango de valores numéricos (por ejemplo, /- 5-10% del valor citado) que una persona con habilidades ordinarias en la técnica consideraría equivalente al valor citado (por ejemplo, que tenga la misma función o resultado). En algunos casos, el término "aproximadamente" puede incluir valores numéricos que se redondean a la cifra significativa más cercana.

II. La presente divulgación

Las biopsias líquidas proporcionan un seguimiento en tiempo real y secuencial de las células tumorales circulantes (CTCs) encontradas en la sangre periférica, y tales ensayos pueden usarse como un sustituto de las biopsias de tejido [1-4]. Evaluar las células tumorales circulantes (CTCs) en la sangre periférica tiene el poder de investigar poblaciones heterogéneas de CTCs, incluidas las subtipos de CTCs que están experimentando la transición epitelial a mesenquimal (EMTCTCs) [2, 3, 5-9] y las CTCs patológicamente definibles y relevantes para el pronóstico (PDCTCs) [6 10], tanto como diagnóstico de cáncer como un medio para el cribado, el monitoreo del tratamiento y la determinación de la susceptibilidad de un tumor en un sujeto particular a un tratamiento particular.

Recientemente, se ha identificado otra célula circulante asociada con el cáncer en la sangre periférica de pacientes con cáncer que puede ser analizada con los métodos definidos aquí. Este subtipo de célula estromal cancerosa ha sido denominado célula tipo macrófago asociada al cáncer o CAML. Las CAMLs se han identificado en la sangre utilizando un método basado en microfiltración no específica que captura tanto CTCs como CAMLs, y permite el análisis singular o paralelo de estos subtipos de células circulantes específicas del cáncer [1, 6-16]. Las CAMLs son una célula estromal derivada de mieloide recientemente definida, encontrada en todas las etapas de malignidad invasiva y en varias malignidades sólidas (por ejemplo, cáncer de mama, próstata, carcinoma pulmonar no microcítico (NSCLC), y pancreático) [11, 13, 14, 17]. Las CAMLs son células mieloides poliploides especializadas en la sangre en todas las etapas de tumores sólidos. Son fáciles de identificar por su gran tamaño (mayor de 25 pm), núcleo poliploide y morfologías: redonda, en forma de barra, con una cola o dos colas a 180 grados. Las CAMLs típicamente expresan CD31, CD14, CD45 y citoqueratina, y también pueden expresar EpCAM, CD146, CD11c y tie2 [11, 13, 14, 17]. Aunque las CAMLs parecen ser específicas del cáncer y se diseminan desde los sitios de malignidad, aún no se sabe si realmente residen en el sitio del tumor primario o si poseen utilidad clínica.

Diferentes subgrupos de CTCs regulan al alza y/o a la baja fenotipos en relación con la progresión tumoral, la propagación tumoral y en respuesta a los tratamientos tumorales. La capacidad de las células cancerosas individuales para transitar entre estados, como las transiciones epitelial a mesenquimal, da lugar a un subtipo adicional de células cancerosas circulantes que puede ser analizado en los métodos definidos aquí, es decir, CTCs en transición epitelial a mesenquimal (EMTCTCs). La EMT es un proceso morfogenético gradual, y las EMTCTCs abarcan células en varias etapas de transición. Las EMTCTCs pueden ser descritas generalmente por la regulación a la baja de proteínas epiteliales, por ejemplo, EpCAM y CK, y la regulación al alza de proteínas de células madre mesenquimatosas, como vimentina y CD34 [13]. La subtipificación de EMTCTCs generalmente se realiza utilizando métodos no proteómicos, es decir, expresión de ARNm o análisis de ADN [13].

Un tipo adicional de célula circulante asociada con el cáncer que puede ser analizado con los métodos definidos aquí es la célula endotelial vascular asociada al cáncer o CAVE. Las CAVEs son un subtipo de células endoteliales circulantes. Los tumores requieren el suministro sanguíneo proporcionado por las células endoteliales tumorales. Las CAVEs son células endoteliales tumorales que se han desprendido del sitio tumoral y han ingresado al torrente sanguíneo. Las CAVEs a menudo se encuentran en grupos. Las CAVEs expresan citoqueratina y varios subtipos de marcadores de células endoteliales como CD31, CD146, CD144, CD105, pero no expresan CD14 ni CD45 [50].

La utilización de tales células circulantes no ha sido bien estudiada en biopsias líquidas, y la presente invención está dirigida a métodos para usar las CAMLs y EMTCTCs en el cribado y el monitoreo de diferentes tipos de cáncer, en particular aquellos cánceres en los que las CAMLs y EMTCTCs asociadas expresan PD-L1 en su superficie.

Métodos de detección de susceptibilidad a inhibidores de puntos de control inmunológico

Como se indicó anteriormente, la presente invención está dirigida a métodos para detectar la susceptibilidad a un inhibidor de punto de control inmunológico en un sujeto con cáncer, que comprende: analizar células tipo macrófago asociadas al cáncer (CAMLs) y CTCs en transición epitelial a mesenquimal (EMTCTCs) aisladas de un sujeto con cáncer para la expresión de PD-L1, donde, cuando se detecta la expresión de PD-L1, se considera que el sujeto es susceptible a un inhibidor de punto de control inmunológico, o se predice que el sujeto responderá al tratamiento con un inhibidor de punto de control inmunológico, o se selecciona la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de un inhibidor de punto de control inmunológico como tratamiento para el sujeto, o el sujeto es identificado como un candidato para recibir tratamiento con un inhibidor de punto de control inmunológico.

Como se utiliza en el presente documento, los términos "tratar", "tratando" y "tratamiento" tienen sus significados ordinarios y habituales, e incluyen uno o más de los siguientes: la eliminación total o parcial de un tumor o cáncer de un sujeto, la reducción del tamaño de un tumor en un sujeto, la muerte de células de un tumor o cáncer en un sujeto, y la mejora de un síntoma de cáncer o de un tumor en un sujeto. El tratamiento significa eliminar, reducir, matar o mejorar en aproximadamente un 1% a aproximadamente un 100% en comparación con un sujeto al que no se le ha administrado un inhibidor de punto de control inmunológico. Preferiblemente, la eliminación, reducción, muerte o mejora es de aproximadamente 100%, aproximadamente 99%, aproximadamente 98%, aproximadamente 97%, aproximadamente 96%, aproximadamente 95%, aproximadamente 90%, aproximadamente 80%, aproximadamente 70%, aproximadamente 60%, aproximadamente 50%, aproximadamente 40%, aproximadamente 30%, aproximadamente 20%, aproximadamente 10%, aproximadamente 5% o aproximadamente 1%. Los resultados del tratamiento pueden ser permanentes o pueden continuar durante un período de días (como 1, 2, 3, 4, 5, 6 o 7 días), semanas (como 1, 2, 3 o 4 semanas), meses (como 1, 2, 3, 4, 5, 6 o más meses) o años (como 1, 2, 3, 4, 5, 6 o más años).

Como se utiliza en el presente documento, los términos "inhibir", "inhibiendo" e "inhibición" tienen sus significados ordinarios y habituales, e incluyen uno o más de los siguientes: obstaculizar, impedir, obstruir, disuadir o restringir el establecimiento de cáncer o un tumor, el desarrollo de cáncer o un tumor, el crecimiento de cáncer o un tumor y la metástasis. La inhibición significa obstaculizar en un rango de aproximadamente 1% a aproximadamente 100% en comparación con un sujeto al que no se le haya administrado un inhibidor de punto de control inmunológico. Preferentemente, la obstaculización es de aproximadamente 100%, aproximadamente 99%, aproximadamente 98%, aproximadamente 97%, aproximadamente 96%, aproximadamente 95%, aproximadamente 90%, aproximadamente 80%, aproximadamente 70%, aproximadamente 60%, aproximadamente 50%, aproximadamente 40%, aproximadamente 30%, aproximadamente 20%, aproximadamente 10%, aproximadamente 5% o aproximadamente 1%. Los métodos de inhibición pueden ser practicados en un sujeto antes de, concurrentemente con, o después del inicio de los síntomas clínicos de cáncer o un tumor. Así, el sujeto puede tener cáncer o un tumor, o simplemente ser susceptible de desarrollar cáncer o un tumor. Los resultados de la inhibición pueden ser permanentes o pueden continuar durante un período de días (por ejemplo, 1,2, 3, 4, 5, 6 o 7 días), semanas (por ejemplo, 1,2, 3 o 4 semanas), meses (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6 o más meses) o años (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6 o más años).

Los inhibidores de puntos de control inmunológicos y las formulaciones farmacéuticas que los contienen pueden administrarse a un sujeto utilizando diferentes esquemas, dependiendo del objetivo particular del método; la edad y tamaño del sujeto; y la salud general del sujeto, por mencionar solo algunos factores a considerar. En general, los inhibidores de puntos de control inmunológicos y las formulaciones farmacéuticas pueden administrarse una vez, dos veces, tres veces, cuatro veces, cinco veces, seis veces o más, durante un curso de tratamiento o inhibición. El tiempo entre cada dosis en un esquema de dosificación puede variar entre días, semanas, meses o años, e incluye administrarse una vez cada 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 o más semanas. La misma cantidad de inhibidor de punto de control inmunológico puede administrarse en cada dosis del esquema de dosificación, o las cantidades en cada dosis pueden variar. La identidad del inhibidor de punto de control inmunológico también puede variar o permanecer igual en cada dosis en un esquema de dosificación.

En cada uno de los métodos de la presente divulgación, se administra una "cantidad terapéuticamente eficaz" de un inhibidor de punto de control inmunológico o formulación farmacéutica que contenga un inhibidor de punto de control inmunológico a un sujeto. La cantidad terapéuticamente eficaz variará entre sujetos. Sin embargo, la cantidad terapéuticamente eficaz es aquella que es suficiente para lograr el objetivo o propósito del método, ya sea inhibiendo o tratando. Como ejemplo, una cantidad terapéuticamente eficaz de un inhibidor de punto de control inmunológico utilizado en los métodos de la divulgación es típicamente entre aproximadamente 0,1 pg y aproximadamente 10.000 pg de inhibidor de punto de control inmunológico por kg de peso corporal del sujeto al que se le administra el péptido. Una cantidad terapéuticamente eficaz también incluye entre aproximadamente 0,5 pg y aproximadamente 5000 pg, entre aproximadamente 1 pg y aproximadamente 500 pg, entre aproximadamente 10 pg y aproximadamente 200 pg, entre aproximadamente 1 pg y aproximadamente 800 pg, entre aproximadamente 10 pg y aproximadamente 1000 pg, entre aproximadamente 50 pg y aproximadamente 5000 pg, entre aproximadamente 50 pg y aproximadamente 500 pg, entre aproximadamente 100 pg y aproximadamente 1000 pg, entre aproximadamente 250 pg y aproximadamente 2500 pg, entre aproximadamente 500 pg y aproximadamente 2000 pg, entre aproximadamente 10 pg y aproximadamente 800 pg, entre aproximadamente 10 pg y aproximadamente 1000 pg, entre aproximadamente 1 pg y aproximadamente 300 pg, y entre aproximadamente 10 pg y aproximadamente 300 pg de inhibidor de punto de control inmunológico por kg de peso corporal del sujeto.

Las dosis y esquemas de dosificación apropiados pueden ser determinados fácilmente mediante técnicas bien conocidas por aquellos con habilidades en la técnica sin necesidad de experimentación indebida. Tal determinación se basará, en parte, en la tolerancia y eficacia de una dosis particular.

La administración del inhibidor de punto de control inmunológico o formulación farmacéutica puede ser por cualquiera de las vías comúnmente conocidas en el arte de la entrega de péptidos. Dichas vías incluyen la intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, subcutánea e intradérmica, así como la aplicación nasal, por inhalación, oftálmica, oral, rectal, vaginal o por cualquier otro modo que permita que el inhibidor de punto de control inmunológico o la formulación farmacéutica entre en contacto con los tejidos mucosos.

Las formulaciones farmacéuticas de la divulgación comprenden uno o más inhibidores de puntos de control inmunológicos y un portador farmacéuticamente aceptable. Ejemplos adecuados de portadores son bien conocidos por aquellos expertos en la técnica e incluyen agua, agua para inyección, solución salina, solución salina tamponada, dextrosa, glicerol, etanol, propilenglicol, polisorbato 80 (Tween-80™), polietilenglicol 300 y 400 (PEG 300 y 400), aceite de ricino pegilado (por ejemplo, Cremophor EL), poloxámeros 407 y 188, portadores hidrofílicos e hidrofóbicos, y combinaciones de los mismos.

Los portadores hidrofóbicos incluyen, por ejemplo, emulsiones lipídicas, lípidos, fosfolípidos pegilados, matrices poliméricas, polímeros biocompatibles, liposferas, vesículas, partículas y liposomas. Los términos excluyen específicamente los medios de cultivo celular. Las formulaciones también pueden incluir agentes estabilizantes, tampones, antioxidantes y conservantes, agentes tonificantes, agentes de carga, emulsionantes, agentes suspensores o de viscosidad, diluyentes inertes, rellenos y combinaciones de los mismos.

Un kit que comprende los componentes necesarios para practicar los métodos divulgados en el presente documento también se describe en el mismo. El kit comprende uno o más inhibidores de puntos de control inmunológicos e instrucciones para su uso. En algunos aspectos, los uno o más inhibidores de puntos de control inmunológicos están en una formulación farmacéutica que comprende los inhibidores de puntos de control inmunológicos y un portador farmacéuticamente aceptable.

Métodos de Monitoreo de la Expresión de PD-L1

La invención también abarca métodos para monitorear la expresión de PD-L1 en un sujeto con cáncer. El método comprende: (a) la obtención de CAMLs y EMTCTCs aislados en un primer punto en el tiempo de un sujeto con cáncer para analizar la expresión de PD-L1; (b) el análisis de uno o más de los CAMLs y EMTCTCs aislados en un segundo punto en el tiempo de un sujeto con cáncer para analizar la expresión de PD-L1; y (c) la comparación de la expresión de PD-L1 analizada en las células aisladas en el primer y el segundo punto en el tiempo. En aspectos particulares de esta modalidad, el sujeto está recibiendo tratamiento para el cáncer.

Métodos de Monitoreo del Tratamiento

En el presente documento se describen métodos para monitorear el tratamiento en un sujeto con cáncer. El método comprende: (a) el análisis de uno o más de CTCs, EMTCTCs, CAMLs y CAVEs aislados en un primer punto en el tiempo de un sujeto que está recibiendo tratamiento para el cáncer para analizar la expresión de PD-L1; (b) el análisis de uno o más de CTCs, EMTCTCs, CAMLs y CAVEs aislados en un segundo punto en el tiempo de un sujeto que está recibiendo tratamiento para el cáncer para analizar la expresión de PD-L1; y (c) la comparación de la expresión de PD-L1 analizada en las células aisladas en el primer y el segundo punto en el tiempo, con lo cual se monitorea el tratamiento en un sujeto con cáncer. En aspectos particulares, el sujeto está siendo tratado mediante un inhibidor de puntos de control inmunológico.

Inhibidores de Puntos de Control Inmunológicos

Como se utiliza en el presente documento, el término "inhibidor de puntos de control inmunológicos" se refiere a un compuesto, como un fármaco (incluido un anticuerpo), que inhibe o bloquea proteínas expresadas por células del sistema inmunológico, como las células T, y algunos tipos de células cancerígenas. Estas proteínas inhiben las respuestas inmunológicas y pueden bloquear las células T de matar las células cancerígenas. Cuando estas proteínas son bloqueadas, la inhibición del sistema inmunológico se supera y las células T pueden matar las células cancerígenas. Ejemplos de proteínas de puntos de control encontradas en células T o células cancerígenas incluyen PD-1/PD-L1 y C<t l>A-4/B7I/B7-2. Los inhibidores de puntos de control inmunológicos buscan superar una de las principales defensas del cáncer (es decir, las células T) contra un ataque del sistema inmunológico.

Los inhibidores de puntos de control inmunológicos de la presente invención incluyen, pero no se limitan a, antagonistas de PD-L1, antagonistas de PD-1 y antagonistas de CTLA-4.

Los inhibidores de puntos de control inmunológicos de la presente invención también incluyen, pero no se limitan a, inhibidores de uno o más de: (i) la unión entre PD-L1 y PD-1, (ii) la unión de PD-L1 con su(s) pareja(s) de unión, (iii) la unión de PD-1 con su(s) pareja(s) de unión, y (iv) la unión de CTLA-4 con su(s) pareja(s) de unión.

Los inhibidores de puntos de control inmunológicos de la presente invención también incluyen, pero no se limitan a, anticuerpos, como los anticuerpos monoclonales. En aspectos particulares, el inhibidor de puntos de control inmunológicos es un anticuerpo humano, un anticuerpo humanizado o un anticuerpo quimérico. Los inhibidores de puntos de control inmunológicos también incluyen fragmentos de anticuerpos que conservan su actividad inhibidora. Tales fragmentos de anticuerpos incluyen, pero no se limitan a, fragmentos Fab, fragmentos F(ab')2 y cadenas simples Fv (scFv). En un aspecto, el inhibidor de puntos de control inmunológicos es un anticuerpo con especificidad de unión para PD-L1, PD-1 o CTLA-4, o fragmento de anticuerpo del mismo.

Ejemplos de inhibidores específicos de puntos de control inmunológicos incluyen, pero no se limitan a, uno o más de Nivolumab (Opdivo), Ipilimumab (Yervoy), Pembrolizumab (Keytruda), Atezolizumab (Tecentriq), Tremelimumab y Durvalumab (MED 14736).

Agentes Anti-cáncer

Se divulga aquí el tratamiento del cáncer, los métodos pueden incluir la administración de una cantidad terapéuticamente efectiva de uno o más agentes anti-cáncer al sujeto, además de los inhibidores de puntos de control inmunológicos.

Los agentes anti-cáncer están limitados únicamente en que deben ser compatibles con los inhibidores de puntos de control inmunológicos que también se administran al sujeto.

Los agentes anti-cáncer adicionales incluyen, pero no se limitan a, agentes inmunoterapéuticos, agentes quimioterapéuticos, agentes radioterapéuticos, medicamentos contra el cáncer existentes, CCR5 y CXCR4. Ejemplos de agentes anti-cáncer específicos incluyen, pero no se limitan a, uno o más de T-VEC, AM-0010, antagonista de CXCR4, inhibidor de la quinasa TGF-beta galunisertib, anticuerpo monoclonal anti-CSF-IR, Abemaciclib, Faslodex, necitumumab, AZD9291, Cyramza (ramucirumab), TPIV 200, Galunisertib, vacunas contra el cáncer, citoquinas, terapias basadas en células, anticuerpos bi- y multispecíficos, anticuerpos monoclonales dirigidos a tumores, Rituximab, virus oncolíticos, reovirus, Blinatumomab, Sipuleucel-T, T-Vec, IL-2, IFN-a, Trastuzumab, Celuximab, bevacizumab, Tim3, BTLA, anti-IL-10, GM-CSF, tratamiento anti-angiogénico, bloqueo de VEGF, HMGB1, Nrpl, receptores de tirosina quinasa TAM, Axl, MerTK, ALT-803, IL-15, ligando inmunosupresor fosfatidilserina (PS), bavituximab, bevacizumab (anti-VEGF), cobimetinib (inhibidor de MEK), vemurafenib (inhibidor de BRAF), erlotinib (EGFR), alectinib (inhibidor de ALK), bevacizumab (antiVEGF), pazopanib (inhibidor de tirosina quinasa), dabrafenib (inhibidor de BRAF), trametinib (inhibidor de MEK), durvalumab (anti-PD-L1), sunitinib (inhibidor de RTK), pazopanib (inhibidor de RTK), sargramostim, VISTA, TM-3, LAG-3, PRS-343, CD137 (4-1BB)/HER2 bispecífico, USP7, anti-HER2, SEMA4D, CTLA-4, PD-1, PD-L1 y PD-L2.

Métodos para Evaluar la Expresión de PD-L1

Como será evidente, los métodos de la presente invención se basan en la evaluación, es decir, en la detección y/o medición de la expresión de PD-L1 en una célula. En un aspecto de la invención, cada uno de los métodos definidos aquí puede ser utilizado simplemente determinando si una célula seleccionada expresa PD-L1. Por lo tanto, estos métodos se pueden realizar sin necesidad de cuantificar la cantidad de expresión de PD-L1 en una célula. Sin embargo, y en otro aspecto de la invención, cada uno de los métodos definidos aquí puede ser utilizado determinando la cantidad relativa o específica de expresión de PD-L1 en una célula. La cantidad relativa puede ser determinada, por ejemplo, determinando si una célula expresa más o menos PD-L1 que otra célula o estándar. La cantidad específica puede ser determinada, por ejemplo, cuantificando el nivel de expresión de PD-L1 en una célula.

La expresión de PD-L1 puede ser evaluada por uno o más de los siguientes métodos: detectar/medir la expresión de proteína PD-L1 y detectar/medir la producción de ARNm de PD-L1. La expresión de proteína PD-L1 puede ser detectada/medida, por ejemplo, mediante inmunohistoquímica (IHC). La IHC puede realizarse mediante tinción de membrana, tinción citoplasmática o una combinación de ambas. La IHC puede realizarse utilizando un anticuerpo anti-PD-L1, como, pero no limitado a, EIL3N, SP142.2, 28-8, 220, EPR19759, MIH2, MIH5, MIH6, ABM4E54, 130021, EPR20529, IOF.9G2 y CD274. La expresión de proteína PD-L1 puede ser detectada/medida como una intensidad de tinción débil, moderada o fuerte. La expresión de proteína PD-L1 también puede ser detectada como una intensidad de tinción baja, moderada o alta. La expresión de proteína PD-L1 también puede ser detectada como inducible, desde una intensidad de tinción baja hasta alta con el tiempo, o inducible desde una intensidad de tinción baja a moderada con el tiempo, o inducible desde una intensidad de tinción moderada hasta alta con el tiempo. La expresión de proteína PD-L1 también puede ser detectada/medida simplemente como cualquier tinción por encima del fondo.

En ciertos aspectos, la IHC se realiza utilizando tinción por inmunofluorescencia (IF). Se puede utilizar uno o más anticuerpos con especificidad de unión para PD-L1 para detectar la expresión de proteína PD-L1. La unión del anticuerpo anti-PD-L1 a PD-L1 puede ser detectada mediante un compuesto fluorescente u otra etiqueta detectable conjugada al anticuerpo anti-PD-L1 o puede ser detectada mediante un fluoróforo u otra etiqueta detectable conjugada a un anticuerpo secundario que, a su vez, tiene especificidad de unión para el anticuerpo anti-PD-L1.

En ciertas de las realizaciones relevantes y aspectos definidos anteriormente, la expresión de PD-L1 se determina como detectada cuando el nivel de expresión de PD-L1 es mayor que la expresión de PD-L1 en una población de células estromales de un sujeto de la misma especie que no tiene cáncer.

Fuente de Células

Las células utilizadas en los métodos de la presente invención incluyen CAMLs y EMTCTCs.

Las células pueden obtenerse de cualquier fluido corporal en el que se puedan encontrar las células, incluyendo la sangre, como la sangre periférica. Las muestras de sangre pueden ser recolectadas en tubos preservativos Cell SaveTM, por ejemplo, y la sangre puede ser procesada con un ensayo de microfiltración CellSieve™ utilizando un sistema de vacío de baja presión, por ejemplo.

Sujetos

Los sujetos mencionados en los métodos de la presente invención serán humanos, primates no humanos, aves, caballos, vacas, cabras, ovejas, animales de compañía, como perros, gatos o roedores, o cualquier otro mamífero.

El sujeto con cáncer puede estar recibiendo tratamiento para el cáncer. Dichos tratamientos incluyen, pero no se limitan a, agentes dirigidos, quimioterapia y radioterapia. El cáncer puede ser uno o más de los siguientes: cáncer de pulmón, cáncer de mama, cáncer de próstata, cáncer de páncreas, melanoma, cáncer de vejiga, cáncer de riñón, cáncer de cabeza y cuello, cáncer colorrectal, cáncer de hígado, cáncer de ovario, neuroblastoma, sarcoma, osteosarcoma, cáncer esofágico, cerebral y sistema nervioso central (SNC), laringe, bronquios, cavidad bucal y faringe, estómago, testículos, tiroides, cuello uterino o cuerpo uterino. El cáncer puede ser un tumor sólido, como un tumor sólido de etapa I, etapa II, etapa III o etapa IV. El tumor sólido puede ser, pero no se limita a, carcinoma, sarcoma, neuroblastoma o melanoma. Ejemplos de cánceres de pulmón incluyen, pero no se limitan a, carcinoma de pulmón no microcítico (NSCLC).

Foco de RAD50

En ciertas de las realizaciones relevantes y aspectos definidos anteriormente, al menos una EMTCTC o CAML exhibe al menos un foco de RAD50.

Las células originarias de tumores que reciben radiación dirigida al sitio están marcadas por daño al ADN inducido por radiación ionizante, incluyendo células tumorales y estromales [18-24]. Así, las células circulantes que se originan en el sitio del tumor durante la radioterapia deben mostrar evidencia de daño al ADN, como focos inducidos por radiación ionizante (IRIF), que pueden visualizarse con RAD50 [18-24]. RAD50 es una proteína que se compleja con las proteínas NBS1 y MRE11, y es crucial en el proceso de reparación de doble cadena del ADN luego de tratar con radiación y/o agentes químicos. En células mamíferas normales, RAD50 se distribuye por todo el citoplasma y el núcleo. Luego de rupturas de doble cadena en el ADN, el complejo RAD50/NBS/MRE11 se transloca rápidamente a los sitios de la ruptura formando focos nucleares agregados hasta que la ruptura es reparada, por ejemplo, los IRIF [18, 20, 23, 25]. Así, RAD50 puede ser utilizado como un identificador específico de células que han sido expuestas a altos niveles de radiación, actuando como una etiqueta biológica de células de pacientes que han sido directamente expuestos a radiación dirigida a una masa tumoral [18-24, 26-28].

III. Ejemplos

Los ejemplos que no se relacionan con CAMLs y EMTCTCs son solo para fines comparativos.

Ejemplo 1

Recogida de muestras de sangre

Cuarenta y un pacientes con cáncer de pulmón en estadio I-IV fueron incluidos en este estudio piloto prospectivo (Tabla 1). Se recogieron muestras de sangre periférica anonimizada después de obtener el consentimiento informado por escrito y de acuerdo con la aprobación de la IRB local. Los pacientes fueron reclutados entre julio de 2013 y mayo de 2014, antes de comenzar la radioterapia para el cáncer de pulmón primario. Cuatro pacientes recibieron radioterapia corporal estereotáctica (SBRT) para la enfermedad en estadio I y 37 pacientes recibieron quimiorradioterapia para enfermedades en estadio II-IV con terapia con protones (n=16) o radioterapia de intensidad modulada (IMRT) (n=21). Se extrajeron muestras de sangre anonimizada (7.5 mL) y fueron procesadas en el sitio en el MD Anderson Cancer Center (NIDA). Las láminas fueron anonimizadas, luego enviadas y analizadas en el laboratorio clínico de Creatv MicroTech, Inc. Las muestras de biopsia anonimizada de tumores primarios fueron procesadas en MDA de acuerdo con los protocolos del fabricante (DAKO). Los resultados de las instituciones no fueron compartidos ni comunicados hasta la finalización del estudio.

Tabla 1.Resumen de la población de pacientes

Procedimiento de Microfiltración de Bajo Flujo Cell Sieve™

Las muestras de sangre (7,5 mL) recolectadas en tubos conservadores CellSave™ se procesaron mediante un ensayo de microfiltración CellSieve™ utilizando un sistema de vacío de baja presión [1, 12]. El ensayo de microfiltración CellSieve™ aísla células circulantes basándose en la exclusión por tamaño, >7 micrones. Un citólogo capacitado identificó células tumorales circulantes (CTCs) con relevancia pronóstica y definibles patológicamente (PDCTCs), EMTCTCs y CAMLs según características morfológicas y la expresión fenotípica de CD45, EpCAM, Citoqueratinas 8, 18, 19 y DAPI (Figuras 1 y 2) [12], utilizando características citológicas preestablecidas descritas [6, 1114]. Todas las imágenes se obtuvieron con un microscopio fluorescente Olympus BX54WI con Carl Zeiss AxioCam y Zen2011 Blue (Carl Zeiss).

Enumeración de subtipos de PDCTC/EMTCTC y CAMLs

Las características definitorias de los dos subtipos más comunes de CTC encontrados en pacientes con cáncer (PDCTCs y EMTCTCs) y las de identificación de CAMLs fueron descritas previamente [6, 10-14]. Para este estudio, solo se caracterizaron PDCTCs, EMTCTCs y CAMLs intactos (Figuras 2 y 3) [1, 6, 10-14]. Las PDCTCs son negativas para CD45, tienen positividad filamentosa para citoqueratina y núcleos positivos para DAPI con criterios patológicos malignos, clasificadas como el subtipo de CTC CellSearch® [1, 6, 10-14]. Las EMTCTCs son negativas para CD45, con una señal difusa de citoqueratina y un núcleo positivo para DAPI con criterios anormales previamente definidos [1, 6, 9, 12, 13]. Las CAMLs se describen como células agrandadas (>30 pm), multinucleadas, con tinción difusa de citoqueratina citoplasmática y/o CD45+/CD14+ [6, 11, 14, 17, 22, 43]. Los 3 tipos celulares fueron identificados e imaginados por un citólogo de CTC capacitado y confirmados por un patólogo. Las CTC apoptóticas y aquellas que no pudieron clasificarse citológicamente según las descripciones previas no fueron incluidas. Después de la identificación, las células fueron imaginadas y se marcó el eje x-y de cada célula para análisis futuro. Las muestras se archivaron a 4 °C durante 1-3 años.

Apagado OUAS-R y nuevo teñido para PD-L1 y RAD50

Después de la identificación y cuantificación inicial de PDCTCs, EMTCTCs y CAMLs, se apagó la fluorescencia y las muestras se tiñeron nuevamente con RAD50-DyLight 550 (Pierce Thermo), PD-L1-AlexaFluor 488 (R&D Systems) y tinción nuclear DAPI (Figura 1). Se utilizó la técnica QUAS-R (Quench, Underivatize, Amine-Strip and Restain) como se describió previamente [13]. Brevemente, tras ser imaginadas y marcadas, los filtros se sometieron a un tratamiento químico secuencial con solución de apagado, Tris y pasos de lavado. Después del apagado químico, los filtros se lavaron con PBS, se incubaron con 1XPBS/20% FBS y luego con anticuerpos contra RAD50-AlexaFluor 550 y PD-L1-AlexaFluor 488 durante 1 hora a temperatura ambiente. Tras la incubación con anticuerpos, los filtros se lavaron en 1xPBST y se montaron en portaobjetos con Fluoromount-G/DAPI (Southern Biotech). Las muestras se orientaron en los ejes x/y y las células previamente imaginadas se relocalizaron utilizando el software de marcación y búsqueda Zen2011 Blue (Carl Zeiss). Se utilizó Zen2011 Blue (Carl Zeiss) para procesar las imágenes.

Cuantificación de PD-L1 en biopsias tumorales primarias

La expresión de PD-L1 en todas las biopsias tumorales primarias disponibles se analizó utilizando los clones DAKO pharmdx 22c3 y DAKO pharmdx 28-8 siguiendo las pautas del fabricante (Figura 4). Ocho pacientes del estudio tenían suficientes muestras tumorales archivadas para analizar ambos clones, y una muestra tenía suficiente tejido para una única prueba de IHC contra el clon 22c3. Ambos clones se tiñeron según los procedimientos operativos estándar previamente descritos [29'31, 38].

Cuantificación de RAD50 y PD-L1 en células circulantes

La formación de loci RAD50 se determinó enumerando los loci de RAD50 localizados en el núcleo de cada célula (Figuras 1 y 5) [23]. La intensidad de píxeles de PD-L1 en cada célula se midió utilizando el software ZenBlue, considerando el área total de cada célula. El promedio de intensidad de píxeles de cada célula se restó del promedio de intensidad de píxeles del fondo local para cada imagen (Figura 1C). El promedio de intensidad de píxeles de las células se clasificó en 4 grupos de IHC: 0 - negativo (promedio de píxeles 0-150), 1 - bajo (promedio de píxeles 151 300), 2 - medio (promedio de píxeles 301-750), y 3 - alto (promedio de píxeles 751+) (Figura 5). Los umbrales de intensidad de PD-L1 para la puntuación de IHC se determinaron de la siguiente manera: 150 de intensidad de píxeles representaba la desviación estándar de la señal de fondo localizada, 300 de intensidad de píxeles equivalía a dos veces la desviación estándar de la señal de fondo localizada, 750 de intensidad de píxeles representaba dos veces la intensidad de fondo localizada (Figura 5).

Métodos Estadísticos

Los análisis fueron realizados en MATLAB R2013A utilizando los conteos de todos los subtipos y las poblaciones de pacientes conocidas. Para el análisis de supervivencia libre de progresión, el tiempo hasta la progresión fue definido como el intervalo entre cuando la muestra de sangre T0 fue obtenida hasta la fecha de progresión; todos los pacientes permanecieron en el estudio a lo largo del punto final de 24 meses, es decir, ningún paciente fue censurado. La significancia de los cambios promedio en la formación de focos RAD50 y la expresión de PD-L1 fueron determinados mediante un Student's T-test. Un coeficiente de Pearson fue utilizado para determinar la correlación entre los focos RAD50 y la expresión de PD-L1 para mediciones individuales. La significancia de las gráficas de Kaplan Meier fue determinada mediante análisis de log-rank.

Resultados

PDCTCs, EMTCTCs y CAMLs en pacientes con LC

Informes previos indicaron que la subpoblación de CTC en pacientes con NSCLC utilizando la plataforma CellSearch® típicamente se encuentra en solo 0-5% de los casos no metastásicos. En contraste, la población EMTCTC típicamente se encuentra en ~80% de las poblaciones de pacientes no metastásicos, mientras que los CAMLs no han sido evaluados extensivamente en NSCLC [3_6, 8, 15, 17, 43_45]. En la primera muestra de sangre inicial tomada antes de comenzar la terapia de radiación (T0), fuimos capaces de identificar al menos una célula positiva para citoqueratina (es decir, PDCTC, EMTCTC o Ca Ml ) (Figura 1 y 3) en 35 de las 41 muestras (85%). Los pacientes entonces tuvieron una segunda muestra de seguimiento (T1) tomada 2-3 semanas después del inicio de la radioterapia o después de la última fracción para los pacientes con SBRT. Para T1, hubo al menos una célula positiva para citoqueratina (es decir, PDCTC, EMTCTC o CAML) encontrada en las 41 muestras (100%). Específicamente, EMTCTCs fueron encontradas en 49% de las muestras T0 y en 66% de las muestras T1. CAMLs fueron encontradas en 81% de las muestras T0 y en 100% de las muestras T1 (Figura 3). PDCTCs fueron encontradas en solo 1 muestra en T0 (2%) y en solo 3 muestras en T1 (7%) (Figura 3). Siendo que PDCTCs han demostrado ser la misma población de células CTC aisladas por el sistema CellSearch® CTC, estos números están en línea con informes previos [7‘9’ 15]. El sistema CellSearch® aísla CTCs en pacientes con NSCLC que varían desde ~0-5% de positividad en NSCLC estadio III y 21-32% en estadio IV [7-9, 15]. Dado que 35 de los pacientes fueron clasificados como estadio I-III, 2-7% está dentro del rango de la población clásica de CTC (Tabla 1) [7‘9, 15]. La baja incidencia de la población clásica de PDCTC (Figura 3) está en contraste con EMTCTC y CAMLs, que están presentes en T0 y T1 de las muestras. Aunque se ha postulado que EMTCTCs por sí solas pueden proporcionar cierta sensibilidad aumentada para biopsias líquidas en NSCLC [7‘9, 16], estos resultados sugieren que la combinación de EMTCTCs y CAMLs proporciona sensibilidad mejorada analizando células derivadas de tumores para diagnósticos basados en sangre.

RAD50 como rastreador biológico de células irradiadas

Aunque CTCs y CAMLs han sido descritas como diseminadas hacia la sangre periférica desde el sitio de un tumor primario, los estudios aún no han confirmado la ubicación exacta donde estas células residen antes de ingresar a la circulación. La principal razón de este origen desconocido es que etiquetar células tumorales/estromales en pacientes y rastrear su diseminación es difícil, ya que tales experimentos representan un peligro para los pacientes. Mientras que los focos RAD50 dentro de las formaciones IRIF en células de mamíferos han sido mostrados como rastreadores biológicos de exposición directa a radiación en células, esto nunca ha sido evaluado en células tumorales circulantes o estromales en pacientes sometidos a radiación. En pacientes con LC no irradiados en la línea base T0, los focos RAD50 en células EMTCTCs oscilaron entre 0-4 por núcleo con un promedio de 0.59±0.97 focos, y en CAMLs el número de focos osciló entre 0-5 con un promedio de 0.38±1.07 (Figuras 6 y 7). La presencia de algunos focos RAD50 en células no es sorprendente, ya que RAD50 es un mecanismo biológico normal de reparación típicamente identificado en un pequeño número de células no tratadas [21, 23, 24]. Después de que los pacientes fueran expuestos a radioterapia dirigida al tumor en T1, los focos RAD50 en EMTCTCs aumentaron significativamente a 0-9 por núcleo con un promedio de 4.27±2.63, y en CAMLs el número aumentó a 0-20 con un promedio de 3.9±3.93 por núcleo (Figura 6). Este aumento fue observado en todos los pacientes con células detectables en ambos puntos de tiempo T0 y T1 (n=35), y rara vez se encontró en cualquier fondo de leucocitos CD45+ normales (Figura 1B). Por lo tanto, Ra D50 en EMTCTCs y CAMLs aumentó de un promedio de 0.48 en T0 a un promedio de 4.05 (p<0.0001) en T1 (Figura 6). Estos resultados sugieren que RAD50 puede ser usado para etiquetar y rastrear las células irradiadas que se originan en los sitios del tumor y, por lo tanto, pueden ser utilizadas para rastrear la dinámica tumoral.

Expresión dinámica de PD-L1 en células circulantes

Se ha sugerido que PD-L1 puede ser inducido en tumores por varias terapias citotóxicas, incluyendo la radiación [29 34, 36'4°, 42]. Para determinar si esto podría observarse utilizando BBB, evaluamos la tinción de PD-L1 en los puntos de tiempo T0 y T1. Un sistema de puntuación comparativo normalizado fue desarrollado de manera similar a la puntuación clásica de IHC 0-3 para biopsias de tejido (Figuras 5 y 8). Después de teñir e imaginar, la expresión de PD-L1 y el fondo local para todas las 373 células encontradas en pacientes con LC fueron medidas. El fondo local de cada imagen promedió 375±150 de intensidad de píxeles (Figura 5). Para tener en cuenta el efecto de fondo localizado, se restó el fondo de cada imagen de cada célula medida, obteniendo un rango de intensidad de píxeles corregido de PD-L1 de 17-3090 (Figura 5). Luego agrupamos las células con las intensidades de píxeles corregidas utilizando la desviación estándar del fondo de 0-150 píxeles como una puntuación de 0 (26% de las células) y 2 veces la desviación estándar (151-300 píxeles) como una puntuación de 1 (baja expresión, 42% de las células). La expresión media, con una puntuación de 2 (22% de las células) se determinó como 2 veces la señal de fondo media (301-750 píxeles) y la alta expresión o puntuación de 3 (10% células) se estableció en >2 veces la señal de fondo media (>750 píxeles) (Figura 5).

La intensidad de píxeles de PD-L1 en EMTCTCs promedió 384±484 en T0 y 672±669 en T1 (p=0.021), mientras que en CAMLs fue un promedio de 182±89 en T0 y 282±169 en T1 (p=0.004) (Figura 8). El análisis de regresión encontró una correlación débil pero significativa entre RAD50 y PD-L1 de T0 a T1 (Pearson R2=0.079, p<0.0001, n=373). Aunque RAD50 fue inducido de manera confiable de T0 a T1 entre los pacientes, los cambios en la expresión de PD-L1 en pacientes individuales fueron mucho más variables (Figura 8). Encontramos 3 patrones distintos de expresión de PD-L1 entre T0 y T1 en los 35 pacientes evaluables para ambos puntos de tiempo. Dieciocho pacientes (51%) no tuvieron o baja expresión de PD-L1 en ambos puntos de tiempo, 6 pacientes (17%) tuvieron PD-L1 media/alta persistente en ambos puntos de tiempo, y 11 pacientes (32%) observaron un aumento de una puntuación baja (0/1) a una puntuación media/alta (2/3) (Figura 8).

Comparación de los niveles de PD-L1 en el tejido primario, CTCs y CAMLs

Teñimos los tejidos disponibles de la biopsia diagnóstica original mediante IHC utilizando dos pruebas comerciales certificadas por CLIA con los clones 22c3 y 28-8 (DAKO). Solo pudimos recuperar tejido o bloques celulares utilizables de los archivos patológicos en 9 de los 41 pacientes, y de estos 9 pacientes, solo 1 tenía tejido suficiente para una prueba de IHC (Figura 4). Esto se debió a necrosis tumoral o a pequeños nódulos que resultaron en una masa insuficiente para realizar la prueba de IHC de PD-L1. De las 9 muestras archivadas, solo 2 presentaron tinción positiva para PD-L1 con cierta variabilidad en las puntuaciones de expresión y porcentajes entre las dos pruebas (Figura 4C). En comparación, la expresión de PD-L1 fue cuantificable en el 85% de las muestras de pacientes en T0 (n=35/41) y en el 100% en T1 (n=41/41) utilizando BBB. Específicamente, en T0, EMTCTCs y CAMLs mostraron baja/negativa (puntuación 0/1) expresión de PD-L1 en 21 pacientes (60%), media (puntuación 2) en 9 pacientes (26%) y alta (puntuación 3) en 5 pacientes (14%) (Figura 4C).

En T0, la expresión de PD-L1 en células circulantes se asemejó a los resultados de la biopsia IHC en las dos muestras teñidas positivamente con el clon 28-8 IHC (Figura 4C). Tres pacientes tuvieron resultados concordantes con tejido negativo para PD-L1 por IHC y baja expresión (0/1) en células circulantes, pero 3 pacientes tuvieron resultados discordantes con tejido negativo para PD-L1 por IHC y puntuaciones de 2/3 en las células circulantes, y un paciente no tenía células circulantes en la muestra T0 (Figura 4). Dado el número limitado de muestras, no fue posible realizar un análisis estadístico adecuado. Sin embargo, estos resultados sugieren que las biopsias primarias no siempre proporcionan suficiente tejido para evaluar la expresión de PD-L1, mientras que un enfoque de biopsia basada en sangre (BBB) podría medir niveles intrínsecos y monitorear cambios en la expresión de PD-L1 en células circulantes que se originan en poblaciones celulares del tumor primario de pulmón.

PD-L1 y RAD50 en células circulantes como marcadores pronósticos potenciales

En biopsias de tejido, la expresión del biomarcador PD-L1 por sí sola no es un indicador pronóstico de supervivencia en cáncer de pulmón, mientras que la formación de focos RAD50 ha demostrado estar positivamente correlacionada con la supervivencia [14, 18, 20, 24, 29, 30, 32, 35, 39, 40, 42]. Analizamos los resultados clínicos de los pacientes basándonos en la expresión de PD-L1 o el promedio de RAD50 en T0 y T1 (Figura 9). Para comparar la SLP utilizando la expresión de PD-L1, usamos la expresión media como criterio de corte, es decir, <2 frente a >2 para los dos cohortes. Los pacientes con menor PD-L1 en T0 tuvieron un índice de riesgo (HR) ligeramente peor de 1.8, que no fue significativo (p=0.305). En T1, los pacientes con menor PD-L1 tuvieron una SLP general ligeramente mejor (HR=0.7), tampoco significativa (p=0.581). Estos datos sugieren una correlación limitada o nula entre la SLP general y los niveles de PD-L1 en T0 o T1. Sin embargo, encontramos una ligera tendencia hacia una mejor SLP media en T0 en células con mayor PD-L1 (16 meses frente a >24 meses), aunque esto requiere confirmación con tamaños de muestra mayores.

Dado que la formación de focos RAD50 en biopsias de tejido ha mostrado correlación positiva con la supervivencia [18, 20, 24, 26], evaluamos su valor pronóstico en células circulantes (Figura 9). El número de focos RAD50 en EMTCTCs y CAMLs en T0 no mostró diferencias clínicas en la SLP general (HR=1.0, p=0.775). Sin embargo, los pacientes con mayor RAD50 en T1 mostraron una tendencia no significativa hacia una mejor SLP general (HR=2.3, p=0.27) (Figura 9). Aunque la SLP general no fue significativamente diferente, la SLP media fue 1.9 veces mayor en pacientes con >1 foco RAD50/célula en comparación con aquellos con <1 foco RAD50/célula (9.8 meses frente a 18.5 meses, respectivamente). Estos datos sugieren que un aumento en RAD50 en células circulantes después de radioterapia podría tener valor pronóstico, aunque se necesita validación adicional con tamaños de muestra mayores.

Según los resultados proporcionados en los párrafos anteriores, rastreamos prospectiva y secuencialmente los niveles de PD-L1 y los focos de RAD50 en tres subtipos de células sanguíneas circulantes: PDCTCs, EMTCTCs y CAMLs, de 41 pacientes con cáncer de pulmón que se sometieron a (quimio) radioterapia. Fenotipamos las células circulantes basándonos en la formación de focos de RAD50 inducidos por radiación para rastrear cuantitativamente los cambios biológicos claros en las células que emanan de una masa tumoral pulmonar primaria. Además, el seguimiento de estos cambios dinámicos podría utilizarse para diferenciar a los pacientes con tumores que pueden haberse vuelto más sensibilizados a la radioterapia, aunque se necesitan estudios más amplios.

Muchos grupos han establecido que la formación de IRIF es observable mediante la formación de focos de RAD50 en los núcleos de las células dañadas por radiación (Figura 10) [18, 23] y la inhibición de la formación de IRIF a través de la sensibilización previa con agentes que dañan el ADN ha demostrado estar positivamente correlacionada con el resultado clínico en varios tipos de cáncer (es decir, NSCLC, cáncer de mama, carcinoma de células escamosas, etc.) [18, 2o, 23, 24, 26]. Inicialmente observamos que los pacientes con NSCLC no tratados antes de la radioterapia tenían un número bajo de focos de RAD50 con un aumento significativo de los focos de RAD50 directamente en paralelo con la inducción de la radioterapia. Este aumento en RAD50 probablemente sea el resultado del daño al ADN causado por la inducción radioterapéutica y la formación de focos de RAD50 en las células circulantes parece actuar como un marcador no invasivo en pacientes con cáncer que reciben radioterapia dirigida al sitio. Sugerimos que RAD50 podría usarse en análisis de biopsias líquidas para confirmar el órgano de origen de las células circulantes y sugiere que tanto las EMTCTCs como las CAMLs se diseminan desde masas pulmonares primarias en los pacientes.

La prueba IHC actualmente aprobada de tejido de biopsia para la expresión de PD-L1 es solo un predictor de respuesta en pacientes con niveles muy altos de expresión de PD-L1, sin embargo, muchos pacientes negativos para PD-L1 también se beneficiarán [29, 30, 33, 39-42, 46]. Esta discrepancia puede atribuirse a la naturaleza dinámica de la expresión de la modulación inmune y/o la incapacidad de analizar los componentes de las células estromales. Debido a que la expresión de las proteínas de puntos de control inmunológico es dinámica, influenciada por múltiples factores microambientales, inflamatorios y terapéuticos, se ha planteado la hipótesis de que el análisis basado en sangre puede proporcionar una representación más precisa de la expresión actual de PD-L1 en los pacientes [29, 30, 39, 42, 43, 47, 48]. Curiosamente, encontramos tres clases de respuestas de PD-L1 en las células circulantes de los pacientes: aquellas que son persistentemente bajas, persistentemente altas o inducibles de bajas a altas; lo que ocurre en aproximadamente un tercio de los pacientes (32%). Esto sugiere que los niveles intrínsecamente altos o inducibles de PD-L1 en casi la mitad de los pacientes (49%) podrían ser predictivos de la respuesta a la inmunoterapia; una hipótesis que necesitará validación prospectiva en ensayos clínicos que combinen inmunoterapia y radioterapia.

Ejemplo 2

Las células endoteliales tumorales (TECs) [60-62] son una población de células estromales necesarias para la iniciación, supervivencia y crecimiento del tumor al formar las estructuras vitales para la angiogénesis y la neovascularización. Las TECs son componentes obligatorios en todos los sitios tumorales, necesarios para la vasculatura tumoral, ayudan a preparar nichos metastásicos y contribuyen a la inestabilidad molecular de los tumores. En la circulación, se ha identificado y definido una población común de TECs como células endoteliales vasculares asociadas al cáncer (CAVEs) basadas en su gran tamaño, agrupamiento multicelular y los marcadores clásicos de EC CD31 y Vimentina [60].

La exclusión por tamaño es una técnica para aislar células grandes de la sangre periférica del paciente independientemente de su expresión de marcadores de superficie, lo que permite la captura de muchos subtipos de ECs tumorales circulantes. Los microfiltros CellSieve™ son membranas de exclusión por tamaño capaces de aislar rápida y eficientemente CAVEs, CAMLs y CTCs de sangre completa, haciendo posible [13, 60-62]. Además, se ha desarrollado una técnica de multifenotipado para estudiar todos los tipos de células en conjunto y en relación con la enfermedad maligna utilizando microfiltros CellSieve™, permitiendo una detección masiva de biomarcadores de subtipos en células aisladas.

Para demostrar este enfoque, se tomaron muestras de sangre periférica de 116 pacientes con cáncer (etapas I-IV) entre 2012-2014, incluyendo mama (n=42), pulmón (n=39) y próstata (n=35), así como sangre de 34 controles sanos. La sangre se procesó mediante un enfoque de filtración establecido, es decir, la técnica de microfiltración CellSieve™ (Creatv MicroTech), filtrando la sangre por exclusión de tamaño y tiñendo las células para CK 8, 18 y 19, EpCAM y CD45 (Fig. 11 A). Después de la identificación y el análisis de imágenes, se utilizó la técnica QUAS-R (Quench, Underivatize, Amine-Strip and Restain) para eliminar la señal de fluorescencia y volver a teñir todas las células con CD 146, CD 14, vimentina y DAPI (Fig. 11B). Después de volver a tomar imágenes, se utilizó nuevamente QUAS-R para eliminar la fluorescencia y volver a teñir las células para CD144, CD34 (o CD105), cm 1 y DAPI (Fig. 11C). Los grupos multinucleados de CAVEs se diferenciaron de las células macrófagas asociadas al cáncer utilizando CD 14+ y la estructura del núcleo poliploide observada con CAMLs.

Las CAVEs se identificaron en 63 de 116 pacientes (54%) basándose en la positividad de CD31, CD 144 o CD 146, pero no se encontraron en controles sanos. Las CAVEs se encontraron en 43% de los pacientes en etapa I, 66% en etapa II, 74% en etapa III y 82% en etapa IV (Fig. 12). Las CAVEs se encontraron en 69% de las muestras de mama, 60% de pulmón y 77% de próstata. Todas las CAVEs fueron negativas para CD14 y CD45. CD31 fue el marcador más presente, encontrado en 96% de las CAVEs, seguido por CD 144 (85%), citoqueratina (68%), CD34 (64%), CD 146 (45%), EpCAM (23%) y CD105 (4%) (Fig. 13).

Los resultados demuestran que las CECs aisladas por microfiltración son positivas para citoqueratina y negativas para CD45, que aparecen comúnmente en la circulación de pacientes con tumores sólidos, pero no en controles sanos. El subtipado multiphenotípico puede identificar y subtipar adecuadamente las CECs en pacientes con cáncer con múltiples tipos de tumores sólidos. Estos datos sugieren que un subconjunto de CECs, por ejemplo, CAVEs, se encuentran en circulación como CK+/CD45- y existen como una población heterogénea de células circulantes específicas del cáncer.

Ejemplo 3

La Figura 14 muestra la tinción para verificar la aparición de CAVEs en un grupo de células. Durante la tinción inicial de todas las células capturadas de un paciente con carcinoma, las muestras se tiñeron con DAPI, citoqueratina 8, 18 y 19, EpCAM y CD45. La fila superior de la Figura 14 muestra un grupo con expresión de citoqueratina y EpCAM, sin expresión de CD45. La segunda fila de la Figura 14 muestra que las células se volvieron a teñir para DAPI, PD-L1,<c>D 14 y CD31. La tinción de membrana CD31+ y la tinción negativa de CD45 y CD14 indican que este es un grupo de CAVEs. Este grupo de CAVEs tiene una alta expresión de PD-L1. En la tercera fila de la Figura 14, las células se volvieron a teñir para CD 144, CXCR4 y vimentina. CXCR4 es otro objetivo de fármacos. Se utilizó QUAS-R para el restañado [13], que consistió en apagar el tinte fluorescente seguido de restañado. El restañado indica un método para analizar la inmunoterapia combinada. En este ejemplo, tanto las expresiones de PD-L1 como de CXCR4 son altas, lo que indica que esta inmunoterapia combinada podría funcionar para este paciente.

La Figura 15 muestra una célula CAML inicialmente teñida con DAPI, citoqueratina 8, 18 y 19, EpCAM y CD45 (fila superior). La segunda fila de la Figura 15 muestra que las células se volvieron a teñir para DAPI, PD-L1, CCR5 y PD-1. En este ejemplo, tanto las expresiones de PD-L1 como de CCR5 son altas, lo que indica que esta inmunoterapia combinada podría funcionar para este paciente.

La Figura 16 muestra una célula CAML inicialmente teñida con DAPI, citoqueratina 8, 18 y 19, EpCAM y CD45 (fila superior). La segunda fila de la Figura 16 muestra que las células se volvieron a teñir para DAPI, PD-L1, CCR5 y PD-1. En este ejemplo, hay CCR5 pero no expresiones de PD-L1, lo que indica que esta inmunoterapia combinada podría funcionar para este paciente.

Ejemplo 4

Un diagnóstico complementario actual para la inmunoterapia se basa en la expresión de la proteína PD-L1 en biopsias de tejido. Sin embargo, el enfoque de biopsia de tejido IHC está limitado por la viabilidad clínica y el costo de repetir una biopsia, la heterogeneidad inherente del tumor y el conocimiento de que los pacientes negativos para PD-L1 IHC aún pueden responder a la inmunoterapia.

La expresión de PD-L1 puede detectarse en CAMLs y CTCs, como se muestra en las Figuras 17A y 17B. Para determinar si la expresión de PD-L1 puede monitorearse en tiempo real a partir de células circulantes periféricas, evaluamos muestras seriadas de un paciente con RCC antes y después de la iniciación de pembrolizumab, una inmunoterapia anti-PD1. La expresión de PD-L1 se midió cuantitativamente y se puntuó en función de la intensidad de la señal de fluorescencia: (señal-fondo)/fondo, o (S-N)/N. Demostramos la capacidad de monitorear los cambios dinámicos de la expresión de la proteína PD-L1 durante el tratamiento utilizando CAMLs.

Antes del primer tratamiento con pembrolizumab para un paciente, esta expresión era de aproximadamente 6 en las CAVEs (Fig. 17A). Un mes después de pembrolizumab, la expresión de PD-L1 en las CAMLs disminuyó al nivel del fondo (Fig. 17B). La Fig. 17B es una CAMl en forma de varilla de 74 pm de largo con (S-N)/N<0.5, casi invisible en el canal fluorescente de PD-L1.

La Figura 18 incluye otras tinciones que permiten la visualización de la célula. En este momento, el paciente todavía tenía 26 CAMLs de un tubo de sangre, todas con PD-L1 en el nivel de ruido. El paciente murió unos meses después mientras aún estaba en tratamiento con pembrolizumab. La pérdida de expresión de PD-L1 puede indicar la presencia de diferentes subclones de RCC o la selección de un subclon con baja expresión de PD-L1 en respuesta a pembrolizumab.

REFERENCIAS

Todas las siguientes referencias han sido citadas en esta solicitud:

1. Adams DL, Zhu P, Makarova OV, Martin SS, Charpentier M, Chumsri S, et al. The systematic study of circulating tumor cell isolation using lithographic microfllters. RSC Advances. 2014; 4:4334-42.

2. Lianidou ES, Markou A. Circulating tumor cells in breast cancer: detection systems, molecular characterization, and future challenges. Clinical chemistry. 2011; 57:1242-55.

3. Pantel K, Brakenhoff RH, Brandt B. Detection, clinical relevance and specific biological properties of disseminating tumour cells. Nature reviews Cancer. 2008; 8:329-40.

4 Paterlini-Brechot P, Benali NL. Circulating tumor cells (CTC) detection: clinical impact and future directions. Cáncer letters. 2007; 253:180-204.

5. Adams D, Tsai S, Makarova OV, Zhu P, Li S, Amstutz P T, et al. Low cytokeratin-and low EpCAM-expressing circulating tumor cells in pancreatic cancer. ASCO Annual Meeting Proceedings; 2013. p. 11046.

6. Adams DL, Stefansson S, Haudenschild C, Martin SS, Charpentier M, Chumsri S, et al. Cytometric characterization of circulating tumor cells captured by microflltration and their correlation to the cellsearch((R)) C TC test. Cytometry Part A • the journal of the International Society for Analytical Cytology. 2015; 87: 137-144.

7. Krebs m G, Hou JM, Sloane R, Lancashire L, Priest L, Nonaka D, et al. Analysis of circulating tumor cells in patients with non-small cell lung cancer using epithelial markerdependent and -independent approaches. J Thorac Oncol. 2012; 7:306-15.

8. Farace F, Massard C, Vimond N, Drusch F, Jacques N, Billiot F, et al. A direct comparison of CellSearch and ISET for circulating tumour-cell detection in patients with metastatic carcinomas. British journal of cancer. 2011; 105:847-53.

9. Lecharpentier A, Vielh P, Perez-Moreno P, Planchard D, Soria JC, Farace F. Detection of circulating tumour cells with a hybrid (epithelial/mesenchymal) phenotype in patients with metastatic non-small cell lung cancer. British journal of cancer. 2011; 105:1338-41.

10. Adams DL, Adams DK, Stefansson S, Haudenschild C, Martin SS, Charpentier M, et al. Mitosis in circulating tumor cells stratifies highly aggressive breast carcinomas. Breast cancer research: BCR. 2016; 18:44.

11. Adams DL, Adams DK, Alpaugh RK, Cristofanilli M, Martin SS, Chumsri S, et al. Circulating Cancer-Associated Macrophage-Like Cells Differentiate Malignant Breast Cancer and Benign Breast Conditions. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 2016; 25:1037-42.

12. Adams DL, Alpaugh RK, Martin SS, Charpentier M, Chumsri S, Cristofanilli M, et al. Precision microfilters as an all in one system for multiplex analysis of circulating tumor cells. RSC Advances. 2026; 6:6405-14.

13. Adams DL, Alpaugh RK, Tsai S, Tang CM, Stefansson S. Multi-Phenotypic subtyping of circulating tumor cells using sequential fluorescent quenching and restaining. Sci Rep. 2016; 6:33488.

14. Adams DL, Martin SS, Alpaugh RK, Charpentier M, Tsai S, Bergan RC, et al. Circulating giant macrophages as a potential biomarker of solid tumors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America.

2014; I I I :3514-9.

15. Allard WJ, J, Miller MC, Repollet M, Connelly MC, Rao C, et al. Tumor cells circulate in the peripheral blood of all major carcinomas but not in healthy subjects or patients with nonmalignant diseases. Clin Cancer Res. 2004; 10:6897-904. 16. Anantharaman A, Friedlander T, Lu D, Krupa R, Premasekharan G, Hough J, et al. Programmed death-ligand I (PD-L1) characterization of circulating tumor cells (CTCs) in muscle invasive and metastatic bladder cancer patients. BMC Cancer. 2016; 16:744.

17. Muz, Benali-Furet N, Uzan G, znaty A, Ye Z, Paolillo C, et al. Detection and Characterization of Circulating Tumor Associated Cells in Metastatic Breast Cancer. Int J Mol Sci. 2016; 17.

18. Abuzeid WM, Jiang X, Shi G, wang H, Paulson D, Araki K, et al. Molecular disruption of RAD50 sensitizes human tumor cells to cisplatin-based chemotherapy. J Clin Invest. 2009; 119:1974-85.

19. Adams DL, Edelman MJ, Fang P, Jiang W, He J, Xu T, et al. Sequential tracking of PDL1 expression and RAD50 induction in CTCs and circulating stromal cells of lung cancer patients during treatment with radiotherapy. Cancer Research. 2016; 76:4990-.

20. Flores-Perez A, Rafaelli LE, Ramirez-Torres N, Arechaga-Ocampo E, Frias S, Sanchez S, et al. RAD50 targeting impairs DNA damage response and sensitizes human breast cancer cells to cisplatin therapy. Cancer Biol Ther. 2014; 15:777-88.

21. Garcia-Villa A, Balasubramanian P, Miller BL, Lustberg MB, Ramaswamy B, Chalmers JJ. Assessment of gamma-H2AX levels in circulating tumor cells from patients receiving chemotherapy. Front Oncol. 2012; 2:128.

22. Lin SH, He J, Edelman M, Xu T, Gao H, Reuben J, et al. Sequential Assessment ofDNA Damage Response and PD-L1 Expression in Circulating Tumor Cells of Lung Cancer Patients during Radiotherapy. JOURNAL Of THORACIC ONCOLOGY; 2015: ELSEVIER SCIENCE INC 360 PARK AVE SOUTH, NEW YORK, NY 10010-1710 USA. p. S266-S7.

23. Maser RS, Monsen KJ, Neims BE, Petrini JH. hMre11 and hRad50 nuclear foci are induced during the normal cellular response to DNA double-strand breaks. Mol Cell Biol. 1997; 17:6087-96.

24. Wang LH, Pfister TD, Parchment RE, Kummar S, Rubinstein L, Evrard YA, et al. Monitoring drug-induced gammaH2AX as a pharmacodynamic biomarker in individual circulating tumor cells. Clin Cancer Res. 2010; 16:1073-84.

25. Gatei M, Jakob B, Chen P, Kijas AW, Becherel OJ, Gueven N, et al. ATM proteindependent phosphorylation of Rad50 protein regulates DNA repair and cell cycle control. J Biol Chem. 2011; 286:31542-56.

26. Teng SC, wu KJ, Tseng SF, Wong CW, Kao L. Importin KPNA2, NBS 1, DNA repair and tumorigenesis. J Mol Histol. 2006; 37:293-9.

27. Demaria S, Golden EB, Formenti SC. Role of Local Radiation Therapy in Cancer Immunotherapy. JAMA Oncol.

2015;1: 1325-32.

28. Derer A, Deloch L, Rubner Y, Fietkau R, Frey B, Gaipl US. Radio-immunotherapyInduced Immunogenic Cancer Cells as Basis for Induction of Systemic Anti -Tumor Immune Responses - Pre-Clinical Evidence and Ongoing Clinical Applications. Front Immunol. 2015; 6:505.

29. Brahmer J, Reckamp KL, Baas P, Crino L, Eberhardt WE, Poddubskaya E, et al.

Nivolumab versus Docetaxel in Advanced Squamous-Cell Non-Small-Cell Lung Cancer. N Engl J Med. 2015;373: 123-35.

30. Brahmer JR, Tykodi SS, Chow LQ, Hwu WJ, Topalian SL, Hwu P, et al. Safety and activity of anti-PD-L1 antibody in patients with advanced cancer. N Engl J Med. 2012; 366:245565.

31. Garon EB, Rizvi NA, Hui R, Leighl N, Balmanoukian AS, Eder JP, et al. Pembrolizumab for the treatment of nonsmall-cell lung cáncer. N Engl J Med. 2015; 372:2018-28.

32. Gettinger SN, Horn L, Gandhi L, Spigel DR, Antonia SJ, Rizvi NA, et al. Overall Survival and Long-Term Safety of Nivolumab (Anti-Programmed Death I Antibody, BMS936558, ONO-4538) in Patients With Previously Treated Advanced Non-Small-Cell Lung Cancer. J Clin Oncol. 0004-12.

33 Ilie M, Long-Mira E, Bence C, Butori C, Lassalle S, Bouhlel L, et al. Comparative study of the PD-L1 status between surgically resected specimens and matched biopsies of NSCLC patients reveal major discordances: a potential issue for anti-PD-L1 therapeutic strategies. Annals of oncology: official journal of the European Society for Medical Oncology / ESMO. 2016; 27:147-53.

34. ReckM, Rodriguez-Abreu D, Robinson AG, Hui R, Csoszi T, Fulop A, et al. Pembrolizumab versus Chemotherapy for PD-L1 -Positive Non-Small-Cell Lung Cancer. N Engl J Med. 2016.

35. Sundar R, Cho BC, Brahmer JR, soo RA. Nivolumab in NSCLC: latest evidence and clinical potential. Therapeutic advances in medical oncology. 2015; 7:85-96.

36. Topalian SL, Hodi FS, Brahmer JR, Gettinger SN, Smith DC, McDermott DF, et al. Safety, activity, and immune correlates of anti-PD-1 antibody in cancer. N Engl J Med. 2012; 366: 2443-54.

37. Antonia S, Goldberg SB, Balmanoukian A, Chaft JE, Sanborn RE, Gupta A, et al. Safety and antitumour activity of durvalumab plus tremelimumab in non-small cell lung cancer: a multicentre, phase 1b study. The lancet oncology.

2016; 17:299-308.

38. Borghaei H, Paz-Ares L, Horn L, spigel DR, Steins M, Ready NE, et al. Nivolumab versus Docetaxel in Advanced Nonsquamous Non-Small-Cell Lung Cancer. N Engl J Med. 2015; 373:1627-39.

39. Ma W, Gilligan BM, Yuan J, Li T. Current status and perspectives in translational biomarker research for PD-1/PD-L1 immune checkpoint blockade therapy. J Hematol Oncol.2046; 9:47.

40. Taube JM, Klein A, Brahmer JR, Xu H, Pan X, Kim JH, et al. Association of PD-1, PD-1 ligands, and other features of the tumor immune microenvironment with response to anti-PD-1 therapy. Clin Cancer Res. 2014; 20:506474.

41. Herbst RS, Soria JC, Kowanetz M, Fine GD, Hamid O, Gordon MS, et al. Predictive correlates of response to the anti-PD-L1 antibody MPDL3280A in cancer patients. Nature. 2014; 515:563-7.

42. Ung C, Kockx MM. Challenges & Perspectives of Immunotherapy Biomarkers & The HistoOncoImmuneTM Methodology. Expert Review of Precision Medicine and Drug Development. 2016; I :9-24.

43. Zhu P, Stanton ML, Castle EP, Joseph RW, Adams DL, Li S, et al. Detection of tumorassociated cells in cryopreserved peripheral blood mononuclear cell samples for retrospective analysis. J Transl Med. 2016; 14:198.

44. Alix-Panabieres C, Pantel K. Challenges in circulating tumour cell research. Nature reviews Cancer. 2014; 14:623-31 45. Marrinucci D, Bethel K, Kolatkar A, Luttgen MS, Malchiodi M, Baehring F, et al. Fluid biopsy in patients with metastatic prostate, pancreatic and breast cancers. Phys Biol. 2012; 9:016003.

46. Callahan wC, Ott PA, Odunsi K, Bertolini SV, Pan L<s>, Venhaus RR, et al. A phase 1 study to evaluate the safety and tolerability of MED14736, an anti-PD-L1 antibody, in combination with tremelimumab in patients with advanced solid tumors. ASCO Annual Meeting Proceedings; 2014. p. TPS3120.

47. Mazel M, Jacot W, Pantel K, Bartkowiak K, Topart D, Cayrefourcq L, et al. Frequent expression of PD-L1 on circulating breast cancer cells. Mol Oncol. 2015;9: 1773-82.

48 Satelli A, Batth IS, Brownlee Z, Rojas C, Meng QH, Kopetz S, et al. Potential role of nuclear PD-L1 expression in cellsurface vimentin positive circulating tumor cells as a prognostic marker in cancer patients. Sci Rep. 2016; 6:28910.

49. Nicolazzo C, Raimondi C, Mancini M, Caponnetto S, Gradilone A, Gandini O, et al. Monitoring PD-L1 positive circulating tumor cells in non-small cell lung cancer patients treated with the PD-1 inhibitor Nivolumab. Sci Rep. 2016; 6:31726.

50. Daniel L. Adams, R. Katherine Alpaugh, Steven H. Lin, Jeffrey R. Marks, Raymond

Bergan, Stuart S. Martin, Saranya Chumsri, Massimo Cristofanilli, Cha-Mei Tang, Steingrimur Stefansson, "Multiplex phenotyping of circulating cancer associated macrophage-like cells in patients with solid tumors", Proceedings of AACR, Vol. 58, April 2017. Abstract #778.

51. American Cancer Society. http://www.cancer.org/cancer/cancerbasics/lifetimeprobability-of-developing-or-dyingfrom-cancer

52. SEER. https://seer.cancer.gov/

53. CDC. https://www.cdc.gov/nchs/fastats/leading-causes-of-death.htm

54. Burstein HJ, Krilov L, Aragon-Ching JB, Baxter fNN, Chiorean EG, Chow WN, De Groot JF, Devine SM, and more, Clinical Cancer Advances 2017: Annual Report on Progress Against Cancer From the American Society of Clinical Oncology. J. of Clinical Oncology, 2017, February 1, 35. DOI: 10.1200/JCO.2016.71.5292. http://ascopubs.org/doi/abs/10.1200/JCO.2016.71.5292

55. Yervoy (ipilimumab) FDA approval history. https://www.drugs.com/history/yervoy.html

56. Opdivo (nivolumab) FDA approval history. https://www.drugs.com/history/opdivo.html

57. Keytruda (pembrolizumab) FDA approval history. https://www.drugs.com/history/keytruda.html

58 Tecentriq (atezolizumab) FDA approval history. https://www.drugs.com/history/tecentriq.html

59. Yervoy and Opdivo combination FDA approval history. http://www.fda.gov/Drugs/InformationOnDrugs/ApprovedDrugs/ucm465274.htm

60. Adams DL "Detection and monitoring of circulating immune cells in solid tumors: shifting priorities In liquid biopsies in solid tumors" (Chapter 5), Springer, 2017.

61. El-Heliebi A, et al "Are morphological criteria sufficient for the identification of circulating tumor cells in renal cancer?" J. Trans Med. I I :214, 2013

62. Cima I, et al "Tumor-derived circulating endothelial cell clusters in colorectal cancer”. Sci Trans Med 8(345):345ra3892016.

Claims (17)

REIVINDICACIONES

1. Método para evaluar la susceptibilidad de un sujeto con cáncer a un inhibidor de puntos de control inmunitario, que comprende:

analizar células macrófagas asociadas al cáncer (CAMLs) y células tumorales circulantes de transición epitelial a mesenquimal (EMTCTCs) aisladas de un sujeto con cáncer para la expresión de PD-L1,

donde cuando se detecta la expresión de PD-L1, se considera que el sujeto es susceptible a un inhibidor de punto de control inmunológico, o

se predice que el sujeto responderá al tratamiento con un inhibidor de punto de control inmunológico, o

se selecciona la administración de una cantidad terapéuticamente efectiva de un inhibidor de punto de control inmunológico como tratamiento para el sujeto,

o se identifica al sujeto como un sujeto para recibir un tratamiento con inhibidor de punto de control inmunológico.

2. Método de monitoreo de la expresión de PD-L1 en un sujeto con cáncer, que comprende:

(a) analizar CAMLs y EMTCTCs aisladas en un primer punto temporal de un sujeto con cáncer para la expresión de PD-L1, (b) analizar CAMLs y EMTCTCs aisladas en un segundo punto temporal de un sujeto con cáncer para la expresión de PD-L1, y

(c) comparar la expresión de PD-L1 analizada en las células aisladas en el primer y el segundo punto temporal.

3. El método de la reivindicación 2, en el que el sujeto está recibiendo tratamiento para el cáncer.

4. El método de la reivindicación 2, en el que el sujeto está tomando un inhibidor de punto de control inmunológico.

5. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-2 y 4, en el que el inhibidor de punto de control inmunológico es uno o más de un antagonista de PD-L1, un antagonista de PD-1 y un antagonista de CTLA-4.

6. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-2 y 4, en el que el inhibidor de punto de control inmunológico inhibe la unión entre PD-L1 y PD-1, o la unión de PD-L1 a sus ligandos, o la unión de PD-1 a sus ligandos, o la unión de CTLA-4 a sus ligandos.

7. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-2 y 4, en el que el inhibidor de punto de control inmunológico es un anticuerpo, preferiblemente un anticuerpo monoclonal, o preferiblemente un anticuerpo humano, un anticuerpo humanizado o un anticuerpo quimérico.

8. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-2 y 4, en el que el inhibidor de punto de control inmunológico es uno o más de Nivolumab (Opdivo), Ipilimumab (Yervoy), Pembrolizumab (Keytruda), Atezolizumab (Tecentriq), Tremelimumab y Durvalumab (MED 14736).

9. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en el que el análisis para la expresión de PD-L1 es mediante uno o más de la detección de la expresión de la proteína PD-L1 y la detección de la producción de ARNm de PD-L1, preferiblemente en el que la expresión de la proteína PD-L1 se detecta mediante inmunohistoquímica (IHC), preferiblemente en el que la IHC se realiza mediante tinción de membrana, tinción citoplasmática o una combinación de ambas, más preferiblemente en el que la IHC se realiza utilizando un anticuerpo anti-PD-L1.

10. El método de la reivindicación 9, en el que la expresión de la proteína PD-L1 se detecta como una baja intensidad de tinción mediante IHC, o como una alta intensidad de tinción mediante IHC, o como inducible mediante IHC, o como cualquier tinción de las células aisladas.

11. El método de la reivindicación 9, en el que la IHC se realiza utilizando tinción por inmunofluorescencia (IF), en el que se utilizan uno o más anticuerpos con especificidad de unión para PD-L1, preferiblemente en el que la unión del anticuerpo anti-PD-L1 a PD-L1 se detecta mediante un compuesto fluorescente conjugado al anticuerpo anti-PD-L1 o la unión del anticuerpo anti-PD-L1 a PD-L1 se detecta mediante un anticuerpo secundario conjugado con fluoróforo con especificidad de unión para el anticuerpo anti-PD-L1.

12. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en el que la expresión de PD-L1 se detecta cuando el nivel de expresión de PD-L1 es mayor que la expresión de PD-L1 en una población de células estromales de un sujeto de la misma especie que no tiene cáncer.

13. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en el que las EMTCTCs y CAMLs se aíslan de sangre obtenida del sujeto con cáncer, preferiblemente en el que la sangre es sangre periférica.

14. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en el que el sujeto con cáncer está recibiendo tratamiento con uno o más agentes dirigidos, quimioterapia o radioterapia.

15. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en el que el cáncer es un tumor sólido, preferiblemente el tumor sólido es un cáncer en estadio I, estadio II, estadio III o estadio IV, o preferiblemente en el que el tumor sólido es un carcinoma, sarcoma, neuroblastoma o melanoma.

16. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en el que el cáncer es cáncer de pulmón, cáncer de mama, cáncer de próstata, cáncer de páncreas, melanoma, cáncer de vejiga, cáncer de riñón, cáncer de cabeza y cuello, cáncer colorrectal, cáncer de hígado, cáncer de ovario, neuroblastoma, sarcoma, osteosarcoma, cáncer de esófago, cerebro y sistema nervioso central, laringe, bronquios, cavidad oral y faringe, estómago, testículos, tiroides, cuello uterino o cuerpo uterino, preferiblemente el cáncer de pulmón es carcinoma de pulmón no microcítico (NSCLC).

17. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en el que al menos una EMTCTC o CAML presenta al menos un foco de RAD50.