EA050147B1 - Лечение и профилактика метаболических заболеваний - Google Patents

Abstract

Описаны способы лечения и профилактики метаболического заболевания путем ингибирования сигнального пути, опосредованного интерлейкином 11 (ИЛ-11), а также агенты для применения в таких способах.

Description

Настоящая заявка испрашивает приоритет на основании заявки GB 1906291.8, поданной 3 мая 2019 г., заявки GB 1906597.8, поданной 10 мая 2019 г., заявки GB 2001013.8, поданной 24 января 2020 г., заявки GB 2001896.6, поданной 12 февраля 2020 г., и заявки GB 2002030.1, поданной 14 февраля 2020 г., содержание и элементы которых включены в настоящую заявку посредством ссылок для всех целей.

Область техники

Настоящее изобретение относится к диагностике, лечению и профилактике метаболических заболеваний.

Уровень техники

Ожирение, диабет и связанные с ними заболевания ВОЗ определяет ожирение как чрезмерное накопление жира, которое может привести к ухудшению состояния здоровья и диагностируется при ИМТ >30 кг/м². Ожирение значительно повышает риск метаболических заболеваний (включая сахарный диабет 2 типа (СД2) и стеатоз печени), сердечно-сосудистых заболеваний (включая гипертонию, инфаркт миокарда и инсульт), заболеваний опорно-двигательного аппарата (например, остеоартрита), болезни Альцгеймера, депрессии и некоторых видов рака (молочной железы, яичников, предстательной железы, печени, почек и толстой кишки) - см., например, Bluher, et al., Nat Rev Endocrinol. (2019) 15:288-298 и Prospective Studies Collaboration, Lancet. (2009) 373(9669):1083-96. Кроме того, ожирение может привести к снижению качества жизни, потере работы, снижению производительности и социальному неблагополучию, см. Berrington de Gonzalez et al., N Engl J Med (2010) 363:2211-2219. Ожирение также связано с снижением продолжительности жизни, при этом, по оценкам, такое снижение составляет 5-20 лет в зависимости от тяжести состояния и сопутствующих заболеваний, см. Fontaine et al., JAMA (2003) 289: 187-193.

За последние 50 лет распространенность ожирения возросла до уровня пандемии. В период с 1975 по 2016 год также тревожными темпами увеличивалась распространенность ожирения в мире у детей и подростков - с 0,7% до 5,6% у мальчиков и 0,9% до 7,8% у девочек (NCD-RisC, Lancet (2017) 390(10113):26227-2642). Было показано, что основной причиной ожирения является вестернизация образа жизни и употребление гиперкалорийной пищи.

Еще одной наиболее серьезной угрозой для здоровья людей во всем мире является рост заболеваемости сахарным диабетом 2 типа с ожирением. В статье Menke et al., JAMA (2015) 314: 1021-1029 изучали тенденции по категориям ИМТ, причем частота сахарного диабета была повышена только среди пациентов с ожирением (от 18,0% до 20,1%), что указывает на значительную связь увеличения распространенности сахарного диабета с увеличением распространенности ожирения. Особую озабоченность вызывает высокая распространенность диабета среди монголоидов, у которых диабет развивается на 30-50% чаще, чем у европеоидов, несмотря на более низкий ИМТ (Lee et al., Diabetes Care (2011) 34, 353-357).

Метформин продемонстрировал терапевтический потенциал и используется в качестве терапии первой линии при диабете наряду с переходом на здоровый образ жизни, что также включает регулярные физические упражнения, оказывающие благоприятное действие при борьбе с ожирением (Yerevanian et al., Curr Obes Rep (2019)). Кроме того, недавно показано, что интерлейкин-1 является терапевтической мишенью при лечении сахарного диабета с целью регуляции неспецифичного воспаления при СД 2 типа (Kataria et al., Semin Immunopathol. (2010)).

Неалкогольный стеатогепатит (НАСГ).

Расчетная распространенность неалкогольной жировой болезни печени (НАЖБП) в мире составляет 25% (Friedman et al., Nat Med. (2018) 24(7): 908-922), и хотя НАЖБП обратима, она может прогрессировать до неалкогольного стеатогепатита (НАСГ). НАСГ характеризуется воспалением, вызванным стеатозом, гибелью гепатоцитов и фиброзом печени, что в конечном итоге приводит к печеночной недостаточности. Звездчатые клетки печени (ЗКП) играют ключевую роль в патогенезе НАСГ и приводят к образованию до 95% миофибробластов печени (Mederacke et al. Nat Commun (2013) 4:2823), что лежит в основе многих ключевых патологических явлений при НАСГ, а именно фиброза печени, воспаления и дисфункции паренхимы (Friedman, Physiol Rev (2008) 88:125-172; Friedman, J Biol Chem (2000) 275:22472250; Higashi et al., Adv Drug Deliv Rev (2017) 121:27-42).

В активации и трансформации ЗКП участвует ряд факторов, включая классические профиброзные факторы - трансформирующий фактор роста-в1 (TGFe1) и фактор роста тромбоцитов (PDGF; Hellerbrand J Hepatol (1999) 30:77-87; Tsuchida and Friedman Nat Rev Gastroenterol Hepatol (2017) 14:397-411), а также провоспалительные факторы, например, CCL2, ФНОа и CCL5 (Friedman, J Biol Chem (2000) 275:22472250; Tsuchida and Friedman Nat Rev Gastroenterol Hepatol (2017) 14:397-411; Kim et al., Sci Rep (2018) 8:7499). Возможно, из-за этой сложности и внутренней избыточности адресное воздействие ни на один из вышестоящих инициирующих факторов не принесло успеха при лечении НАСГ, и утвержденные препараты для лечения НАСГ отсутствуют. В настоящее время существует ряд препаратов, используемых в клинических исследованиях НАСГ, однако многие из них воздействуют на метаболизм, и неясно, могут ли они вызывать улучшение состояния при фиброзе печени, что определяет клинические результаты (Friedman et al., Nat Med. (2018)24(7): 908-922; Banini etal., Curr Opin Gastroenterol (2017) 33:134-141).

Покоящиеся HSC представляют собой клетки, запасающие витамин А, и сильно отличаются от фибробластов. Вместе с тем, оба типа клеток используют общие факторы для активации и стимуляции их

- 1 050147 перехода в миофибробласты с общими признаками (Mederacke et al. Nat Commun (2013) 4:2823; Iwaisako et al., Proc Natl Acad Sci U S A 2014; 111:E3297-305). Недавно установлено, что ИЛ-11 является важнейшим фактором трансформации фибробластов сердечно-сосудистой системы и легких в миофибробласты (Schafer et al., Nature 2017;552:110-115; Cook et al., (2018) https://doi.org/10.1101/336537). Имеются крайне ограниченные данные о роли ИЛ-11 в печени, однако имеются сообщения о том, что рекомбинантный ИЛ-11 человека оказывает защитное действие при введении грызунам в очень высоких дозах (Zhu et al., PLoS One (2015) 10:e0126296; Yu et al., Clin Res Hepatol Gastroenterol (2016) 40: 562-570) и использовался в исследованиях на людях в попытке ослабить воспаление при поздних стадиях гепатита (Lawitz et al., Am J Gastroenterol 2004; 99:2359-2364).

Заболевания, связанные с истощением.

Истощение может быть определено как потеря мышц с потерей жировой массы или без нее, которая может проявляться как потеря массы тела. С истощением часто ассоциированы различные острые и хронические заболевания, а также старение. Истощение может приводить к ухудшению алиментарного статуса, потере мышечной массы и функции, ухудшению качества жизни и повышению риска заболеваемости и смертности. Истощение мышц является наиболее распространенным показателем истощения, хотя истощение жировой ткани также может происходить само по себе или в сочетании с истощением мышц. Примеры расстройств, связанных с истощением, включают кахексию, саркопению (например, связанную со старением или потерю массы и силы скелетных мышц из-за отсутствия нагрузок), анорексию (отсутствие или потерю аппетита к пище), миопению (термин, предлагаемый для описания общего истощения мышц), липодистрофию (специфическое истощение жировых отложений) и липоатрофию. Принятое в настоящее время определение кахексии выглядит следующим образом: многофакторный синдром, характеризующийся постоянной потерей массы скелетных мышц (с потерей жировой массы или без нее), полной регрессии которого невозможно добиться с помощью традиционной алиментарной поддержки и который ведет к прогрессирующему функциональному нарушению (Evans et al. Clin Nutr. 2008 (6):7939).

Истощение часто встречается у пациентов с хроническими заболеваниями на поздних стадиях. Приблизительно 5-15% пациентов с хронической сердечной недостаточностью или хронической обструктивной болезнью легких демонстрируют расстройство, связанное с истощением; в то же время, согласно Обществу по саркопении, кахексии и расстройствам, связанным с истощением (SCWS), расстройства, связанные с истощением, испытывают 60-80% пациентов с распространенным раком. Кахексия непосредственно связана с 20% летальных исходов от рака (Skipworth et al, Clin Nutr. 2007; 26:667-76). Истощение отмечается у пациентов с инфекционными заболеваниями, например, ВИЧ/СПИД, малярией и туберкулезом, а также при хронических заболеваниях, например, муковисцидозе, циррозе печени, почечной недостаточности, болезни Крона, ревматоидном артрите, инсульте и неврологическом дегенеративном заболевании. С началом истощения также ассоциированы травматическое повреждение, послеоперационное состояние, невесомость, хронический алкоголизм и сепсис (Farkas et al. J Cachexia Sarcopenia Muscle (2013) 4:173-178).

Истощение и расстройства, связанные с истощением, часто оказывают негативное влияние на лечение основных заболеваний: они могут ухудшить реакцию пациента на лечение основного заболевания, нанести вред иммунной системе и привести к ухудшению симптомов основного состояния. Следовательно, способы лечения, позволяющие ослабить истощение, могут повысить эффективность лечения основных заболеваний/состояний и улучшать прогноз для пациентов.

Например, кахексия, ассоциированная с распространенным раком, часто приводит к плохому прогнозу в отношении лечения рака. Онкологические пациенты, испытывающие потерю веса до и во время химиотерапии, получают более низкую начальную дозу и испытывают более частые и тяжелые токсические явления, ограничивающие дозу по сравнению с пациентами со стабильной массой тела, и, таким образом, получают значительно меньше лечения или могут быть исключены из схемы лечения с самого начала (Vaughan et al. J Cachexia Sarcopenia Muscle (2013) 4:95-109). Эффективное лечение истощения может привести к улучшению результатов для таких пациентов.

В настоящее время лечение от истощения включает стимуляторы аппетита и физические упражнения для наращивания мышечной массы. Вместе с тем, пищевые добавки или фармакологические манипуляции с аппетитом сами по себе часто не в состоянии вызвать регрессию процесса истощения, особенно в тяжелых случаях или на поздней стадии. Выполнено исследование влияния эйкозапентаеновой кислоты (ЭПК; омега-3 жирной кислоты из рыбьего жира) на улучшение кахексии в контексте рака, однако результаты исследования были неоднозначными (Jatoi et al., J Clin Oncol. 2004; 22:2469-76). При исследовании использовали антиоксиданты и нестероидные противовоспалительные средства, и считается, что комбинации этих методов лечения с, например, ЭПК, ингибиторами окислительного стресса и/или стимуляторами аппетита обладают определенным потенциалом при лечении истощения. Ингибирование убиквитинового протеолитического пути (UPP) представляет особый интерес. Ингибирование веществ, ингибирующих мышцы, например, миостатина, не привело к получению успешных результатов в клинических исследованиях.

Многофакторный характер истощения в комбинации с сопутствующими заболеваниями означает

- 2 050147 отсутствие эффективного или приемлемого в глобальном масштабе лечения истощения и даже одобренных лекарственных средств. Действительно, единственным общепринятым способом лечения истощения, ассоциированного с заболеванием, является излечение основного заболевания (Vaughan et al. J Cachexia Sarcopenia Muscle (2013) 4:95-109). Таким образом, необходимы новые способы лечения истощения.

Краткое описание изобретения

В настоящем изобретении предложен агент, способный ингибировать интерлейкин-11 (ИЛ-11)опосредованный сигнальный путь, для применения в способе лечения или профилактики метаболического заболевания.

Кроме того, предложено применение агента, способного ингибировать интерлейкин-11 (ИЛ-11)опосредованный сигнальный путь, при производстве лекарственного средства для применения в способе лечения или профилактики метаболического заболевания.

Кроме того, предложен способ лечения или профилактики метаболического заболевания, включающий введение субъекту терапевтически или профилактически эффективного количества агента, способного ингибировать интерлейкин-11 (ИЛ-11)-опосредованный сигнальный путь.

В некоторых вариантах реализации метаболическое заболевание представляет собой или включает ожирение, диабет 2 типа (СД2), диабет 1 типа (СД1), преддиабет, избыточную массу тела, метаболический синдром, гипергликемию, ассоциированную с беременностью, холестатическое заболевание печени, гипергликемию, гиперлипидемию, гипертриглицеридемию, гиперхолестеринемию, истощение, кахексию, потерю веса, ассоциированную с химиотерапией, недостаточность поджелудочной железы, панкреатит, острый панкреатит, хронический панкреатит, стеатоз, липотоксичность, неалкогольную жировую болезнь печени (НАЖДП), неалкогольный жировой гепатоз (NAFL), неалкогольный стеатогепатит (НАСГ), липодистрофию, липогипертрофию, липоатрофию, инсулинорезистентность или гиперглюкагонемию.

В некоторых вариантах реализации агент представляет собой агент, способный предотвращать или снижать связывание интерлейкина 11 (ИЛ-11) с рецептором интерлейкина 11 (ИЛ-11R).

В некоторых вариантах реализации агент способен связываться с интерлейкином-11 (ИЛ-11) или рецептором интерлейкина 11 (ИЛ-HR).

В некоторых вариантах реализации агент выбран из группы, состоящей из антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, полипептида, пептида, нуклеиновой кислоты, олигонуклеотида, аптамера или низкомолекулярного соединения.

В некоторых вариантах реализации агент представляет собой антитело или его антигенсвязывающий фрагмент.

В некоторых вариантах реализации агент представляет собой рецептор-ловушку.

В некоторых вариантах реализации агент представляет собой антитело против ИЛ-11, являющееся антагонистом сигнального пути, опосредованного ИЛ-11, или его антигенсвязывающий фрагмент. В некоторых вариантах реализации агент представляет собой антитело против ИЛ-HRa, являющееся антагонистом сигнального пути, опосредованного ИЛ-11, или его антигенсвязывающий фрагмент.

В некоторых вариантах реализации агент представляет собой рецептор-ловушку для ИЛ-11. В некоторых вариантах реализации рецептор-ловушка для ИЛ-11 содержит: (i) аминокислотную последовательность, соответствующую цитокин-связывающему модулю др130, и (ii) аминокислотную последовательность, соответствующую цитокин-связывающему модулю ИЛ-HRa.

В некоторых вариантах реализации агент представляет собой мутеин ИЛ-11. В некоторых вариантах реализации мутеин ИЛ-11 представляет собой W147A.

В некоторых вариантах реализации агент способен предотвращать или снижать экспрессию интерлейкина 11 (ИЛ-11) или рецептора интерлейкина 11 (ИЛ-HR).

В некоторых вариантах реализации агент представляет собой олигонуклеотид или низкомолекулярное соединение.

В некоторых вариантах реализации агент представляет собой антисмысловой олигонуклеотид, способный предотвращать или снижать экспрессию ИЛ-11. В некоторых вариантах реализации антисмысловой олигонуклеотид, способный предотвращать или снижать экспрессию ИЛ-11, представляет собой миРНК, мишенью которой является IL11, содержащую последовательность SEQ ID NO:12, 13, 14 или 15. В некоторых вариантах реализации агент представляет собой антисмысловой олигонуклеотид, способный предотвращать или снижать экспрессию ИЛ-HRa. В некоторых вариантах реализации антисмысловой олигонуклеотид, способный предотвращать или снижать экспрессию ИЛ-HRa, представляет собой миРНК, мишенью которой является ИЛ-HRA, содержащую последовательность SEQ ID NO: 16, 17, 18 или 19.

В некоторых вариантах реализации рецептор интерлейкина 11 представляет собой или содержит ИЛ-HRa.

В некоторых вариантах реализации способ включает введение агента субъекту, у которого повышена экспрессия интерлейкина 11 (ИЛ-11) или рецептора ИЛ-11 (ИЛ-11R).

- 3 050147

В некоторых вариантах реализации способ включает введение агента субъекту, у которого установлено повышение экспрессии интерлейкина 11 (ИЛ-11) или рецептора интерлейкина 11 (ИЛ-IIR).

В некоторых вариантах реализации способ включает определение того, повышена ли экспрессия интерлейкина 11 (ИЛ-11) или рецептора ИЛ-11 (ИЛ-11 R) у субъекта, и введение агента субъекту, у которого повышена экспрессия интерлейкина 11 (ИЛ-11) или рецептора ИЛ-11 (ИЛ-11R).

Описание

Интерлейкин-11 и рецепторы ИЛ-11.

Интерлейкин-11 (ИЛ-11), также известный как фактор, ингибирующий адипогенез, является плейотропным цитокином и членом семейства цитокинов ИЛ-6, которое включает ИЛ-6, ИЛ-11, ИЛ-27, ИЛ-31, онкостатин, фактор ингибирования лейкоза (LIF), кардиотрофин-1 (СТ-1), кардиотрофин-подобный цитокин (CLC), цилиарный нейротрофический фактор (CNTF) и нейропоэтин (NP-1).

Интерлейкин-11 (ИЛ-11) экспрессируется в различных типах мезенхимальных клеток. Геномные последовательности ИЛ-11 картированы на хромосоме 19 и в центромерной области хромосомы 7, и транскрибируются вместе с каноническим сигнальным пептидом, обеспечивающим эффективную секрецию из клеток. Комплекс активаторного белка ИЛ-11, cJun/AP-1, расположенный внутри его промоторной последовательности, имеет решающее значение для регуляции базальной транскрипции ИЛ-11 (Du and Williams., Blood 1997, Vol 89: 3897-3908). Незрелая форма ИЛ-11 человека представляет собой полипептид длиной 199 аминокислот, тогда как зрелая форма ИЛ-11 кодирует белок из 178 аминокислотных остатков (Garbers and Scheller., Biol. Chem. 2013; 394(9):1145-1161). Аминокислотная последовательность ИЛ-11 человека доступна под номером доступа в UniProt P20809 (Р20809.1 GM24294; SEQ ID NO:1). Рекомбинантный ИЛ-11 человека (опрелвекин) также доступен для приобретения. Кроме того, клонированы и секвенированы ИЛ-11 других видов, включая мышь, крысу, свинью, корову, несколько видов костных рыб и приматов.

В данном описании ИЛ-11 относится к ИЛ-11 любых видов животных и включает изоформы, фрагменты, варианты или гомологи ИЛ-11 любых видов животных. В предпочтительных вариантах реализации вид представляет собой человека (Homo sapiens). Изоформы, фрагменты, варианты или гомологи ИЛ-11 необязательно можно характеризовать как обладающие по меньшей мере 70%, предпочтительно 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% или 100% идентичностью аминокислотной последовательности по отношению к незрелому или зрелому ИЛ-11 данного вида животных, например, человека. Изоформы, фрагменты, варианты или гомологи ИЛ-11 могут необязательно характеризоваться способностью связывать ИЛ-HRa (предпочтительно того же вида животных) и стимулировать передачу сигналов в клетках, экспрессирующих ИЛ-HRa и gp130 (например, как описано в Curtis et al.Blood, 1997, 90(11); или Karpovich et al. Mol. Hum. Reprod. 2003 9(2): 75-80). Длина фрагмента ИЛ-11 (по количеству аминокислот) может быть любой, хотя необязательно может составлять по меньшей мере 25% от длины зрелого ИЛ-11, а максимальная длина может составлять 50, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98% или 99% от длины зрелого ИЛ-11. Минимальная длина фрагмента ИЛ-11 может составлять 10 аминокислот, а максимальная длина - 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190 или 195 аминокислот.

ИЛ-11 передает сигналы посредством гомодимера повсеместно экспрессируемого гликопротеина 130 (gp130; также известного как гликопротеин 130, ИЛ-6ST, ИЛ-6-бета или CD130). Gp130 представляет собой трансмембранный белок, который образует одну субъединицу рецептора цитокинов I типа с семейством рецепторов ИЛ-6. Специфичность достигается за счет отдельной альфа-субъединицы рецептора интерлейкина 11 (ИЛ-HRa), которая напрямую не участвует в передаче сигналов, хотя первоначальное событие связывания цитокина с α-рецептором приводит к образованию конечного комплекса с gp130.

gp130 человека (включая сигнальный пептид из 22 аминокислот) представляет собой белок из 918 аминокислот, а зрелая форма состоит из 866 аминокислот, включая внеклеточный домен из 597 аминокислот, трансмембранный домен из 22 аминокислот и внутриклеточный домен из 277 аминокислот. Внеклеточный домен белка содержит цитокин-связывающую часть (СВМ) gp130. СВМ gp130 содержит Igподобный домен D1 и домены фибронектина III типа D2 и D3 gp130. Аминокислотная последовательность gp130 человека доступна под номером доступа в UniProt Р40189-1 (SEQ ID NO:2).

ИЛ-HRa человека представляет собой полипептид из 422 аминокислот (UniProt Q14626; SEQ ID NO:3), и его нуклеотидная и аминокислотная последовательность обладает ~85% идентичностью ИЛ11Ra мыши. Сообщалось о двух изоформах ИЛ-HRa, которые различаются по цитоплазматическому домену (см. Du and Williams, выше), α-цепь рецептора ИЛ-11 (ИЛ-HRa) характеризуется значительным структурным и функциональным сходством с α-цепью рецептора ИЛ-6 (ИЛ-6Rα). Внеклеточный домен обладает 24% идентичностью аминокислотной последовательности, включая характерный консервативный мотив Trp-Ser-X-Trp-Ser (WSXWS). Короткий цитоплазматический домен (34 аминокислоты) лишен областей Box 1 и 2, которые необходимы для активации сигнального пути JAK/STAT.

Сайты связывания рецептора на ИЛ-11 мыши картировали и выявили три сайта - сайты I, II и III. Связывание с gp130 уменьшается за счет замен в области сайта II и за счет замен в области сайта III. Му

- 4 050147 танты III сайта не демонстрируют обнаружимой агонистической активности и обладают антагонистической активностью в отношении ИЛ-HRa (Cytokine Inhibitors, глава 8; под редакцией Gennaro Ciliberto и Rocco Savino, Marcel Dekker, Inc. 2001).

В настоящем описании рецептор ИЛ-11 (ИЛ-HR) относится к полипептиду или полипептидному комплексу, способному связывать ИЛ-11. В некоторых вариантах реализации рецептор ИЛ-11 способен связывать ИЛ-11 и индуцировать передачу сигналов в клетках, экспрессирующих указанный рецептор.

Рецептор ИЛ-11 может происходить от любого вида животных и включает изоформы, фрагменты, варианты или гомологи рецептора ИЛ-11 любого вида животных. В предпочтительных вариантах реализации указанный вид представляет собой человека (Homo sapiens).

В некоторых вариантах реализации рецептор ИЛ-11 может представлять собой ИЛ-HRa. В некоторых вариантах реализации рецептор ИЛ-11 может представлять собой полипептидный комплекс, содержащий ИЛ-HRa. В некоторых вариантах реализации рецептор ИЛ-11 может представлять собой полипептидный комплекс, содержащий ИЛ-HRa и gp130. В некоторых вариантах реализации рецептор ИЛ11 может представлять собой gp130 или комплекс, содержащий gp130, с которым связывается ИЛ-11.

Изоформы, фрагменты, варианты или гомологи ИЛ-HRa необязательно можно характеризовать как обладающие по меньшей мере 70%, предпочтительно 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% или 100% идентичностью аминокислотной последовательности по отношению к ИЛ-HRa данного вида животных, например, человека. Изоформы, фрагменты, варианты или гомологи ИЛ-HRa необязательно могут характеризоваться способностью связывать ИЛ-11 (предпочтительно того же вида животных) и стимулировать передачу сигналов в клетках, экспрессирующих ИЛ-HRa и gp130 (например, как описано в Curtis et al.Blood, 1997, 90(11) или Karpovich et al. Mol. Hum. Reprod. 2003 9(2): 75-80). Длина фрагмента рецептора ИЛ-11 (по количеству аминокислот) может быть любой, хотя необязательно может составлять по меньшей мере 25% от длины зрелого ИЛ-HRa, а максимальная длина может составлять 50, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98% или 99% от длины зрелого ИЛ-HRa. Минимальная длина фрагмента рецептора ИЛ-11 может составлять 10 аминокислот, а максимальная длина - 15, 20, 25, 30, 40, 50, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 250, 300, 400 или 415 аминокислот.

Сигнальный путь ИЛ-11.

ИЛ-11 связывается с ИЛ-HR с низким сродством (Kd ~10 нмоль/л), и одного взаимодействия между этими партнерами по связыванию недостаточно для передачи биологического сигнала. Для получения рецептора с высоким сродством (Kd ~400-800 пмоль/л), способного к передаче сигналов, необходима совместная экспрессия ИЛ-HRa и gp130 (Curtis et al Blood 1997; 90 (11):4403-12; Hilton et al., EMBO J 13:4765, 1994; Nandurkar et al., Oncogene 12:585, 1996). Связывание ИЛ-11 с ИЛ-HRa на клеточной поверхности индуцирует гетеродимеризацию, фосфорилирование тирозина, активацию gp130 и дальнейший сигнальный путь, преимущественно через митоген-активируемую протеинкиназу (МАРК), а также янус-киназу/переносчик сигнала и путь активатора транскрипции (Jak/STAT) (см. Garbers and Scheller, выше).

В принципе растворимый ИЛ-HR может также образовывать биологически активные растворимые комплексы с ИЛ-11 (Pflanz et al., 1999 FEBS Lett, 450, 117-122), что повышает способность ИЛ-11 в некоторых случаях связывать растворимый ИЛ-HRa до связывания gp130 на клеточной поверхности, аналогично ИЛ-6 (см. Garbers and Scheller, цитируемый выше). Curtis et al (Blood 1997 Dec 1;90 (11):4403-12) описывают экспрессию альфа-цепи растворимого рецептора ИЛ-11 мыши (рИЛ-HR) и исследовали сигнальный путь в клетках, экспрессирующих gp130. В присутствии gp130, но не трансмембранного ИЛ11R, растворимый ИЛ-HR опосредовал ИЛ-11-зависимую дифференцировку клеток лейкоза М1 и пролиферацию в клетках Ba/F3 и ранние внутриклеточные события, включая фосфорилирование gp130, STAT3 и SHP2, аналогично сигнальному пути через трансмембранный ИЛ-HR. Недавно продемонстрирована активация сигнального пути через связанный с клеточной мембраной gp130 с помощью ИЛ-11, связанного с растворимым ИЛ-HRa (Lokau et al., 2016 Cell Reports 14, 1761-1773). Этот так называемый транс-сигнальный путь ИЛ-11 может быть важным для патогенеза заболеваний, однако его роль в заболеваниях человека еще не изучена.

В настоящем документе термин транс-сигнальный путь ИЛ-11 используется для обозначения сигнального пути, инициирующегося связыванием ИЛ-11, связанного с ИЛ-HRa, с gp130. ИЛ-11 может связываться с ИЛ-HR в виде нековалентного комплекса. Gp130 является мембраносвязанным и экспрессируется клеткой, в которой действует сигнальный путь после связывания комплекса ИЛ-11 :ИЛ-11Rα с gp130. В некоторых вариантах реализации ИЛ-HRa может представлять собой растворимый ИЛ-HRa. В некоторых вариантах реализации растворимый ИЛ-HRa представляет собой растворимую (секретируемую) изоформу ИЛ-HRa (например, в которой отсутствует трансмембранный домен). В некоторых вариантах реализации растворимый ИЛ-HRa представляет собой продукт, высвобождаемый при протеолитическом расщеплении внеклеточного домена ИЛ-HRa, связанного с клеточной мембраной. В некоторых вариантах реализации ИЛ-HRa может быть мембраносвязанным, и сигнальный путь через gp130 может инициироваться связыванием ИЛ-11, связанным с мембраносвязанным ИЛ-HRa, и называется

- 5 050147 цис-сигнальным путем ИЛ-11. В предпочтительных вариантах реализации ингибирование сигнального пути, опосредованного ИЛ-11, достигается путем нарушения цис-сигнального пути, опосредованного ИЛ-11.

Показано, что сигнальный путь, опосредованный ИЛ-11, стимулирует гемопоэз и тромбопоэз, стимулирует активность остеокластов, стимулирует нейрогенез, ингибирует адипогенез, снижает экспрессию провоспалительных цитокинов, модулирует метаболизм внеклеточного матрикса (ВКМ) и опосредует нормальный контроль роста клеток эпителия желудочно-кишечного тракта (см. Du and Williams, выше).

Физиологическая роль интерлейкина 11 (ИЛ-11) остается неясной. ИЛ-11 наиболее тесно связан с активацией гемопоэтических клеток и с продукцией тромбоцитов. Кроме того, показано, что ИЛ-11 обеспечивает защиту от реакции трансплантат против хозяина, воспалительного артрита и воспалительного заболевания кишечника, вследствие чего ИЛ-11 считается противовоспалительным цитокином (Putoczki and Ernst, J Leukoc Biol 2010, 88(6):1109-1117). Тем не менее, предполагается, что ИЛ-11 является провоспалительным, а также противовоспалительным, проангиогенным и важным для неоплазии. Недавние исследования показали, что ИЛ-11 легко обнаруживается во время вирус-индуцированного воспаления в модели артрита у мышей и при различных видах рака, что дает основания полагать, что экспрессия ИЛ-11 может индуцироваться патологическими стимулами. ИЛ-11 также связан со Stat3зависимой активацией опухоль-стимулирующих генов-мишеней в неопластическом желудочнокишечном эпителии (см. Putoczki and Ernst, выше).

В настоящем документе термин сигнальный путь ИЛ-11 и сигнальный путь, опосредованный ИЛ-11 относится к сигнальному пути, опосредованному связыванием ИЛ-11 или его фрагмента, обладающего функцией зрелой молекулы ИЛ-11, с рецептором ИЛ-11. Следует принимать во внимание, что термины сигнальный путь ИЛ-11 и сигнальный путь, опосредованный ИЛ-11 относятся к сигнальному пути, инициируемому ИЛ-11/его функциональным фрагментом, например, посредством связывания с рецептором ИЛ-11. Сигнальный путь, в свою очередь, относится к переносу сигнала и другим клеточным процессам, регулирующим клеточную активность.

Метаболические заболевания.

Настоящее изобретение относится к лечению и/или профилактике метаболических заболеваний.

В настоящем документе термин метаболическое заболевание относится к любому заболеванию или патологическому состоянию, которое вызвано или характеризуется аномальным метаболизмом. Метаболизм в данном контексте относится к преобразованию/переработке в организме источников энергии, например, веществ, потребляемых для обеспечения питания, в энергию и/или для хранения.

Нормальный метаболизм может представлять собой метаболизм здорового субъекта, у которого нет заболевания, например, нет метаболического заболевания, или нет симптома/коррелята метаболического заболевания.

У субъекта с метаболическим заболеванием может наблюдаться аномальный метаболизм. У субъекта с метаболическим заболеванием может иметь место симптом/коррелят аномального метаболизма. У субъекта с метаболическим заболеванием может быть диагностировано метаболическое заболевание. Субъект может соответствовать диагностическим критериям для диагностики метаболического заболевания.

В некоторых вариантах реализации метаболическое заболевание представляет собой или включает (например, характеризуется) ожирение, диабет 2 типа (СД2), диабет 1 типа (СД1), преддиабет, избыточную массу тела, метаболический синдром, гипергликемию, ассоциированную с беременностью (например, гестационный диабет), холестатическое заболевание печени, гипергликемию, гиперлипидемию, гипертриглицеридемию, гиперхолестеринемию, истощение, кахексию, потерю веса, ассоциированную с химиотерапией, недостаточность поджелудочной железы, панкреатит, острый панкреатит, хронический панкреатит, стеатоз, липотоксичность, неалкогольную жировую болезнь печени (НАЖДП), неалкогольный жировой гепатоз (NAFL), неалкогольный стеатогепатит (НАСГ), липодистрофию, липогипертрофию, липоатрофию, инсулинорезистентность и гиперглюкагонемию.

Аспекты настоящего изобретения относятся к лечению и/или профилактике аномальной и/или недостаточной функции клеток/тканей/органов/систем органов, играющих роль в метаболизме. В частности, в настоящем документе рассматривается лечение и/или профилактика аномальной функции и/или недостаточной функции клеток поджелудочной железы/ткани поджелудочной железы/поджелудочной железы, а также лечение и/или профилактика аномальной функции и/или недостаточной функции клеток печени/ткани печени/печени.

В некоторых вариантах реализации метаболическое заболевание представляет собой или включает ожирение. Ожирение характеризуется избытком жира в организме. Обзор диагностики ожирения приведен, например, в источнике Orzano and Scott, J Am Board Fam Pract (2004) 17(5): 359-369, полностью включенном в настоящий документ посредством ссылки. У пациентов с ожирением индекс массы тела (ИМТ, рассчитываемый путем деления массы тела человека на квадрат его роста) составляет более 30 кг/м². В некоторых вариантах реализации метаболическое заболевание представляет собой или включает избыточный вес. Избыточный вес характеризуется ИМТ более 25 кг/м² и менее 30 кг/м² (информацион

- 6 050147 ный бюллетень №311, ВОЗ (2015)). Ожирение и избыточный вес, как правило, вызваны сочетанием чрезмерного потребления пищи, отсутствия физической активности и генетической восприимчивости.

В некоторых вариантах реализации метаболическое заболевание представляет собой или включает сахарный диабет (часто также называемый просто диабетом). Диабет относится к группе метаболических заболеваний, характеризующихся высоким уровнем глюкозы в крови в течение длительного времени (информационный бюллетень по диабету №312, ВОЗ, (2013)). Диагностика сахарного диабета по данным Американской диабетической ассоциации (ADA) требует обнаружения уровня гемоглобина А1с >6,5%, уровня глюкозы в плазме натощак (FPG) (определяемого как отсутствие потребления калорий в течение по меньшей мере 8 ч) >126 мг/дл (7,0 ммоль/л), 2-часового уровня глюкозы в плазме после перорального приема 75 г глюкозы >200 мг/дл (11,1 ммоль/л) или обнаружения у пациента с классическими симптомами гипергликемии или гипергликемического криза случайного уровня глюкозы в плазме >200 мг/дл (11,1 ммоль/л) (American Diabetes Association, Diabetes Care (2010) 33(Suppl 1): S62-S69). Симптомы диабета включают частое мочеиспускание, повышенную жажду и повышенный голод. Основной причиной диабета обычно является недостаточная продукция инсулина поджелудочной железой, или отсутствие надлежащей реакции клеток организма на продуцируемый инсулин.

Существует три основных типа диабета, которые описаны, например, в информационном бюллетене по диабету №312, ВОЗ, (2013). Диабет 1 типа (СД1) является результатом неспособности поджелудочной железы продуцировать достаточное количество инсулина из-за недостаточного количества βклеток, продуцирующих инсулин, в островках поджелудочной железы. Обзор СД1 и его диагностики приведен, например, в источнике Kahanovitz et al., Point Care. (2017) 16(1): 37-40, полностью включенном в настоящий документ посредством ссылки. Сахарный диабет 2 типа (СД2) является результатом неспособности клеток субъекта надлежащим образом реагировать на инсулин и может прогрессировать и включать недостаточную продукцию инсулина. СД2 чаще всего вызывается избыточной массой тела и недостаточными физическими нагрузками. Обзор СД2 приведен в источнике DeFronzo, Nature Reviews Disease Primers (2015) 1:15019, полностью включенном в настоящий документ посредством ссылки. Гестационный диабет (также называемый гипергликемией, ассоциированной с беременностью) возникает при развитии высокого уровня глюкозы в крови у беременных женщин. Гестационный диабет обусловлен недостаточной продукцией дополнительного инсулина, необходимого во время беременности, в контексте инсулинорезистентности, ассоциированной с беременностью. Обзор гестационного диабета приведен, например, в источнике Kampmann et al., World J Diabetes. (2015) 6(8): 1065-1072, полностью включенном в настоящий документ посредством ссылки.

В некоторых вариантах реализации метаболическое заболевание представляет собой или включает дефицит инсулина. В некоторых вариантах реализации метаболическое заболевание представляет собой или включает инсулинорезистентность. В некоторых вариантах реализации метаболическое заболевание представляет собой или включает гипергликемию. В некоторых вариантах реализации метаболическое заболевание представляет собой или включает диабет 2 типа (СД2). В некоторых вариантах реализации метаболическое заболевание представляет собой или включает диабет 1 типа (СД1). В некоторых вариантах реализации метаболическое заболевание представляет собой или включает гипергликемию, ассоциированную с беременностью.

В некоторых вариантах реализации метаболическое заболевание представляет собой или включает предиабет. Преддиабет относится к состоянию гипергликемии, при котором уровень глюкозы в крови повышается в течение длительного периода времени, но до более низкого уровня, чем требуется для диагностики диабета. Обзор преддиабета и его диагностики приведен, например, в источнике Bansal World J Diabetes. (2015) 6(2):296-303, полностью включенном в настоящий документ посредством ссылки. ВОЗ определяет преддиабет как состояние промежуточной гипергликемии, диагностируемое путем определения уровня FPG 6,1-6,9 ммоль/л (от 110 до 125 мг/дл) и уровня глюкозы в плазме через 2 ч после перорального приема 75 г глюкозной нагрузки, равного 7,8-11,0 ммоль/л (140-200 мг/дл). Диагностика преддиабета по АЛС требует уровня глюкозы в плазме через 2 ч после перорального приема 75 г глюкозной нагрузки, равного 7,8-11,0 ммоль/л (140-200 мг/дл), уровня FPG 100-125 мг/дл и уровня гемоглобина А1 с от 5,7% до 6,4%.

В некоторых вариантах реализации метаболическое заболевание представляет собой или включает метаболический синдром. Обзор метаболического синдрома приведен, например, в источнике Rochlani et al., Сердечно-сосудистое заболевание (2017) 215-225, полностью включенном в настоящий документ посредством ссылки. ВОЗ определяет метаболический синдром как наличие инсулинорезистентности (нарушение уровня глюкозы натощак, нарушение толерантности к глюкозе или СД2) в дополнение к двум следующим признакам: ожирение, гиперлипидемия (гипертриглицеридемия или низкий уровень холестерина липопротеинов высокой плотности (ЛПВП)), артериальная гипертензия или микроальбуминурия. Существует несколько других определений метаболического синдрома, сводная информация о которых приведена в таблице 1 в работе Rochlani et al., выше.

В некоторых вариантах реализации метаболическое заболевание представляет собой или включает холестаз. Холестаз относится к уменьшению потока желчи из печени в двенадцатиперстную кишку. В

- 7 050147 некоторых вариантах реализации метаболическое заболевание представляет собой или включает холестатическое заболевание печени. Холестатическое заболевание печени является результатом недостаточного синтеза, секреции и/или протекания желчи через желчные пути, и его обзор, например, приведен в источниках Jansen et al., Hepatology (2017) 65(2):722-738 и Pollock and Minuk, J Gastroenterol Hepatol (2017) 32(7): 1303-1309, оба из которых полностью включены в настоящую заявку посредством ссылок. Холестатические заболевания печени включают первичный желчный холангит (ПБХ) и первичный склерозирующий холангит (ПСХ).

В некоторых вариантах реализации метаболическое заболевание представляет собой или включает гиперлипидемию. Гиперлипидемия относится к повышенному уровню липидов или липопротеинов в крови. Гиперлипидемия включает гипертриглицеридемию, гиперхолестеринемию и комбинированную гиперлипидемию (сочетание гипертриглицеридемии и гиперхолестеринемии). Гиперлипидемия ассоциирована, например, с атеросклерозом и сердечно-сосудистыми заболеваниями.

В некоторых вариантах реализации метаболическое заболевание представляет собой или включает гипертриглицеридемию. Гипертриглицеридемия описана, например, в источнике Berglund et al., J. Clin. Endocrinol. Metab. (2012) 97(9):2969-89, и определяется как уровень триглицеридов в крови >150 мг/дл (>1,7 ммоль/л).

В некоторых вариантах реализации метаболическое заболевание представляет собой или включает гиперхолестеринемию. Гиперхолестеринемия описана, например, в Bhatnagar et al., BMJ (2008) 337:a993. NHS Великобритании определяет гиперхолестеринемию как уровень общего холестерина в крови >5 ммоль/л или уровень липопротеинов низкой плотности (ЛПНП) в крови >3 ммоль/л. NIH США определяет гиперхолестеринемию как уровень общего холестерина в крови >240 мг/дл.

В некоторых вариантах реализации метаболическое заболевание представляет собой или включает недостаточность поджелудочной железы. Недостаточность поджелудочной железы может быть эндокринной или экзокринной. Эндокринная недостаточность поджелудочной железы может характеризоваться недостаточной продукцией одного или более из инсулина, амилина, глюкагона, соматостатина, грелина и панкреатического полипептида (ПП). Экзокринная недостаточность поджелудочной железы может характеризоваться недостаточной продукцией одного или более из поджелудочного сока, пищеварительных ферментов, трипсиногена, химотрипсиногена, эластазы, карбоксипептидазы, панкреатической липазы, нуклеаз и амилазы и последующей невозможности правильного переваривания пищи. Недостаточность поджелудочной железы, как правило, вызвана утратой клеток поджелудочной железы, которые продуцируют соответствующие факторы, например, островковых клеток в случае эндокринной функции и ацинарных клеток в случае экзокринной функции. Экзокринная недостаточность поджелудочной железы описана, например, в источнике Struyvenberg et al., ВМС Med (2017) 15:29, полностью включенном в настоящий документ посредством ссылки. Наиболее распространенной причиной недостаточности поджелудочной железы является панкреатит, однако она также может быть вызвана муковисцидозом, хирургической операцией, целиакией и диабетом.

В некоторых вариантах реализации метаболическое заболевание представляет собой или включает повреждение поджелудочной железы. В настоящем документе термин повреждение относится к повреждению соответствующего органа и/или ткани или клеток органа. Повреждение клетки/ткани/органа может быть вызвано повреждающим воздействием на клетку/ткань/орган, например, химическим или физическим воздействием/явлением. В некоторых вариантах реализации повреждение может быть следствием химического повреждающего воздействия, например, в случае лекарственного повреждения. В некоторых вариантах реализации повреждение может возникать в результате физического повреждающего воздействия, например, повреждение в результате хирургической операции, которое может возникать, например, во время хирургической операции для лечения заболевания и/или для трансплантации (например, повреждение может иметь ятрогенные причины). В некоторых вариантах реализации повреждение может быть следствием гипоксии, например, следствием ишемии, или может быть результатом реперфузии. В некоторых вариантах реализации повреждение может возникать в результате инфекции, иммунного ответа на инфекцию, рака и/или аутоиммунной реакции. Повреждение может быть обратимым или необратимым. Повреждение клетки/ткани/органа может характеризоваться изменением структуры и/или функции указанных клетки/ткани/органа. Например, повреждение клетки/ткани/органа может характеризоваться снижением уровня коррелята нормальной функции указанных клетки/ткани/органа и/или повышением коррелята нарушенной функции указанных клетки/ткани/органа. Повреждение клетки/ткани/органа может характеризоваться гибелью клеток, например, гибелью клеток поврежденного органа/ткани. Гибель клеток может быть результатом апоптоза (т.е. запрограммированной гибели клеток) или некроза (преждевременной гибели клеток вследствие повреждения).

В некоторых вариантах реализации метаболическое заболевание представляет собой или включает панкреатит. Панкреатит характеризуется воспалением поджелудочной железы. Панкреатит может быть острым или хроническим. Обзор острого панкреатита приведен, например, в источнике Shah et al., J Inflamm Res (2018) 11:77-85, полностью включенном в настоящий документ посредством ссылки. Острый панкреатит чаще всего вызван желчнокаменной болезнью, но также может быть вызван, в числе прочего,

- 8 050147 алкоголем и метаболическими заболеваниями. Обзор хронического панкреатита приведен, например, в источнике Pham et al, Version 1. F1000Res (2018) 7: F1000 Faculty Rev-607, полностью включенном в настоящий документ посредством ссылки. Хронический панкреатит - это синдром, включающий хроническое воспаление, фиброз и утрату ацинарных и островковых клеток, который может проявляться при экзокринной и эндокринной недостаточности.

В некоторых вариантах реализации метаболическое заболевание представляет собой или включает стеатоз. Стеатоз относится к аномальному удерживанию липида в клетке/ткани/органе. Стеатоз может быть макровезикулярным или микровезикулярным.

В некоторых вариантах реализации метаболическое заболевание характеризуется накоплением молекул, содержащих липидные группы (или их производные) в нежировой ткани. В некоторых вариантах реализации метаболическое заболевание представляет собой, включает, характеризуется или ассоциировано с липотоксичностью.

В настоящем документе термин липотоксичность относится к повреждению, дисфункции или/и гибели клеток/ткани в результате накопления молекул, содержащих липидные группы (или их производные) в нежировой ткани. В некоторых вариантах реализации в соответствии с настоящим изобретением липотоксичность представляет собой липотоксичность клеток печени, почки, сердца и/или скелетной мышцы. В некоторых вариантах реализации липотоксичность представляет собой липотоксичность клеток печени (например, гепатоцитов).

Метаболические заболевания, характеризующиеся/ассоциированные с липотоксичностью, включают, например, неалкогольную жировую болезнь печени (НАЖБП) и НАСГ. Накопление липидов в гепатоцитах и его связь с НАЖБП и, в частности, НАСГ описаны в источниках Friedman et al., Nat. Med. (2018) 24(7):908-922 и Farrell et al., Adv. Exp. Med. Biol. (2018) 1061: 19-44 (оба из которых полностью включены в настоящую заявку посредством ссылок).

Считается, что НАЖБП, например, НАСГ, возникает вследствие липотоксичности для гепатоцитов. Считается, что липотоксические факторы включают свободный (неэтерифицированный) холестерин, насыщенные свободные жирные кислоты (например, пальмитиновую кислоту), диацилглицериды, лизофосфатидилхолин, сфинголипиды и церамид. Гепатоциты не способны связывать такие химически реакционноспособные молекулы липидов, что приводит к повреждению митохондрий, стрессу эндоплазматического ретикулума (ER) и аутофагии. Липотоксичность приводит к апоптозу, а также некрозу, некроптозу и пироптозу гепатоцитов, которые активируют врожденную иммунную систему и вызывают экспрессию провоспалительных факторов. Провоспалительные цитокины и хемокины, в свою очередь, рекрутируют воспалительные клетки, например, макрофаги и нейтрофилы.

В настоящих примерах (в частности, в примере 5) авторы изобретения демонстрируют, что аутокринный сигнальный путь, опосредованный ИЛ-11, является важным компонентом липотоксических сигнальных путей (например, в гепатоцитах), и что липототоксичность (и ее дальнейшие последствия) можно ингибировать за счет антагонистического воздействия на сигнальный путь, опосредованный ИЛ-11. Соответственно, в аспектах настоящего изобретения предложено лечение/профилактика липотоксичности или заболеваний, характеризующихся или ассоциированных с липотоксичностью, посредством антагонистического воздействия на сигнальный путь, опосредованный ИЛ-11.

Важно, что авторы изобретения демонстрируют в примере 5.3.5 настоящего документа, что сигнальный путь, опосредованный ИЛ-11, является важным компонентом липотоксичности в гепатоцитах, ассоциированным с NAFL, и приводит к НАСГ за счет вышестоящих стадий, не относящихся к опосредованной ИЛ-11 активации HSC в миофибробластах. Соответственно, в аспектах настоящего изобретения предложено лечение/профилактика НАЖБП (например, НАСГ), включающие ингибирование липотоксичности в гепатоцитах посредством антагонистического воздействия на сигнальный путь, опосредованный ИЛ-11.

В некоторых вариантах реализации метаболическое заболевание представляет собой неалкогольную жировую болезнь печени (НАЖБП). Обзор НАЖБП приведен, например, в источниках Benedict and Zhang, World J Hepatol. (2017) 9(16): 715-732 и Albhaisi et al., Version 1. F1000Res. (2018) 7: F1000 Faculty Rev-720, оба из которых полностью включены в настоящий документ посредством ссылок. НАЖБП характеризуется стеатозом печени, в частности, гепатоцитов. НАЖБП включает неалкогольный жировой гепатоз (NAFL) и неалкогольный стеатогепатит (НАСГ). NAFL характеризуется стеатозом печени, затрагивающим более 5% паренхимы, без признаков повреждения гепатоцитов. NAFL может прогрессировать до НАСГ, который представляет собой стеатоз в сочетании с воспалением и/или фиброзом (стеатогепатитом).

В некоторых вариантах реализации метаболическое заболевание представляет собой или включает липодистрофию. Обзор липодистрофии приведен, например, в источнике Fiorenza et al., Nature Reviews Endocrinology (2011) 7: 137-150, полностью включенном в настоящий документ посредством ссылки. Липодистрофия относится к неспособности продуцировать и/или поддерживать здоровую жировую ткань и включает полную или частичную потерю жировой ткани (липоатрофию), которая может происходить в сочетании с патологическим накоплением жировой ткани (липогипертрофией). Липодистрофия может быть наследственной или приобретенной, хотя синдромы наследственной липодистрофии встре

- 9 050147 чаются редко. В некоторых вариантах реализации метаболическое заболевание представляет собой или включает липоатрофию. В некоторых вариантах реализации метаболическое заболевание представляет собой или включает липогипертрофию.

В некоторых вариантах реализации метаболическое заболевание представляет собой или включает гиперглюкагонемию. Гиперглюкагонемия описана, например, в источнике Wewer Albrechtsen et al., Biomark Med. (2016) (11): 1141-1151, полностью включенном в настоящий документ посредством ссылки.

В некоторых вариантах реализации метаболическое заболевание представляет собой или включает истощение. В настоящем документе термин истощение относится к непроизвольной потере веса, которая может быть прогрессирующей и/или дегенеративной. Истощение можно определить как потерю мышц с потерей жировой массы или без нее и, как правило, включает значительную, обычно непроизвольную, потерю массы тела (включая скелетные мышцы) и может включать или не включать потерю жировой ткани. В некоторых случаях истощение жировой ткани может происходить отдельно, что наблюдается при заболеваниях липодистрофии. Истощение может характеризоваться отрицательным белковым и энергетическим балансом, обусловленным переменной комбинацией снижения потребления пищи и аномального метаболизма (Fearon et al. Lancet Oncol. (2011) 12(5):489-95). Истощение может приводить к прогрессирующим функциональным нарушениям, ухудшению качества жизни, повышению риска заболеваемости и смертности. В некоторых случаях истощение приводит к астении (аномальной физической слабости или недостатку энергии) и/или анемии (недостатку эритроцитов или гемоглобина в крови). В некоторых случаях полная регрессия истощения нереализуема с помощью традиционной алиментарной поддержки или терапевтических вмешательств, которые были испытаны до настоящего времени. Смерть обычно наступает, когда потеря веса достигает 30% от ранее стабильной массы тела пациента (Tisdale, Nature Reviews Cancer, 2, 862-871 (2002)).

Заболевания/состояния, характеризующиеся истощением, включают кахексию (не связанную с возрастом потерю мышечной массы), саркопению (потерю мышечной массы, например, связанную с возрастом, отсутствием нагрузок, космическим путешествием или денервацией), анорексические расстройства (белково-энергетическое недоедание), мышечную дистрофию, липодистрофию (например, аномальное или дегенеративное состояние жировой ткани), липоатрофию (связанную с возрастом потерю подкожного жира в области лица и других тканях) и миопению (истощение мышц при любом хроническом заболевании; предложено в Fearon et al. J Cachexia Sarcopenia Muscle. 2011; 2:1-3). В настоящем документе заболевания/патологические состояния, характеризующиеся истощением, также называют расстройствами, связанными с истощением. В некоторых вариантах реализации расстройство, связанное с истощением, согласно настоящему изобретению представляет собой кахексию, прекахексию, рефрактерную кахексию, саркопению, анорексию, липодистрофию, липоатрофию и/или миопению. В некоторых вариантах реализации в соответствии с различными аспектами, описанными в настоящем документе, расстройство, связанное с истощением, представляет собой кахексию, прекахексию и/или рефрактерную кахексию.

Расстройства, связанные с истощением, обусловленные хроническим заболеванием, могут включать легкое мышечное истощение (со слабостью или без нее), умеренное мышечное истощение (со слабостью или без нее, иногда называемое прекахексией) или тяжелое мышечное истощение (иногда называемое кахексией, при котором часто присутствует слабость).

Кахексия представляет собой сложный воспалительный/метаболический синдром, ассоциированный с основным заболеванием (которое может быть острым или хроническим заболеванием) и характеризующийся истощением. Важным клиническим признаком кахексии является потеря веса у взрослых (с поправкой на задержку жидкости) или недостаточность роста у детей (за исключением эндокринных расстройств). Анорексия, воспаление, инсулинорезистентность, повышенное расщепление мышечного белка и повышенная базальная скорость метаболизма часто ассоциированы с кахексией. Низкий уровень липидов и жировая инфильтрация печени у пациентов с кахексией указывают на роль метаболизма в печени в патогенезе кахексии. Таким образом, терапия, мишенью которой является печень, предотвращающая жировую инфильтрацию печени, повреждение печени или метаболизм в печени, может иметь прямое отношение к кахексии. Кахексия отличается от голодания, возрастной потери мышечной массы, первичной депрессии, мальабсорбции и гипертиреоза и ассоциирована с повышенной заболеваемостью (Evans et al. Clin Nutr. 2008 (6):793-9).

Кахексию можно определить как непроизвольную потерю веса >5% от ранее стабильной массы тела, индекс массы тела (ИМТ) <20 кг/м² (у людей моложе 65 лет) или <22 кг/м² (у людей в возрасте 65 лет или старше) с любой степенью потери веса >2%, или индекс скелетных мышц, соответствующий саркопении, с любой степенью потери веса >2%. Субъект также может демонстрировать <10% жира в организме и/или низкий уровень альбумина в крови, составляющий <35 г/л. Эти критерии также могут помочь выявить популяции, подверженные риску развития расстройства, связанного с истощением (Fearon et al. Lancet Oncol. 2011; 12(5):489-95).

Предложена трехэтапная классификация кахексии с классификацией тяжести по степени истощения запасов энергии и белка в организме (ИМТ) в комбинации со степенью постоянной потери веса.

1. Прекахексия - состояние, когда у пациента имеет место потеря веса <5%, но еще не развились се

- 10 050147 рьезные осложнения.

2. Кахексия - состояние, когда синдром прогрессирует, потеря веса превышает вышеупомянутые параметры, но его все еще можно лечить.

3. Рефрактерная кахексия - момент, когда заболевание больше не реагирует на лечение или польза от лечения перевешивается нагрузкой и риском (Fearon et al, см. выше). Часто стадия рефрактерности обусловлена общей стадией основного заболевания, описанного ниже, и состоянием пациента.

Метаболические заболевания могут присутствовать в условиях острого или хронического заболевания. В аспектах настоящего изобретения предложено лечение/профилактика заболеваний/состояний, ассоциированных с метаболическими заболеваниями. Заболевания/состояния, ассоциированные с метаболическими заболеваниями, включают заболевания/состояния, положительно ассоциированные с возникновением метаболического заболевания. В некоторых вариантах реализации заболевание/состояние, ассоциированное с метаболическим заболеванием, представляет собой заболевание, которое может вызывать/вызывает/вызвало (то есть может приводить, приводит или приводило к) метаболическое заболевание.

Заболевание/состояния, ассоциированные с метаболическими заболеваниями, также включают заболевания/состояния, вызванные и/или усугубляемые (ухудшающиеся, прогрессирующие и/или осложняющиеся за счет) метаболическим заболеванием. В некоторых вариантах реализации заболевание/состояние, ассоциированное с метаболическим заболеванием, может быть положительно ассоциировано с началом метаболического заболевания и может также усугубляться метаболическим заболеванием. Ассоциированное заболевание/состояние может представлять собой заболевание/состояние, включающее патологию, имеющую отношение к метаболическому заболеванию.

В вариантах реализации настоящего изобретения метаболическое заболевание или заболевание/состояние, ассоциированное с метаболическим заболеванием, может присутствовать в любом органе/ткани, например, сердце, печени, почке, головном мозге, коже, мышечной системе, желудке, тонком кишечнике, толстом кишечнике, поджелудочной железе, ротовой полости, слюнных железах, глотке, пищеводе, желчном пузыре, трахее, гортани, мочевом пузыре, яичниках, матке, яичках, железах эндокринной системы, например, гипофизе или щитовидной железе, лимфатической системе, например, селезенке, или влиять на них.

В вариантах реализации настоящего изобретения заболевание/состояние, ассоциированное с метаболическим заболеванием, может представлять собой одно или более из рака, заболевания сердца, заболевания почек, заболевания легких, заболевания печени, хронической инфекции, неврологических дегенеративных заболеваний, острого повреждения, травматического повреждения/травмы, послеоперационных состояний или старения/дряхления.

В некоторых вариантах реализации метаболическое заболевание можно распознать/идентифицировать/диагностировать с использованием одного или более биомаркеров или коррелятов метаболического заболевания.

Агенты, способные ингибировать действие ИЛ-11.

Аспекты настоящего изобретения включают ингибирование сигнального пути, опосредованного ИЛ-11.

В настоящей заявке термин ингибирование относится к уменьшению, снижению или ослаблению относительно контрольного состояния. Например, ингибирование действия ИЛ-11 агентом, способным ингибировать сигнальный путь, опосредованный ИЛ-11, относится к уменьшению, снижению или ослаблению величины/активности сигнального пути, опосредованного ИЛ-11, в отсутствие агента, и/или в присутствии соответствующего контрольного агента.

В настоящем документе ингибирование может также называться нейтрализацией или антагонизмом. Таким образом, агент, способный ингибировать сигнальный путь, опосредованный ИЛ-11 (например, взаимодействие, передачу сигналов или другую активность, опосредованную ИЛ-11 или комплексом, содержащим ИЛ-11), можно назвать нейтрализующим или антагонистическим агентом по отношению к соответствующей функции или процессу. Например, агент, способный ингибировать сигнальный путь, опосредованный ИЛ-11, можно называть агентом, способным нейтрализовать сигнальный путь, опосредованный ИЛ-11, или антагонистом сигнального пути, опосредованного ИЛ-11.

Сигнальный путь ИЛ-11 обеспечивает множество путей ингибирования сигнального пути ИЛ-11. Агент, способный ингибировать сигнальный путь, опосредованный ИЛ-11, может осуществлять это, например, путем ингибирования действия одного или более факторов, участвующих в сигнальном пути через рецептор ИЛ-11, или необходимых для него.

Например, ингибирование сигнального пути ИЛ-11 может достигаться путем нарушения взаимодействия между ИЛ-11 (или комплексом, содержащим ИЛ-11, например, комплексом ИЛ-11 и ИЛ-HRa) и рецептором ИЛ-11 (например, ИЛ-HRa, рецепторным комплексом, содержащим ИЛ-HRa, gp130, или рецепторным комплексом, содержащим ИЛ-HRa и gp130). В некоторых вариантах реализации ингибирование сигнального пути, опосредованного ИЛ-11, достигается путем ингибирования экспрессии гена или белка одного или более из, например, ИЛ-11, ИЛ-11Ra и gp130.

- 11 050147

В вариантах реализации ингибирование сигнального пути, опосредованного ИЛ-11, достигается путем нарушения цис-сигнального пути, опосредованного ИЛ-11, но без нарушения транссигнального пути, опосредованного ИЛ-11, например, ингибирование сигнального пути, опосредованного ИЛ-11, достигается путем ингибирования комплексов цис-сигнального пути, опосредованного gp130, содержащих мембраносвязанный ИЛ-HRa. В вариантах реализации ингибирование сигнального пути, опосредованного ИЛ-11, достигается путем нарушения транс-сигнального пути, опосредованного ИЛ-11, но без нарушения цис-сигнального пути, опосредованного ИЛ-11, т.е. ингибирование сигнального пути, опосредованного ИЛ-11, достигается путем ингибирования комплексов транс-сигнального пути, опосредованного gp130, например, ИЛ-11, связанного с растворимым ИЛ-HR, или ИЛ-6, связанного с растворимым ИЛ-6R. В вариантах реализации ингибирование сигнального пути, опосредованного ИЛ-11, достигается путем нарушения цис-сигнального пути, опосредованного ИЛ-11, и транс-сигнального пути, опосредованного ИЛ-11. Любой агент, описанный в настоящем документе, можно использовать для ингибирования цис- и/или транс-сигнального пути, опосредованного ИЛ-11.

В других примерах ингибирование сигнального пути ИЛ-11 может достигаться путем нарушения сигнальных путей после ИЛ-11/ИЛ-11Ra/gp130. Таким образом, в некоторых вариантах реализации ингибирование/антагонизм сигнального пути, опосредованного ИЛ-11, включает ингибирование сигнального пути/процесса/фактора, имеющего место после этапа сигнального пути, включающего комплекс ИЛ-11/рецептор ИЛ-11.

В некоторых вариантах реализации ингибирование/антагонизм сигнального пути, опосредованного ИЛ-11, включает ингибирование передачи сигналов через внутриклеточный сигнальный путь, активируемый комплексом ИЛ-11/рецептор ИЛ-11. В некоторых вариантах реализации ингибирование/антагонизм сигнального пути, опосредованного ИЛ-11, включает ингибирование одного или более факторов, экспрессия/активность которых повышается вследствие сигнального пути через комплекс ИЛ11/рецептор ИЛ-11.

В некоторых вариантах реализации в способах согласно настоящему изобретению используются агенты, способные ингибировать сигнальный путь JAK/STAT. В некоторых вариантах реализации агенты, способные ингибировать сигнальный путь JAK/STAT, способны ингибировать действие JAK1, JAK2, JAK3, TYK2, STAT1, STAT2, STAT3, STAT4, STAT5A, STAT5B и/или STAT6. Например, агенты могут ингибировать активацию белков JAK/STAT, ингибировать взаимодействие белков JAK или STAT с рецепторами клеточной поверхности, например, ИЛ-HRa или gp130, ингибировать фосфорилирование белков JAK, ингибировать взаимодействие между белками JAK и STAT, ингибировать фосфорилирование белков STAT, ингибировать димеризацию белков STAT, ингибировать транслокацию белков STAT в ядро клетки, ингибировать связывание белков STAT с ДНК и/или способствовать разложению белков JAK и/или STAT. В некоторых вариантах реализации ингибитор JAK/STAT выбран из руксолитиниба (Jakafi/Jakavi; Incyte), тофацитиниба (Xeljanz/Jakvinus; NIH/Pfizer), оклацитиниба (Apoquel), барицитиниба (Olumiant; Incyte/Eli Lilly), филготиниба (G-146034/GLPG-0634; Galapagos NV), гандотиниба (LY2784544; Eli Lilly), лестауртиниба (CEP-701; Teva), момелотиниба (GS-0387/CYT-387; Gilead Sciences), пакритиниба (SB1518; CTI), PF-04965842 (Pfizer), упадацитиниба (АВТ-494; AbbVie), пефицитиниба (ASP015K/JNJ-54781532; Astellas), федратиниба (SAR302503; Celgene), кукурбитацина I (JSI-124) и CHZ868.

В некоторых вариантах реализации в способах согласно настоящему изобретению применяют агенты, способные ингибировать сигнальный путь MAPK/ERK. В некоторых вариантах реализации агенты, способные ингибировать сигнальный путь MAPK/ERK, способны ингибировать действие GRB2, ингибировать действие киназы RAF, ингибировать действие белков МЕК, ингибировать активацию МАРЗК/МАР2К/МАРК и/или Мус и/или ингибировать фосфорилирование белков STAT. В некоторых вариантах реализации агенты, способные ингибировать сигнальный путь ERK, способны ингибировать р42/44 ERK. В некоторых вариантах реализации ингибитор ERK выбран из SCH772984, SC1, VX-11e, DEL-22379, сорафениба (Nexavar; Bayer/Onyx), SB590885, PLX4720, XL281, RAF265 (Novartis), энкорафениба (LGX818/Braftovi; Array BioPharma), дабрафениба (Tafinlar; GSK), вемурафениба (Zelboraf; Roche), кобиметиниба (Cotellic; Roche), CI-1040, PD0325901, биниметиниба (MEK162/MEKTOVI; Array BioPharma), селуметиниба (AZD6244; Array/AstraZeneca) и траметиниба (GSK1120212/Mekinist; Novartis). В некоторых вариантах реализации в способах согласно настоящему изобретению используют агенты, способные ингибировать сигнальный путь/активность N-концевой киназы c-Jun (JNK). В некоторых вариантах реализации гены, способные ингибировать сигнальный путь/активность JNK, способны ингибировать действие и/или фосфорилирование JNK (например, JNK1, JNK2). В некоторых вариантах реализации ингибитор JNK выбран из SP600125, СЕР 1347, TCS JNK 6о, пептида c-JUN, SU3327, AEG 3482, TCS JNK 5a, BI78D3, IQ3, SR3576, IQ1S, JIP-1 (153-163) и дигидрохлорида СС401.

В примерах настоящей заявки авторы настоящего изобретения демонстрируют, что экспрессия и активность NOX4 повышается посредством сигнального пути через ИЛ-11/ИЛ-1Rα/gp130. NOX4 является НАДФН-оксидазой и источником активных форм кислорода (АФК). Экспрессия Nox4 повышена у трансгенных мышей с гепатоцит-специфической экспрессией ИЛ-11, и первичные гепатоциты человека,

- 12 050147 стимулированные ИЛ-11, повышают экспрессию NOX4.

В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения используют агенты, способные ингибировать экспрессию (экспрессию гена или белка) или функцию NOX4. B некоторых вариантах реализации настоящего изобретения используют агенты, способные ингибировать активацию экспрессии/функции NOX4, опосредованную ИЛ-11. Агенты, способные ингибировать экспрессию или функцию NOX4, в настоящей заявке можно называть ингибиторами NOX4. Например, ингибитор NOX4 может снижать экспрессию (например, экспрессию гена и/или белка) NOX4, снижать уровень РНК, кодирующей NOX4, снижать уровень белка NOX4 и/или снижать уровень активности NOX4 (например, снижать опосредованную NOX4 активность НАДФН-оксидазы и/или опосредованную NOX4 продукцию АФК).

Ингибиторы NOX4 включают NOX4-связывающие молекулы и молекулы, способные снижать экспрессию NOX4. NOX4-связывающие ингибиторы включают пептидные/нуклеотидные аптамеры, антитела (и фрагменты антител) и фрагменты партнеров по взаимодействию NOX4, которые ведут себя как антагонисты функции NOX4, а также низкомолекулярные ингибиторы NOX4. Молекулы, способные снижать экспрессию NOX4, включают антисмысловую РНК (например, миРНК, кшРНК) против NOX4. В некоторых вариантах реализации ингибитор NOX4 выбран из ингибитора NOX4, описанного в источнике Altenhofer et al., Antioxid Redox Signal. (2015) 23(5): 406-427 или Augsburder et al., Redox Biol. (2019)26: 101272, например, GKT137831.

Связывающие агенты.

В некоторых вариантах реализации агенты, способные ингибировать сигнальный путь, опосредованный ИЛ-11, могут связываться с ИЛ-11. В некоторых вариантах реализации агенты, способные ингибировать сигнальный путь, опосредованный ИЛ-11, могут связываться с рецептором ИЛ-11 (например, ИЛ-URa, gp130 или комплексом, содержащим ИЛ-URa и/или gp130). Связывание таких агентов может ингибировать сигнальный путь, опосредованный ИЛ-11, за счет снижения/предотвращения способности ИЛ-11 связываться с рецепторами ИЛ-11, тем самым ингибируя дальнейшие этапы сигнального пути. Связывание таких агентов может ингибировать цис- и/или транс-сигнальный путь, опосредованный ИЛ11, за счет снижения/предотвращения способности ИЛ-11 связываться с рецепторами ИЛ-11, например, ИЛ-URa и/или gp130, тем самым ингибируя дальнейшие этапы сигнального пути. Агенты могут связываться с комплексами транс-сигнального пути, например, ИЛ-11 и растворимого ИЛ-URa, и ингибировать сигнальный путь, опосредованный gp130.

Агенты, способные связываться с ИЛ-11/комплексом, содержащим ИЛ-11, или рецептором ИЛ-11, могут относиться к любому типу, но в некоторых вариантах реализации агент может представлять собой антитело, его антигенсвязывающий фрагмент, полипептид, пептид, нуклеиновую кислоту, олигонуклеотид, аптамер или низкомолекулярное соединение. Агенты могут быть предоставлены в выделенной или очищенной форме или могут быть включены в состав фармацевтической композиции или лекарственного средства.

Антитела и антигенсвязывающие фрагменты.

В некоторых вариантах реализации агент, способный связываться с ИЛ-11/комплексом, содержащим ИЛ-11, или рецептором ИЛ-11, представляет собой антитело или его антигенсвязывающий фрагмент. В некоторых вариантах реализации агент, способный связываться с ИЛ-11/комплексом, содержащим ИЛ-11, или рецептором ИЛ-11, представляет собой полипептид, например, молекулу рецептораловушки. В некоторых вариантах реализации агент, способный связываться с ИЛ-11/комплексом, содержащим ИЛ-11, или рецептором ИЛ-11, может представлять собой аптамер.

В некоторых вариантах реализации агент, способный связываться с ИЛ-11/комплексом, содержащим ИЛ-11, или рецептором ИЛ-11, представляет собой антитело или его антигенсвязывающий фрагмент. Антитело в контексте настоящего изобретения употребляется в самом широком смысле и охватывает моноклональные антитела, поликлональные антитела, моноспецифичные и полиспецифичные антитела (например, биспецифичные антитела) и фрагменты антител, при условии, что они демонстрируют связывание с соответствующей молекулой-мишенью.

Принимая во внимание современные методы, относящиеся к технологии моноклональных антител, могут быть получены антитела к большинству антигенов. Антигенсвязывающая часть может представлять собой часть антитела (например, Fab-фрагмент) или синтетический фрагмент антитела (например, одноцепочечный Fv-фрагмент [ScFv]). Моноклональные антитела к выбранным антигенам могут быть получены известными способами, например, способами, описанными в источниках Monoclonal Antibodies: A manual of techniques , H Zola (CRC Press, 1988) и Monoclonal Hybridoma Antibodies: Techniques and Applications , J G R Hurrell (CRC Press, 1982). Химерные антитела обсуждаются Neuberger et al (1988, 8-й Международный биотехнологический симпозиум, часть 2, 792-799). Моноклональные антитела (mAb) особенно подходят для применения в способах согласно настоящему изобретению и представляют собой однородную популяцию антител, специфично нацеленных на один эпитоп на антигене.

Поликлональные антитела также подходят для применения в способах согласно настоящему изобретению. Предпочтительными являются моноспецифичные поликлональные антитела. Подходящие

- 13 050147 поликлональные антитела могут быть получены с использованием способов, хорошо известных в данной области техники.

Антигенсвязывающие фрагменты антител, такие как Fab- и Fab2-фрагменты, могут быть использованы/предоставлены точно так же, как и генетически сконструированные антитела и фрагменты антител. Вариабельные тяжелые (VH) и вариабельные легкие (VL) домены антитела участвуют в распознавании антигена. Этот факт был впервые установлен в ранних экспериментах по расщеплению протеазами. Дальнейшее подтверждение было получено в результате гуманизации антител грызунов. Вариабельные домены, происходящие от грызунов, могут быть слиты с константными доменами человеческого происхождения, так что полученное в результате антитело сохраняет антигенную специфичность родительского антитела грызунов (Morrison et al (1984) Proc. Natl. Acad. Sd. USA 81, 6851-6855).

Антитела и антигенсвязывающие фрагменты согласно настоящему изобретению содержат области, определяющие комплементарность (CDR), антитела, способного связываться с соответствующей молекулой-мишенью (т.е. ИЛ-11/комплексом, содержащим ИЛ-11/рецептором ИЛ-11).

Антитела, способные связываться с ИЛ-11, включают, например, моноклональное антитело мыши против ИЛ-11 человека, клон №22626; номер в каталоге МАВ218 (R&D Systems, MN, USA), использованное, например, в источнике Bockhorn et al. Nat. Commun. (2013) 4(0):1393, клон 6D9A (Abbiotec), клон KT8 (Abbiotec), клон M3103F11 (BioLegend), клон 1F1 (Abnova Corporation), клон 3C6 (Abnova Corporation), клон GF1 (LifeSpan Biosciences), клон 13455 (Source BioScience), 11h3/19.6.1 (Hermann et al., Arthritis Rheum. (1998) 41 (8):1388-97), AB-218-NA (R&D Systems), X203 (Ng et al., Sci Transl Med. (2019) 11(511) pii: eaaw1237) и антитела против ИЛ-11, описанные в заявках US 2009/0202533 А1, WO 99/59608 А2, WO 2018/109174 А2 и WO 2019/238882 А1.

В частности, показано, что клон 22626 антитела против ИЛ-11 (также известный как МАВ218) является антагонистом сигнального пути, опосредованного ИЛ-11, например, в Schaefer et al., Nature (2017) 552(7683):110-115. В источнике Hermann et al., Arthritis Rheum. (1998) 41(8): 1388-97 описано моноклональное антитело 11h3/19.6.1, являющееся нейтрализующим lgG1 против ИЛ-11. AB-218-NA от R&D Systems, использованное, например, в работе McCoy et al., ВМС Cancer (2013) 13:16, является еще одним примером нейтрализующего антитела против ИЛ-11. В WO 2018/109174 А2 и WO 2019/238882 А1 описаны другие примеры антител к ИЛ-11, являющихся антагонистами сигнального пути, опосредованного ИЛ-11. Х203 (также называемое Enx203), описанное в Ng, et al., IL-11 is a therapeutic target in idiopathic pulmonary fibrosis. bioRxiv 336537; doi: https://doi.org/10.1101/336537 и WO 2019/238882 A1, представляет собой антитело против ИЛ-11, являющееся антагонистом сигнального пути, опосредованного ИЛ-11, и содержит область VH, соответствующую SEQ ID NO:92 из WO 2019/238882 А1 (SEQ ID NO:22 в настоящем изобретении), и область VL, соответствующую SEQ ID NO:94 из WO 2019/238882 А1 (SEQ ID NO:23 в настоящем изобретении). В WO 2019/238882 А1 описаны гуманизированные варианты Х203, включая hEnx203, которое содержит область VH, соответствующую SEQ ID NO:117 из WO 2019/238882 А1 (SEQ ID NO:30 в настоящем изобретении), и область VL, соответствующую SEQ ID NO:122 из WO 2019/238882 А1 (SEQ ID NO:31 в настоящем изобретении). Епх108А представляет собой еще один пример антитела против ИЛ-11, являющегося антагонистом сигнального пути, опосредованного ИЛ-11, и содержит область VH, соответствующую SEQ ID NO:8 из WO 2019/238882 А1 (SEQ ID NO:26 в настоящем изобретении), и область VL, соответствующую SEQ ID NO:20 из WO 2019/238882 А1 (SEQ ID NO:27 в настоящем изобретении).

Антитела, способные связываться с ИЛ-HRa, включают, например, моноклональное антитело, клон 025 (Sino Biological), клон EPR5446 (Abcam), клон 473143 (R&D Systems), клоны 8Е2, 8D10 и 8Е4 и варианты 8Е2 с созревшим сродством, описанные в US 2014/0219919 А1, моноклональные антитела, описанные в Blanc et al (J. Immunol Methods. 2000 Jul 31;241(1-2);43-59), X209 (Widjaja et al., Gastroenterology (2019) 157(3):777-792, также опубликованное в Widjaja, et al., IL-11 neutralising therapies target hepatic stellate cell-induced liver inflammation and fibrosis in NASH. bioRxiv 470062; doi: https://doi.org/10.1101/470062), антитела, описанные в WO 2014121325 A1 и US 2013/0302277 A1, и антитела против ИЛ-HRa, описанные в US 2009/0202533 А1, WO 99/59608 А2, WO 2018/109170 А2 и WO 2019/238884 А1.

В частности, показано, что клон 473143 антитела против ИЛ-HRa (также известный как МАВ1977) является антагонистом сигнального пути, опосредованного ИЛ-11, например, в Schaefer et al., Nature (2017) 552(7683):110-115. В US 2014/0219919 A1 приведены последовательности клонов антител против ИЛ-HRa человека 8Е2, 8D10 и 8Е4, и описана их способность являться антагонистами сигнального пути, опосредованного ИЛ-11 - см., например, [0489]-[0490] в US 2014/0219919 А1. Кроме того, в US 2014/0219919 А1 приведена информация о последовательности дополнительных 62 вариантов клона 8Е2 с созревшим сродством, для 61 из которых показан антагонизм по отношению к сигнальному пути, опосредованному ИЛ-11 - см. таблицу 3 в US 2014/0219919 А1. В WO 2018/109170 А2 и WO 2019/238884 А1 описаны другие типичные антитела против ИЛ-HRa, являющиеся антагонистами сигнального пути, опосредованного ИЛ-11. Х209 (также называемое Епх209), описанное в Widjaja, et al., IL-11 neutralising therapies target hepatic stellate cell-induced liver inflammation and fibrosis in NASH. bioRxiv 470062; doi:

- 14 050147 https://doi.org/10.1101/470062 и WO 2019/238884 A1, представляет собой антитело против ИЛ-HRa, являющееся антагонистом сигнального пути, опосредованного ИЛ-11, и содержит область VH, соответствующую SEQ ID NO:7 из WO 2019/238884 А1 (SEQ ID NO:24 в настоящем изобретении), и область VL, соответствующую SEQ ID NO:14 из WO 2019/238884 А1 (SEQ ID NO:25 в настоящем изобретении). Гуманизированные варианты Х209 описаны в WO 2019/238884 А1, включая hEnx209, которое содержит область VH, соответствующую SEQ ID NO:11 из WO 2019/238884 А1 (SEQ ID NO:32 в настоящем изобретении), и область VL, соответствующую SEQ ID NO:17 из WO 2019/238884 А1 (SEQ ID NO:33 в настоящем изобретении).

Специалисту хорошо известны методики получения антител, подходящих для терапевтического применения у данного вида/субъекта. Например, процедуры получения антител, подходящих для терапевтического применения у людей, описаны в источнике Park and Smolen Advances in Protein Chemistry (2001) 56: 369-421 (полностью включенном в настоящий документ посредством ссылки).

Антитела к данному белку-мишени (например, ИЛ-11 или ИЛ-HRa) можно получить у модельных видов (например, грызунов, зайцеобразных) и впоследствии модифицировать с целью улучшения их пригодности для терапевтического применения у данного вида/субъекта. Например, одну или более аминокислот моноклональных антител, полученных путем иммунизации модельных видов, можно заменить с целью получения последовательности антитела, более сходной с эмбриональными последовательностями иммуноглобулина человека (тем самым снижая возможность иммунных реакций против ксеногенного антитела у субъекта-человека, получающего лечение таким антителом). Модификации в вариабельных доменах антитела могут быть сконцентрированы в каркасных областях, чтобы сохранить паратоп антитела. Гуманизация антител является повседневной практикой в области технологии антител и рассмотрена, например, в Almagro and Fransson, Frontiers in Bioscience (2008) 13:1619-1633, Safdari et al., Biotechnology and Genetic Engineering Reviews (2013) 29(2): 175-186 и Lo et al., Microbiology Spectrum (2014) 2(1), все из которых полностью включены в настоящий документ посредством ссылки. Необходимость в гуманизации можно преодолеть путем получения антител к данному белку-мишени (например, ИЛ-11 или ИЛ-HRa) у трансгенных модельных видов, экспрессирующих гены иммуноглобулинов человека, так что антитела, полученные у таких животных, являются полностью человеческими (как описано, например, в Bruggemann et al., Arch Immunol Ther Exp (Warsz) (2015) 63(2):101-108, полностью включенном в настоящий документ посредством ссылки).

Для выявления антител к данному белку-мишени (например, ИЛ-11 или ИЛ-HRa) также можно использовать методики фагового дисплея, хорошо известные специалисту. Использование фагового дисплея для выявления полностью человеческих антител к белкам-мишеням человека рассмотрено, например, в Hoogenboom, Nat. Biotechnol. (2005) 23, 1105-1116 и Chan et al., International Immunology (2014) 26(12): 649-657, полностью включенных в настоящий документ посредством ссылок.

Антитела/фрагменты могут представлять собой антагонистические антитела/фрагменты, ингибирующие или снижающие биологическую активность ИЛ-11. Антитела/фрагменты могут представлять собой нейтрализующие антитела, нейтрализующие биологическое действие ИЛ-11, например, его способность стимулировать продуктивный сигнальный путь через рецептор ИЛ-11. Нейтрализующую активность можно измерять по способности нейтрализовать индуцированную ИЛ-11 пролиферацию линии клеток плазмоцитомы мыши Т11 (Nordan, R. P. et al. (1987) J. Immunol. 139:813).

ИЛ-11- или ИЛ-11Rα-связывающие антитела можно оценивать на предмет способности являться антагонистами сигнального пути, опосредованного ИЛ-11, например, с использованием анализа, описанного в US 2014/0219919 А1 или Blanc et al (J. Immunol Methods. 2000 Jul 31;241(1-2);43-59). Вкратце, ИЛ11- и ИЛ-11Rα-связывающие антитела можно оценивать in vitro на предмет способности ингибировать пролиферацию клеток Ba/F3, экспрессирующих ИЛ-HRa и gp130 соответствующих видов животных, в ответ на стимуляцию ИЛ-11 соответствующих видов животных. В качестве альтернативы, ИЛ-11- и ИЛHRa-связывающие антитела можно анализированы in vitro на предмет способности ингибировать переход фибробласта в миофибробласт после стимуляции фибробластов TGFe1, путем оценки экспрессии aSMA (как описано, например, в WO 2018/109174 А2 (пример 6) и WO 2018/109170 А2 (пример 6), Ng et al., Sci Transl Med. (2019) 11(511) pii: eaaw1237 и Widjaja et al., Gastroenterology (2019) 157(3):777-792).

Антитела обычно содержат шесть CDR; три в вариабельной области легкой цепи (VL): LC-CDR1, LC-CDR2, LC-CDR3, и три в вариабельной области тяжелой цепи (VH): HC-CDR1, HC-CDR2 и НСCDR3. Шесть CDR вместе определяют паратоп антитела - часть антитела, которая связывается с молекулой-мишенью. Область VH и область VL содержат каркасные области (FR) с обеих сторон каждой CDR, которые обеспечивают каркас для CDR. От N-конца к С-концу области VH содержат следующую структуру: N-конец-[HC-FR1]-[HC-CDR1]-[HC-FR2]-[HC-CDR2]-[HC-FR3]-[HC-CDR3]-[HC-FR4]-C-конец; а области VL содержат следующую структуру: N-конец(-[LC-FR1]-[LC-CDR1]-[LC-FR2]-[LC-CDR2]-[LCFR3 ]-[LC-CDR3 ]-[LC-FR4]-C-конец.

Существует несколько различных правил определения CDR и FR антител, например, правила, описанные в Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed.Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991), Chothia et al., J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987), и VBASE2, как

- 15 050147 описано в Retter et al., Nucl. Acids Res. (2005) 33 (suppl 1): D671-D674. CDR и FR VH-областей и VLобластей антител, описанных в настоящем документе, определены в соответствии с системой Kabat.

В некоторых вариантах реализации антитело или его антигенсвязывающий фрагмент согласно настоящему изобретению происходят от антитела, специфично связывающегося с ИЛ-11 (например, Епх108А, Enx203 или hEnx203). В некоторых вариантах реализации антитело или его антигенсвязывающий фрагмент согласно настоящему изобретению происходят от антитела, специфично связывающегося с ИЛ-HRa (например, Enx209 или hEnx209).

Антитела и антигенсвязывающие фрагменты согласно настоящему изобретению предпочтительно ингибируют сигнальный путь, опосредованный ИЛ-11. Такие антитела/антигенсвязывающие фрагменты можно описать как антагонисты сигнального пути, опосредованного ИЛ-11, и/или как обладающие способностью нейтрализовать сигнальный путь, опосредованный ИЛ-11.

В некоторых вариантах реализации антитело/антигенсвязывающий фрагмент содержит CDR антитела, связывающегося с ИЛ-11. В некоторых вариантах реализации антитело/антигенсвязывающий фрагмент содержит CDR ИЛ-11-связывающего антитела, описанного в настоящей заявке (например, Enx108A, Enx203 или hEnx203), или CDR, происходящие от его CDR.

В некоторых вариантах реализации антитело/антигенсвязывающий фрагмент содержит область VH, содержащую следующие CDR:

(1):

HC-CDR1 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:34;

HC-CDR2 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:35;

HC-CDR3 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:36;

или ее вариант, в котором одна, или две, или три аминокислоты в одной или более из НС-CDRI, HC-CDR2 или HC-CDR3 заменены другой аминокислотой.

В некоторых вариантах реализации антитело/антигенсвязывающий фрагмент содержит область VL, содержащую следующие CDR:

(2):

LC-CDR1 с аминокислотной последовательностью SEQ ID N0:37;

LC-CDR2 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:38;

LC-CDR3 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:39;

или ее вариант, в котором одна, или две, или три аминокислоты в одной или более из LC-CDR1, LCCDR2 или LC-CDR3 заменены другой аминокислотой.

В некоторых вариантах реализации антитело/антигенсвязывающий фрагмент содержит область VH, содержащую следующие CDR:

(3):

HC-CDR1 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:40;

HC-CDR2 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:41;

HC-CDR3 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:42;

или ее вариант, в котором одна, или две, или три аминокислоты в одной или более из НС-CDR^ HC-CDR2 или HC-CDR3 заменены другой аминокислотой.

В некоторых вариантах реализации антитело/антигенсвязывающий фрагмент содержит область VL, содержащую следующие CDR:

(4):

LC-CDR1 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:43;

LC-CDR2 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:44;

LC-CDR3 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:45;

или ее вариант, в котором одна, или две, или три аминокислоты в одной или более из LC-CDR1, LCCDR2 или LC-CDR3 заменены другой аминокислотой.

В некоторых вариантах реализации антитело/антигенсвязывающий фрагмент содержит область VH, содержащую CDR согласно (1), и область VL, содержащую CDR согласно (2). В некоторых вариантах реализации антитело/антигенсвязывающий фрагмент содержит область VH, содержащую CDR согласно (3), и область VL, содержащую CDR согласно (4).

В некоторых вариантах реализации антитело/антигенсвязывающий фрагмент содержит область VH и область VL антитела, связывающегося с ИЛ-11. В некоторых вариантах реализации антитело/антигенсвязывающий фрагмент содержит область VH и область VL ИЛ-11-связывающего антитела, описанного в настоящей заявке (например, Enx108A, Enx203 или hEnx203), или область VH и область VL, происходящие от его области VH и области VL.

В некоторых вариантах реализации антитело/антигенсвязывающий фрагмент содержит область VH, содержащую аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 70% идентичностью последовательности, более предпочтительно по меньшей мере 75, 80, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% или 100% идентичностью аминокислотной последовательности SEQ ID NO:26. В некоторых вариантах реализации антитело/антигенсвязывающий фрагмент содержит область VL, содержащую аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 70% идентичностью по

- 16 050147 следовательности, более предпочтительно по меньшей мере 75, 80, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% или 100% идентичностью аминокислотной последовательности SEQ ID NO:27. В некоторых вариантах реализации антитело/антигенсвязывающий фрагмент содержит область VH, содержащую аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 70% идентичностью последовательности, более предпочтительно по меньшей мере 75, 80, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% или 100% идентичностью аминокислотной последовательности SEQ ID NO:26, и область VL, содержащую аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 70% идентичностью последовательности, более предпочтительно по меньшей мере 75, 80, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% или 100% идентичностью аминокислотной последовательности SEQ ID NO:27.

В некоторых вариантах реализации антитело/антигенсвязывающий фрагмент содержит область VH, содержащую аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 70% идентичностью последовательности, более предпочтительно по меньшей мере 75, 80, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% или 100% идентичностью аминокислотной последовательности SEQ ID NO:22. В некоторых вариантах реализации антитело/антигенсвязывающий фрагмент содержит область VL, содержащую аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 70% идентичностью последовательности, более предпочтительно по меньшей мере 75, 80, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% или 100% идентичностью аминокислотной последовательности SEQ ID NO:23. В некоторых вариантах реализации антитело/антигенсвязывающий фрагмент содержит область VH, содержащую аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 70% идентичностью последовательности, более предпочтительно по меньшей мере 75, 80, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% или 100% идентичностью аминокислотной последовательности SEQ ID NO:22, и область VL, содержащую аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 70% идентичностью последовательности, более предпочтительно по меньшей мере 75, 80, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% или 100% идентичностью аминокислотной последовательности SEQ ID NO:23.

В некоторых вариантах реализации антитело/антигенсвязывающий фрагмент содержит область VH, содержащую аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 70% идентичностью последовательности, более предпочтительно по меньшей мере 75, 80, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% или 100% идентичностью аминокислотной последовательности SEQ ID NO:30. В некоторых вариантах реализации антитело/антигенсвязывающий фрагмент содержит область VL, содержащую аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 70% идентичностью последовательности, более предпочтительно по меньшей мере 75, 80, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% или 100% идентичностью аминокислотной последовательности SEQ ID NO:31. В некоторых вариантах реализации антитело/антигенсвязывающий фрагмент содержит область VH, содержащую аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 70% идентичностью последовательности, более предпочтительно по меньшей мере 75, 80, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% или 100% идентичностью аминокислотной последовательности SEQ ID NO:30, и область VL, содержащую аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 70% идентичностью последовательности, более предпочтительно по меньшей мере 75, 80, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% или 100% идентичностью аминокислотной последовательности SEQ ID NO:31.

В некоторых вариантах реализации антитело/антигенсвязывающий фрагмент содержит CDR антитела, связывающегося с ИЛ-HRa. В некоторых вариантах реализации антитело/антигенсвязывающий фрагмент содержит CDR ИЛ-HRa-связывающего антитела, описанного в настоящей заявке (например, Enx209 или hEnx209), или CDR, происходящие от его CDR.

В некоторых вариантах реализации антитело/антигенсвязывающий фрагмент содержит область VH, содержащую следующие CDR:

(5):

HC-CDR1 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:46;

HC-CDR2 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:47;

HC-CDR3 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:48;

или ее вариант, в котором одна, или две, или три аминокислоты в одной или более из НС-CDRI, HC-CDR2 или HC-CDR3 заменены другой аминокислотой.

В некоторых вариантах реализации антитело/антигенсвязывающий фрагмент содержит область VL, содержащую следующие CDR:

(6):

LC-CDR1 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:49;

LC-CDR2 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:50;

LC-CDR3 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:51;

или ее вариант, в котором одна, или две, или три аминокислоты в одной или более из LC-CDR1, LCCDR2 или LC-CDR3 заменены другой аминокислотой.

В некоторых вариантах реализации антитело/антигенсвязывающий фрагмент содержит область VH, содержащую CDR согласно (5), и область VL, содержащую CDR согласно (6).

- 17 050147

В некоторых вариантах реализации антитело/антигенсвязывающий фрагмент содержит область VH и область VL антитела, связывающегося с ИЛ-HRa. В некоторых вариантах реализации антитело/антигенсвязывающий фрагмент содержит область VH и область VL ИЛ-11Rα-связывающего антитела, описанного в настоящей заявке (например, Enx209 или hEnx209), или область VH и область VL, происходящие от его области VH и области VL.

В вариантах реализации согласно настоящему изобретению, в которых одна или более аминокислот эталонной аминокислотной последовательности (например, последовательности CDR, последовательности области VH или последовательности области VL, описанной в настоящем документе) заменены другой аминокислотой, замены могут быть консервативными заменами, например, в соответствии со следующей таблицей. В некоторых вариантах реализации замещены аминокислоты в одном и том же блоке в среднем столбце. В некоторых вариантах реализации замещены аминокислоты в одной и той же строке в крайнем правом столбце. _____________________________________

АЛИФАТИЧЕСКИЕ	Неполярные	GAP 1 LV
Полярные - незаряженные	CSTM NQ
Полярные - заряженные	D Е KR
АРОМАТИЧЕСКИЕ		Н FWY

В некоторых вариантах реализации замена(ны) может быть функционально консервативной. То есть в некоторых вариантах реализации замена может не влиять (или может по существу не влиять) на одно или более функциональных свойств (например, связывание мишени) антитела/фрагмента, содержащего замену, по сравнению с эквивалентной незамещенной молекулой.

В некоторых вариантах реализации замена(ны) относительно эталонной последовательности области VH или области VL может быть сосредоточена в определенной области или областях последовательности области VH или области VL. Например, изменения по отношению к эталонной последовательности области VH или области VL могут быть сосредоточены в одной или более каркасных областях (FR1, FR2, FR3 и/или FR4).

Антитела и антигенсвязывающие фрагменты согласно настоящему изобретению можно конструировать и получать с использованием последовательностей моноклональных антител (mAb), способных связываться с соответствующей молекулой-мишенью. Кроме того, можно применять/представлять антигенсвязывающие области антител, например, одноцепочечный вариабельный фрагмент (scFv), Fab- и Fab2-фрагменты. Антигенсвязывающая область или антигенсвязывающий фрагмент представляет собой любой фрагмент антитела, способный связываться с мишенью, к которой специфично данное антитело.

В некоторых вариантах реализации антитела/фрагменты содержат области VL и VH антитела, способного связываться с ИЛ-11, комплексом, содержащим ИЛ-11, или рецептором ИЛ-11. Область VL и VH антигенсвязывающей области антитела вместе составляют область Fv. В некоторых вариантах реализации антитела/фрагменты содержат или состоят из области Fv антитела, способного связываться с ИЛ11, комплексом, содержащим ИЛ-11, или рецептором ИЛ-11. Область Fv может быть экспрессирована в виде одной цепи, где области VH и VL ковалентно связаны, например, с помощью гибкого олигопептида. Соответственно, антитела/фрагменты могут содержать или состоять из scFv, содержащего области VL и VH антитела, способного связываться с ИЛ-11, комплексом, содержащим ИЛ-11, или рецептором ИЛ-11.

Область VL и константный домен легкой цепи (CL), и область VH и константный домен 1 тяжелой цепи (СН1) антигенсвязывающей области антитела вместе составляют область Fab. В некоторых вариантах реализации антитела/фрагменты содержат или состоят из области Fab антитела, способного связываться с ИЛ-11, комплексом, содержащим ИЛ-11, или рецептором ИЛ-11.

В некоторых вариантах реализации антитела/фрагменты содержат или состоят из целого антитела, способного связываться с ИЛ-11, комплексом, содержащим ИЛ-11, или рецептором ИЛ-11. Целое антитело относится к антителу со структурой, по существу аналогичной структуре иммуноглобулина (Ig). Различные виды иммуноглобулинов и их структуры описаны, например, в источнике Schroeder and Cavacini J Allergy Clin Immunol. (2010) 125(202): S41-S52, полностью включенном в настоящий документ посредством ссылки. Иммуноглобулины типа G (т.е. IgG) представляют собой гликопротеины размером ~150 кДа, содержащие две тяжелые цепи и две легкие цепи. От N- к С-концу тяжелые цепи содержат VH, за которой следует константная область тяжелой цепи, содержащая три константных домена (СН1, СН2 и СН3), и аналогичным образом легкая цепь содержит VL, за которой следует CL. В зависимости от тяжелой цепи иммуноглобулины можно классифицировать как IgG (например, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4), IgA (например, IgA1, IgA2), IgD, IgE или IgM. Легкая цепь может представлять собой каппа (k) или лямбда (λ)-цепь.

В некоторых вариантах реализации антитело/антигенсвязывающий фрагмент согласно настоящему изобретению содержит константную последовательность тяжелой цепи иммуноглобулина. В некоторых вариантах реализации константная последовательность тяжелой цепи иммуноглобулина может представлять собой константную последовательность тяжелой цепи иммуноглобулина человека. В некоторых

- 18 050147 вариантах реализации константная последовательность тяжелой цепи иммуноглобулина представляет собой или происходит от константной последовательности тяжелой цепи IgG (например, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4), IgA (например, IgA1, IgA2), IgD, IgE или IgM, например, IgG человека (например, hIgG1, hIgG2, hIgG3, hIgG4), hIgA (например, hIgA1, hIgA2), hIgD, hIgE или hIgM. В некоторых случаях константная последовательность тяжелой цепи иммуноглобулина представляет собой или происходит от константной последовательности тяжелой цепи аллотипа IgG1 человека (например, G1m1, G1m2, G1m3 или G1m17).

В некоторых вариантах реализации константная последовательность тяжелой цепи иммуноглобулина представляет собой или происходит от последовательности константной области константного домена 1 иммуноглобулина G человека (IGHG1; UniProt: P01857-1, v1). В некоторых вариантах реализации константная последовательность тяжелой цепи иммуноглобулина представляет собой или происходит от последовательности константной области иммуноглобулина G 1 человека (IGHG1; UniProt: P01857-1, v1), содержащей замены K214R, D356E и L358M (т.е. аллотипа G1m3). В некоторых вариантах реализации антитело/антигенсвязывающий фрагмент содержит аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 70% идентичностью последовательности, более предпочтительно по меньшей мере 75, 80, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% или 100% идентичностью аминокислотной последовательности SEQ ID NO:52.

В некоторых вариантах реализации константная последовательность тяжелой цепи иммуноглобулина представляет собой или происходит от последовательности константной области иммуноглобулина G 4 человека (IGHG4; UniProt: P01861, v1). В некоторых вариантах реализации константная последовательность тяжелой цепи иммуноглобулина представляет собой или происходит от последовательности константной области иммуноглобулина G 4 человека (IGHG4; UniProt: P01861, v1), содержащей замены S241P и/или L248E. Мутация S241P стабилизирует шарнир, в то время как мутация L248E дополнительно снижает и без того низкую АЗКЦ-эффекторную функцию IgG4 (Davies and Sutton, Immunol Rev.2015 Nov; 268(1):139-159; Angal et al Mol Immunol. 1993 Jan;30(1):105-8). В некоторых вариантах реализации антитело/антигенсвязывающий фрагмент содержит аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 70% идентичностью последовательности, более предпочтительно по меньшей мере 75, 80, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% или 100% идентичностью аминокислотной последовательности SEQ ID NO:53.

В некоторых вариантах реализации антитело/антигенсвязывающий фрагмент согласно настоящему изобретению содержит константную последовательность легкой цепи иммуноглобулина. В некоторых вариантах реализации константная последовательность легкой цепи иммуноглобулина может представлять собой константную последовательность легкой цепи иммуноглобулина человека. В некоторых вариантах реализации константная последовательность легкой цепи иммуноглобулина представляет собой или происходит от легкой цепи каппа (к) или лямбда (λ), например, константной области каппа-цепи иммуноглобулина человека (IGKC; Ск; UniProt: P01834-1, v2) или константной области лямбда-цепи иммуноглобулина человека (IGLC; Сλ), например, IGLC1 (UniProt: P0CG04-1, v1), IGLC2 (UniProt: P0DOY2-1, v1), IGLC3 (UniProt: P0DOY3-1, v1), IGLC6 (UniProt: P0CF74-1, v1) или IGLC7 (UniProt: A0M8Q6-1, v3).

В некоторых вариантах реализации антитело/антигенсвязывающий фрагмент содержит константную последовательность легкой цепи иммуноглобулина. В некоторых вариантах реализации константная последовательность легкой цепи иммуноглобулина представляет собой или происходит от константной области каппа-цепи иммуноглобулина человека (IGKC; Ск; UniProt: Р01834-1, v2; SEQ ID NO:90). В некоторых вариантах реализации константная последовательность легкой цепи иммуноглобулина представляет собой константную область лямбда-цепи иммуноглобулина человека (IGLC; Сλ), например, IGLC1, IGLC2, IGLC3, IGLC6 или IGLC7. В некоторых вариантах реализации антитело/антигенсвязывающий фрагмент содержит аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 70% идентичностью последовательности, более предпочтительно по меньшей мере 75, 80, 85, 86, 87%, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% или 100% идентичностью аминокислотной последовательности SEQ ID NO:54. В некоторых вариантах реализации антитело/антигенсвязывающий фрагмент содержит аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 70% идентичностью последовательности, более предпочтительно по меньшей мере 75, 80, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% или 100% идентичностью аминокислотной последовательности SEQ ID NO:55.

В некоторых вариантах реализации антитело/антигенсвязывающий фрагмент содержит: (i) полипептид, содержащий или состоящий из аминокислотной последовательности, обладающей по меньшей мере 70%, предпочтительно 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% или 100% идентичностью аминокислотной последовательности SEQ ID NO:28, и (ii) полипептид, содержащий или состоящий из аминокислотной последовательности, обладающей по меньшей мере 70%, предпочтительно 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% или 100% идентичностью аминокислотной последовательности SEQ ID NO:29.

В некоторых вариантах реализации антитело/антигенсвязывающий фрагмент содержит: (i) поли

- 19 050147 пептид, содержащий или состоящий из аминокислотной последовательности, обладающей по меньшей мере 70%, предпочтительно 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% или 100% идентичностью аминокислотной последовательности SEQ ID NO:56, и (ii) полипептид, содержащий или состоящий из аминокислотной последовательности, обладающей по меньшей мере 70%, предпочтительно 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% или 100% идентичностью аминокислотной последовательности SEQ ID NO:57.

В некоторых вариантах реализации антитело/антигенсвязывающий фрагмент содержит: (i) полипептид, содержащий или состоящий из аминокислотной последовательности, обладающей по меньшей мере 70%, предпочтительно 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% или 100% идентичностью аминокислотной последовательности SEQ ID NO:58, и (ii) полипептид, содержащий или состоящий из аминокислотной последовательности, обладающей по меньшей мере 70%, предпочтительно 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% или 100% идентичностью аминокислотной последовательности SEQ ID NO:59.

Все фрагменты антител Fab, Fv, ScFv и dAb можно экспрессировать и секретировать в Е. coli, что позволяет легко получать большие количества указанных фрагментов.

Целые антитела и А(ab')2-фрагменты являются бивалентными. Под бивалентными авторы подразумевают, что указанные антитела и F(ab')2-фрагменты содержат два антигенсвязывающих сайта. Напротив, фрагменты Fab, Fv, ScFv и dAb являются одновалентными и содержат только один антигенсвязывающий сайт. Синтетические антитела, способные связываться с ИЛ-11, комплексом, содержащим ИЛ-11, или рецептором ИЛ-11, также можно получать с использованием технологии фагового дисплея, хорошо известной в данной области техники.

Антитела можно продуцировать посредством процесса созревания сродства, при котором получают модифицированное антитело, обладающее улучшенным сродством антитела к антигену по сравнению с немодифицированным исходным антителом. Антитела с созревшим сродством можно получать с помощью методик, известных в данной области техники, например, Marks et al., Rio/Technology 10:779-783 (1992); Barbas et al. Proc Nat. Acad. Sci. USA 91:3809-3813 (1994); Schier et al.Gene 169:147-155 (1995); Yelton et al. J. Immunol. 155:1994-2004 (1995); Jackson et al., J. Immunol. 154(7):3310-159 (1995); и Hawkins et al, J. Mol. Biol. 226:889-896 (1992).

Антитела/фрагменты включают в себя биспецифичные антитела, например, состоящие из двух разных фрагментов двух разных антител, так что биспецифичное антитело связывает антигены двух типов. Биспецифичное антитело содержит антитело/фрагмент, описанные в настоящем документе и способные связываться с ИЛ-11, комплексом, содержащим ИЛ-11, или рецептором ИЛ-11. Антитело может содержать другой фрагмент, обладающий аффинностью ко второму антигену, который может представлять собой любой желаемый антиген. Способы получения биспецифичных антител хорошо известны в данной области техники, например, см. Mueller, D et al., (2010 Biodrugs 24 (2):89-98), Wozniak-Knopp G et al., (2010 Protein Eng Des 23 (4): 289-297), и Baeuerle, PA et al., (2009 Cancer Res 69 (12): 4941-4944). Биспецифичные антитела и биспецифичные антигенсвязывающие фрагменты могут быть предоставлены в любом подходящем формате, например, в форматах, описанных в источнике Kontermann MAbs 2012, 4(2): 182-197, полностью включенном в настоящий документ посредством ссылки. Например, биспецифичное антитело или биспецифичный антигенсвязывающий фрагмент может представлять собой конъюгат биспецифичного антитела (например, IgG2, F(ab')2 или CovX-Body), биспецифичное IgG или IgG-подобную молекулу (например, IgG, scFv4-lg, IgG-scFv, scFv-IgG, DVD-Ig, IgG-sVD, sVD-IgG, IgG 2 в 1, мАт2 или тандемное антитело с общей LC), ассиметричный биспецифичный IgG или IgG-подобную молекулу (например, IgG kih, IgG kih с общей LC, CrossMab, IgG-scFab kih, mAb-Fv, заряженную пару или SEEDтело), молекулу небольшого биспецифичного антитела (например, диатело (Db), dsDb, DART, scDb, тандемные диатела, тандемный scFv (taFv), тандемное dAb/VHH, триатело, антитело в формате тройная головка, Fab-scFv или F(ab')2-scFv2), биспецифичный гибридный белок Fc и СН3 (например, taFv-Fc, Di-диатело, scDb-СН3, scFv-Fc-scFv, HCAb-VHH, scFv-kih-Fc или scFv-kih-СН3), или биспецифичный гибридный белок (например, scFv2-альбумин, scDb-альбумин, taFv-токсин, DNL-Fab3, DNL-Fab4-IgG, DNL-Fab4-IgG-цитокин2). См., в частности, фиг. 2 в Kontermann MAbs 2012, 4(2): 182-19.

Способы получения биспецифичных антител включают химическое перекрестное связывание антител или фрагментов антител, например, с помощью восстанавливаемых дисульфидных или невосстанавливаемых тиоэфирных связей, например, как описано в источнике Segal and Bast, 2001. Production of Bispecific Antibodies. Current Protocols in Immunology. 14:IV:2.13:2.13.1-2.13.16, полностью включенном в настоящий документ посредством ссылки. Например, N-сукцинимидил-3-(-2-пиридилдитио)пропионат (SPDP) можно использовать для химического сшивания, например, Fab-фрагментов через SH-группы шарнирных областей для создания дисульфид-связанных биспецифичных F(ab)2 гетеродимеров.

Другие способы получения биспецифичных антител включают слияние гибридом, продуцирующих антитела, например, с помощью полиэтиленгликоля, с получением клетки квадрогибридомы, способной секретировать биспецифичное антитело, например, как описано в источнике D.M. and Bast, В. J. 2001. Production of Bispecific Antibodies. Current Protocols in Immunology. 14:IV:2.13:2.13.1-2.13.16.

Биспецифичные антитела и биспецифичные антигенсвязывающие фрагменты также можно полу

- 20 050147 чить рекомбинантно путем экспрессии, например, из нуклеотидного конструкта, кодирующего полипептиды антигенсвязывающих молекул, например, как описано в Antibody Engineering: Methods and Protocols, Second Edition (Humana Press, 2012), в главе 40: Production of Bispecific Antibodies: Diabodies and Tandem scFv (Hornig and Farber-Schwarz), или French, French, How to make bispecific antibodies, Methods Mol. Med. 2000; 40:333-339.

Например, с помощью методик молекулярного клонирования можно получить ДНК-конструкт, кодирующий вариабельные домены легкой и тяжелой цепи для двух антигенсвязывающих доменов (т.е. вариабельные домены легкой и тяжелой цепи для антигенсвязывающего домена, способного связываться с ИЛ-11, комплексом, содержащим ИЛ-11, или рецептором ИЛ-11, и вариабельные домены легкой и тяжелой цепи для антигенсвязывающего домена, способного связываться с другим белком-мишенью), и включающий последовательности, кодирующие подходящий линкер или домен димеризации, между антигенсвязывающими доменами. После этого можно получить рекомбинантное биспецифичное антитело путем экспрессии (например, in vitro) указанного конструкта в подходящей клетке-хозяине (например, клетке-хозяине млекопитающего), а затем можно необязательно очистить экспрессированное рекомбинантное биспецифичное антитело.

Рецепторы-ловушки.

Агенты на основе пептидов или полипептидов, способные связываться с ИЛ-11 или комплексами, содержащими ИЛ-11, могут быть основаны на рецепторе ИЛ-11, например, ИЛ-11-связывающем фрагменте рецептора ИЛ-11.

В некоторых вариантах реализации связывающий агент может содержать ИЛ-11-связывающий фрагмент цепи ИЛ-HRa и предпочтительно может быть растворимым и/или не содержать один или более, или все трансмембранные домены. В некоторых вариантах реализации связывающий агент может содержать ИЛ-11-связывающий фрагмент gp130 и предпочтительно может быть растворимым и/или не содержать один или более, или все трансмембранные домены. Такие молекулы могут быть описаны как рецепторы-ловушки. Связывание таких агентов может ингибировать цис- и/или транс-сигнальный путь, опосредованный ИЛ-11, за счет снижения/предотвращения способности ИЛ-11 связываться с рецепторами ИЛ-11, например, ИЛ-HRa или gp130, тем самым ингибируя дальнейшие этапы сигнального пути.

Curtis et al (Blood 1997 Dec 1;90 (11):4403-12) сообщают, что альфа-цепь растворимого рецептора ИЛ-11 мыши (рИЛ-HR) способна являться антагонистом активности ИЛ-11 при тестировании на клетках, экспрессирующих трансмембранные ИЛ-HR и gp130. Они предположили, что наблюдаемый антагонизм ИЛ-11 со стороны рИЛ-HR зависит от ограничивающего количества молекул gp130 на клетках, уже экспрессирующих трансмембранный ИЛ-HR.

Об использовании растворимых рецепторов-ловушек в качестве основы для ингибирования сигнальных путей и терапевтического вмешательства также сообщалось для других пар сигнальная молекула:рецептор, например, VEGF и рецептора VEGF (De-Chao Yu et al., Molecular Therapy (2012); 205, 938947; Konner and Dupont Clin Colorectal Cancer 2004 Oct;4 Suppl 2:S81-5).

По существу, в некоторых вариантах реализации связывающий агент может представлять собой рецептор-ловушку, например, растворимый рецептор для ИЛ-11 и/или комплексов, содержащих ИЛ-11. Сообщалось, что конкуренция за ИЛ-11 и/или комплексы, содержащие ИЛ-11, обеспечиваемая рецептором-ловушкой, приводит к антагонистическому действию в отношении ИЛ-11 (см. источник Curtis et al., выше). Рецепторы-ловушки ИЛ-11 также описаны в заявках WO 2017/103108 А1 и WO 2018/109168 А1, полностью включенных в настоящий документ посредством ссылок.

Рецепторы-ловушки ИЛ-11 предпочтительно связывают ИЛ-11 и/или комплексы, содержащие ИЛ11, и тем самым делают эти молекулы недоступными для связывания с рецепторами gp130, ИЛ-HRa и/или gp130:ИЛ-11Rα. Как таковые, они действуют как рецепторы-ловушки для ИЛ-11 и комплексов, содержащих ИЛ-11, во многом аналогично действию этанерцепта в качестве рецептора-ловушки для ФНОа. Сигнальный путь, опосредованный ИЛ-11, подавляется по сравнению с активностью сигнального пути в отсутствие рецептора-ловушки.

Рецепторы-ловушки ИЛ-11 предпочтительно связываются с ИЛ-11 посредством одного или более цитокин-связывающего модуля (СВМ). СВМ представляют собой или происходят от или являются гомологами СВМ молекул природных рецепторов ИЛ-11. Например, рецепторы-ловушки ИЛ-11 могут содержать или состоять из одного или более СВМ, которые получены, происходят от или гомологичны СВМ gp130 и/или ИЛ-HRa.

В некоторых вариантах реализации рецептор-ловушка ИЛ-11 может содержать или состоять из аминокислотной последовательности, соответствующей цитокин-связывающему модулю gp130. В некоторых вариантах реализации рецептор-ловушка ИЛ-11 может содержать аминокислотную последовательность, соответствующую цитокин-связывающему модулю ИЛ-HRa. В настоящей заявке аминокислотная последовательность, соответствующая эталонной области или последовательности данного пептида/полипептида, обладает по меньшей мере 60%, например, по меньшей мере 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% идентичностью аминокислотной последовательности эталонной области/последовательности.

- 21 050147

В некоторых вариантах реализации рецептор-ловушка может связывать ИЛ-11, например, со сродством связывания, равным по меньшей мере 100 мкМ или менее, необязательно 10 мкМ или менее, 1 мкМ или менее, 100 нМ или менее или приблизительно от 1 до 100 нМ. В некоторых вариантах реализации рецептор-ловушка может полностью или частично содержать ИЛ-11-связывающий домен и может необязательно быть лишенным всех или части трансмембранных доменов. Рецептор-ловушка может быть необязательно объединен с константной областью иммуноглобулина, например, с областью Fc IgG.

Ингибиторы.

Настоящее изобретение предусматривает применение молекул-ингибиторов, способных связываться с одним или более из ИЛ-11, комплекса, содержащего ИЛ-11, ИЛ-HRa, gp130 или комплекса, содержащего ИЛ-11Ra и/или gp130, и ингибировать сигнальный путь, опосредованный ИЛ-11.

В некоторых вариантах реализации агент представляет собой связывающий агент на основе пептида или полипептида на основе ИЛ-11, например, мутант, вариант или связывающий фрагмент ИЛ-11. Подходящие агенты на основе пептидов или полипептидов могут связываться с рецептором ИЛ-11 (например, ИЛ-HRa, gp130 или комплексом, содержащим ИЛ-HRa и/или gp130) способом, который не приводит к инициации сигнального пути, или который приводит к неоптимальному функционированию сигнального пути. Мутанты ИЛ-11 этого типа могут действовать в качестве конкурентных ингибиторов эндогенного ИЛ-11.

Например, W147A является антагонистом ИЛ-11, в котором аминокислота 147 мутирована из триптофана в аланин, что разрушает так называемый сайт III ИЛ-11. Этот мутант может связываться с ИЛ11Ra, однако присоединения гомодимера gp130 не происходит, что приводит к эффективной блокаде сигнального пути ИЛ-11 (Underhill-Day et al., 2003; Endocrinology 2003 Aug;144(8):3406-14). Lee et al (Am J respire Cell Mol Biol. 2008 Dec; 39(6):739-746) также сообщают о создании мутанта антагониста ИЛ-11 (мутеина), способного специфично ингибировать связывание ИЛ-11 с ИЛ-HRa. Мутеины ИЛ-11 также описаны в WO 2009/052588 А1.

Menkhorst et al (Biology of Reproduction May 1, 2009 vol.80 no.5 920-927) описывают пэгилированный антагонист ИЛ-11, PEGIL11A (CSL Limited, Парквилл, Виктория, Австралия), эффективно ингибирующий действие ИЛ-11 у самок мышей.

Pasqualini et al. Cancer (2015) 121(14):2411-2421 описывают лиганд-направленное пептидомиметическое лекарственное средство, пептидомиметик-11, мишенью которого являются метастазы в кости (ВМТР-11), способный связываться с ИЛ-HRa.

В некоторых вариантах реализации связывающий агент, способный связываться с рецептором ИЛ11, может быть представлен в форме низкомолекулярного ингибитора одного из ИЛ-HRa, gp130 или комплекса, содержащего ИЛ-HRa и/или gp130. В некоторых вариантах реализации связывающий агент может быть представлен в форме низкомолекулярного ингибитора ИЛ-11 или комплекса, содержащего ИЛ-11, например, ингибитора ИЛ-11, описанного в источнике Lay et al., Int. J. Oncol. (2012); 41(2): 759764, полностью включенном в настоящий документ посредством ссылки.

Аптамеры.

В некоторых вариантах реализации агент, способный связываться с ИЛ-11/комплексом, содержащим ИЛ-11, или рецептором ИЛ-11 (например, ИЛ-HRa, gp130 или комплексом, содержащим ИЛ-HRa и/или gp130), представляет собой аптамер. Аптамеры, также называемые нуклеиновыми/пептидными лигандами, представляют собой молекулы нуклеиновых кислот или пептидов, характеризующиеся способностью связываться с молекулой-мишенью с высокой специфичностью и высокой аффинностью. Почти каждый аптамер, идентифицированный до настоящего времени, является не встречающейся в природе молекулой.

Аптамеры для данной мишени (например, ИЛ-11, комплекса, содержащего ИЛ-11, или рецептора ИЛ-11) можно выявлять и/или получать с помощью способа систематической эволюции лигандов при экспоненциальном обогащении (SELEXTM) или путем разработки SOMA-меров (SOMAmers) (модифицированных аптамеров с низкой скоростью диссоциации) (Gold L et al. (2010) PLoS ONE 5(12):е15004). Аптамеры и SELEX описаны в Tuerk and Gold, Science (1990) 249(4968):505-10 и в WO 91/19813. Применение SELEX и технологии SOMAmer включает, например, добавление функциональных групп, имитирующих боковые цепи аминокислот для расширения химического разнообразия аптамера. В результате можно обогащать и выявлять аптамеры с высоким сродством к мишени.

Аптамеры могут представлять собой молекулы ДНК или РНК и могут быть одноцепочечными или двуцепочечными. Аптамер может содержать химически модифицированные нуклеиновые кислоты, например, в которых углевод и/или фосфат и/или основание химически модифицированы. Такие модификации могут улучшить стабильность аптамера или сделать аптамер более устойчивым к разложению, и могут включать модификацию в 2'-положении рибозы.

Аптамеры можно синтезировать способами, хорошо известными специалисту. Например, аптамеры можно синтезировать химически, например, на твердой подложке. В твердофазном синтезе можно использовать фосфорамидитную химию. Вкратце, нуклеотид на твердой подложке детритилируют, затем конденсируют с подходящим образом активированным нуклеозидным фосфорамидитом с образованием

- 22 050147 фосфитной триэфирной связи. Затем может происходить блокирование с последующим окислением фосфитного триэфира окислителем, обычно иодом. Затем цикл можно повторить для сборки аптамера (например, см. Sinha, N. D.; Biernat, J.; McManus, J.; Koster, H.Nucleic Acids Res. 1984, 12, 4539; и Beaucage, S. L; Lyer, R. P. (1992). Tetrahedron 48 (12):2223).

Минимальная длина подходящих нуклеотидных аптамеров может необязательно составлять 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 или 40 нуклеотидов. Максимальная длина подходящих нуклеотидных аптамеров может необязательно составлять 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77,

78, 79 или 80 нуклеотидов. Длина подходящих нуклеотидных аптамеров может необязательно составлять 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39,

40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69,

70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79 или 80 нуклеотидов.

Аптамеры могут представлять собой пептиды, выбранные или сконструированные для связывания определенных молекул-мишеней. Обзор пептидных аптамеров и способов их получения и выявления приведен в источнике Reverdatto et al., Curr Top Med Chem. (2015) 15(12):1082-101, полностью включенном в настоящий документ посредством ссылки. Пептидные аптамеры могут необязательно иметь минимальную длину 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 аминокислот. Пептидные аптамеры могут иметь максимальную длину 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 или 50 аминокислот. Подходящие пептидные аптамеры могут необязательно иметь длину 2-30, 2-25, 2-20, 5-30, 5-25 или 5-20 аминокислот.

Аптамеры могут иметь K_D в наномолярном или пикомолярном диапазоне, например, менее 500 нМ, 100 нМ, 50 нМ, 10 нМ, 1 нМ, 500 пМ, 100 пМ.

Свойства ИЛ-11-связывающих агентов.

Агенты, способные связываться с ИЛ-11/комплексом, содержащим ИЛ-11, или рецептором ИЛ-11 согласно настоящему изобретению, могут обладать одним или более из следующих свойств:

специфичное связывание с ИЛ-11/комплексом, содержащим ИЛ-11, или рецептором ИЛ-11;

связывание с ИЛ-11/комплексом, содержащим ИЛ-11, или рецептором ИЛ-11, с KD 10 мкМ или менее, предпочтительно <5 мкМ, <1 мкМ, <500 нМ, <100 нМ, <10 нМ, <1 нМ или <100 пМ;

ингибирование взаимодействия между ИЛ-11 и ИЛ-11Ra;

ингибирование взаимодействия между ИЛ-11 и gp130;

ингибирование взаимодействия между ИЛ-11 и рецепторным комплексом ИЛ-11Ra:gp130;

ингибирование взаимодействия между рецепторным комплексом ИЛ-11 :ИЛ-11Rα и gp130.

Эти свойства можно определить путем анализа соответствующего агента в подходящем анализе, который может включать сравнение характеристик агента с подходящими контрольными агентами. Специалист может определить подходящие условия контроля для отдельно взятого анализа.

Например, подходящим отрицательным контролем для анализа способности тестируемого антитела/антигенсвязывающего фрагмента связываться с ИЛ-11/комплексом, содержащим ИЛ-11/рецептором ИЛ-11 может быть антитело/антигенсвязывающий фрагмент против нецелевого белка (т.е. антитело/антигенсвязывающий фрагмент, которые не являются специфичными для ИЛ-11/комплекса, содержащего ИЛ-11/рецептора ИЛ-11). Подходящим положительным контролем может быть известное, подтвержденное (например, коммерчески доступное) антитело, связывающееся с ИЛ-11 или рецептором ИЛ11. Изотип контрольных материалов может быть аналогичен изотипу предполагаемого анализируемого антитела/антигенсвязывающего фрагмента, связывающего ИЛ-11/комплекс, содержащий ИЛ11/рецептор ИЛ-11, и могут, например, содержать такие же константные области.

В некоторых вариантах реализации агент может специфично связываться с ИЛ-11 или комплексом, содержащим ИЛ-11, или рецептором ИЛ-11 (например, ИЛ-HRa, gp130 или комплексом, содержащим ИЛ-HRa и/или gp130). Агент, специфично связывающийся с данной молекулой-мишенью, предпочтительно связывает мишень с большим сродством и/или с большей продолжительностью по сравнению со связыванием с другими, нецелевыми молекулами.

В некоторых вариантах реализации агент может связываться с ИЛ-11 или комплексом, содержащим ИЛ-11, с большим сродством, чем сродство связывания с одним или более другими членами семейства цитокинов ИЛ-6 (например, ИЛ-6, лейкоз-ингибирующим фактором (LIF), онкостатином М (OSM), кардиотрофином-1 (СТ-1), цилиарным нейротрофическим фактором (CNTF) и кардиотрофин-подобным цитокином (CLC)). В некоторых вариантах реализации агент может связываться с рецептором ИЛ-11 (например, ИЛ-HRa, gp130 или комплексом, содержащим ИЛ-HRa и/или gp130) с большим сродством, чем сродство связывания с одним или более другими членами семейства рецепторов ИЛ-6. В некоторых вариантах реализации агент может связываться с ИЛ-HRa с большим сродством, чем сродство связывания с одним или более из ИЛ-6Rα, рецептора лейкоз-ингибирующего фактора (LIFR), рецептора онкостатина М (OSMR), альфа-рецептора цилиарного нейротрофического фактора (CNTFRa) и фактора 1, подобного рецептору цитокинов (CRLF1).

- 23 050147

В некоторых вариантах реализации степень связывания связывающего агента с нецелевым объектом составляет менее чем приблизительно 10% от связывания агента с мишенью, согласно измерениям, например, с помощью ELISA, SPR, биослойной интерферометрии (BLI), микроскопического термофореза (MST) или радиоиммуноанализа (RIA). В качестве альтернативы, специфичность связывания можно выражать в контексте сродства связывания, где связывающий агент связывается с ИЛ-11, комплексом, содержащим ИЛ-11, или рецептором ИЛ-11 с K_D, которая на по меньшей мере 0,1 порядка величины (т.е. 0,1x10n, где n - целое число, представляющее собой порядок величины) больше, чем K_D по отношению к другой нецелевой молекуле. Необязательно, она может составлять по меньшей мере 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,5 или 2,0.

Сродство связывания для данного связывающего агента с его мишенью часто описывают по показателю его константы диссоциации (K_D). Сродство связывания можно измерять способами, известными в данной области техники, например, твердофазным ИФА, поверхностным плазменным резонансом (ППР; см., например, Hearty et al., Methods Mol Biol (2012) 907:411-442; или Rich et al., Anal Biochem. 2008 Feb 1; 373(1):112-20), биослойной интерферометрией (см., например, Lad et al., (2015) J Biomol Screen 20(4): 498-507; или Concepcion et al., Comb Chem High Throughput Screen. 2009 Sep; 12(8):791-800), анализом посредством микроскопического термофереза (MST) (см., например, Jerabek-Willemsen et al., Assay Drug Dev Technol. 2011 Aug; 9(4):342-353), или анализом связывания антигена, меченого радиоактивной меткой (РИА).

В некоторых вариантах реализации агент способен связываться с ИЛ-11 или комплексом, содержащим ИЛ-11, или с рецептором ИЛ-11 с K_D 50 мкМ или менее, предпочтительно <10 мкМ, <5 мкМ, <4 мкМ, <3 мкМ, <2 мкМ, <1 мкМ, <500 нМ, <100 нМ, <75 нМ, <50 нМ, <40 нМ, <30 нМ, <20 нМ, <15 нМ, <12.5 нМ, <10 нМ, <9 нМ, <8 нМ, <7 нМ, <6 нМ, <5 нМ, <4 нМ, <3 нМ, <2 нМ, <1 нМ, <500 пМ, <400 пМ, <300 пМ, <200 пМ или <100 пМ.

В некоторых вариантах реализации агент связывается с ИЛ-11, комплексом, содержащим ИЛ-11, или рецептором ИЛ-11 со сродством связывания (например, согласно твердофазному ИФА) ЕС50=10000 нг/мл или менее, предпочтительно <5000 нг/мл, <1000 нг/мл, <900 нг/мл, <800 нг/мл, <700 нг/мл, <600 нг/мл, <500 нг/мл, <400 нг/мл, <300 нг/мл, <200 нг/мл, <100 нг/мл, <90 нг/мл, <80 нг/мл, <70 нг/мл, <60 нг/мл, <50 нг/мл, <40 нг/мл, <30 нг/мл, <20 нг/мл, <15 нг/мл, <10 нг/мл, <7,5 нг/мл, <5 нг/мл, <2,5 нг/мл или <1 нг/мл. Такой твердофазный ИФА можно выполнять, например, как описано в Antibody Engineering, vol.1 (2nd Edn), Springer Protocols, Springer (2010), Part V, pp657-665.

В некоторых вариантах реализации агент связывается с ИЛ-11 или ИЛ-11-содержащим комплексом в области, важной для связывания с рецептором ИЛ-11 или комплексом, содержащим ИЛ-11, например, gp130 или ИЛ-HRa, и тем самым ингибирует взаимодействие между ИЛ-11 или комплексом, содержащим ИЛ-11, и рецептором ИЛ-11, и/или сигнальный путь через указанный рецептор. В некоторых вариантах реализации агент связывается с рецептором ИЛ-11 в области, важной для связывания с ИЛ-11 или комплексом, содержащим ИЛ-11, и тем самым ингибирует взаимодействие между ИЛ-11 или комплексом, содержащим ИЛ-11, и рецептором ИЛ-11, и/или сигнальный путь через указанный рецептор.

Способность данного связывающего агента (например, агента, способного связывать ИЛ11/комплекс, содержащий ИЛ-11, или рецептор ИЛ-11) ингибировать взаимодействие между двумя белками можно определить, например, анализом взаимодействия в присутствии связывающего агента или после инкубирования одного или обоих партнеров по взаимодействию со связывающим агентом. Примером подходящего анализа для определения того, способен ли отдельно взятый связывающий агент ингибировать взаимодействие между двумя партнерами по взаимодействию, является конкурентный ELISA.

Связывающий агент, способный ингибировать отдельно взятое взаимодействие (например, между ИЛ-11 и ИЛ-11Ra, или между ИЛ-11 и gp130, или между ИЛ-11 и ИЛ-11Рα:gp130, или между ИЛ-11:ИЛ11Ra и gp130), выявляют по наблюдению уменьшения/снижения уровня взаимодействия между партнерами по взаимодействию в присутствии связывающего агента или после инкубирования одного или обоих партнеров по взаимодействию со связывающим агентом по сравнению с уровнем взаимодействия в отсутствие связывающего агента (или в присутствии подходящего контрольного связывающего агента). Подходящий анализ можно выполнять in vitro, например, с использованием рекомбинантных партнеров по взаимодействию или с использованием клеток, экспрессирующих партнеров по взаимодействию. Клетки, экспрессирующие партнеров по взаимодействию, могут делать это эндогенно или могут делать это с нуклеиновой кислоты, введенной в клетку. Для целей таких анализов один или оба из партнеров по взаимодействию и/или связывающий агент могут быть помечены или использованы в сочетании с обнаруживаемым объектом для целей обнаружения и/или измерения уровня взаимодействия. Например, агент может быть меченным радиоактивным атомом или окрашенной молекулой, или флуоресцентной молекулой, или молекулой, которую легко обнаружить любым другим способом. Подходящие обнаружимые молекулы включают флуоресцентные белки, люциферазу, ферментные субстраты и радиоактивные метки. Связывающий агент может быть непосредственно или опосредованно меченным обнаружимой меткой. Например, связывающий агент может быть не меченным и обнаруживаться с помощью другого, меченого связывающего агента. В качестве альтернативы, второй связывающий агент может быть

- 24 050147 связан с биотином, и связывание меченого стрептавидина с биотином можно использовать для опосредованного мечения первого связывающего агента.

Способность связывающего агента ингибировать взаимодействие между двумя партнерами по связыванию также можно определять путем анализа дальнейших функциональных последствий такого взаимодействия, например, сигнального пути, опосредованного ИЛ-11. Например, дальнейшие функциональные последствия взаимодействия между ИЛ-11 и ИЛ-11Rα:gp130 или между ИЛ-11:ИЛ-11Rα и gp130 могут включать, например, процесс, опосредованный ИЛ-11, или экспрессию генов/белка, например, коллагена или ИЛ-11.

Ингибирование взаимодействия между ИЛ-11 или комплексом, содержащим ИЛ-11, и рецептором ИЛ-11 можно анализировать с помощью анализов включения 3H-тимидина и/или анализов пролиферации клеток Ba/F3, например, описанных в источниках Curtis et al.Blood, 1997, 90(11) и Karpovich et al. Mol. Hum. Reprod. 2003 9(2): 75-80. Клетки Ba/F3 совместно экспрессируют ИЛ-HRa и gp130.

В некоторых вариантах реализации связывающий агент может ингибировать взаимодействие между ИЛ-11 и ИЛ-HRa до менее чем 100%, например, 99% или менее, 95% или менее, 90% или менее, 85% или менее, 75% или менее, 70% или менее, 65% или менее, 60% или менее, 55% или менее, 50% или менее, 45% или менее, 40% или менее, 35% или менее, 30% или менее, 25% или менее, 20% или менее, 15% или менее, 10% или менее, 5% или менее или 1% или менее от уровня взаимодействия между ИЛ-11 и ИЛ-HRa в отсутствие связывающего агента (или в присутствии подходящего контрольного связывающего агента). В некоторых вариантах реализации связывающий агент может ингибировать взаимодействие между ИЛ-11 и ИЛ-HRa до менее чем 1-кратного, например, до <0,99-кратного, <0,95-кратного, <0,9-кратного, <0,85-кратного, <0,8-кратного, <0,75-кратного, <0,7-кратного, <0,65-кратного, <0,6кратного, <0,55-кратного, <0,5-кратного, <0,45-кратного, <0,4-кратного, <0,35-кратного, <0,3-кратного, <0,25-кратного, <0,2-кратного, <0,15-кратного, <0,1-кратного от уровня взаимодействия между ИЛ-11 и ИЛ-HRa в отсутствие связывающего агента (или в присутствии подходящего контрольного связывающего агента).

В некоторых вариантах реализации связывающий агент может ингибировать взаимодействие между ИЛ-11 и gp130 до менее чем 100%, например, 99% или менее, 95% или менее, 90% или менее, 85% или менее, 75% или менее, 70% или менее, 65% или менее, 60% или менее, 55% или менее, 50% или менее, 45% или менее, 40% или менее, 35% или менее, 30% или менее, 25% или менее, 20% или менее, 15% или менее, 10% или менее, 5% или менее или 1% или менее от уровня взаимодействия между ИЛ-11 и gp130 в отсутствие связывающего агента (или в присутствии подходящего контрольного связывающего агента). В некоторых вариантах реализации связывающий агент может ингибировать взаимодействие между ИЛ11 и gp130 до менее чем 1-кратного, например, до <0,99-кратного, <0,95-кратного, <0,9-кратного, <0,85кратного, <0,8-кратного, <0,75-кратного, <0,7-кратного, <0,65-кратного, <0,6-кратного, <0,55-кратного, <0,5-кратного, <0,45-кратного, <0,4-кратного, <0,35-кратного, <0,3-кратного, <0,25-кратного, <0,2кратного, <0,15-кратного, <0,1-кратного от уровня взаимодействия между ИЛ-11 и gp130 в отсутствие связывающего агента (или в присутствии подходящего контрольного связывающего агента).

В некоторых вариантах реализации связывающий агент может ингибировать взаимодействие между ИЛ-11 и ИЛ-11Rα:gp130 до менее чем 100%, например, 99% или менее, 95% или менее, 90% или менее, 85% или менее, 75% или менее, 70% или менее, 65% или менее, 60% или менее, 55% или менее, 50% или менее, 45% или менее, 40% или менее, 35% или менее, 30% или менее, 25% или менее, 20% или менее, 15% или менее, 10% или менее, 5% или менее или 1% или менее от уровня взаимодействия между ИЛ-11 и ИЛ-11Rα:gp130 в отсутствие связывающего агента (или в присутствии подходящего контрольного связывающего агента). В некоторых вариантах реализации связывающий агент может ингибировать взаимодействие между ИЛ-11 и ИЛ-11Rα:gp130 до менее чем 1-кратного, например, до <0,99-кратного, <0,95кратного, <0,9-кратного, <0,85-кратного, <0,8-кратного, <0,75-кратного, <0,7-кратного, <0,65-кратного, <0,6-кратного, <0,55-кратного, <0,5-кратного, <0,45-кратного, <0,4-кратного, <0,35-кратного, <0,3кратного, <0,25-кратного, <0,2-кратного, <0,15-кратного, <0,1-кратного от уровня взаимодействия между ИЛ-11 и ИЛ-11Rα:gp130 в отсутствие связывающего агента (или в присутствии подходящего контрольного связывающего агента).

В некоторых вариантах реализации связывающий агент может ингибировать взаимодействие между комплексом ИЛ-11:ИЛ-11Rα и gp130 до менее чем 100%, например, 99% или менее, 95% или менее, 90% или менее, 85% или менее, 75% или менее, 70% или менее, 65% или менее, 60% или менее, 55% или менее, 50% или менее, 45% или менее, 40% или менее, 35% или менее, 30% или менее, 25% или менее, 20% или менее, 15% или менее, 10% или менее, 5% или менее или 1% или менее от уровня взаимодействия между комплексом ИЛ-11:ИЛ-11Ка и gp130 в отсутствие связывающего агента (или в присутствии подходящего контрольного связывающего агента). В некоторых вариантах реализации связывающий агент способен ингибировать взаимодействие между комплексом ИЛ-11:ИЛ-11Rα и gp130 до менее чем 1кратного, например, до <0,99-кратного, <0,95-кратного, <0,9-кратного, <0,85-кратного, <0,8-кратного, <0,75-кратного, <0,7-кратного, <0,65-кратного, <0,6-кратного, <0,55-кратного, <0,5-кратного, <0,45

- 25 050147 кратного, <0,4-кратного, <0,35-кратного, <0,3-кратного, <0,25-кратного, <0,2-кратного, <0,15-кратного, <0,1-кратного от уровня взаимодействия между комплексом ИЛ-11:ИЛ-11Rα и gp130 в отсутствие связывающего агента.

Агенты, способные снижать экспрессию ИЛ-11 или рецептора ИЛ-11.

В аспектах настоящего изобретения агент, способный ингибировать сигнальный путь, опосредованный ИЛ-11, может предотвращать или снижать экспрессию одного или более из ИЛ-11, ИЛ-HR или gp130.

Экспрессия может представлять собой экспрессию гена или белка, и ее можно определять, как описано в настоящей заявке, или способами в данной области техники, хорошо известными специалисту в данной области техники. Экспрессия может осуществляться клеткой/тканью/органом/системой органов субъекта.

Подходящие агенты могут быть любого типа, однако в некоторых вариантах реализации агент, способный предотвращать или снижать экспрессию одного или более из ИЛ-11, ИЛ-HRa или gp130, может представлять собой низкомолекулярное соединение или олигонуклеотид.

Агент, способный предотвращать или снижать экспрессию одного или более из ИЛ-11, ИЛ-HRa или gp130, может осуществлять это, например, посредством ингибирования транскрипции гена, кодирующего ИЛ-11, ИЛ-HRa или gp130, ингибирования посттранскрипционного процессинга РНК, кодирующей ИЛ-11, ИЛ-HRa или gp130, снижения стабильности РНК, кодирующей ИЛ-11, ИЛ-HRa или gp130, стимуляции разложения РНК, кодирующей ИЛ-11, ИЛ-HRa или gp130, ингибирования посттрансляционного процессинга полипептида ИЛ-11, ИЛ-HRa или gp130, снижения стабильности полипептида ИЛ-11, ИЛ-HRa или gp130 или стимуляции разложения полипептида ИЛ-11, ИЛ-HRa или gp130.

Taki et al. Clin Exp Immunol (1998) Apr; 112(1):133-138 сообщили о снижении экспрессии ИЛ-11 в ревматоидных клетках синовиальной оболочки после лечения индометацином, дексаметазоном или интерфероном-гамма (ИФНу).

Настоящее изобретение предусматривает применение антисмысловой нуклеиновой кислоты для предотвращения/снижения экспрессии ИЛ-11, ИЛ-HRa или gp130. В некоторых вариантах реализации агент, способный предотвращать или снижать экспрессию ИЛ-11, ИЛ-HRa или gp130, может вызывать снижение экспрессии посредством РНК-интерференции (РНКи).

В некоторых вариантах реализации агент может представлять собой ингибирующую нуклеиновую кислоту, например, антисмысловую или малую интерферирующую РНК, включая кшРНК или миРНК, но не ограничиваясь ими.

В некоторых вариантах реализации ингибирующая нуклеиновая кислота представлена в векторе. Например, в некоторых вариантах реализации агент может представлять собой лентивирусный вектор, кодирующий кшРНК для одного или более из ИЛ-11, ИЛ-11Ra или gp130.

Для регуляции экспрессии генов могут быть использованы молекулы олигонуклеотидов, в частности, РНК. К ним относятся антисмысловые олигонуклеотиды, адресное разложение мРНК с помощью малых интерферирующих РНК (миРНК), посттранскрипционный сайленсинг генов (PTG), регулируемое развитием специфичное по отношению к последовательности подавление трансляции мРНК с помощью микроРНК (мкРНК) и адресный транскрипционный сайленсинг генов.

Антисмысловой олигонуклеотид представляет собой олигонуклеотид, предпочтительно одноцепочечный, который специфичен по отношению к и связывается путем связывания комплементарной последовательности с олигонуклеотидом-мишенью, например, мРНК. Если олигонуклеотид-мишень представляет собой мРНК, связывание антисмысловой последовательности с мРНК блокирует трансляцию мРНК и экспрессию продукта гена. Антисмысловые олигонуклеотиды можно конструировать с возможностью связывания смысловой геномной нуклеиновой кислоты и ингибирования транскрипции нуклеотидной последовательности-мишени.

Так как нуклеотидные последовательности ИЛ-11, ИЛ-HRa и gp130 известны (например, известные последовательности мРНК, доступные в GenBank под номерами доступа: ВС012506.1 GI:15341754 (ИЛ-11 человека), ВС134354.1 GI:126632002 (ИЛ-11 мыши), AF347935.1 GI:13549072 (ИЛ-11 крысы), NM_001142784.2 GI:391353394 (ИЛ-HRa человека), NM_001163401.1 GI:254281268 (ИЛ-HRa мыши), NM_139116.1 GI:20806172 (ИЛ-HRa крысы), NM_001190981.1 GI:300244534 (gp130 человека), NM_010560.3 GI:225007624 (gp130 мыши), NM_001008725.3 GI:300244570 (gp130 крысы)), можно конструировать олигонуклеотиды, способные подавлять или осуществлять сайленсинг экспрессии ИЛ-11, ИЛ-HRa или gp130.

Такие олигонуклеотиды могут иметь любую длину, но предпочтительно могут быть короткими, например, менее 100 нуклеотидов, например, 10-40 нуклеотидов или 20-50 нуклеотидов, и могут содержать нуклеотидную последовательность, обладающую полной или почти полной комплементарностью (например, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% или 100% комплементарностью) нуклеотидной последовательности соответствующей длины в олигонуклеотиде-мишени, например, мРНК ИЛ-11, ИЛ-HR или gp130. Длина комплементарной области нуклеотидной последовательности может быть любой, но

- 26 050147 предпочтительно составляет по меньшей мере 5 и, необязательно, не более 50 нуклеотидов, например, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 или 50 нуклеотидов.

Подавление экспрессии ИЛ-11, ИЛ-HRa или gp130 предпочтительно приводит к снижению количества ИЛ-11, ИЛ-HRa или gp130, экспрессируемого клеткой/тканью/органом/системой органов/субъектом. Например, в отдельно взятой клетке подавление ИЛ-11, ИЛ-HRa или gp130 путем введения подходящей нуклеиновой кислоты приведет к уменьшению количества ИЛ-11, ИЛ-HRa или gp130, экспрессируемого этой клеткой, по сравнению с необработанной клеткой. Подавление может быть частичным. Предпочтительные степени подавления составляют по меньшей мере 50%, более предпочтительно по меньшей мере 60, 70, 80, 85% или 90%. Уровень подавления от 90 до 100% считается сайленсингом экспрессии или функции.

Была продемонстрирована роль механизма РНКи и малых РНК в нацеливании на гетерохроматиновые комплексы и эпигенетический сайленсинг генов в определенных хромосомных локусах. Зависимый от двуцепочечной РНК (дцРНК) посттранскрипционный сайленсинг, также известный как РНКинтерференция (РНКи), представляет собой явление, при котором комплексы дцРНК могут специфично проявлять сайленсинг по отношению к определенным гомологичным генам в течение короткого периода времени. Он действует как сигнал, стимулирующий разложение мРНК с соответствующей идентичностью последовательности. Длина 20-нуклеотидных миРНК, как правило, достаточна для генспецифичного сайленсинга, и они достаточно коротки, чтобы избежать ответа хозяина. Снижение экспрессии продуктов генов-мишеней может быть значительным при 90% сайленсинге, вызванном несколькими молекулами миРНК. Лекарственные средства на основе РНКи прошли клинические исследования I, II и III фазы по ряду показаний (Nature 2009 Jan 22; 457(7228):426-433).

В данной области техники эти последовательности РНК называют короткими или малыми интерферирующими РНК (миРНК) или микроРНК (мкРНК) в зависимости от их происхождения. Оба эти типа последовательностей можно применять для подавления экспрессии генов путем связывания с комплементарными РНК и инициации удаления мРНК (РНКи), либо остановки трансляции мРНК в белок. МиРНК получают путем процессинга длинных двуцепочечных РНК, и встречающиеся в природе миРНК обычно имеют экзогенное происхождение. Интерферирующие микроРНК (мкРНК) представляют собой эндогенные малые некодирующие РНК, полученные путем процессинга коротких шпилек. Как миРНК, так и мкРНК могут ингибировать трансляцию мРНК, несущих частично комплементарные последовательности-мишени, без расщепления РНК, и разрушать мРНК, несущие полностью комплементарные последовательности.

Лиганды миРНК, как правило, являются двуцепочечными, и для оптимизации эффективности РНКопосредованного подавления функции гена-мишени предпочтительно выбрать длину молекулы миРНК, обеспечивающую правильное распознавание миРНК комплексом RISC, который опосредует распознавание миРНК мРНК-мишени, причем миРНК должна быть достаточно короткой, чтобы ослабить ответ хозяина.

Лиганды мкРНК обычно являются одноцепочечными и содержат частично комплементарные области, что позволяет лигандам образовывать шпильку. мкРНК представляют собой гены РНК, транскрибируемые с ДНК, но не транслируемые в белок. Последовательность ДНК, кодирующая ген мкРНК, длиннее, чем мкРНК. Эта последовательность ДНК включает последовательность мкРНК и приблизительно обратно комплементарную цепь. При транскрипции этой последовательности ДНК в молекулу одноцепочечной РНК пары оснований последовательности мкРНК и обратно комплементарной ей цепи спариваются с образованием частично двуцепочечного сегмента РНК. Конструирование последовательностей микроРНК обсуждается в источнике John et al, PLoS Biology, 11(2), 1862-1879, 2004.

Как правило, лиганды РНК, предназначенные для имитации действия миРНК или мкРНК, содержат от 10 до 40 рибонуклеотидов (или их синтетических аналогов), более предпочтительно от 17 до 30 рибонуклеотидов, более предпочтительно от 19 до 25 рибонуклеотидов и наиболее предпочтительно от 21 до 23 рибонуклеотидов. В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения, использующих двуцепочечную миРНК, молекула может содержать симметричные 3'-липкие концы, например, длиной один или два (рибо)нуклеотида, обычно UU 3'-липкого конца dTdT. На основании приведенного в настоящей заявке описания специалист может легко разработать подходящие последовательности миРНК и мкРНК, например, используя такие ресурсы, как Ambion siRNA finder. Последовательности миРНК и мкРНК можно получать синтетически и добавлять экзогенно с целью подавления гена, или получать с использованием систем экспрессии (например, векторов). В предпочтительном варианте реализации миРНК синтезируют синтетически.

Более длинные двуцепочечные РНК можно подвергать процессингу в клетке с получением миРНК (см., например, Myers (2003) Nature Biotechnology 21:324-328). Более длинная молекула дцРНК может иметь симметричные 3'- или 5'-липкие концы, например, из одного или двух (рибо)нуклеотидов, или может иметь тупые концы. Более длинные молекулы дцРНК могут состоять из 25 нуклеотидов или более. Предпочтительно длина более длинных молекул дцРНК составляет от 25 до 30 нуклеотидов. Более пред

- 27 050147 почтительно, длина более длинных молекул дцРНК составляет от 25 до 27 нуклеотидов. Наиболее предпочтительно, длина более длинных молекул дцРНК составляет 27 нуклеотидов. дцРНК длиной 30 или более нуклеотидов можно экспрессировать с использованием вектора pDECAP (Shinagawa et al., Genes and Dev., 17, 1340-5, 2003).

Еще одной альтернативой является экспрессия молекулы короткой шпилечной РНК (кшРНК) в клетке. кшРНК более стабильны, чем синтетические миРНК. кшРНК состоит из коротких инвертированных повторов, разделенных короткой последовательностью петли. Один инвертированный повтор комплементарен гену-мишени. В клетке кшРНК подвергается процессингу DICER в миРНК, которая разрушает мРНК гена-мишени и подавляет экспрессию. В предпочтительном варианте реализации кшРНК получают эндогенно (внутри клетки) путем транскрипции с вектора. кшРНК можно получать внутри клетки путем трансфекции клетки вектором, кодирующим последовательность кшРНК, под контролем промотора РНК-полимеразы III, например, промотора Н1 или 7SK человека или промотора РНКполимеразы II. В качестве альтернативы, кшРНК можно синтезировать экзогенно (in vitro) путем транскрипции с вектора. Затем кшРНК можно ввести непосредственно в клетку. Предпочтительно молекула кшРНК содержит частичную последовательность ИЛ-11, ИЛ-HR или gp130. Длина последовательности кшРНК предпочтительно составляет от 40 до 100 оснований, более предпочтительно от 40 до 70 оснований. Длина стебля шпильки предпочтительно составляет от 19 до 30 пар оснований в длину. Стебель может содержать пары G-U для стабилизации шпилечной структуры.

Молекулы миРНК, более длинные молекулы дцРНК или молекулы мкРНК могут быть получены рекомбинантно путем транскрипции последовательности нуклеиновой кислоты, предпочтительно содержащейся в векторе. Предпочтительно молекула миРНК, более длинная молекула дцРНК или молекула мкРНК содержат частичную последовательность ИЛ-11, ИЛ-HRa или gp130.

В одном из вариантов реализации миРНК, более длинную дцРНК или мкРНК продуцируют эндогенно (внутри клетки) путем транскрипции с вектора. Вектор можно ввести в клетку любым из способов, известных в данной области техники. Экспрессия последовательности РНК необязательно может регулироваться с использованием тканеспецифичного промотора (например, специфичного для сердца, печени или почек). В дополнительном варианте реализации миРНК, более длинную дцРНК или мкРНК продуцируют экзогенно (in vitro) путем транскрипции с вектора.

Подходящими векторами могут быть олигонуклеотидные векторы, разработанные с возможностью экспрессии олигонуклеотидного агента, способного к подавлению ИЛ-11, ИЛ-HR или gp130. Такие векторы могут представлять собой вирусные векторы или плазмидные векторы. Терапевтический олигонуклеотид может быть включен в геном вирусного вектора и функционально связан с регуляторной последовательностью, например, промотором, управляющей его экспрессией. Термин функционально связанный может включать ситуацию, в которой выбранная нуклеотидная последовательность и регуляторная нуклеотидная последовательность ковалентно связаны таким образом, чтобы поместить экспрессию нуклеотидной последовательности под влияние или контроль указанной регуляторной последовательности. Таким образом, регуляторная последовательность функционально связана с выбранной нуклеотидной последовательностью, если указанная регуляторная последовательность способна осуществлять транскрипцию нуклеотидной последовательности, которая образует часть или всю указанную выбранную нуклеотидную последовательность.

Вирусные векторы, кодирующие экспрессируемые промотором последовательности миРНК, известны в данной области техники и обладают преимуществом долгосрочной экспрессии терапевтического олигонуклеотида. Примеры включают лентивирус (Nature 2009 Jan 22; 457(7228):426-433), аденовирус (Shen et al., FEBS Lett 2003 Mar 27;539(1-3)111-4) и ретровирусы (Barton and Medzhitov PNAS November 12, 2002 vol.99, no.23 14943-14945).

В других вариантах реализации можно разработать вектор разработан для доставки терапевтического олигонуклеотида в сайт, где требуется подавление экспрессии ИЛ-11, ИЛ-HR или gp130. Такие векторы обычно включают образование комплекса олигонуклеотида с положительно заряженным вектором (например, катионными пептидами, проникающими в клетки, катионными полимерами и дендримерами и катионными липидами); конъюгирование олигонуклеотида с низкомолекулярными соединениями (например, холестерином, желчными кислотами и липидами), полимерами, антителами и РНК; или инкапсулирование олигонуклеотида в составы наночастиц (Wang et al., AAPS J. 2010 Dec; 12(4): 492-503).

В одном из вариантов реализации вектор может содержать нуклеотидную последовательность как в смысловой, так и в антисмысловой ориентации, так что при экспрессии в виде РНК смысловые и антисмысловые участки будут ассоциировать с образованием двуцепочечной РНК.

В качестве альтернативы, молекулы миРНК могут быть синтезированы с использованием стандартных методик твердофазного или жидкофазного синтеза, известных в данной области техники. Связи между нуклеотидами могут представлять собой фосфодиэфирные связи или альтернативы, например, связывающие группы формулы P(O)S, (тиоэфир); P(S)S, (дитиоэфир); P(O)NR'2; P(O)R'; P(O)OR6; сО; или CONR'2, где R представляет собой Н (или соль) или алкил (1-12С), a R6 представляет собой алкил (1-9С), присоединенный к соседним нуклеотидам через -О- или -S-.

Модифицированные нуклеотидные основания могут быть использованы в дополнение к встречаю

- 28 050147 щимся в природе основаниям и могут придавать выгодные свойства содержащим их молекулам миРНК.

Например, модифицированные основания могут повышать стабильность молекулы миРНК, тем самым уменьшая количество, необходимое для сайленсинга. Включение модифицированных оснований также может обеспечить молекулы миРНК, которые являются более или менее стабильными, чем немодифицированные миРНК.

Термин модифицированное нуклеотидное основание охватывает нуклеотиды с ковалентно модифицированным основанием и/или углеводной группой. Например, модифицированные нуклеотиды включают нуклеотиды, содержащие углеводы, ковалентно связанные с низкомолекулярными органическими группами, отличными от гидроксильной группы в 3'-положении и отличными от фосфатной группы в 5'-положении. Таким образом, модифицированные нуклеотиды могут также включать 2'замещенные углеводы, например, 2'-О-метил-; 2'-О-алкил; 2'-О-аллил; 2'-S-алкил; 2'-S-аллил; 2'-фтор-; 2'галоген или азидорибозу, карбоциклические аналоги углеводов, α-аномерные углеводы; эпимерные углеводы, например, арабинозу, ксилозы или ликсозы, пиранозные углеводы, фуранозные углеводы и седогептулозу.

Модифицированные нуклеотиды известны в данной области техники и включают алкилированные пурины и пиримидины, ацилированные пурины и пиримидины и другие гетероциклы. Эти классы пиримидинов и пуринов известны в данной области техники и включают псевдоизоцитозин, N4,N4этанцитозин, 8-гидрокси-И6-метиладенин, 4-ацетилцитозин, 5-(карбоксигидроксилметил)урацил, 5фторурацил, 5-бромурацил, 5-карбоксиметиламинометил-2-тиоурацил, 5карбоксиметиламинометилурацил, дигидроурацил, инозин, N6-изопентиладенин, 1-метиладенин, 1метилпсевдоурацил, 1-метилгуанин, 2,2-диметилгуанин, 2-метиладенин, 2-метилгуанин, 3-метилцитозин, 5-метилцитозин, N6-метиладенин, 7-метилгуанин, 5-метиламинометилурацил, 5-метоксиаминометил-2тиоурацил, -D-маннозилквеуозин, 5-метоксикарбонилметилурацил, 5-метоксиурацил, 2-метилтио-N6изопентениладенин, метиловый эфир урацил-5-оксиуксусной кислоты, псевдоурацил, 2-тиоцитозин, 5метил-2-тиоурацил, 2-тиоурацил, 4-тиоурацил, 5-метилурацил, метиловый эфир N-урαцил-5оксиуксусной кислоты, урацил 5-оксиуксусную кислоту, квеуозин, 2-тиоцитозин, 5-пропилурацил, 5пропилцитозин, 5-этилурацил, 5-этилцитозин, 5-бутилурацил, 5-пентилурацил, 5-пентилцитозин и 2,6диаминопурин, метилпсевдоурацил, 1-метилгуанин, 1-метилцитозин.

В данной области техники известны способы, относящиеся к применению РНКи для сайленсинга генов у С. elegans, Drosophila, растений и млекопитающих (Fire A, et al., 1998 Nature 391:806-811; Fire, A. Trends Genet. 15, 358-363 (1999); Sharp, P. A. RNA interference 2001. Genes Dev. 15, 485-490 (2001); Hammond, S.M., et al., Nature Rev. Genet. 2, 110-1119 (2001); Tuschl, T. Chem. Biochem. 2, 239-245 (2001); Hamilton, A. et al., Science 286, 950-952 (1999); Hammond, S. M., et al., Nature 404, 293-296 (2000); Zamore, P.D., et al., Cell 101, 25-33 (2000); Bernstein, E., et al., Nature 409, 363-366 (2001); Elbashir, S. M., et al., Genes Dev. 15, 188-200 (2001); WO0129058; WO9932619, и Elbashir S M, et al., 2001 Nature 411:494-498).

Соответственно, настоящее изобретение относится к нуклеиновой кислоте, способной при надлежащем введении в клетку млекопитающего, например, человека, которая в противном случае экспрессирует ИЛ-11, ИЛ-HRa или gp130, или экспрессии в ней подавлять экспрессию ИЛ-11, ИЛ-HRa или gp130 посредством РНКи.

Можно конструировать нуклеотидные последовательности олигонуклеотидов для ИЛ-11, ИЛ-HRa и gp130 (например, известные последовательности мРНК, доступные в GenBank под номерами доступа: ВС012506.1 GI:15341754 (ИЛ-11 человека), ВС134354.1 GI:126632002 (ИЛ-11 мыши), AF347935.1 GI:13549072 (ИЛ-11 крысы), NM_001142784.2 GI:391353394 (ИЛ-HFa человека), NM_001163401.1 GI:254281268 (ИЛ-HRa мыши), NM_139116.1 GI:20806172 (ИЛ-HRa крысы), NM_001190981.1 GI:300244534 (gp130 человека), NM_010560.3 GI:225007624 (gp130 мыши), NM_001008725.3 GI:300244570 (gp130 крысы)), способные подавлять ИЛ-11, ИЛ-HRa или gp130 или осуществлять сайленсинг их экспрессии.

Нуклеиновая кислота может обладать существенной идентичностью последовательности по отношению к фрагменту мРНК ИЛ-11, ИЛ-HR или gp130, например, заданному под номерами доступа GenBank NM_000641.3 GI:391353405 (ИЛ-11), NM_001142784.2 GI:391353394 (ИЛ-HRa), NM_001190981.1 GI:300244534 (gp130), или последовательности, комплементарной указанной мРНК.

Нуклеиновая кислота может представлять собой двуцепочечную миРНК. (Как понятно специалисту и как поясняется ниже, молекула миРНК может также содержать короткую 3'-последовательность ДНК).

В качестве альтернативы, нуклеиновая кислота может представлять собой ДНК (обычно двуцепочечную ДНК), которая при транскрипции в клетке млекопитающего позволяет получить РНК, содержащую два комплементарных фрагмента, соединенные спейсером, так что РНК принимает форму шпильки при гибридизации комплементарных фрагментов друг с другом. В клетке млекопитающего шпилечная структура может отщепляться от молекулы ферментом DICER с получением двух различных, но гибридизованных молекул РНК.

В некоторых предпочтительных вариантах реализации мишенью указанной нуклеиновой кислоты обычно является последовательность одной из SEQ ID NO:4-7 (ИЛ-11) или одной из SEQ ID NO:8-11

- 29 050147 (ИЛ-HRa).

Ожидается, что только подходящими мишенями для РНКи являются одноцепочечные (т.е. не самогибридизующиеся) области транскрипта мРНК. Поэтому предполагается, что другие последовательности в мРНК-транскрипте ИЛ-11 или ИЛ-HRa, очень близкие к последовательности, представленной одной из SEQ ID NO:4-7 или 8-11, также могут быть подходящими мишенями для РНКи. Такие последовательности-мишени предпочтительно имеют длину 17-23 нуклеотида и предпочтительно перекрываются с одной из SEQ ID NO:4-7 или 8-11 по меньшей мере на 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 или все 19 нуклеотидов (на любом конце одной из SEQ ID NO:4-7 или 8-11).

Соответственно, настоящее изобретение относится к нуклеиновой кислоте, способной при введении подходящим образом в клетку млекопитающего, которая в противном случае экспрессирует ИЛ-11 или ИЛ-HRa, или экспрессии в такой клетке подавлять экспрессию ИЛ-11 или ИЛ-HRa посредством РНКи, причем мишенью указанной нуклеиновой кислоты обычно является последовательность одной из SEQ ID NO:4-7 или 8-11.

Под обычно является мишенью подразумевается, что мишенью указанной нуклеиновой кислоты может являться последовательность, перекрывающаяся с SEQ ID NO:4-7 или 8-11. В частности, мишенью указанной нуклеиновой кислоты может являться последовательность в мРНК ИЛ-11 или ИЛ-HR человека, длина которой немного больше или меньше, чем длина одной из SEQ ID NO:4-7 или 8-11 (предпочтительно составляет 17-23 нуклеотида), но в остальном идентичная одной из SEQ ID NO:4-7 или 8-11.

Ожидается, что идеальная идентичность/комплементарность между нуклеиновой кислотой согласно настоящему изобретению и последовательностью-мишенью является предпочтительной, но не принципиальной. Соответственно, нуклеиновая кислота согласно настоящему изобретению может включать одно несовпадение с мРНК ИЛ-11 или ИЛ-HRa. Вместе с тем ожидается, что наличие даже одного несовпадения может привести к снижению эффективности, поэтому предпочтение отдается отсутствию несовпадений. При наличии 3'-липких концов их можно исключить из рассмотрения количества несовпадений.

Термин комплементарность не ограничивается обычным спариванием оснований между нуклеиновой кислотой, состоящей из природных рибо- и/или дезоксирибонуклеотидов, но также включает спаривание оснований между мРНК и нуклеиновыми кислотами согласно настоящему изобретению, содержащими неприродные нуклеотиды.

В одном из вариантов реализации нуклеиновая кислота (называемая в настоящей заявке двуцепочечной миРНК) содержит последовательности двуцепочечной РНК, представленные в SEQ ID NO:12-15. В еще одном варианте реализации нуклеиновая кислота (называемая в настоящей заявке двуцепочечной миРНК) содержит последовательности двуцепочечной РНК, представленные в SEQ ID NO:16-19.

В то же время ожидается, что несколько более короткие или более длинные последовательности против той же области мРНК ИЛ-11 или ИЛ-HRa также будут эффективными. В частности, ожидается, что двуцепочечные последовательности длиной от 17 до 23 п. н. также будут эффективными.

Цепи, образующие двуцепочечную РНК, могут содержать короткие динуклеотидные 3'-липкие концы, которые могут представлять собой ДНК или РНК. Использование 3'-липкого конца ДНК не влияет на активность миРНК по сравнению с 3'-липким концом РНК, но снижает стоимость химического синтеза цепей нуклеиновой кислоты (Elbashir et al., 2001c). По этой причине динуклеотиды ДНК могут быть предпочтительными.

При наличии динуклеотидных липких концов они могут быть симметричны друг другу, хотя это не является обязательным. 3'-липкий конец смысловой (верхней) цепи фактически не влияет на активность РНКи, так как он не участвует в распознавании и разрушении мРНК (Elbashir et al., 2001а, 2001b, 2001c).

Хотя эксперименты с РНКи на Drosophila показывают, что антисмысловые 3'-липкие концы могут участвовать в распознавании мРНК и адресном воздействии на нее (Elbashir et al. 2001c), и 3'-липкие концы, по-видимому, не являются необходимыми для активности РНКи миРНК в клетках млекопитающих. Поэтому считается, что неправильный отжиг 3'-липких концов оказывает незначительное влияние на клетки млекопитающих (Elbashir et al.2001c; Czauderna et al. 2003).

Поэтому в антисмысловой цепи миРНК можно использовать любой динуклеотидный липкий конец. Тем не менее, динуклеотид предпочтительно представляет собой -UU или -UG (или -ТТ или -TG, если липкий конец представляет собой ДНК), более предпочтительно -UU (или -ТТ). Динуклеотидный липкий конец -UU (или -ТТ) наиболее эффективен и согласуется с (т.е. способен образовывать часть) сигналом терминации транскрипции РНК-полимеразой III (сигнал терминатора представляет собой ТТТТТ). Соответственно, этот динуклеотид является наиболее предпочтительным. Кроме того, можно использовать динуклеотиды АА, СС и GG, однако они менее эффективны и, следовательно, менее предпочтительны.

Более того, 3'-липкие концы можно полностью исключить из миРНК.

Настоящее изобретение также относится к одноцепочечным нуклеиновым кислотам (называемым в настоящей заявке одноцепочечными миРНК), соответственно состоящим из цепи-компонента одной из вышеупомянутых двуцепочечных нуклеиновых кислот, предпочтительно, но необязательно содержащи

- 30 050147 ми З'-липкие концы. Настоящее изобретение также относится к наборам, содержащим пары таких одноцепочечных нуклеиновых кислот, которые способны гибридизоваться друг с другом in vitro с образованием вышеупомянутых двуцепочечных миРНК, которые затем можно вводить в клетки.

Настоящее изобретение также относится к ДНК, которая при транскрипции в клетке млекопитающего позволяет получить РНК (также называемую в настоящей заявке кшРНК), содержащую два комплементарных фрагмента, способные к самогибридизации с образованием двуцепочечного мотива, например, включающего последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO :12-15 или 16-19, или последовательность, которая отличается от любой из вышеупомянутых последовательностей заменой одной пары оснований.

Комплементарные фрагменты, как правило, соединены спейсером подходящей длины, последовательность которого позволяет двум комплементарным фрагментам гибридизоваться друг с другом. Два комплементарных (т.е. смысловой и антисмысловой) фрагменты могут быть соединены от 5'-конца к 3'концу в любом порядке. Спейсер обычно представляет собой короткую последовательность, состоящую из приблизительно 4-12 нуклеотидов, предпочтительно 4-9 нуклеотидов, более предпочтительно 6-9 нуклеотидов.

Предпочтительно, 5'-конец спейсера (расположенный непосредственно с 3'-конца от расположенного против хода транскрипции комплементарного фрагмента) состоит из нуклеотидов -UU- или -UG-, предпочтительно -UU- (хотя, опять же, использование этих конкретных динуклеотидов не является принципиальным). Подходящим спейсером, рекомендованным для применения в системе pSuper от OligoEngine (Сиэтл, штат Вашингтон, США), является UUCAAGAGA. В этом и других случаях концы спейсера могут гибридизоваться друг с другом, например, удлиняя двуцепочечный мотив за пределы точных последовательностей SEQ ID NO:12-15 или 16-19 на небольшое количество (например, 1 или 2) пар оснований.

Подобным образом транскрибированная РНК предпочтительно включает 3'-липкий конец из расположенном по ходу транкрипции комплементарном фрагменте. Предпочтительно он представляет собой UU или -UG, более предпочтительно -UU.

Такие молекулы кшРНК затем могут расщепляться в клетке млекопитающего ферментом DICER с получением двуцепочечной миРНК, описанной выше, причем одна или каждая цепь гибридизированной дцРНК содержит 3'-липкий конец.

Разумеется, методики синтеза нуклеиновых кислот согласно настоящему изобретению хорошо известны в данной области техники.

Специалист в полной мере способен сконструировать подходящие векторы для транскрипции ДНК согласно настоящему изобретению, используя хорошо известные методики и коммерчески доступные материалы. В частности, ДНК ассоциируют с контрольными последовательностями, включающими промотор и последовательность терминации транскрипции.

Особенно подходящими являются коммерчески доступные системы pSuper и pSuperior от OligoEngine (Сиэтл, штат Вашингтон, США). В них использован промотор полимеразы III (H1) и последовательность терминатора транскрипции Т5, которая вносит два остатка U на 3'-конец транскрипта (которые после процессинга посредством DICER обеспечивают 3'-UU-липкий конец одной цепи миРНК).

Другая подходящая система описана в Shin et al. (RNA, 2009 May; 15(5): 898-910), где используется другой промотор полимеразы III (U6).

Двуцепочечные миРНК согласно настоящему изобретению можно вводить в клетки млекопитающих in vitro или in vivo с использованием известных методик, описанных ниже, для подавления экспрессии ИЛ-11 или рецептора ИЛ-11.

Аналогичным образом векторы транскрипции, содержащие ДНК согласно настоящему изобретению, можно вводить в опухолевые клетки in vitro или in vivo с использованием известных методик, описанных ниже, для временной или стабильной экспрессии РНК для подавления экспрессии ИЛ-11 или рецептора ИЛ-11.

Соответственно, настоящее изобретение также относится к способу подавления экспрессии ИЛ-11 или рецептора ИЛ-11 в клетке млекопитающего, например, человека, включающему введение в указанную клетку двуцепочечной миРНК согласно настоящему изобретению или вектора для транскрипции согласно настоящему изобретению.

Аналогичным образом, настоящее изобретение также относится к способу лечения метаболического заболевания, включающему введение субъекту двуцепочечной миРНК согласно настоящему изобретению или вектора для транскрипции согласно настоящему изобретению.

Кроме того, настоящее изобретение относится к двуцепочечным миРНК согласно настоящему изобретению и векторам для транскрипции согласно настоящему изобретению для применения в способе лечения, предпочтительно в способе лечения метаболического заболевания.

Кроме того, настоящее изобретение относится к применению двуцепочечных миРНК согласно настоящему изобретению и векторов для транскрипции согласно настоящему изобретению для получения лекарственного средства для лечения метаболического заболевания.

Кроме того, настоящее изобретение относится к композиции, содержащей двуцепочечную миРНК

- 31 050147 согласно настоящему изобретению или вектор для транскрипции согласно настоящему изобретению в смеси с одним или более фармацевтически приемлемыми носителями. Подходящие носители включают липофильные носители или везикулы, которые могут способствовать проникновению через клеточную мембрану.

Материалы и способы, подходящие для введения двуцепочечных миРНК и ДНК-векторов согласно настоящему изобретению, хорошо известны в данной области техники, и в настоящее время разрабатываются улучшенные способы с учетом потенциала технологии РНКи.

В целом существует множество способов введения нуклеиновых кислот в клетки млекопитающих. Выбор способа зависит от того, переносят ли нуклеиновую кислоту в клетки, культивируемые in vitro, или в клетки пациента in vivo. Способы, подходящие для переноса нуклеиновой кислоты в клетки млекопитающих in vitro, включают применение липосом, электропорацию, микроинъекцию, слияние клеток, осаждение с ДЭАЭ, декстраном и фосфатом кальция. Способы переноса генов in vivo включают трансфекцию вирусными (как правило, ретровирусными) векторами и трансфекцию, опосредованную белком оболочки вируса и липосомами (Dzau et al. (2003) Trends in Biotechnology 11, 205-210).

В частности, подходящие способы введения нуклеиновых кислот в клетки согласно настоящему изобретению как in vitro, так и in vivo описаны в следующих статьях.

Общие обзоры. Borkhardt, A. 2002. Blocking oncogenes in malignant cells by RNA interference-new hope for a highly specific cancer treatment? Cancer Cell. 2:167-8. Hannon, G.J. 2002. RNA interference. Nature. 418:244-51. McManus, M.T., and P.A. Sharp. 2002. Gene silencing in mammals by small interfering RNAs. Nat Rev Genet. 3:737-47. Scherr, M., M.A. Morgan, and M. Eder. 2003b. Gene silencing mediated by small interfering RNAs in mammalian cells. Curr Med Chem. 10:245-56. Shuey, D.J., D.E. McCallus, and T. Giordano. 2002. RNAi: gene-silencing in therapeutic intervention. Drug Discov Today. 7:1040-6.

Системная доставка с использованием липосом. Lewis, D.L., J.E. Hagstrom, A.G. Loomis, J.A. Wolff, and H. Herweijer. 2002. Efficient delivery of siRNA for inhibition of gene expression in postnatal mice. Nat Genet. 32:107-8. Paul, СР., P.D. Good, I. Winer, and D.R. Engelke. 2002. Effective expression of small interfering RNA in human cells. Nat Biotechnol. 20:505-8. Song, E., S.K. Lee, J. Wang, N. Ince, N. Ouyang, J. Min, J. Chen, P. Shankar, and J. Lieberman. 2003. RNA interference targeting Fas protects mice from fulminant hepatitis. Nat Med. 9:347-51. Sorensen, D.R., M. Leirdal, and M. Sioud. 2003. Gene silencing by systemic delivery of synthetic siRNAs in adult mice. J Mol Biol. 327:761-6.

Вирус-опосредованный перенос. Abbas-Terki, Т., W. Blanco-Bose, N. Deglon, W. Pralong, and P. Aebischer. 2002. Lentiviral-mediated RNA interference. Hum Gene Ther. 13:2197-201. Barton, G.M., and R. Medzhitov. 2002. Retroviral delivery of small interfering RNA into primary cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 99:14943-5. Devroe, E., and P.A. Silver. 2002. Retrovirus-delivered siRNA. BMC Biotechnol. 2:15. Lori, F., P. Guallini, L. Galluzzi, and J. Lisziewicz. 2002. Gene therapy approaches to HIV infection. Am J Pharmacogenomics. 2:245-52. Matta, H., B. Hozayev, R. Tomar, P. Chugh, and P.M. Chaudhary. 2003. Use of lentiviral vectors for delivery of small interfering RNA. Cancer Biol Ther. 2:206-10. Qin, X.F., D.S. An, I.S. Chen, and D. Baltimore. 2003. Inhibiting HIV-1 infection in human T cells by lentiviral-mediated delivery of small interfering RNA against CCR5. Proc Natl Acad Sci USA. 100:183-8. Scherr, M., K. Battmer, A. Ganser, and M. Eder. 2003a. Modulation of gene expression by lentiviral-mediated delivery of small interfering RNA. Cell Cycle. 2:251-7. Shen, C, A.K. Buck, X. Liu, M. Winkler, and S.N. Reske. 2003. Gene silencing by adenovirusdelivered siRNA. FEBS Lett. 539:111-4.

Доставка пептидов.

Morris, M.C., L. Chaloin, F. Heitz, and G. Divita. 2000. Translocating peptides and proteins and their use for gene delivery. Curr Opin Biotechnol. 11:461-6. Simeoni, F., M.C. Morris, F. Heitz, and G. Divita. 2003. Insight into the mechanism of the peptide-based gene delivery system MPG: implications for delivery of siRNA into mammalian cells. Nucleic Acids Res. 31:2717-24. Другие технологии, которые могут быть подходящими для доставки миРНК в клетки-мишени, основаны на наночастицах или нанокапсулах, например, описанных в патентах США № 6649192В и 5843509В.

Ингибирование сигнального пути, опосредованного ИЛ-11.

В вариантах реализации настоящего изобретения агенты, способные ингибировать действие ИЛ-11, могут обладать одним или более из следующих функциональных свойств:

ингибирование сигнального пути, опосредованного ИЛ-11;

ингибирование сигнального пути, опосредованного связыванием ИЛ-11 с комплексом ИЛ11Rα:рецептор gp130;

ингибирование сигнального пути, опосредованного связыванием комплекса ИЛ-11:ИЛ-11Rα c gp130 (т.е. транс-сигнального пути ИЛ-11);

ингибирование процесса, опосредованного ИЛ-11;

ингибирование экспрессии генов/белков ИЛ-11 и/или ИЛ-11Ra.

Эти свойства можно определить путем анализа соответствующего агента в подходящем анализе, который может включать сравнение характеристик агента с подходящими контрольными агентами. Специалист может определить подходящие условия контроля для отдельно взятого анализа.

- 32 050147

Сигнальный путь, опосредованный ИЛ-11 и/или процессы, опосредованные ИЛ-11, включают сигнальный путь, опосредованный фрагментами ИЛ-11 и полипептидными комплексами, содержащими ИЛ11 или его фрагменты. Сигнальный путь, опосредованный ИЛ-11, может представлять собой сигнальный путь, опосредованный ИЛ-11 человека и/или ИЛ-11 мыши. Сигнальный путь, опосредованный ИЛ-11, может иметь место после связывания ИЛ-11 или комплекса, содержащего ИЛ-11, с рецептором, с которым связывается ИЛ-11 или указанный комплекс.

В некоторых вариантах реализации агент может ингибировать биологическую активность ИЛ-11 или комплекса, содержащего ИЛ-11.

В некоторых вариантах реализации агент является антагонистом одного или более сигнальных путей, активируемых сигнальным путем через рецептор, содержащий ИЛ-HRa и/или gp130, например, ИЛ-11Rα:gp130. В некоторых вариантах реализации агент способен ингибировать сигнальный путь посредством одного или более иммунных рецепторных комплексов, содержащих ИЛ-HRa и/или gp130, например, ИЛ-11Rα:gp130. В различных аспектах настоящего изобретения агент, предложенный в настоящей заявке, способен ингибировать цис- и/или транс-сигнальный путь, опосредованный ИЛ-11. В некоторых вариантах реализации в соответствии с различными аспектами настоящего изобретения агент, предложенный в настоящей заявке, способен ингибировать цис-сигнальный путь, опосредованный ИЛ11.

В некоторых вариантах реализации агент может ингибировать сигнальный путь, опосредованный ИЛ-11 до менее чем 100%, например, 99% или менее, 95% или менее, 90% или менее, 85% или менее, 80% или менее, 75% или менее, 70% или менее, 65% или менее, 60% или менее, 55% или менее, 50% или менее, 45% или менее, 40% или менее, 35% или менее, 30% или менее, 25% или менее, 20% или менее, 15% или менее, 10% или менее, 5% или менее или 1% или менее от активности сигнального пути в отсутствие агента (или в присутствии подходящего контрольного агента). В некоторых вариантах реализации агент может подавлять сигнальный путь, опосредованный ИЛ-11, до менее чем 1-кратного, например, до <0,99-кратного, <0,95-кратного, <0,9-кратного, <0,85-кратного, <0,8-кратного, <0,75-кратного, <0,7-кратного, <0,65-кратного, <0,6-кратного, <0,55-кратного, <0,5-кратного, <0,45-кратного, <0,4кратного, <0,35-кратного, <0,3-кратного, <0,25-кратного, <0,2-кратного, <0,15-кратного, <0,1-кратного уровня от активности сигнального пути в отсутствие агента (или в присутствии подходящего контрольного агента).

В некоторых вариантах реализации сигнальный путь, опосредованный ИЛ-11, может представлять собой сигнальный путь, опосредованный связыванием ИЛ-11 с рецептором ИЛ-11Rα:gp130. Такой сигнальный путь можно анализировать, например, путем обработки клеток, экспрессирующих ИЛ-HRa и gp130, с помощью ИЛ-11, или путем стимуляции продукции ИЛ-11 в клетках, экспрессирующих ИЛ11Ra и gp130.

IC₅₀ агента для ингибирования сигнального пути, опосредованного ИЛ-11, можно определить, например, путем культивирования клеток Ba/F3, экспрессирующих ИЛ-11Ra и gp130, в присутствии ИЛ-11 человека и указанного агента, и измерения включения 3H-тимидина в ДНК. В некоторых вариантах реализации агент может демонстрировать IC₅₀ в таком анализе, равную 10 мкг/мл или менее, предпочтительно <5 мкг/мл, <4 мкг/мл, <3,5 мкг/мл, <3 мкг/мл, <2 мкг/мл, <1 мкг/мл, <0,9 мкг/мл, <0,8 мкг/мл, <0,7 мкг/мл, <0,6 мкг/мл или <0,5 мкг/мл.

В некоторых вариантах реализации сигнальный путь, опосредованный ИЛ-11, может представлять собой сигнальный путь, опосредованный связыванием комплекса ИЛ-11:ИЛ-11Rα с gp130. В некоторых вариантах реализации комплекс ИЛ-11:ИЛ-11Rα может быть растворимым, например, комплекс внеклеточного домена ИЛ-HRa и ИЛ-11, или комплекс растворимой изоформы/фрагмента ИЛ-HRa и ИЛ-11. В некоторых вариантах реализации растворимый ИЛ-HRa представляет собой растворимую (секретируемую) изоформу ИЛ-HRa, или представляет собой продукт, высвобождаемый при протеолитическом расщеплении внеклеточного домена ИЛ-11Ra, связанного с клеточной мембраной.

В некоторых вариантах реализации комплекс ИЛ-11:ИЛ-11Rα может быть связан с клеткой, например, комплекс ИЛ-11Ra и ИЛ-11, связанного с клеточной мембраной. Сигнальный путь, опосредованный связыванием комплекса ИЛ-11:ИЛ-11Rα с gp130, можно анализировать путем обработки клеток, экспрессирующих gp130, комплексом ИЛ-11:ИЛ-11Rα, например, рекомбинантным гибридным белком, содержащим ИЛ-11, соединенный пептидным линкером с внеклеточным доменом ИЛ-HRa, например, hyper ИЛ-11. Hyper ИЛ-11 конструировали с использованием фрагментов ИЛ-HRa (аминокислотные остатки с 1 по 317, состоящие из доменов 1-3; UniProtKB: Q14626) и ИЛ-11 (аминокислотные остатки с 22 по 199 из UniProtKB: P20809) с линкером из 20 аминокислот (SEQ ID NO:20). Аминокислотная последовательность Hyper ИЛ-11 представлена в SEQ ID NO:21.

В некоторых вариантах реализации агент может ингибировать сигнальный путь, опосредованный связыванием комплекса ИЛ-11:ИЛ-11Rα c gp130, и также способен ингибировать сигнальный путь, опосредованный связыванием ИЛ-11 с рецептором ИЛ-11Ra:gp130.

В некоторых вариантах реализации агент может ингибировать процесс, опосредованный ИЛ-11.

- 33 050147

В некоторых вариантах реализации агент может ингибировать экспрессию генов/белков ИЛ-11 и/или ИЛ-HRa. Экспрессию генов и/или белков можно измерять, как описано в настоящей заявке, или способами в данной области техники, хорошо известными специалисту в данной области техники.

В некоторых вариантах реализации агент может ингибировать экспрессию генов/белков ИЛ-11 и/или ИЛ-HRa до менее чем 100%, например, 99% или менее, 95% или менее, 90% или менее, 85% или менее, 80% или менее, 75% или менее, 70% или менее, 65% или менее, 60% или менее, 55% или менее, 50% или менее, 45% или менее, 40% или менее, 35% или менее, 30% или менее, 25% или менее, 20% или менее, 15% или менее, 10% или менее, 5% или менее или 1% или менее от уровня экспрессии в отсутствие агента (или в присутствии подходящего контрольного агента). В некоторых вариантах реализации агент может ингибировать экспрессию генов/белков ИЛ-11 и/или ИЛ-HRa до менее чем 1-кратного, например, до <0,99-кратного, <0,95-кратного, <0,9-кратного, <0,85-кратного, <0,8-кратного, <0,75-кратного, <0,7-кратного, <0,65-кратного, <0,6-кратного, <0,55-кратного, <0,5-кратного, <0,45-кратного, <0,4кратного, <0,35-кратного, <0,3-кратного, <0,25-кратного, <0,2-кратного, <0,15-кратного, <0,1-кратного от уровня экспрессии в отсутствие агента (или в присутствии подходящего контрольного агента).

Лечение/профилактика метаболических заболеваний.

В настоящем изобретении предложены способы и изделия (агенты и композиции) для лечения и/или профилактики метаболических заболеваний, например, метаболических заболеваний, описанных в настоящем документе.

Лечение осуществляется путем ингибирования сигнального пути, опосредованного ИЛ-11 (т.е. антагонизма сигнального пути, опосредованного ИЛ-11). Таким образом, в настоящем изобретении предложено лечение/профилактика метаболических заболеваний посредством ингибирования сигнального пути, опосредованного ИЛ-11, например, в клетке, ткани/органе/системе органов/организме субъекта. В некоторых вариантах реализации ингибирование сигнального пути, опосредованного ИЛ-11, согласно настоящему изобретению включает ингибирование сигнального пути, опосредованного ИЛ-11, в клетках печени (например, гепатоцитах).

Соответственно, в настоящем изобретении предложен агент, способный ингибировать сигнальный путь, опосредованный интерлейкином-11 (ИЛ-11), для применения в способе лечения или профилактики метаболического заболевания.

Кроме того, предложено применение агента, способного ингибировать сигнальный путь, опосредованный интерлейкином-11 (ИЛ-11), для применения при производстве лекарственного средства для применения в способе лечения или профилактики метаболического заболевания.

Кроме того, предложен способ лечения или профилактики метаболического заболевания, включающий введение субъекту, нуждающемуся в лечении, терапевтически эффективного количества агента, способного ингибировать сигнальный путь, опосредованный интерлейкином-11 (ИЛ-11).

Применимость настоящего изобретения распространяется на лечение/профилактику любого метаболического заболевания. В настоящем изобретении также предложено лечение/профилактика заболеваний/состояний, вызванных или усугубляемых метаболическим заболеванием. В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения предложено лечение/профилактика заболеваний/состояний у субъекта, для которого метаболическое заболевание обеспечивает плохой прогноз.

В некоторых вариантах реализации изобретения метаболическое заболевание, подлежащее лечению/профилактике, может характеризоваться увеличением экспрессии ИЛ-11 и/или ИЛ-HRa (т.е. экспрессии гена и/или белка) в органе/ткани/организме субъекта, пораженных метаболическим заболеванием, например, по сравнению с нормальным органом/тканью/субъектом (т.е. в отсутствие метаболического заболевания).

Лечение/профилактику метаболического заболевания в соответствии с настоящим изобретением можно выполнять в отношении метаболического заболевания, ассоциированного с активацией ИЛ-11, например, активацией ИЛ-11 в клетках или тканях, в которых проявляются или могут возникать симптомы заболевания, или активацией внеклеточного ИЛ-11 или ИЛ-11Ra.

Метаболическое заболевание может поражать любую ткань, или орган, или систему органов. В некоторых вариантах реализации метаболическое заболевание может поражать несколько тканей/органов/систем органов.

В некоторых вариантах реализации метаболическое заболевание поражает одно или более из: печени, поджелудочной железы, сердечно-сосудистой системы, пищеварительной системы, выделительной системы, дыхательной системы, системы почек, репродуктивной системы, кровеносной системы, мышечной системы, эндокринной системы, экзокринной системы, лимфатической системы, иммунной системы, нервной системы и/или скелета.

В соответствии с различными аспектами, описанными в настоящем документе, в некоторых вариантах реализации метаболическое заболевание характеризуется пониженной функцией печени или пониженной функцией клеток печени (например, гепатоцитов) по сравнению с функцией в отсутствие метаболического заболевания. В некоторых вариантах реализации метаболическое заболевание характеризуется повышенными уровнями АЛТ и/или ACT и/или пониженными уровнями глутатиона (например, в

- 34 050147 сыворотке) по сравнению с уровнями в отсутствие метаболического заболевания.

В некоторых вариантах реализации метаболическое заболевание характеризуется воспалением и/или фиброзом печени. В некоторых вариантах реализации метаболическое заболевание характеризуется повышенной экспрессией провоспалительных и/или профиброзных факторов (например, ИЛ-11, ИЛ-6, CCL2 и/или CCL5) клетками печени (например, гепатоцитами) по сравнению с уровнями в отсутствие метаболического заболевания. В некоторых вариантах реализации метаболическое заболевание характеризуется повышенной экспрессией генов/белков коллагена клетками печени и/или повышенным содержанием коллагена в печени по сравнению с уровнями в отсутствие метаболического заболевания.

В некоторых вариантах реализации метаболическое заболевание характеризуется повышенным количеством/долей миофибробластов в печени по сравнению с количеством/долей миофибробластов в печени в отсутствие метаболического заболевания.

В некоторых вариантах реализации метаболическое заболевание характеризуется увеличением апоптоза и/или некроза клеток печени (например, гепатоцитов) по сравнению с уровнем в отсутствие метаболического заболевания. В некоторых вариантах реализации метаболическое заболевание характеризуется увеличением количества/доли апоптозных и/или некротических клеток печени по сравнению с количеством/долей в отсутствие метаболического заболевания.

В некоторых вариантах реализации метаболическое заболевание характеризуется повышенной экспрессией гена/белка синтазы жирных кислот (FASN) клетками печени (например, гепатоцитами) по сравнению с уровнями в отсутствие метаболического заболевания. В некоторых вариантах реализации метаболическое заболевание характеризуется повышенными уровнями активных форм кислорода (АФК) в клетках печени (например, гепатоцитах) по сравнению с уровнями в отсутствие метаболического заболевания. В некоторых вариантах реализации метаболическое заболевание характеризуется повышенной экспрессией гена/белка NOX4 клетками печени (например, гепатоцитами) по сравнению с уровнями в отсутствие метаболического заболевания. В некоторых вариантах реализации метаболическое заболевание характеризуется повышенными уровнями активации ERK и/или JNK в клетках печени (например, гепатоцитах) по сравнению с уровнями в отсутствие метаболического заболевания.

В некоторых вариантах реализации метаболическое заболевание характеризуется повышенными уровнями триглицеридов в печени или в клетках печени (например, гепатоцитах) по сравнению с уровнями в отсутствие метаболического заболевания. В некоторых вариантах реализации метаболическое заболевание характеризуется гипергликемией. В некоторых вариантах реализации метаболическое заболевание характеризуется гипертриглицеридемией. В некоторых вариантах реализации метаболическое заболевание характеризуется гиперхолестеринемией. В некоторых вариантах реализации метаболическое заболевание характеризуется повышенной массой тела по сравнению с массой тела в отсутствие метаболического заболевания. В некоторых вариантах реализации метаболическое заболевание характеризуется повышенной массой печени по сравнению с массой печени в отсутствие метаболического заболевания.

Лечение может эффективно уменьшать/задерживать/предотвращать развитие или прогрессирование метаболического заболевания. Лечение может эффективно уменьшать/задерживать/предотвращать ухудшение одного или более симптомов метаболического заболевания. Лечение может эффективно улучшать один или более из симптомов метаболического заболевания. Лечение может эффективно снижать тяжесть и/или устранять один или более из симптомов метаболического заболевания. Лечение может эффективно вызывать регрессию эффектов метаболического заболевания.

Профилактика может относиться к предотвращению развития метаболического заболевания и/или предотвращению ухудшения метаболического заболевания, например, предотвращению прогрессирования метаболического заболевания, например, до более поздней/хронической стадии.

В соответствии с различными аспектами настоящего изобретения способ лечения и/или профилактики метаболического заболевания согласно настоящему изобретению может включать одно или более из следующего:

снижение уровня липидов в крови;

снижение уровня глюкозы в крови;

повышение толерантности к глюкозе (например, у субъекта с непереносимостью глюкозы);

повышение толерантности к инсулину (например, у субъекта, резистентного к инсулину);

повышение функции поджелудочной железы;

снижение массы тела (например, у субъекта с избыточным весом/ожирением);

уменьшение жировой массы тела;

увеличение безжировой массы;

снижение уровня глюкозы в крови натощак;

снижение уровня триглицеридов в сыворотке;

снижение уровня холестерина в сыворотке;

повышение толерантности к глюкозе;

повышение функции поджелудочной железы (например, экзокринной и/или эндокринной функции);

усиление роста ткани поджелудочной железы;

- 35 050147 регенерация ткани поджелудочной железы;

увеличение массы поджелудочной железы;

ингибирование перехода PSC в миофибробласты с помощью PSC;

снижение количества/доли миофибробластов в поджелудочной железе;

снижение уровня гидроксипролина в поджелудочной железе;

снижение уровня коллагена в поджелудочной железе;

уменьшение повреждений поджелудочной железы;

снижение гиперплазии островковых клеток поджелудочной железы;

снижение экспрессии глюкагона;

повышение экспрессии инсулина;

увеличение массы тела (например, у субъекта с заболеванием, связанным с истощением, например, кахексией);

снижение экспрессии белка ИЛ-11 в печени;

снижение активации Erk в печени;

снижение активации JNK в печени;

снижение расщепления каспазы-3 в печени;

снижение уровня АФК в печени;

снижение экспрессии NOX4 в печени;

снижение стеатоза, например, печени;

снижение уровня триглицеридов в печени;

снижение экспрессии синтазы жирных кислот;

снижение уровня АЛТ и/или ACT в сыворотке;

снижение экспрессии провоспалительного фактора (например, ФНОа, CCL2, CCL5, ИЛ-6, CXCL5 и/или CXCL1);

снижение экспрессии профиброзного фактора (например, ИЛ-11, TIMP1, АСТА2, TGFe1, ММР2, TIMP2, ММР9, COL1A2, COL1A1 и/или COL3A1);

снижение уровня TGFe1 в сыворотке;

снижение экспрессии/продукции ИЛ-11, АСТА2, ММР2, TGFe1, PDGF, ANG II, bFGF, CCL2 и/или Н2О2 в HSC;

ингибирование перехода HSC в миофибробласт с помощью HSC;

снижение количества/доли миофибробластов в печени;

снижение уровня гидроксипролина в печени;

снижение уровня коллагена в печени;

повышение функции печени;

повышение уровня GSH в сыворотке;

повышение функции органа/ткани, пораженных метаболическим заболеванием;

снижение повреждений печени;

снижение гибели гепатоцитов;

снижение гибели клеток вследствие липотоксичности;

снижение активности сигнального пути, опосредованного ИЛ-11, в гепатоцитах; и снижение количества/доли CD45+ клеток в печени.

В соответствии с различными аспектами и вариантами реализации изобретения, описанными в настоящем документе, лечение/профилактика метаболического заболевания, в частности, включает ингибирование, снижение или профилактику липотоксичности, например, в данной системе органов/органе/ткани/типе клеток. В некоторых вариантах реализации лечение/профилактика метаболического заболевания включает ингибирование/снижение/профилактику липотоксичности в печени, например, в гепатоцитах.

Введение.

Введение агента, способного ингибировать сигнальный путь, опосредованный ИЛ-11, предпочтительно осуществляют в терапевтически эффективном или профилактически эффективном количестве, достаточном для демонстрации благоприятного эффекта у субъекта.

Фактическое вводимое количество, а также скорость и временная динамика введения зависят от природы и тяжести заболевания, а также природы агента. Назначение лечения, например, решение о дозировке и т.д., входит в сферу ответственности врачей общей практики и других врачей и, как правило, осуществляется с учетом заболевания/состояния, подлежащего лечению, состояния отдельного субъекта, места доставки, способа введения и других факторов, известных практикующим врачам. Примеры способов и протоколов, упомянутых выше, содержатся в Remington's Pharmaceutical Sciences, 20th Edition, 2000, pub. Lippincott, Williams & Wilkins.

Можно вводить несколько доз агента. Одна или более, или каждая из доз может сопровождаться одновременным или последовательным введением другого терапевтического агента.

Несколько доз могут быть разделены заданным интервалом времени, который может быть выбран

- 36 050147 из 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 или 31 дня, или 1, 2, 3, 4, 5 или 6 месяцев. Например, дозы можно вводить раз в 7, 14, 21 или 28 дней (плюсминус 3, 2 или 1 день).

Для терапевтического применения агенты, способные ингибировать сигнальный путь, опосредованный ИЛ-11, предпочтительно включают в состав лекарственного или фармацевтического средства вместе с одним или более другими фармацевтически приемлемыми ингредиентами, хорошо известными специалистам в данной области техники, включая фармацевтически приемлемые носители, адъюванты, вспомогательные вещества, разбавители, наполнители, буферы, консерванты, антиоксиданты, смазывающие вещества, стабилизаторы, солюбилизаторы, поверхностно-активные вещества (например, увлажнители), маскирующие агенты, красители, ароматизаторы и подсластители, но не ограничиваясь ими.

Термин фармацевтически приемлемый в настоящем документе относится к соединениям, ингредиентам, материалам, композициям, лекарственным формам и т.д., которые с медицинской точки зрения подходят для применения в контакте с тканями рассматриваемого субъекта (например, человека) и не вызывают чрезмерной токсичности, раздражения, аллергической реакции или других проблем или осложнений, соразмерных с разумным соотношением польза/риск. Каждый носитель, адъювант, вспомогательное вещество и т.д. также должны быть приемлемыми в смысле совместимости с другими ингредиентами препарата.

Подходящие носители, адъюванты, вспомогательные вещества и т.д. можно найти в стандартных фармацевтических пособиях, например, в Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th edition, Mack Publishing Company, Easton, Pa., 1990; и Handbook of Pharmaceutical Excipients, 2nd edition, 1994.

Составы можно получать любыми способами, хорошо известными в области фармацевтики. Такие способы включают стадию объединения активного соединения с носителем, который состоит из одного или более дополнительных ингредиентов. Как правило, составы готовят путем равномерного и тщательного объединения активного соединения с носителями (например, жидкими носителями, тонкоизмельченным твердым носителем и т.д.), а затем, при необходимости, формования продукта.

Можно получать составы для местного, парентерального, системного, внутривенного, внутриартериального, внутримышечного, интратекального, внутриглазного, внутриконъюнктивального, подкожного, перорального или трансдермального способов введения, которые могут включать инъекцию. Составы для инъекций могут содержать выбранный агент в стерильной или изотонической среде. Состав и способ введения можно выбирать в соответствии с агентом и заболеванием, подлежащим лечению.

Обнаружение ИЛ-11 и рецепторов ИЛ-11.

Некоторые аспекты и варианты реализации настоящего изобретения относятся к обнаружению экспрессии ИЛ-11 или рецептора ИЛ-11 (например, ИЛ-HRa, gp130 или комплекса, содержащего ИЛ-HRa и/или gp 130) в образце, полученном от субъекта.

В некоторых аспектах и вариантах реализации настоящее изобретение относится к повышению экспрессии (сверхэкспрессии) ИЛ-11 или рецептора ИЛ-11 (в виде белка или олигонуклеотида, кодирующего соответствующий ИЛ-11 или рецептор ИЛ-11) и обнаружению такого повышения в качестве индикатора пригодности для лечения агентом, способным ингибировать действие ИЛ-11, или агентом, способным предотвращать или снижать экспрессию ИЛ-11 или рецептора ИЛ-11.

Повышение экспрессии включает экспрессию на уровне, превышающем уровень, обычно ожидаемый для клетки или ткани данного типа. Повышение можно определить путем измерения уровня экспрессии соответствующего фактора в клетке или ткани. Можно сравнивать уровень экспрессии в образце клетки или ткани, полученном от субъекта, с эталонным уровнем экспрессии соответствующего фактора, например, значением или диапазоном значений, представляющих нормальный уровень экспрессии соответствующего фактора для того же самого или соответствующего типа клетки или ткани. В некоторых вариантах реализации эталонные уровни можно определять путем обнаружения экспрессии ИЛ-11 или рецептора ИЛ-11 в контрольном образце, например, в соответствующих клетках или ткани здорового субъекта или в здоровой ткани того же субъекта. В некоторых вариантах реализации эталонные уровни можно получать из градуировочной кривой или набора данных.

Можно количественно определять уровни экспрессии для абсолютного сравнения или выполнять относительные сравнения.

В некоторых вариантах реализации можно считать, что активация ИЛ-11 или рецептора ИЛ-11 (например, ИЛ-11Ra, gp130 или комплекса, содержащего ИЛ-11Ra и/или gp130) имеет место, когда уровень экспрессии в тестируемом образце по меньшей мере в 1,1 раза превышает эталонный уровень. Более предпочтительно, уровень экспрессии можно выбрать из уровня, по меньшей мере в 1,2, по меньшей мере в 1,3, по меньшей мере в 1,4, по меньшей мере в 1,5, по меньшей мере в 1,6, по меньшей мере в 1,7, по меньшей мере в 1,8, по меньшей мере в 1,9, по меньшей мере в 2,0, по меньшей мере в 2,1, по меньшей мере в 2,2, по меньшей мере в 2,3, по меньшей мере в 2,4 по меньшей мере в 2,5, по меньшей мере в 2,6, по меньшей мере в 2,7, по меньшей мере в 2,8, по меньшей мере в 2,9, по меньшей мере в 3,0, по меньшей мере в 3,5, по меньшей мере в 4,0, по меньшей мере в 5,0, по меньшей мере в 6,0, по меньшей мере в 7,0, по меньшей мере в 8,0, по меньшей мере в 9,0 или по меньшей мере в 10,0 раз превышающего эта

- 37 050147 лонный уровень.

Уровни экспрессии можно определять одним из ряда известных способов анализа in vitro, например, анализа на основе ПЦР, анализа на основе гибридизации in situ, анализа посредством проточной цитометрии, иммунологических или иммуногистохимических анализов.

Например, подходящие методики включают способ обнаружения уровня ИЛ-11 или рецептора ИЛ11 в образце путем приведения образца в контакт с агентом, способным связывать ИЛ-11 или рецептор ИЛ-11, и обнаружения образования комплекса агента и ИЛ-11 или рецептора ИЛ-11. Агент может представлять собой любую подходящую связывающую молекулу, например, антитело, полипептид, пептид, олигонуклеотид, аптамер или низкомолекулярное соединение, и необязательно может являться меченым для обеспечения возможности обнаружения, например, визуализации, образованных комплексов. Подходящие метки и средства для их обнаружения хорошо известны специалистам в данной области техники и включают флуоресцентные метки (например, флуоресцеин, родамин, эозин и NDB (нитробензоксадиазол), зеленый флуоресцентный белок (ЗФБ), хелаты редкоземельных элементов, например, европия (Eu), тербия (Tb) и самария (Sm), тетраметилродамин, техасский красный, 4-метилумбеллиферон, 7-амино-4метилкумарин, Су3, Су5), изотопные маркеры, радиоактивные изотопы (например, 32Р, 33Р, 35S), хемилюминесцентные метки (например, сложный эфир акридиния, люминол, изолюминол), ферменты (например, пероксидазу, щелочную фосфатазу, глюкозооксидазу, бета-галактозидазу, люциферазу), антитела, лиганды и рецепторы. Методики обнаружения хорошо известны специалистам в данной области техники и могут быть выбраны таким образом, чтобы они соответствовали агенту-метке. Подходящие методики включают ПЦР-амплификацию олигонуклеотидных меток, масс-спектрометрию, детекцию флуоресценции или цвета, например, при ферментативном превращении субстрата репортерным белком, или детекцию радиоактивности.

Можно разработать анализы с возможностью определения количества ИЛ-11 или рецептора ИЛ-11 в образце. Определенные количества ИЛ-11 или рецептора ИЛ-11 в тестируемом образце можно сравнивать с эталонными значениями, и это сравнение можно применять для определения того, содержит ли тестируемый образец количество ИЛ-11 или рецептора ИЛ-11, меньшее или большее эталонного значения для выбранного уровня статистической значимости.

Количественное определение обнаруженного ИЛ-11 или рецептора ИЛ-11 можно применять для определения активации или подавления или амплификации генов, кодирующих ИЛ-11 или рецептор ИЛ11. Если тестируемый образец содержит фиброзные клетки, такую активацию, подавление или амплификацию можно сравнить с эталонным значением с целью определения наличия или отсутствия статистически значимого различия.

Образец, полученный от субъекта, может быть любого вида. Биологический образец можно получить из любой ткани или физиологической жидкости, например, образца крови, образца, полученного из крови, образца сыворотки, образца лимфы, образца спермы, образца слюны, образца синовиальной жидкости. Образец, полученный из крови, может представлять собой выделенную фракцию крови пациента, например, выделенную фракцию, содержащую клетки, или фракцию плазмы или сыворотки. Образец может включать образец ткани или биоптат; или клетки, выделенные из субъекта. Образцы можно получать с помощью известных методик, например, биопсии или аспирации через иглу. Образцы можно хранить и/или обрабатывать для последующего определения уровней экспрессии ИЛ-11.

Образцы можно использовать для определения активации ИЛ-11 или рецептора ИЛ-11 у субъекта, у которого взят образец.

В некоторых предпочтительных вариантах реализации образец может представлять собой образец ткани, например, биоптат, взятый из ткани/органа, пораженного метаболическим заболеванием. Образец может содержать клетки.

Субъект может быть выбран для лечения/профилактики согласно настоящему изобретению на основании определения того, что у субъекта повышен уровень экспрессии ИЛ-11 или рецептора ИЛ-11 (например, ИЛ-HR, gp130 или комплекса, содержащего ИЛ-HRa и/или gp130). Повышенная экспрессия ИЛ-11 или рецептора ИЛ-11 может служить маркером метаболического заболевания, подходящего для лечения агентом, способным ингибировать сигнальный путь, опосредованный ИЛ-11.

Активация может иметь место в данной ткани или в отдельных клетках данной ткани. Предпочтительной тканью может быть ткань печени или ткань поджелудочной железы.

Повышение экспрессии ИЛ-11 или рецептора ИЛ-11 также можно определять в циркулирующей жидкости, например, в крови, или в образце, полученном из крови. Активация может относиться к внеклеточному ИЛ-11 или ИЛ-HRa. В некоторых вариантах реализации экспрессия может быть повышена локально или системно.

После отбора субъекту можно ввести агент, способный ингибировать сигнальный путь, опосредованный ИЛ-11.

Диагностика и прогноз.

Выявление повышения экспрессии ИЛ-11 или рецептора ИЛ-11 (например, ИЛ-HRa, gp130 или комплекса, содержащего ИЛ-HRa и/или gp130) также можно применять в способе диагностики метабо

- 38 050147 лического заболевания, выявления субъекта с риском развития метаболического заболевания, и в способах прогнозирования или предсказания реакции субъекта на лечение агентом, способным ингибировать сигнальный путь, опосредованный ИЛ-11.

Развитие и другие формы этого слова могут относиться к возникновению расстройства/заболевания или продолжению или прогрессированию расстройства/заболевания.

В некоторых вариантах реализации у субъекта может быть подозрение на наличие метаболического заболевания, например, на основании наличия других симптомов, свидетельствующих о метаболическом заболевании в организме субъекта или в отдельных клетках/тканях организма субъекта, или субъекта можно считать подверженным риску развития метаболического заболевания, например, из-за генетической предрасположенности или воздействия внешних условий, которые являются известными факторами риска развития метаболического заболевания. Определение повышения экспрессии ИЛ-11 или рецептора ИЛ-11 может подтвердить диагноз или предполагаемый диагноз, или может подтвердить, что субъект подвержен риску развития метаболического заболевания. Посредством определения также возможно диагностировать, что метаболическое заболевание или предрасположенность подходят для лечения агентом, способным ингибировать сигнальный путь, опосредованный ИЛ-11.

Таким образом, можно предложить способ обеспечения прогноза для субъекта с метаболическим заболеванием или подозрением на него, причем указанный способ включает определение наличия или отсутствия повышенной экспрессии ИЛ-11 или рецептора ИЛ-11 в образце, полученном от указанного субъекта, и, на основании указанного определения, обеспечение прогноза лечения указанного субъекта агентом, способным ингибировать сигнальный путь, опосредованный ИЛ-11.

В некоторых аспектах способы диагностики или способы прогнозирования или предсказания реакции субъекта на лечение агентом, способным ингибировать сигнальный путь, опосредованный ИЛ-11, могут не требовать определения экспрессии ИЛ-11 или рецептора ИЛ-11, а могут основываться на определении генетических факторов у субъекта, которые являются прогностическими факторами повышения экспрессии или активности. Такие генетические факторы могут включать определение генетических мутаций, однонуклеотидных полиморфизмов (ОНП) или амплификации генов ИЛ-11, ИЛ-HRa и/или gp130, которые коррелируют с и/или являются прогностическими факторами повышения экспрессии или активности указанных генов и/или сигнального пути, опосредованного ИЛ-11. Использование генетических факторов для прогнозирования предрасположенности к патологическому состоянию или реакции на лечение известно в данной области техники, см., например, см. Peter Starkel Gut 2008;57:440-442; Wright et al., Mol. Cell. Biol. March 2010 vol. 30 no. 6 1411-1420.

Генетические факторы можно анализировать способами, известными специалистам в данной области техники, включая анализы на основе ПЦР, например, количественную ПЦР, конкурентную ПЦР. Посредством определения наличия генетических факторов, например, в образце, полученном от субъекта, можно подтвердить диагноз и/или классифицировать субъекта как подверженного риску развития метаболического заболевания, и/или выявить субъекта, подходящего для лечения агентом, способным ингибировать сигнальный путь, опосредованный ИЛ-11.

Некоторые способы могут включать определение наличия одного или более ОНП, связанных с секрецией ИЛ-11, или предрасположенности к развитию метаболического заболевания. ОНП обычно являются биаллельными и, следовательно, их легко обнаруживать с использованием одного из ряда обычных анализов, известных специалистам в данной области техники (см., например, Anthony J.Brookes. The essence of SNPs. Gene Volume 234, Issue 2, 8 July 1999, 177-186; Fan et al., Highly Parallel SNP Genotyping. Cold Spring Harb Symp Quant Biol 2003. 68: 69-78; Matsuzaki et al., Parallel Genotyping of Over 10,000 SNPs using a one-primer assay on a high-density oligonucleotide array. Genome Res. 2004. 14: 414-425).

Указанные способы могут включать определение того, какой аллель ОНП присутствует в образце, полученном от субъекта. В некоторых вариантах реализации определение наличия минорного аллеля может быть ассоциировано с повышенной секрецией ИЛ-11 или предрасположенностью к развитию метаболического заболевания.

Соответственно, в одном из аспектов настоящего изобретения предложен способ скрининга субъекта, включающий:

получение образца нуклеиновой кислоты от указанного субъекта;

определение того, какой аллель присутствует в указанном образце в положении полиморфного нуклеотида одного или более из ОНП, перечисленных на фиг. 33, 34 или фиг. 35 заявки WO 2017/103108 А1 (включенной в настоящий документ посредством ссылки), или ОНП в неравновесном сцеплении с одним из перечисленных ОНП с г>0,8.

Этап определения может включать определение, присутствует ли минорный аллель в образце в выбранном положении полиморфного нуклеотида. Он может включать определение того, присутствует ли 0, 1 или 2 минорных аллелей.

Способ скрининга может представлять собой способ или являться частью способа определения предрасположенности субъекта к развитию метаболического заболевания или способа диагностики или прогнозирования, описанного в настоящей заявке.

- 39 050147

Указанный способ может дополнительно включать стадию выявления субъекта с предрасположенностью или повышенным риском развития метаболического заболевания, например, если у субъекта обнаружен минорный аллель в положении полиморфного нуклеотида. Способ может дополнительно включать этап отбора субъектов для лечения агентом, способным ингибировать сигнальный путь, опосредованный ИЛ-11, и/или введения субъекту агента, способного ингибировать сигнальный путь, опосредованный ИЛ-11, для обеспечения лечения метаболического заболевания у субъекта или для профилактики развития или прогрессирования метаболического заболевания у субъекта.

В некоторых вариантах реализации в способе диагностики метаболического заболевания, выявления субъекта, подверженного риску развития метаболического заболевания, и способах прогнозирования или предсказания реакции субъекта на лечение агентом, способным ингибировать сигнальный путь, опосредованный ИЛ-11, используется показатель, отличный от обнаружения повышения экспрессии ИЛ-11 или рецептора ИЛ-11 или генетических факторов.

В некоторых вариантах реализации способ диагностики метаболического заболевания, выявления субъекта, подверженного риску развития метаболического заболевания, и способы прогнозирования или предсказания реакции субъекта на лечение агентом, способным ингибировать сигнальный путь, опосредованный ИЛ-11, основаны на обнаружении, измерении и/или идентификации одного или более показателей метаболической функции.

Способы диагностики или прогнозирования можно осуществлять in vitro на образце, полученном от субъекта, или после обработки образца, полученного от субъекта. После взятия образца присутствие пациента для проведения способа диагностики или прогнозирования in vitro не требуется, и, следовательно, указанный способ может являться способом, который не осуществляется в отношении организма человека или животного. Образец, полученный от субъекта, может быть любого вида, как описано выше в настоящей заявке.

В комбинации с описанными в настоящей заявке способами можно применять и другие диагностические или прогностические анализы с целью повышения точности диагноза или прогноза или подтверждения результата, полученного с помощью анализов, описанных в настоящем документе.

Субъекты.

Субъекты могут представлять собой животных или людей. Субъекты предпочтительно представляют собой млекопитающих, более предпочтительно людей. Субъект может представлять собой млекопитающее, не являющееся человеком, но более предпочтительно представляет собой человека. Субъект может быть мужского или женского пола. Субъект может представлять собой пациента.

У пациента может иметь место метаболическое заболевание, описанное в настоящем документе. У субъекта может быть диагностировано метаболическое заболевание, требующее лечения, подозрение на наличие такого метаболического заболевания, или он может быть подвержен риску развития метаболического заболевания.

В вариантах реализации согласно настоящему изобретению субъект предпочтительно представляет собой человека. В вариантах реализации согласно настоящему изобретению субъект может быть выбран для лечения в соответствии со способами, основанными на получении характеристики определенных маркеров метаболического заболевания.

Дополнительные способы и варианты применения.

В настоящем изобретении также предложен агент, способный ингибировать сигнальный путь, опосредованный ИЛ-11, для применения, или применения агента, способного ингибировать сигнальный путь, опосредованный ИЛ-11, в способе: снижения уровня липидов в крови, снижения уровня глюкозы в крови, повышения толерантности к глюкозе (например, у субъекта с непереносимостью глюкозы), повышения толерантности к инсулину (например, у субъекта, резистентного к инсулину), повышения функции поджелудочной железы, снижения массы тела (например, у субъекта, страдающего избыточным весом/ожирением), снижения массы жира, увеличения безжировой массы, снижения уровня глюкозы в крови натощак, снижения уровня триглицеридов в сыворотке, снижения уровня холестерина в сыворотке, повышения толерантности к глюкозе, повышения функции поджелудочной железы (например, экзокринной и/или эндокринной функции), усиления роста ткани поджелудочной железы, регенерации ткани поджелудочной железы, увеличения массы поджелудочной железы, ингибирования перехода PSC в миофибробласты с помощью PSC, снижения количества/доли миофибробластов в поджелудочной железе, снижения уровня гидроксипролина в поджелудочной железе, снижения уровня коллагена в поджелудочной железе, уменьшения повреждения поджелудочной железы, уменьшения гиперплазии клеток островков поджелудочной железы, снижения экспрессии глюкагона, повышения экспрессии инсулина, увеличения массы тела (например, у субъекта с заболеванием, связанным с истощением, например, кахексией), снижения экспрессии белка ИЛ-11 в печени, снижения активации Erk в печени, снижения активации JNK в печени; снижения расщепления каспазой-3 в печени, снижения уровней АФК в печени; снижения экспрессии NOX4 в печени, снижения стеатоза, например, печени, снижения уровня триглицеридов в печени, снижения экспрессии синтазы жирных кислот, снижения уровня АЛТ и/или ACT в сыворотке, снижения экспрессии провоспалительного фактора (например, ФНОа, CCL2, CCL5, ИЛ-6, CXCL5 и/или CXCL1), снижения экспрессии профиброзного фактора (например, ИЛ-11, TIMP1, АСТА2, TGFe1,

- 40 050147

ММР2, TIMP2, ММР9, COL1A2, COL1A1 и/или COL3A1), снижения уровня TGFei в сыворотке, снижения экспрессии/продукции ИЛ-11, АСТА2, ММР2, TGFei, PDGF, ANG II, bFGF, CCL2 и/или Н₂О₂ в HSC, ингибирования перехода HSC в миофибробласты с помощью HSC, снижения количества/доли миофибробластов в печени, снижения уровня гидроксипролина в печени, снижения уровня коллагена в печени, повышения функции печени, повышения уровня GSH в сыворотке, повышения функции органа/ткани, пораженных метаболическим заболеванием, снижения повреждения печени, снижения гибели гепатоцитов; снижения гибели клеток (например, гепатоцитов) вследствие липотоксичности; снижение активности сигнального пути, опосредованного ИЛ-11, в гепатоцитах, или снижение количества/доли CD45+ клеток в печени.

В настоящем изобретении также предложено применение агента, способного ингибировать сигнальный путь, опосредованный ИЛ-11, для применения при производстве композиции для применения в способе: снижения уровня липидов в крови, снижения уровня глюкозы в крови, повышения толерантности к глюкозе (например, у субъекта, не переносящего глюкозу), повышения толерантности к инсулину (например, у субъекта, резистентного к инсулину), повышения функции поджелудочной железы, снижения массы тела (например, у субъекта с избыточным весом/ожирением), снижения массы жира в организме, увеличения безжировой массы, снижения уровня глюкозы в крови натощак, снижения уровня триглицеридов в сыворотке, снижения уровня холестерина в сыворотке, повышения толерантности к глюкозе, повышения функции поджелудочной железы (например, экзокринной и/или эндокринной функции), усиления роста ткани поджелудочной железы, регенерации ткани поджелудочной железы, увеличения массы поджелудочной железы, снижения гиперплазии клеток островков поджелудочной железы, снижения экспрессии глюкагона, повышения экспрессии инсулина, увеличения массы тела (например, у субъекта с заболеванием, связанным с истощением, например, кахексией), снижения экспрессии белка ИЛ-11 в печени, снижения активации Erk в печени, снижения активации JNK в печени; снижения расщепления каспазой-3 в печени; снижения уровня АФК в печени; снижения экспрессии NOX4 в печени, снижения стеатоза, например, печени, снижения уровня триглицеридов в печени, снижения экспрессии синтазы жирных кислот, снижения уровня АЛТ и/или ACT в сыворотке, снижения экспрессии провоспалительного фактора (например, ФНОа, CCL2, CCL5, ИЛ-6, CXCL5 и/или CXCL1), снижения экспрессии профиброзного фактора (например, ИЛ-11, TIMP1, АСТА2, TGFP1, ММР2, TIMP2, ММР9, COL1A2, COL1A1 и/или COL3A1), снижения уровня TGFe1 в сыворотке, снижения экспрессии/продукции ИЛ-11, АСТА2, ММР2, TGFp1, PDGF, ANG II, bFGF, CCL2 и/или Н₂О₂ в HSC, ингибирования перехода HSC в миофибробласты с помощью HSC, снижения количества/доли миофибробластов в печени, снижения уровня гидроксипролина в печени, снижения уровня коллагена в печени, повышения функции печени, повышения уровня GSH в сыворотке, повышения функции органа/ткани, пораженных метаболическим заболеванием, снижения повреждения печени, снижения гибели гепатоцитов; снижения гибели клеток (например, гепатоцитов) вследствие липотоксичности; снижение активности сигнального пути, опосредованного ИЛ-11, в гепатоцитах, или снижение количества/доли CD45+ клеток в печени.

Кроме того, в настоящем изобретении предложен способ: снижения уровня липидов в крови, снижения уровня глюкозы в крови, повышения толерантности к глюкозе (например, у субъекта, не переносящего глюкозу), повышения толерантности к инсулину (например, у субъекта, резистентного к инсулину), повышения функции поджелудочной железы, снижения массы тела (например, у субъекта с избыточным весом/ожирением), снижения массы жира в организме, увеличения безжировой массы, снижения уровня глюкозы в крови натощак, снижения уровня триглицеридов в сыворотке, снижения уровня холестерина в сыворотке, повышения толерантности к глюкозе, повышения функции поджелудочной железы (например, экзокринной и/или эндокринной функции), усиления роста ткани поджелудочной железы, регенерации ткани поджелудочной железы, увеличения массы поджелудочной железы, снижения гиперплазии клеток островков поджелудочной железы, снижения экспрессии глюкагона, повышения экспрессии инсулина, увеличения массы тела (например, у субъекта с заболеванием, связанным с истощением, например, кахексией), снижения экспрессии белка ИЛ-11 в печени, снижения активации Erk в печени, снижения активации JNK в печени; снижения расщепления каспазой-3 в печени; снижения уровня АФК в печени; снижения экспрессии NOX4 в печени, снижения стеатоза, например, печени, снижения уровня триглицеридов в печени, снижения экспрессии синтазы жирных кислот, снижения уровня АЛТ и/или ACT в сыворотке, снижения экспрессии провоспалительного фактора (например, ФНОа, CCL2, CCL5, ИЛ-6, CXCL5 и/или CXCL1), снижения экспрессии профиброзного фактора (например, ИЛ-11, TIMP1, АСТА2, TGFe1, MMP2, TIMP2, ММР9, COL1A2, COL1A1 и/или COL3A1), снижения уровня TGFe1 в сыворотке, снижения экспрессии/продукции ИЛ-11, АСТА2, ММР2, TGFe1, PDGF, ANG II, bFGF, CCL2 и/или Н2О2 в HSC, ингибирования перехода HSC в миофибробласты с помощью HSC, снижения количества/доли миофибробластов в печени, снижения уровня гидроксипролина в печени, снижения уровня коллагена в печени, повышения функции печени, повышения уровня GSH в сыворотке, повышения функции органа/ткани, пораженных метаболическим заболеванием, снижения повреждения печени, снижения гибели гепатоцитов; снижения гибели клеток (например, гепатоцитов) вследствие липотоксичности; снижение активности сигнального пути, опосредованного ИЛ-11, в гепатоцитах, или снижение ко

- 41 050147 личества/доли CD45+ клеток в печени.

Идентичность последовательностей.

Попарное и множественное выравнивание последовательностей для целей определения процента идентичности между двумя или более последовательностями аминокислот или нуклеиновых кислот можно осуществлять различными способами, известными специалисту в данной области техники, например, с использованием общедоступного компьютерного программного обеспечения, например, программного обеспечения ClustalOmega (Soding, J. 2005, Bioinformatics 21, 951-960), T-coffee (Notredame et al. 2000, J. Mol. Biol. (2000) 302, 205-217), Kalign (Lassmann and Sonnhammer 2005, BMC Bioinformatics, 6(298)) и MAFFT (Katoh and Standley 2013, Molecular Biology and Evolution, 30(4) 772-780). При использовании такого программного обеспечения предпочтительно используют параметры по умолчанию, например, для штрафа за разрыв и штрафа за удлинение.

Последовательности

SEQ ID NO:	ОПИСАНИЕ	ПОСЛ ЕДОВАТЕЛ ЬН ОСТЬ
1	ИЛ-11 человека (UniProt Р20809)	MNCVCRLVLVVLSLWPDTAVAPGPPPGPPRVSPDPRAELDSTVLLTRSLLADTRQLA AQLRDKFPADGDHNLDSLPTLAMSAGALGALQLPGVLTRLRADLLSYLRHVQWLRR AGGSSLKTLEPELGTLQARLDRLLRRLQLLMSRLALPQPPPDPPAPPLAPPSSAWG GIRAAHAILGGLHLTLDWAVRGLLLLKTRL
2	др130 человека (UniProt Р40189-1)	MLTLQTWLVQALFIFLTTESTGELLDPCGYISPESPVVQLHSNFTAVCVLKEKCMDYF HVNANYIVWKTNHFTIPKEQYTIINRTASSVTFTDIASLNIQLTCNILTFGQLEQNVYGIT IISGLPPEKPKNLSCIVNEGKKMRCEWDGGRETHLETNFTLKSEWATHKFADCKAKR DTPTSCTVDYSTVYFVNIEVWVEAENALGKVTSDHINFDPVYKVKPNPPHNLSVINSE ELSSILKLTWTNPSIKSVIILKYNIQYRTKDASTWSQIPPEDTASTRSSFTVQDLKPFTE YVFRIRCMKEDGKGYWSDWSEEASGITYEDRPSKAPSFWYKIDPSHTQGYRTVQLV WKTLPPFEANGKILDYEVTLTRWKSHLQNYTVNATKLTVNLTNDRYLATLTVRNLVG KSDAAVLTIPACDFQATHPVMDLKAFPKDNMLWVEWTTPRESVKKYILEWCVLSDK APCITDWQQEDGTVHRTYLRGNLAESKCYLITVTPVYADGPGSPESIKAYLKQAPPS KGPTVRTKKVGKNEAVLEWDQLPVDVQNGFIRNYTIFYRTIIGNETAVNVDSSHTEYT LSSLTSDTLYMVRMAAYTDEGGKDGPEFTFTTPKFAQGEIEAIWPVCLAFLLTTLLG VLFCFNKRDLIKKHIWPNVPDPSKSHIAQWSPHTPPRHNFNSKDQMYSDGNFTDVS VVEIEANDKKPFPEDLKSLDLFKKEKINTEGHSSGIGGSSCMSSSRPSISSSDENESS QNTSSTVQYSTVVHSGYRHQVPSVQVFSRSESTQPLLDSEERPEDLQLVDHVDGG DGILPRQQYFKQNCSQHESSPDISHFERSKQVSSVNEEDFVRLKQQISDHISQSCGS GQMKMFQEVSAADAFGPGTEGQVERFETVGMEAATDEGMPKSYLPQTVRQGGYM PQ
3	ИЛ-11 RA человека (UniProt Q14626)	MSSSCSGLSRVLVAVATALVSASSPCPQAWGPPGVQYGQPGRSVKLCCPGVTAGD PVSWFRDGEPKLLQGPDSGLGHELVLAQADSTDEGTYICQTLDGALGGTVTLQLGY PPARPVVSCQAADYENFSCTWSPSQISGLPTRYLTSYRKKTVLGADSQRRSPSTGP WPCPQDPLGAARCVVHGAEFWSQYRINVTEVNPLGASTRLLDVSLQSILRPDPPQG LRVESVPGYPRRLRASWTYPASWPCQPHFLLKFRLQYRPAQHPAWSTVEPAGLEE VITDAVAGLPHAVRVSARDFLDAGTWSTWSPEAWGTPSTGTIPKEIPAWGQLHTQP EVEPQVDSPAPPRPSLQPHPRLLDHRDSVEQVAVLASLGILSFLGLVAGALALGLWL RLRRGGKDGSPKPGFLASVIPVDRRPGAPNL
4	мишень миРНК в ИЛ-11	CCTTCCAAAGCCAGATCTT
5	мишень миРНК в ИЛ-11	GCCTGGGCAGGAACATATA
6	мишень миРНК в ИЛ-11	CCTGGGCAGGAACATATAT
7	мишень миРНК в ИЛ-11	GGTTCATTATGGCTGTGTT
8	мишень миРНК в ИЛ-11 Ra	GGACCATACCAAAGGAGAT
9	мишень миРНК в ИЛ-11 Ra	GCGTCTTTGGGAATCCTTT
10	мишень миРНК в ИЛ-11 Ra	GCAGGACAGTAGATCCCT
11	мишень миРНК в ИЛ-11 Ra	GCTCAAGGAACGTGTGTAA
12	миРНК к ИЛ-11 (NM 000641.3)	CCUUCCAAAGCCAGAUCUUdTdT-AAGAUCUGGCUUUGGAAGGdTdT
13	миРНК к ИЛ-11 (NM_000641.3)	GCCUGGGCAGGAACAUAUAdTdT-UAUAUGUUCCUGCCCAGGCdTdT

14	миРНК к ИЛ-11 (NM 000641.3)	CCUGGGCAGGAACAUAUAUdTdT-AUAUAUGUUCCUGCCCAGGdTdT
15	миРНК к ИЛ-11 (NM 000641.3)	GGUUCAUUAUGGCUGUGUUdTdT-AACACAGCCAUAAUGAACCdTdT
16	миРНК к ИЛ-11 Ra (U32324.1)	GGACCAUACCAAAGGAGAUdTdT-AUCUCCUUUGGUAUGGUCCdTdT
17	миРНК к ИЛ-11 Ra (U32324.1)	GCGUCUUUGGGAAUCCUUUdTdT-AAAGGAUUCCCAAAGACGCdTdT
18	миРНК к ИЛ-11 Ra (U32324.1)	GCAGGACAGUAGAUCCCUAdTdT-UAGGGAUCUACUGUCCUGCdTdT
19	миРНК к ИЛ-11 Ra (U32324.1)	GCUCAAGGAACGUGUGUAAdTdT-UUACACACGUUCCUUGAGCdTdT
20	Линкер из 20 аминокислот	GPAGQSGGGGGSGGGSGGGSV
21	Нурег-ИЛ-11 (гибрид	MSSSCSGLSRVLVAVATALVSASSPCPQAWGPPGVQYGQPGRSVKLCCPGVTAGD

- 42 050147

	ИЛ-11 РА:ИЛ-11)	PVSWFRDGEPKLLQGPDSGLGHELVLAQADSTDEGTYICQTLDGALGGTVTLQLGY PPARPVVSCQAADYENFSCTWSPSQISGLPTRYLTSYRKKTVLGADSQRRSPSTGP WPCPQDPLGAARCVVHGAEFWSQYRINVTEVNPLGASTRLLDVSLQSILRPDPPQG LRVESVPGYPRRLRASWTYPASWPCQPHFLLKFRLQYRPAQHPAWSTVEPAGLEE VITDAVAGLPHAVRVSARDFLDAGTWSTWSPEAWGTPSTGPAGQSGGGGGSGGG SGGGSVPGPPPGPPRVSPDPRAELDSTVLLTRSLLADTRQLAAQLRDKFPADGDHN LDSLPTLAMSAGALGALQLPGVLTRLRADLLSYLRHVQWLRRAGGSSLKTLEPELGT LQARLDRLLRRLQLLMSRLALPQPPPDPPAPPLAPPSSAWGGIRAAHAILGGLHLTLD WAVRGLLLLKTRL
22	VH Enx203	EVQLQQSGPELVKPGASVKIPCKASGYTFTDYNMDVWKQSHGKSLEWIGDINPHNG GPIYNQKFTGKATLTVDKSSSTAYMELRSLTSEDTAVYYCARGELGHWYFDVWGTG TTVTVSS
23	VL Enx203	DIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRASKSVSTSGYSYIHWYQQKPGQPPKLLIYLASNL DSGVPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDAATYYCQHSRDLPPTFGGGTKLEIK
24	VH Enx209	QVQLQQPGAELVRPGSSVKLSCKASGYTFTNYWMHWLKQRPVQGLEWIGNIGPSD SKTHYNQKFKDKATLTVDKSSSTAYMQLNSLTSEDSAVYYCARGDYVLFTYWGQGT LVTVSA
25	VL Enx209	DIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSISNNLHWYQQKSHEAPRLLIKYASQSISGIP ARFSGSGSGTDFTLSFSSLETEDFAVYFCQQSYSWPLTFGQGTKLEIK
26	VH Enx108A	QVQLVQSGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHVWRQAPGKGLEVWAVISYD GSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKIGATDPLDYWGQ GTLVTVSS
27	VL Enx108A	QSALTQPRSVSGSPGQSVTLSCTGTSSDVGGYNYVSWYQHYPGKAPKLMIFDVNE RSSGVPDRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCASYAGRYTWMFGGGTKVTVL G
28	HC hlgG4 Enx108A (L248E, S241P)	QVQLVQSGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHVWRQAPGKGLEVWAVISYD GSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKIGATDPLDYWGQ GTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSG VHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPC PPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSQEDPEVQFNWYVDGV EVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKA KGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTP PVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
29	LC лямбда Enx108A	QSALTQPRSVSGSPGQSVTLSCTGTSSDVGGYNYVSWYQHYPGKAPKLMIFDVNE RSSGVPDRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCASYAGRYTWMFGGGTKVTVL GQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTT PSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS
30	VH hEnx203	EVQLVQSGAEVKKPGASVKISCKASGYTFTDYNMDWVKQAPGQRLEWIGDINPHNG GPIYNQKFTGRATLTVDKSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGELGHWYFDVWGQ GTTVTVSS
31	VL hEnx203	DIVLTQSPASLALSPGERATLSCRASKSVSTSGYSYIHWYQQKPGQAPRLLIYLASNL DSGVPARFSGSGSGTDFTLTISSLEEEDFATYYCQHSRDLPPTFGQGTKLEIK
32	VH hEnx209	QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYWMHWLRQRPGQGLEWIGNIGPSD SKTHYNQKFKDRVTMTVDKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGDYVLFTYWGQG TLVTVSS
33	VL hEnx209	DIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSISNNLHWYQQKPGQAPRLLIKYASQSISGI PARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQSYSWPLTFGQGTKLEIK
34	CDR1 VH Enx108A	SYGMH
35	CDR2 VH Enx108A	VISYDGSNKYYADSVKG
36	CDR3 VH Enx108A	IGATDPLDY
37	CDR1 VL Enx108A	TGTSSDVGGYNYVS
38	CDR2 VLEnx108A	DVNERSS
39	CDR3 VLEnx108A	ASYAGRYTWM
40	CDR1 VH Enx203, hEnx203	DYNMD
41	CDR2 VH Enx203, hEnx203	DINPHNGGPIYNQKFTG
42	CDR3 VH Enx203, hEnx203	GELGHWYFDV
43	CDR1 VL Enx203, hEnx203	RASKSVSTSGYSYIH
44	CDR2 VL Enx203, hEnx203	LASNLDS
45	CDR3 VL Enx203, hEnx203	QHSRDLPPT
46	CDR1 VH Enx209, hEnx209	NYWMH

- 43 050147

47	CDR2 VH Епх209, hEnx209	NIGPSDSKTHYNQKFKD
48	CDR3 VH Епх209, hEnx209	GDYVLFTY
49	CDR1 VL Епх209, hEnx209	RASQSISNNLH
50	CDR2 VL Епх209, hEnx209	YASQSIS
51	CDR3 VL Enx209, hEnx209	QQSYSWPLT
52	Константная область IGHG1 человека (K214R, D356E, L358M)	ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVL QSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPA PELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNA KTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPR EPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDS DGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
53	Константная область IGHG4 человека (L248E, S241P)	ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVL QSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPE FEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKT KPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREP QVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDG SFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
54	Константная область IGKC человека	RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESV TEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
55	Константная область IGLC2 человека	GQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTT PSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS
56	НС hlgG1 hEnx203	EVQLVQSGAEVKKPGASVKISCKASGYTFTDYNMDWVKQAPGQRLEWIGDINPHNG GPIYNQKFTGRATLTVDKSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGELGHWYFDVWGQ GTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTS GVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDK THTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYV DGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTI SKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYK TTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
57	LC каппа hEnx203	DIVLTQSPASLALSPGERATLSCRASKSVSTSGYSYIHWYQQKPGQAPRLLIYLASNL DSGVPARFSGSGSGTDFTLTISSLEEEDFATYYCQHSRDLPPTFGQGTKLEIKRTVA APSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQD SKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
58	НС hlgG4 hEnx209 (L248E, S241P)	QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYWMHWLRQRPGQGLEWIGNIGPSD SKTHYNQKFKDRVTMTVDKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGDYVLFTYWGQG TLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGV HTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCP PCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVE VHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAK GQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPP VLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
59	LC каппа hEnx209	DIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSISNNLHWYQQKPGQAPRLLIKYASQSISGI PARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQSYSWPLTFGQGTKLEIKRTVAAPSV FIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDS TYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

Настоящее изобретение включает комбинацию описанных аспектов и предпочтительных признаков, за исключением случаев, когда такая комбинация явно недопустима или прямо исключена.

Признаки, описанные в вышеприведенном описании или в нижеследующей формуле изобретения, или на прилагаемых графических материалах, выраженные в своей конкретной форме или с точки зрения средства для выполнения описанной функции, или способа или процесса получения описанных результатов, можно использовать, в зависимости от обстоятельств, по отдельности или в любой комбинации таких признаков для реализации настоящего изобретения в его различных формах.

Во избежание каких-либо сомнений, любые теоретические объяснения, представленные в настоящей заявке, представлены для целей улучшения понимания читателя. Авторы изобретения не желают ограничиваться какими-либо из этих теоретических объяснений.

Заголовки любых разделов, используемые в настоящей заявке, предназначены только для целей упорядочения и не должны рассматриваться как ограничивающие описанный объект.

Во всем тексте описания, включая нижеследующую формулу изобретения, если контекст явно не требует иного, слово содержать и включать, и его вариации, такие как содержит, содержащий и включающий, подразумевают включение указанного целого числа или этапа, или группы целых чисел или этапов, но не исключают любое другое целое число или этап, или группу целых чисел или этапов.

Необходимо отметить, что в контексте описания и прилагаемой формулы изобретения формы единственного числа включают множественное число, если из контекста явно не следует иное. Диапазоны могут быть выражены в настоящем документе в виде от приблизительно одного конкретного значения и/или до приблизительно другого конкретного значения. При таком обозначении диапазона другой вариант реализации включает диапазон от одного конкретного значения и/или до другого конкретного значения. Аналогичным образом, если значения выражены в виде приблизительных значений при помощи предшествующего термина приблизительно, то следует понимать, что конкретное значение состав

-44050147 ляет другой вариант реализации. Термин приблизительно по отношению к числовому значению является необязательным и означает, например, +/-10%.

Описанные в настоящей заявке способы могут быть осуществлены, или продукты могут присутствовать in vitro, ex vivo или in vivo. Подразумевается, что термин in vitro охватывает эксперименты с материалами, биологическими веществами, клетками и/или тканями в лабораторных условиях или в культуре, тогда как в отношении термина in vivo подразумевается, что он охватывает эксперименты и процедуры с интактными многоклеточными организмами. В некоторых вариантах реализации способы, выполняемые in vivo, могут быть выполнены на животных, не являющихся людьми. Ex vivo относится к чему-либо, присутствующему или происходящему вне организма, например, вне организма человека или животного, например, на ткани (например, целых органах) или клетках, взятых из организма.

В местах настоящей заявки, где описана нуклеотидная последовательность, также явным образом рассматривается комплементарная ей последовательность.

Стандартные методики молекулярной биологии см. в источнике Sambrook, J., Russel, D.W. Molecular Cloning, A Laboratory Manual. 3 ed. 2001, Cold Spring Harbor, New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press.

Аспекты и варианты реализации настоящего изобретения далее обсуждаются со ссылкой на прилагаемые графические материалы. Дополнительные аспекты и варианты реализации очевидны для специалистов в данной области техники. Все документы, упомянутые в данном тексте, полностью включены в настоящий документ посредством ссылки. Несмотря на то, что изобретение описано в сочетании с типичными вариантами реализации, описанными ниже, для специалистов в данной области техники при рассмотрении данного описания очевидны многие эквивалентные модификации и изменения. Соответственно, приведенные выше иллюстративные варианты реализации изобретения считаются иллюстративными и не имеющими ограничительного характера. В описанные варианты реализации изобретения можно вносить различные изменения, не отклоняясь от сущности настоящего изобретения.

Краткое описание чертежей

Варианты реализации и эксперименты, иллюстрирующие принципы настоящего изобретения, далее обсуждаются со ссылкой на прилагаемые графические материалы.

Фиг. 1А и 1В. Графики, демонстрирующие процентное изменение массы тела с течением времени для мышей с нокаутом ИЛ-URA (ll11ra1-/-) или мышей дикого типа, экспрессирующих ИЛ-URA (ll11ra1+/+), получавших (1А) нормальный кормовой рацион (NCD) или (1В) западный кормовой рацион с фруктозой (WDF).

Фиг. 2А и 2В. Гистограммы, на которых показано процентное изменение общей массы жира для мышей с нокаутом ИЛ-URA (ll11ra1KO) или мышей дикого типа, экспрессирующих ИЛ-URA (ll11raWT), получавших (2А) нормальный кормовой рацион (NCD) или (2В) западный кормовой рацион с фруктозой (WDF).

Фиг. 3. График, на котором показаны уровни глюкозы в крови натощак (мМ) для мышей с нокаутом ИЛ-URA (KO) или мышей дикого типа, экспрессирующих ИЛ-URA (ДТ), получавших нормальный кормовой рацион (NC) или западный кормовой рацион с фруктозой (WDF).

Фиг. 4. График, на котором показаны уровни триглицеридов в сыворотке (мг/г) для мышей с нокаутом ИЛ-11RA (KO) или мышей дикого типа, экспрессирующих ИЛ-URA (ДТ), получавших нормальный кормовой рацион (NC) или западный кормовой рацион с фруктозой (WDF).

Фиг. 5А и 5В. Графики, демонстрирующие уровни холестерина в сыворотке (мг/дл) для мышей с нокаутом ИЛ-HRA (KO) или мышей дикого типа, экспрессирующих ИЛ-URA (WT), получавших (5А) нормальный кормовой рацион (NC) или (5В) западный кормовой рацион с фруктозой (WDF).

Фиг. 6А и 6В. График и ящичковая диаграмма, демонстрирующие изменение массы тела у мышей, получавших нормальный корм (NC) или западный кормовой рацион с фруктозой (WDF) и обработанных антителом против ИЛ-HRA или контрольным IgG. На (6А) продемонстрировано процентное изменение массы тела с течением времени (недели). На (6В) показана процентная разность между общей жировой массой тела и безжировой массой. *Р<0,05.

Фиг. 7А и 7В. График, схема и гистограмма, демонстрирующие толерантность к глюкозе у мышей, получавших западный кормовой рацион с фруктозой (WDF) и обработанных антителом против ИЛ-11RA или контрольным IgG, как определено с помощью внутрибрюшинного теста толерантности к глюкозе (ipGTT). На (7А) показаны изменения уровня глюкозы (мМ) по сравнению с моментом времени 1 мин. На (7В) показана площадь под кривой. *Р<0,05, ** Р<0,01.

Фиг. 8. Ящичковая диаграмма, на которой показана масса поджелудочной железы у мышей, получавших нормальный корм (NCD) или западный кормовой рацион с фруктозой (WDF), и обработанных в различные моменты времени антителом против ИЛ-HRA или контрольным IgG. ***Р<0,0001.

Фиг. 9А-9С. Ящичковые диаграммы, на которых показаны (9А) уровни холестерина в сыворотке (мг/дл), (9В) уровни триглицеридов в сыворотке (мг/г) и (9С) уровни глюкозы в крови натощак (мМ) для мышей, получавших нормальный корм (NCD) или западный кормовой рацион с фруктозой (WDF), и обработанных антителом против ИЛ-HRA или контрольным IgG в указанные моменты времени.

- 45 050147

Фиг. 10А и 10В. Изображения, демонстрирующие результаты иммуногистохимического анализа содержания (10А) глюкагона и (10В) инсулина в срезах ткани поджелудочной железы, полученные на 24 неделе у мышей, получавших нормальный корм (NCD), или мышей, получавших западный кормовой рацион с фруктозой (WDF) и получавших антитело против ИЛ-11RA или контрольный IgG с 16 недели.

Фиг. 11А и 11В. График и изображения, демонстрирующие эффекты лечения антителами против ИЛ-11/ИЛ-11Rα на потерю веса, связанную с кахексией. (11А) Мышей кормили кормом с дефицитом метионина-холина (HFMCD), индуцирующим кахексию, и они восстанавливали нормальную или почти нормальную массу тела при лечении антителом против ИЛ-11 или антителом против ИЛ-HRa 2 раза в неделю. Контрольных мышей кормили нормальным кормом (NC) либо рационом HFMCD и обрабатывали контрольным изотипическим IgG. (11B) Пример сравнения размеров тела мышей, получавших кормовой рацион HFMCD и обработанных либо IgG, либо антителом против ИЛ-11, либо антителом против ИЛ-HRa.

Фиг. 12А-12С. Графики, демонстрирующие влияние лечения антителом против ИЛ-И/ИЛ-HRa на массу тела в модели потери веса, связанной с кахексией. Мышам, получавшим кормовой рацион HFMCD, два раза в неделю вводили 0,5, 1, 5 или 10 мг/кг антитела против ИЛ-HRa (12A) или одного из двух антител против ИЛ-11 (12В и 12С). Контрольных мышей кормили нормальным кормом (NC) либо рационом HFMCD и обрабатывали контрольным изотипическим IgG.

Фиг. 13А-13С. Графики, демонстрирующие влияние лечения антителом против ИЛ-11/ИЛ-11Ra на потребление пищи в модели потери веса, связанной с кахексией. Мышам, получавшим рацион HFMCD, два раза в неделю вводили 0,5, 1, 5 или 10 мг/кг антитела против ИЛ-HRa (13A) или одного из двух антител против ИЛ-11 (13В и 13С). Контрольных мышей кормили нормальным кормом (NC) либо рационом HFMCD и обрабатывали контрольным изотипическим IgG.

Фиг. 14А и 14В. Графики, демонстрирующие влияние лечения антителами против ИЛ-11/ИЛ-11Ra на массу тела при потере веса, связанном с кахексией после острого повреждения почек, вызванного фолатами. (14А) Мышей с повреждением почек, вызванным фолатами, лечили антителом против ИЛ-HRa, антителом против ИЛ-11 или контрольным IgG от 1 ч до повреждения до 28 дней после повреждения. Контрольным мышам вводили только среду-носитель. (14В) Мышей с повреждением почек, вызванным фолатами, лечили антителом против ИЛ-11 или контрольным IgG через 21 день после повреждения. FA = фолиевая кислота.

Фиг. 15. График, демонстрирующий влияние лечения антителом против ИЛ-11 на массу тела при ассоциированной с кахексией потере веса после односторонней обструкции мочеточника (ООМ), вызванной острым повреждением почек. Мышей с повреждением почек, вызванным ООМ, лечили антителом против ИЛ-11 или контрольным IgG в течение 10 дней после повреждения.

Фиг. 16А и 16В. Графики, демонстрирующие влияние сверхэкспрессии ИЛ-11 на прирост массы тела. (16А) Введение рекомбинантного ИЛ-11 мыши (rmIL11) замедляло прогрессирование нормального прироста массы тела мыши. (16В) Индукция трансгена ИЛ-11 (ИЛ-11 Tg) у мышей приводила к потере массы тела с течением времени.

Фиг. 17A-17N. ИЛ-11 индуцирует активацию HSC и фиброз печени. (А) РНК ИЛ-11 активируется в HSC, стимулированных TGFe1. (В) Белок ИЛ-11 секретируется из HSC, стимулированных TGFe1. (С) Срезы печени человека с высокой точностью среза стимулировали TGFe1 и измеряли уровень белка ИЛ11 в супернатанте. (D) Иммунофлуоресцентные изображения экспрессии ИЛ-6R и ИЛ-URA в HSC и активированных клетках ТНР-1 (масштабная линейка 100 мкм). (E) Иммунофлуоресцентные изображения (масштабная линейка 100 мкм) и (F) вестерн-блоттинг АСТА2 в HSC после инкубирования без стимула (-), с TGFe1, PDGF или ИЛ-11. (G) Иммунофлуоресцентные изображения (масштабная линейка 100 мкм) HSC для окрашивания коллагеном I и (Н) секреция коллагена в супернатанте HSC, стимулированных TGFe1, PDGF или ИЛ-11. (/) Инвазия HSC, индуцированных ИЛ-11, в матригель в зависимости от дозы. (J) Hyper ИЛ-11 вызывает секрецию белка ИЛ-11 из HSC (твердофазный ИФА). (A-C,E-H,J) TGFe1 (5 нг/мл), Hyper ИЛ-11 (0,2 нг/мл), PDGF (20 нг/мл), ИЛ-11 (5 нг/мл); 24 ч; (I) 48 ч. (K) Схематическое изображение мышей, получающих ежедневную инъекцию физиологического раствора (контроль) либо rmll-11 (100 мкг/кг). (L-N) Данные для экспериментов с инъекциями rmll-11, как показано в 1K, (п>7/группу). (L) Относительное содержание гидроксипролина в печени, (М) экспрессия мРНК профиброзных и провоспалительных маркеров в печени и (N) уровни АЛТ в сыворотке. (A-B,H-J,L,N) Данные представлены как среднее ±СО; (С,М) диаграммы типа ящик с усами, на которых показана медиана (средняя линия), 25-75 процентили (ящик) и минимальный-максимальный процентили (усы). (A-C,J,L-N) Двусторонний критерий Стьюдента; (H-I) двусторонний критерий Даннетта. FC: кратность изменения; I/А: интенсивность/площадь.

Фиг. 18A-18N. Мыши с делецией ll11ra1 защищены от патологий печени типа НАСГ, гиперлипидемии и гипергликемии. (А) Вестерн-блоттинг ИЛ-11, Gapdh, p-Erk и Erk в печени мышей, получавших рацион HFMCD в течение 1, 4, 6 и 10 недель. (В) Типичные изображения печени при трихромном окрашивании по Массону (масштабная линейка 100 мкм), уровни (С) триглицеридов в печени, (D) АЛТ в сыворотке и (E) экспрессия мРНК провоспалительных маркеров в печени мышей ll11ra^+/+ (ДТ) и П11га’/’

- 46 050147 (KO) после 10-недельного использования рациона HFMCD (п>5/группу). (F-N) Данные для мышей ДТ и КО, получавших WDF в течение 16 недель. (F) Вестерн-блоттинг ИЛ-11 и Gapdh в печени. (G) Относительные уровни экспрессии мРНК провоспалительных маркеров в печени, (Н) уровни АЛТ в сыворотке, (I) относительное содержание гидроксипролина в печени (nM/группу). (J) Типичные изображения печени при трихромном окрашивании по Массону (масштабная линейка 100 мкм). (K) Вестерн-блоттинг статуса активации Erk в печени, (L) уровень глюкозы в крови натощак, (М) уровень триглицеридов в сыворотке и (N) уровень холестерина в сыворотке (п>3/группу). (C-E,G-I) Данные показаны в виде диаграммы типа ящик с усамис медианой (средняя линия), 25-75 процентилями (ящик) и минимальныммаксимальным процентилями (усы); (L-N) данные представлены как среднее ±СО, пунктирная линия представляет собой среднее значение для ДТ при использовании NC; t-критерий Стьюдента с поправкой Сидака. FC: кратность изменения; NC: нормальный корм; HFMCD: дефицит метионина и холина с высоким содержанием жира; WDF: западный кормовой рацион +15% (мас./об.) фруктозы.

Фиг. 19A-19J. Терапевтические средства против ИЛ-11 ингибируют трансформацию HSC в миофибробласты в зависимости от ERK и имеют благоприятный профиль метаболической безопасности. (А) Кривая доза-ответ и значение IC₅₀ X203 и Х209 (от 61 пг/мл до 4 мкг/мл; 4-кратное разбавление) при ингибировании секреции ММР2 TGFβ1-стимулированными HSC. (В) твердофазный ИФА секреции ИЛ-11 из HSC, стимулированных различными факторами НАСГ (п>5/группу). (С) Типичные флуоресцентные изображения и количественное определение клеток ACTA2^+ve из HSC, обработанных TGFe1 и другими факторами НАСГ в присутствии IgG, X203 или Х209 (масштабная линейка 100 мкм, пунктирная линия представляет собой медианное значение исходного уровня). (D) Влияние Х203 и Х209 на инвазию HSC, индуцированную PDGF или CCL2. (E) Вестерн-блоттинг p-ERK и ERK в лизатах HSC, стимулированных ИЛ-11 (верхняя панель) или различными факторами НАСГ в присутствии IgG или Х209 (нижняя панель). (F) Типичные флуоресцентные изображения и количественное определение ACTA2^+ve клеток в HSC, обработанных ИЛ-11 и важными факторами НАСГ в присутствии ингибиторов ERK/MEK U0126 или PD98059 (масштабные полосы, ая линейка 100 мкм, пунктирная линия представляет собой медианное значение исходного уровня). (A-F) TGFe1 (5 нг/мл), ИЛ-11 (5 нг/мл), PDGF (20 нг/мл), Angll (100 нМ), bFGF (10 нг/мл), CCL2 (5 нг/мл), H₂O₂ (0,2 мМ), IgG, X203 и Х209 (2 мкг/мл), U0126 или PD98059 (10 мкМ); (A,C,E-F) 24 ч; (B,D) 48 ч. (G) Количество периферических тромбоцитов, (H) уровни АЛТ в сыворотке, (I), уровни триглицеридов в сыворотке и (J) уровни холестерина в сыворотке мышей, два раза в неделю получавших 10 мг/кг Х203 и Х209 в течение 5 месяцев (п>5/группу). (B,D) Данные представлены как среднее ±СО; (C,F,G-J) данные представлены в виде диаграммы типа ящик с усамис медианой (средняя линия), 25-75 процентилями (ящик) и минимальным-максимальным процентилями (усы). (B,D,G-J) Двусторонний критерий Даннетта; (C,F) двусторонний критерий Стьюдента с коррекцией по Тьюки. FC: кратность изменения.

Фиг. 20A-20N. Терапевтическое адресное воздействие на ИЛ-11 ингибирует патологические явления НАСГ и вызывает их регрессию в доклинических моделях. (А) Схема, демонстрирующая терапевтическое применение Х203 и Х209 (10 мг/кг, два раза в неделю) у мышей, получавших корм HFMCD для экспериментов, показанных на (В-Е). Х203, Х209 или изотипический контрольный IgG вводили с 6 по 10 неделю использования рациона HFMCD. (В) Типичные гистологические изображения печени (трихромное окрашивание по Массону; масштабная линейка 100 мкм), (С) относительное содержание гидроксипролина в печени, (D) относительные уровни экспрессии провоспалительной мРНК в печени (n> 6/группу) и (E) уровни АЛТ в сыворотке. (F) Вестерн-блоттинг статуса активации Erk в печени. (G) Схема введения Х203 или IgG мышам db/db, получавшим корм MCD, для экспериментов, показанных в H-N. Вестерн-блоттинг (Н) ИЛ-11 и Gapdh, (J) p-Erk и Erk в печени. (J) Типичные изображения печени при трихромном окрашиваниии по Массону у мышей db/db, получавших корм MCD и обработанных Х203 или IgG (масштабная линейка 100 мкм). Уровни (K) триглицеридов в печени, (L) относительного содержания гидроксипролина в печени, (М) АЛТ в сыворотке и (N) экспрессии мРНК провоспалительных маркеров в печени (n>5 на группу). (C-E,K-N) Данные показаны в виде диаграммы типа ящик с усамис медианой (средняя линия), 25-75 процентилями (ящик) и минимальным-максимальным процентилями (усы); двусторонний t-критерий Стьюдента с поправкой по Тьюки. FC: кратность изменения; NC: нормальный корм; HFMCD: дефицит метионина и холина с высоким содержанием жира; MCD: дефицит метионина и холина.

Фиг. 21A-21L. Ингибирование сигнального пути ИЛ-11 вызывает регрессию патологических явлений НАСГ в доклинических моделях и трансформации HSC в миофибробласты. (А) Схема, демонстрирующая терапевтическую схему введения в эксперименте по регрессии НАСГ для данных, показанных на (B-G). Мыши получали корм WDF в течение 16 недель для индукции НАСГ, а затем обрабатывали (10 мг/кг) Х209 или IgG в течение 8 недель, в течение которых они непрерывном получали корм WDF. (В) Общее содержание гидроксипролина в печени, уровни (С) триглицеридов в печени, (D) АЛТ в сыворотке, (E) глюкозы в крови натощак, (F) триглицеридов в сыворотке и (G) холестерина в сыворотке у мышей, получавших NC и WDF с обработкой IgG и Х209 (п>5/группу). (Н) Схема, демонстрирующая эксперимент по регрессии расстройства, в котором устанавливали фиброз путем кормления мышей HFMCD

- 47 050147 в течение 10 недель, а затем заменяли корм на NC и инициировали лечение антителами (Х203 и Х209). Мышей умерщвляли в указанные моменты времени. (I) Общее содержание гидроксипролина в печени (пунктирная линия представляет собой среднее значение для NC=0,93) и (J) относительная экспрессия мРНК Mmp2/Timp1 через 1,3,6 недель после сопутствующего метаболического вмешательства (смена рациона) и лечения Х203, Х209 или IgG (п>3/группу). Количественное определение ACTA2^+ve путем иммунологического окрашивания (масштабная линейка 200 мкм) после инкубирования (K) с TGFe1 или (L) с PDGF до или после добавления Х203, Х209 или IgG (п=5/группу). (K-L) TGFe1 (5 нг/мл), PDGF (20 нг/мл), IgG, X203 и Х209 (2 мкг/мл). (B-G,K-L) Данные представлены в виде диаграммы типа ящик с усамис медианой (средняя линия), 25-75 процентилями (ящик) и минимальным-максимальным процентилями (усы); (I) данные представлены в виде среднее значение ±СО; (J) данные представлены в виде линейной диаграммы (среднее значение), а области прозрачности обозначают СО. (В) Двухсторонний критерий Стьюдента (C-G,K-L) двухсторонний критерий Стьюдента с поправкой по Тьюки; (I-J) двусторонний дисперсионный анализ. FC: кратность изменения; NC: нормальный корм; WDF: западный кормовой рацион +15% (мас./об.) фруктозы; HFMCD: дефицит метионина и холина с высоким содержанием жира.

Фиг. 22А-22К. Нейтрализация сигнального пути ИЛ-11 вызывает регрессию повреждения печени на ранней стадии НАСГ. (А) Относительная экспрессия мРНК печени при фиброзе и маркерах воспаления у мышей, получавших корм NC или HFMCD в указанные моменты времени. (В) Схема эксперимента с лечением антителом против ИЛ-11 на ранней стадии в модели НАСГ за счет использования кормового рациона HFMCD. Лечение антителами начинали через 1 неделю после начала использования рациона НАСГ, вводя Х209, Х203 или IgG (10 мг/кг, два раза в неделю) внутрибрюшинно в течение 5 недель. (CG) Данные для экспериментов, показанных на фиг. 21В. (С) Типичные макроскопические изображения печени и (D) изображения печени с трихромным окрашиванием по Массону (масштабная линейка 100 мкм) после 5 недель лечения IgG или Х209. (E) уровни триглицеридов в печени (n>5 на группу), (F) содержание гидроксипролина в печени мышей, получавших Х209 и IgG (n>5 на группу), (G) уровни АЛТ в сыворотке (п>5 на группу). (Н) Иммунофлуоресцентные изображения экспрессии ИЛ-6R и ИЛ-URA в гепатоцитах (масштабная линейка 100 мкм). Влияние в зависимости от дозы (I) ИЛ-11 на АЛТ в супернатанте гепатоцитов и (J) образование стресс-волокон (окрашивание родамином-фаллоидином) в гепатоцитах (масштабная линейка 200 мкм). (K) Белок ИЛ-11 секретируется из первичных гепатоцитов человека, стимулированных TGFe1 (5 нг/мл); 24 ч. (E) Данные представлены в виде диаграммы типа ящик с усами с медианой (средняя линия), 25-75 процентилями (ящик) и минимальным-максимальным процентилями (усы); (F-G,I,K) данные представлены в виде среднее ±СО. (E) Критерий Стьюдента с поправкой по Тьюки; (F,G) двусторонний дисперсионный анализ; (I,K) двусторонний критерий Даннетта. FC: кратность изменения; NC: нормальный корм; HFMCD: дефицит метионина и холина с высоким содержанием жира.

Фиг. 23A-23G. Лечение антителом против ИЛ-URA восстанавливает молекулярную сигнатуру НАСГ в сторону нормального профиля печени, ингибируя активацию иммунных клеток. (A-G) Данные для экспериментов, показанных на фиг. 22В. (А) График анализа основных компонентов (РСА) экспрессии гена печени у мышей при использовании NC или HFMCD в присутствии IgG, антител Х203 или Х209 для моментов времени, показанных на 6В. Стрелки обозначают переходы от нормальной экспрессии гена (NC) к максимальному нарушению экспрессии гена при НАСГ (HFMCD + IgG), к промежуточному восстановлению экспрессии гена (HFMCD + Abs (3 нед.)), к нормализованной экспрессии гена (HFMCD + Abs (6 нед)). (В) Карта интенсивности экспрессии профиброзных и провоспалительных генов (масштабированные транскрипты на миллион, ТРМ). (С) Экспрессия мРНК Tnfa, Ccl2 и Ccl5 согласно кПЦР (п>5/группу). (D) Количество CD45^+ve иммунных клеток в печени, (E) Ly6C^+ve TGFe1^+ve клетки в общей популяции CD45^+ve, (F) типичные псевдоцветовые графики, иллюстрирующие стратегию гейтирования, используемую для обнаружения Ly6C^+ve TGFe1^+ve клеток (п>4/группу). (G) Уровни TGFe в сыворотке (n+5/группу). (C-E,G) Данные представлены в виде диаграммы типа ящик с усами с медианой (средняя линия), 25-75 процентилями (ящик) и минимальным-максимальным процентилями (усы). (C,G) двусторонний критерий Стьюдента с поправкой по Тьюки; (D-E) двусторонний критерий Стьюдента. FC: кратность изменения; NC: нормальный корм; HFMCD: дефицит метионина и холина с высоким содержанием жира.

Фиг. 24A-24K. HSC секретируют ИЛ-11 и реагируют на ИЛ-11 и инъекции ИЛ-11 мышам, вызывая фиброз печени. (A) Полногеномные изменения экспрессии РНК в HSC после стимуляции TGFe1 (n=3, секвенирование РНК). (В) Повышение уровня экспрессии РНК, индуцированное сдавлением, в HSC человека (секвенирование РНК¹⁴), гены ранжированы в соответствии с количеством фрагментов на миллион т.п.о. (FPKM), IL-11 является наиболее интенсивно стимулируемым геном в геноме. (С) транскрипты IL-11RA в фибробластах сердца человека (HCF), фибробластах легких человека (HLF) и HSC человека. (D) Вестерн-блоттинг и (E) денситометрия ИЛ-11 и GAPDH в образцах печени здоровых людей и пациентов, страдающих алкогольной болезнью печени (ALD), первичным склерозирующим холангитом (PSC), первичным билиарным циррозом (РВС) и неалкогольным стеатогепатитом (НАСГ). Автоматизи

- 48 050147 рованное количественное определение флуоресценции для (F) АСТА2^+те-клеток и (G) иммунологическое окрашивание коллагена I после инкубирования без стимула (-), с TGFei, PDGF или ИЛ-11. (H) Концентрация ММР-2 в супернатанте HSC без стимула (-), с TGFei или ИЛ-11, определяемая твердофазным ИФА. (A,F-H) TGFe1 и ИЛ-11 (5 нг/мл), PDGF (20 нг/мл); 24-часовая стимуляция. (I) Типичные (масштабная линейка 100 мкм) и (J) количественное определение на изображениях срезов печени мышей, которым вводили физиологический раствор или rmll-11, при трихромном окрашивании по Массону. (K) Схематические и типичные флуоресцентные изображения GFP^+ve клеток мышей Col1a1-GFP, которым ежедневно вводили rmll-11 либо физиологический раствор. Срезы подвергали иммунологическому окрашиванию для выявления Acta2 и контрастировали DAPI (масштабная линейка 200 мкм). (C,F-G) Данные показаны в виде диаграммы типа ящик с усами с медианой (средняя линия), 25-75 процентилями (ящик) и минимальным-максимальным процентилями (усы); (E,H,J) данные представлены как среднее ±СО. (F-H) Двусторонний критерий Даннетта; (J) Двусторонний критерий Стьюдента. FC: кратность изменения; ТРМ: количество транскриптов на миллион.

Фиг. 25A-25I. Генетическое ингибирование сигнального пути ИЛ-11 защищает мышей от вызванных HFMCD патологических явлений НАСГ. Влияние 16-недельного использования рациона HFMCD по сравнению с рационом NC на уровни мРНК (А) II-11 и (В) белка ИЛ-11 в печени. (А-В) РНК и белок выделяли из одних и тех же мышей (п=5/группу). (С) Относительное содержание гидроксипролина в печени и (D) уровни АЛТ в сыворотке у мышей, получавших корм NC или HFMCD в течение 1, 4, 6 или 10 недель (п>5 на группу). (E-1) Данные для мышей ll11ra^+/+ (WT) и ll11ra’/’ (KO) через 10 недель использования рациона HFMCD. (E) Относительное содержание гидроксипролина в печени, (F) типичное (масштабная линейка 100 мкм) и (G) количественное определение с использованием изображений печени при трихромном окрашивании по Массону. (H) Относительный уровень экспрессии мРНК Acta2, Colla1, Col1a2 и Col3a1 в печени (п>5/группу). (I) Вестерн-блоттинг фосфорилированного и общего Erk после 10 недель использования рациона NC и HFMCD. (A, E, Н) Данные показаны в виде диаграммы типа ящик с усами с медианой (средняя линия), 25-75 процентилями (ящик) и минимальным-максимальным процентилями (усы); (C-D, G) данные представлены как среднее ±СО. (A, G) Двусторонний критерий Стьюдента; (C-D) двусторонний дисперсионный анализ; (E, Н), критерий Стьюдента с поправкой по Сидаку. (С) Значения при использовании NC и HFMCD через 6 недель аналогичны значениям, используемым на фиг. 20С; значения при использовании NC и HFMCD через 1 неделю аналогичны значениям, используемым на фигуре 22F. (D) Значения при использовании HFMCD через 6 недель аналогичны значениям, используемым на фигуре 20D; значения при использовании NC и HFMCD через 1 неделю аналогичны значениям, используемым на фигуре 22G. FC: кратность изменения; NC: нормальный корм; HFMCD: дефицит метионина и холина с высоким содержанием жира.

Фиг. 26А-26Е. Генетическое ингибирование сигнального пути ИЛ-11 защищает мышей от вызванных WDF патологических явлений НАСГ. Влияние WDF в течение 16 недель на (А) массу тела (п>6/группу) мышей ll11ra^+/+ (ДТ) и ll11ra’/’ (KO). (В) уровни триглицеридов в печени, (С) типичные изображения (масштабная линейка 100 мкм) и (D) количественное определение с использованием изображений печени при трихромном окрашивании по Массону, (E) относительные уровни экспрессии мРНК профиброзных генов (п>5/группу) в печени мышей ДТ и KO через 16 недель при использовании NC и WDF. (A, D) Данные показаны как среднее ±СО, двусторонний t-критерий Стьюдента; (В, E) данные показаны в виде диаграммы типа ящик с усами с медианой (средняя линия), 25-75 процентилями (ящик) и минимальным-максимальным процентилями (усы), t-критерий Стьюдента с поправкой по Сидаку. FC: кратность изменения; NC: нормальный корм; WDF: западный кормовой рацион +15% (мас./об.) фруктозы.

Фиг. 27А-27Е. Разработка нейтрализующего моноклонального антитела против ИЛ-HRA. (А) Ингибирование трансформации фибробластов предсердий человека, стимулированных TGFe1 (вверху), hyperlLH (в середине) и TGFe1 (внизу), в клетки ACTA2^+ve очищенными моноклональными антителамикандидатами мыши против ИЛ-HRA (6 мкг мл¹). (В) Взаимодействие Х209 с ИЛ-HRA, согласно ППР (1:1 Langmuir). (С) Фармакокинетика 125I-X209 в крови мышей (п=5). Результат аппроксимировали (R2=0,92) двухфазной моделью экспоненциального уменьшения. (D) Процент поглощения 125I-X209 печенью (п=5) в указанные моменты времени после ретроорбитальной инъекции. (E-F) Типичные флуоресцентные изображения (масштабная линейка 100 мкм) и количественное определение HSC, иммунологически окрашенных по коллагену 1 и обработанных различными факторами НАСГ, в присутствии (E) контрольного IgG, X203 или Х209 или в присутствии ингибиторов (F) MEK/ERK (U0126 или PD98059). (A,E-F) TGFe1 (5 нг/мл), ИЛ-11 (5 нг/мл), PDGF (20 нг/мл), Angll (100 нМ), bFGF (10 нг/мл), CCL2 (5 нг/мл), H₂O₂ (0,2 мМ), IgG, X203 и Х209 (2 мкг/мл), U0126 или PD98059 (10 мкМ); 24-часовая стимуляция. (C-D) Данные представлены как среднее +СО; (E-F) данные показаны в виде диаграммы типа ящик с усами с медианой (средняя линия), 25-75 процентилями (ящик) и минимальным-максимальным процентилями (усы), пунктирная линия представляет собой среднее исходное значение, t-критерий Стьюдента с поправкой Тьюки. FC: кратность изменения; I/A: интенсивность/площадь.

Фиг. 28A-28F. Нейтрализующие антитела против ИЛ-11 и ИЛ-HRA подавляют патологические яв

- 49 050147 ления НАСГ, индуцированные HFMCD и WDF. (A-D) Данные для терапевтического применения Х203 и Х209 у мышей, получавших корм HFMCD, как показано на фиг. 20А. (А) Количественное определение с использованием срезов печени при трихромном окрашивании по Массону (пунктирная линия представляет среднее значение при использовании NC). (В) Относительные уровни экспрессии мРНК генов фиброза в печени и (С) содержание триглицеридов в печени (п>5/группу). (D) Вестерн-блоттинг активации ERK в печени мышей, получавших NC, IgG и Х203 (10 мг/кг, два раза в неделю) при использовании корма HFMCD. (E) Количественное определение с использованием срезов печени при трихромном окрашивании по Массону, пунктирная линия представляет собой среднее значение для печени при стеатозе у мышей db/db в возрасте 12 недель (см. фиг. 20G) и (F) относительные уровни экспрессии мРНК профиброзных генов в печени мышей db/db со стеатозом и при использовании корма MCD, которым вводили IgG либо Х203, как показано на схеме (фиг. 20G, н>5/группу). (А,Е) Данные представлены как среднее значение +СО; (В-С, F) данные показаны в виде диаграммы типа ящик с усами с медианой (средняя линия), 25-75 процентилями (ящик) и минимальным-максимальным процентилями (усы). (A-C,E-F) Двухсторонний t-критерий Стьюдента с поправкой по Тьюки. FC: кратность изменения; NC: нормальный корм; HFMCD: дефицит метионина и холина с высоким содержанием жира; MCD: дефицит метионина и холина.

Фиг. 29А-29Е. Лечение нейтрализующими антителами против ИЛ-URA вызывает регрессию WDFиндуцированных патологических явлений НАСГ. (А-Е) Данные для исследования терапевтического вмешательства с использованием антител против ИЛ-URA у мышей, получающих корм WDF, как показано на схеме (фиг. 21А). Мыши, питавшиеся кормом WDF, получали IgG или Х209 (10 мг/кг) два раза в неделю в течение 8 недель, начиная с недели 16 до момента умерщвления (неделя 24). (А) Вестернблоттинг p-Erk и Erk в печени мышей при использовании NC или WDF в течение 24 недель. (В) Измерение массы тела раз в два месяца (п>4/группу). (С) Типичное (масштабная линейка 100 мкм) и (D) количественное определение с использованием изображений печени при трихромном окрашивании по Массону для мышей, получавших корм WDF в течение 16 недель (слева), в течение 24 недель с инъекцией IgG с 16-24 недели (в середине) и в течение 24 недель с обработкой Х209 с 16-24 недели (справа), пунктирная линия представляет среднее значение при использовании NC. (E) Относительные уровни экспрессии мРНК провоспалительных генов в печени (н>5/группу). (В, D) Данные представлены как среднее ±СО; (E) данные представлены в виде диаграммы типа ящик с усами с медианой (средняя линия), 25-75 процентилями (ящик) и минимальным-максимальным процентилями (усы). (D, E) Двухсторонний tкритерий Стьюдента с поправкой по Тьюки.

Фиг. 30A-30G. Нейтрализующие антитела против ИЛ-11 или ИЛ-URA вызывают регрессию индуцированного HFMCD фиброза печени и трансформации HSC в миофибробласты. (A-D) Данные для мышей, получавших IgG, X203 или Х209 в течение 1, 3 или 6 недель, как показано в 5G (эксперимент по регрессии влияния HFMCD) (А) Вестерн-блоттинг статуса активации ERK печени. (В) Типичное (масштабная линейка 100 мкм) и (С) количественное определение с использованием изображений печени при трихромном окрашивании по Массону для мышей, получавших IgG, X203 или Х209 в течение 6 недель. (D-G) Данные, полученные в экспериментах по регрессии трансформации HSC, как показано на фигурах 21K-21L;TGFe1 (5 нг/мл), PDGF (20 нг/мл), IgG, X203 и Х209 (2 мкг/мл). (D) Типичные флуоресцентные изображения (масштабная линейка 200 мкм) при иммунологическом окрашивании ACTA2^+ve после инкубирования с TGFe1 или с PDGF до или после добавления Х203, Х209 или IgG. Количество коллагена, секретируемого HSC, стимулированными (E) TGFe1 или (F) PDGF, до или после добавления IgG, X203 или Х209 (н=5/группу). (G) Вестерн-блоттинг статуса активации ERK в HSC, обработанных TGFe1, после обработки Х203 и Х209. (С) Данные представлены как среднее ±СО; (E-F) данные представлены в виде диаграммы типа ящик с усами с медианой (средняя линия), 25-75 процентилями (ящик) и минимальным-максимальным процентилями (усы). (С, E-F) Двухсторонний t-критерий Стьюдента с поправкой по Тьюки. FC: кратность изменения; NC: нормальный корм; HFMCD: дефицит метионина и холина с высоким содержанием жира.

Фиг. 31А-31Н. Нейтрализующие антитела против ИЛ-11 и ИЛ-URA защищают мышей, получавших корм HFMCD, от фиброза и воспаления печени. (A) CCL2 в супернатантах HSC (н=4/группу) без стимула (-), с ИЛ-11 или с TGFe1 в присутствии IgG, X203 или Х209 при использовании твердофазного ИФА; ИЛ-11 (5 нг мл¹), TGFe1 (5 нг мл^-1), IgG, X203 и Х209 (2 мкг мл^-1). (В-1) Данные для экспериментов с терапевтическим дозированием, показанные на фиг. 22В. (В) Типичные макроскопические изображения печени, (С) вестерн-блоттинг статуса активации ERK в печени, (D) типичные изображения (масштабная линейка 100 мкм) и (E) количественное определение с использованием изображений печени при трихромном окрашивании по Массону после 5-недельной ранней обработки Х203 и Х209. (F) Содержание гидроксипролина в печени (значения при использовании корма NC и HFMCD через 1 неделю аналогичны значениям, используемым на фигуре 25С, значения для IgG через 3 и 6 недель аналогичны значениям, используемым на фигуре 22F, н>5/группу), (G) относительные уровни экспрессии РНК маркеров фиброза в печени после 5 недель лечения Х203 и Х209, измеренные с помощью кПЦР, что подтверждает данные секвенирования РНК (значения при использовании NC через 6 недель для Col1a1, Col1a2, Col3a1

- 50 050147 и Acta2 аналогичны значениям, показанным на фигуре 28D, п>5/группу) и (Н) уровни АЛТ в сыворотке (значения при использовании NC и HFMCD через 1 неделю аналогичны значениям, используемым на фиг. 25D, значения IgG через 3 и 6 недель (2 недели и 5 недель лечения, соответственно) аналогичны значениям, используемым на фигуре 22G, п>5/группу). (A,E-F,H) Данные представлены как среднее ±СО; (G) данные показаны в виде диаграммы типа ящик с усами с медианой (средняя линия), 25-75 процентилями (ящик) и минимальным-максимальным процентилями (усы). (A,E,G) Двухсторонний tкритерий Стьюдента с поправкой по Тьюки; (F,H) двусторонний дисперсионный анализ. FC: кратность изменения; NC: нормальный корм; HFMCD: дефицит метионина и холина с высоким содержанием жира.

Фиг. 32A-32D. Нейтрализующие антитела против ИЛ-11 или против ИЛ-HRA приводят к регрессии молекулярной сигнатуры НАСГ, восстанавливая нормальный профиль печени. (A-D) Данные для секвенирования РНК и анализа представленности групп генов для ранних экспериментов с терапевтическим дозированием, как показано на фиг. 22А (п=3/группу). (А-В) Карты интенсивности, на которых показаны уровни экспрессии генов (масштабированные транскрипты на миллион отображенных прочтений, ТРМ) в образцах для всех генов, статистически дифференцированно экспрессируемых при обработке IgG и (А) Х209 или (В) Х203. Профиль экспрессии для кластеров лечения антителом против ИЛ-11 вместе с профилями при использовании NC, что указывает на почти полную регрессию влияния корма HFMCD на транскрипцию. (С) Карта интенсивности экспрессии генов липогенеза и β-окисления, демонстрирующая, что Х209 улучшало метаболизм липидов в печени в большей степени по сравнению с IgG, чем Х203. (D) Пузырьковая диаграмма, на которой показаны результаты анализа представленности групп генов (GSEA) для дифференциально экспрессируемых генов через 6 недель использования корма NC или HFMCD и терапии антителами. Каждая точка представляет собой нормированный показатель обогащения (NES) для набора генов и его скорректированный по FDR уровень значимости, обобщенный по цвету и размеру, соответственно. Наборы генов для анализа представленности выбраны из коллекции Н Hallmark в MSigDB. FC: кратность изменения; NC: нормальный корм; HFMCD: дефицит метионина и холина с высоким содержанием жира.

Фиг. ЗЗА-ЗЗК. Диаграммы рассеяния, ящичковые диаграммы, гистограммы и изображения, относящиеся к экспрессии рецепторов ИЛ-11 и ИЛ-6 и эффектам сигнального пути ИЛ-11 и ИЛ-6 в первичных гепатоцитах человека. (А) Типичные графики проточной цитометрии с прямым рассеянием (FSC) и интенсивности флуоресценции при окрашивании гепатоцитов по ИЛ-HRA, ИЛ-6R и gp130. (В) Представленность прочтений IL11RA1 и IL6R в гепатоцитах в исходный момент уровне на основе секвенирования РНК (слева) и Ribo-seq (справа) (количество транскриптов на миллион, ТРМ). (С и D) Охват прочтений транскриптов (C) IL11RA1 и (D) IL6R на основе секвенирования РНК и Ribo-seq в гепатоцитах человека (n=3). (Е и F) (Е) Вестерн-блоттинг, демонстрирующий статус активации ERK, JNK и STAT3 и (F) секрецию АЛТ гепатоцитами после стимуляции hyperlLH либо hyperlL6 в диапазоне доз. (G) Уровни АЛТ в супернатантах гепатоцитов, стимулированных hyperlLH отдельно или в присутствии возрастающего количества растворимого gp130 (sgp130). (Н и I) Вестерн-блоттинг лизатов гепатоцитов, демонстрирующий (Н) фосфорилированные ERK и JNK и их общую экспрессию в ответ на стимуляцию hyperlLH отдельно или с sgp130 и (I) фосфорилированный STAT3 и общий STAT3 в ответ на стимуляцию hyperlL6 с и без sgp130. (J) Типичные графики FSC при окрашивании гепатоцитов, стимулированных ИЛ-11, иодидом пропидия (PI) в присутствии sgp130 или растворимого ИЛ-HRA (sIL11RA). (K) Вестерн-блоттинг, демонстрирующий p-ERK, p-JNK и их общую экспрессию в гепатоцитах в ответ на стимуляцию ИЛ-11 отдельно или в присутствии sgp130 или sIL11RA. (А-K) первичные гепатоциты человека; (Е-K) 24часовая стимуляция; (Е-K) hyperlLH, hyperlL6, ИЛ-11 (20 нг/мл), sgp130, sIL11RA (1 мкг/мл). (В, F-G) Данные показаны в виде диаграммы типа ящик с усами с медианой (средняя линия), 25-75 процентилями (ящик) и минимальным и максимальным значениями (усы).

Фиг. 34А-34К. Графики, диаграммы рассеяния и изображения, демонстрирующие, что нагруженные липидами гепатоциты секретируют ИЛ-11, который управляет несколькими липотоксическими фенотипами посредством аутокринного цис-сигнального пути ИЛ-11. (А-K) Данные для экспериментов по загрузке первичных гепатоцитов человека пальмитатом в присутствии IgG (2 мкг/мл), антитела против ИЛ11RA (x209, 2 мкг/мл) или sgp130 (1 мкг/мл). (А) Уровни секреции белка ИЛ-11, (В) ИЛ-6, (С) CCL2 и (D) CCL5, измеренные с помощью твердофазного ИФА в супернатантах. (Е и F) (Е) Типичные графики FSC и (F) количественное определение Pl+ve-гепатоцитов, стимулированных пальмитатом. (G) Уровни АЛТ в супернатантах. (Н) Уровни глутатиона в гепатоцитах (GSH). (I) Типичные флуоресцентные изображения при окрашивании DCFDA (обнаружение АФК; масштабная линейка 100 мкм). (J) Вестернблоттинг pERK, ERk, pJNK, JNK, расщепленной каспазы 3, каспазы 3, NOX4, FASN и GAPDH (K) Типичные изображения при окрашивании Oil Red О (масштабная линейка 100 мкм). (A-D, F-H) Среднее ±СО; t-критерий Стьюдента с поправкой по Тьюки.

Фиг. 35А-35Р. Схема, изображения и ящичковые диаграммы, демонстрирующие, что ингибирование транс-сигнального пути цитокинов семейства ИЛ-6 не влияет на НАСГ или метаболические фенотипы у мышей, получавших западный кормовой рацион с добавлением фруктозы. (А) Схема получения корма WDF у мышей с гепатоцит-специфической экспрессией sgp130 для данных, показанных на (В-Р).

- 51 050147

Через три недели после инъекции вируса AAV8-Alb-Null или AAV8-Alb-sgp130 мышей кормили WDF в течение 16 недель. (В) Вестерн-блоттинг, демонстрирующий уровни sgp130, ИЛ-11, ИЛ-6 и GAPDH в печени в качестве внутреннего контроля. (С) Уровни ИЛ-11 в сыворотке. (D) Уровни ИЛ-6 в сыворотке. (Е) Типичные макроскопические изображения печени и изображения печени при окрашивании гематоксилином и эозином. (F) Масса печени. (G) Содержание триглицеридов в печени. (Н) Уровни АЛТ в сыворотке. (I) Уровни ACT в сыворотке. (J) Уровни коллагена в печени. (K) Уровни глюкозы в крови натощак. (L) Уровни триглицеридов в сыворотке. (М) Уровни холестерина в сыворотке. (N) Содержание GSH в печени. (О) Карта интенсивности экспрессии провоспалительных и фиброзных генов в печени (значения показаны на фиг. 41D и 41Е). (Р) Вестерн-блоттинг p-ERK, ERK, p-JNK, JNK, p-STAT3 и STAT3 в печени. (C-N) Данные показаны в виде диаграмм типа ящик с усами с медианой (средняя линия), 25-75 процентилями (ящик) и минимальным и максимальным значениями (усы), t-критерий Стьюдента с поправкой по Тьюки; слева направо показаны следующие условия: NC Null, WDF Null, WDF sgp130.

Фиг. 36A-36K. Схема, изображения, графики и ящичковые диаграммы, демонстрирующие, что гепатоцит-специфичное ингибирование цис-сигнального пути ИЛ-11 защищает мышей, получающих корм HFMCD, от кахексии и НАСГ. (А) Схема кормления HFMCD для мышей ll11ra1_loxP/]o_xP, получавших инъекции AAV8-Alb-Cre (условный нокаут; CKO), в экспериментах, показанных на (В-K). Мышам ll11ra1_loxP/loxP внутривенно вводили AAV8-Alb-Null либо AAV8-Alb-Cre для специфичной делеции П11га1 в гепатоцитах за три недели до начала кормления HFMCD. (В) Вестерн-блоттинг ИЛ-URA и GAPDH в печени. (С) Масса тела (в процентах (%) от исходной массы тела). (D) Типичные макроскопические изображения печени и изображения печени, окрашенной гематоксилином и эозином. (Е) Содержание триглицеридов в печени. (F) Уровни АЛТ в сыворотке. (G) Уровни ACT в сыворотке. (Н) Содержание GSH в печени. (I) Уровни коллагена в печени. (J) Карта интенсивности, демонстрирующая экспрессию мРНК провоспалительных маркеров (Tnfa, Ccl2, Ccl5) и фиброзных маркеров (Col1a1, Col1a2, Col3a1, Acta2) в печени. Значения показаны на фигурах 43А и 43В. (K) Вестерн-блоттинг, демонстрирующий статус активации ERK и JNK в печени. (С) Данные показаны как среднее ±SEM, 2-сторонний дисперсионный анализ с множественным критерием сравнения Тьюки, статистическая значимость показана как значения Р между HFMCD ДТ и CKO; (E-I) Данные показаны в виде диаграмм типа ящик с усами с медианой (средняя линия), 25-75 процентилями (ящик) и минимальным и максимальным значениями (усы), tкритерий Стьюдента с поправкой по Сидаку; слева направо показаны следующие условия: NC ДТ, NC CKO, HFMCD ДТ, HFMCD CKO.

Фиг. 37А-37М. Схема, изображения, графики и ящичковые диаграммы, демонстрирующие, что мыши с гепатоцит-специфичным ингибированием цис-сигнального пути ИЛ-11 защищены от вызванного WDF ожирения и НАСГ. (А) Схема эксперимента для контрольных мышей и мышей с CKO при использовании корма WDF для данных, показанных на (В-М). Через три недели после инъекции AAV8-Alb-Null или AAV8-Alb-Cre мышей с CKO кормили WDF в течение 16 недель. (В) Вестерн-блоттинг, демонстрирующий уровни ИЛ-URA и GAPDH в печени. (С) Масса тела (в процентах (%) от исходной массы тела). D) Масса жира. (Е) Типичные макроскопические изображения печени и изображения печени при окрашивании гематоксилином и эозином. (F) Содержание триглицеридов в печени. (G) Масса печени. (Н) Уровни АЛТ в сыворотке. (I) Уровни ACT в сыворотке. (J) Содержание GSH в печени. (K) Уровни коллагена в печени. (L) Экспрессия провоспалительных и фиброзных генов в печени на карте интенсивности (значения показаны на фигурах 44А и 44В). (М) Вестерн-блоттинг, демонстрирующий статус активации ERK и JNK в печени. (С и D) Данные показаны как среднее ±SEM, 2-сторонний дисперсионный анализ с множественным критерием сравнения Тьюки, статистическая значимость показана как значения Р между WDF ДТ и CKO; (F-K) Данные показаны в виде диаграммы типа ящик с усами с медианой (средняя линия), 25-75 процентилями (ящик) и минимальным и максимальным значениями (усы), t-критерий Стьюдента с поправкой по Сидаку; слева направо показаны следующие условия: NC ДТ, NC CKO, WDF ДТ, WDF CKO.

Фиг. 38A-38N. Схема, изображения и ящичковые диаграммы, демонстрирующие, что стеатогепатит у мышей, получающих корм WDF, вызывает гепатоцит-специфичный цис-сигнальный путь, но не транссигнальный путь ИЛ-11. (А) Схема использования корма WDF у мышей l11ra1^+/+ (ДТ) и ППгаГ/’ (KO) для экспериментов, показанных на (B-N). Мышей KO, получавших инъекции AAV8-Alb-Null, AAV8Alb-mbll11ra1 (полноразмерный мембраносвязанный Ил-11ra1) и AAV8-Alb-sll11ra1 (растворимая форма Ил-11ra1), кормили WDF в течение 16 недель, начиная с момента через три недели после введения вируса. (В) Вестерн-блоттинг, демонстрирующий уровни ИЛ-URA и GAPDH в печени. (С) Типичные макроскопические изображения печени и изображения печени при окрашивании гематоксилином и эозином. (D) Масса печени. (Е) Содержание триглицеридов в печени. (F) Уровни АЛТ в сыворотке. (G) Уровни ACT в сыворотке. (Н) Содержание GSH в печени. (I) Содержание коллагена в печени. (J) Карта интенсивности экспрессии провоспалительных и фиброзных генов в печени (значения показаны на фиг. 45С и 45D). (K) Вестерн-блоттинг, демонстрирующий статус активации ERK и JNK в печени. (L) Уровни глюкозы в крови натощак. (М) Уровни триглицеридов в сыворотке. (N) Уровни холестерина в сыворотке. (DI, L-N) Данные показаны в виде диаграмм типа ящик с усами с медианой (средняя линия), 25-75 про

- 52 050147 центилями (ящик) и минимальным и максимальным значениями (усы), t-критерий Стьюдента с поправкой по Тьюки; слева направо показаны следующие условия: NC Null ДТ, WDF Null ДТ, WDF Null KO, WDF mbll11ra1 KO, WDF sll11ra1 KO.

Фиг. 39. Схема предполагаемого механизма сигнального пути ИЛ-11 при НАСГ. Чрезмерное накопление липидов в гепатоцитах приводит к липотоксичности, приводящей к продукции активных форм кислорода, что запускает трансляцию и секрецию белка ИЛ-11. ИЛ-11 связывается с ИЛ-HRA и gp130 на гепатоцитах, инициируя аутокринную активацию ERK, JNK и каспазы 3, что приводит к липоапоптозу. ИЛ-11 также действует паракринным образом, стимулируя трансформацию покоящихся звездчатых клеток печени (HSC) в активированные миофибробласты. Цитокины и хемокины, высвобождаемые из липотоксических гепатоцитов и HSC, активируют и рекрутируют иммунные клетки, вызывающие воспаление. Таким образом, аутокринный цис-сигнальный путь ИЛ-11 в гепатоцитах является важным инициирующим событием для всех патологических явлений НАСГ.

Фиг. 40A-40I. Диаграммы рассеяния, ящичковые диаграммы, изображения и графики, относящиеся к экспрессии рецепторов ИЛ-11 и ИЛ-6 и эффектам сигнального пути ИЛ-11 и ИЛ-6 в первичных гепатоцитах человека. (А) Типичные графики FSC при окрашивании активированных клеток ТНР-1 на ИЛ11RA, ИЛ-6R и gp130. (В) Транскрипты gp130 в первичных гепатоцитах человека на основе секвенирования РНК и Ribo-seq (количество транскриптов на миллион, ТРМ). (С) Охват прочтений транскриптов gp130 на основе секвенирования РНК и Ribo-seq в первичных гепатоцитах человека (n=3). (D) Иммунофлуоресцентные изображения (масштабная линейка 100 мкм) экспрессии ИЛ-HRA, ИЛ-6R, gp130 и альбумина в первичных гепатоцитах человека и активированных клетках ТНР-1. (Е) Исходные уровни растворимого ИЛ-6R в среде для гепатоцитов. (F) Количественное определение при окрашивании ИЛ-11стимулированных первичных гепатоцитов человека PI (PI+ve-клетки) в присутствии sgp130 или sIL11RA. (G) Влияние увеличения концентрации ИЛ-11 в зависимости от дозы в присутствии 1 мкг/мл sgp130 или sIL11RA на уровни АЛТ, секретируемой первичными гепатоцитами человека. (Н) Влияние увеличения концентрации sgp130 либо sIL11RA в зависимости от дозы на индуцированную ИЛ-11 секрецию АЛТ. (I) Уровни триглицеридов в гепатоцитах после стимуляции пальмитатом в присутствии IgG (2 мкг/мл), антитела против ИЛ-HRA (X209, 2 мкг/мл) или sgp130 (1 мкг/мл). (В, G-Н) Данные представлены в виде диаграмм типа ящик с усами с медианой (средняя линия), 25-75 процентилями (ящик) и минимальным и максимальным значениями (усы); (E-F, I) данные представлены как среднее ±SEM; (F-I) t-критерий Стьюдента с поправкой по Тьюки. (G) для каждой концентрации ИЛ-11 слева направо показаны следующие условия: BL, sgp130, sIL11RA. (H) для каждой концентрации ИЛ-11 + sgp130/ИЛ-11RA слева направо показаны следующие условия: sgp130, sIL11RA.

Фиг. 41А-41Е. Схема, ящичковые диаграммы и график, демонстрирующие, что экспрессия sgp130 не защищает мышей от WDF-индуцированных фенотипов печени и ожирения. (А) Схема структуры доменов белка gp130 и их положения в аминокислотной последовательности (слева) и домены, которые использовались для конструирования sgp130 в настоящем исследовании (справа). (В-Е) Данные для экспериментов WDF-sgp130 in vivo, показанных на фиг. 35А. (В) Уровни gp130 в сыворотке контрольных мышей, получавших корм NC, и мышей, получавших корм WDF, которым вводили инъекции AAV8-AlbNull и AAV8-Alb-sgp130. (С) Влияние корма WDF в течение 16 недель на массу тела мышей, которым вводили инъекции AAV8-Alb-Null и AAV8-Alb-sgp130. Данные представлены как среднее ±SEM. (D и Е) Экспрессия мРНК (D) провоспалительных маркеров (Tnfa, Ccl2, Ccl5) и (Е) маркеров фиброза (Col1a1, Col1a2, Col3a1, Acta2) в печени, как показано на фиг. 35O. (В, D-E) Данные показаны в виде диаграммы типа ящик с усами с медианой (средняя линия), 25-75 процентилями (ящик) и минимальным и максимальным значениями (усы), t-критерий Стьюдента с поправкой по Тьюки; слева направо показаны следующие условия: NC Null, WDF Null, WDF sgp130.

Фиг. 42A-42N. Схема, изображения и ящичковые диаграммы, демонстрирующие, что ингибирование предполагаемого транс-сигнального пути членов семейства ИЛ-6 не влияет на фенотипы НАСГ у мышей, получавших корм HFMCD. (А) Схема эксперимента на мышах с гепатоцит-специфичной экспрессией sgp130, получавших корм HFMCD, для данных, показанных на (B-N). Мышам внутривенно вводили AAV8-Alb-Null либо AAV8-Alb-sgp130 и кормили HFMCD в течение 4 недель. (В) Вестернблоттинг, демонстрирующий уровни sgp130, ИЛ-11 и ИЛ-6 в печени, причем уровень GAPDH показан в качестве внутреннего контроля. (С) Уровни gp130 в сыворотке. (D) Уровни ИЛ-11 в сыворотке. (Е) Уровни ИЛ-6 в сыворотке. (F) Типичные макроскопические изображения печени и изображения печени при окрашивании гематоксилином и эозином. (G) Содержание триглицеридов в печени.

(Н) Уровни АЛТ в сыворотке. (I) Уровни ACT в сыворотке. (J) Содержание GSH в печени. (K) Уровни коллагена в печени (L и М) Экспрессия мРНК (L) провоспалительных маркеров (Tnfa, Ccl2, Ccl5) и (М) маркеров фиброза (Col1a1, Col1a2, Col3a1, Acta2) в печени. (N) Вестерн-блоттинг p-ERK, ERK, p-JNK, JNK, p-STAT3, STAT3 в печени. (С-Е, G-M) Данные показаны в виде диаграммы типа ящик с усами с медианой (средняя линия), 25-75 процентилями (ящик) и минимальным и максимальным значениями (усы), t-критерий Стьюдента с поправкой по Тьюки; слева направо показаны следующие условия: NC Null, HFMCD Null, HFMCD sgp130.

- 53 050147

Фиг. 43А и 43В. Диаграммы типа ящик с усами, демонстрирующие, что мыши с гепатоцитспецифичной делецией ll11ra1 защищены от HFMCD-индуцированной дисрегуляции гена. (А и В) Экспрессия мРНК (А) провоспалительных маркеров (Tnfa, Ccl2, Ccl5) и (В) маркеров фиброза (Col1a1, Col1a2, Col3a1, Acta2) в печени контрольных мышей и мышей с CKO, получавших корм NC и HFMCD, как показано на фиг. 36J. (А-В) Данные показаны в виде диаграммы типа ящик с усами с медианой (средняя линия), 25-75 процентилями (ящик) и минимальным и максимальным значениями (усы), tкритерий Стьюдента с поправкой по Сидаку; для каждого гена слева направо показаны следующие условия: NC ДТ, NC CKO, HFMCD ДТ, HFMCD CKO.

Фиг. 44А-44Е. Ящичковые диаграммы, демонстрирующие, что мыши с гепатоцит-специфичной делецией ll11ra1 защищены от фенотипов НАСГ, индуцированных WDF. (А-Е) Данные для контрольных мышей и мышей с CKO, получавших корм NC и WDF, как показано на фиг. 37А. (А и В) Экспрессия мРНК (А) провоспалительных маркеров (Tnfa, Ccl2, Ccl5) и (В) маркеров фиброза (Col1a1, Col1a2, Col3a1, Acta2) в печени, как показано на фигуре 37L. (С) Уровни глюкозы в крови натощак. (D) Уровни триглицеридов в сыворотке. (Е) Уровни холестерина в сыворотке. (А-Е) Данные показаны в виде диаграммы типа ящик с усами с медианой (средняя линия), 25-75 процентилями (ящик) и минимальным и максимальным значениями (усы), t-критерий Стьюдента с поправкой по Сидаку. (А и В) для каждого гена слева направо показаны следующие условия: NC ДТ, NC CKO, WDF ДТ, WDF CKO. (С-Е) слева направо показаны следующие условия: NC ДТ, NC CKO, WDF ДТ, WDF CKO.

Фиг. 45A-45D. Схема и ящичковые диаграммы, демонстрирующие, что WDF-индуцированный стеатогепатит у мышей стимулирует гепатоцит-специфичный цис-сигнальный путь, но не транс-сигнальный путь ИЛ-11. (А) Схема структуры доменов полноразмерного мембраносвязанного белка ИЛ-URA и их положения в аминокислотной последовательности (слева) и домены, которые использовали для конструирования растворимого ИЛ-URA (справа). (B-D) Данные для схемы использования корма WDF у мышей ll11ra1^+/+ (ДТ) и мышей с глобальной делецией для Ил-11ra ((ll11гаГ^/_; мышей KO), которым вводили инъекции AAV8-Alb-Null, AAV8-Alb-mbll11ra1 (полноразмерный мембраносвязанный Ил-11ra1) или AAV8-Alb-sll11ra1 (растворимая форма Ил-11ra1), как проиллюстрировано на фиг. 38А. (В) Уровни ИЛ11RA в сыворотке мышей KO, получавших корм WDF и инъекции AAV8-Alb-Null и AAV8-Alb-sll11ra1. (С и D) Экспрессия мРНК (С) провоспалительных маркеров (Tnfa, Ccl2, Ccl5) и (D) маркеров фиброза (Col1a1, Col1a2, Col3a1, Acta2) в печени. (B-D) Данные показаны в виде диаграммы типа ящик с усами с медианой (средняя линия), 25-75 процентилями (ящик) и минимальным и максимальным значениями (усы), t-критерий Стьюдента с поправкой по Тьюки. (С и D) для каждого гена слева направо показаны следующие условия: NC Null ДТ, WDF Null ДТ, WDF Null KO, WDF mbll11ra1 KO, WDF sll11ra1 KO.

Фиг. 46A-46L. Схема, изображения и ящичковые диаграммы, демонстрирующие, что стеатогепатит у мышей, получающих корм HFMCD, вызывает гепатоцит-специфичный цис-сигнальный путь, но не транс-сигнальный путь ИЛ-11. (А) Схема экспериментов на мышах ДТ и KO, получавших корм HFMCD, показанных на (B-L). Мышам с KO внутривенно вводили AAV8-Alb-Null либо AAV8-Alb-mbll11ra1 или AAV8-ALB-sll11ra1; мыши ДТ получали AAV8-Alb-Null в качестве контроля. Через три недели после введения вируса мышей начинали кормить HFMCD в течение 4 недель. (В) Вестерн-блоттинг, демонстрирующий уровни ИЛ-URA и GAPDH в печени. (С) Уровни ИЛ-URA в сыворотке. (D) Типичные макроскопические изображения печени и изображения печени, окрашенной гематоксилином и эозином. (Е) Содержание триглицеридов в печени. (F) Уровни АЛТ в сыворотке. (G) Уровни ACT в сыворотке. (Н) Уровни GSH в печени. (I) Содержание коллагена в печени. (J и K) Экспрессия мРНК (J) провоспалительных маркеров (Tnfa, Ccl2, Ccl5) и (K) маркеров фиброза (Col1a1, Col1a2, Col3a1, Acta2) в печени. (L) Вестерн-блоттинг, демонстрирующий статус активации ERK и JNK в печени. (С, Е-K) Данные показаны в виде диаграммы типа ящик с усами с медианой (средняя линия), 25-75 процентилями (ящик) и минимальным и максимальным значениями (усы), t-критерий Стьюдента с поправкой по Тьюки. (Е-I) слева направо показаны следующие условия: NC Null ДТ, HFMCD Null ДТ, HFMCD Null KO, HFMCD mbl11ra1 KO, HFMCD sll11ra1 KO. (J и K) для каждого гена слева направо показаны следующие условия: NC Null ДТ, HFMCD Null ДТ, HFMCD Null KO, HFMCD mbll11ra1 KO, HFMCD sll11ra1 KO.

Фиг. 47А и 47В. Графики и изображения, демонстрирующие, что звездчатые клетки поджелудочной железы (PSC) экспрессируют ИЛ-HRa и gp130, но не ИЛ-6Ra. (А) Анализ экспрессии генов II6st (кодирующего gp130), ll11ra1 и IIra6 в одиночных PSC и клетках протоков мыши посредством секвенирования РНК. (В) Иммунофлуоресцентный анализ экспрессии белка gp130, ИЛ-11RA и ИЛ-6RA в PSC человека.

Фиг. 48А и 48В. Ящичковые диаграммы и изображения, демонстрирующие активацию звездчатых клеток поджелудочной железы (PSC) до aSMA-положительного, экспрессирующего коллаген фиброгенного фенотипа. (А) Количественное определение путем одномоментной многопараметрической визуализации доли АСТА2-положительных клеток и интенсивности/площади коллагена I после стимуляции PSC in vitro в течение 24 ч указанными факторами в присутствии или в отсутствие нейтрализующего антитела против ИЛ-URA или изотипического контрольного IgG-антитела. (В) Типичные изображения для анализа путем одномоментной многопараметрической визуализации интенсивности/площади коллагена I после стимуляции PSC in vitro в течение 24 ч указанными факторами в присутствии нейтрализующего ан

- 54 050147 титела против ИЛ-11RA или изотипического контрольного IgG-антитела.

Фиг. 49А-49С. Схема, ящичковые диаграммы и изображения, относящиеся к индукции фиброза поджелудочной железы in vivo у трансгенных мышей с индуцибельной фибробласт-специфичной экспрессией ИЛ-11. (А) Схематическое представление эксперимента, в котором у трансгенных мышей Col1a2-CreER Rosa26ll11/+ (IL11 Tg) индуцировали экспрессию ИЛ-11 в фибробластах обработкой тамоксифеном. (В) Содержание гидроксипролина в ткани поджелудочной железы контрольных мышей и мышей IL11 Tg через 24 дня. (С) Типичные изображения при трихромном окрашивании по Массону ткани поджелудочной железы контрольных мышей и мышей IL11 Tg через 24 дня.

Фиг. 50А-50С. Схема, ящичковые диаграммы и изображения, относящиеся к эффекту антагонизма сигнального пути, опосредованного ИЛ-11, в модели повреждения поджелудочной железы путем перевязки протока поджелудочной железы (PDL). (А) Схематическое представление эксперимента, в котором индуцировали повреждение поджелудочной железы посредством PDL, a затем лечили мышей нейтрализующим антителом против ИЛ-HRA или изотипическим контрольным IgG-антителом. (В) Масса лигированной доли для мышей, получавших нейтрализующее антитело против ИЛ-HRA или контрольное изотипическое IgG-антитело через 14 дней. (С) Типичные изображения при трихромном окрашивании по Массону ткани поджелудочной железы мышей, получавших нейтрализующее антитело против ИЛ-HRA или изотипическое контрольное IgG-антитело через 14 дней.

Примеры

В следующих примерах авторы изобретения демонстрируют, что ингибирование сигнального пути, опосредованного ИЛ-11, снижает тяжесть и устраняет симптомы ряда метаболических заболеваний.

Пример 1. Общие способы для примеров 1-4.

Мыши с нокаутом ИЛ-11-RA.

Мыши без функциональных аллелей ИЛ-Hra (ll11ra-/-) характеризовались фоновым генотипом C57BI/6J (B6.129S1-ll11ratm1Wehi/J, Jackson 's Laboratory).

Обработка антителом против ИЛ-11 или антителом против ИЛ-HRa.

Мышам внутрибрюшинно вводили 10 мг/кг антагонистического антитела против ИЛ-11, антагонистического антитела против ИЛ-HRa или идентичного количества изотипически сходного контрольного антитела IgG. Антитела против ИЛ-11 и против ИЛ-11Ra связывались с ИЛ-11 мыши и ИЛ-HRa мыши, соответственно, и ингибировали сигнальный путь, опосредованный ИЛ-11.

В частности, антитело против ИЛ-11, используемое в настоящих примерах, представляло собой IgG X203 мыши против ИЛ-11 мыши, которое описано, например, в источнике Ng et al., Sci Transl Med. (2019) 11(511) pii: eaaw1237 (также опубликованном как Ng, et al., IL-11 is a therapeutic target in idiopathic pulmonary fibrosis. bioRxiv 336537; doi: https://doi.org/10.1101/336537). X203 также было известно под названием Enx203 и содержало область VH, соответствующую SEQ ID NO:92 из WO 2019/238882 A1 (SEQ ID NO:22 в настоящем изобретении), и область VL, соответствующую SEQ ID NO:94 из WO 2019/238882 А1 (SEQ ID NO:23 в настоящем изобретении).

Антитело против ИЛ-HRa, использованное в настоящих примерах, представляло собой IgG X209 мыши против ИЛ-HRa мыши, которое описано, например, в источнике Widjaja et al., Gastroenterology (2019) 157(3):777-792 (также опубликованном как Widjaja, et al., IL-11 neutralising therapies target hepatic stellate cell-induced liver inflammation and fibrosis in NASH. bioRxiv 470062; doi: https://doi.org/10.1101/470062). X209 также было известно под названием Enx209 и содержало область VH, соответствующую SEQ ID NO:7 из WO 2019/238884 А1 (SEQ ID NO:24 в настоящем изобретении), и область VL, соответствующую SEQ ID NO:14 из WO 2019/238884 А1 (SEQ ID NO:25 в настоящем изобретении).

Кормовые рационы.

Западный кормовой рацион с фруктозой (WDF) использовали для установления метаболических расстройств, которые напоминают расстройства, наблюдающиеся у людей во время ожирения, СД2 и НАЖБП (Baena et al., Sci Rep (2016) 6: 26149, Machado et al., PLoS One (2015) 10:e0127991).

Для установления таких метаболических заболеваний, как ожирение и СД2, мышей кормили западным кормовым рационом (D12O79B, Research Diets) с добавлением 15% (мас./об.) фруктозы в питьевой воде (WDF) в течение 16 недель, начиная с 12-недельного возраста.

Для установления метаболического расстройства, аналогичного кахексии, использовали кормовой рацион с высоким содержанием метионина и дефицитом холина (HFMCD). Для установления потери веса при кахексии и потери безжировой массы мышей C57BL/6N кормили рационом с дефицитом метионина и холина (HFMCD) с добавлением 60 ккал% жира (А06071301В, Research Diets).

Контрольные субъекты получали нормальный корм (NC, Specialty Feeds) и питьевую воду.

Эхо-МРТ анализ состава тела.

Измерения общего жира и безжировой массы тела выполняли каждые две недели с помощью анализа эхо-МРТ с использованием анализатора состава тела для живых мелких животных 4in1 Body Composition Analyzer for Live Small Animals.

Измерение уровня глюкозы в крови натощак.

- 55 050147

Для измерения уровня глюкозы в крови натощак мышей не кормили в течение 6 ч перед отбором крови (путем обрезания хвоста) и для измерения уровня глюкозы натощак использовали глюкометр Accu-Chek.

Внутрибрюшинный анализ толерантности к глюкозе (ipGTT).

Для внутрибрюшинного анализа толерантности к глюкозе мышей не кормили в течение 6 ч перед процедурой ipGTT. Базальный уровень глюкозы натощак измеряли путем обрезания хвоста с использованием глюкометра Accu-Chek. Внутрибрюшинно вводили 2 г глюкозы/кг безжировой массы и выполняли измерения глюкозы каждые 15 мин в течение 2 ч. Площадь под кривой (ППК) рассчитывали и отображали в виде гистограмм.

Гистология поджелудочной железы для выявления островков Лангерганса, глюкагона и инсулина.

Для гистологического анализа вырезали образцы поджелудочной железы, фиксировали их в течение 24 ч при КТ в 4% нейтральном забуференном формалине (NBF) и хранили в 30% сахарозе. Криосрезы толщиной 5 мкм окрашивали антителами против глюкагона или инсулина в течение ночи, визуализировали с помощью набора для обнаружения полимера ПХ-IgG ImmPRESS (Vector Laboratories) с субстратом для пероксидазы ImmPACT DAB Peroxidase Substrate (Vector Laboratories) в соответствии со стандартными протоколами и исследовали с помощью светового микроскопа.

Пример 2: антагонизм сигнального пути, опосредованного ИЛ-11. при расстройствах, связанных с ожирением.

Для исследования влияния антагонизма сигнального пути, опосредованного ИЛ-11, на ожирение и связанные с ним расстройства, например, СД2, выполняли эксперименты in vivo с использованием вызванных кормовым рационом моделей этих метаболических заболеваний у мышей, используя мышей с нокаутом рецептора ИЛ-11 альфа (IL11-RA-/-), или путем лечения мышей антагонистическим антителом против ИЛ-11 мыши или антагонистическим антителом против ИЛ-11-RA мыши.

Мыши с нокаутом ИЛ-URA, получавшие нормальный кормовой рацион (NCD) или WDF, демонстрировали улучшенный метаболический фенотип по сравнению с однопометными животными дикого типа, экспрессирующими ИЛ-URA.

На фиг. 1А и 1В показано, что масса тела в большей степени увеличивалась у мышей дикого типа, чем у мышей с нокаутом ИЛ-11RA.

На фиг. 2А и 2В показано, что мыши с нокаутом ИЛ-URA характеризовались значительно меньшей общей массой жира в организме по сравнению с мышами дикого типа.

На фиг. 3 показано, что мыши с нокаутом ИЛ-URA характеризовались значительно более низкими уровнями глюкозы в крови натощак по сравнению с мышами дикого типа.

На фигуре 4 показано, что мыши с нокаутом ИЛ-URA характеризовались значительно более низкими уровнями триглицеридов в сыворотке по сравнению с мышами дикого типа.

На фигурах 5А и 5В показано, что мыши с нокаутом ИЛ-URA характеризовались значительно более низкими уровнями холестерина в сыворотке по сравнению с мышами дикого типа.

Результаты показали, что подавление сигнального пути, опосредованного ИЛ-11, благотворно влияло на метаболизм.

Затем авторы изобретения исследовали влияние антагонистического антитела против ИЛ-URA или контрольного антитела IgG на мышей, получавших корм WDF.

Примечательно, что мыши, получавшие антитело против ИЛ-URA и корм WDF, демонстрировали значительное снижение массы тела по сравнению с контрольными мышами, получавшими IgG и корм WDF (фиг. 6А). Аналогично мышам с KO ИЛ-URA (фиг. 3), эти мыши, получавшие антитело против ИЛ-URA, также демонстрировали значительное снижение жировой массы (фиг. 6В).

Интересно, что у мышей, получавших антитело против ИЛ-URA, также наблюдалось увеличение безжировой массы по сравнению с мышами, получавшими контрольный IgG, что указывает на то, что ингибирование сигнального пути ИЛ-11 во время метаболического патогенеза, индуцированного WDF, восстанавливало мышечную массу. Кроме того, результаты внутрибрюшинного анализа толерантности к глюкозе (ipGTT), наряду с измерением глюкозой натощак, продемонстрировали значительное улучшение толерантности к глюкозе у мышей, получавших антитело против ИЛ-11RA (фиг. 7А и 7В).

Этот анализ также применили к эффектам, проявляющимся по отношению к поджелудочной железе. Неожиданно обнаружили, что мыши, получавшие антитело против ИЛ-URA и корм WDF, демонстрировали выраженную защиту от потери массы поджелудочной железы, вызванной WDF (фиг. 8), независимо от того, получали ли они лечение в течение 8-16 недель (для защиты от эффектов, ассоциированных с метаболическим заболеванием) или в течение 16-24 недель (для устранения эффектов, ассоциированных с метаболическим заболеванием), по сравнению с мышами, получавшими контрольный IgG.

На фиг. 9А показано, что мыши, получавшие антитело против ИЛ-URA и корм WDF, характеризовались значительно более низкими уровнями холестерина в сыворотке по сравнению с мышами, получавшими контрольный IgG и корм WDF, а на фигуре 9В показано, что мыши, получавшие антитело против ИЛ-URA и корм WDF, характеризовались значительно более низкими уровнями триглицеридов в сыворотке по сравнению с мышами, получавшими контрольный IgG и корм WDF.

На фигуре 9С показано, что мыши, получавшие антитело против ИЛ-URA и корм с WDF, характе

- 56 050147 ризовались значительно более низкими уровнями глюкозы в крови натощак по сравнению с контрольными мышами, получавшими IgG и корм WDF.

Кроме того, иммуногистология поджелудочной железы также выявила увеличение окрашивания по глюкагону и инсулину в островках поджелудочной железы наряду с гиперплазией островков у мышей, получавших IgG и корм WDF (фиг. 10А и 10В), что является классическими признаками СД2 (BonnerWeir and O'Brien Diabetes (2008) 57:2899-2904). Лечение мышей, получавших WDF в течение 16-24 недель, антителом против ИЛ-URA значительно уменьшало гиперплазию островков и окрашивание по глюкагону, а также улучшало экспрессию инсулина в островках у мышей, получавших WDF (фиг. 10А и 10В), что позволяет предположить, что антагонизм сигнального пути, опосредованного ИЛ-11, полезен для улучшения и регрессии метаболических заболеваний, вызванных использованием рациона западного типа.

Пример 3: антагонизм сигнального пути, опосредованного ИЛ-11, и кахексии.

Терапиевтические средства против ИЛ-11 оценивали на предмет их влияния на модель кахексии у мышей.

Кормление мышей рационом с дефицитом метионина и холина (MCD) вызывало тяжелый неалкогольный стеатогепатит (НАСГ), воспаление печени и фиброз, а также приводило к тяжелой и устойчивой потере веса (до 30% массы тела после 3 недель использования рациона MCD). Хотя мыши, получавшие рацион MCD, характеризовались на 36% более высокими показателями метаболизма по сравнению с мышами, получавшими нормальный кормовой рацион (NCD), и средой, в значительной степени стимулирующей аппетит (низкий уровень лептина, низкий уровень глюкозы, низкий уровень ТГ/холестерина, низкий уровень инсулина), потребление пищи у них не увеличивалось (Rizki et al. J. Lipid Res. (2006) 47:2280-2290). Таким образом, рацион MCD является хорошо известной моделью кахексии, у которой много общих черт с кахексией, ассоциированной с раком. Стеатогепатит часто документируют при экспериментальной кахексии и при онкологической кахексии у людей; он играет важную, но не до конца понятную роль в синдромах, связанных с истощением.

Самцов мышей в возрасте пяти недель кормили рационом с дефицитом метионина и холина (MCD) и 60 ккал% жира (А06071301В, Research Diets), обозначенным как рацион MCD с высоким содержанием жира (HFMCD), что вызывало более тяжелый НАСГ по сравнению с рационом MCD самим по себе. Контрольных мышей кормили нормальным кормом (NC; Specialty Feeds). Мышам дважды в неделю внутрибрюшинно вводили инъекции 10 мг/кг антитела против ИЛ-11 или антитела против ИЛ-URA или идентичную концентрацию контрольного изотипического IgG через неделю после получения HFMCD на протяжении такого же периода лечения. Массу тела измеряли еженедельно.

Результаты показаны на фиг. 11А и 11В. Обнаружено, что лечение антитело против ИЛ-11 оказывало глубокое положительное влияние на массу тела, что указывает на то, что ингибирование сигнального пути, опосредованного ИЛ-11, способно облегчить потерю веса, ассоциированную с кахексией. В то время как все экспериментальные группы, получавшие HFMCD (n>5 мышей/группу), потеряли ~15% массы тела после первой недели использования рациона HFMCD, индуцирующей стеатогепатит, группы, получавшие лечение антителом против ИЛ-11 или антителом против ИЛ-URA, быстро восстановили нормальную или почти нормальную массу тела через 5 недель (фиг. 11А). Мыши, получавшие кормовой рацион NC, стабильно набирали вес, в то время как мыши, получавшие кормовой рацион HFMCD и контрольный IgG, теряли >30% массы тела в ходе лечения. Пример сравнения размеров мышей показан на фиг. 11В. Таким образом, обнаружено, что ингибирование сигнального пути, опосредованного ИЛ-11, вызывает регрессию кахексии in vivo на модели анорексии/кахексии у мыши.

Для дальнейшего исследования влияния ингибирования сигнального пути, опосредованного ИЛ-11, в отношении кахексии в модели MCD, изучили ряд терапевтических доз антитела против ИЛ-11. Пятинедельных самцов мышей кормили рационом HFMCD или NC, как и раньше, в течение одной недели для индукции кахексии, что приводило к ~15% потере массы тела у мышей MCD. После первой недели мышам дважды в неделю внутрибрюшинно вводили 0,5, 1, 5 или 10 мг/кг антитела против ИЛ-11 или антитела против ИЛ-URA. Изучали три антитела: два антитела против ИЛ-11 ((1) и (2)) и одно антитело против ИЛ-URA. В качестве контроля использовали 10 мг/кг изотипического IgG-антитела.

Массу тела и потребление корма измеряли еженедельно. Для потребления пищи измеряли среднее потребление пищи (г/мышь/неделю) в кормушках из клеток (n=3 мыши на клетку).

Результаты относительно массы тела показаны на фиг. 12А-12С. Обнаружено, что все три терапевтических антитела против ИЛ-11 обеспечивали увеличение массы тела в зависимости от дозы, что указывало на регрессию кахексии. Максимальные дозы демонстрируют наибольший эффект регрессии кахексии. Мыши, получавшие кормовой рацион NC, стабильно набирали вес, в то время как мыши, получавшие кормовой рацион HFMCD и контрольный IgG, теряли ~30% массы тела в ходе лечения.

Результаты относительно потребления корма показаны на фиг. 13А-13С. Обнаружено, что все три терапевтических антитела против ИЛ-11 обеспечивали увеличение потребления корма в зависимости от дозы. Максимальные дозы оказывали наибольшее влияние на потребление корма, в то время как у мышей, получавших контрольный IgG, наблюдалось небольшое снижение потребления корма.

Обнаружено, что лечение антителом против ИЛ-URA вызывает наиболее эффективную регрессию

- 57 050147 снижения массы тела и ассоциировано с наибольшим увеличением потребления корма.

Острое заболевание, например, травма или сепсис, также может быть ассоциировано с анорексией и кахексией, и поэтому авторы изобретения далее исследовали влияние антагонизма сигнального пути, опосредованного ИЛ-11, на анорексию и кахексию в моделях острого повреждения почек у мышей.

Повреждение почек вызывали путем в/б инъекции фолиевой кислоты (180 мг/кг) в среде-носителе (0,3 М NaHCO₃) самцам мышей в возрасте 10 недель; контрольным мышам вводили только средуноситель. Животных умерщвляли через 28 дней после инъекции. Мышам каждые 3 дня внутрибрюшинно вводили 20 мг/кг антитела против ИЛ-11, антитела против ИЛ-IIRA или идентичной концентрации контрольного изотипического IgG, начиная с 1 ч до введения фолиевой кислоты до умерщвления мышей.

Результаты показаны на фиг. 14А. Фолат-индуцированное повреждение почек приводило к быстрой потере массы тела, ассоциированной с анорексией/кахексией в связи с острой фазой тяжелого двустороннего повреждения почек. Мыши (п=7/группу), получавшие лечение антителом против ИЛ-HRa или антителом против ИЛ-11 во время повреждения и на протяжении времени существования повреждения, набирали массу тела быстрее по сравнению с контрольным IgG и восстанавливали нормальную или почти нормальную массу тела через 3 недели.

Во втором эксперименте повреждение почек вызывали, как и ранее, путем в/б инъекции фолиевой кислоты. Мышей лечили антителом против ИЛ-11 или контрольным IgG только через 21 день после повреждения почек. Массу тела животных оценивали до и после лечения антителами. В качестве контроля использовали здоровых мышей, которые не получали фолиевую кислоту.

Результаты показаны на фигуре 14В. У животных, получавших антитело против ИЛ-11, масса тела начала восстанавливаться после начала лечения, что свидетельствует о возможности купирования потери массы тела, ассоциированной с истощением, на поздней стадии заболевания.

В дальнейших экспериментах мышей подвергали односторонней обструкции мочеточника (ООМ), что вызывало острое повреждение почек. Хирургические операции для выполнения UUO выполняли на мышах в возрасте 12 недель. Вкратце, мышей анестезировали путем в/б инъекции кетамина (100 мг/кг)/ксилазина (10 мг/кг), глубину анестезии оценивали с помощью ножного рефлекса. Затем брили левую сторону живота мышей. С помощью скальпеля делали вертикальный разрез через кожу, второй разрез делали через брюшину, чтобы обнажить почку. С помощью щипцов вынимали почку на поверхность и дважды перевязывали мочеточник хирургическим шелком ниже почки. Лигированную почку осторожно помещали обратно в правильное анатомическое положение и добавляли стерильный физиологический раствор для восполнения потери жидкости. Затем разрезы зашивали. Животным после операции вводили антибиотик энрофлоксацин (15 мг/кг, п/к) и анальгетик бупренорфин (0,1 мг/кг, п/к) в течение трех дней подряд. Мышей умерщвляли через 10 дней после лигирования. Мышам внутрибрюшинно вводили 20 мг/кг (2 раза в неделю) антитела против ИЛ-11 или идентичную концентрацию контрольного изотипического IgG с 4 дня после операции до умерщвления мышей.

Результаты показаны на фиг. 15. Животные из обеих групп изначально теряли одинаковую массу (~6%) из-за анорексии, ассоциированной с хирургической травмой. Животные, получавшие лечение антителом против ИЛ-11 (20 мг/кг 2 раза в неделю с 4 дня после UUO до умерщвления мышей), набирали массу тела быстрее, чем животные, получавшие контрольный IgG, и восстанавливали нормальную массу тела в течение 4 дней.

Таким образом, антагонизм сигнального пути, опосредованного ИЛ-11, ассоциирован с терапевтическим восстановлением массы тела в моделях острого заболевания.

Далее авторы изобретения исследовали влияние сверхэкспрессии ИЛ-11 на массу тела мыши посредством инъекции рекомбинантного ИЛ-11 мыши или индукции экспрессии трансгена ИЛ-11.

Рекомбинантный ИЛ-11 мыши (rmlL11) разводили до концентрации 50 мкг мл¹ в физиологическом растворе. Десятинедельные самцы мышей C57BL/6J дикого типа ежедневно получали подкожную инъекцию 100 мкг кг^-1 rmlL11 в физиологическом растворе (n=19) либо идентичного объема физиологического раствора (n=15) в течение 21 дня.

Результаты показаны на фиг. 16А. Обнаружено, что введение rmlL11 замедляло нормальный прирост массы тела. Мыши, получавшие ежедневную инъекцию rmlL11 в течение 21 дня, набирали меньшую массу тела в ходе лечения по сравнению с мышами, получавшими только физиологический раствор.

Получили трансгенных по ИЛ-11 мышей (ИЛ-11-Tg). Гетерозиготных мышей Rosa26-IL11 скрещивали с мышами Col1a2-CreER для получения двойных гетерозиготных потомков Col1a2-CreER:Rosa26IL11 (мыши ИЛ-11-Tg), экспрессирующих трансген ИЛ-11 в фибробластах. Для Cre-опосредованной индукции трансгена ИЛ-11 мышам ИЛ-11-Tg внутрибрюшинно вводили 50 мг кг¹ тамоксифена (SigmaAldrich) в возрасте 6 недель в течение 10 дней подряд; животных умерщвляли на 21 день (n=14). Мышам Rosa26:ll11 (без аллеля Col1a2-CreER) вводили эквивалентную дозу тамоксифена в течение 10 дней подряд в качестве контроля (n=10).

Результаты показаны на фиг. 16В. Мыши ИЛ-11-Tg демонстрировали ранние признаки кахексии, перестали набирать массу тела и с течением времени испытывали потерю массы тела. Таким образом, обнаружено, что сигнальный путь, опосредованный ИЛ-11, способствует потере массы тела, ассоциированной с истощением.

- 58 050147

Пример 4: антагонизм сигнального пути, опосредованного ИЛ-11, в моделях неалкогольного стеатогепатита (НАСГ) у мышей.

Авторы изобретения исследовали роль сигнального пути ИЛ-11 в патогенезе неалкогольного стеатогепатита (НАСГ).

4.1. Способы.

Звездчатые клетки печени (HSC) или гепатоциты стимулировали ИЛ-11 и оценивали эффекты с помощью визуализации клеток и одновременной многопараметрической визуализации, иммуноблоттинга, твердофазного ИФА и анализов инвазии. Генетические и фармакологические эксперименты с усилением или потерей функции за счет ИЛ-11 выполняли in vitro и in vivo. Сигнальный путь ИЛ-11 исследовали с использованием ингибиторов ERK. Влияние лечения антителом против ИЛ-11 или антителом против ИЛ-URA оценивали в трех доклинических моделях НАСГ с использованием рационов с дефицитом метионина/холина или западного кормового рациона с жидкой фруктозой. Фенотипирование выполняли с использованием анализа гидроксипролина, кПЦР, секвенирования РНК, вестерн-блоттинга, гистологического анализа, CyTOF, липидных и метаболических биомаркеров.

Эксперименты на животных.

Все процедуры на животных были одобрены и выполнялись в соответствии с правилами комитета учреждения SingHealth по содержанию и использованию животных (IACUC). Всем мышам был предоставлен неограниченный доступ к корму и воде.

Модели НАСГ у мышей.

Мыши дикого типа, получавшие кормовой рацион с высоким содержанием жира и недостатком метионина и холина (HFMCD).

Пятинедельным самцам мышей C57BL/6N давали кормовой рацион с дефицитом метионина и холина и добавлением 60 ккал% жира (А06071301В16, Research Diets); контрольным мышам давали нормальный корм (NC, Specialty Feeds). Описывали продолжительность использования кормового рациона и лечения антителами.

Мыши db/db, получавшие кормовой рацион с дефицитом метионина и холина (MCD).

У самцов мышей BKS.Cg-Dock7m+/+LeprdbJ (db/db) с фоновым генотипом C57BL/6J в возрасте 12 недель развивался стеатоз печени за счет получения кормового рациона с дефицитом метионина и холина (MCD, A02082002BRi, Research Diets) в течение 8 недель; контрольные мыши характеризовались таким же генотипом. Описывали продолжительность использования кормового рациона и лечения антителами.

Мыши дикого типа, получавшие западный кормовой рацион с добавлением фруктозы (WDF) Самцам мышей C57BI/6J в возрасте десяти недель давали западный кормовой рацион (D12O79B, Research Diets) с добавлением 15% (мас./об.) фруктозы в питьевой воде для имитации НАЖБП/НАСГ, аналогичного этому расстройству у людей 17,18, в то время как контрольные мыши получали нормальный корм и водопроводную воду. Описывали продолжительность использования кормового рациона и лечения антителами.

Мыши с делецией ll11ra.

Мыши без функциональных аллелей ll11ra (ll11ra-/-) характеризовались фоновым генотипом C57BI/6J (B6.129S1-ll11ratm1Wehi/J, Jackson's Laboratory). Мышей ll11ra-/- и однопометных особей дикого типа (ll11ra+/+) кормили (1) HFMCD в течение 10 недель в возрасте от 5 недель и (2) WDF в течение 16 недель в возрасте от 12 недель для развития НАСГ; контрольным мышам давали корм NC в течение такого же времени.

Введение ИЛ-11 in vivo.

Самцы репортерных мышей 19 Col1a1-GFP и мышей C57BL/6J дикого типа в возрасте десяти недель ежедневно получали подкожную инъекцию 100 мкг/кг рекомбинантного ИЛ-11 мыши (rmII-11) либо идентичного объема физиологического раствора в течение 21 дня.

Введение моноклональных антител против ИЛ-11 или против ИЛ-URA in vivo Мышам внутрибрюшинно вводили антагонистическое антитело против ИЛ-11, антагонистическое антитело против ИЛ11RA, либо идентичное количество контрольного изотипического IgG в течение периода лечения, указанного на фигурах.

Измерение уровня глюкозы в крови натощак.

Мышей не кормили в течение 6 ч перед отбором крови (посредством обрезания хвоста), для измерения уровня глюкозы натощак использовали глюкометр Accu-Chek.

Культивирование клеток.

Клетки (фибробласты предсердия, HSC и гепатоциты) выращивали и поддерживали при 37°С и 5% СО₂. Ростовую среду обновляли каждые 2-3 дня и пересевали клетки при 80-90% конфлюэнтности с использованием стандартных методик трипсинизации. Все эксперименты выполняли на клетках низкого пересева (Р1-Р2). Клетки выдерживали без сыворотки в течение 16 ч до стимуляции. Стимулированные клетки сравнивали с нестимулированными клетками, выращенными в течение такого же времени при тех же условиях (бессывороточная среда), но без стимулов.

Первичные фибробласты предсердия человека.

- 59 050147

Фибробласты предсердия человека получали и культивировали, как описано ранее 11.

Первичные звездчатые клетки печени человека (HSC).

HSC (5300, ScienCell) культивировали в полной среде для звездчатых клеток (5301, ScienCell) на планшетах, покрытых поли-Е-лизином (2 мкг/см2, 0403, ScienCell).

Первичные гепатоциты человека.

Гепатоциты человека (5200, ScienCell) выращивали и поддерживали в среде для гепатоцитов (5201, ScienCell) с добавкой 2% эмбриональной сыворотки KPC (FBS) и 1% пенициллина-стрептомицина.

ТНР-1.

ТНР-1 (АТСС) культивировали в RPMI 1640 (А1049101, Thermo Fisher) с добавлением 10% FBS и 0,05 мМ β-меркаптоэтанола. Клетки ТНР-1 дифференцировали с использованием 10 нг/мл форбол-12миристата-13-ацетата (РМА, Р1585, Sigma) в RPMI 1640 в течение 48 ч.

Фенотипирование с высокой пропускной способностью с помощью анализа Operetta.

Анализ Operetta выполняли в основном, как описано ранее 11, с незначительными изменениями, описанными ниже: HSC или гепатоциты высевали в 96-луночные черные планшеты CellCarrier (PerkinElmer) при плотности 5x103 клеток на лунку. После воздействия экспериментальных условий клетки фиксировали в 4% параформальдегиде (PFA, 28908, Thermo Fisher), пермеабилизовали 0,1% Triton X-100 (Sigma) и блокировали неспецифические сайты 0,5% БСА и 0,1% Tween-20 в PBS. Клетки инкубировали в течение ночи (4 °С) с первичными антителами (1:500) с последующим инкубированием с соответствующими вторичными антителами, мечеными AlexaFluor 488 (1:1000). Окрашивание родамином и фаллоидином (1:1000, R415, Thermo Fisher) выполняли путем инкубирования в течение ночи (4°С). Клетки контрастировали 1 мкг/мл DAPI (D1306, Thermo Fisher) в блокирующем растворе. Каждое состояние визуализировали в двух повторностях, учитывая как минимум 7 полей/лунку с использованием системы одновременной многофакторной визуализации Operetta 1483 (PerkinElmer). Клетки, экспрессирующие АСТА2, количественно определяли с использованием Harmony версии 3.5.2 (PerkinElmer), для каждого поля определяли процент активированных фибробластов/общее количество клеток (ACTA2+ve). Измерение интенсивности флуоресценции на единицу площади (нормированной по количеству клеток) коллагена I выполняли с помощью Columbus 2.7.1 (PerkinElmer).

Иммунофлуоресценция.

HSC и гепатоциты человека высевали на 8-луночные предметные стекла (1,5x104 клеток/лунка) за 24 ч до окрашивания. Клетки фиксировали в 4% PFA в течение 20 мин, промывали PBS, a неспецифические сайты блокировали 5% БСА в PBS в течение 2 ч. Клетки инкубировали с антителом против ИЛURA или антителом против ИЛ-6И в течение ночи (4°С) с последующим инкубированием с соответствующим вторичным антителом, меченым Alexa Fluor 488, в течение 1 ч. Предметные стекла с лунками высушивали в темноте и добавляли 5 капель гистологической среды с DAPI на 15 мин перед визуализацией с помощью флуоресцентного микроскопа (Leica).

Времяпролетная масс-цитометрия (CyTOF).

Иммунные клетки выделяли из печени, как описано ранее 20. Ткани печени измельчали и расщепляли 100 мкг/мл коллагеназы IV и 20 ед/мл ДНКазы I при 37°С в течение 1 ч. После расщепления клетки пропускали через сито, получая суспензию отдельных клеток, и подвергали центрифугированию в градиенте перколла для выделения иммунных клеток. Окрашивание для CyTOF выполняли, как описано ранее 21. Клетки размораживали и окрашивали цисплатином (Fluidigm) для выявления живых клеток с последующим окрашиванием конъюгированным с металлом антителом против CD45 для баркодирования.

После баркодирования клетки окрашивали антителом против поверхности клетки, конъюгированным с металлом (Ly6C). Затем клетки фиксировали 1,6% PFA, пермеабилизовали 100% метанолом и подвергали внутриклеточному окрашиванию антителом (TGFe1). Клетки метили ДНК-интеркалятором перед регистрацией на масс-цитометре Helios (Fluidigm). Для анализа сначала выявляли отдельные живые клетки, а затем определяли баркоды для идентификации отдельных образцов. Ручную установку дискриминационного окна выполняли с использованием программного обеспечения Flowjo (Flowjo).

Статистический анализ.

Статистический анализ выполняли с использованием программного обеспечения GraphPad Prism (версия 6.07). Значения Р вычисляли с поправкой на множественное тестирование по Даннетту (когда несколько экспериментальных групп сравнивали с одним состоянием), Тьюки (когда несколько состояний сравнивали друг с другом в рамках одного эксперимента), Сидаку (когда несколько состояний для 2 различных генотипов сравнивали друг с другом).

Анализ двух параметров (эффективность антител во времени) для сравнения двух различных групп выполняли с помощью двухфакторного дисперсионного анализа. Критерий статистической значимости представлял собой Р<0,05.

Доступность данных.

Данные высокопроизводительного секвенирования, полученные для настоящего исследования, можно загрузить из GSE128940. Все остальные данные приведены в рукописи или в дополнительных

- 60 050147 способах.

4.2. Результаты.

Краткое описание.

При стимуляции факторами НАСГ HSC секретировали ИЛ-11, который управлял аутокринной ERK-зависимой петлей сигнального пути, необходимой для трансформации HSC в миофибробласт. Стимуляция ИЛ-11 происходит при НАСГ человека и мыши, инъекция ИЛ-11 вызывала повреждение печени, воспаление и фиброз у мышей, но мыши с делецией П11га1 были защищены от НАСГ в двух доклинических моделях. Терапевтические антитела против ИЛ-HRA или ИЛ-11 последовательно ингибировали и вызывали регрессию фиброза и стеатоза в трех моделях НАСГ у мышей. Неожиданно оказалось, что ИЛ-11 вызывал повреждение гепатоцитов и способствовал стромально-опосредованному воспалению, а лечение антителом против ИЛ-11 вызывало регрессию НАСГ-ассоциированной гепатотоксичности и гепатита. Генетическое или фармакологическое ингибирование сигнального пути ИЛ-11 при НАСГ было ассоциировано с пониженным уровнем триглицеридов, холестерина и глюкозы в сыворотке.

ИЛ-11 активирует HSC и стимулирует фиброз печени.

Полногеномное секвенирование РНК показало, что TGFe1 в значительной степени активировал IL11 (в 14,9 раза, Р=3,40х10^-145) в HSC, что проверили с помощью кПЦР, подтвердили на уровне белка и воспроизвели в экспериментах с использованием высокоточных срезов печени человека (фиг. 17А-17С, фиг. 24А). Независимо полученные данные секвенирования РНК²² показали, что IL-11 являлся наиболее интенсивно стимулируемым геном в HSC при выращивании на жесткой подложке для моделирования цирроза печени (фиг. 24В). HSC экспрессировали повышенные уровни альфа-субъединицы рецептора ИЛ-11 (IL11RA) по сравнению с фибробластами сердца или легких, которые реагировали на ИЛ-11 (фиг. 24В). Иммуногистохимический анализ подтвердил высокий уровень экспрессии ИЛ-HRA и необнаружимый уровень экспрессии ИЛ-6К в HSC (фиг. 17D). Вестерн-блоттинг образцов печени человека показал повышенный уровень ИЛ-11 у пациентов с фиброзными заболеваниями печени, включая НАСГ (фиг. 24D-24E). Эти данные показали, что HSC являлись одновременно источником и мишенью ИЛ-11 в печени человека и что уровень ИЛ-11 повышен при заболеваниях печени человека.

Для исследования влияния ИЛ-11 на HSC клетки стимулировали ИЛ-11 либо TGFe1 либо PDGF. ИЛ-11 активировал HSC в той же степени, что и TGFe1 или PDGF, трансформируя покоящиеся HSC в АСТА2^+те-миофибробласты, секретирующие ферменты, модифицирующие коллаген и матрикс (фиг. 17Е-17Н, фигуры 24F-24H). ИЛ-11 также способствовал инвазии HSC в матрикс в зависимости от дозы, что является важным аспектом патобиологии HSC при НАСГ²³ (фиг. 17I). HSC, стимулированные hyperlLH¹¹, также секретировали ИЛ-11, подтверждая наличие аутокринной петли прямой связи в сигнальном пути ИЛ-11 (фиг. 17 J).

Репортерные мыши Col1a1-GFP¹⁹, получавшие рекомбинантный ИЛ-11 мыши (rmll-11), накапливали экспрессирующие GFP миофибробласты Col1a1^+ve в печени, что дополнительно подтверждает влияние ИЛ-11 на трансформацию HSC в миофибробласты in vivo. Подкожное введение rmll-11 мышам в течение 21 дня также повышало содержание коллагена в печени, экспрессию ключевых профиброзных и провоспалительных генов и уровня аланинаминотрансферазы (АЛТ) в сыворотке (фиг. 17K-17N, фиг. 24I-24K). Это указывало на то, что rmll-11 вызывал повреждение гепатоцитов и воспаление в дополнение к фиброзу.

Делеция ll11ra1 защищала мышей от НАСГ-ассоциированного воспаления, гепатотоксичности и фиброза, а также снижала уровень липидов и глюкозы в сыворотке.

Исследования выполняли на доклинической модели тяжелого НАСГ с использованием рациона с высоким содержанием жиров и дефицитом метионина и холина (HFMCD)¹⁶. В этой модели уровень мРНК IL-11 был слегка повышен, в то время как уровни белка были сильно повышены, что указывало на посттранскрипционную регуляцию экспрессии ИЛ-11 в печени (фиг. 25А-25В). Прогрессирующая индукция белка ИЛ-11 во время НАСГ отражалась в активации Erk, которая может быть важным фактором патогенеза НАСГ²⁴, а также в повышенном уровне коллагена и повышенном уровне АЛТ в сыворотке (фиг. 18А, фиг. 25C-25D).

Для оценки патофизиологической значимости повышенных уровней ИЛ-11 при НАС авторы изобретения использовали генетическую модель потери функции: мышь с делецией альфа-субъединицы рецептора ИЛ-11 (ИПгаТ/')²⁵. Мыши ИПгаТ/', получавшие кормовой рацион HFMCD, были в значительной степени защищены от фиброза и характеризовались менее выраженным стеатозом и повреждением печени по сравнению с контрольными животными (фиг. 18B-18D, фиг. 25Е-25Н). Кроме того, у мышей ИПгаТ/' наблюдали значительно менее выраженное воспаление печени (фиг. 18Е), что указывало на важную роль ИЛ-11 при различных патологических явлениях НАСГ.

Модель HFMCD характеризовалась ранним началом стеатогепатита с последующим фиброзом. Тем не менее, эта модель не характеризовалась ожирением или инсулинорезистентностью. Разработали еще одну модель НАСГ за счет использования западного кормового рациона с добавлением жидкой фруктозы (WDF)²⁶, которая характеризовалась ожирением, инсулинорезистентностью и гипергликемией, что отражало особенности НАСГ¹⁸ у человека. После 16 недель использования корма WDF развивался НАСГ

- 61 050147 и повышался уровень белка ИЛ-11 в печени (фиг. 18F). Мыши 1111га1^А при использовании WDF характеризовались аналогичным приростом массы тела по сравнению с контрольными мышами, но были защищены от стеатоза, воспаления, повреждения гепатоцитов и фиброза печени (фиг. 18G-18J, фиг. 26). Активация ERK у мышей 1111гаГ^/- была снижена как в модели HFMCD, так и в модели WDF, что указывало на важность ИЛ-11-зависимой активации ERK для НАСГ (фиг. 18K, фиг. 25I).

Основными причинами смерти при НАСГ являются сердечно-сосудистые заболевания: инфаркт миокарда, почечная недостаточность и инсульт^27,28. Биомаркеры сердечно-сосудистого риска измеряли у мышей ППгаГ/’ через 16 недель использования рациона WDF. По сравнению с контрольной группой однопометных животных, мыши ППгаГ/’, получавшие WDF, характеризовались более низкими уровнями глюкозы в крови натощак, холестерина и триглицеридов в сыворотке (фиг. 18L-18N).

Нейтрализующие антитело против ИЛ-11 или антитело против ИЛ-URA блокировали активацию HSC.

Мышей генетически иммунизировали ИЛ-URA для получения нейтрализующих антител против ИЛ-URA. Выявили клоны, блокировавшие трансформацию фибробластов¹¹, и первоочередное внимание уделили клону Х209 (IgG1к, KD=6 нМ). Х209 блокировало секрецию ММР2 из HSC со значением IC50 5,8 пМ, его период полувыведения in vivo составлял приблизительно 18 дней с хорошим поглощением в печени (фиг. 19А, фиг. 27A-27D). Для обеспечения терапевтической специфичности по отношению к сигнальному пути ИЛ-11 разработали нейтрализующее антитело Х203 против ИЛ-11¹² (IgG1к, IC50=40,1 пМ для активации HSC) и использовали его в экспериментах.

Авторы изобретения обнаружили, что в дополнение к TGFe1 (фиг. 17А-17С) секрецию ИЛ-11 из HSC индуцируют и другие ключевые стимулы НАСГ, например, PDGF, CCL2, ангиотензин II, bFGF или окислительный стресс (фиг. 19В). Это указывало на важную роль ИЛ-11 в активации HSC после множества факторов. Для проверки этого HSC стимулировали различными факторами НАСГ и обнаружили, что индукция экспрессии АСТА2 или коллагена всеми стимулами зависит от интактного сигнального пути ИЛ-11 (фиг. 19С, 27Е). В отдельных анализах также показано, что проинвазивное влияние PDGF или CCL2 на HSC зависит от ИЛ-11 (фиг. 19D).

У мышей ИПгаЙ' защита печени при использовании кормовых рационов HFMCD или WDF была ассоциирована с пониженной активацией Erk. Авторы изобретения обнаружили, что ИЛ-11 непосредственно активировал ERK в HSC и что все стимулы, индуцирующие секрецию ИЛ-11 из HSC, также индуцировали активацию ERK. X209 устраняло фосфорилирование ERK и трансформацию HSC после всех факторов, включая сам ИЛ-11. Ингибиторы ERK блокировали влияние ИЛ-11 и активацию HSC после всех пусковых факторов НАСГ, что указывало на центральное значение ИЛ-11-зависимого фосфорилирования ERK для трансформации HSC (фиг. 19E-19F, 27F).

Опубликованная литература по ИЛ-11 в печени ограничена, однако инъекция высоких доз рекомбинантного ИЛ-11 человека грызунам ассоциирована с защитными эффектами^13,14, и существует путаница относительно роли ИЛ-11 в биологии тромбоцитов²⁵. Чтобы исключить проблемы с безопасностью, авторы изобретения выполнили долгосрочные (5 месяцев) доклинические токсикологические исследования Х209 и Х203 в высоких дозах (10 мг/кг х 2/неделю) и не наблюдали влияния на уровни АЛТ в сыворотке или количество тромбоцитов (фиг. 19G-19Н). В соответствии с данными на мышах П11га^-/’, лекарственные средства на основе антител против ИЛ-11 снижали или имели тенденцию к снижению уровня липидов в сыворотке в течение этого периода лечения (фиг. 19I-19J).

Терапевтическое адресное воздействие на ИЛ-11 или ИЛ-URA было эффективным в трех доклинических моделях НАСГ.

Затем авторы изобретения протестировали терапевтические антитела Х209 и Х203 in vivo и начали введение антител через шесть недель использования рациона HFMCD, когда была в значительной степени стимулирована экспрессия ИЛ-11, накоплен коллаген и развился стеатогепатит (фиг. 18А, 20А и 25C25D). После четырех недель лечения оба антитела ингибировали или вызывали регрессию фиброза, воспаления и повреждения печени, при отсутствии влияния на стеатоз (фиг. 20В-20Е, 28А-28С). Кроме того, оба антитела устраняли активацию ERC, что указывало на вовлечение и охват мишени (фиг. 20F, 28D).

Авторы изобретения также протестировали терапевтическое средство на основе антитела против ИЛ-11 у мышей db/db в возрасте двадцати недель, страдающих ожирением, диабетом и стеатозом печени за счет использования кормового рациона с дефицитом метионина и холина (MCD), вызывающего НАСГ, в течение восьми недель (фиг. 20G)^29-31. В соответствии с другими использованными моделями, уровни экспрессии ИЛ-11 и активации Erk были повышены в печени мышей db/db, получавших MCD, и лечение ингибировало активацию Erk (фиг. 20H-20I). В этой модели терапевтическое антитело против ИЛ-11 подавляло стеатоз, фиброз и воспаление печени при снижении уровней АЛТ (фиг. 20J-20N, 28E28F).

Третью модель НАСГ, индуцированного WDF, использовали для тестирования влияния терапевтического антитела против ИЛ-11 в контексте ожирения, инсулинорезистентности и диабета¹⁸. Мышей кормили WDF в течение 16 недель, к этому времени у них развивалось ожирение и инсулинорезистентность со стеатозом, воспалением и фиброзом печени. Затем начинали лечение с применением антитела против ИЛ-URA (Х209) (фиг. 21А). При адресном воздействии на сигнальный путь ИЛ-11 происходило

- 62 050147 ингибирование активации ERK в печени при НАСГ (фиг. 29/4). Несмотря на аналогичный прирост массы тела, у мышей, получавших лечение антителом против ИЛ-URA, наблюдалась регрессия фиброза, стеатоза, воспаления печени и снижение уровней АЛТ в сыворотке. Это сопровождалось снижением уровня глюкозы, триглицеридов и холестерина в сыворотке (фиг. 21B-21G и 29В-29Е).

Влияние комбинированного вмешательства за счет метаболических факторов и антитела против ИЛ-11 на фиброз печени.

Наши данные показали, что лечение антителом против ИЛ-11 вызывало регрессию фиброза, но не позволили оценить, был ли этот эффект устойчивым или прогрессирующим. Кроме того, комбинированная терапия может быть полезна для регрессии фиброза при НАСГ¹. Для решения этих проблем вызывали тяжелый фиброз печени с использованием HFMCD в течение 10 недель, затем мышей переводили на нормальный корм, имитируя активное метаболическое вмешательство, и параллельно начинали лечение антителом против ИЛ-11 (фиг. 21Н).

После удаления метаболического стимула активация Erk медленно регрессировала, что ускорялось лечением с использованием Х203 или Х209 (фиг. 30А). Изменения в отношении фиброза у животных, получавших IgG, отсутствовали на протяжении всего эксперимента, что позволяет предположить, что полная метаболическая коррекция сама по себе вызывала очень медленную регрессию фиброза или не вызывала ее. Напротив, содержание коллагена в печени подвергалось значительной регрессии через три недели лечения антителами (регрессия: 18%, Х203; 24%, Х209) с дальнейшей регрессией через шесть недель (регрессия: 37%, Х203; 46%, Х209), демонстрируя прогрессирующий и устойчивый эффект (фиг. 211, фиг. 30В-30С).

Регрессия фиброза была ассоциирована с пониженными уровнями TIMP и повышенными - ММР, что способствовало благоприятному ремоделированию матрикса³³². В соответствии с этим, у мышей с тяжелым фиброзом, получавших Х203 или Х209, наблюдалась быстрая стимуляция экспрессии Мтр2 и подавление экспрессии Timp1 (фиг. 21J). Регрессия фиброза печени является предпочтительной, когда трансформированные HSC подвергаются апоптозу³³, старению^34,35 и/или возвращаются в неактивное АСТА2’^те-состояние³⁶. Для проверки необходимости ИЛ-11 для поддержания HSC в трансформированном состоянии HSC стимулировали TGFe1 или PDGF с последующим ингибированием сигнального пути ИЛ-11. В течение 24 ч после ингибирования ИЛ-11 процент АСТА2^+те-клеток и количество секретируемого коллагена возвращались почти к исходным уровням, активность ERK в значительной степени снижалась, несмотря на продолжающуюся стимуляцию TGFe1/PDGF (фиг. 21K-21L, 30D-30G).

Влияние лечения антителом против ИЛ-11 на состояние печени при остром некровоспалении на ранней стадии НАСГ.

Переход от НАЖБП к НАСГ характеризуется развитием стеатогепатита, воспаления и гибели клеток (некровоспаления). HSC играют центральную роль в этом процессе за счет секреции провоспалительных факторов^3,8,37,38. Авторы изобретения исследовали, влияет ли ИЛ-11 на HSC-зависимые воспалительные пути, и обнаружили, что ИЛ-11 стимулирует продукцию CCL2 в HSC, в то время как ингибирование ИЛ-11 блокирует секрецию CCL2 (фиг. 31А). Это демонстрирует недооценку провоспалительной роли ИЛ-11 в стромальном иммунитете в контексте неизменно низких уровней воспаления, наблюдаемыми в печени мышей ПИгаГ/', получавших Х203 или Х209, во время использования рационов, вызывающих НАСГ.

В модели НАСГ за счет HFMCD за ранним воспалением следует фаза фиброза (фиг. 22A). Терапевтическое адресное воздействие на ИЛ-11 во время раннего стеатогепатита резко подавляло стеатоз печени, что сопровождалось уменьшением активации Erk (фиг. 22В-22Е, 31В-31С). В печени мышей, получавших Х203 и Х209, отсутствовали липидные капли, и у этих мышей не развивался фиброз (фиг. 22D, 22F и 31D-31G). Рацион HFMCD также индуцировал острое и тяжелое некровоспаление (>20-кратное увеличение уровня АЛТ через 1 неделю), при терапии антителом против ИЛ-11 в течение трехнедельного периода, как ни странно, наблюдалась значительная регрессия повреждения печени (фиг. 22G, 31Н). Эти быстрые терапевтические благоприятные эффекты предшествовали фиброзной стадии заболевания и указывали, наряду с неизменно пониженными уровнями АЛТ у мышей ll11ra1-/-, получавших Х203 или Х209 в предыдущих доклинических моделях, на повреждающее действие ИЛ-11 непосредственно на гепатоциты.

Обнаружено, что первичные гепатоциты человека экспрессировали ИЛ-URA, но не ИЛ-6И (фиг. 22Н). При стимуляции гепатоцитов физиологическими уровнями ИЛ-11 происходило высвобождение АЛТ в зависимости от дозы. Это происходило одновременно с прогрессирующим увеличением экспрессии стресс-волокон в гепатоцитах (фиг. 22I-22J). Примечательно, что гепатоциты также интенсивно секретировали ИЛ-11 при стимуляции TGFe1, что указывало на неадаптивную аутокринную активность ИЛ-11 в гепатоцитах (фиг. 22K). Таким образом, сигнальный путь ИЛ-11 непосредственно нарушал функцию гепатоцитов.

Анализ путем секвенирования РНК выполняли для профилирования эффектов терапии ИЛ-11 во время острой воспалительной фазы НАСГ, вызванного HFMCD. Независимые анализы показали, что лечение антителами вызывало почти полную регрессию патологической сигнатуры экспрессии РНК, вы

- 63 050147 званной использованием рациона HFMCD (фиг. 23А, 32А-32В). Стимуляция профиброзных и провоспалительных генов устранялась, и восстанавливалась экспрессия генов метаболизма липидов (фиг. 23В23С, 32С). Непредвзятые исследования представленности групп генов подтвердили восстановление почти нормальных сигнатур транскрипции генов метаболизма жирных кислот, желчных кислот, окислительного стресса, фиброза и воспаления (фиг. 32D).

Резидентные макрофаги и инфильтрирующие моноциты играют важную роль в патогенезе НАСГ и являются основным источником ΊΌΡβ1. Популяции воспалительных клеток в печени исследовали во время стеатогепатита, наблюдая меньшее количество иммунных клеток в целом в печени при обработке Х209, и специфичное снижение количества Ly6C^+veΊGFβ1^+ve-клеток (фиг. 23D-23F). Уровни TGFei в кровотоке повышались при использовании рациона HFMCD, но снижались за счет терапии Х209, что показывает, что терапевтические антитела против ИЛ-llRA модифицируют картину заболевания (фиг. 23G).

4.3. Обсуждение.

HSC являются основным источником провоспалительных миофибробластов в печени², и ингибирование и регрессия их трансформации является мишенью для терапии НАСГ. Показано, что для трансформации HSC требуется не избыточный ERK-зависимый сигнальный путь ИЛ-11, аналогично его роли в активации фибробластов в сердце, почках и легких^11,12. Таким образом, адресное воздействие на ИЛ-11 с целью регрессии фиброза печени может иметь преимущества по сравнению с терапевтическими средствами против других иммунных, метаболических или фиброзных факторов, которые часто демонстрируют определенный уровень избыточности. Интересно, что сильное метаболическое вмешательство само по себе не оказывало влияния на фиброз в наших экспериментах, и метаболическая терапия может оказывать ограниченное влияние на регрессию фиброза при НАСГ.

Авторы изобретения неожиданно обнаружили провоспалительную роль ИЛ-11 в печени и показали, что HSC экспрессируют высокие уровни ИЛ-URA, в то время как иммунные клетки экспрессируют ИЛ6R. Полученные данные свидетельствуют о косвенном воздействии ИЛ-11 на иммунные клетки, опосредованном стромой. Независимо от использования генетических или фармакологических подходов к потере функции, последовательно и надежно продемонстрировано, что ингибирование сигнального пути, опосредованного ИЛ-11, предотвращало/вызывало регрессию воспаления в нескольких моделях НАСГ. В то время как более ранние публикации указывали, что ИЛ-11 может играть защитную роль в печени, в этих исследованиях использовали чрезвычайно высокие дозы чужеродного рекомбинантного ИЛ-11 человека у грызунов^13,14, что не приводило к стимуляции ll11ra1 мыши¹¹. Показано, что истинное биологическое действие ИЛ-11 на физиологических уровнях является провоспалительным и опосредовано стромой.

Гепатоциты также экспрессировали ИЛ-URA и интенсивно секретировали ИЛ-11 при стимуляции TGFe1, и сигнальный путь ИЛ-11 в гепатоцитах индуцировал образование стресс-волокон и цитотоксические явления. Влияние ИЛ-11 на гепатоциты при остром некровоспалении при НАСГ представляет собой сложный процесс, и терапевтическое адресное воздействие на ИЛ-11 восстанавливало уровень АЛТ от приблизительно 700 ед/л до нормального уровня в течение трех недель. На более поздних стадиях НАСГ генетическое или терапевтическое ингибирование ИЛ-11 также предотвращало или вызывало регрессию повреждения гепатоцитов, что требует дальнейшего изучения.

Нокауты IL11RA у человека⁴⁰ и мыши²⁵ могут приводить к легкой деформации черепа и проявляться в виде слабости суставов, но в остальном такие особи являются здоровыми, и для взрослых млекопитающих ИЛ-11, по-видимому, не нужен. Это обеспечивает убедительные доказательства с точки зрения генетической безопасности для применения ИЛ-11 в качестве мишени для лекарственных средств. В дополнение к этим данным о безопасности мишени настоящие исследования показывают, что при нейтрализации сигнального пути ИЛ-11 в течение длительного времени с использованием высоких доз терапевтических антител нежелательные эффекты отсутствуют. Кроме того, генетическое или фармакологическое ингибирование ассоциировано с пониженным уровнем триглицеридов, холестерина и глюкозы в сыворотке натощак. Этот аспект ингибирования ИЛ-11 является желательной особенностью для потенциальной терапии НАСГ, поскольку пациенты с НАСГ часто страдают сердечно-сосудистыми заболеваниями.

Авторы изобретения выявили недооцениваемую центральную роль ИЛ-11 в патобиологии печени. Адресное воздействие нейтрализующими антителами на сигнальный путь ИЛ-11 вызывало регрессию фиброза, стеатоза, гибели гепатоцитов и воспаления по всему спектру НАСГ. Этот новый терапевтический подход ассоциирован с благоприятным кардиометаболическим профилем.

- 64 050147

4.4. Список литературных источников для примера 4.

1. Friedman SL, Neuschwander-Tetri BA, Rinella M, et al. Mechanisms of NAFLD development and therapeutic strategies. Nat Med 2018. Доступно по адресу: http://dx.doi.org/10.1038/s41591-0180104-9.

2. Mederacke I, Hsu CC, Troeger JS, et al. Fate tracing reveals hepatic stellate cells as dominant contributors to liver fibrosis independent of its aetiology. Nat Commun 2013;4:2823.

3. Friedman SL. Hepatic stellate cells: protean, multifunctional, and enigmatic cells of the liver. Physiol Rev 2008;88:125-172.

4. Friedman SL. Molecular Regulation of Hepatic Fibrosis, an Integrated Cellular Response to Tissue Injury. J Biol Chern 2000;275:2247-2250.

5. Higashi T, Friedman SL, Hoshida Y. Hepatic stellate cells as key target in liver fibrosis. Adv Drug Deliv Rev 2017;121:27-42.

6. Hellerbrand C, Stefanovic B, Giordano F, et al. The role of TGFpl in initiating hepatic stellate cell activation in vivo. J Hepatol 1999;30:77-87.

7. Tsuchida T, Friedman SL. Mechanisms of hepatic stellate cell activation. Nat Rev Gastroenterol Hepatol 2017;14:397-411.

8. Kim B-M, Abdelfattah AM, Vasan R, et al. Hepatic stellate cells secrete Ccl5 to induce hepatocyte steatosis. Sci Rep 2018;8:7499.

9. Banini BA, Sanyal AJ. Current and future pharmacologic treatment of nonalcoholic steatohepatitis. Curr Opin Gastroenterol 2017;33:134-141.

10. Iwaisako K, Jiang C, Zhang M, et al. Origin of myofibroblasts in the fibrotic liver in mice. Proc Natl Acad Sci U S A 2014; 111 :E3297-305.

11. Schafer S, Viswanathan S, Widjaja AA, et al. IL-11 is a crucial determinant of cardiovascular fibrosis. Nature 2017;552:110-115.

12. Cook S, Ng B, Dong J, et al. IL-11 is a therapeutic target in idiopathic pulmonary fibrosis. 2018. Доступно по адресу: http://dx.doi.org/10.1101/336537.

13. Zhu M, Lu B, Cao Q, et al. IL-11 Attenuates Liver Ischemia/Reperfusion Injury (IRI) through STAT3 Signalling Pathway in Mice. PLoS One 2015;10:e0126296.

14. Yu J, Feng Z, Tan L, et al. Interleukin-11 protects mouse liver from warm ischemia/reperfusion (Wl/Rp) injury. Clin Res Hepatol Gastroenterol 2016;40:562-570.

15. Lawitz EJ, Hepburn MJ, Casey TJ. A pilot study of interleukin-11 in subjects with chronic hepatitis C

- 65 050147 and advanced liver disease nonresponsive to antiviral therapy. Am J Gastroenterol 2004;99:23592364.

16. Gomes AL, Teijeiro A, Buren S, et al. Metabolic Inflammation-Associated IL-17A Causes Nonalcoholic Steatohepatitis and Hepatocellular Carcinoma. Cancer Cell 2016;30:161-175.

17. Baena M, Sangiiesa G, Hutter N, et al. Liquid fructose in Western-diet-fed mice impairs liver insulin signalling and causes cholesterol and triglyceride loading without changing calorie intake and body weight. J NutrBiochem 2017;40:105-115.

18. Machado MV, Michelotti GA, Xie G, et al. Mouse models of diet-induced nonalcoholic steatohepatitis reproduce the heterogeneity of the human disease. PLoS One 2015;10:e0127991.

19. Yata Y. DNase l-hypersensitive sites enhance a1(l) collagen gene expression in hepatic stellate cells. Hepatology 2003;37:267-276.

20. Sheng J, Ruedi C, Karjalainen K. Most Tissue-Resident Macrophages Except Microglia Are Derived from Fetal Hematopoietic Stem Cells. Immunity 2015;43:382-393.

21. Chew V, Lai L, Pan L, et al. Delineation of an immunosuppressive gradient in hepatocellular carcinoma using high-dimensional proteomic and transcriptomic analyses. Proc Natl Acad Sci U S A 2017;114:E5900-E5909.

22. Dou C, Liu Z, Tu K, et al. P300 Acetyltransferase Mediates Stiffness-Induced Activation of Hepatic Stellate Cells Into Tumor-Promoting Myofibroblasts. Gastroenterology 2018;154:2209-2221 ,e14.

23. Yang C, Zeisberg M, Mosterman B, et al. Liver fibrosis: insights into migration of hepatic stellate cells in response to extracellular matrix and growth factors. Gastroenterology 2003;124:147-159.

24. Lawan A, Bennett AM. Mitogen-Activated Protein Kinase Regulation in Hepatic Metabolism. Trends Endocrinol Metab 2017;28:868-878.

25. Nandurkar HH, Robb L, Tarlinton D, et al. Adult mice with targeted mutation of the interleukin-11 receptor (IL11Ra) display normal hematopoiesis. Blood 1997;90:2148-2159.

26. Stephenson K, Kennedy L, Hargrove L, et al. Updates on Dietary Models of Nonalcoholic Fatty Liver Disease: Current Studies and Insights. Gene Expr 2018;18:5-17.

27. Simon TG, Bamira DG, Chung RT, et al. Nonalcoholic Steatohepatitis is Associated with Cardiac Remodeling and Dysfunction. Obesity 2017;25:1313-1316.

28. Yasui K, Sumida Y, Mori Y, et al. Nonalcoholic steatohepatitis and increased risk of chronic kidney disease. Metabolism 2011;60:735-739.

29. Lau JKC, Zhang X, Yu J. Animal models of non-alcoholic fatty liver disease: current perspectives and recent advances. J Pathol 2017;241:36-44.

30. Rinella ME, Elias MS, Smolak RR, et al. Mechanisms of hepatic steatosis in mice fed a lipogenic methionine choline-deficient diet. J Lipid Res 2008;49:1068-1076.

31. Wortham M, He L, Gyamfi M, et al. The Transition from Fatty Liver to NASH Associates with SAMe Depletion in db/db Mice Fed a Methionine Choline-Deficient Diet. Dig Dis Sci 2008;53:2761-2774.

32. Hemmann S, Graf J, Roderfeld M, et al. Expression of MMPs and TIMPs in liver fibrosis - a systematic review with special emphasis on anti-fibrotic strategies. J Hepatol 2007;46:955-975.

33. Elsharkawy AM, Oakley F, Mann DA. The role and regulation of hepatic stellate cell apoptosis in reversal of liver fibrosis. Apoptosis 2005;10:927-939.

34. Krizhanovsky V, Yon M, Dickins RA, et al. Senescence of activated stellate cells limits liver fibrosis. Cell 2008;134:657-667.

- 66 050147

35. Schnabl В, Purbeck CA, Choi YH, et al. Replicative senescence of activated human hepatic stellate cells is accompanied by a pronounced inflammatory but less fibrogenic phenotype. Hepatology 2003;37:653-664.

36. Kisseleva T, Cong M, Paik Y, et al. Myofibroblasts revert to an inactive phenotype during regression of liver fibrosis. Proc Natl Acad Sci U S A 2012;109:9448-9453.

37. Seki E, De Minicis S, Osterreicher CH, et al. TLR4 enhances TGF-β signalling and hepatic fibrosis. Nat Med 2007;13:1324-1332.

38. Marra F, Valente AJ, Pinzani M, et al. Cultured human liver fat-storing cells produce monocyte chemotactic protein-1. Regulation by proinflammatory cytokines. J Clin Invest 1993;92:1674-1680.

39. Koyama Y, Brenner DA. Liver inflammation and fibrosis. J Clin Invest 2017;127:55-64.

40. Brischoux-Boucher E, Trimouille A, Baujat G, et al. IL11RA-related Crouzon-like autosomal recessive craniosynostosis in ten new patients: resemblances and differences. Clin Genet 2018. Доступно по адресу: http://dx.doi.org/10.1111/cge.13409.

4.5. Дополнительные материалы.

Антитела.

АСТА2 (ab7817, Abcam; IF), ACTA2 (19245, CST; WB), CD45 (103102, Biolegend), коллаген I (ab34710, Abcam), p-ERK1/2 (4370, CST), ERK1/2 (4695, CST), GAPDH (2118, CST), IgG (Aldevron), нейтрализующее антитело против ИЛ-11 (Х203, Aldevron), нейтрализующее антитело против ИЛ-HRA (Х209, Aldevron; исследование in vivo), ИЛ-HRA (ab250515, Abcam; IF), Ly6C (128039, Biolegend), TGFe1 (141402, Biolegend), антитело против антител кролика, меченое ПХ (7074, CST), антитело против антител мыши, меченое ПХ (7076, CST), антитело против антител кролика, меченое Alexa Fluor 488 (ab150077, Abcam), антитело против антител мыши, меченое Alexa Fluor 4880115 (ab150113, Abcam).

Рекомбинантные белки.

Коммерческие рекомбинантные белки: ангиотензин II человека (А9525, Sigma-Aldrich), CCL2 человека (279-MC-050/CF, R&D Systems), bFGF человека (233-FB-025, R&D Systems), ИЛ-11 человека (РНС0115, Life Technologies), PDGF человека (220-ВВ-010, R&D Systems), TGFe1 человека (РНР143В, Bio-Rad) и TGFe1 мыши (7666-МВ-005, R&D Systems).

Пользовательские рекомбинантные белки: ИЛ-11 мыши (UniProtKB: P47873) синтезировали без сигнального пептида. HyperlLH (гибридный белок ИЛ-11РА:ИЛ-11), имитирующий комплекс транссигнального пути, конструировали с использованием фрагмента ИЛ-HRA (аминокислотные остатки 1-317; UniProtKB: Q14626) и ИЛ-11 (аминокислотные остатки 22-199, UniProtKB: P20809) с линкером из 20 аминокислот (GPAGQSGGGGGSGGGSGGGSV)¹. Все пользовательские рекомбинантные белки синтезировали с помощью GenScript с использованием системы экспрессии млекопитающих.

Химические вещества.

Перекись водорода (Н₂О₂, 31642, Sigma), PD98059 (9900, CST), U0126 (9930, CST).

Получение моноклональных антител мыши против ИЛ-11RA.

Генетическая иммунизация и скрининг специфичного связывания кДНК, кодирующую аминокислоты 23-422 ИЛ-11RA человека, клонировали в экспрессирующие плазмиды (Aldevron). Мышей иммунизировали путем внутрикожного нанесения частиц золота, покрытых ДНК, с использованием ручного устройства для бомбардировки частицами. Экспрессию на поверхности временно трансфицированных клеток НЕК подтверждали с помощью антител против маркера, распознающих маркер, добавленный к Nконцу белка ИЛ-11RA. Сыворотку собирали через 24 дня после серии иммунизации и тестировали в проточной цитометрии на клетках НЕК293, временно трансфицированных вышеупомянутыми экспрессирующими плазмидами. Вторичным антителом являлось антитело козы против IgG мыши, конъюгированное с R-фикоэритрином (Southern Biotech, № 1030-09), в конечной концентрации 10 мкг мл¹. Сыворотку разбавляли PBS, содержащим 3% FBS. Взаимодействие сыворотки сравнивали с клетками НЕК293, трансфицированными неспецифичной кДНК. Специфичную реакционную способность подтвердили у 2 животных, из этих животных выделили клетки, продуцирующие антитела, и слили их с клетками миеломы мыши (Ag8) в соответствии со стандартными процедурами. Супернатант культур гибридом инкубировали с клетками НЕК, экспрессирующими конструкт ИЛ-11RA-flag, и с помощью проточной цитометрии выявляли гибридомы, продуцирующие антитела, специфичные по отношению к ил-iira.

Выявление нейтрализующих антител против ИЛ-11RA.

Антитела, связывавшиеся с клетками ИЛ-11RA-flag, но не с отрицательным контролем, считали специфично связывающимися агентами и впоследствии тестировали на предмет антифиброзной активности на фибробластах предсердий человека и мыши, как описано в источнике Schafer et al.². Вкратце, первичные фибробласты человека или мыши стимулировали TGFe1 человека или мыши, соответственно (5 нг мл^-1; 24 ч) в присутствии антител-кандидатов (6 мкг мл^-1). Стимуляция TGFe1 приводила к актива

- 67 050147 ции эндогенного ИЛ-11, который в случае нейтрализации блокировал профиброзный эффект TGFei. Фракцию активированных миофибробластов (ACTA2^+ve клетки) измеряли на платформе Operetta, как описано выше, для оценки потенциала нейтрализации антител-кандидатов. Для блокировки потенциальных эффектов транс-сигнального пути антитела также подвергали скринингу в контексте стимуляции фибробластов человека hyperlLil (200 пг мл^-1). Обнаружили три специфичных нейтрализующих антитела против ИЛ-iiRA, из которых Х209 впоследствии использовали для исследований in vivo. Аналогичные процедуры выполняли для получения нейтрализующего антитела, связывающегося с лигандом ИЛ113.

Кинетика связывания Х209 с ИЛ-11RA.

Связывание Х209 с ИЛ-11RA человека измеряли на Biacore T200 (GE Healthcare). X209 иммобилизовали на чипе для захвата с антителами против антител мыши. Анализы взаимодействия выполняли с использованием физиологического раствора с HEPES-буфером, рН 7,4, содержащим 0,005% Р20 и 0,5% БСА. Анализируемое вещество (ИЛ-11RA человека) в диапазон концентраций (от 1,56 нМ до 100 нМ) вводили через Х209 и эталонные поверхности со скоростью потока 40 мкл мин^-1. Связывание с ИЛ-11ra1 мыши подтверждали в системе Octet (ForteBio) с использованием аналогичной стратегии. Все сенсограммы выравнивали и снабжали двойными ссылками ⁴ Сродство и кинетические константы определяли путем аппроксимации скорректированных сенсограмм моделью Ленгмюра 1:1. Равновесную константу связывания K_D определяли по отношению kd/ka.

Измерение IC₅₀ X209.

HSC стимулировали TGFe1 (5 нг мл^-1, 24 ч) в присутствии IgG (4 мкг мл^-1) и различных концентраций Х209 (от 4 мкг мл^-1 до 61 пг мл^-1; 4-кратные разведения). Супернатанты собирали и анализировали в них количество секретируемого ММР2. Кривые доза-ответ строили путем получения графика логарифма протестированной концентрации (пМ) Х209 в зависимости от соответствующих процентных значений ингибирования с использованием аппроксимации по методу наименьших квадратов (обычной). Значение IC₅₀ рассчитывали с использованием уравнения зависимости нормированного ответа от логарифма концентрации ингибитора с переменным угловым коэффициентом.

Фармакокинетика в крови и биораспределение.

Мышам C57BL/6J (возрастом 10-12 недель) ретроорбитально (в левый глаз) вводили 100 мкл свежемеченого ¹²⁵1-Х209 (5 мкКи, 2,5 мкг) в PBS. Мышей анестезировали 2% изофлураном и выполняли отбор крови из подчелюстной вены в несколько моментов времени (2, 5, 10, 15, 30 мин, 1, 2, 4, 6, 8 ч, 1, 2, 3, 7, 14 и 21 день) после инъекции. Для исследований биораспределения кровь собирали путем пункции сердца, а также собирали ткани в следующие моменты времени: 1, 4 ч, 1, 3, 7, 14, 21 день после инъекции. Содержание радиоактивности измеряли с использованием гамма-счетчика (2480 Wizard2, Perkin Elmer) с поправкой на распад (100-кратное разбавление 100 мкл дозы). Измеренную радиоактивность нормировали по % введенной дозы/г ткани.

Секвенирование РНК.

Получение библиотек для секвенирования РНК.

Общую РНК количественно оценивали с использованием набора для высокочувствительного анализа РНК Qubit (Thermo Fisher Scientific), а число целостности РНК (RIN) оценивали с использованием набора реагентов для анализа РНК LabChip GX (Perkin Elmer). Набор для получения библиотек мРНК TruSeq Stranded mRNA Library Preparation Kit (Illumina) использовали для подготовки библиотеки транскриптов в соответствии с протоколом производителя. Все готовые библиотеки количественно определяли с использованием наборов для количественного определения библиотек KAPA (KAPA Biosystems). Качество и средний размер фрагментов в готовых библиотеках определяли с использованием набора высокочувствительных реагентов LabChip GX DNA High Sensitivity Reagent Kit (Perkin Elmer). Библиотеки объединяли и секвенировали на настольном секвенаторе NextSeq 500 (lllumina) с использованием набора NextSeq 500 High Output v2 и реагентов для секвенирования спаренных концевых фрагментов длиной 75 п.о.

Анализ секвенирования РНК.

Регуляция РНК, индуцированной сдавлением, в звездчатых клетках печени: Нормированные значения экспрессии генов загружали из Dou et al⁵. Слабо экспрессирующиеся гены (FPKM на исходном уровне >2) удаляли из анализа, кратность изменения рассчитывали как среднее значение FPKM в HSC на жесткой поверхности, разделенное на среднее значение FPKM в HSC на мягкой поверхности. Получали график кратности изменения экспрессии РНК для стимулируемых генов (f.c.>1), и гены ранжировали в соответствии с их средним значением FPKM.

Стимуляция TGFB1 звездчатых клеток печени человека и лечение антителами при использовании HFMCD: Секвенированные библиотеки демультиплексировали с использованием bcl2fastq v2.19.0.316 с параметром-no-lane-splitting. Затем последовательности адаптеров удаляли с использованием trimmomatic⁶ вер. 0.36 в режиме спаренных концевых фрагментов с параметрами MAXINFO:35:0,5 MINLEN:35. Укороченные прочтения выравнивали с Homo sapiens GRCh38 с использованием STAR⁷ вер. 2.2.1 с параметрами --outFilterType BySJout --outFilterMultimapNmax 20 --alignSJoverhangMin 8 - 68 050147 alignSJDBoverhangMin 1 --outFilterMismatchNmax 999 -alignlntronMin 20 --alignlntronMax 1000000 -alignMatesGapMax 1000000 в режиме спаренных концевых фрагментов, один проход. Для подсчета сохраняли только уникальные выравнивания. Подсчеты выполняли на уровне генов с помощью модуля FeatureCounts из subread⁸ вер. 1.5.1, с параметрами -О -s 2 -J -Т 8 -р -R -G. Ensembl, выпуск 86 hg38 GTF использовали в качестве аннотации для подготовки индексов STAR и для FeatureCounts.

Библиотеки для экспериментов по лечению антителами у мышей обрабатывали так же, как и для образцов человека, только с использованием генома и аннотации mm10 Ensembl выпуск 86.

Анализ дифференциальной экспрессии выполняли в R 3.4.1 с использованием пакета Bioconductor DESeq2⁹ 1.18.1, используя критерий Вальда для сравнения и включая этап сужения дисперсии, устанавливающий порог значимости 0,05.

Анализ представленности групп генов (GSEA) выполняли в R 3.4.1 с использованием пакета fgsea и наборов генов MSigDB Hallmark^10,11, выполняя 100000 итераций. Столбец stat вывода результатов DESeq2 использовали в качестве ранжированного ввода для каждого обогащения, принимая только гены мыши с ортологами человека один на один.

Твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA) и колориметрические анализы Уровни ИЛ-11 и ММР-2 в равных объемах сред для культивирования клеток количественно определяли с использованием набора Human IL-11 Quantikine ELISA kit (D1100, R&D Systems) и набора Total MMP-2 Quantikine ELISA kit (MMP200, R&D Systems), соответственно. Общий секретируемый коллаген в супернатанте клеточной культуры количественно определяли с использованием набора для определения коллагена Sirius red collagen detection kit (9062, Chondrex). Общее содержание гидроксипролина в печени измеряли с использованием набора для анализа Quickzyme Total Collagen (Quickzyme Biosciences). Уровни аланинаминотрансферазы (АЛТ), холестерина и триглицеридов в сыворотке мышей измеряли с помощью набора для анализа активности аланинаминотрансферазы (ab105134, abcam), набора для анализа холестерина (ab65390, abcam) и набора для анализа триглицеридов (ab65336, abcam) соответственно. Измерения триглицеридов (ТГ) в печени выполняли с использованием набора для колориметрического анализа триглицеридов (10010303, Cayman). Все варианты твердофазного ИФА и колориметрические анализы проводили в соответствии с протоколом производителя.

Анализ инвазии в матригель.

Инвазивное поведение HSC человека анализировали с использованием 24-луночных анализов инвазии в камере Бойдена (Cell Biolabs Inc.). Равное количество HSC в бессывороточной среде для HSC высевали в трех повторностях на матригель, покрытый ЕСМ, и позволяли выполнить инвазию в среду для HSC, содержащую 0,2% FBS. Через 48 ч инкубирования со стимулами среду аспирировали и удаляли неинвазивные клетки с помощью ватных тампонов. Клетки, выполнившие инвазию в нижнюю камеру, окрашивали раствором для окрашивания клеток (Cell Biolabs Inc.), и визуализировали и подсчитывали инвазивные клетки из 5 неперекрывающихся полей/мембрану при 40-кратном увеличении. Для экспериментов по ингибированию антител HSC предварительно обрабатывали Х203, Х209 или контрольными IgG-антителами в течение 15 мин перед добавлением стимулов.

Высокоточные срезы печени (PCLS) и вестерн-блоттинг печени пациента с НАСГ.

Вкратце, нарезали PCLS человека и инкубировали их с TGFe1 в течение 24 ч. Твердофазный ИФА в супернатанте выполняли с использованием набора Human IL-11 DuoSet (DY218, R&D Systems). Эта КИО также собирала биоптаты печени пациентов, перенесших резекцию печени из-за онкологических заболеваний, в которых для молекулярных исследований собирали смежную нераковую ткань. У пациентов либо не было документированного объективного заболевания печени (контрольная группа), либо ранее были документированы алкогольная болезнь печени, первичный билиарный цирроз, первичный склерозирующий холангит или НАСГ. По соображениям конфиденциальности никакой дополнительной информации по этим образцам представлено не было.

Количественная полимеразная цепная реакция (кПЦР).

Общую РНК выделяли из быстрозамороженных тканей печени или лизата HSC с использованием Trizol (Invitrogen) с последующей очисткой на колонке RNeasy (Qiagen). кДНК синтезировали с помощью набора для синтеза кДНК iScript™ (Bio-Rad) в соответствии с инструкциями производителя. Анализ экспрессии генов выполняли на двух параллельных образцах с использованием технологии TaqMan (Applied Biosystems) или fast SYBR green (Qiagen) с помощью StepOnePlus™ (Applied Biosystem) в течение 40 циклов. Данные экспрессии нормировали по экспрессии мРНК GAPDH и рассчитывали кратность изменения с использованием способа 2’^ΔΔα. Последовательности специфичных зондов TaqMan и праймеров, меченых SYBR green, доступны по запросу.

Иммуноблоттинг.

Вестерн-блоттинг выполняли на экстрактах общего белка из HSC и тканей печени. Как клетки, так и замороженные ткани гомогенизировали в буфере для радиоиммунопреципитационного анализа (RIPA), содержащем ингибиторы протеаз и фосфатаз (Thermo Scientifics), с последующим центрифугированием для осветления лизата. Концентрации белка определяли с помощью методики Бредфорда (Bio-Rad). Равное количество белковых лизатов разделяли с помощью электрофореза в ДСН-ПААГ, переносили на

- 69 050147 мембрану из ПВДФ и подвергали иммуноблоттингу на предмет указанных первичных антител. Белки визуализировали с использованием системы обнаружения ECL (Pierce) с соответствующими вторичными антителами.

Гистология.

Ткани печени фиксировали в течение 48 ч при КТ в 10% нейтральном забуференном формалине (NBF), обезвоживали, помещали в парафиновые блоки и нарезали на срезы по 7 мкм. Срезы, трихромно окрашенные по Массону, исследовали с помощью светового микроскопа. Каждый гистологический эксперимент повторяли независимо с аналогичными результатами из расчета п=3/группу. Получали изображения срезов и полуколичественно определяли окрашенные синим фиброзные участки с помощью программного обеспечения Image-J (обратная цветовая фильтрация - трихромное окрашивание по Массону) из расчета 4 среза/печень. Информация о лечении и генотипах не была известна исследователям, выполняющим гистологические анализы и получающим полуколичественные показания.

Ссылки на дополнительные материалы.

1. Dams-Kozlowska Н, Gryska К, Kwiatkowska-Borowczyk Е, et al. A designer hyper interleukin 11 (H11) is a biologically active cytokine. BMC Biotechnol 2012;12:8.

2. Schafer S, Viswanathan S, Widjaja AA, et al. IL-11 is a crucial determinant of cardiovascular fibrosis. Nature 2017;552:110-115.

3. Cook S, Ng B, Dong J, et al. IL-11 is a therapeutic target in idiopathic pulmonary fibrosis. 2018. Доступно по адресу: http://dx.doi.org/10.1101/336537.

4. Myszka DG. Improving biosensor analysis. J Mol Recognit 1999;12:279-284.

5. Dou C, Liu Z, Tu K, et al. P300 Acetyltransferase Mediates Stiffness-Induced Activation of Hepatic Stellate Cells Into Tumor-Promoting Myofibroblasts. Gastroenterology 2018;154:2209-2221.e14.

6. Bolger AM, Lohse M, Usadel B. Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data. Bioinformatics 2014;30:2114-2120.

7. Dobin A, Davis CA, Schlesinger F, et al. STAR: ultrafast universal RNA-seq aligner. Bioinformatics 2013;29:15-21.

8. Liao Y, Smyth GK, Shi W. The Subread aligner: fast, accurate and scalable read mapping by seedand-vote. Nucleic Acids Res 2013;41:e108.

9. Love Ml, Huber W, Anders S. Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2. Genome Biol 2014;15:550.

10. Liberzon A, Subramanian A, Pinchback R, et al. Molecular signatures database (MSigDB) 3.0. Bioinformatics 2011 ;27:1739-1740.

11. Subramanian A, Tamayo P, Mootha VK, et al. Gene set enrichment analysis: a knowledge-based approach for interpreting genome-wide expression profiles. Proc Natl Acad Sci U S A 2005;102:15545-15550.

Пример 5: аутокринный цис-сигнальный путь ИЛ-11 в гепатоцитах является инициирующей связью между липотоксичностью и неалкогольным стеатогепатитом (НАСГ).

5.1. Обзор.

Сигнальный путь ИЛ-11 играет важную роль при неалкогольном стеатогепатите (НАСГ). В настоящем примере авторы изобретения демонстрируют, что нагруженные липидами гепатоциты секретируют ИЛ-11, который действует через аутокринную петлю цис-сигнального пути, вызывая липоапоптоз. В то время как ИЛ-6 защищает гепатоциты, ИЛ-11 вызывает гибель гепатоцитов посредством активации неканонических сигнальных путей и активации NOX4 и активных форм кислорода. В двух доклинических моделях гепатоцит-специфичная делеция Ил-11ra1 защищала мышей от всех аспектов НАСГ. Кроме того, восстановление цис-сигнального пути ИЛ-11 только в гепатоцитах у мышей с глобальным нокаутом ll11ra1 восстанавливало стеатоз и воспаление. Никаких доказательств, подтверждающих существование транс-сигнального пути ИЛ-6 или ИЛ-11, обнаружено не было. Авторы изобретения пришли к выводу, что липотоксические явления в гепатоцитах стимулируют секрецию ИЛ-11, приводящую к гибели гепатоцитов с последующим фиброзом и воспалением. Эти данные описывают новый, специфичный для гепатоцитов механизм перехода от неалкогольной жировой болезни печени к НАСГ.

5.2. Введение.

Интерлейкин 11 (ИЛ-11) является ключевым фиброгенным фактором (Ng et al., 2019; Schafer et al., 2017), уровень которого повышается в высокоточных срезах печени при фиброзе у различных видов животных (Bigaeva et al., 2019). Показано, что ИЛ-11 оказывает негативное влияние на функцию гепатоцитов после токсического поражения печени (Widjaja et al.) и, прямо или косвенно, способствует развитию патологических явлений неалкогольного стеатогепатита (НАСГ) (Widjaja et al., 2019). С другой стороны, в ряде более ранних публикаций предполагалось, что ИЛ-11 является защитным фактором в моделях ишемического, инфекционного или токсикологического повреждения печени у мышей (Bozza et al., 1999;

- 70 050147

Maeshima et al., 2004; Nishina et al., 2012; Trepicchio et al., 2001; Yu et al., 2016; Zhu et al., 2015). Однако теперь очевидно, что рекомбинантный ИЛ-11 человека (rhlL11), использовавшийся в более ранних исследованиях, неэффективен у мышей (Widjaja et al.).

ИЛ-11 является членом цитокинового семейства интерлейкина 6 (ИЛ-6) и, как и ИЛ-6, связывается со своим мембраносвязанным альфа-рецептором (ИЛ-НИЛ) и гликопротеином 130 (gp130), активируя цис-сигнальный путь. Сам ИЛ-6 связан с функцией печени, и в публикациях указывается на его общий благотворный эффект (Klein et al., 2005; Kroy et al., 2010; Matthews et al., 2010; Schmidt-Arras and RoseJohn, 2016; Wuestefeld et al., 2003). Тем не менее, считается, что ИЛ-6 также может связываться с растворимым рецептором ИЛ-6 (slL6R) и активировать транссигнальный путь, который считается дезадаптивным (Schmidt-Arras and Rose-John, 2016). Возможно, сигнальный путь ИЛ-11, как и ИЛ-6, в трансварианте действует в патогенном режиме, однако эксперименты на сегодняшний день не нашли доказательств этого в опухолях или репродуктивных тканях (Agthe et al., 2017; Balic et al., 2017).

Механизм, лежащий в основе перехода от неалкогольной жировой болезни печени (НАЖБП) к НАСГ, является многофакторными, однако центральное значение имеет липидная нагрузка гепатоцитов (Friedman et al., 2018). Некоторые виды липидов токсичны для гепатоцитов, и эта липотоксичность стимулирует высвобождение цитокинов, вызывающее гибель гепатоцитов и паракринную активацию звездчатых клеток печени (HSC) и иммунных клеток (Farrell et al., 2018; Friedman et al., 2018). Липотоксичность, например, обусловленная пальмитатом (Kakisaka et al., 2012), является ранним явлением при НАСГ и представляет собой связь между диетой, НАЖБП и НАСГ. Хотя генетическое или фармакологическое ингибирование цис-сигнального пути ИЛ-6 ухудшает фенотипы стеатоза (Kroy et al., 2010; Matthews et al., 2010; Yamaguchi et al., 2010), роль ИЛ-11 при липотоксичности в печени не описана.

В настоящем примере для решения ключевых вопросов, касающихся роли ИЛ-11 в биологии гепатоцитов, НАЖБП и НАСГ, использовали ряд подходов in vitro и in vivo: (1) определение истинной роли цис- и транс-сигнального пути ИЛ-11 в гепатоцитах человека, (2) изучение того, связана ли липотоксичность с активностью ИЛ-11 в гепатоцитах, (3) установление того, способствует ли транс-сигнальный путь ИЛ-11 или ИЛ-6 развитию НАСГ, (4) критический анализ взаимосвязи между цис-сигнальным путем ИЛ-11 в гепатоцитах и развитием стеатоза, гибелью гепатоцитов, воспалением и фиброзом. Эти исследования выявили неожиданные аспекты биологии ИЛ-6 и ИЛ-11 и продемонстрировали однозначный патогенный эффект активируемого липотоксичностью аутокринного цис-сигнального пути ИЛ-11 в гепатоцитах, который инициирует переход от НАЖБП к НАСГ.

5.3. Результаты.

5.3.1. Синтетические конструкты транс-сигнального пути ИЛ-11 вызывают гибель гепатоцитов.

Авторы изобретения сначала оценили уровни экспрессии ИЛ-6R, ИЛ-URA и gp130 в первичных гепатоцитах человека с помощью проточной цитометрии. Выраженная экспрессия ИЛ-URA и gp130 наблюдалась в подавляющем большинстве клеток (92,6% и 91,9%, соответственно), но только некоторые гепатоциты (3,0%) экспрессировали ИЛ-6R, причем уровень этой экспрессии был низким (фиг. 33А и 40А). В соответствии с этим результатом, исследования посредством секвенирования РНК и Ribo-seq обнаружили, что транскрипты ИЛ-URA и gp130 экспрессируются на высоком уровне и активно транслируются в гепатоцитах. Напротив, наблюдалось малое количество транскриптов ИЛ-6R, а обнаружимая трансляция ИЛ-6R практически отсутствовала (фиг. 33B-33D, 40В и 40С). Иммунофлуоресцентное окрашивание гепатоцитов подтверждало результаты данных Ribo-seq: высокий уровень экспрессии ИЛ11RA при отсутствии обнаружимой экспрессии ИЛ-6R (фиг. 40D). Авторы изобретения также не обнаружили значимых уровней ИЛ-6R в культуральных средах (уровни были чуть выше нижнего предела обнаружения), и поэтому исключили возможность отсоединения ИЛ-6R от мембран клеток (фиг. 40Е). В совокупности эти данные показывают, что в первичных гепатоцитах человека ИЛ-6R экспрессируется на очень низких уровнях, что подразумевает ограниченную роль цис-сигнального пути ИЛ-6 в этих клетках. Вместе с тем эти клетки демонстрируют сильную совместную экспрессию как ИЛ-URA, так и gp130.

Учитывая отсутствие экспрессии ИЛ-6R гепатоцитами человека, авторы изобретения использовали синтетический конструкт транс-сигнального пути ИЛ-6 (hyperlL6) для активации сигнального пути ИЛ-6 в этих клетках и сравнили его с синтетическим комплексом транссигнального пути ИЛ-11 (hyperlLH). HyperlLH, как и сам ИЛ-11 (Widjaja et al.), активировал ERK и JNK в зависимости от дозы (от 2,5 нг/мл до 20 нг/мл). Напротив, транс-сигнальный путь ИЛ-6 не активировал неканонические сигнальные пути, и вместо этого индуцировал активацию STAT3 в зависимости от дозы (фиг. 33Е). Таким образом, ИЛ-11 или ИЛ-6 в заранее сформированном синтетическом комплексе со своими рецепторами активируют различные внутриклеточные пути при связывании с gp130 на гепатоцитах, что является новым и интригующим открытием.

HyperlLH вызывал повышение уровня аланинаминотрансферазы (АЛТ) в среде первичных культур гепатоцитов человека в зависимости от дозы, в то время как обнаружено, что hyperlL6 (20 нг/мл) обладал значительным, хотя и ограниченным, цитопротекторным эффектом (кратность изменения (FC)=0,9; Р=0,0468) (фиг. 33F). Растворимый gp130 (sgp130) является ингибитором комплексов транс-сигнального пути, действующих через gp130 (Schmidt-Arras and Rose-John, 2016). В соответствии с его зарегистрированными эффектами рецептора-приманки, sgp130 блокировал активацию сигнальных путей на стадиях

- 71 050147 после hyperlLH (p-ERK/p-JNK) и hyperlL6 (p-STAT3), а также ингибировал гепатотоксические эффекты hyperlL11 (фиг. 33G-33I).

Затем авторы изобретения провели эксперименты с целью обнаружения транс-сигнального пути ИЛ-11 в отсутствие искусственных белковых комплексов hyperlL6 или hyperlLH. Клетки стимулировали ИЛ-11 в присутствии растворимого gp130 (sgp130, для ингибирования предполагаемого транссигнального пути) либо растворимого ИЛ-URA (sIL11RA, для стимуляции предполагаемого транссигнального пути). sgp130 или sIL11RA не влияли на индуцированную ИЛ-11 гибель гепатоцитов и сигнальные пути (фиг. 33J-33K и 40F). Кроме того, ИЛ-11 в зависимости от дозы (от 0,625 нг/мл до 20 нг/мл) вызывал гибель гепатоцитов, на которую не влияло добавление sgp130 (1 мкг/мл) или sIL11RA (1 мкг/мл) (фиг. 40G). И наоборот, увеличение дозы sgp130 или sIL11RA не оказывало влияния на высвобождение АЛТ из ИЛ-11 -стимулированных гепатоцитов (фиг. 40Н). Эти данные позволяют предположить, что транссигнальный путь ИЛ-11 может отсутствовать в отсутствие синтетических конструктов.

5.3.2. Цис-сигнальный путь ИЛ-11 лежит в основе липотоксичности в гепатоцитах.

Для оценки роли ИЛ-11 в жировой болезни печени авторы изобретения смоделировали липотоксичность гепатоцитов, рассматриваемую как патологическое явление, инициирующее НАСГ и связанное с высвобождением цитокинов из поврежденных гепатоцитов (Friedman et al., 2018). Гепатоциты загружали смесью пальмитат:БСА в соотношении 6:1 с использованием концентрации насыщенных жирных кислот (sFS), наблюдаемой в сыворотке пациентов с НАЖБП (Kleinfeld et al., 1996). По сравнению с контролем клетки, загруженные sFA, секретировали большее количество ИЛ-11 (FC=28, P<0,0001), а также ИЛ-6, CCL2 и CCL5 (фиг. 34A-34D). Нагруженные липидами гепатоциты подвергались апоптотической гибели (согласно FACS), а также некротическому высвобождению АЛТ (фиг. 34E-34G).

Для проверки наличия функциональной связи секреции ИЛ-11 из гепатоцитов, нагруженных липидами, с липотоксичностью посредством цис- или транс-сигнального пути клетки инкубировали с антителом против ИЛ-URA (X209) либо с sgp130. X209 снижало секрецию всех цитокинов, включая сам ИЛ11, тогда как sgp130 не оказывал никакого эффекта (фиг. 34A-34G). Это свидетельствует о наличии аутокринной петли цис-сигнального пути ИЛ-11 при гепатоцитарной липотоксичности. Продукция активных форм кислорода (АФК) из поврежденных митохондрий имеет важное значение для липотоксичности (Farrell et al., 2018), а АФК из NOX4 также имеют отношение к НАСГ (Bettaieb et al., 2015). Обнаружено, что Х209 предотвращало продукцию АФК в гепатоцитах, нагруженных sFA, и что это сопровождалось частичным восстановлением уровней глутатиона (GSH) (фиг. 34Н и 34I).

Далее авторы изобретения исследовали события, связанные с сигнальными путями. Липотоксичность тесно связана с активацией JNK, которая управляет активацией каспазы-3 и липоапоптозом. Соответственно, нагруженные пальмитатом гепатоциты демонстрировали активацию JNK и расщепление каспазы-3, а также фосфорилирование ERK (фиг. 34J). Эта картина была в значительной степени сходна с эффектами, наблюдаемыми при стимуляции ИЛ-11 (фиг. 33Е). Х209 в значительной степени ингибировало индуцированные пальмитатом явления, связанные с сигнальными путями, а также активацию синтазы жирных кислот (FASN), активацию каспазы-3 и накопление триглицеридов, несмотря на аналогичное поглощение sFA гепатоцитами (фиг. 34J, 34K и 40I). Пальмитат стимулировал, а Х209 ингибировало NOX4 (фиг. 34J). Хотя STAT3 активировали путем загрузки sFA, обнаружено, что этот эффект не зависел от сигнального пути, опосредованного ИЛ-URA, и не был связан с липоапоптозом (фиг. 34J). На протяжении этих экспериментов sgp130 не оказывал никакого влияния. В совокупности эти данные показывают, что индуцированная пальмитатом секреция ИЛ-11 и аутокринный цис-сигнальный путь ИЛ-11 по принципу прямой связи важны для липотоксичности гепатоцитов.

5.3.3. Отсутствие доказательств существования транс-сигнального пути ИЛ-11 или ИЛ-6 в двух моделях НАСГ.

Затем авторы изобретения исследовали, лежит ли транс-сигнальный путь в основе НАСГ in vivo с использованием двух доклинических моделей НАСГ у мышей: Модели западного кормового рациона с добавлением фруктозы (WDF) и модели кормового рациона с дефицитом метионина и холина и высоким содержанием жиров (HFMCD). Модель WDF была ассоциирована с ожирением, гиперлипидемией и инсулинорезистентностью и рассматривалась как способная переходить в распространенные формы НАСГ человека, как у пациентов с сахарным диабетом. Модель HFMCD стимулировала быстрое начало НАСГ, специфично вызванное липотоксичностью гепатоцитов, что было ассоциировано с потерей массы тела в отсутствие инсулинорезистентности. Липотоксичность являлась общим фактором для обеих моделей, в то время как ожирение и инсулинорезистентность не являлись таковыми.

За три недели до начала использования рациона WDF и HFMCD мышам вводили вирус AAV8, кодирующий либо sgp130 под контролем промотором альбумина (AAV8-Alb-sgp130), содержавший весь внеклеточный домен белка gp130 мыши (аминокислоты 1-617), либо только промотор альбумина (AAV8Alb-Null) (фиг. 35А, 41А и 42А). Введение AAV8-Alb-sgp130 индуцировало высокие уровни sgp130 в печени, который также обнаруживался в периферическом кровотоке, что подходило как для местного, так и для системного ингибирования предполагаемого транссигнального пути ИЛ-6 или ИЛ-11 (фиг. 35В, 41В, 42В-42С).

После 16 недель WDF уровни ИЛ-11 были сильно повышены в печени и на периферии, однако вли

- 72 050147 яние на экспрессию ИЛ-6 отсутствовало (фиг. 35В и 35С). У мышей, получавших WDF, развилось ожирение (фиг. 41С), они характеризовались приблизительно 2-кратным увеличением массы печени, и у них развился тяжелый стеатоз согласно данным макроморфологии, гистологии и количественного анализа триглицеридов в печени (фиг. 35E-35G). Высокие уровни экспрессии sgp130 не влияли на эти фенотипические аспекты (фиг. 35B-35G). Аналогичным образом, мыши, получавшие WDF, характеризовались повышенными уровнями АЛТ, ACT, коллагена и периферических сердечно-сосудистых факторов риска (глюкозы в крови натощак, триглицеридов в сыворотке и холестерина в сыворотке), а также истощением GSH, но sgp130 не влиял ни на один из этих параметров (фиг. 35H-35N). Печень мышей, получавших рацион WDF в течение 16 недель, демонстрировала повышенную экспрессию провоспалительных генов и генов фиброза, и опосредованное sgp130 ингибирование предполагаемого транссигнального пути не влияло на эту сигнатуру (фиг. 35O и 41D-41E).

Во втором наборе экспериментов НАСГ индуцировали с использованием кормового рациона HFMCD (фиг. 42А). Рацион HFMCD повышал уровни ИЛ-11 в печени и сыворотке, в то время как уровни ИЛ-6 были несколько ниже в печени и незначительно увеличены на периферии (фиг. 42В и 42D-42E). У мышей, получавших HFMCD, развился быстрый и выраженный стеатоз, согласно данным макроморфологических, гистологических и молекулярных анализов, на который не влияла экспрессия sgp130 (фиг. 42F и 42G). При использовании рациона HFMCD уровни маркеров повреждения гепатоцитов (АЛТ и ACT) были повышены, a GSH истощен, независимо от экспрессии sgp130 (фиг. 42H-42J). Аналогичным образом, sgp130 не влиял на HFMCD-индуцированный фиброз печени (фиг. 42K). На уровне РНК рацион HFMCD был ассоциирован с нарушениями регуляции экспрессии генов воспаления и фиброза, и экспрессия sgp130 не влияла на эти молекулярные фенотипы (фиг. 42L и 42М).

На уровне сигнальных путей кормовые рационы WDF и HFMCD стимулировали активацию ERK и JNK, что согласуется с повышенной активностью цис-сигнального пути ИЛ-11 (фиг. 35Р и 42N). Напротив, уровни pSTAT3 в печени не повышались при использовании WDF (фиг. 35Р) и, по-видимому, были незначительно повышены у мышей, получавших HFMCD (фиг. 42N). Во всех случаях влияние sgp130 на индуцированные рационом явления, связанные с сигнальными путями, отсутствовало. В целом эти данные свидетельствуют о том, что ни транс-сигнальный путь ИЛ-6, ни транс-сигнальный путь ИЛ-11 не играют никакой роли при НАСГ, что согласуется с другими исследованиями, где транс-сигнальные пути семейства ИЛ-6 не обнаруживались (Agthe et al., 2017; Balic et al., 2017; Kammoun et al., 2017; Kraakman etal., 2015).

5.3.4. Для инициации НА СГ требуется гепатоцит-специфичный цис-сигнальный путь ИЛ-11 Несмотря на отсутствие доказательств, подтверждающих роль транс-сигнального пути ИЛ-11 в моделях НАСГ, в целом данные свидетельствуют об увеличении эффектов ИЛ-11 в гепатоцитах, предположительно по цис-пути. Для проверки этого предположения авторы изобретения вводили AAV8-Alb-Cre мышам ll11ra1_loxP/_1oxP для делеции ll11ra1 только в гепатоцитах (мыши с CKO). Затем мышей с CKO кормили нормальным кормом (NC), кормовым рационом HFMCD, либо кормовым рационом WDF (фиг. 36А и 37А). Уровень белка ИЛ-URA в печени был значительно снижен у мышей с CKO после введения AAV8-Alb-Cre, демонстрируя эффективность модели и указывая на то, что гепатоциты являются крупнейшим резервуаром Ил-11ra1 в печени (фиг. 36В и 37В).

В дополнение к быстрой стимуляции НАСГ, обусловленного липотоксичностью (Stephenson et al., 2018), рацион HFMCD вызывал потерю массы тела (Stephenson et al., 2018). Как ни странно, потеря массы тела у мышей, получавших рацион HFMCD, была изначально ограничена, а затем обратима у мышей с CKO (фиг. 36С). Мыши, получавшие WDF, набирали массу тела и жира в течение всего эксперимента, как и ожидалось. Однако, что не менее странно, эти фенотипы ожирения были смягчены у мышей с CKO (фиг. 37С и 37D). Эти данные свидетельствуют о том, что ингибирование сигнального пути ИЛ-11 является допустимым для гомеостаза массы тела и характеризуется контекстно-специфичными эффектами, противодействующими кахексии или ожирению.

Согласно данным макроморфологических, гистологических исследований и количественного анализа триглицеридов мыши с CKO, получавшие рацион HFMCD либо WDF, были надежно защищены от стеатоза (фиг. 36D и 36Е, 37Е и 37F), а мыши, получавшие рацион WDF, характеризовались менее выраженной гепатомегалией (фиг. 37G). Маркеры поражения печени были заметно снижены у мышей с CKO, получавших рацион HFMCD (снижение: АЛТ, 99%; ACT, 97%; Р<0,0001 для обоих показателей) либо WDF (снижение: АЛТ, 98%; ACT, 98%; Р<0,0001 для обоих показателей), и были признаны сопоставимыми с контрольными уровнями при использовании NC (фиг. 36F и 36G, 37Н и 37I). В обеих моделях уровни GSH были снижены у контрольных мышей, получавших рационы, вызывающие НАСГ, но нормализовались у мышей с CKO (фиг. 36Н и 37J).

Фиброз печени был значительно ослаблен у мышей с CKO, получавших любой рацион, вызывающий НАСГ, по сравнению с контрольными животными (снижение: HFMCD, 87%; WDF, 64%; Р<0,001 для обоих рационов) (фиг. 36I и 36K). Повышение уровня экспрессии провоспалительных генов и генов фиброза у мышей, получавших рацион HFMCD или WDF, также снижалось у мышей с CKO (фиг. 36J, 37L, 43А и 43В, 44А и 44В). Это позволяет предположить, что трансформация HSC в миофибробласты и

- 73 050147 активация иммунных клеток частично являются вторичными по отношению к предыдущим явлениям, обусловленным ИЛ-11 в гепатоцитах. У мышей, получавших WDF, также развились гипергликемия, гипертриглицеридемия и гиперхолестеринемия, причем все эти явления были менее выражены у мышей с CKO, что указывает на важную роль гепатоцит-специфичного сигнального пути ИЛ-11 для фенотипов НАСГ в более общем плане (фиг. 44С-44Е). На уровне сигнальных путей как рацион HFMCD, так и рацион WDF приводили к повышенному фосфорилированию ERK и JNK. Это в значительной степени предотвращалось у мышей с CKO, что согласуется с ингибированием сигнального пути ИЛ-11 в гепатоцитах (фиг. 36K и 37М).

5.3.5. Восстановление гепатоцит-специфичного цис-сигнального пути ИЛ-11 у мышей без IL11ra1 восстанавливает стеатогепатит, но не фиброз печени.

Эксперименты с усилением функции in vivo использовали для дополнения экспериментов с потерей функции с использованием мышей с CKO. Авторы изобретения исследовали, приводит ли гепатоцитспецифичное восстановление цис- или транс-сигнального пути ИЛ-11 у мышей с глобальной делецией ll11ra1 (нокауты ll11ra1-/- (KO)) к заболеванию. Мышам с KO вводили AAV8, кодирующий полноразмерный мембраносвязанный Ш1га1 (mbll11ra1; для восстановления цис-сигнального пути), либо секретируемую/растворимую форму ll11ra1 (sll11ra1, которая представляет собой внеклеточный фрагмент ll11ra1; для активации транс-сигнального пути), либо контрольный конструкт, после чего животных кормили NC, рационом HFMCD или WDF (фиг. 38А, 45 А и 46А).

Мыши с KO, которым вводили AAV8-Alb-mbll11ra1, вновь экспрессировали Ил-Urai на гепатоцитах, а мыши с KO, которым вводили AAV8-Alb-sll11ra1, демонстрировали повышенную экспрессию sIL11RA1 как в печени, так и в кровотоке (фиг. 38В, 45В, 46В и 46С). Как и ожидалось, у мышей дикого типа, получавших контрольные конструкты AAV8 (AAV8-Alb-Null) и корм NC, была нормальная печень и при использовании рациона HFMCD или WDF у них развивался стеатоз, воспаление и повреждение печени (фиг. 38C-38J, 45С и 45D, 46D-46K). Мыши с KO, которым вводили контрольный вирус и кормили рационом HFMCD либо WDF, были защищены от фенотипов НАСГ, хотя защита путем делеции эмбрионального ll11ra1 была не такой эффективной, как у мышей с CKO.

Восстановление цис-сигнального пути ИЛ-11 у мышей с KO с использованием mb11ra1 приводило к воспроизведению стеатоза и воспаления печени, что было очевидно на основе макроморфологических данных и молекулярной картины экспрессии генов и сигнальных путей (фиг. 38C-38J, 45C-45D и 46D46L). Примечательно, что содержание коллагена в печени и экспрессия генов фиброза не восстанавливались (фиг. 38I и 38J, 45D, 46I и 46K), поскольку сигнальный путь ИЛ-11 в HSC, важный для трансформации HSC в миофибробласты (Widjaja et al., 2019), не зависит от экспрессии Ил-11ra1, управляемой альбумином (т.е. HSC сохраняли делецию ll11ra1 в этих моделях). Напротив, экспрессия sIL11RA в гепатоцитах при KO, которая теоретически могла бы активировать транс-сигнальный путь, не имела эффекта, несмотря на высокие уровни ИЛ-11 (фиг. 35В), и мыши оставались защищенными от всех патологических явлений НАСГ (фиг. 38C-38J, 45C-45D и 46D-46K). Изменения сигнальных путей были последовательными в том, что экспрессия mlL11RA восстанавливала активацию ERK и JNK у мышей KO при использовании любого рациона, в то время как sIL11RA1 не восстанавливал ее (фиг. 38K и 46L). В модели WDF восстановление цис-сигнального пути ИЛ-11, специфичного для гепатоцитов, у мышей с KO вызывало гипергликемию, гипертриглицеридемию и гиперхолестеринемию, однако экспрессия slL11ra1 не вызывала их (фиг. 38L-38N).

5.4. Обсуждение.

Метаболическое заболевание печени обычно встречается в контексте ожирения и диабета 2 типа и первоначально проявляется как НАЖБП, которая может прогрессировать до НАСГ (Friedman et al., 2018; Sanyal, 2019). Ключевой базовой патологией при прогрессировании до НАСГ является перегрузка субстратом, при которой изобилие метаболитов превосходит способность гепатоцитов перерабатывать жир, что приводит к липотоксичности. Цитокины являются ключевыми факторами НАСГ, секретируемыми липотоксическими гепатоцитами (Friedman et al., 2018), и авторы изобретения в настоящем документе установили, что ИЛ-11 является важным компонентом липотоксической среды и фактором перехода от НАЖБП к НАСГ.

Большой объем доказательств подтверждает представления о том, что сигнальный путь ИЛ-6 в печени оказывает благоприятный эффект (Kroy et al., 2010; Schmidt-Arras and Rose-John, 2016; Yamaguchi et al., 2010). Тем не менее, предполагалась, что транс-сигнальный путь ИЛ-6 играет патогенную роль при стеатозе печени (Kammoun et al., 2017; Wieckowska et al., 2008). Авторы изобретения с использованием синтетических конструктов обнаружили, что hyperlLH, инициирующий транс-сигнальный путь ИЛ-11, является цитотоксическим, тогда как hyperlL6 оказывает на гепатоциты защитное действие. Однако доказательства существования транссигнального пути отсутствовали в биологически значимом контексте in vitro или in vivo, при использовании как усиления, так и потери функции. Это говорит о том, что транс-сигнальный путь члена семейства ИЛ-6 не играет никакой роли при НАСГ, что согласуется с предыдущими исследованиями в организме за пределами печени (Agthe et al., 2017; Balic et al., 2017). Актуальность этих результатов для других заболеваний неясна, и в настоящее время ведутся клинические исследования, целью которых является выяснение роли транс-сигнального пути при язвенном колите (Kang

- 74 050147 et al., 2019). Предыдущие исследования показали, что ИЛ-6R экспрессировался в гепатоцитах (SchmidtArras and Rose-John, 2016), и поэтому обнаружение крайне низкого уровня/отсутствия экспрессии ИЛ-6R в первичных гепатоцитах человека было неожиданным. Это может отражать сильную зависимость от трансформированных гепатоцитоподобных клеток (например, HepG2) в более ранних исследованиях.

Авторы изобретения в настоящем документе демонстрируют критическую важность циссигнального пути ИЛ-11 в гепатоцитах для НАСГ. Этот эффект установлен с использованием как гепатоцит-специфичной потери функции при фоновом генотипе дикого типа, так и гепатоцит-специфичной усиления функции при отсутствии ll11ra1 в генотипе. Это опровергает приведенное в литературе предположение о том, что ИЛ-11 играет защитную роль в гепатоцитах, основанное на использовании rhИЛ11, неэффективного у мышей, в моделях заболевания печени у мышей (Maeshima et al., 2004; Nishina et al., 2012; Trepicchio et al., 2001; Zhu et al., 2015). Важно отметить, что в то время как восстановление гепатоцит-специфичного цис-сигнального пути ИЛ-11 вызывало стеатогепатит у мышей с КО, восстановления фиброза не происходило, а у мышей с CKO наблюдалось предотвращение фиброза. Это демонстрирует, что цис-сигнальный путь ИЛ-11 в HSC необходим для фиброза печени, и дисфункция гепатоцитов происходит до активации HSC.

Авторы изобретения предлагают механистическую модель для НАСГ, в которой загруженные липидами гепатоциты секретировали ИЛ-11, что приводило к гибели аутокринных клеток, паракринной активации HSC и вторичной активации и инфильтрации воспалительных клеток (фиг. 39). Мишенью ингибирования сигнального пути ИЛ-11 являлась причинно-следственная связь, инициирующая стеатогепатит, обусловленный применением рациона, которая влияет на последующий фиброз и воспаление печени, что предполагает разработку нового подхода к лечению НАСГ.

5.5. Материалы и способы для примера 5.

5.5.1. Векторы AAV8.

Все векторы на основе аденоассоциированного вируса серотипа 8 (AAV8) синтезировали в Vector Biolabs. Вектор AAV8, несущий кДНК мембраносвязанного ll11ra1 мыши (номер доступа NCBI: ВС069984), кДНК растворимого ll11ra1 мыши и кДНК растворимого gp130 мыши под контролем промотора альбумина (Alb), называли AAV8-Alb-mbll11ra1, AAV8-Alb-sll11ra1 и AAV8-Alb-sgp130, соответственно. AAV8-Alb-sgp130 и AAV8-Alb-sll11ra1 конструировали путем удаления трансмембранной и цитоплазматической областей последовательности gp130 мыши (номер доступа NCBI: BC058679) и последовательности ll11ra1 мыши, соответственно. Вектор AAV8-Null использовали в качестве контрольного вектора. Для специфичной делеции ll11ra1 в клетках, экспрессирующих альбумин, вектор AAV8-Alb-iCre вводили мышам, гомозиготным по аллелям ll11ra1, фланкированным LoxP (мышам ll11ra1_loxP/loxP).

5.5.2. Антитела.

Альбумин (ab207327, Abcam), вторичное антитело, меченое Alexa Fluor 488 (ab150077, Abcam), расщепленная каспаза-3 (9664, CST), каспаза-3 (9662, CST) p-ERK1/2 (4370, CST), ERK1/2 (4695, CST), GAPDH (2118, CST), gp130 (PA5-28932, Thermo Fisher), ИЛ-6 (AF506, R&D systems), ИЛ-6R (проточная цитометрия, ab222101, Abcam), ИЛ-6R (для иммунофлуоресцентного окрашивания, МА1-80456, Thermo Fisher), ИЛ-11 (Aldevron), ИЛ-URA (проточная цитометрия и иммунофлуоресцентное окрашивание, ab125015, Abcam), ИЛ-URA (вестерн-блоттинг, 130920, Santa Cruz), p-JNK (4668, CST), JNK (9258, CST), p-STAT3 (4113, CST), STAT3 (4904, CST), антитело против антител мыши, меченое ПХ (7076, CST), антитело против антител кролика, меченое ПХ (7074, CST), антитело против антител крысы, меченое ПХ (31470, Santa Cruz).

5.5.3. Рекомбинантные белки.

Коммерческие рекомбинантные белки: HyperIL6 человека (гибридный белок mi-6R:ИЛ-6, 8954-SR, R&D systems), растворимый Fc gp130 человека (671-GP-100, R&D systems), ИЛ-URA человека (8895MR-050, R&D systems).

Пользовательские рекомбинантные белки: ИЛ-11 человека (UniProtKB:P20809, Genscript). HyperlLH человека (гибридный белок ИЛ-11ИА:ИЛ-11), имитирующий комплекс транс-сигнального пути, конструировали с использованием фрагмента ИЛ-URA (аминокислотные остатки 1-317; UniProtKB: Q14626) и ИЛ-11 (аминокислотные остатки 22-199, UniProtKB: P20809) с линкером из 20 аминокислот (SEQ ID NO:20) (Schafer et al., 2017).

5.5.4. Химические вещества.

Пальмитат (Р5585, Sigma), параформальдегид (PFA, 28908; Thermo Fisher), форбол-12-миристат 13ацетат (РМА, Р1585, Sigma), тритон Х-100 (Т8787, Sigma) и 4',6-диамидин-2-фенилиндол (D1306; Thermo Fisher).

5.5.5. Культура первичных гепатоцитов человека.

Первичные гепатоциты человека (5200, ScienCell) поддерживали в среде для гепатоцитов (520, ScienCell) с добавлением 2% эмбриональной сыворотки КРС, 1% пенициллин-стрептомицина при 37°С и 5% СО2. Гепатоциты (Р2-Р3) инкубировали в среде без сыворотки в течение ночи, если иное не указано в способах, а затем выполняли 24-часовую стимуляцию различными дозами различных описанных рекомбинантных белков.

5.5.6. Культура ТНР-1.

- 75 050147

ТНР-1 (АТСС) культивировали в RPMI 1640 (А1049101, Thermo Fisher) с добавлением 10% FBS и 0,05 мМ β-меркаптоэтанола. Клетки ТНР-1 дифференцировали с использованием 10 нг/мл РМА в RPMI 1640 в течение 48 ч.

5.5.7. Обработка пальмитатом (насыщенной жирной кислотой) in vitro.

Раствор пальмитата, конъюгированного с БСА, в соотношении 6:1 получали, как описано ранее (Alsabeeh et al., 2018). Пальмитат (0,5 мМ), конъюгированный с БСА, не содержащим жирных кислот, использовали для обработки клеток, как описано в условных обозначениях на фигурах; 0,5% раствор БСА использовали в качестве контроля.

5.5.8. Проточная цитометрия.

Для анализа поверхностных ИЛ-URA, ИЛ-6R и gp130 первичные гепатоциты человека и клетки ТНР-1 окрашивали антителом против ИЛ-URA, ИЛ-6R или gp130 и соответствующим вторичным антителом, меченым Alexa Fluor 488. Анализ гибели клеток выполняли путем окрашивания первичных гепатоцитов человека с помощью набора для определения апоптоза мертвых клеток с использованием аннексина V, FITC и PI (V13242, Thermo Fisher). Затем клетки Pl+ve количественно определяли с помощью проточного цитометра (Fortessa, BD Biosciences) и анализировали с помощью программного обеспечения FlowJo версии X (TreeStar).

5.5.9. Иммунофлуоресценция.

Первичные гепатоциты человека высевали на 8-луночные предметные стекла (1,5х10⁴клеток/лунка) за 24 ч до окрашивания. Клетки фиксировали в 4% PFA в течение 20 мин, промывали PBS, а неспецифические сайты блокировали 5% БСА в PBS в течение 2 ч. Клетки инкубировали с антителом против ИЛ11RA, ИЛ-6R, gp130 или альбумином в течение ночи (4°С) с последующим инкубированием с соответствующим вторичным антителом, меченым Alexa Fluor 488, в течение 1 ч. Предметные стекла с лунками высушивали в темноте и добавляли 5 капель гистологической среды с DAPI на 15 мин перед визуализацией с помощью флуоресцентного микроскопа (Leica).

5.5.10. Окрашивание Oil Red О.

Первичные гепатоциты человека высевали на 8-луночные предметные стекла (1x104 клеток/лунку). Через 24 ч обработки пальмитатом клетки фиксировали в 10% PFA в течение 30 мин, промывали дистиллированной водой и инкубировали с 60% (об./об.) изопропиловым спиртом в течение 5 мин. Затем клетки окрашивали раствором Oil Red О в течение 30 мин и промывали дистиллированной водой перед визуализацией с помощью микроскопии в светлом поле (ВХ53, Olympus). Липидные капли выявляли по красному окрашиванию.

5.5.11. Обнаружение активных форм кислорода (АФК).

Первичные гепатоциты человека высевали на 8-луночные предметные стекла (1x104 клеток/лунку). Для этого эксперимента клетки не инкубировали в среде без сыворотки до обработки пальмитатом. Через 24 ч после стимуляции пальмитатом клетки промывали, инкубировали с 25 мкМ раствора DCFDA (ab113851, Abcam) в течение 45 мин при 37°С в темноте и промывали буфером для разбавления в соответствии с протоколом производителя. Живые клетки с положительным окрашиванием DCF визуализировали с помощью набора фильтров, подходящих для флуоресцеина (FITC), с использованием флуоресцентного микроскопа (Leica).

5.5.12. Модельные животные.

Эксперименты на животных выполняли в соответствии с рекомендациями комитета учреждения SingHealth по содержанию и использованию животных (IACUC). Мышей содержали в окружении SPF и давали корм и воду вволю.

Модели метаболического заболевания печени у мышей HFMCD.

6-8-недельным мышам C57BL/6N, ll11ra1-/- и ll11ra1_loxP/]_oxP и соответствующим контрольным животным давали кормовой рацион с дефицитом метионина и холина и добавлением 60 ккал% жира (HFMCD, A06071301B16, Research Diets) в течение 4 недель. Контрольных мышей кормили нормальным кормом (NC, Specialty Feeds).

WDF.

6-8-недельным мышам C57BL/6N, ll11ra1-/- и ll11ra1_loxP/loxP и соответствующим контрольным животным давали западный кормовой рацион (D12O79B, Research Diets) с добавлением 15% (мас./об.) фруктозы в питьевой воде (WDF) в течение 16 недель. Контрольные мыши получали NC и водопроводную воду.

Мыши с делецией ll11ra1 (KO).

6-8-недельным самцам мышей ll11ra1-/- (B6.129S1-ll11ratm1Wehil J, Jackson's Laboratory) внутривенно вводили 4x1011 копий генома (gc) вируса AAV8-Alb-mbll11ra1 или AAV8-Alb-sll11ra1 для индукции гепатоцит-специфичной экспрессии ll11ra1 мыши или растворимого ll11ra1, соответственно. Контрольным мышам ll11ra1-/- и их однопометникам дикого типа (ll11ra1+/+) внутривенно вводили 4x1011 gc вируса AAV8-Alb-Null. Через 3 недели после введения вируса мышей кормили рационами HFMCD, WDF или NC. Продолжительность применения рационов описана.

Введение растворимого gp130 in vivo.

- 76 050147

6-8-недельным самцам мышей C57BL/6N (InVivos) вводили 4x1011 gc вируса AAV8-Alb-sgp 130 для индукции гепатоцит-специфичной экспрессии растворимого gp130; контрольным мышам вводили 4 Х10¹¹ дс вируса AAV8-Alb-Null. Через 3 недели после введения вируса мышей кормили рационами HFMCD, WDF или NC в течение описанного времени.

Мыши с ll11ra, фланкированным loxP (CKO).

Мышей с ll11ra1, фланкированным loxP, у которых экзоны 4-7 гена ll11ra1 были фланкированы сайтами loxP, получали с использованием системы CRISPR/Cas9, как описано ранее (Ng et al.). Для индукции гепатоцит-специфичной делеции ll11ra1 6-8-недельным самцам гомозиготных мышей с ll11ra1, фланкированным loxP, внутривенно вводили вирус AAV8-Alb-Cre (4x1011 gc); гомозиготным контрольным мышам с ll11ra1, фланкированным loxP, вводили аналогичное количество вируса AAV8-Alb-Null. Мышам, которым вводили AAV8, давали возможность восстановиться в течение трех недель, а затем кормили рационом HFMCD, WDF или NC. Эффективность нокдауна определяли с помощью вестернблоттинга ИЛ-HRA в печени.

5.5.13. Секвенирование РНК (RNA-seq) и профилирование рибосом (Ribo-seq).

Подготовку библиотек для секвенирования РНК и Ribo-Seq выполняли, как описано ранее (Chothani et al., 2019).

Получение библиотек для секвенирования РНК.

Общую РНК выделяли из гепатоцитов человека с использованием колонок RNeasy (Qiagen). РНК количественно оценивали с использованием набора для высокочувствительного анализа РНК.

Qubit (Life Technologies), а ее качество оценивали на основе числа целостности РНК с использованием набора реагентов для анализа LabChip GX RNA (Perkin Elmer). Набор TruSeq Stranded mRNA Library Preparation kit (lllumina) использовали для измерения содержания транскриптов, следуя стандартным инструкциям производителя.

Получение библиотек для Ribo-seq.

Гепатоциты выращивали до 90% конфлюентности в чашке для культивирования диаметром 10 см и лизировали в 1 мл холодного буфера для лизиса (состав, аналогичный реагенту в наборе TruSeq® Ribo Profile Mammalian Kit, RPHMR12126, lllumina) с добавлением 0,1 мг/мл циклогексимида. Затем гомогенизированные и очищенные лизаты подвергали футпринтингу с использованием нуклеазы Truseq (lllumina) в соответствии с инструкциями производителя. Рибосомы очищали, используя колонки lllustra Sephacryl S400 (GE Healthcare), защищенные фрагменты РНК выделяли с использованием стандартной методики с фенол:хлороформ:изоамиловым спиртом. После удаления рибосомной РНК (Mammalian RiboZero Magnetic Gold, lllumina) из РНК, подвергнутой футпринтингу, получали библиотеки для секвенирования с использованием набора TruSeq® Ribo Profile Mammalian Kit в соответствии с протоколом производителя.

Готовые библиотеки для секвенирования РНК и профилирования рибосом количественно определяли с использованием наборов для количественного определения библиотек KAPA (KAPA Biosystems) в системе ПЦР в реальном времени StepOnePlus (Applied Biosystems) в соответствии с протоколом производителя. Качество и средний размер фрагментов готовых библиотек определяли с использованием набора реагентов LabChip GX DNA High Sensitivity Reagent Kit (Perkin Elmer). Библиотеки с уникальными индексами объединяли и секвенировали на настольном секвенаторе NextSeq 500 (lllumina) с использованием набора NextSeq 500 High Output v2 и реагентов для секвенирования спаренных концевых фрагментов длино й75 п.о.

Обработка и анализ данных для секвенирования РНК и профилирования рибосом.

Необработанные данные секвенирования демультиплексировали с помощью bcl2fastq версии 2.19.0.316, адаптеры обрезали с использованием Trimmomatic (Bolger et al., 2014) версии 0.36, сохраняя прочтения длиной более 20 нт после обрезания. Прочтения Ribo-seq выравнивали с использованием bowtie (Langmead et al., 2009) с известными последовательностями мтРНК, рРНК и тРНК (RNACentral (The RNAcentral Consortium, 2017), выпуск 5.0), и в качестве защищенных фрагментов рибосом (RPF) сохраняли только не выравниваемые прочтения. Выравнивание с геномом человека (hg38) выполняли с использованием STAR (Dobin et al., 2012). Экспрессию генов количественно определяли в областях CDS (кодирующих последовательностей) для Ribo-seq и в экзонных областях для секвенирования РНК, используя однозначно сопоставляемые прочтения (выпуск базы данных Ensembl GRCh38 v86) с подсчетом признаков (Liao et al., 2014). ТРМ рассчитывали и визуализировали с использованием ящичковой диаграммы для сравнения исходной экспрессии ИЛ-HRA (ENSG00000137070), ИЛ-6R (ENSG00000160712) и gp130 (ENSG00000134352). Охват прочтений Ribo-seq и секвенирования РНК для ИЛ-IIRA, ИЛ-6R и gp130 визуализировали с использованием пакета Gviz R (Hahne and Ivanek, 2016) с файлами выравнивания, специфичными по отношению к цепи.

5.5.14. Колориметрические анализы.

Активность аланинаминотрансферазы (АЛТ) в супернатанте клеточной культуры и сыворотке мышей измеряли с использованием набора для анализа активности АЛТ (ab105134, Abcam). Уровни глутатиона (GSH) в печени измеряли с помощью набора для колориметрического обнаружения глутатиона

- 77 050147 (EIAGSHC, Thermo Fisher). Содержание общего гидроксипролина в печени мышей измеряли с использованием набора для анализа Quickzyme Total Collagen (QZBtotco15, Quickzyme Biosciences). Уровни триглицеридов в сыворотке и печени измеряли с использованием набора для анализа триглицеридов (ab65336, Abcam). Уровни аспартатаминотрансферазы (ACT) и холестерина в сыворотке мышей измеряли с помощью набора для анализа ACT (ab105135, Abcam) и набора для анализа холестерина (ab65390; Abcam), соответственно. Все колориметрические анализы выполняли в соответствии с протоколом производителя.

5.5.15. Твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA).

Уровни gp130 в сыворотке мышей количественно определяли с использованием набора для твердофазного ИФА gp130 мыши Mouse gp130 DuoSet ELISA (DY468, R&D systems) в соответствии с протоколом производителя.

5.5.16. ОТ-кПЦР.

Общую РНК выделяли из мгновенно замороженных тканей печени с использованием Trizol (Invitrogen) и набора RNeasy Mini Kit (Qiagen). ПЦР-амплификацию выполняли с использованием набора iScript cDNA Synthesis Kit (Biorad). Экспрессию генов анализировали в двух повторностьях с помощью технологии TaqMan (Applied Biosystems) или SYBR green (Qiagen) с использованием StepOnePlus (Applied Biosystem) в течение 40 циклов. Данные экспрессии нормировали по экспрессии мРНК GAPDH и рассчитывали кратность изменения с использованием способа 2-AACt. Последовательности специфичных зондов TaqMan и праймеров, меченых SYBR green, доступны по запросу.

5.5.17. Иммуноблоттинг.

Вестерн-блоттинг выполняли на экстрактах общего белка из гепатоцитов и тканей печени. Лизаты гепатоцитов и ткани печени гомогенизировали в буфере для лизиса и выделения RIPA (89901, Thermo Scientific), содержащем ингибиторы протеаз и фосфатаз (Roche). Белковые лизаты разделяли с помощью электрофореза в ДСН-ПААГ и переносили на мембраны из ПВДФ. Полосы белков визуализировали с использованием системы обнаружения ECL (Pierce) с соответствующими вторичными антителами: антителом против антител кролика, меченым ПХ, или антителом против антител мыши, меченым ПХ.

5.5.18. Обработка тканей печени и гистологический анализ.

Образцы печени фиксировали в 10% нейтральном формалине, заливали парафином, разрезали на срезы толщиной 5 мкм, окрашивали гематоксилином и эозином (Н&Е) в соответствии со стандартным протоколом и исследовали с помощью светового микроскопа.

5.5.19. Статистический анализ.

Все статистические анализы выполняли с использованием программного обеспечения GraphPad Prism (версия 6.07). Значения Р вычисляли с поправкой на множественное тестирование по Даннетту (когда несколько экспериментальных групп сравнивали с одним состоянием), Тьюки (когда несколько состояний сравнивали друг с другом в рамках одного эксперимента), Сидаку (когда несколько состояний для 2 различных генотипов сравнивали друг с другом). Анализ двух параметров для сравнения двух разных групп выполняли с помощью двухфакторного дисперсионного анализа. Критерий статистической значимости был задан на уровне Р<0,05.

- 78 050147

5.6. Список литературных источников для примера 5.

Agthe, М., Garbers, Y., Putoczki, T., and Garbers, С. (2017). Interleukin-11 classic but not trans-signaling is essential for fertility in mice. Placenta 57, 13-16.

Alsabeeh, N., Chausse, B., Kakimoto, P.A., Kowaltowski, A.J., and Shirihai, O. (2018). Cell culture models of fatty acid overload: Problems and solutions. Biochim. Biophys. Acta Mol. Cell Biol. Lipids 7863, 143-151.

Balic, J.J., Garbers, C., Rose-John, S., Yu, L., and Jenkins, B.J. (2017). Interleukin-11-driven gastric tumourigenesis is independent of trans-signalling. Cytokine 92, 118-123.

Bettaieb, A., Jiang, J.X., Sasaki, Y., Chao, T.-L, Kiss, Z., Chen, X., Tian, J., Katsuyama, M., YabeNishimura, C., Xi, Y., et al. (2015). Hepatocyte Nicotinamide Adenine Dinucleotide Phosphate Reduced Oxidase 4 Regulates Stress Signaling, Fibrosis, and Insulin Sensitivity During Development of Steatohepatitis in Mice. Gastroenterology 149, 468-480.e10.

Bigaeva, E., Gore, E., Simon, E., Zwick, M., Oldenburger, A., de Jong, K.P., Hofker, H.S., Schlepiitz, M., Nicklin, P., Boersema, M., et al. (2019). Transcriptomic characterization of culture-associated changes in murine and human precision-cut tissue slices. Arch. Toxicol.

Bolger, A.M., Lohse, M., and Usadel, B. (2014). Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data. Bioinformatics 30, 2114-2120.

Bozza, M., Bliss, J.L., Maylor, R., Erickson, J., Donnelly, L., Bouchard, P., Dorner, A.J., and Trepicchio, W.L. (1999). Interleukin-11 reduces T-cell-dependent experimental liver injury in mice. Hepatology 30, 1441-1447.

Chothani, S., Schafer, S., Adami, E., Viswanathan, S., Widjaja, A.A., Langley, S.R., Tan, J., Wang, M., Quaife, N.M., Jian Pua, C., et al. (2019). Widespread Translational Control of Fibrosis in the Human Heart by RNA-Binding Proteins. Circulation 140, 937-951.

Dobin, A., Davis, C.A., Schlesinger, F., Drenkow, J., Zaleski, C., Jha, S., Batut, P., Chaisson, M., and Gingeras, T.R. (2012). STAR: ultrafast universal RNA-seq aligner. Bioinformatics 29, 15-21.

Farrell, G.C., Haczeyni, F., and Chitturi, S. (2018). Pathogenesis of NASH: How Metabolic Complications of Overnutrition Favour Lipotoxicity and Pro-Inflammatory Fatty Liver Disease. Adv. Exp. Med. Biol. 1061, 19-44.

- 79 050147

Friedman, S.L., Neuschwander-Tetri, B.A., Rinella, M., and Sanyal, A.J. (2018). Mechanisms of NAFLD development and therapeutic strategies. Nat. Med.

Hahne, F., and Ivanek, R. (2016). Visualizing Genomic Data Using Gviz and Bioconductor. In Statistical Genomics, (Humana Press, New York, NY), pp. 335-351.

Kakisaka, K., Cazanave, S.C., Fingas, C.D., Guicciardi, M.E., Bronk, S.F., Werneburg, N.W., Mott, J.L., and Gores, G.J. (2012). Mechanisms of lysophosphatidylcholine-induced hepatocyte lipoapoptosis. Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 302, G77-G84.

Kammoun, H.L., Allen, T.L., Henstridge, D.C., Kraakman, M.J., Peijs, L., Rose-John, S., and Febbraio, M.A. (2017). Over-expressing the soluble gp130-Fc does not ameliorate methionine and choline deficient diet-induced non alcoholic steatohepatitis in mice. PLoS One 12, e0179099.

Kang, S., Tanaka, T., Narazaki, M., and Kishimoto, T. (2019). Targeting lnterleukin-6 Signaling in Clinic. Immunity 50, 1007-1023.

Klein, C., Wustefeld, T., Assmus, U., Roskams, T., Rose-John, S., Muller, M., Manns, M.P., Ernst, M., and Trautwein, C. (2005). The IL-6-gp130-STAT3 pathway in hepatocytes triggers liver protection in T cell-mediated liver injury. J. Clin. Invest. 115, 860-869.

Kleinfeld, A.M., Prothro, D., Brown, D.L., Davis, R.C., Richieri, G.V., and DeMaria, A. (1996). Increases in serum unbound free fatty acid levels following coronary angioplasty. Am. J. Cardiol. 78, 1350-1354.

Kleinfeld, A.M., Prothro, D., Brown, D.L., Davis, R.C., Richieri, G.V., and DeMaria, A. (1996). Increases in serum unbound free fatty acid levels following coronary angioplasty. Am. J. Cardiol. 78, 1350-1354.

Kraakman, M.J., Kammoun, H.L., Allen, T.L., Deswaerte, V., Henstridge, D.C., Estevez, E., Matthews, V.B., Neill, B., White, D.A., Murphy, A.J., et al. (2015). Blocking IL-6 trans-signaling prevents high-fat dietinduced adipose tissue macrophage recruitment but does not improve insulin resistance. Cell Metab. 21, 403-416.

Kroy, D.C., Beraza, N., Tschaharganeh, D.F., Sander, L.E., Erschfeld, S., Giebeler, A., Liedtke, C., Wasmuth, H.E., Trautwein, C., and Streetz, K.L. (2010). Lack of interleukin-6/glycoprotein 130/signal transducers and activators of transcription-3 signaling in hepatocytes predisposes to liver steatosis and injury in mice. Hepatology 51, 463-473.

Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M., and Salzberg, S.L. (2009). Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome. Genome Biol. 10, R25.

Liao, Y., Smyth, G.K., and Shi, W. (2014). featurecounts: an efficient general purpose program for assigning sequence reads to genomic features. Bioinformatics 30, 923-930.

Maeshima, K., Takahashi, T., Nakahira, K., Shimizu, H., Fujii, H., Katayama, H., Yokoyama, M., Morita, K., Akagi, R., and Sassa, S. (2004). A protective role of interleukin 11 on hepatic injury in acute endotoxemia. Shock 21, 134-138.

Matthews, V.B., Allen, T.L., Risis, S., Chan, M.H.S., Henstridge, D.C., Watson, N., Zaffino, L.A., Babb, J.R., Boon, J., Meikle, P.J., et al. (2010). lnterleukin-6-deficient mice develop hepatic inflammation and systemic insulin resistance. Diabetologia 53, 2431-2441.

Ng, B., Dong, J., D’Agostino, G., Viswanathan, S., Widjaja, A.A., Lim, W.-W., Ko, N.S.J., Tan, J., Chothani, S.P., Huang, B., et al. (2019). Interleukin-11 is a therapeutic target in idiopathic pulmonary fibrosis. Sci. Transl. Med. 11.

- 80 050147

Ng, В., Dong, J., Viswanathan, S., Widjaja, A.A., Paleja, B.S., Adami, E., Ko, N.S.J., Wang, M., Lim, S., Tan, J., et al. Fibroblast-specific IL11 signaling is required for lung fibrosis and inflammation.

Nishina, T., Komazawa-Sakon, S., Yanaka, S., Piao, X., Zheng, D.-M., Piao, J.-H., Kojima, Y., Yamashina, S., Sano, E., Putoczki, T., et al. (2012). Interleukin-11 links oxidative stress and compensatory proliferation. Sci. Signal. 5, ra5.

Sanyal, A.J. (2019). Past, present and future perspectives in nonalcoholic fatty liver disease. Nat. Rev. Gastroenterol. Hepatol. 16, 377-386.

Schafer, S., Viswanathan, S., Widjaja, A.A., Lim, W.-W., Mo re no-Mora I, A., DeLaughter, D.M., Ng, B., Patone, G., Chow, K., Khin, E., et al. (2017). IL-11 is a crucial determinant of cardiovascular fibrosis. Nature 552, 110-115.

Schafer, S., Viswanathan, S., Widjaja, A.A., Lim, W.-W., Moreno-Moral, A., DeLaughter, D.M., Ng, B., Patone, G., Chow, K., Khin, E., et al. (2017). IL-11 is a crucial determinant of cardiovascular fibrosis. Nature 552, 110-115.

Schmidt-Arras, D., and Rose-John, S. (2016). IL-6 pathway in the liver: From physiopathology to therapy. J. Hepatol. 64, 1403-1415.

Stephenson, K., Kennedy, L., Hargrove, L., Demieville, J., Thomson, J., Alpini, G., and Francis, H. (2018). Updates on Dietary Models of Nonalcoholic Fatty Liver Disease: Current Studies and Insights. Gene Expr. 18, 5-17.

The RNAcentral Consortium (2017). RNAcentral: a comprehensive database of non-coding RNA sequences. Nucleic Acids Res. 45, D128-D134.

Trepicchio, W.L., Bozza, M., Bouchard, P., and Dorner, A.J. (2001). Protective effect of rhlL-11 in a murine model of acetaminophen-induced hepatotoxicity. Toxicol. Pathol. 29, 242-249.

Widjaja, A.A., Dong, J., Adami, E., Viswanathan, S., Ng, B., Singh, B.K., Lim, W.W., Zhou, J., Pakkiri, L.S., Shekeran, S.G., et al. Redefining Interleukin 11 as a regeneration-limiting hepatotoxin.

Widjaja, A.A., Singh, B.K., Adami, E., Viswanathan, S., Dong, J., D’Agostino, G.A., Ng, B., Lim, W.W., Tan, J., Paleja, B.S., et al. (2019). Inhibiting Interleukin 11 Signaling Reduces Hepatocyte Death and Liver Fibrosis, Inflammation, and Steatosis in Mouse Models of Non-Alcoholic Steatohepatitis. Gastroenterology.

Wieckowska, A., Papouchado, B.G., Li, 2., Lopez, R., Zein, N.N., and Feldstein, A.E. (2008). Increased hepatic and circulating interleukin-6 levels in human nonalcoholic steatohepatitis. Am. J. Gastroenterol. 103, 1372-1379.

Wuestefeld, T., Klein, C., Streetz, K.L., Betz, U., Lauber, J., Buer, J., Manns, M.P., Muller, W., and Trautwein, C. (2003). lnterleukin-6/glycoprotein 130-dependent pathways are protective during liver regeneration. J. Biol. Chern. 278, 11281-11288.

Yamaguchi, K., Itoh, Y., Yokomizo, C., Nishimura, T., Niimi, T., Fujii, H., Okanoue, T., and Yoshikawa, T. (2010). Blockade of interleukin-6 signaling enhances hepatic steatosis but improves liver injury in methionine choline-deficient diet-fed mice. Lab. Invest. 90, 1169-1178.

Yu, J., Feng, Z., Tan, L., Pu, L., and Kong, L. (2016). Interleukin-11 protects mouse liver from warm ischemia/reperfusion (Wl/Rp) injury. Clin. Res. Hepatol. Gastroenterol. 40, 562-570.

Zhu, M„ Lu, B„ Cao, Q„ Wu, Z„ Xu, Z„ Li, W„ Yao, X., and Liu, F. (2015). IL-11 Attenuates Liver Ischemia/Reperfusion Injury (IRI) through STAT3 Signaling Pathway in Mice. PLoS One 10, e0126296.

Пример 6: анализ фиброзно-воспалительных механизмов при панкреатите.

Хронический панкреатит - это этиологически гетерогенный фиброзно-воспалительный синдром, который приводит к экзокринной и эндокринной недостаточности поджелудочной железы.

Звездчатые клетки поджелудочной железы (PSC) существуют в двух состояниях и являются преобладающим типом фиброгенных клеток, участвующих в повреждении поджелудочной железы. PSC входят в состав более широкой сети клеток, запасающих ретиноиды, в организме, включая клетки в паренхиме печени (HSC). Недавно показано, что ИЛ-11 играет ключевую роль при трансформации HSC, определяющем патологическом явлении при НАСГ (Widjaja et al., Gastroenterology (2019) 157(3): 777-792).

Анализ секвенирования РНК в единичных клетках (scRNA-seq) ткани поджелудочной железы Mus musculus (по данным Tabula muris Consortium - Schaum et al., Nature (2018) 562: 367-372) показал, что PSC (и клетки протока) демонстрируют высокую экспрессию ll11ra1, но не 116ra - см. фиг. 47А. Этот результат подтвержден на уровне белка иммунофлуоресцентным анализом PSC человека (фиг. 47В).

Показано, что активация PSC запускается обработкой ИЛ-11 in vitro и ингибируется обработкой антителом против ИЛ-URA, антагонистом сигнального пути, опосредованного ИЛ-11, независимо от сти

-

Claims (18)

1. мула для активации PSC (т.е. TGFei, ИЛ-11, bFGF, CTGF, PDGF или ЕТ-1) - см. фиг. 48А и 48В.

   У трансгенных мышей с индуцибельной фибробласт-специфичной экспрессией ИЛ-11 развивался фиброз поджелудочной железы - см. фиг. 49А-49С.

   В модели повреждения поджелудочной железы за счет перевязки протока поджелудочной железы (PDL) лечение антителом против ИЛ-11RA, антагонистом сигнального пути, опосредованного ИЛ-11, подавляло фиброз поджелудочной железы и ингибировало уменьшение количества ткани поджелудочной железы, ассоциированное с PDL - см. фиг. 50А-50С.

   ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

   1. Применение агента, способного ингибировать сигнальный путь, опосредованный интерлейкином 11 (ИЛ-11), при производстве лекарственного средства в способе лечения или профилактики метаболического заболевания, причем указанное метаболическое заболевание представляет собой или включает ожирение, диабет, диабет 2 типа (СД2), преддиабет, избыточную массу тела, метаболический синдром, гипергликемию, ассоциированную с беременностью, гипергликемию, гиперлипидемию, гипертриглицеридемию, гиперхолестеринемию, недостаточность поджелудочной железы, панкреатит, острый панкреатит, хронический панкреатит, стеатоз, липотоксичность, неалкогольный жировой гепатоз (NAFL), инсулинорезистентность или гиперглюкагонемию.
2. 2. Применение по п.1, отличающееся тем, что указанный агент представляет собой агент, способный предотвращать или снижать связывание интерлейкина 11 (ИЛ-11) с рецептором интерлейкина 11 (ИЛ-HR).
3. 3. Применение по п. 1 или 2, отличающееся тем, что агент способен связываться с интерлейкином 11 (ИЛ-11) или рецептором интерлейкина 11 (ИЛ-11R).
4. 4. Применение по любому из пп.1-3, отличающееся тем, что указанный агент выбран из группы, состоящей из антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, полипептида, пептида, нуклеиновой кислоты, олигонуклеотида, аптамера или низкомолекулярного соединения.
5. 5. Применение по п.4, отличающееся тем, что указанный агент представляет собой антитело против ИЛ-11, являющееся антагонистом сигнального пути, опосредованного ИЛ-11, или его антигенсвязывающий фрагмент.
6. 6. Применение по п.4, отличающееся тем, что указанный агент представляет собой антитело против ИЛ-HRa, являющееся антагонистом сигнального пути, опосредованного ИЛ-11, или его антигенсвязывающий фрагмент.
7. 7. Применение по п.4, отличающееся тем, что указанный агент представляет собой рецепторловушку для ИЛ-11.
8. 8. Применение по п.7, отличающееся тем, что указанный рецептор-ловушка для ИЛ-11 содержит: (i) аминокислотную последовательность, соответствующую цитокин-связывающему модулю gp130, и (ii) аминокислотную последовательность, соответствующую цитокин-связывающему модулю ИЛ-HRa.
9. 9. Применение по п.3 или 4, отличающееся тем, что указанный агент представляет собой мутеин ИЛ-11, причем необязательно указанный мутеин ИЛ-11 представляет собой W147A.
10. 10. Применение по п.1, отличающееся тем, что указанный агент способен предотвращать или снижать экспрессию интерлейкина 11 (ИЛ-11) или рецептора интерлейкина 11 (ИЛ-11 R).
11. 11. Применение по п.10, отличающееся тем, что указанный агент представляет собой олигонуклеотид или низкомолекулярное соединение.
12. 12. Применение по п.11, отличающееся тем, что указанный агент представляет собой антисмысловой олигонуклеотид, способный предотвращать или снижать экспрессию ИЛ-11.
13. 13. Применение по п.12, отличающееся тем, что указанный антисмысловой олигонуклеотид, способный предотвращать или снижать экспрессию ИЛ-11, представляет собой миРНК, мишенью которой является ИЛ-11, содержащую последовательность SEQ ID NO: 12, 13, 14 или 15.
14. 14. Применение по п.13, отличающееся тем, что указанный агент представляет собой антисмысловой олигонуклеотид, способный предотвращать или снижать экспрессию ИЛ-11Ra.
15. 15. Применение по п.14, отличающееся тем, что указанный антисмысловой олигонуклеотид, способный предотвращать или снижать экспрессию ИЛ-HRa, представляет собой миРНК, мишенью которой является IL11RA, содержащую последовательность SEQ ID NO: 16, 17, 18 или 19.
16. 16. Применение по любому из пп.3-15, отличающееся тем, что указанный рецептор интерлейкина 11 представляет собой или содержит ИЛ-HRa.
17. 17. Применение по любому из пп.1-16, отличающееся тем, что способ лечения или профилактики метаболического заболевания включает введение указанного агента субъекту со стимуляцией экспрессии интерлейкина 11 (ИЛ-11) или рецептора ИЛ-11 (ИЛ-HR), причем необязательно способ включает введение указанного агента субъекту, у которого определено наличие стимуляции экспрессии интерлейкина 11 (ИЛ-11) или рецептора интерлейкина 11 (ИЛ-HR).
18. 18. Применение по любому из пп.1-17, отличающееся тем, что указанный способ лечения или профилактики метаболического заболевания включает определение наличия или отсутствия стимуляции

    -