HK1259019B

HK1259019B - 抗pd1抗体及使用方法

Info

Publication number: HK1259019B
Application number: HK19101507.3A
Authority: HK
Inventors: Stefan Seeber; Valeria Lifke; Jens Fischer; Barbara Weiser; Ildiko WUENSCHE; Oliver Ploettner; Adrian ZWICK; Guy Georges; Stefan DENGL; Viktor LEVITSKI; Christian Klein; Laura CODARRI DEAK; Sebastian Fenn; Joerg Benz
Original assignee: 豪夫迈．罗氏有限公司
Priority date: 2015-10-02
Filing date: 2016-09-29
Publication date: 2022-02-18

Description

抗PD1抗体及使用方法

发明领域

本发明涉及抗PD1抗体及其使用方法。

发明背景

PD-1

共刺激或对T细胞提供两种截然不同的信号是一种关于抗原呈递细胞(APC)对静息T淋巴细胞的淋巴细胞活化的广泛接受的模型(Lafferty et al.,Aust.J.Exp.Biol.Med.Sci 53:27-42(1975))。

此模型进一步提供了自身与非自身的辨别和免疫耐受(Bretscher et al.,Science 169:1042-1049(1970)；Bretscher,P.A.,Proc.Nat.Acad.Sci.USA 96:185-190(1999)；Jenkins et al.,J.Exp.Med.165:302-319(1987))。在主要组织相容性复合体(MHC)的背景中呈递的外来抗原肽的识别后，第一信号或抗原特异性信号经由T细胞受体(TCR)转导。第二或共刺激信号通过抗原呈递细胞(APC)上表达的共刺激分子投递至T细胞，诱导T细胞以促进克隆扩充，细胞因子分泌和效应器功能(Lenschow et al.,Ann.Rev.Immunol.14:233(1996))。在共刺激缺失下，T细胞能对抗原刺激变得不应，不发起有效的免疫应答，并且进一步可以导致对外来抗原的耐受或耗竭。

简单的两信号模型可能过度简化，因为TCR信号的强度实际上对T细胞活化和分化具有定量影响(Viola et al.,Science 273:104-106(1996)；Sloan-Lancaster,Nature363:156-159(1993))。而且，如果TCR信号强度高的话，T细胞活化甚至能在共刺激信号缺失下发生。更为重要的是，T细胞接受正和负第二共刺激信号两者。此类正和负信号的调节对于在维持免疫耐受性和防止自身免疫的同时使宿主的保护性免疫应答最大化是至关重要的。

负第二信号对于诱导T细胞耐受性似乎是必需的，而正信号促进T细胞活化。虽然简单的两信号模型仍然为未免疫淋巴细胞提供有效解释，但是宿主的免疫应答是一个动态过程，并且也可以对抗原暴露的T细胞提供共刺激信号。

共刺激的机制是治疗学方面感兴趣的，因为已经显示了共刺激信号的操作提供增强或终止基于细胞的免疫应答的手段。最近，已经发现了T细胞功能障碍或无反应性与抑制性受体(编程性死亡1多肽(PD-1))的诱导且持续的表达并行发生。因此，靶向PD-1的治疗剂是强烈感兴趣的领域。

蛋白质编程性死亡1(PD-1)是CD28受体家族的一个抑制性成员，该家族还包括CD28，CTLA-4，ICOS和BTLA。PD-1在活化的B细胞，T细胞，和髓样细胞上表达(Agata et al.,supra；Okazaki et al.(2002)Curr.Opin.Immunol.14:391779-82；Bennett et al.(2003)J Immunol 170:711-8)。该家族的初始成员CD28和ICOS是通过添加单克隆抗体后对提升T细胞增殖的功能性影响而发现的(Hutloff et al.(1999)Nature 397:263-266；Hansen etal.(1980)Immunogenics 10:247-260)。PD-1是经由筛选凋亡细胞中的差异表达而发现的(Ishida et al.(1992)EMBO J 11:3887-95)。该家族的其它成员CTLA-4和BTLA分别是经由筛选细胞毒性T淋巴细胞和THl细胞中的差异表达而发现的。CD28，ICOS和CTLA-4均具有一个不配对的半胱氨酸残基，容许同二聚化。与之对比，有人提出PD-1作为单体存在，缺少其它CD28家族成员特征性的不配对半胱氨酸残基。

PD-1基因是一种55kDa I型跨膜蛋白，是Ig基因超家族的一部分(Agata et al.(1996)bit Immunol 8:765-72)。PD-1含有近膜免疫受体酪氨酸抑制性基序(ITIM)和远膜基于酪氨酸的转换基序(ITSM)(Thomas,MX.(1995)J Exp A4edW,:1953-6；Vivier,E andDaeron,M(1997)Immunol Today 18:286-91)。虽然在结构上与CTLA-4相似，但是PD-1缺少对于B7-1和B7-2结合至关紧要的MYPPPY基序。已经鉴定出PD-1的两种配体，PD-Ll和PD-L2，已经显示它们在结合PD-1后下调T细胞活化(Freeman et al.(2000)J Exp Med 192:1027-34；Latchman et al.(2001)Nat Immunol 2:261-8；Carter et al.(2002)Eur J Immunol32:634-43)。PD-Ll和PD-L2均是B7同系物，结合PD-1，但是不结合其它CD28家族成员。PD-1的一种配体，PD-L1在多种人癌症中是丰富的(Dong et al.(2002)Nat.Med 8:787-9)。PD-1和PD-L1之间的相互作用导致肿瘤浸润性淋巴细胞减少，T细胞受体介导的增殖降低，和癌性细胞的免疫逃避(Dong et al.(2003)J.MoI.Med.81:281-7；Blank et al.(2005)CancerImmunol.Immunother.54:307-314；Konishi et al.(2004)Clin.Cancer Res.10:5094-100)。通过抑制PD-1与PD-L1的局部相互作用能逆转免疫遏制，而且该作用在同样阻断PD-1与PD-L2的相互作用时是加成的(Iwai et al.(2002)Proc.Nat 7.Acad.ScL USA 99:12293-7；Brown et al.(2003)J.Immunol.170:1257-66)。

PD1是在活化的B细胞，T细胞，和髓样细胞上表达的CD28家族的一个抑制性成员(Agata et al.,supra；Okazaki et al.(2002)Curr Opin Immunol 14:391779-82；Bennett et al.(2003)J Immunol YWJl 1-8)。PD-1缺陷动物形成各种自身免疫性表型，包括自身免疫性心肌病和带有关节炎和肾炎的狼疮样综合征(Nishimura et al.(1999)Immunity H:141-51；Nishimura et al.(2001)Science 291:319-22)。另外，已经发现PD1在自身免疫性脑脊髓炎，系统性红斑狼疮，移植物抗宿主病(GVHD)，I型糖尿病，和类风湿性关节炎中发挥作用(Salama et al.(2003)J Exp Med 198:71-78；Prokunina andAlarcon-Riquelme(2004)Hum Mol Genet 13_:R143；Nielsen et al.(2004)Lupus 11:510)。在一种鼠B细胞肿瘤系中，显示了PD1的ITSM对于阻断BCR介导的Ca2+流和下游效应器分子的酪氨酸磷酸化是必需的(Okazaki etal。(2001)PNAS 98:13866-71)。

多份专利申请披露了抗PD-1抗体的生成和/或用干扰PD-L1结合和/或PD-1信号传导的药剂(包括抗PD-1抗体)增强免疫应答的方法，包括下面的：US2003/0039653，US2004/0213795，US2006/0110383，US2007/0065427，US2007/0122378，US2012/237522，WO2004/072286，WO2006/121168，WO2006/133396，WO2007/005874，WO2008/083174，WO2008/156712，WO2009/024531，WO2009/014708，WO2009/114335，WO2010/027828，WO2010/027423，WO2010/036959，WO2010/029435，WO2010/029434，WO2010/063011，WO2010/089411，WO2011/066342，WO2011/110604，WO2011/110621，和WO2012/145493。

发明概述

本发明提供抗PD1抗体及其使用方法。

本发明的一个方面是这样一种抗PD1的抗体，其中该抗体：

i)与包含PD1-0103的VH和VL的抗PD1抗体竞争对PD-1的结合；和/或

ii)结合人和食蟹猴PD-1；和/或

iii)以10μg/ml的抗体浓度将异基因经刺激T细胞的干扰素伽马(IFNγ)分泌增强85％或更多；和/或

iv)以10μg/ml的抗体浓度将异基因经刺激T细胞的肿瘤坏死因子阿尔法(TNFα)分泌增强200％或更多。

本发明的另一个方面是结合人PD1的抗体，其中该抗体在混合淋巴细胞反应(MLR)测定法中以10μg/ml的抗体浓度将异基因经刺激T细胞的干扰素伽马(IFNγ)分泌增强85％或更多。

本发明的另一个方面是结合人PD1的抗体，其中该抗体在混合淋巴细胞反应(MLR)测定法中以10μg/ml的抗体浓度将异基因经刺激T细胞的肿瘤坏死因子阿尔法(TNFα)分泌增强200％或更多。

本发明提供一种分离的结合人PD1的抗体，其中该抗体包含

A)(a)包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列的HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO：3的氨基酸序列的HVR-H3；(d)包含SEQ ID NO：4的氨基酸序列的HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO：5的氨基酸序列的HVR-L2；和(f)包含SEQ ID NO：6的氨基酸序列的HVR-L3；或

B)(a)包含SEQ ID NO：9的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO：10的氨基酸序列的HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO：11的氨基酸序列的HVR-H3；(d)包含SEQ ID NO：12的氨基酸序列的HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO：13的氨基酸序列的HVR-L2；和(f)包含SEQ ID NO：14的氨基酸序列的HVR-L3；或

C)(a)包含SEQ ID NO：17的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO：18的氨基酸序列的HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO：19的氨基酸序列的HVR-H3；(d)包含SEQ ID NO：20的氨基酸序列的HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO：21的氨基酸序列的HVR-L2；和(f)包含SEQ ID NO：22的氨基酸序列的HVR-L3；或

D)(a)包含SEQ ID NO：25的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO：26的氨基酸序列的HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO：27的氨基酸序列的HVR-H3；(d)包含SEQ ID NO：28的氨基酸序列的HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO：29的氨基酸序列的HVR-L2；和(f)包含SEQ ID NO：30的氨基酸序列的HVR-L3；或

E)(a)包含SEQ ID NO：33的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO：34的氨基酸序列的HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO：35的氨基酸序列的HVR-H3；(d)包含SEQ ID NO：36的氨基酸序列的HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO：37的氨基酸序列的HVR-L2；和(f)包含SEQ ID NO：38的氨基酸序列的HVR-L3；或

F)(a)包含SEQ ID NO：41的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO：42的氨基酸序列的HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO：43的氨基酸序列的HVR-H3；(d)包含SEQ ID NO：44的氨基酸序列的HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO：45的氨基酸序列的HVR-L2；和(f)包含SEQ ID NO：46的氨基酸序列的HVR-L3；或

G)(a)包含SEQ ID NO：49的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO：50的氨基酸序列的HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO：51的氨基酸序列的HVR-H3；(d)包含SEQ ID NO：52的氨基酸序列的HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO：53的氨基酸序列的HVR-L2；和(f)包含SEQ ID NO：54的氨基酸序列的HVR-L3。

本发明进一步提供一种分离的结合人PD1的抗体，其中该抗体包含

A)(a)如下的VH域，该VH域包含(i)包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列的HVR-H1，(ii)包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列的HVR-H2，和(iii)包含选自SEQ ID NO：3的氨基酸序列的HVR-H3；和(b)如下的VL域，该VL域包含(i)包含SEQ ID NO：4的氨基酸序列的HVR-L1，(ii)包含SEQ ID NO：5的氨基酸序列的HVR-L2，和(iii)包含SEQ ID NO：6的氨基酸序列的HVR-L3；或

B)(a)如下的VH域，该VH域包含(i)包含SEQ ID NO：9的氨基酸序列的HVR-H1，(ii)包含SEQ ID NO：10的氨基酸序列的HVR-H2，和(iii)包含选自SEQ ID NO：11的氨基酸序列的HVR-H3；和(b)如下的VL域，该VL域包含(i)包含SEQ ID NO：12的氨基酸序列的HVR-L1，(ii)包含SEQ ID NO：13的氨基酸序列的HVR-L2，和(iii)包含SEQ ID NO：14的氨基酸序列的HVR-L3；或

C)(a)如下的VH域，该VH域包含(i)包含SEQ ID NO：17的氨基酸序列的HVR-H1，(ii)包含SEQ ID NO：18的氨基酸序列的HVR-H2，和(iii)包含选自SEQ ID NO：19的氨基酸序列的HVR-H3；和(b)如下的VL域，该VL域包含(i)包含SEQ ID NO：20的氨基酸序列的HVR-L1，(ii)包含SEQ ID NO：21的氨基酸序列的HVR-L2，和(iii)包含SEQ ID NO：22的氨基酸序列的HVR-L3；或

D)(a)如下的VH域，该VH域包含(i)包含SEQ ID NO：25的氨基酸序列的HVR-H1，(ii)包含SEQ ID NO：26的氨基酸序列的HVR-H2，和(iii)包含选自SEQ ID NO：27的氨基酸序列的HVR-H3；和(b)如下的VL域，该VL域包含(i)包含SEQ ID NO：28的氨基酸序列的HVR-L1，(ii)包含SEQ ID NO：29的氨基酸序列的HVR-L2，和(iii)包含SEQ ID NO：30的氨基酸序列的HVR-L3；或

E)(a)如下的VH域，该VH域包含(i)包含SEQ ID NO：33的氨基酸序列的HVR-H1，(ii)包含SEQ ID NO：34的氨基酸序列的HVR-H2，和(iii)包含选自SEQ ID NO：35的氨基酸序列的HVR-H3；和(b)如下的VL域，该VL域包含(i)包含SEQ ID NO：36的氨基酸序列的HVR-L1，(ii)包含SEQ ID NO：37的氨基酸序列的HVR-L2，和(iii)包含SEQ ID NO：38的氨基酸序列的HVR-L3；或

F)(a)如下的VH域，该VH域包含(i)包含SEQ ID NO：41的氨基酸序列的HVR-H1，(ii)包含SEQ ID NO：42的氨基酸序列的HVR-H2，和(iii)包含选自SEQ ID NO：43的氨基酸序列的HVR-H3；和(b)如下的VL域，该VL域包含(i)包含SEQ ID NO：44的氨基酸序列的HVR-L1，(ii)包含SEQ ID NO：45的氨基酸序列的HVR-L2，和(iii)包含SEQ ID NO：46的氨基酸序列的HVR-L3；或

G)(a)如下的VH域，该VH域包含(i)包含SEQ ID NO：49的氨基酸序列的HVR-H1，(ii)包含SEQ ID NO：50的氨基酸序列的HVR-H2，和(iii)包含选自SEQ ID NO：51的氨基酸序列的HVR-H3；和(b)如下的VL域，该VL域包含(i)包含SEQ ID NO：52的氨基酸序列的HVR-L1，(ii)包含SEQ ID NO：53的氨基酸序列的HVR-L2，和(iii)包含SEQ ID NO：54的氨基酸序列的HVR-L3。

A)

i)包含SEQ ID NO：7的VH序列和SEQ ID NO：8的VL序列；

ii)或i)下的抗体的VH和VL的人源化变体；

或B)

i)包含SEQ ID NO：57的VH序列和SEQ ID NO：58的VL序列；

ii)包含SEQ ID NO：57的VH序列和SEQ ID NO：59的VL序列；

iii)包含SEQ ID NO：57的VH序列和SEQ ID NO：60的VL序列；

iv)包含SEQ ID NO：57的VH序列和SEQ ID NO：61的VL序列；

或C)

i)包含SEQ ID NO：15的VH序列和SEQ ID NO：16的VL序列；

ii)或i)下的抗体的VH和VL的人源化变体；

或D)

i)包含SEQ ID NO：23的VH序列和SEQ ID NO：24的VL序列；

ii)或i)下的抗体的VH和VL的人源化变体；

或E)

i)包含SEQ ID NO：31的VH序列和SEQ ID NO：32的VL序列；

ii)或i)下的抗体的VH和VL的人源化变体；

或F)

i)包含SEQ ID NO：39的VH序列和SEQ ID NO：40的VL序列；

ii)或i)下的抗体的VH和VL的人源化变体；

或G)

i)包含SEQ ID NO：47的VH序列和SEQ ID NO：48的VL序列；

ii)或i)下的抗体的VH和VL的人源化变体；

或H)

i)包含SEQ ID NO：55的VH序列和SEQ ID NO：56的VL序列；

ii)或i)下的抗体的VH和VL的人源化变体。

在一个实施方案中，依照本发明的抗PD1抗体为单克隆抗体。

在一个实施方案中，依照本发明的抗PD1抗体为人，人源化，或嵌合抗体。

在一个实施方案中，依照本发明的抗PD1抗体为结合PD1的抗体片段。

在一个实施方案中，依照本发明的抗PD1抗体为Fab片段。

本发明提供一种分离的核酸，其编码依照前述实施方案任一项的抗体。

本发明提供一种宿主细胞，其包含此类核酸。

本发明提供一种生成抗体的方法，其包括培养该宿主细胞，使得该抗体生成。

本发明提供此类生成抗体的方法，其进一步包括自该宿主细胞回收该抗体。

本发明提供一种药物配制剂，其包含本文中描述的抗体和药学可接受载剂。

本发明提供本文中描述的抗体，其用作药物。

本发明提供本文中描述的抗体，其用于治疗癌症。

本发明提供本文中描述的抗体在制造药物中的用途。在一个实施方案中，该药物用于治疗癌症。

本发明提供一种治疗具有癌症的个体的方法，其包括对该个体施用有效量的本文中描述的抗体。

附图简述

图1：用嵌合PD1-0103阻断PD1强烈增强异基因的经刺激的原代人T细胞的IFNγ分泌。

图2：用嵌合PD1-0103阻断PD1强烈提高异基因的经刺激的原代人T细胞的干扰素γ(IFN-g)分泌。

图3：用嵌合PD1-0103阻断PD1强烈提高异基因的经刺激的原代人T细胞的肿瘤坏死因子α(TNF)分泌。

图4：4A)生成粒酶B的CD4 T细胞的频率；4B)在渐增浓度的不同抗PD-1抗体存在下MLR上清液中通过吸光度(光密度，O.D.)检测的IFN-γ的量。

图5：5A)在不同抗PD-1抗体存在下PD1/PD-L1阻断对受到遏制的T细胞受体信号的活化的影响；5B)在不同抗PD-1抗体存在下PD1/PD-L1阻断对受到遏制的T细胞受体信号传导的再活化的影响。

图6：与PD1-0103的Fab复合的PD1-ECD的结构。

图7：PD1-ECD与Fab PD1-0103的复合物的结构：PD1上的ASN58处的糖基化参与相互作用。

图8：PD1-ECD与Fab PD1-0103的复合物的结构：表位/互补位的视图。

图9：接触Asn58处的PD1核心糖侧链–Fab PD1-0103重链：接触通过的距离截留来鉴定。

图10：PD1-ECD中与抗体相互作用的残基-序列视图及详细接触特性–PD-1。

图11：抗体中与PD1-ECD相互作用的残基-序列视图及详细接触特性–重链。

图12：抗体中与PD1-ECD相互作用的残基-序列视图及详细接触特性–轻链。

图13A：不同抗体对在Asn58处无糖基化的PD1(左)和对在Asn58处糖基化的PD1(右)的结合(Biacore传感图)。

图13B：不同抗体对在Asn58处无糖基化的PD1和对在Asn58处糖基化的PD1的结合-通过Biacore测定的单抗的结合-解离速率。

图14A：与双特异性CEA-CD3抗体组合，PD1-0103-0312(aPD-1)与纳武单抗相比的体内肿瘤生长抑制–高剂量。

图14B：与双特异性CEA-CD3抗体组合，PD1-0103-0312(aPD-1)与纳武单抗相比的体内肿瘤生长抑制–高剂量。

发明详述

出于本文中的目的，“受体人框架”指包含自人免疫球蛋白框架或如下文定义的人共有框架衍生的轻链可变域(VL)框架或重链可变域(VH)框架的氨基酸序列的框架。自人免疫球蛋白框架或人共有框架“衍生”的受体人框架可以包含其相同的氨基酸序列，或者它可以含有氨基酸序列变化。在一些实施方案中，氨基酸变化的数目是10或更少，9或更少，8或更少，7或更少，6或更少，5或更少，4或更少，3或更少，或2或更少。在一些实施方案中，VL受体人框架与VL人免疫球蛋白框架序列或人共有框架序列在序列上相同。

在本文中使用时，术语“PD1”，“人PD1”，“PD-1”或“人PD-1”指人蛋白质PD1(SEQ IDNO：68)(无信号序列的蛋白质)/(SEQ ID NO：70)(有信号序列的蛋白质)。如本文中使用的，“结合人PD1”，“特异性结合人PD1”的抗体或“抗PD1抗体”指以K_D值为1.0x10^-8mol/l或更低，在一个实施方案中，K_D值为1.0x10^-9mol/l或更低，在一个实施方案中，K_D值为1.0x10^-9mol/l至1.0x10^-13mol/l的结合亲和力特异性结合人PD1抗原或其胞外域(ECD)的抗体。结合亲和力是用标准结合测定法，诸如表面等离振子共振技术(GE-HealthcareUppsala，Sweden)例如使用PD1胞外域测定的。

人PD1在SEQ ID NO：70的PD-1残基49，58，74处具有N连接的糖基化位点(参见例如D.Y.Lin et al,PNAS 105(2008)3011-3016)。PD-1的位置Asn58处的核心糖链(N连接的糖基化)树就单糖而言具有下面的结构。在一个实施方案中，PD1的Asn58处的核心糖链指在Asn58处附着于PD1的头5个糖(单糖)。

Asn58-N-GlcNAc(FUC)–GlcNAc–BMA–MAN(见图9)，其中使用下面的缩写。

[GlcNAc]＝NGA＝N-乙酰基-β-D-半乳糖胺＝2-(乙酰基氨基)-2-脱氧-β-D-半乳吡喃糖

[FUC]＝α-L-岩藻糖

[BMA]＝β-D-甘露吡喃糖

[MAN]＝α-D-甘露吡喃糖

该糖链中的第一个GlcNAC是岩藻糖基化的，缩写为GlcNAc(FUC)。

在一个实施方案中，PD1的Asn58处的核心糖链指在Asn58处附着于PD1的头5个糖(单糖)GlcNAc，FUC，GlcNAc，BMA，MAN。

本文中的术语“抗体”以最广义使用，并且涵盖各种抗体结构，包括但不限于单克隆抗体，多克隆抗体，多特异性抗体(例如双特异性抗体)，和抗体片段，只要它们展现出期望的抗原结合活性。

“抗体片段”指与完整抗体不同的分子，其包含完整抗体中与完整抗体结合的抗原结合的部分。抗体片段的例子包括但不限于Fv，Fab，Fab’，Fab’-SH，F(ab’)₂；双抗体；线性抗体；单链抗体分子(例如scFv)；和自抗体片段形成的多特异性抗体。

与参照抗体“结合相同表位的抗体”指在竞争测定法中将参照抗体对其抗原的结合阻断50％或更多的抗体，且相反，参照抗体在竞争测定法中将该抗体对其抗原的结合阻断50％或更多。本文中提供了一种例示性竞争测定法。

术语“嵌合”抗体指其中的重和/或轻链的一部分自特定来源或物种衍生，而重和/或轻链的剩余部分自不同来源或物种衍生的抗体。

抗体的“类”指其重链拥有的恒定域或恒定区的类型。抗体有5大类：IgA，IgD，IgE，IgG，和IgM，并且这些中的几种可以进一步分成亚类(同种型)，例如，IgG₁，IgG₂，IgG₃，IgG₄，IgA₁，和IgA₂。与不同类免疫球蛋白对应的重链恒定域分别称作α，δ，ε，γ，和μ。

如本文中使用的，术语“细胞毒剂”指抑制或阻止细胞功能和/或引起细胞死亡或破坏的物质。细胞毒剂包括但不限于放射性同位素(例如At²¹¹，I¹³¹，I¹²⁵，Y⁹⁰，Re¹⁸⁶，Re¹⁸⁸，Sm¹⁵³，Bi²¹²，P³²，Pb²¹²和Lu的放射性同位素)；化疗剂或化疗药物(例如甲氨蝶呤(methotrexate)，阿霉素(adriamicin)，长春花生物碱类(vinca alkaloids)(长春新碱(vincristine)，长春碱(vinblastine)，依托泊苷(etoposide))，多柔比星(doxorubicin)，美法仑(melphalan)，丝裂霉素(mitomycin)C，苯丁酸氮芥(chlorambucil)，柔红霉素(daunorubicin)或其它嵌入剂)；生长抑制剂；酶及其片段，诸如溶核酶；抗生素；毒素，诸如小分子毒素或者细菌，真菌，植物或动物起源的酶活性毒素，包括其片段和/或变体；及下文公开的各种抗肿瘤或抗癌剂。

药剂(例如药物配制剂)的“有效量”指在必需的剂量和时段上有效实现期望的治疗或预防结果的量。

本文中的术语“Fc区”用于定义免疫球蛋白重链中至少含有恒定区一部分的C端区域。该术语包括天然序列Fc区和变体Fc区。在一个实施方案中，人IgG重链Fc区自Cys226，或自Pro230延伸至重链的羧基端。然而，Fc区的C端赖氨酸(Lys447)可以存在或不存在。除非本文中另有规定，Fc区或恒定区中的氨基酸残基的编号方式依照EU编号系统，又称作EU索引，如记载于Kabat,E.A.et al.,Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th ed.,Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991)NIH Publication 91-3242。

“框架”或“FR”指除高变区(HVR)残基外的可变域残基。一般地，可变域的FR由4个FR域组成：FR1，FR2，FR3，和FR4。因而，HVR和FR序列在VH(或VL)中一般以如下顺序出现：FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4。

术语“全长抗体”，“完整抗体”，和“全抗体”在本文中可互换使用，指与天然抗体结构具有基本上类似的结构或者具有含有本文中定义的Fc区的重链的抗体。

术语“宿主细胞”，“宿主细胞系”，和“宿主细胞培养物”可互换使用，并且指已经导入有外源核酸的细胞，包括此类细胞的后代。宿主细胞包括“转化体”和“经转化的细胞”，其包括原代的经转化的细胞及自其衍生的后代而不考虑传代的次数。后代在核酸内容物上可以与亲本细胞不完全相同，而是可以含有突变。本文中包括具有与在初始转化细胞中筛选或选择的功能或生物学活性相同的功能或生物学活性的突变体后代。

“人抗体”指拥有与由人或人细胞生成的或利用人抗体全集或其它人抗体编码序列自非人来源衍生的抗体的氨基酸序列对应的氨基酸序列的抗体。人抗体的此定义明确排除包含非人抗原结合残基的人源化抗体。

“人共有框架”指代表人免疫球蛋白VL或VH框架序列选集中最常存在的氨基酸残基的框架。通常，人免疫球蛋白VL或VH序列选集来自可变域序列亚组。通常，序列亚组是如Kabat,E.A.et al.,Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th ed.,Bethesda MD(1991),NIH Publication 91-3242,Vols.1-3中的亚组。在一个实施方案中，对于VL，亚组是如Kabat等，见上文中的亚组卡帕I。在一个实施方案中，对于VH，亚组是如Kabat等，见上文中的亚组III。

“人源化”抗体指包含来自非人HVR的氨基酸残基和来自人FR的氨基酸残基的嵌合抗体。在某些实施方案中，人源化抗体会包含至少一个，通常两个基本上整个可变域，其中所有或基本上所有HVR(例如CDR)对应于非人抗体的那些，且所有或基本上所有FR对应于人抗体的那些。任选地，人源化抗体可以至少包含自人抗体衍生的抗体恒定区的一部分。抗体(例如非人抗体)的“人源化形式”指已经经历人源化的抗体。

如本文中使用的，术语“高变区”或“HVR”指抗体可变域中在序列上高变的(“互补决定区”或“CDR”)和/或形成结构上定义的环的(“高变环”)和/或含有抗原接触残基的(“抗原接触”)每一个区域。一般地，抗体包含6个HVR；三个在VH中(H1，H2，H3)，且三个在VL中(L1，L2，L3)。本文中的例示性HVR包括：

(a)高变环，其存在于氨基酸残基26-32(L1)，50-52(L2)，91-96(L3)，26-32(H1)，53-55(H2)，和96-101(H3)(Chothia and Lesk,J.Mol.Biol.196:901-917(1987))；

(b)CDR，其存在于氨基酸残基24-34(L1)，50-56(L2)，89-97(L3)，31-35b(H1)，50-65(H2)，和95-102(H3)(Kabat et al.,Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest,5th Ed.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991))；

(c)抗原接触，其存在于氨基酸残基27c-36(L1)，46-55(L2)，89-96(L3)，30-35b(H1)，47-58(H2)，和93-101(H3)(MacCallum et al.J.Mol.Biol.262:732-745(1996))；和

(d)(a)，(b)，和/或(c)的组合，包括HVR氨基酸残基46-56(L2)，47-56(L2)，48-56(L2)，49-56(L2)，26-35(H1)，26-35b(H1)，49-65(H2)，93-102(H3)，和94-102(H3)。

除非另有指示，可变域中的HVR残基和其它残基(例如FR残基)在本文中依照Kabat等，见上文编号。

“免疫缀合物”指与一种或多种异源分子(包括但不限于细胞毒剂)缀合的抗体。

“个体”或“受试者”指哺乳动物。哺乳动物包括但不限于驯养的动物(例如牛，绵羊，猫，犬，和马)，灵长类(例如人和非人灵长类，诸如猴)，家兔，和啮齿类(例如小鼠和大鼠)。在某些实施方案中，个体或受试者指人。

“分离的”抗体指已经与其天然环境的成分分开的抗体。在一些实施方案中，抗体纯化至大于95％或99％的纯度，如通过例如电泳(例如SDS-PAGE，等电聚焦(IEF)，毛细管电泳)或层析(例如离子交换或反相HPLC)测定的。关于用于评估抗体纯度的方法的综述参见例如Flatman,S.et al.,J.Chromatogr.B 848:79-87(2007)。

“分离的”核酸指已经与其天然环境的成分分开的核酸分子。分离的核酸包括通常含有核酸分子的细胞中含有的核酸分子，但是核酸分子在染色体外或在与其天然染色体位置不同的染色体位置处存在。

“编码抗PD1抗体的分离的核酸”指编码抗体重和轻链(或其片段)的一种或多种核酸分子，包括单一载体或分开的载体中的此类核酸分子，和存在于宿主细胞中的一个或多个位置的此类核酸分子。

如本文中使用的，术语“单克隆抗体”指从一群基本上同质的抗体获得的抗体，即构成群体的各个抗体是相同的和/或结合相同表位，除了例如含有天然存在的突变或在单克隆抗体制备物的生成期间发生的可能的变体抗体外，此类变体一般以极小量存在。与通常包含针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制备物不同，单克隆抗体制备物的每个单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。如此，修饰语“单克隆”指示抗体自一群基本上同质的抗体获得的特征，而不应解释为要求通过任何特定方法来生成抗体。例如，可以通过多种技术来生成要依照本发明使用的单克隆抗体，包括但不限于杂交瘤方法，重组DNA方法，噬菌体展示方法，和利用含有整个或部分人免疫球蛋白基因座的转基因动物的方法，本文中描述了用于生成单克隆抗体的此类方法和其它例示性方法。

“裸抗体”指未与异源模块(例如细胞毒性模块)或放射性标记物缀合的抗体。裸抗体可以存在于药物配制剂中(包括如果现有技术有的话免疫缀合物)。

“天然抗体”指具有不同结构的天然存在的免疫球蛋白分子。例如，天然IgG抗体是约150,000道尔顿的异四聚糖蛋白，由二硫键合的两条相同轻链和两条相同重链构成。从N至C端，每条重链具有一个可变区(VH)，又称作可变重域或重链可变域，接着是三个恒定域(CH1，CH2，和CH3)。类似地，从N至C端，每条轻链具有一个可变区(VL)，又称作可变轻域或轻链可变域，接着是一个恒定轻(CL)域。根据其恒定域氨基酸序列，抗体轻链可归入两种型中的一种，称作卡帕(κ)和拉姆达(λ)。

术语“包装插页”用于指治疗产品的商业包装中通常包含的用法说明书，其含有关于涉及此类治疗产品应用的适应症，用法，剂量，施用，联合疗法，禁忌症和/或警告的信息。

关于参照多肽序列的“百分比(％)氨基酸序列同一性”定义为比对序列并在必要时引入缺口以实现最大百分比序列同一性后，且不将任何保守替代视为序列同一性的一部分时，候选序列中与参照多肽序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分率。为测定百分比氨基酸序列同一性目的的对比可以以本领域技术范围内的多种方式实现，例如使用公众可得到的计算机软件，诸如BLAST，BLAST-2，ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。本领域技术人员能决定用于比对序列的适宜参数，包括对所比较序列全长实现最大对比需要的任何算法。然而，为了本发明的目的，％氨基酸序列同一性值是使用序列比较计算机程序ALIGN-2产生的。ALIGN-2序列比较计算机程序由Genentech公司编写，并且源代码已经连同用户文档一起提交给美国版权局(Washington D.C.，20559)，在那里其以美国版权注册号TXU510087注册。公众自Genentech公司(South San Francisco，California)可获得ALIGN-2程序，或者可以从源代码编译。ALIGN-2程序应当编译成在UNIX操作系统(包括数码UNIXV4.0D)上使用。所有序列比较参数由ALIGN-2程序设定且不变。

在采用ALIGN-2来比较氨基酸序列的情况中，给定氨基酸序列A相对于(to)，与(with)，或针对(against)给定氨基酸序列B的％氨基酸序列同一性(或者可表述为具有或包含相对于，与，或针对给定氨基酸序列B的某一％氨基酸序列同一性的给定氨基酸序列A)如下计算：

分数X/Y乘100

其中X是由序列比对程序ALIGN-2在该程序的A和B比对中评分为相同匹配的氨基酸残基的数目，且其中Y是B中的氨基酸残基的总数。应当领会，在氨基酸序列A的长度与氨基酸序列B的长度不相等的情况下，A相对于B的％氨基酸序列同一性会不等于B相对于A的％氨基酸序列同一性。除非另有明确说明，本文中使用的所有％氨基酸序列同一性值都是依照上一段所述，使用ALIGN-2计算机程序获得的。

术语“药物配制剂”指所处形式使得允许其中含有的活性组分的生物学活性是有效的，且不含对会接受配制剂施用的受试者具有不可接受的毒性的别的成分的制剂。

“药学可接受载剂”指药物配制剂中与活性成分不同，且对受试者无毒的组分。药学可接受载剂包括但不限于缓冲剂，赋形剂，稳定剂，或防腐剂。

如本文中使用的，“治疗/处理”(及其语法变型)指试图改变所治疗个体的天然过程的临床干预，并且可以为了预防或者在临床病理学的过程期间实施。期望的治疗效果包括但不限于预防疾病的发生或再发生，减轻症状，减轻/减少疾病的任何直接或间接病理后果，预防转移，降低疾病进展速率，改善或减轻疾病状态，和消退或改善的预后。在一些实施方案中，使用本发明的抗体来延迟疾病的形成或减缓疾病的进展。

术语“可变区”或“可变域”指抗体重或轻链中牵涉抗体结合抗原的域。天然抗体的重链和轻链可变域(分别为VH和VL)一般具有类似的结构，其中每一个域包含4个保守的框架区(FR)和3个高变区(HVR)(参见例如Kindt,T.J.et al.,Kuby Immunology,6th ed.,W.H.Freeman and Co.,N.Y.(2007),page91)。单个VH或VL域可能足以赋予抗原结合特异性。此外，可以分别使用来自结合抗原的抗体的VH或VL域筛选互补VL或VH域的文库来分离结合特定抗原的抗体。参见例如Portolano,S.et al.,J.Immunol.150:880-887(1993)；Clarkson,T.et al.,Nature 352:624-628(1991))。

如本文中使用的，术语“载体”指能够增殖与其连接的另一种核酸的核酸分子。该术语包括作为自身复制型核酸结构的载体以及并入接受其导入的宿主细胞的基因组中的载体。某些载体能够指导与其可操作连接的核酸表达。此类载体在本文中称为“表达载体”。

I.组合物和方法

一方面，本发明部分基于下述发现，本发明的选定抗PD1抗体结合PD1的某些表位，而且有能力提高不同免疫细胞(例如T细胞，B细胞，NK细胞，树突细胞(DC)，单核细胞和巨噬细胞)的活化。例如，它们提高免疫调控性细胞因子(例如干扰素伽马和粒酶B)释放(分泌)。提高或能提高的其它免疫调控性细胞因子有例如肿瘤坏死因子阿尔法(TNFα)和IL-12分泌。如本文中使用的，术语干扰素伽马(IFNγ)，肿瘤坏死因子阿尔法(TNFα)，IL-12等指人细胞因子。

在某些实施方案中，提供了结合PD1的抗体。本发明的抗体对于例如癌症的诊断或治疗是有用的。

A.例示性抗PD1抗体

在一个方面，本发明提供分离的结合人PD1的抗体。

在某些实施方案中，提供了一种抗PD1抗体，其中该抗体：

i)与包含PD1-0103的VH和VL的抗PD1抗体竞争对PD-1的结合；和

ii)结合人和食蟹猴PD-1；和

iii)以10μg/ml的抗体浓度将异基因经刺激T细胞的干扰素伽马(IFNγ)分泌增强85％或更多(在一个优选的实施方案中，90％或更多，在一个优选的实施方案中，95％或更多)(其中无抗体时的分泌设为0％(IFNγ的基础水平)且有20EU/ml重组人IL-2时的分泌设为100％)(在依照实施例3的(异基因)混合淋巴细胞反应(MLR)测定法中)；和/或

iv)以10μg/ml的抗体浓度将异基因经刺激T细胞的肿瘤坏死因子阿尔法(TNFα)分泌增强200％或更多(在一个优选的实施方案，250％或更多)(其中无抗体时的分泌设为0％(TNFα的基础水平)且有20EU/ml重组人IL-2时的分泌设为100％)(在依照实施例3的(异基因)混合淋巴细胞反应(MLR)测定法中)。

在一个方面，本发明提供一种抗PD1抗体，其包含(a)包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列的HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO：3的氨基酸序列的HVR-H3；(d)包含SEQ ID NO：4的氨基酸序列的HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO：5的氨基酸序列的HVR-L2；和(f)包含SEQ ID NO：6的氨基酸序列的HVR-L3。

在另一个方面，本发明的抗体包含(a)如下的VH域，该VH域包含(i)包含SEQ IDNO：1的氨基酸序列的HVR-H1，(ii)包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列的HVR-H2，和(iii)包含选自SEQ ID NO：3的氨基酸序列的HVR-H3；和(b)如下的VL域，该VL域包含(i)包含SEQ IDNO：4的氨基酸序列的HVR-L1，(ii)包含SEQ ID NO：5的氨基酸序列的HVR-L2，和(iii)包含SEQ ID NO：6的氨基酸序列的HVR-L3。

在一个实施方案中，此类抗PD1抗体包含

i)包含SEQ ID NO：7的VH序列和SEQ ID NO：8的VL序列；

ii)i)下的抗体的VH和VL的人源化变体。

在一个实施方案中，此类抗PD1抗体包含

i)SEQ ID NO：57的VH序列和SEQ ID NO：58的VL序列，或

ii)SEQ ID NO：57的VH序列和SEQ ID NO：59的VL序列，或

iii)SEQ ID NO：57的VH序列和SEQ ID NO：60的VL序列，或

iv)SEQ ID NO：57的VH序列和SEQ ID NO：61的VL序列。

在一个实施方案中，此类抗PD1抗体包含SEQ ID NO：57的VH序列和SEQ ID NO：58的VL序列。

在一个实施方案中，此类抗PD1抗体包含SEQ ID NO：57的VH序列和SEQ ID NO：59的VL序列。

在一个实施方案中，此类抗PD1抗体包含SEQ ID NO：57的VH序列和SEQ ID NO：60的VL序列。

在一个实施方案中，此类抗PD1抗体包含SEQ ID NO：57的VH序列和SEQ ID NO：61的VL序列。

在一个方面，本发明提供一种抗PD1抗体，其包含至少一种，两种，三种，四种，五种，或六种选自下述的HVR：(a)包含SEQ ID NO：9的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ IDNO：10的氨基酸序列的HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO：11的氨基酸序列的HVR-H3；(d)包含SEQID NO：12的氨基酸序列的HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO：13的氨基酸序列的HVR-L2；和(f)包含SEQ ID NO：14的氨基酸序列的HVR-L3。

在一个方面，本发明提供一种抗PD1抗体，其包含(a)包含SEQ ID NO：9的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO：10的氨基酸序列的HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO：11的氨基酸序列的HVR-H3；(d)包含SEQ ID NO：12的氨基酸序列的HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO：13的氨基酸序列的HVR-L2；和(f)包含SEQ ID NO：14的氨基酸序列的HVR-L3。

在另一个方面，本发明的抗体包含(a)如下的VH域，该VH域包含至少一种，至少两种，或所有三种选自下述的VH HVR序列：(i)包含SEQ ID NO：9的氨基酸序列的HVR-H1，(ii)包含SEQ ID NO：10的氨基酸序列的HVR-H2，和(iii)包含选自SEQ ID NO：11的氨基酸序列的HVR-H3；和(b)如下的VL域，该VL域包含至少一种，至少两种，或所有三种选自下述的VLHVR序列：(i)包含SEQ ID NO：12的氨基酸序列的HVR-L1，(ii)包含SEQ ID NO：13的氨基酸序列的HVR-L2，和(c)包含SEQ ID NO：14的氨基酸序列的HVR-L3。

在另一个方面，本发明的抗体包含(a)如下的VH域，该VH域包含(i)包含SEQ IDNO：9的氨基酸序列的HVR-H1，(ii)包含SEQ ID NO：10的氨基酸序列的HVR-H2，和(iii)包含选自SEQ ID NO：11的氨基酸序列的HVR-H3；和(b)如下的VL域，该VL域包含(i)包含SEQ IDNO：12的氨基酸序列的HVR-L1，(ii)包含SEQ ID NO：13的氨基酸序列的HVR-L2，和(iii)包含SEQ ID NO：14的氨基酸序列的HVR-L3。

在一个实施方案中，此类抗PD1抗体包含

i)包含SEQ ID NO：15的VH序列和SEQ ID NO：16的VL序列；

ii)i)下的抗体的VH和VL的人源化变体。

在一个方面，本发明提供一种抗PD1抗体，其包含至少一种，两种，三种，四种，五种，或六种选自下述的HVR：(a)包含SEQ ID NO：17的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ IDNO：18的氨基酸序列的HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO：19的氨基酸序列的HVR-H3；(d)包含SEQID NO：20的氨基酸序列的HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO：21的氨基酸序列的HVR-L2；和(f)包含SEQ ID NO：22的氨基酸序列的HVR-L3。

在一个方面，本发明提供一种抗PD1抗体，其包含(a)包含SEQ ID NO：17的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO：18的氨基酸序列的HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO：19的氨基酸序列的HVR-H3；(d)包含SEQ ID NO：20的氨基酸序列的HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO：21的氨基酸序列的HVR-L2；和(f)包含SEQ ID NO：22的氨基酸序列的HVR-L3。

在另一个方面，本发明的抗体包含(a)如下的VH域，该VH域包含至少一种，至少两种，或所有三种选自下述的VH HVR序列：(i)包含SEQ ID NO：17的氨基酸序列的HVR-H1，(ii)包含SEQ ID NO：18的氨基酸序列的HVR-H2，和(iii)包含选自SEQ ID NO：19的氨基酸序列的HVR-H3；和(b)如下的VL域，该VL域包含至少一种，至少两种，或所有三种选自下述的VL HVR序列：(i)包含SEQ ID NO：20的氨基酸序列的HVR-L1，(ii)包含SEQ ID NO：21的氨基酸序列的HVR-L2，和(c)包含SEQ ID NO：22的氨基酸序列的HVR-L3。

在另一个方面，本发明的抗体包含(a)如下的VH域，该VH域包含(i)包含SEQ IDNO：17的氨基酸序列的HVR-H1，(ii)包含SEQ ID NO：18的氨基酸序列的HVR-H2，和(iii)包含选自SEQ ID NO：19的氨基酸序列的HVR-H3；和(b)如下的VL域，该VL域包含(i)包含SEQID NO：20的氨基酸序列的HVR-L1，(ii)包含SEQ ID NO：21的氨基酸序列的HVR-L2，和(iii)包含SEQ ID NO：22的氨基酸序列的HVR-L3。

在一个实施方案中，此类抗PD1抗体包含

i)包含SEQ ID NO：23的VH序列和SEQ ID NO：24的VL序列；

ii)i)下的抗体的VH和VL的人源化变体。

在一个方面，本发明提供一种抗PD1抗体，其包含至少一种，两种，三种，四种，五种，或六种选自下述的HVR：(a)包含SEQ ID NO：25的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ IDNO：26的氨基酸序列的HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO：27的氨基酸序列的HVR-H3；(d)包含SEQID NO：28的氨基酸序列的HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO：29的氨基酸序列的HVR-L2；和(f)包含SEQ ID NO：30的氨基酸序列的HVR-L3。

在一个方面，本发明提供一种抗PD1抗体，其包含(a)包含SEQ ID NO：25的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO：26的氨基酸序列的HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO：27的氨基酸序列的HVR-H3；(d)包含SEQ ID NO：28的氨基酸序列的HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO：29的氨基酸序列的HVR-L2；和(f)包含SEQ ID NO：30的氨基酸序列的HVR-L3。

在另一个方面，本发明的抗体包含(a)如下的VH域，该VH域包含至少一种，至少两种，或所有三种选自下述的VH HVR序列：(i)包含SEQ ID NO：25的氨基酸序列的HVR-H1，(ii)包含SEQ ID NO：26的氨基酸序列的HVR-H2，和(iii)包含选自SEQ ID NO：27的氨基酸序列的HVR-H3；和(b)如下的VL域，该VL域包含至少一种，至少两种，或所有三种选自下述的VL HVR序列：(i)包含SEQ ID NO：28的氨基酸序列的HVR-L1，(ii)包含SEQ ID NO：29的氨基酸序列的HVR-L2，和(c)包含SEQ ID NO：30的氨基酸序列的HVR-L3。

在另一个方面，本发明的抗体包含(a)如下的VH域，该VH域包含(i)包含SEQ IDNO：25的氨基酸序列的HVR-H1，(ii)包含SEQ ID NO：26的氨基酸序列的HVR-H2，和(iii)包含选自SEQ ID NO：27的氨基酸序列的HVR-H3；和(b)如下的VL域，该VL域包含(i)包含SEQID NO：28的氨基酸序列的HVR-L1，(ii)包含SEQ ID NO：29的氨基酸序列的HVR-L2，和(iii)包含SEQ ID NO：30的氨基酸序列的HVR-L3。

在一个实施方案中，此类抗PD1抗体包含

i)包含SEQ ID NO：31的VH序列和SEQ ID NO：32的VL序列；或

ii)i)下的抗体的VH和VL的人源化变体。

在一个方面，本发明提供一种抗PD1抗体，其包含至少一种，两种，三种，四种，五种，或六种选自下述的HVR：(a)包含SEQ ID NO：33的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ IDNO：34的氨基酸序列的HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO：35的氨基酸序列的HVR-H3；(d)包含SEQID NO：36的氨基酸序列的HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO：37的氨基酸序列的HVR-L2；和(f)包含SEQ ID NO：38的氨基酸序列的HVR-L3。

在一个方面，本发明提供一种抗PD1抗体，其包含(a)包含SEQ ID NO：33的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO：34的氨基酸序列的HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO：35的氨基酸序列的HVR-H3；(d)包含SEQ ID NO：36的氨基酸序列的HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO：37的氨基酸序列的HVR-L2；和(f)包含SEQ ID NO：38的氨基酸序列的HVR-L3。

在另一个方面，本发明的抗体包含(a)如下的VH域，该VH域包含至少一种，至少两种，或所有三种选自下述的VH HVR序列：(i)包含SEQ ID NO：33的氨基酸序列的HVR-H1，(ii)包含SEQ ID NO：34的氨基酸序列的HVR-H2，和(iii)包含选自SEQ ID NO：35的氨基酸序列的HVR-H3；和(b)如下的VL域，该VL域包含至少一种，至少两种，或所有三种选自下述的VL HVR序列：(i)包含SEQ ID NO：36的氨基酸序列的HVR-L1，(ii)包含SEQ ID NO：37的氨基酸序列的HVR-L2，和(c)包含SEQ ID NO：38的氨基酸序列的HVR-L3。

在另一个方面，本发明的抗体包含(a)如下的VH域，该VH域包含(i)包含SEQ IDNO：33的氨基酸序列的HVR-H1，(ii)包含SEQ ID NO：34的氨基酸序列的HVR-H2，和(iii)包含选自SEQ ID NO：35的氨基酸序列的HVR-H3；和(b)如下的VL域，该VL域包含(i)包含SEQID NO：36的氨基酸序列的HVR-L1，(ii)包含SEQ ID NO：37的氨基酸序列的HVR-L2，和(iii)包含SEQ ID NO：38的氨基酸序列的HVR-L3。

在一个实施方案中，此类抗PD1抗体包含

i)包含SEQ ID NO：39的VH序列和SEQ ID NO：40的VL序列；或

ii)i)下的抗体的VH和VL的人源化变体。

在一个方面，本发明提供一种抗PD1抗体，其包含至少一种，两种，三种，四种，五种，或六种选自下述的HVR：(a)包含SEQ ID NO：41的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ IDNO：42的氨基酸序列的HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO：43的氨基酸序列的HVR-H3；(d)包含SEQID NO：44的氨基酸序列的HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO：45的氨基酸序列的HVR-L2；和(f)包含SEQ ID NO：46的氨基酸序列的HVR-L3。

在一个方面，本发明提供一种抗PD1抗体，其包含(a)包含SEQ ID NO：41的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO：42的氨基酸序列的HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO：43的氨基酸序列的HVR-H3；(d)包含SEQ ID NO：44的氨基酸序列的HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO：45的氨基酸序列的HVR-L2；和(f)包含SEQ ID NO：46的氨基酸序列的HVR-L3。

在另一个方面，本发明的抗体包含(a)如下的VH域，该VH域包含至少一种，至少两种，或所有三种选自下述的VH HVR序列：(i)包含SEQ ID NO：41的氨基酸序列的HVR-H1，(ii)包含SEQ ID NO：42的氨基酸序列的HVR-H2，和(iii)包含选自SEQ ID NO：43的氨基酸序列的HVR-H3；和(b)如下的VL域，该VL域包含至少一种，至少两种，或所有三种选自下述的VL HVR序列：(i)包含SEQ ID NO：44的氨基酸序列的HVR-L1，(ii)包含SEQ ID NO：45的氨基酸序列的HVR-L2，和(c)包含SEQ ID NO：46的氨基酸序列的HVR-L3。

在另一个方面，本发明的抗体包含(a)如下的VH域，该VH域包含(i)包含SEQ IDNO：41的氨基酸序列的HVR-H1，(ii)包含SEQ ID NO：42的氨基酸序列的HVR-H2，和(iii)包含选自SEQ ID NO：43的氨基酸序列的HVR-H3；和(b)如下的VL域，该VL域包含(i)包含SEQID NO：44的氨基酸序列的HVR-L1，(ii)包含SEQ ID NO：45的氨基酸序列的HVR-L2，和(iii)包含SEQ ID NO：46的氨基酸序列的HVR-L3。

在一个实施方案中，此类抗PD1抗体包含

i)包含SEQ ID NO：47的VH序列和SEQ ID NO：48的VL序列；或

ii)i)下的抗体的VH和VL的人源化变体。

在一个方面，本发明提供一种抗PD1抗体，其包含至少一种，两种，三种，四种，五种，或六种选自下述的HVR：(a)包含SEQ ID NO：49的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ IDNO：50的氨基酸序列的HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO：51的氨基酸序列的HVR-H3；(d)包含SEQID NO：52的氨基酸序列的HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO：53的氨基酸序列的HVR-L2；和(f)包含SEQ ID NO：54的氨基酸序列的HVR-L3。

在一个方面，本发明提供一种抗PD1抗体，其包含(a)包含SEQ ID NO：49的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO：50的氨基酸序列的HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO：51的氨基酸序列的HVR-H3；(d)包含SEQ ID NO：52的氨基酸序列的HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO：53的氨基酸序列的HVR-L2；和(f)包含SEQ ID NO：54的氨基酸序列的HVR-L3。

在另一个方面，本发明的抗体包含(a)如下的VH域，该VH域包含至少一种，至少两种，或所有三种选自下述的VH HVR序列：(i)包含SEQ ID NO：49的氨基酸序列的HVR-H1，(ii)包含SEQ ID NO：50的氨基酸序列的HVR-H2，和(iii)包含选自SEQ ID NO：51的氨基酸序列的HVR-H3；和(b)如下的VL域，该VL域包含至少一种，至少两种，或所有三种选自下述的VL HVR序列：(i)包含SEQ ID NO：52的氨基酸序列的HVR-L1，(ii)包含SEQ ID NO：53的氨基酸序列的HVR-L2，和(c)包含SEQ ID NO：54的氨基酸序列的HVR-L3。

在另一个方面，本发明的抗体包含(a)如下的VH域，该VH域包含(i)包含SEQ IDNO：49的氨基酸序列的HVR-H1，(ii)包含SEQ ID NO：50的氨基酸序列的HVR-H2，和(iii)包含选自SEQ ID NO：51的氨基酸序列的HVR-H3；和(b)如下的VL域，该VL域包含(i)包含SEQID NO：52的氨基酸序列的HVR-L1，(ii)包含SEQ ID NO：53的氨基酸序列的HVR-L2，和(iii)包含SEQ ID NO：54的氨基酸序列的HVR-L3。

在一个实施方案中，此类抗PD1抗体包含

i)包含SEQ ID NO：47的VH序列和SEQ ID NO：48的VL序列；

ii)i)下的抗体的VH和VL的人源化变体。

在一个优选的实施方案，提供了一种抗体，其与包含SEQ ID NO：7的VH序列和SEQID NO：8的VL序列的抗PD1抗体结合相同表位。

在一个优选的实施方案，提供了一种抗体，其与包含SEQ ID NO：7的VH序列和SEQID NO：8的VL序列的抗PD1抗体竞争对人PD1的结合(如在实施例2中描述的竞争测定法(表位作图ELISA/结合竞争测定法)中测定的)。

在一个方面，本发明提供一种抗PD1抗体(例如一种结合人PD1的抗体)，其包含

A)(a)包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列的HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO：3的氨基酸序列的HVR-H3；(d)包含SEQ ID NO：4的氨基酸序列的HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO：5的氨基酸序列的HVR-L2；和(f)包含SEQ ID NO：6的氨基酸序列的HVR-L3。

在另一个方面，本发明提供一种抗PD1抗体(例如一种结合人PD1的抗体)，其包含

A)(a)如下的VH域，该VH域包含(i)包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列的HVR-H1，(ii)包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列的HVR-H2，和(iii)包含选自SEQ ID NO：3的氨基酸序列的HVR-H3；和(b)如下的VL域，该VL域包含(i)包含SEQ ID NO：4的氨基酸序列的HVR-L1，(ii)包含SEQ ID NO：5的氨基酸序列的HVR-L2，和(iii)包含SEQ ID NO：6的氨基酸序列的HVR-L3。

在一个方面，本发明提供一种结合人PD1的抗体，其

A)

i)包含SEQ ID NO：7的VH序列和SEQ ID NO：8的VL序列；

ii)或i)下的抗体的VH和VL的人源化变体；

或B)

i)包含SEQ ID NO：57的VH序列和SEQ ID NO：58的VL序列；

ii)包含SEQ ID NO：57的VH序列和SEQ ID NO：59的VL序列；

iii)包含SEQ ID NO：57的VH序列和SEQ ID NO：60的VL序列；

iv)包含SEQ ID NO：57的VH序列和SEQ ID NO：61的VL序列；

或C)

i)包含SEQ ID NO：15的VH序列和SEQ ID NO：16的VL序列；

ii)或i)下的抗体的VH和VL的人源化变体；

或D)

i)包含SEQ ID NO：23的VH序列和SEQ ID NO：24的VL序列；

ii)或i)下的抗体的VH和VL的人源化变体；

或E)

i)包含SEQ ID NO：31的VH序列和SEQ ID NO：32的VL序列；

ii)或i)下的抗体的VH和VL的人源化变体；

或F)

i)包含SEQ ID NO：39的VH序列和SEQ ID NO：40的VL序列；

ii)或i)下的抗体的VH和VL的人源化变体；

或G)

i)包含SEQ ID NO：47的VH序列和SEQ ID NO：48的VL序列；

ii)或i)下的抗体的VH和VL的人源化变体；

或H)

i)包含SEQ ID NO：55的VH序列和SEQ ID NO：56的VL序列；

ii)或i)下的抗体的VH和VL的人源化变体。

在一个方面，本发明提供一种结合人PD1的抗体，其

i)包含SEQ ID NO：7的VH序列和SEQ ID NO：8的VL序列；

ii)i)下的抗体的VH和VL的人源化变体。

在一个方面，本发明提供一种结合人PD1的抗体，其包含SEQ ID NO：57的VH序列和SEQ ID NO：58的VL序列。

在一个方面，本发明提供一种结合人PD1的抗体，其包含SEQ ID NO：57的VH序列和SEQ ID NO：59的VL序列。

在一个方面，本发明提供一种结合人PD1的抗体，其包含SEQ ID NO：57的VH序列和SEQ ID NO：60的VL序列。

在一个方面，本发明提供一种结合人PD1的抗体，其包含SEQ ID NO：57的VH序列和SEQ ID NO：61的VL序列。

G)(a)包含SEQ ID NO：49的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO：50的氨基酸序列的HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO：51的氨基酸序列的HVR-H3；(d)包含SEQ ID NO：52的氨基酸序列的HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO：53的氨基酸序列的HVR-L2；和(f)包含SEQ ID NO：54的氨基酸序列的HVR-L3；

其中该抗体独立地特征在于下述特性中的一项或多项：该抗PD-1抗体

i)与包含PD1-0103的VH和VL的抗PD1抗体竞争对PD-1的结合；和/或

ii)结合人和食蟹猴PD-1；和/或

iii)以10μg/ml的抗体浓度将异基因经刺激T细胞的干扰素伽马(IFNγ)分泌增强85％或更多(在一个优选的实施方案，90％或更多，在一个优选的实施方案，95％或更多)(其中无抗体时的分泌设为0％(IFNγ的基础水平)且有20EU/ml重组人IL-2时的分泌设为100％(在依照实施例3的(异基因)混合淋巴细胞反应(MLR)测定法中)；和/或

iv)以10μg/ml的抗体浓度将异基因经刺激T细胞的肿瘤坏死因子阿尔法(TNFα)分泌增强200％或更多(在一个优选的实施方案，250％或更多)(其中无抗体时的分泌设为0％(TNFα的基础水平)且有20EU/ml重组人IL-2时的分泌设为100％(在依照实施例3的(异基因)混合淋巴细胞反应(MLR)测定法中)。

G)(a)如下的VH域，该VH域包含(i)包含SEQ ID NO：49的氨基酸序列的HVR-H1，(ii)包含SEQ ID NO：50的氨基酸序列的HVR-H2，和(iii)包含选自SEQ ID NO：51的氨基酸序列的HVR-H3；和(b)如下的VL域，该VL域包含(i)包含SEQ ID NO：52的氨基酸序列的HVR-L1，(ii)包含SEQ ID NO：53的氨基酸序列的HVR-L2，和(iii)包含SEQ ID NO：54的氨基酸序列的HVR-L3；

i)与包含PD1-0103的VH和VL的抗PD1抗体竞争对PD-1的结合；和/或

ii)结合人和食蟹猴PD-1；和/或

在本发明的又一个方面，依照上述实施方案任一的抗PD1抗体是单克隆抗体，包括嵌合，人源化或人抗体。在一个实施方案中，抗PD1抗体是抗体片段，例如Fv，Fab，Fab’，scFv，双抗体，或F(ab’)₂片段。在另一个实施方案中，该抗体是全长抗体，例如完整IgG1或IgG4抗体或本文中定义的其它抗体类或同种型。

在又一个方面，依照上述实施方案任一的抗PD1抗体可以单一地或组合地并入下文1-7节描述的任何特征：

1.抗体亲和力

在某些实施方案中，本文中提供的抗体具有≤1μM，≤100nM，≤10nM，≤1nM，≤0.1nM，≤0.01nM，或≤0.001nM(例如10^-8M或更少，例如10^-8M至10^-13M，例如10^-9M至10^-13M)的解离常数KD。

在一个优选实施方案中，KD是使用表面等离振子共振测定法使用于25℃使用固定化抗原CM5芯片在约10个响应单位(RU)测量的。简言之，依照供应商的用法说明书用盐酸N-乙基-N’-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活化羧甲基化右旋糖苷生物传感器芯片(CM5,BIACORE,Inc.)。将抗原用10mM乙酸钠pH 4.8稀释至5μg/ml(约0.2μM)，然后以5μl/分钟的流速注射以获得约10个响应单位(RU)的偶联蛋白质。注入抗原后，注入1M乙醇胺以封闭未反应基团。为了动力学测量，于25℃以约25μl/分钟的流速注入在含0.05％聚山梨酯20(TWEEN-20^TM)表面活性剂的PBS(PBST)中两倍连续稀释的Fab(0.78nM至500nM)。使用简单一对一朗格缪尔(Langmuir)结合模型(Evaluation软件版本3.2)通过同时拟合结合和解离传感图计算结合速率(k_on或ka)和解离速率(k_off或kd)。平衡解离常数(KD)以比率kd/ka(k_off/k_on)计算。参见例如Chen et al.,J.Mol.Biol.293:865-881(1999)。如果根据上文表面等离振子共振测定法，结合速率超过10⁶M^-1s^-1，那么可使用荧光淬灭技术来测定结合速率，即根据分光计诸如配备了断流装置的分光光度计(Aviv Instruments)或8000系列SLM-AMINCO^TM分光光度计(ThermoSpectronic)中用搅拌比色杯进行的测量，在存在浓度渐增的抗原的情况中，测量PBS pH 7.2中20nM抗抗原抗体(Fab形式)于25℃的荧光发射强度(激发＝295nm；发射＝340nm，16nm带通)的升高或降低。

2.抗体片段

在某些实施方案中，本文中提供的抗体是抗体片段。抗体片段包括但不限于Fab，Fab’，Fab’-SH，F(ab’)₂，Fv，和scFv片段，及下文描述的其它片段。关于某些抗体片段的综述，参见Hudson,P.J.et al.,Nat.Med.9:129-134(2003)。关于scFv片段的综述，参见例如Plueckthun,A.,In:The Pharmacology of Monoclonal Antibodies,Vol.113,Rosenburgand Moore(eds.),Springer-Verlag,New York(1994),pp.269-315；还可参见WO 93/16185；及美国专利No.5,571,894和No.5,587,458。关于包含补救受体结合表位残基且具有延长的体内半衰期的Fab和F(ab’)₂片段的讨论，参见美国专利No.5,869,046。

双抗体是具有两个抗原结合位点的抗体片段，其可以是二价的或双特异性的。参见例如EP 0 404 097；WO 1993/01161；Hudson,P.J.et al.,Nat.Med.9:129-134(2003)；及Holliger,P.et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6444-6448(1993)。三抗体和四抗体也记载于Hudson,P.J.et al.,Nat.Med.9:129-134(2003)。

单域抗体是包含抗体的整个或部分重链可变域或整个或部分轻链可变域的抗体片段。在某些实施方案中，单域抗体是人单域抗体(Domantis,Inc.，Waltham，MA；参见例如美国专利No.6,248,516B1)。

可以通过多种技术，包括但不限于对完整抗体的蛋白水解消化及重组宿主细胞(例如大肠杆菌或噬菌体)的生成来生成抗体片段，如本文中所描述的。

3.嵌合抗体和人源化的抗体

在某些实施方案中，本文中提供的抗体是嵌合抗体。某些嵌合抗体记载于例如美国专利No.4,816,567；及Morrison,S.L.et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:6851-6855(1984)。在一个例子中，嵌合抗体包含非人可变区(例如自小鼠，大鼠，仓鼠，家兔，或非人灵长类，诸如猴衍生的可变区)和人恒定区。在又一个例子中，嵌合抗体是“类转换的”抗体，其中类或亚类已经自亲本抗体的类或亚类改变。嵌合抗体包括其抗原结合片段。

在某些实施方案中，嵌合抗体是人源化抗体。通常，将非人抗体人源化以降低对人的免疫原性，同时保留亲本非人抗体的特异性和亲和力。一般地，人源化抗体包含一个或多个可变域，其中HVR，例如CDR(或其部分)自非人抗体衍生，而FR(或其部分)自人抗体序列衍生。任选地，人源化抗体还会至少包含人恒定区的一部分。在一些实施方案中，将人源化抗体中的一些FR残基用来自非人抗体(例如衍生HVR残基的抗体)的相应残基替代，例如以恢复或改善抗体特异性或亲和力。

人源化抗体及其生成方法综述于例如Almagro,J.C.and Fransson,J.,Front.Biosci.13:1619-1633(2008)，并且进一步记载于例如Riechmann,I.et al.,Nature332:323-329(1988)；Queen,C.et al.,Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 86:10029-10033(1989)；美国专利No.5,821,337，No.7,527,791，No.6,982,321，和No.7,087,409；Kashmiri,S.V.et al.,Methods 36:25-34(2005)(记载SDR(a-CDR)嫁接)；Padlan,E.A.,Mol.Immunol.28:489-498(1991)(记载“重修表面”)；Dall’Acqua,W.F.et al.,Methods36:43-60(2005)(记载“FR改组”)；Osbourn,J.et al.,Methods 36:61-68(2005)及Klimka,A.et al.,Br.J.Cancer 83:252-260(2000)(记载FR改组的“引导选择”办法)。

可以用于人源化的人框架区包括但不限于：使用“最佳拟合(best-fit)”方法选择的框架区(见例如Sims,M.J.等,J.Immunol.151:2296-2308(1993))；自轻或重链可变区的特定亚组的人抗体的共有序列衍生的框架区(见例如Carter,P.等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89:4285-4289(1992)；及Presta,L.G.等,J.Immunol.,151:2623-2632(1993))；人成熟的(体细胞突变的)框架区或人种系框架区(见例如Almagro,J.C.和Fransson,J.,Front.Biosci.13:1619-1633(2008))；和通过筛选FR文库衍生的框架区(见例如Baca,M.等,J.Biol.Chem.272:10678-10684(1997)及Rosok,M.J.等,J.Biol.Chem.271:22611-22618(1996))。

4.人抗体

在某些实施方案中，本文中提供的抗体是人抗体。可以使用本领域中已知的多种技术来生成人抗体。一般地，人抗体记载于van Dijk,M.A.and van de Winkel,J.G.,Curr.Opin.Pharmacol.5:368-374(2001)及Lonberg,N.,Curr.Opin.Immunol.20:450-459(2008)。

可以通过对转基因动物施用免疫原来制备人抗体，所述转基因动物已经修饰为响应抗原性攻击而生成完整人抗体或具有人可变区的完整抗体。此类动物通常含有整个或部分人免疫球蛋白基因座，其替换内源免疫球蛋白基因座，或者其在染色体外存在或随机整合入动物的染色体中。在此类转基因小鼠中，一般已经将内源免疫球蛋白基因座灭活。关于自转基因动物获得人抗体的方法的综述参见Lonberg,N.,Nat.Biotech.23:1117-1125(2005)。还可参见例如美国专利No.6,075,181和No.6,150,584，其描述了XENOMOUSE^TM技术；美国专利No.5,770,429，其描述了技术；美国专利No.7,041,870，其描述了K-M技术，和美国专利申请公开文本No.US 2007/0061900，其描述了技术。可以例如通过与不同人恒定区组合进一步修饰来自由此类动物生成的完整抗体的人可变区。

也可以通过基于杂交瘤的方法生成人抗体。已经描述了用于生成人单克隆抗体的人骨髓瘤和小鼠-人异源骨髓瘤细胞系(参见例如Kozbor,D.,J.Immunol.133:3001-3005(1984)；Brodeur,B.R.et al.,Monoclonal Antibody Production Techniques andApplications,Marcel Dekker,Inc.,New York(1987),pp.51-63；及Boerner,P.et al.,J.Immunol.147:86-95(1991))。经由人B细胞杂交瘤技术生成的人抗体也记载于Li,J.etal.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA103:3557-3562(2006)。其它方法包括那些记载于例如美国专利No.7,189,826(其描述了自杂交瘤细胞系生成单克隆人IgM抗体)及Ni,J.,XiandaiMianyixue 26:265-268(2006)(其描述了人-人杂交瘤)的。人杂交瘤技术(Trioma技术)也记载于Vollmers,H.P.and Brandlein,S.,Histology and Histopathology 20:927-937(2005)及Vollmers,H.P.and Brandlein,S.,Methods and Findings in Experimentaland Clinical Pharmacology 27:185-191(2005)。

也可以如下生成人抗体，即分离自人衍生的噬菌体展示文库选择的Fv克隆可变域序列。然后，可以将此类可变域序列与期望的人恒定域组合。下文描述了自抗体文库选择人抗体的技术。

5.文库衍生的抗体

可以通过对组合文库筛选具有期望的一种或多种活性的抗体来分离本发明的抗体。例如，用于生成噬菌体展示文库及对此类文库筛选拥有期望结合特征的抗体的多种方法是本领域中已知的。此类方法综述于例如Hoogenboom,H.R.et al.,Methods inMolecular Biology 178:1-37(2001)，并且进一步记载于例如McCafferty,J.et al.,Nature 348:552-554(1990)；Clackson,T.et al.,Nature 352:624-628(1991)；Marks,J.D.et al.,J.Mol.Biol.222:581-597(1992)；Marks,J.D.and Bradbury,A.,Methods inMolecular Biology 248:161-175(2003)；Sidhu,S.S.et al.,J.Mol.Biol.338:299-310(2004)；Lee,C.V.et al.,J.Mol.Biol.340:1073-1093(2004)；Fellouse,F.A.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 101:12467-12472(2004)；及Lee,C.V.et al.,J.Immunol.Methods 284:119-132(2004)。

在某些噬菌体展示方法中，将VH和VL基因的全集分别通过聚合酶链式反应(PCR)克隆，并在噬菌体文库中随机重组，然后可以对所述噬菌体文库筛选抗原结合噬菌体，如记载于Winter,G.et al.,Ann.Rev.Immunol.12:433-455(1994)。噬菌体通常以单链Fv(scFv)片段或以Fab片段展示抗体片段。来自经免疫来源的文库提供针对免疫原的高亲和力抗体，而不需要构建杂交瘤。或者，可以(例如自人)克隆未免疫全集以在没有任何免疫的情况中提供针对一大批非自身和还有自身抗原的抗体的单一来源，如由Griffiths,A.D.et al.,EMBO J,12:725-734(1993)描述的。最后，也可以通过自干细胞克隆非重排的V基因区段，并使用含有随机序列的PCR引物编码高度可变的CDR3区并在体外实现重排来合成生成未免疫文库，如由Hoogenboom,H.R.and Winter,G.,J.Mol.Biol.227:381-388(1992)所描述的。描述人抗体噬菌体文库的专利公开文本包括例如：美国专利No.5,750,373及美国专利公开文本No.2005/0079574，2005/0119455，2005/0266000，2007/0117126，2007/0160598，2007/0237764，2007/0292936和2009/0002360。

认为自人抗体文库分离的抗体或抗体片段是本文中的人抗体或人抗体片段。

6.多特异性抗体

在某些实施方案中，本文中提供的抗体是多特异性抗体，例如双特异性抗体。多特异性抗体是对至少两种不同位点具有结合特异性的单克隆抗体。在某些实施方案中，结合特异性之一针对PD1，而另一种针对任何其它抗原。在某些实施方案中，双特异性抗体可结合PD1上的两种不同表位。也可以使用双特异性抗体来将细胞毒剂定位于表达PD1的细胞。双特异性抗体可以以全长抗体或抗体片段制备。

用于生成多特异性抗体的技术包括但不限于具有不同特异性的两对免疫球蛋白重链-轻链的重组共表达(参见Milstein,C.and Cuello,A.C.,Nature 305:537-540(1983)；WO 93/08829；及Traunecker,A.et al.,EMBO J.10:3655-3659(1991))，和“节-入-穴”工程化(参见例如美国专利No.5,731,168)。也可以通过用于生成抗体Fc-异二聚体分子的工程化静电操纵效应(WO 2009/089004)；交联两种或更多种抗体或片段(参见例如美国专利No.4,676,980及Brennan,M.et al.,Science 229:81-83(1985))；使用亮氨酸拉链来生成双特异性抗体(参见例如Kostelny,S.A.et al.,J.Immunol.148:1547-1553(1992))；使用用于生成双特异性抗体片段的“双抗体”技术(参见例如Holliger,P.et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6444-6448(1993))；及使用单链Fv(sFv)二聚体(参见例如Gruber,M.et al.,J.Immunol.152:5368-5374(1994))；及制备三特异性抗体(如例如Tutt,A.et al.,J.Immunol.147:60-69(1991)中所描述的)来生成多特异性抗体。

本文中还包括具有三个或更多个功能性抗原结合位点的工程化改造抗体，包括“章鱼抗体”(参见例如US 2006/0025576)。

本文中的抗体或片段还包括包含结合PD1及另一种不同抗原的抗原结合位点的“双重作用Fab”或“DAF”(参见例如US 2008/0069820)。

本文中的抗体或片段还包括WO 2009/080251，WO 2009/080252，WO 2009/080253，WO 2009/080254，WO 2010/112193，WO 2010/115589，WO 2010/136172，WO 2010/145792，及WO 2010/145793，WO 2011/117330，WO 2012/025525，WO 2012/025530，WO 2013/026835，WO2013/026831，WO 2013/164325，或WO 2013/174873中记载的多特异性抗体。

7.抗体变体

在某些实施方案中，涵盖本文中提供的抗体的氨基酸序列变体。例如，可能期望改善抗体的结合亲和力和/或其它生物学特性。可以通过将适宜的修饰引入编码抗体的核苷酸序列中，或者通过肽合成来制备抗体的氨基酸序列变体。此类修饰包括例如对抗体的氨基酸序列内的残基的删除，和/或插入和/或替代。可以进行删除，插入，和替代的任何组合以得到最终的构建体，只要最终的构建体拥有期望的特征，例如抗原结合。

a)替代，插入，和删除变体

在某些实施方案中，提供具有一处或多处氨基酸替代的抗体变体。替代诱变感兴趣的位点包括HVR和FR。例示性变化在表1中在“例示性替代”的标题下提供，并且如下文参照氨基酸侧链类别进一步描述的。保守替代在表1中在“优选的替代”的标题下显示。可以将氨基酸替代引入感兴趣的抗体中，并且对产物筛选期望的活性，例如保留/改善的抗原结合，降低的免疫原性，或改善的ADCC或CDC。

表1

依照共同的侧链特性，氨基酸可以如下分组：

(1)疏水性的：正亮氨酸，Met，Ala，Val，Leu，Ile；

(2)中性，亲水性的：Cys，Ser，Thr，Asn，Gln；

(3)酸性的：Asp，Glu；

(4)碱性的：His，Lys，Arg；

(5)影响链取向的残基：Gly，Pro；

(6)芳香族的：Trp，Tyr，Phe。

非保守替代会需要用这些类别之一的成员替换另一个类别的。

一类替代变体牵涉替代亲本抗体(例如人源化或人抗体)的一个或多个高变区残基。一般地，为进一步研究选择的所得变体相对于亲本抗体会具有某些生物学特性的改变(例如改善)(例如升高的亲和力，降低的免疫原性)和/或会基本上保留亲本抗体的某些生物学特性。一种例示性替代变体是亲和力成熟抗体，其可以例如使用基于噬菌体展示的亲和力成熟技术诸如本文中所描述的那些技术来方便地生成。简言之，将一个或多个HVR残基突变，并将变体抗体在噬菌体上展示，并对其筛选特定的生物学活性(例如结合亲和力)。

可以在HVR中做出变化(例如替代)，例如以改善抗体亲和力。可以在HVR“热点”中，即由在体细胞成熟过程期间以高频率经历突变的密码子编码的残基(参见例如Chowdhury,P.S.,Methods Mol.Biol.207:179-196(2008))，和/或SDR(a-CDR)做出此类变化，对所得变体VH或VL测试结合亲和力。通过次级文库的构建和再选择进行的亲和力成熟已经记载于例如Hoogenboom,H.R.et al.,in Methods in Molecular Biology 178:1-37(2002))。在亲和力成熟的一些实施方案中，通过多种方法(例如易错PCR，链改组，或寡核苷酸指导的诱变)任一将多样性引入为成熟选择的可变基因。然后，创建次级文库。然后，筛选文库以鉴定具有期望亲和力的任何抗体变体。另一种引入多样性的方法牵涉HVR指导的办法，其中将数个HVR残基(例如一次4-6个残基)随机化。可以例如使用丙氨酸扫描诱变或建模来特异性鉴定牵涉抗原结合的HVR残基。特别地，经常靶向CDR-H3和CDR-L3。

在某些实施方案中，可以在一个或多个HVR内发生替代，插入，或删除，只要此类变化不实质性降低抗体结合抗原的能力。例如，可以在HVR中做出保守变化(例如保守替代，如本文中提供的)，其没有实质性降低结合亲和力。此类变化可以在HVR“热点”或SDR以外。在上文提供的变体VH和VL序列的某些实施方案中，每个HVR或是未改变的，或是含有不多于1，2或3处氨基酸替代。

一种可用于鉴定抗体中可作为诱变靶位的残基或区域的方法称作“丙氨酸扫描诱变”，如记载于Cunningham,B.C.and Wells,J.A.,Science,244:1081-1085(1989)。在这种方法中，鉴定一个残基或一组靶残基(例如带电荷的残基，诸如arg，asp，his，lys，和glu)，并用中性或带负电荷的氨基酸(例如丙氨酸或多丙氨酸)替换以测定抗体与抗原的相互作用是否受到影响。可以在对初始替代表明功能敏感性的氨基酸位置引入进一步的替代。或者/另外，利用抗原-抗体复合物的晶体结构来鉴定抗体与抗原之间的接触点。作为替代的候选，可以靶向或消除此类接触残基和邻近残基。可以筛选变体以确定它们是否含有期望特性。

氨基酸序列插入包括长度范围为1个残基至含有100或更多个残基的多肽的氨基和/或羧基末端融合，以及单个或多个氨基酸残基的序列内插入。末端插入的例子包括具有N端甲硫氨酰基残基的抗体。抗体分子的其它插入变体包括抗体的N或C端与酶(例如对于ADEPT)或延长抗体的血清半衰期的多肽的融合物。

b)Fc区变体

在某些实施方案中，可以将一处或多处氨基酸修饰引入本文中提供的抗体的Fc区中，由此生成Fc区变体。Fc区变体可以包含在一个或多个氨基酸位置包含氨基酸修饰(例如替代)的人Fc区序列(例如人IgG1，IgG2，IgG3或IgG4 Fc区)。

具有降低的效应器功能的抗体包括那些具有Fc区残基238，265，269，270，297，327和329中的一个或多个的替代的(美国专利No.6,737,056)。此类Fc突变体包括在氨基酸位置265，269，270，297和327中的两处或更多处具有替代的Fc突变体，包括残基265和297替代成丙氨酸的所谓的“DANA”Fc突变体(美国专利No.7,332,581)。

描述了具有改善的或降低的对FcR的结合的某些抗体变体(参见例如美国专利No.6,737,056；WO 2004/056312；及Shields,R.L.et al.,J.Biol.Chem.276:6591-6604(2001))。

在本发明的一个实施方案中，此类抗体是具有突变L234A和L235A或具有突变L234A，L235A和P329G的IgG1，在另一个实施方案中，或具有突变S228P和L235E或S228P，L235E和P329G的IgG4(编号方式依照Kabat et al,Kabat et al.,Sequences of Proteinsof Immunological Interest,5th Ed.Public Health Service,National Institutes ofHealth,Bethesda,MD,1991的EU索引)。

具有延长的半衰期和改善的对新生儿Fc受体(FcRn)的结合的抗体记载于US2005/0014934，新生儿Fc受体(FcRn)负责将母体IgG转移至胎儿(Guyer,R.L.et al.,J.Immunol.117:587-593(1976)及Kim,J.K.et al.,J.Immunol.24:2429-2434(1994))。那些抗体包含其中具有改善Fc区对FcRn的结合的一处或多处替代的Fc区。此类Fc变体包括那些在Fc区残基238，256，265，272，286，303，305，307，311，312，317，340，356，360，362，376，378，380，382，413，424或434中的一处或多处具有替代，例如Fc区残基434的替代的(美国专利No.7,371,826)。

还可参见Duncan,A.R.and Winter,G.,Nature 322:738-740(1988)；US 5,648,260；US 5,624,821；及WO 94/29351，其关注Fc区变体的其它例子。

c)经半胱氨酸工程化改造的抗体变体

在某些实施方案中，可能期望创建经半胱氨酸工程化改造的抗体，例如“thioMAb”，其中抗体的一个或多个残基用半胱氨酸残基替代。在特定实施方案中，替代的残基存在于抗体的可接近位点。通过用半胱氨酸替代那些残基，反应性硫醇基团由此定位于抗体的可接近位点，并且可以用于将抗体缀合至其它模块，诸如药物模块或接头-药物模块，以创建免疫缀合物，如本文中进一步描述的。在某些实施方案中，可以用半胱氨酸替代下述残基之任一个或多个：轻链的V205(Kabat编号方式)；重链的A118(EU编号方式)；和重链Fc区的S400(EU编号方式)。可以如例如美国专利No.7,521,541所述生成经半胱氨酸工程化改造的抗体。

d)抗体衍生物

在某些实施方案中，可以进一步修饰本文中提供的抗体以含有本领域知道的且易于获得的另外的非蛋白质性质模块。适合于抗体衍生化的模块包括但不限于水溶性聚合物。水溶性聚合物的非限制性例子包括但不限于聚乙二醇(PEG)，乙二醇/丙二醇共聚物，羧甲基纤维素，右旋糖苷，聚乙烯醇，聚乙烯吡咯烷酮，聚-1,3-二氧戊环，聚-1,3,6-三口恶烷，乙烯/马来酸酐共聚物，聚氨基酸(均聚物或随机共聚物)，和右旋糖苷或聚(n-乙烯吡咯烷酮)聚乙二醇，丙二醇均聚物，环氧丙烷/环氧乙烷共聚物，聚氧乙烯化多元醇(例如甘油)，聚乙烯醇，及其混合物。由于其在水中的稳定性，聚乙二醇丙醛在生产中可能具有优势。聚合物可以是任何分子量，而且可以是分支的或不分支的。附着至抗体的聚合物的数目可以变化，而且如果附着了多于一个聚合物，那么它们可以是相同或不同的分子。一般而言，可根据下述考虑来确定用于衍生化的聚合物的数目和/或类型，包括但不限于抗体要改进的具体特性或功能，抗体衍生物是否会用于指定条件下的治疗，等。

在另一个实施方案中，提供抗体和可以通过暴露于辐射而选择性加热的非蛋白质性质模块的缀合物。在一个实施方案中，非蛋白质性质模块是碳纳米管(Kam,N.W.et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 102:11600-11605(2005))。辐射可以是任何波长的，而且包括但不限于对普通细胞没有损害，但是将非蛋白质性质模块加热至抗体-非蛋白质性质模块附近的细胞被杀死的温度的波长。

B.重组方法和组合物

可使用重组方法和组合物来生成抗体，例如如记载于美国专利No.4,816,567的。在一个实施方案中，提供编码本文所述抗PD1抗体的分离的核酸。此类核酸可编码包含抗体VL的氨基酸序列和/或包含抗体VH的氨基酸序列(例如抗体的轻和/或重链)。在又一个实施方案中，提供包含此类核酸的一种或多种载体(例如表达载体)。在又一个实施方案中，提供包含此类核酸的宿主细胞。在一个此类实施方案中，宿主细胞包含(例如已经用下述各项转化)：(1)包含核酸的载体，所述核酸编码包含抗体VL的氨基酸序列和包含抗体VH的氨基酸序列，或(2)第一载体和第二载体，所述第一载体包含编码包含抗体VL的氨基酸序列的核酸，所述第二载体包含编码包含抗体VH的氨基酸序列的核酸。在一个实施方案中，宿主细胞是真核的，例如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或淋巴样细胞(例如Y0，NS0，Sp20细胞)。在一个实施方案中，提供生成抗PD1抗体的方法，其中该方法包括在适合于抗体表达的条件下培养包含编码抗体的核酸的宿主细胞，如上文提供的，并任选自宿主细胞(或宿主细胞培养液)回收抗体。

对于抗PD1抗体的重组生成，分离编码抗体的核酸(例如如上文所描述的)，并插入一种或多种载体中，用于在宿主细胞中进一步克隆和/或表达。可使用常规规程将此类核酸容易地分离并测序(例如通过使用寡核苷酸探针来进行，所述寡核苷酸探针能够特异性结合编码抗体重和轻链的基因)。

适合于克隆或表达编码抗体的载体的宿主细胞包括本文所述原核或真核细胞。例如，可以在细菌中生成抗体，特别是在不需要糖基化和Fc效应器功能时。对于抗体片段和多肽在细菌中的表达，参见例如US 5,648,237；US 5,789,199；及US 5,840,523。还可参见Charlton,K.A.,In:Methods in Molecular Biology,Vol.248,Lo,B.K.C.(ed.),HumanaPress,Totowa,NJ(2003),pp.245-254，其描述抗体片段在大肠杆菌中的表达。表达后，可以在可溶性级分中自细菌细胞浆分离抗体，并可以进一步纯化。

在原核生物之外，真核微生物诸如丝状真菌或酵母也是适合于编码抗体的载体的克隆或表达宿主，包括其糖基化途径已经“人源化”，导致生成具有部分或完全人的糖基化样式的抗体的真菌和酵母菌株。参见Gerngross,T.U.,Nat.Biotech.22:1409-1414(2004)；及Li,H.et al.,Nat.Biotech.24:210-215(2006)。

适合于表达糖基化抗体的宿主细胞也是自多细胞生物体(无脊椎动物和脊椎动物)衍生的。无脊椎动物细胞的例子包括植物和昆虫细胞。已经鉴定出许多杆状病毒株，其可以与昆虫细胞联合使用，特别是用于转染草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)细胞。

也可利用植物细胞培养物作为宿主。参见例如美国专利No.5,959,177；No.6,040,498；No.6,420,548；No.7,125,978；及No.6,417,429(其描述用于在转基因植物中生成抗体的PLANTIBODIES^TM技术)。

也可使用脊椎动物细胞作为宿主。例如，适应悬浮生长的哺乳动物细胞系可能是有用的。有用哺乳动物宿主细胞系的其它例子有经SV40转化的猴肾CV1系(COS-7)；人胚肾系(293或293细胞，如记载于例如Graham,F.L.et al.,J.Gen Virol.36:59-74(1977))；幼仓鼠肾细胞(BHK)；小鼠塞托利(sertoli)细胞(TM4细胞，如记载于例如Mather,J.P.,Biol.Reprod.23:243-252(1980))；猴肾细胞(CV1)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76)；人宫颈癌细胞(HELA)；犬肾细胞(MDCK)；牛鼠(buffalo rat)肝细胞(BRL 3A)；人肺细胞(W138)；人肝细胞(Hep G2)；小鼠乳房肿瘤(MMT060562)；TRI细胞，如记载于例如Mather,J.P.et al.,Annals N.Y.Acad.Sci.383:44-68(1982)；MRC 5细胞；和FS4细胞。其它有用哺乳动物宿主细胞系包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，包括DHFR^-CHO细胞(Urlaub,G.et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77:4216-4220(1980))；和骨髓瘤细胞系诸如Y0，NS0和Sp2/0。关于适合于抗体生成的某些哺乳动物宿主细胞系的综述参见例如Yazaki,P.and Wu,A.M.,Methods in Molecular Biology,Vol.248,Lo,B.K.C.(ed.),Humana Press,Totowa,NJ(2004),pp.255-268。

C.测定法

可通过本领域已知的多种测定法对本文中提供的抗PD1抗体鉴定，筛选，或表征其物理/化学特性和/或生物学活性。

1.结合测定法和其它测定法

一方面，对本发明的抗体测试其抗原结合活性，例如通过已知方法诸如ELISA，Western印迹，等。

另一方面，可使用竞争测定法来鉴定与PD1-0103(包含VH序列SEQ ID NO:7和VL序列SEQ ID NO:8)(或者与具有相同的5至6种HVR的人源化PD1-0103变体抗体PD1-0103-0312，PD1-0103-0313，PD1-0103-0314，PD1-0103-0315)竞争对PD1的结合的抗体。本发明的一个实施方案是与包含VH序列SEQ ID NO:7的所有3种HVR和VL序列SEQ ID NO:8的所有3种HVR的抗PD1抗体竞争对人PD1的结合的抗体。本发明的一个实施方案是与包含VH序列SEQID NO:57的所有3种HVR和VL序列SEQ ID NO:58的所有3种HVR的抗PD1抗体竞争对人PD1的结合的抗体。在某些实施方案中，此类竞争性抗体结合与抗PD1抗体PD1-0103所结合表位相同的表位(例如线性或构象表位)。用于定位抗体所结合表位的详细例示性方法参见Morris(1996)“Epitope Mapping Protocols,”in Methods in Molecular Biology,vol.66(Humana Press,Totowa,NJ)。

在一种例示性竞争测定法中，在包含第一经标记抗体(其结合PD1，例如抗PD1抗体PD1-0103或人源化抗体PD1-0103-0312)和第二未标记抗体(其要测试与第一抗体竞争对PD1的结合的能力)的溶液中温育固定化PD1(-ECD)。第二抗体可存在于杂交瘤上清液中。作为对照，在包含第一经标记抗体但不包含第二未标记抗体的溶液中温育固定化PD1。在允许第一抗体结合PD1的条件下温育后，除去过量的未结合抗体，并测量与固定化PD1联合的标记物的量。如果测试样品中与固定化PD1联合的标记物的量相对于对照样品实质性减少，那么这指示第二抗体与第一抗体竞争对PD1的结合。参见Harlow,E.and Lane,D.,Antibodies:A Laboratory Manual,Chapter 14,Cold Spring Harbor Laboratory,ColdSpring Harbor,NY(1988)。另一种例示性竞争测定法见实施例2(表位作图ELISA/结合竞争测定法)。

2.活性测定法

一方面，提供了用于鉴定具有生物学活性的抗PD1抗体的测定法。生物学活性可包括例如增强不同免疫细胞，尤其是T细胞的活化和/或增殖的能力。例如，它们增强免疫调控性细胞因子(例如干扰素伽马(IFNγ)和/或肿瘤坏死因子阿尔法(TNFα))的分泌。增强或能增强的其它免疫调控性细胞因子有例如IL12，粒酶B，等。生物学活性还可以包括食蟹猴结合交叉反应性，以及对不同细胞类型的结合。还提供了在体内和/或在体外具有此类生物学活性的抗体。

在某些实施方案中，对本发明的抗体测试此类生物学活性，如记载于例如下文实施例。

D.免疫缀合物(仅癌症或为靶标修饰)

本发明还提供包含本文中的抗PD1抗体的免疫缀合物，该抗体与一种或多种细胞毒剂诸如化疗剂或药物，生长抑制剂，毒素(例如蛋白质毒素，细菌，真菌，植物，或动物起源的酶活性毒素，或其片段)，或放射性同位素缀合。

在一个实施方案中，免疫缀合物是抗体-药物缀合物(ADC)，其中抗体与一种或多种药物缀合，包括但不限于美登木生物碱(maytansinoid)(参见US 5,208,020，US 5,416,064和EP 0 425 235B1)；auristatin诸如单甲基auristatin药物模块DE和DF(MMAE和MMAF)(参见US 5,635,483，US5,780,588，及US 7,498,298)；多拉司他汀(dolastatin)；加利车霉素(calicheamicin)或其衍生物(参见US 5,712,374，US 5,714,586，US5,739,116，US 5,767,285，US 5,770,701，US 5,770,710，US 5,773,001，和US 5,877,296；Hinman,L.M.等人，Cancer Res.53:3336-3342(1993)；及Lode,H.N.等人，Cancer Res.58:2925-2928(1998))；蒽环类抗生素诸如道诺霉素(daunomycin)或多柔比星(doxorubicin)(参见Kratz,F.等人，Current Med.Chem.13:477-523(2006)；Jeffrey,S.C.等人，BioorgMed.Chem.Letters16:358-362(2006)；Torgov,M.Y.等人，Bioconjug.Chem.16:717-721(2005)；Nagy,A.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97:829-834(2000)；Dubowchik,G.M.等人，Bioorg.&Med.Chem.Letters 12:1529-1532(2002)；King,H.D.等人，J.Med.Chem.45:4336-4343(2002)；及美国专利No.6,630,579)；甲氨蝶呤；长春地辛(vindesine)；紫杉烷诸如多西他赛(docetaxel)，帕利他赛(paclitaxel)，larotaxel，tesetaxel，和ortataxel；单端孢菌素(trichothecene)；和CC1065。

在另一个实施方案中，免疫缀合物包含本文所述抗体，该抗体与酶活性毒素或其片段缀合，包括但不限于白喉毒素A链，白喉毒素的非结合活性片段，外毒素A链(来自铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa)，蓖麻毒蛋白(ricin)A链，相思豆毒蛋白(abrin)A链，蒴莲根毒蛋白(modeccin)A链，α-帚曲霉素(sarcin)，油桐(Aleurites fordii)毒蛋白，香石竹(dianthin)毒蛋白，美洲商陆(Phytolaca americana)毒蛋白(PAPI，PAPII和PAP-S)，苦瓜(Momordica charantia)抑制物，麻疯树毒蛋白(curcin)，巴豆毒蛋白(crotin)，肥皂草(sapaonaria officinalis)抑制物，白树毒蛋白(gelonin)，丝林霉素(mitogellin)，局限曲菌素(restrictocin)，酚霉素(phenomycin)，依诺霉素(enomycin)和单端孢菌素(tricothecenes)。

在另一个实施方案中，免疫缀合物包含本文所述抗体，该抗体与放射性原子缀合以形成放射缀合物。多种放射性同位素可用于生成放射缀合物。实例包括At²¹¹，I¹³¹，I¹²⁵，Y⁹⁰，Re¹⁸⁶，Re¹⁸⁸，Sm¹⁵³，Bi²¹²，P³²，Pb²¹²和Lu的放射性同位素。在将放射缀合物用于检测时，它可包含放射性原子用于闪烁照相研究，例如TC^99m或I¹²³，或自旋标记物用于核磁共振(NMR)成像(也称为磁共振成像，MRI)，诸如再一次的碘-123，碘-131，铟-111，氟-19，碳-13，氮-15，氧-17，钆，锰或铁。

可使用多种双功能蛋白质偶联剂来制备抗体和细胞毒剂的缀合物，诸如N-琥珀酰亚氨基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)，琥珀酰亚氨基-4-(N-马来酰亚氨基甲基)环己烷-1-羧酸酯(SMCC)，亚氨基硫烷(IT)，亚氨酸酯(诸如盐酸己二酰亚氨酸二甲酯)，活性酯类(诸如辛二酸二琥珀酰亚氨基酯)，醛类(诸如戊二醛)，双叠氮化合物(诸如双(对-叠氮苯甲酰基)己二胺)，双重氮衍生物(诸如双(对-重氮苯甲酰基)乙二胺)，二异氰酸酯(诸如甲苯2,6-二异氰酸酯)，和双活性氟化合物(诸如1,5-二氟-2,4-二硝基苯)的双功能衍生物。例如，可如Vitetta,E.S.等,Science 238:1098-1104(1987)中所述制备蓖麻毒蛋白免疫毒素。碳-14标记的1-异硫氰酸苯甲基-3-甲基二亚乙基三胺五乙酸(MX-DTPA)是用于将放射性核苷酸与抗体缀合的例示性螯合剂。参见WO 94/11026。接头可以是便于在细胞中释放细胞毒药物的“可切割接头”。例如，可使用酸不稳定接头，肽酶敏感接头，光不稳定接头，二甲基接头，或含二硫化物接头(Chari,R.V.等,Cancer Res.52:127-131(1992)；美国专利No.5,208,020)。

本文中的免疫缀合物或ADC明确涵盖但不限于用下列交联剂制备的此类缀合物，包括但不限于：商品化(如购自Pierce Biotechnology Inc.,Rockford,IL,U.S.A)的BMPS，EMCS，GMBS，HBVS，LC-SMCC，MBS，MPBH，SBAP，SIA，SIAB，SMCC，SMPB，SMPH，sulfo-EMCS，sulfo-GMBS，sulfo-KMUS，sulfo-MBS，sulfo-SIAB，sulfo-SMCC，和sulfo-SMPB，和SVSB(琥珀酰亚胺基-(4-乙烯基砜)苯甲酸酯)。

E.用于诊断和检测的方法和组合物

在某些实施方案中，本文中提供的任何抗PD1抗体对于检测生物学样品中PD1的存在是有用的。如本文中使用的，术语“检测”涵盖定量或定性检测。在某些实施方案中，生物学样品包括细胞或组织，诸如免疫细胞或T细胞浸润物。

在一个实施方案中，提供在诊断或检测方法中使用的抗PD1抗体。在又一方面，提供检测生物学样品中PD1的存在的方法。在某些实施方案中，该方法包括在允许抗PD1抗体结合PD1的条件下使生物学样品与本文所述抗PD1抗体接触，并检测是否在抗PD1抗体与PD1之间形成复合物。此类方法可以是体外或体内方法。在一个实施方案中，使用抗PD1抗体来选择适合用抗PD1抗体治疗的受试者，例如其中PD1是一种用于选择患者的生物标志物。

在某些实施方案中，提供经标记的抗PD1抗体。标记物包括但不限于直接检测的标记物或模块(诸如荧光，发色，电子致密，化学发光，和放射性标记物)，以及例如经由酶促反应或分子相互作用间接检测的模块，诸如酶或配体。例示性标记物包括但不限于放射性同位素³²P，¹⁴C，¹²⁵I，³H，和¹³¹I，荧光团诸如稀土螯合物或荧光素及其衍生物，罗丹明(rhodamine)及其衍生物，丹酰，伞形酮，萤光素酶例如萤火虫萤光素酶和细菌萤光素酶(美国专利No.4,737,456)，萤光素，2,3-二氢酞嗪二酮，辣根过氧化物酶(HRP)，碱性磷酸酶，β-半乳糖苷酶，葡糖淀粉酶，溶菌酶，糖氧化酶例如葡萄糖氧化酶，半乳糖氧化酶，和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶，杂环氧化酶诸如尿酸酶和黄嘌呤氧化酶(其与采用过氧化氢氧化染料前体的酶诸如HRP偶联)，乳过氧化物酶，或微过氧化物酶，生物素/亲合素，自旋标记物，噬菌体标记物，稳定的自由基，等等。

F.药物配制剂

通过混合具有期望纯度的本文所述抗PD1抗体与一种或多种任选的药学可接受载剂来制备此类抗体的药物配制剂(Remington's Pharmaceutical Sciences,16thedition,Osol,A.(ed.)(1980))，处于冻干配制剂或水性溶液形式。一般地，药学可接受载剂在所采用的剂量和浓度对接受者是无毒的，而且包括但不限于：缓冲剂，诸如磷酸盐，柠檬酸盐，和其它有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(诸如氯化十八烷基二甲基苄基铵；氯化己烷双胺；苯扎氯铵；苄索氯铵；酚，丁醇或苯甲醇；对羟基苯甲酸烃基酯，诸如对羟基苯甲酸甲酯或丙酯；邻苯二酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，诸如血清清蛋白，明胶，或免疫球蛋白；亲水性聚合物，诸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，诸如甘氨酸，谷氨酰胺，天冬酰胺，组氨酸，精氨酸，或赖氨酸；单糖，二糖，和其它碳水化合物，包括葡萄糖，甘露糖，或糊精；螯合剂，诸如EDTA；糖，诸如蔗糖，甘露醇，海藻糖或山梨醇；成盐反荷离子，诸如钠；金属复合物(例如Zn-蛋白质复合物)；和/或非离子表面活性剂，诸如聚乙二醇(PEG)。本文中的例示性药学可接受载剂进一步包括间质药物分散剂，诸如可溶性中性活性透明质酸酶糖蛋白(sHASEGP)，例如人可溶性PH-20透明质酸酶糖蛋白，诸如rhuPH20(Baxter International,Inc.)。某些例示性sHASEGP和使用方法(包括rhuPH20)记载于美国专利公开文本No.2005/0260186和No.2006/0104968。在一方面，将sHASEGP与一种或多种别的糖胺聚糖酶诸如软骨素酶组合。

例示性冻干抗体配制剂记载于美国专利No.6,267,958。水性抗体配制剂包括那些记载于美国专利No.6,171,586和WO 2006/044908的，后一种配制剂包含组氨酸-乙酸盐缓冲液。

本文中的配制剂还可含有所治疗具体适应症所必需的多于一种活性组分，优选活性互补且彼此没有不利影响的那些。例如，可能想要进一步提供。合适的是，此类活性组分以对于预定目的有效的量组合存在。

活性组分可包载于例如通过凝聚技术或通过界面聚合制备的微胶囊中(例如分别是羟甲基纤维素或明胶微胶囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊)，在胶状药物投递系统中(例如脂质体，清蛋白微球体，微乳剂，纳米颗粒和纳米胶囊)或在粗滴乳状液中。此类技术披露于例如Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition,Osol,A.(ed.)(1980)。

可制备持续释放制剂。持续释放制剂的合适例子包括含有抗体的固体疏水性聚合物的半透性基质，该基质为成形制品形式，例如膜或微胶囊。

用于体内施用的配制剂一般是无菌的。无菌性可容易地实现，例如通过穿过无菌滤膜过滤。

G.治疗性方法和组合物

本文中提供的任何抗PD1抗体(或抗原结合蛋白)可用于治疗方法。

一方面，提供了抗PD1抗体，其用作药物。又一些方面，提供了抗PD1抗体，其用于治疗癌症。在某些实施方案中，提供了抗PD1抗体，其用于治疗方法。在某些实施方案中，本发明提供抗PD1抗体，其用于治疗具有癌症的个体的方法，包括对该个体施用有效量的抗PD1抗体。

在又一些实施方案中，本发明提供抗PD1抗体，其用作免疫刺激剂/或用于刺激干扰素伽马(IFNγ)分泌。在某些实施方案中，本发明提供抗PD1抗体，其用于在个体中免疫刺激/或刺激干扰素伽马(IFNγ)分泌的方法，包括对该个体施用有效量的该抗PD1抗体来免疫刺激/或刺激干扰素伽马(IFNγ)分泌。

在又一些实施方案中，本发明提供抗PD1抗体，其用作免疫刺激剂/或用于刺激肿瘤坏死因子阿尔法(TNFα)分泌。在某些实施方案中，本发明提供抗PD1抗体，其用于在个体中免疫刺激/或刺激肿瘤坏死因子阿尔法(TNFα)分泌的方法，包括对该个体施用有效量的该抗PD1抗体来免疫刺激/或刺激肿瘤坏死因子阿尔法(TNFα)分泌。

依照任何上述实施方案，“个体”优选为人。又一方面，本发明提供抗PD1抗体在制造或制备药物中的用途。在一个实施方案中，该药物用于治疗癌症。在又一个实施方案中，该药物用于治疗癌症的方法，包括对具有癌症的个体施用有效量的药物。在又一个实施方案中，该药物用于诱导细胞介导的癌细胞裂解。在又一个实施方案中，该药物用于在罹患癌症的个体中诱导细胞介导的癌细胞裂解的方法，包括对该个体施用有效量的药物以诱导癌细胞凋亡和/或抑制癌细胞增殖。依照任何上述实施方案，“个体”可以为“人”。

又一方面，本发明提供用于治疗癌症的方法。在一个实施方案中，该方法包括对具有癌症的个体施用有效量的抗PD1抗体。依照任何上述实施方案，“个体”可以为人。

又一方面，本发明提供用于在罹患癌症的个体中诱导细胞介导的癌细胞裂解的方法。在一个实施方案中，该方法包括对该个体施用有效量的抗PD1抗体以在罹患癌症的个体中诱导细胞介导的癌细胞裂解。在一个实施方案中，“个体”为人。

又一方面，本发明提供包含本文中提供的任何抗PD1抗体的药物配制剂，其用于例如任何上述治疗方法。在一个实施方案中，药物配制剂包含本文中提供的任何抗PD1抗体和药学可接受载体。

可以通过任何合适手段，包括胃肠外，肺内，和鼻内，及若期望用于局部治疗的话，损伤内施用来施用本发明的抗体(和任何别的治疗剂)。胃肠外输注包括肌肉内，静脉内，动脉内，腹膜内，或皮下施用。部分根据施用是短暂的还是长期的，剂量给药可以通过任何合适路径(例如通过注射，诸如静脉内或皮下注射)进行。本文中涵盖各种剂量给药日程表，包括但不限于单次施用或在多个时间点的多次施用，推注施用，和脉冲输注。

本发明的抗体应当以一种与较好医学实践一致的方式配制，定剂量，和施用。关于这一点考虑的因素包括所治疗的具体病症，所治疗的具体哺乳动物，患者个体的临床状态，病症的起因，药剂递送部位，施用方法，施用日程表，及医学从业人员知道的其它因素。抗体无需但任选与一种或多种当前用于预防或治疗所讨论病症的药剂一起配制。此类其它药剂的有效量取决于配制剂中存在的抗体的量，病症或治疗的类型，及上文讨论的其它因素。这些通常以与本文所述相同的剂量和施用路径，或者以本文所述剂量的约1-99％，或者以凭经验/在临床上确定为适宜的任何剂量和任何路径使用。

对于疾病的预防或治疗，本发明的抗体(当单独地或与一种或多种其它别的治疗剂组合地使用时)的适宜剂量会取决于要治疗的疾病的类型，抗体的类型，疾病的严重性和病程，施用抗体是出于预防还是治疗目的，之前的疗法，患者的临床史和对抗体的响应，及主治医师的判断。抗体恰当地以一次或一系列治疗施用于患者。取决于疾病的类型和严重性，约1μg/kg至15mg/kg(例如0.5mg/kg至10mg/kg)的抗体可作为施用于患者的初始候选剂量，无论是例如通过一次或多次分开的施用或是通过连续输注。取决于上文所述因素，一个典型日剂量的范围可以为约1μg/kg至100mg/kg或更多。对于几天或更长时间的重复施用，取决于状况，治疗一般会持续直至出现疾病症状的期望遏制。抗体的一种例示性剂量会在约0.05mg/kg至约10mg/kg的范围中。如此，可以对患者施用一剂或多剂约0.5mg/kg，2.0mg/kg，4.0mg/kg或10mg/kg(或其任意组合)。此类剂量可间歇施用，例如每周或每三周(例如使得患者接受约2剂至约20剂，或例如约6剂抗体)。可施用一个较高的初始加载剂量，接着是一个或多个较低的剂量。一种例示性剂量给药方案包括施用约4mg/kg的初始加载剂量，接着是约2mg/kg抗体的每周一次维持剂量。然而，其它剂量摄生法可能是有用的。这种疗法的进展易于通过常规技术和测定方法来监测。

应当理解，可使用本发明的免疫缀合物实施任何上述配制剂或治疗性方法，作为抗PD1抗体的替代。

应当理解，可使用本发明的免疫缀合物实施任何上述配制剂或治疗性方法，作为抗PD1抗体的补充。

II.制品

在本发明的另一方面，提供一种制品，其包含对于治疗，预防和/或诊断上文所述病症有用的材料。制品包括容器和容器上或与容器联合的标签或包装插页。合适的容器包括例如瓶，管形瓶，注射器，IV溶液袋，等。容器可以自多种材料诸如玻璃或塑料形成。容器装有单独或与另一种组合物组合有效治疗，预防和/或诊断疾患的组合物，并且可具有无菌存取口(例如，容器可以是具有由皮下注射针可刺穿的塞子的管形瓶或静脉内溶液袋)。组合物中的至少一种活性剂是本发明的抗体。标签或包装插页指示使用组合物来治疗选择的状况。此外，制品可包括(a)其中装有组合物的第一容器，其中该组合物包含本发明的抗体；和(b)其中装有组合物的第二容器，其中该组合物包含别的细胞毒性或其它方面治疗性的药剂。在本发明的这个实施方案中的制品可进一步包括包装插页，其指示可使用组合物来治疗特定状况。或者/另外，制品可进一步包括第二(或第三)容器，其装有药学可接受缓冲液，诸如抑菌性注射用水(BWFI)，磷酸盐缓冲盐水，林格(Ringer)氏溶液和右旋糖溶液。它可进一步包括从商业和用户立场看期望的其它材料，包括其它缓冲液，稀释剂，滤器，针，和注射器。

应当理解，任何上述制品可包括本发明的免疫缀合物，作为抗PD1抗体的替代或补充。

氨基酸序列的描述

SEQ ID NO：1重链HVR-H1，PD1-0103

SEQ ID NO：2重链HVR-H2，PD1-0103

SEQ ID NO：3重链HVR-H3，PD1-0103

SEQ ID NO：4轻链HVR-L1，PD1-0103

SEQ ID NO：5轻链HVR-L2，PD1-0103

SEQ ID NO：6轻链HVR-L3，PD1-0103

SEQ ID NO：7重链可变域VH，PD1-0103

SEQ ID NO：8轻链可变域VL，PD1-0103

SEQ ID NO：9重链HVR-H1，PD1-0098

SEQ ID NO：10重链HVR-H2，PD1-0098

SEQ ID NO：11重链HVR-H3，PD1-0098

SEQ ID NO：12轻链HVR-L1，PD1-0098

SEQ ID NO：13轻链HVR-L2，PD1-0098

SEQ ID NO：14轻链HVR-L3，PD1-0098

SEQ ID NO：15重链可变域VH，PD1-0098

SEQ ID NO：16轻链可变域VL，PD1-0098

SEQ ID NO：17重链HVR-H1，PD1-0050

SEQ ID NO：18重链HVR-H2，PD1-0050

SEQ ID NO：19重链HVR-H3，PD1-0050

SEQ ID NO：20轻链HVR-L1，PD1-0050

SEQ ID NO：21轻链HVR-L2，PD1-0050

SEQ ID NO：22轻链HVR-L3，PD1-0050

SEQ ID NO：23重链可变域VH，PD1-0050

SEQ ID NO：24轻链可变域VL，PD1-0050

SEQ ID NO：25重链HVR-H1，PD1-0069

SEQ ID NO：26重链HVR-H2，PD1-0069

SEQ ID NO：27重链HVR-H3，PD1-0069

SEQ ID NO：28轻链HVR-L1，PD1-0069

SEQ ID NO：29轻链HVR-L2，PD1-0069

SEQ ID NO：30轻链HVR-L3，PD1-0069

SEQ ID NO：31重链可变域VH，PD1-0069

SEQ ID NO：32轻链可变域VL，PD1-0069

SEQ ID NO：33重链HVR-H1，PD1-0073

SEQ ID NO：34重链HVR-H2，PD1-0073

SEQ ID NO：35重链HVR-H3，PD1-0073

SEQ ID NO：36轻链HVR-L1，PD1-0073

SEQ ID NO：37轻链HVR-L2，PD1-0073

SEQ ID NO：38轻链HVR-L3，PD1-0073

SEQ ID NO：39重链可变域VH，PD1-0073

SEQ ID NO：40轻链可变域VL，PD1-0073

SEQ ID NO：41重链HVR-H1，PD1-0078

SEQ ID NO：42重链HVR-H2，PD1-0078

SEQ ID NO：43重链HVR-H3，PD1-0078

SEQ ID NO：44轻链HVR-L1，PD1-0078

SEQ ID NO：45轻链HVR-L2，PD1-0078

SEQ ID NO：46轻链HVR-L3，PD1-0078

SEQ ID NO：47重链可变域VH，PD1-0078

SEQ ID NO：48轻链可变域VL，PD1-0078

SEQ ID NO：49重链HVR-H1，PD1-0102

SEQ ID NO：50重链HVR-H2，PD1-0102

SEQ ID NO：51重链HVR-H3，PD1-0102

SEQ ID NO：52轻链HVR-L1，PD1-0102

SEQ ID NO：53轻链HVR-L2，PD1-0102

SEQ ID NO：54轻链HVR-L3，PD1-0102

SEQ ID NO：55重链可变域VH，PD1-0102

SEQ ID NO：56轻链可变域VL，PD1-0102

SEQ ID NO：57人源化变体-PD1-0103_01的重链可变域VH

SEQ ID NO：58人源化变体-PD1-0103_01的轻链可变域VL

SEQ ID NO：59人源化变体-PD1-0103_02的轻链可变域VL

SEQ ID NO：60人源化变体-PD1-0103_03的轻链可变域VL

SEQ ID NO：61人源化变体-PD1-0103_04的轻链可变域VL

SEQ ID NO：62人κ轻链恒定区

SEQ ID NO：63人λ轻链恒定区

SEQ ID NO：64自IgG1衍生的人重链恒定区

SEQ ID NO：65自IgG1衍生的具有突变L234A和L235A的人重链恒定区

SEQ ID NO：66自IgG1衍生的具有突变L234A，L235A和P329G的人重链恒定区

SEQ ID NO：67自IgG4衍生的人重链恒定区

SEQ ID NO：68例示性人PD1序列(无信号序列)

SEQ ID NO：69人PD1胞外域(ECD)

SEQ ID NO：70例示性人PD1序列(包括信号序列)

SEQ ID NO：71 PD1-0103和PD1-0103人源化变体PD1-0103-0312，PD1-0103-0313，PD1-0103-0314，和PD1-0103-0315的最小限度HVR1

SEQ ID NO：72 PD1-0103和PD1-0103人源化变体PD1-0103-0312，PD1-0103-0313，PD1-0103-0314，和PD1-0103-0315的最小限度HVR2

SEQ ID NO：73 PD1-0103和PD1-0103人源化变体PD1-0103-0312，PD1-0103-0313，PD1-0103-0314，和PD1-0103-0315的最小限度HVR3

SEQ ID NO：74 PD1-0103和PD1-0103人源化变体PD1-0103-0312，PD1-0103-0313，PD1-0103-0314，和PD1-0103-0315的最小限度LVR1

SEQ ID NO：75 PD1-0103和PD1-0103人源化变体PD1-0103-0312，PD1-0103-0313，PD1-0103-0314，和PD1-0103-0315的最小限度LVR2

SEQ ID NO：76 PD1-0103和PD1-0103人源化变体PD1-0103-0312，PD1-0103-0313，PD1-0103-0314，和PD1-0103-0315的最小限度LVR3

SEQ ID NO：77在依照Kabat编号方式的位置71，72，73处包含氨基酸序列RDN的FR-H3片段

下面列出抗PD1抗体PD1-0016(及其人源化型式PD1-0103-0312，PD1-0103-0313，PD1-0103-0314和PD1-0103-0315)，PD1-0098，PD1-0050，PD1-0069，PD1-0073，PD1-0078和PD1-0102的VH和VL域的氨基酸序列，包括标示的HVR(HVR为粗体，下划线字母)：

抗PD1 PD1-0103：

VH PD1-0103：

VL PD1-0103：

人源化抗PD1 PD1-0103型式PD1-0103-0312，PD1-0103-0313，PD1-0103-0314和 PD1-0103-0315：

VH PD1-0103-0312＝VH PD1-0103-0313＝VH PD1-0103-0314＝VH PD1-0103-0315：

VL PD1-0103-0312：

VL PD1-0103-0313：

VL PD1-0103-0314：

VL PD1-0103-0315：

抗PD1 PD1-0098：

VH PD1-0098：

VL PD1-0098：

VH：0050

VL：0050

VH：0069

VL：0069

VH：0073

VL：0073

VH：0078

VL：0078

VH：0102

VL：0102

下面列出本发明的具体实施方案：

1.一种分离的结合人PD1的抗体，其中该抗体结合在Asn58处糖基化的SEQ ID NO：70的糖基化人PD1的Asn58处的(核心)糖链。

2.依照实施方案1的抗体，其中该抗体另外结合人PD1的位置60至64，68，78至84，126至134的一个或多个氨基酸。

3.依照实施方案1或2任一项的抗体，其中该抗体以其重链在Asn58处结合该糖链。

4.依照实施方案2至3任一项的抗体，其中该抗体结合人PD1的位置61，62，64，83，126，128，132，134的一个或多个氨基酸。

5.依照实施方案2至3任一项的抗体，其中该抗体结合人PD1的位置61，62，64，83，126，128，132，134的氨基酸。

6.依照实施方案2至3任一项的抗体，其中该抗体结合人PD1的位置60，61，62，63，64，68，78，82，83，84，126，127，128，130，131，132，133，134的氨基酸。

7.依照实施方案1至6任一项的抗体，其中该抗体结合人PD1，其中该抗体结合在Asn58处糖基化的SEQ ID NO：70的糖基化人PD1的Asn58处的(核心)糖链内的第一和第二GlNac，FUC，BMA和MAN。

8.依照实施方案1至7任一项的抗体，其中该抗体显示与对在Asn58处糖基化的人PD1的结合相比降低的对未在Asn58处糖基化的SEQ ID NO：70的人PD1的结合。

9.一种分离的结合人PD1的抗体，其中该抗体包含

(a)包含SEQ ID NO：71的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO：72的氨基酸序列的HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO：73的氨基酸序列的HVR-H3；(d)包含SEQ ID NO：74的氨基酸序列的HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO：75的氨基酸序列的HVR-L2；和(f)包含SEQ ID NO：76的氨基酸序列的HVR-L3，和(g)在依照Kabat编号方式的位置71，72和73处包含(RDN的)SEQID NO：77的氨基酸序列的FR-H3。

10.依照实施方案9的分离的结合人PD1的抗体，其中该抗体

A)

i)包含SEQ ID NO：7的VH序列和SEQ ID NO：8的VL序列；

ii)或i)下的抗体的VH和VL的人源化变体；

或B)

i)包含SEQ ID NO：57的VH序列和SEQ ID NO：58的VL序列。

ii)包含SEQ ID NO：57的VH序列和SEQ ID NO：59的VL序列。

iii)包含SEQ ID NO：57的VH序列和SEQ ID NO：60的VL序列。

iv)包含SEQ ID NO：57的VH序列和SEQ ID NO：61的VL序列。

下面列出本发明的具体实施方案：

1.一种分离的结合人PD1的抗体，其中该抗体包含

2.一种分离的结合人PD1的抗体，其中该抗体包含

3.一种分离的结合人PD1的抗体，其中该抗体

A)

i)包含SEQ ID NO：7的VH序列和SEQ ID NO：8的VL序列；

ii)或i)下的抗体的VH和VL的人源化变体；

或B)

i)包含SEQ ID NO：57的VH序列和SEQ ID NO：58的VL序列；

ii)包含SEQ ID NO：57的VH序列和SEQ ID NO：59的VL序列；

iii)包含SEQ ID NO：57的VH序列和SEQ ID NO：60的VL序列；

iv)包含SEQ ID NO：57的VH序列和SEQ ID NO：61的VL序列；

或C)

i)包含SEQ ID NO：15的VH序列和SEQ ID NO：16的VL序列；

ii)或i)下的抗体的VH和VL的人源化变体；

或D)

i)包含SEQ ID NO：23的VH序列和SEQ ID NO：24的VL序列；

ii)或i)下的抗体的VH和VL的人源化变体；

或E)

i)包含SEQ ID NO：31的VH序列和SEQ ID NO：32的VL序列；

ii)或i)下的抗体的VH和VL的人源化变体；

或F)

i)包含SEQ ID NO：39的VH序列和SEQ ID NO：40的VL序列；

ii)或i)下的抗体的VH和VL的人源化变体；

或G)

i)包含SEQ ID NO：47的VH序列和SEQ ID NO：48的VL序列；

ii)或i)下的抗体的VH和VL的人源化变体；

或H)

i)包含SEQ ID NO：55的VH序列和SEQ ID NO：56的VL序列；

ii)或i)下的抗体的VH和VL的人源化变体。

4.一种分离的结合人PD1的抗体，其中该抗体

i)包含SEQ ID NO：7的VH序列和SEQ ID NO：8的VL序列；

ii)或i)下的抗体的VH和VL的人源化变体；

5.一种分离的结合人PD1的抗体，其中该抗体包含SEQ ID NO：57的VH序列和SEQID NO：58的VL序列。

6.一种分离的结合人PD1的抗体，其中该抗体包含SEQ ID NO：57的VH序列和SEQID NO：59的VL序列。

7.一种分离的结合人PD1的抗体，其中该抗体包含SEQ ID NO：57的VH序列和SEQID NO：60的VL序列。

8.一种分离的结合人PD1的抗体，其中该抗体包含SEQ ID NO：57的VH序列和SEQID NO：61的VL序列。

9.依照前述实施方案任一项的抗PD1抗体，

i)与包含具有SEQ ID NO：7的氨基酸序列的VH和具有SEQ ID NO：8的氨基酸序列的VL的抗PD-1抗体竞争对PD-1的结合；和/或

ii)结合人和食蟹猴PD-1；和/或

10.一种分离的结合PD1的抗体，其中该抗体在混合淋巴细胞反应(MLR)测定法中以10μg/ml的抗体浓度将异基因经刺激T细胞的肿瘤坏死因子阿尔法(TNFα)分泌增强200％或更多(在一个优选的实施方案，250％或更多)。

11.一种分离的结合PD1的抗体，其中该抗体在混合淋巴细胞反应(MLR)测定法中以10μg/ml的抗体浓度将异基因经刺激T细胞的干扰素伽马(IFNγ)分泌增强85％或更多(在一个优选的实施方案，90％或更多，在一个优选的实施方案，95％或更多)。

12.一种分离的结合人PD-1的抗体，其中该抗体：

i)与包含具有SEQ ID NO：7的氨基酸序列的VH和具有SEQ ID NO：8的氨基酸序列的VL的抗PD1抗体竞争对PD-1的结合；和/或

ii)结合人和食蟹猴PD-1；和

iii)以10μg/ml的抗体浓度将异基因经刺激T细胞的干扰素伽马(IFNγ)分泌增强85％或更多；和

13.依照前述实施方案任一项的抗体，其是单克隆抗体。

14.依照前述实施方案任一项的抗体，其是人，人源化，或嵌合抗体。

15.依照前述实施方案任一项的抗体，其是结合PD1的抗体片段。

16.依照前述实施方案任一项的抗体，其是全长IgG1抗体。

17.依照前述实施方案任一项的抗体，其是具有突变L234A，L235A和P329G(编号依照Kabat的EU索引)的全长IgG1抗体。

18.一种分离的核酸，其编码依照前述实施方案任一项的抗体。

19.一种宿主细胞，其包含实施方案19的核酸。

20.一种生成抗体的方法，其包括培养实施方案20的宿主细胞，使得该抗体生成

21.实施方案21的方法，其进一步包括自该宿主细胞回收该抗体。

22.一种药物配制剂，其包含依照实施方案1至18任一项的抗体和药学可接受载剂。

23.依照实施方案1至18任一项的抗体，其用作药物。

24.依照实施方案1至18任一项的抗体，其用于治疗癌症。

25.依照实施方案1至18任一项的抗体在制造药物中的用途。

26.实施方案26的用途，其中该药物用于治疗癌症。

27.一种治疗具有癌症的个体的方法，其包括对该个体施用有效量的实施方案1的抗体。

实施例

以下是本发明的方法和组合物的实施例。应理解鉴于上文提供的一般性描述，可以实践各种其他实施方案。

尽管为了清楚理解的目的已经通过举例说明的方式较为详细地描述了上述发明，说明书和实施例不应解释为限制发明范围。通过援引明确收录本文中引用的所有专利和科学文献的全部公开内容。

实施例1：抗PD-1抗体的生成

小鼠的免疫接种

对NMRI小鼠进行遗传免疫接种，其使用编码全长人PD-1的质粒表达载体通过皮内应用100ug载体DNA(质粒15300_hPD1-fl)，接着电穿孔(2个1000V/cm矩形脉冲，持续0.1ms，间隔0.125s；接着4个287.5V/cm矩形脉冲，持续10ms，间隔0.125s)进行。小鼠在第0，14，28，42，56，70，和84天连续接受6次免疫接种。在第36，78和92天采集血液并制备血清，用于通过ELISA进行的滴度测定(见下文)。选择具有最高滴度的动物在第96天通过静脉内注射50ug重组人PD1人Fc嵌合物进行强化，并通过在强化后3天融合脾细胞与骨髓瘤细胞系通过杂交瘤技术分离单克隆抗体。

血清滴度的测定(ELISA)

在PBS中以0.3ug/ml，100ul/孔在96孔NUNC Maxisorp板上固定化人重组PD1人Fc嵌合物，接着是：用含2％Crotein C的PBS，200ul/孔封闭板；应用抗血清的连续稀释液，一式两份，在含0.5％Crotein C的PBS中，100ul/孔；用HRP缀合的山羊抗小鼠抗体(JacksonImmunoresearch/Dianova115-036-071；1/16 000)检测。对于所有步骤，将板于37℃温育1小时。在所有步骤之间，将板用含0.05％Tween 20的PBS清洗3次。通过添加BM Blue POD底物溶液(Roche)，100ul/孔来发生信号；并通过添加1M HCl，100ul/孔来终止。于450nm读取吸光度，针对690nm作为参照。滴度定义为产生半最大信号的抗血清的稀释度。

实施例2：抗PD1抗体的表征

抗PD1抗体对人PD1的结合

针对人PD1的ELISA

将Nunc Maxisorp链霉亲合素包被板(MicroCoat#11974998001)用25μl/孔生物素化PD1-ECD-AviHis包被并于4℃温育过夜。清洗(3x90μl/孔PBST缓冲液)后，添加25μl抗PD1样品或参照抗体(人抗PD1；Roche/小鼠抗PD1；Biolegend；目录：329912)并于室温温育1小时。清洗(3x90μl/孔PBST缓冲液)后，以1:2000/1:1000稀释度添加25μl/孔山羊抗人H+L-POD(JIR，JIR109-036-088)/绵羊抗小鼠-POD(GE Healthcare；NA9310)并在摇床上于室温温育1小时。清洗(3x90μl/孔PBST缓冲液)后，添加25μl/孔TMB底物(Roche目录号11835033001)并温育直至OD 2–3。于370/492nm进行测量。

在下文汇总表2和3中作为EC50值[ng/ml]列出ELISA结果。

针对PD1的细胞ELISA

以0.01x10E6细胞/ml的浓度将用编码全长人PD1的质粒15311_hPD1-fl_pUC_Neo稳定转染并用G418(质粒上的新霉素抗性标志物)选择的贴壁CHO-K1细胞系接种入384孔平底板并生长过夜。

次日，添加25μl/孔PD1样品或人抗PD1(Roche)/小鼠抗PD1(Biolegend；目录：329912)参照抗体并于4℃温育2小时(以避免内在化)。小心清洗(1x90μl/孔PBST)后，通过添加30μl/孔在1xPBS缓冲液中稀释的0.05％戊二醛(Sigma，目录号：G5882，25％)并于室温温育10分钟来固定细胞。清洗(3x90μl/孔PBST)后，添加25μl/孔二抗进行检测：山羊抗人H+L-POD(JIR，JIR109-036-088)/绵羊抗小鼠-POD(GE NA9310)，接着在摇床上于室温温育1小时。清洗(3x90μl/孔PBST)后，添加25μl/孔TMB底物溶液(Roche11835033001)并温育直至OD1.0–2.0。于370/492nm测量板。

下文汇总表3中作为“EC50 CHO-PD1”值[ng/ml]列出细胞ELISA结果。

针对食蟹猴PD1的ELISA

将Nunc Maxisorp链霉亲合素包被板(MicroCoat#11974998001)用25μl/孔生物素化cynoPD1-ECD-生物素包被并于4℃温育过夜。清洗(3x90μl/孔PBST缓冲液)后，添加25μl抗PD1样品或参照抗体(人抗PD1；Roche)并在摇床上于室温温育1小时。清洗(3x90μl/孔PBST缓冲液)后，以1:1000稀释度添加25μl/孔山羊抗人H+L-POD(JIR，JIR109-036-088)并在摇床上于室温温育1小时。清洗(3x90μl/孔PBST缓冲液)后，添加25μl/孔TMB底物(Roche，11835033001)并温育直至OD 2–3。于370/492nm进行测量。

在下文汇总表2和3中作为EC50值[ng/ml]列出ELISA结果。

PD配体1置换测定法

将Nunc Maxisorp链霉亲合素包被板(MicroCoat#11974998001)用25μl/孔生物素化PD1-ECD-AviHis包被并于4℃温育过夜。清洗(3x90μl/孔PBST缓冲液)后，添加25μl抗PD1样品或参照抗体(小鼠抗PD1；Biolegend；目录：329912)并在摇床上于室温温育1小时。清洗(3x90μl/孔PBST缓冲液)后，添加25μl/孔PD-L1(重组人B7-H1/PD-L1 Fc嵌合物；156-B7，R&D)并在摇床上于室温温育1小时。清洗(3x90μl/孔PBST缓冲液)后，以1:1000稀释度添加25μl/孔山羊抗人H+L-POD(JIR，109-036-088)并在摇床上于室温温育1小时。清洗(3x90μl/孔PBST缓冲液)后，添加25μl/孔TMB底物(Roche，11835033001)并温育直至OD 2–3。于370/492nm进行测量。

在下文汇总表2中作为IC50值[ng/ml]列出ELISA结果。

PD配体2置换测定法

将Nunc Maxisorp链霉亲合素包被板(MicroCoat#11974998001)用25μl/孔生物素化PD1-ECD-AviHis包被并于4℃温育过夜。清洗(3x90μl/孔PBST缓冲液)后，添加25μl抗PD1样品或参照抗体(小鼠抗huPD1；Roche)并在摇床上于室温温育1小时。清洗(3x90μl/孔PBST缓冲液)后，添加25μl/孔PD-L2(重组人B7-DC/PD-L2 Fc嵌合物；1224-PL-100，R&D)并在摇床上于室温温育1小时。清洗(3x90μl/孔PBST缓冲液)后，以1:2000稀释度添加25μl/孔山羊抗人H+L-POD(JIR，109-036-088)并在摇床上于室温温育1小时。清洗(3x90μl/孔PBST缓冲液)后，添加25μl/孔TMB底物(Roche，11835033001)并温育直至OD 2–3。于370/492nm进行测量。

在下文汇总表2中作为IC50值[ng/ml]列出ELISA结果。

表位作图ELISA/结合竞争测定法

将Nunc Maxisorp板(Nunc#464718)用25μl/孔捕捉抗体(山羊抗小鼠IgG；JIR；115-006-071)包被并在摇床上于室温温育1小时。清洗(3x90μl/孔PBST缓冲液)后，将板用含有2％BSA的PBS缓冲液在摇床上于室温封闭1小时。清洗(3x90μl/孔PBST缓冲液)后，添加25μl小鼠抗PD1样品并在摇床上于室温温育1小时。清洗(3x90μl/孔PBST缓冲液)后，将捕捉抗体用30μl/孔小鼠IgG(JIR；015-000-003)在摇床上于室温封闭1小时。同时，将生物素化PD1-ECD-AviHis与第二样品抗体一起在摇床上于室温预温育1小时。清洗测定板(3x90μl/孔PBST缓冲液)后，将PD1抗体混合物转移至测定法并在摇床上于室温温育1小时。清洗(3x90μl/孔PBST缓冲液)后，以1:4000稀释度添加25μl/孔链霉亲合素POD(Roche，#11089153001)并在摇床上于室温温育1小时。清洗(3x90μl/孔PBST缓冲液)后，添加25μl/孔TMB底物(Roche，11089153001)并温育直至OD 1.5–2.5。于370/492nm进行测量。通过针对参照抗体的等级聚簇来定义表位组。

表2：例示性抗体的结合，PD-L1抑制和表位区分组(ELISA)

表3：自亲本小鼠抗体PD1-0103衍生的人源化PD1抗体的生化和细胞结合(ELISA)

人源化抗PD-1抗体的Biacore表征

已经使用基于表面等离振子共振(SPR)的测定法在数种鼠PD1结合物以及商业性人PD1结合参照之间测定结合的动力学参数。因此，通过胺偶联将抗人IgG固定化至(Biacore)CM5传感器芯片的表面。然后捕捉样品并使人PD1-ECD结合至它们。在每个分析循环后再生传感器芯片表面。最终通过将数据拟合至1:1Langmuir相互作用模型来得到平衡常数和动力学速率常数。

通过使用胺偶联试剂盒(GE Healthcare)于pH 5.0将约2000个响应单位(RU)的20μg/ml抗人IgG(GE Healthcare#BR-1008-39)偶联到Biacore T200中的CM5传感器芯片的流动室1和2(或者3和4)上。

样品和运行缓冲液是HBS-EP+(0.01M HEPES，0.15M NaCl，3mM EDTA，0.05％v/v表面活性剂P20，pH 7.4)。流动室温度设定为25℃，而样品隔室温度设定为12℃。用运行缓冲液使系统准备好。

样品以10nM的浓度注射20秒，并结合至第二流动室。然后在每份样品上注射一整套人PD1-ECD浓度(144nM，48nM，16nM，5.33nM，1.78nM，0.59nM，0.20nM和0nM)120秒，接着是解离时间30/300秒和3M MgCl₂溶液的两个20秒再生步骤，其中最后一个含有运行缓冲液的“注射后额外清洗”。

最终，用Biacore T200评估软件将双重参照数据拟合至1:1Langmuir相互作用模型。所得K_D，k_a和k_d值在表4中显示。

表4：通过Biacore(见下文)测定的嵌合PD1-0103和人源化PD1抗体的动力学速率常数和平衡常数

配体
				嵌合PD1-0103	3.86E+05	3.07E-04	0.8
PD1-0103-0312	1.95E+05	3.45E-04	1.8
				PD1-0103-0313	1.60E+05	3.67E-04	2.3
PD1-0103-0314	1.87E+05	2.79E-04	1.5
				PD1-0103-0315	1.89E+05	2.91E-04	1.5

如表4中显示的，嵌合PD1-0103的所有人源化型式(生成见实施例6)展示与亲本抗体(嵌合PD1-0103)相似的动力学特性。

动力学

将S系列CM5传感器安置到Biacore 4000系统中并依照制造商的说明书对检测点进行流体动力学编址。

在流动室1，2，3和4中的检测点1和5上以10 000Ru固定化多克隆家兔IgG抗体<IgGFCγM>R(Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc.)。经由EDC/NHS化学依照制造商的说明书进行偶联。流动室中的剩余点充当参照。样品缓冲液是补充有1mg/ml羧甲基葡聚糖的系统缓冲液。

在一个实施方案中，于25℃驱动测定法。在另一个实施方案中，于37℃驱动测定法。通过以10μl/min注射1分钟，在传感器表面上捕捉50nM每一种鼠单克隆抗体。随后，对于4分钟结合期时间，以30μl/min注射相应抗原的100nM，2x33nM，11nM，4nM，1nM浓度系列和系统缓冲液0nM。监测解离另外4分钟。使用以30μl/min注射10mM甘氨酸pH 1.5达3分钟来再生捕捉系统。使用Biacore评估软件依照制造商的说明书计算相关动力学数据。

表位作图

对Biacore 4000仪器安置Biacore CAP传感器并像制造商推荐的那样做好准备。仪器缓冲液是HBS-ET(10mM HEPES pH 7.4，150mM NaCl，3mM EDTA，0.005％w/v Tween20)。于25℃运行仪器。

在系统缓冲液中稀释所有样品。通过在流动室1，2，3和4中在点1和5中以30μl/min注射1分钟，以200RU在CAP传感器表面上捕捉35kDa生物素化抗原PD1-ECD-AviHis。点2，3和4充当参照。在另一个实施方案中，以相同方式以200RU在CAP传感器上捕捉35kDa生物素化抗原PD1-ECD-AviHis。

随后，以30μl/min注射100nM一抗达3分钟，接着以30μl/min注射100nM二抗达3分钟。注射一抗直至表面呈递抗原完全饱和。在一抗和二抗注射期结束时，设置报告点“晚结合”(BL)来监测相应抗体的结合响应。计算二抗结合响应“BL2”和一抗响应“BL1”之间的商，摩尔比。使用该摩尔比作为抗原早就被一抗复合时，二抗的抗原可及性的指标。

如制造商推荐的那样，通过以30μl/min注射2M盐酸胍250mM NaOH再生缓冲液达2分钟，自传感器表面完全去除复合物，接着以30μl/min注射系统缓冲液达1分钟。

实施例3：在混合淋巴细胞反应(MLR)中不同抗PD-1抗体对细胞因子生成的影响

3A)混合淋巴细胞反应(MLR)是一种免疫细胞测定法，其测量来自一名个体(供体X)的淋巴细胞活化来自另一名个体(供体Y)的淋巴细胞。使用混合淋巴细胞反应来证明阻断PD1途径至淋巴细胞效应细胞的影响。在抗PD1单抗存在或缺失下对该测定法中的T细胞测试活化和它们的IFNγ分泌。

为了实施异基因MLR，使用Leukosep(Greiner Bio One，227 288)通过密度梯度离心分离来自HLA型未知的至少四名健康供体的外周血单个核细胞(PBMC)。简言之，用3倍体积的PBS稀释肝素化血液样品并在50ml Leukosep管中铺放稀释血液的25ml等分试样。于室温以800x g离心15分钟(无中断)后，收获含有淋巴细胞的级分，在PBS中清洗并直接用于功能测定法或以1.0E+07个细胞/ml在冷冻介质(10％DMSO，90％FCS)中重悬浮并在液氮中保存。如下设置个体两路MLR反应，即以1:1刺激者/响应者细胞比混合来自两名不同供体的PBMC并至少一式两份在平底96孔板中在不同浓度范围的纯化的抗PD1单克隆抗体PD1-0050，PD1-0069，PD1-0073，PD1-0078，PD1-0098，PD1-0102，PD1-0103存在或缺失下于37℃，5％CO₂进行共培养6天。作为参照抗PD1抗体，合成包含纳武单抗(也称作MDX-5C4或MDX-1106)或帕姆单抗(也称作MK-3475或Org 1.09A)的VH和VL域并与人IgG1主链(具有突变L234A，L235A和P329G(Kabat的EU索引))一起克隆的抗体。使用无抗体或同种型对照抗体作为阴性对照并使用重组人IL-2(20EU/ml)作为阳性对照。第6天后，自每一份培养物取出100μl培养液用于测量细胞因子。使用OptEIA ELISA试剂盒(BD Biosciences)测量IFNγ的水平。

结果在表5中显示(IFN-g分泌/释放)。抗PD1单克隆抗体以浓度依赖性方式促进T细胞活化和IFNγ分泌。IFNg分泌的％升高值与不添加任何阻断性单抗的MLR(基础异基因刺激诱导的IFNg值作为E-c)和有添加20EU/ml重组人IL-2的MLR(阳性对照＝100％IFNg值作为E+c)的IFN-g生成相比计算并依照下面的公式计算：相对刺激[％]＝((E样品-E-c)/(E+c-E-c)*100

表5：异基因刺激和抗PD-1抗体处理后IFNγ分泌的百分比，与作为阳性对照的重组人IL-2处理(20EU/ml)(＝100％升高)的效果比较

	浓度(μg/ml)	1:12	1:120	1:1200	在MLR中的效果
						PD1-0050	44	136	96	33	+++
PD1-0069	60	76	71	55	+++
						PD1-0073	43	103	63	38	++
PD1-0078	64	99	72	21	++

通过增强干扰素γ(IFN-g)的分泌(没有显示所有抗体的数据)，数种PD1阻断性抗体PD1-0050，PD1-0069，PD1-0073，PD1-0078，PD1-0098，PD1-0102，PD1-0103展现强免疫调控活性。

3B)在又一项实验中，评估嵌合PD1-0103(具有突变L234A，L235A和P329G(Kabat的EU索引)的人IgG1同种型)。用嵌合PD1-0103阻断PD1强烈增强异基因的经刺激的原代人T细胞的IFNγ分泌。嵌合PD1-0103比参照抗PD1抗体更加有力(见图1)。

为了比较，使用合成包含纳武单抗(也称作MDX5C4或MDX-1106)和帕姆单抗(也称作MK-3475或Org 1.09A)的VH和VL域并与人IgG1主链(具有突变L234A，L235A和P329G(Kabat的EU索引))一起克隆的参照抗PD1抗体。

3C)在另外的实验中，在上文所述MLR中评估抗PD-1抗体PD1-0103的人源化变体(人源化抗体PD1-0103-0312，PD1-0103-0314，在图2和3中，还可见下文实施例6)的免疫调控活性，a)IFN释放(分泌)和b)TNFα释放(分泌)。将嵌合PD1-0103抗体及其人源化型式的效果与包含纳武单抗(也称作MDX5C4或MDX-1106)和帕姆单抗(也称作MK-3475或Org 1.09A)的VH和VL域且具有人IgG1主链(具有突变L234A，L235A和P329G(Kabat的EU索引))的参照抗PD1抗体进行比较。MLR培养6天后，取出50μl上清液并使用Bio-Plex Pro^TM人细胞因子Th1/Th2测定法(Bio-Rad Laboratories Inc.)在一份培养物中测量多种细胞因子(没有显示所有细胞因子的数据)。

嵌合PD1-0103抗体及其人源化型式(PD1-0103_0312和PD1-0103_0314)与参照抗PD1抗体相比在增强T细胞活化和IFNγ分泌方面更加有力(见图2)。

而且，嵌合PD1-0103抗体及其人源化变体提高抗原呈递细胞的肿瘤坏死因子α(TNFα)(见图3)和IL-12(数据未显示)分泌且增强单核细胞/巨噬细胞或抗原呈递细胞刺激T细胞的能力。

实施例4：抗PD-1阻断对与异基因成熟树突细胞共培养的人CD4 T细胞的细胞毒性粒酶B释放和IFN-γ分泌的影响

为了进一步调查抗PD-1处理在异基因设置中的效果，我们开发了一种测定法，其中将新鲜纯化的CD4 T细胞在单核细胞衍生的异基因成熟树突细胞(mDC)存在下共培养5天。1周前，经由塑胶粘附，接着去除非粘附细胞，自新鲜PBMC分离单核细胞。然后，通过将它们在含有GM-CSF(50ng/ml)和IL-4(100ng/ml)的培养基中培养5天，我们自单核细胞生成未成熟DC。为了诱导iDC成熟，我们对培养中的培养基添加TNF-α，IL-1β和IL-6(各50ng/ml)再过2天。然后，通过经由流式细胞术(LSRFortessa，BD Biosciences)测量它们II类主要组织相容性复合物(MHCII)，CD80，CD83和CD86的表面表达，我们评估DC成熟。

在最小限度混合淋巴细胞反应(mMLR)那天，经由微珠试剂盒(Miltenyi Biotec)自从无关供体获得的10⁸个PBMC富集CD4 T细胞。培养前，用5μM羧基-荧光素-琥珀酰亚胺基酯(CFSE)标记CD4 T细胞。然后在浓度为10μg/ml(若图中没有不同标示)的阻断性抗PD1抗体(PD1-0103，嵌合PD1-0103，或人源化抗体PD1-0103-0312，PD1-0103-0313，PD1-0103-0314，PD1-0103-0315，在图4A和4B中缩写为0312，0313，0314，0315)存在或缺失下在96孔板中与成熟异-DC一起(5:1)铺放10⁵个CD4 T细胞。

5天后，我们收集细胞培养物上清液，稍后用于通过ELISA(R&D systems)测量IFNγ水平，并将细胞在Golgi Plug(布雷菲德菌素A)和Golgi Stop(莫能菌素)存在下于37℃再放置5小时。然后，清洗细胞，在表面上用抗人CD4抗体和活/死可固定染料Aqua(Invitrogen)染色，之后用固定/透化缓冲液(BD Bioscience)固定/透化。我们实施了针对粒酶B(BD Bioscience)，IFNγ和IL-2(二者均来自eBioscience)的细胞内染色。结果在图4A和4B中显示。

我们还测试了不同浓度的人源化变体PD1-0103(人源化抗体PD1-0103-0312，PD1-0103-0313，PD1-0103-0314，PD1-0103-0315，在图中缩写为0312，0313，0314，0315，还可见下文实施例6)并发现它们在增强粒酶B和干扰素γ方面同等好。DP47是一种非结合性人IgG，具有Fc部分中的LALA突变以避免受到FcγR识别且用作阴性对照。

实施例5：嵌合抗体衍生物

生成了嵌合PD1抗体通过经由PCR扩增抗PD1小鼠抗体PD1-0098，PD1-0103的可变重和轻链区并将它们作为与具有消除效应器功能的突变L234A，L235A和P329G(Kabat的EU索引))(亮氨酸234变成丙氨酸，亮氨酸235至丙氨酸，脯氨酸329至甘氨酸)的人IgG1主链/人CH1-铰链-CH2-CH3的融合蛋白克隆入重链表达载体及作为与人Cκ的融合蛋白克隆入轻链表达载体。然后将LC和HC质粒共转染入HEK293并在7天后通过抗体纯化的标准方法自上清液纯化。将嵌合PD1抗体重命名为嵌合chiPD1-0098(chiPD1-0098)和嵌合PD1-0103(chiPD1-0103)。为了比较，使用合成包含纳武单抗(也称作MDX-5C4或MDX-1106)和帕姆单抗(也称作MK-3475或Org 1.09A)的VH和VL域并与人IgG1主链(具有突变L234A，L235A和P329G(Kabat的EU索引))一起克隆的参照抗PD1抗体。

实施例6：抗PD1抗体PD-0103的人源化变体(huMabPD-0103)的生成，表达和纯化及表征

鼠抗PD1抗体0103的VH和VL域的人源化

基于鼠抗PD1抗体0103的鼠VH和VL域的氨基酸序列(SEQ ID NO：7和8)，生成了人源化抗PD1抗体变体。

VH的人源化变体基于人种系IMGT_hVH_3_23，与具有数项突变的人J-元件种系IGHJ5-01组合(产生SEQ ID NO：57)。

VL的人源化变体基于人种系IMGT_hVK_4_1，IMGT_hVK_2_30，IMGT_hVK_3_11和IMGT_hVK_1_39，与人J-元件种系IGKJ1-01组合。不同突变产生人源化变体SEQ ID NO：58至SEQ ID NO：61。

将PD1-0103的重和轻链可变区的人源化氨基酸序列逆翻译成DNA并合成(GenArt)所得cNDA，然后作为与具有消除效应器功能的LALA和PG突变(亮氨酸234变成丙氨酸，亮氨酸235变成丙氨酸，脯氨酸329变成甘氨酸)的人IgG1主链/人CH1-铰链-CH2-CH3的融合蛋白克隆入重链表达载体或作为与人Cκ的融合蛋白克隆入轻链表达载体。然后将LC和HC质粒共转染入HEK293并在7天后通过抗体纯化的标准方法自上清液纯化。所得人源化PD1抗体命名如下：

表6：PD1-0103的人源化变体抗体的VH和VL序列

表7：PD1-0103的人源化变体抗体的HVR序列

如上文所述表征人源化PD1-0103抗体变体和亲本嵌合PD1-0103。结果在表8中显示。

表8：人源化PD1-0103抗体变体和亲本嵌合PD1-0103的结果的汇总

实施例7：PD-1抗体的中和效力

为了测试内部生成的PD-1抗体在体外在模拟恢复受到遏制的T细胞应答中的中和效力，使用可商购的PD1/PD-L1报告物测定法(Promega)。这个系统由PD1+NFAT Jurkat细胞和PD-L1+CHO对应物(其还给出活化信号)组成。原理上，报告物系统基于三个步骤：(1)TCR介导的NFAT活化，(2)活化后PD-1/PD-L1轴对NFAT信号的抑制和(3)PD-1阻断性抗体对NFAT信号的恢复。

材料和方法

·PD-L1培养基：PAN Biotech(#P04-03609)；FBS(10％)和L-Gln(4mM)

·测定培养基：RPMI 1640(#31870；Invitrogen)，25mM HEPES，2mM L-Gln，FBS(2％)

·用于这项测定法的细胞(两种细胞类型均购自Promega)：

PD-L1+CHO细胞(批号#139147)：2-3x10⁴个细胞/96孔

PD-1+NFAT Jurkat细胞(批号#133024：3.5x10⁴个细胞/孔

第1天，融化PD-L1+细胞，以所示细胞浓度在上文所述培养基中接种并于37℃和5％CO₂培养过夜。次日，去除培养基并将PD-L1+细胞与所示浓度的制备的抗体一起温育(在测定培养基中)。平行地，融化PD-1+NFAT Jurkat细胞并将上文所述细胞数转移至PD-L1+细胞并共培养。于37℃和5％CO₂温育6小时后，温热Bio-Glo底物至室温(在添加前1-2小时)。自温箱取出细胞培养板并调节至室温(10分钟)，之后添加每孔80μl Bio-Glo溶液，温育5-10分钟，之后在Tecan Infinite读数仪上依照试剂盒制造商的推荐测量发光。结果可以在图5A和5B中看到，其中显示了TCR刺激后不同PD-1抗体对PD-1/PD-L1介导的NFAT信号遏制的恢复：图5A：嵌合PD1-0103显示可再现的与参照抗体相比卓越的效果。作为参照，合成包含纳武单抗(也称作MDX-5C4或MDX-1106)的VH和VL域并与人IgG1主链(具有突变L234A，L235A和P329G(Kabat的EU索引))一起克隆的抗PD1抗体。图5B：PD1-0103的四种人源化变体展现与先导抗体相似的体外效力且略微优于参照抗体。

实施例8：Fab PD1-0103与PD-1外域的结晶

为了形成复合物，将Fab PD1-0103以1.1摩尔过量与PD-1外域混合。在冰上温育1小时后，将复合物去糖基化，其通过一个PNG酶步骤来去除不参与复合物形成的聚糖。以15mg/ml的浓度实施Fab片段PD1-0103(具有人CH1和CL)与PD-1ECD的复合物晶体的结晶筛选。于21℃设置结晶小滴，其通过在蒸气扩散坐滴实验中混合0.1μl蛋白质溶液与0.1μl储液。自各种含有PEG作为沉淀剂的条件出现晶体。在4天内自30％PEG1500出现用于测定结构的晶体并在7天内生长至0.03x0.06x0.02μm最终大小。

将晶体转移入补充有20％甘油作为防冻剂的储液，然后在液氮中骤冻。以SwissLight Source的束线X10SA于100K的温度用Pilatus 6M检测仪收集衍射图像并用XDS包[Kabsch,W.Automatic processing of rotation diffraction data from crystals ofinitially unknown symmetry and cell constants.J.Appl.Cryst.26,795-800(1993)]加工。合并来自一个晶体的数据以产生分辨率数据集，在空间群P1中，每个结晶学不对称单元中有两个复合物分子(见表1)。

通过分子置换测定结构，其中使用来自PDB-ID 3UTZ的Fab片段的坐标作为搜索模型。使用PDB-ID 3RRQ作为PD-1ECD的搜索坐标。将Fab分拆成恒定和可变域并在CCP4程序PHASER CCP4中实施这两项分开的搜索[CCP4(协同计算计划，N.The CCP4 suite:programsfor protein crystallography.Acta Crystallogr.D,760-763(1994)]以考虑肘角的可能变化。在COOT(Emsley,P.,Lohkamp,B.,Scott,WG.&Cowtan,K.Features and developmentof COOT.Acta Crystallogr.D Biol.Crystallogr.60,486-501(2010))中重建模型并用CCP4程序REFMAC精化。用程序BUSTER(Bricogne G.,Blanc E.,Brandl M.,Flensburg C.,Keller P.,Paciorek W.,Roversi P,Sharff A.,Smart O.S.,Vonrhein C.,Womack T.O.(2016).BUSTER version 2.11.6.Cambridge,United Kingdom:Global Phasing Ltd.)实施最终的精化步骤。

表9：FabPD1-0103-PD-1ECD晶体的数据收集和结构精化统计量

¹ 圆括号中的值指最高分辨率仓。

² R_合并＝Σ|I-<I>|/ΣI，其中I是强度。

³ R_工作＝Σ|F_o-<F_c>|/ΣF_o，其中F_o是观察的且F_c是计算的结构因子振幅。

⁴ R_自由是基于精化期间省略的全部数据的5％计算的。

Fab PD1-0103与PD-1外域的复合物的结构测定

为了详细表征表位和互补位，我们测定PD-1外域与Fab PD1-0103的复合物的晶体结构至的分辨率。结构揭示Fab PD1-0103识别由BC和FG环区及由PD-1V型Ig域的前β片层的β链残基CC’FG形成的表位。另外，该表位包括位置Asn58(它是PD-1的BC环的一部分)处的N连接的糖基化树。除了轻链CDR2以外，Fab PD1-0103的所有CDR对互补位有贡献。

PD-1的的表面积受到Fab PD1-0103覆盖，归于重链且归于轻链。用程序PISA分析结合界面揭示Fab PD1-0103与PD-1ECD的相互作用样式，其经由6个氢键和范德华力。侧链氢键在重链CDR1(Thr33)和CDR2(Ser52，Arg56，Asp57)残基与PD-1的BC环的Glu61和Ser62之间形成。范德华接触主要由轻和重链的CDR3(特别是HCDR3的Phe105)及由HCDR1的Tyr32驱动，它们与BC环的Val64，Pro83及与FG环的Ile126和Leu128残基距离近。别的范德华接触在FG环残基Pro130，Ala132，Ile134与Fab PD1-0103的重链的CDR2和轻链的CDR3之间观察到。Fab PD1-0103的轻链唯独接触PD-1的FG环。轻链的CDR2不提供接触来形成复合物。

PD-1的位置Asn58处的N连接的糖基化树是表位的一部分且仅仅与FabPD1-0103的重链的残基相互作用。

PD-1的位置Asn58处的核心糖链(N连接的糖基化)树就单糖而言具有下面的结构。

[FUC]＝α-L-岩藻糖

[BMA]＝β-D-甘露吡喃糖

[MAN]＝α-D-甘露吡喃糖

该糖链中的第一个GlcNAC是岩藻糖基化的，缩写为GlcNAc(FUC)。

在该结构中，除了一个甘露糖单元以外，核心聚糖在电子密度方面得到较好限定。岩藻糖模块指向由PD-1与CDR1和CDR2形成的亲水性口袋。岩藻糖的结合得到CDR1的Ser30和Ser31与PD-1的Glu61和Gln99一起的氢键网络的配合。别的接触由第一个GlcNac对Arg56和框架残基Arg72，Asp73，Asn74对Man的氢键提供。

表10：PD1–Fab PD1-0103重链接触的列表

接触通过的距离截留来鉴定

PD1	PD-103的HC
		Ser60	Asp57，Tyr59
Glu61	Thr33，Ser52，Gly53，Gly54，Arg56，Asp57
		Ser62	Thr33，Ser52，Asp57，Phe105
Phe63	Phe105
		Val64	Gly101，Arg102，Phe105
Tyr68	Tyr104
		Lys78	Arg102
Phe82	Ser31
		Pro83	Ser31，Tyr32
Glu84	Tyr32
		Ile126	Gly101，Tyr104，Phe105
Ser127	Phe105
		Leu128	Tyr59，Leu99，Phe105
Pro130	Tyr59
		Ile134	Tyr104

表11：PD1–Fab PD1-0103轻链接触的列表

接触通过的距离截留来鉴定

表12：PD1的Asn58处的核心糖链–Fab PD1-0103重链的接触的列表

接触通过的距离截留来鉴定

总结

·PD1上的表位类似平坦表面

->结合主要通过PD1的CDR3和前b片层

·相互作用涉及极性和范德华接触

·PD1与Fab重链的相互作用表面积大

·位置Asn58处的糖基化参与PD1对Fab片段的结合

·岩藻糖单元占据由PD1和Fab PD1-0103的重链形成的口袋

实施例9：与对在Asn58处糖基化的人PD1的结合相比降低的抗体对在Asn58处未糖基化的人PD1的结合(抗PD-1抗体对糖基化和非糖基化重组PD1的Biacore表征)

已经使用基于表面等离振子共振(SPR)的测定法在糖基化PD1和非糖基化重组人PD1之间测定结合的动力学参数。因此，通过胺偶联将抗人IgG固定化至(Biacore)CM5传感器芯片的表面。然后捕捉样品并使人PD1-ECD结合它们。在每个分析循环后再生传感器芯片表面。最终通过将数据拟合至1:1Langmuir相互作用模型来得到平衡常数和动力学速率常数。

样品以10nM的浓度注射20秒，并结合至第二流动室。然后在每份样品上注射一整套人PD1-ECD(糖基化的或非糖基化的)浓度(200nM，66.6nM，22.2nM，7.4nM，2.46nM和0nM)200秒，接着是解离时间0/2000秒(66.6nM和22.2nM)和3M MgCl₂的两个20秒再生步骤，其中最后一个含有运行缓冲液的“注射后额外清洗”。

最终，用Biacore T200评估软件将双重参照数据拟合至1:1Langmuir相互作用模型。所得K_D，k_a和k_d值在表13中显示。

表13：通过Biacore测定的动力学速率常数和平衡常数

配体	样品
					PD1-0103-0312	在Asn58处无糖基化的PD1	3.36E+05	2.70E-02	8.02E-08
PD1-0103-0312	在Asn58处糖基化的PD1	7.77E+05	7.46E-05	9.61E-11
					帕姆单抗	在Asn58处无糖基化的PD1	1.51E+06	2.46E-03	1.63E-09
帕姆单抗	在Asn58处糖基化的PD1	1.87E+06	4.50E-03	2.41E-09
					纳武单抗	在Asn58处无糖基化的PD1	5.49E+05	3.66E-03	6.66E-09
纳武单抗	在Asn58处糖基化的PD1	4.44E+05	1.63E-03	3.68E-09

与帕姆单抗和纳武单抗形成对比，PD-103-0312对无糖基化和糖基化PD-1的结合之间有明显区别(还可见图13A和13B)。

实施例10：PD1抗体与针对CEA的T细胞双特异性抗体组合的体内抗肿瘤功效

通过以后续过继性转移人造血干细胞来条件化NOG小鼠，生成人源化动物。所得小鼠展示范围为20至85％人衍生细胞的人和小鼠白细胞之间的嵌合比。在此类模型中，T细胞是功能性的且能被结合CEA和CD3的双特异性抗体(其记载于WO2014/131712)活化以杀死肿瘤细胞。然后给此类人源化动物在侧面位置皮下注射1x10⁶个CEA阳性肿瘤细胞，MKN45胃癌。通过一周三次用操作员指导卡尺测量肿瘤的3维轴，可评估肿瘤生长(图14A和B)。注射肿瘤后第9天，基于肿瘤尺寸将小鼠随机化以具有均质的动物组并开始治疗性处理。媒介组(图14A和14B，圆圈)除外，一周两次以2.5mg/kg的剂量给所有小鼠组静脉内施用CEACD3TCB。另外，还用一种组合配偶处理每一个小鼠组：抗PD1(PD1-0103-0312)，腹膜内每周0.15mg/kg(图14A，方形)或每周1.5mg/kg(图14B，方形)；纳武单抗，腹膜内每周0.15mg/kg(图14A，菱形)或每周1.5mg/kg(图14B，菱形)。随时间显示一个处理组内的肿瘤尺寸均值。每一个组由9-10只小鼠构成且继续测量直至每个组有至少3只小鼠。已经计算标准化曲线下面积(sAUC)并使用单因素ANOVA分析来计算统计学显著性。

序列表

<110> 豪夫迈·罗氏有限公司（F. Hoffmann-La Roche AG）

<120> 抗PD1抗体及使用方法

<130> P33103-WO

<150> EP15188061.4

<151> 2015-10-02

<160> 77

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 7

<212> PRT

<213> 小鼠（Mus Musculus）

<400> 1

Gly Phe Ser Phe Ser Ser Tyr

1 5

<210> 2

<211> 3

<212> PRT

<213> 小鼠（Mus Musculus）

<400> 2

Gly Gly Arg

1

<210> 3

<211> 9

<212> PRT

<213> 小鼠（Mus Musculus）

<400> 3

Thr Gly Arg Val Tyr Phe Ala Leu Asp

1 5

<210> 4

<211> 11

<212> PRT

<213> 小鼠（Mus Musculus）

<400> 4

Ser Glu Ser Val Asp Thr Ser Asp Asn Ser Phe

1 5 10

<210> 5

<211> 3

<212> PRT

<213> 小鼠（Mus Musculus）

<400> 5

Arg Ser Ser

1

<210> 6

<211> 6

<212> PRT

<213> 小鼠（Mus Musculus）

<400> 6

Asn Tyr Asp Val Pro Trp

1 5

<210> 7

<211> 120

<212> PRT

<213> 小鼠（Mus Musculus）

<400> 7

Glu Val Ile Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Thr Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Asp Trp Val

35 40 45

Ala Thr Ile Ser Gly Gly Gly Arg Asp Ile Tyr Tyr Pro Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Glu Met Ser Ser Leu Met Ser Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys

85 90 95

Val Leu Leu Thr Gly Arg Val Tyr Phe Ala Leu Asp Ser Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 8

<211> 111

<212> PRT

<213> 小鼠（Mus Musculus）

<400> 8

Lys Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Thr Ser

20 25 30

Asp Asn Ser Phe Ile His Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser Pro

35 40 45

Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Ser Ser Thr Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Arg Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asp

65 70 75 80

Pro Val Glu Ala Asp Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Tyr

85 90 95

Asp Val Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 9

<211> 8

<212> PRT

<213> 小鼠（Mus Musculus）

<400> 9

Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp Tyr

1 5

<210> 10

<211> 3

<212> PRT

<213> 小鼠（Mus Musculus）

<400> 10

Tyr Ser Gly

1

<210> 11

<211> 9

<212> PRT

<213> 小鼠（Mus Musculus）

<400> 11

His Gly Ser Ala Pro Trp Tyr Phe Asp

1 5

<210> 12

<211> 12

<212> PRT

<213> 小鼠（Mus Musculus）

<400> 12

Ser Gln Asn Ile Val His Ser Asp Gly Asn Thr Tyr

1 5 10

<210> 13

<211> 3

<212> PRT

<213> 小鼠（Mus Musculus）

<400> 13

Lys Val Ser

1

<210> 14

<211> 6

<212> PRT

<213> 小鼠（Mus Musculus）

<400> 14

Gly Ser His Phe Pro Leu

1 5

<210> 15

<211> 120

<212> PRT

<213> 小鼠（Mus Musculus）

<400> 15

Asp Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln

1 5 10 15

Ser Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Thr Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp

20 25 30

Tyr Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln Phe Pro Gly Asp Lys Leu Glu Trp

35 40 45

Leu Gly Tyr Ile Thr Tyr Ser Gly Phe Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu

50 55 60

Lys Ser Arg Ile Ser Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Phe

65 70 75 80

Leu Gln Leu Asn Ser Val Ala Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Trp His Gly Ser Ala Pro Trp Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Arg

100 105 110

Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 16

<211> 112

<212> PRT

<213> 小鼠（Mus Musculus）

<400> 16

Asp Val Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Asn Ile Val His Ser

20 25 30

Asp Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Asn Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Arg Arg Phe Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly

85 90 95

Ser His Phe Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys

100 105 110

<210> 17

<211> 8

<212> PRT

<213> 小鼠（Mus Musculus）

<400> 17

Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp Tyr

1 5

<210> 18

<211> 3

<212> PRT

<213> 小鼠（Mus Musculus）

<400> 18

Tyr Thr Gly

1

<210> 19

<211> 9

<212> PRT

<213> 小鼠（Mus Musculus）

<400> 19

Met Asp Tyr Tyr Gly Ser Thr Leu Asp

1 5

<210> 20

<211> 11

<212> PRT

<213> 小鼠（Mus Musculus）

<400> 20

Ser Glu Ser Val Asp Arg Tyr Gly Asn Ser Phe

1 5 10

<210> 21

<211> 3

<212> PRT

<213> 小鼠（Mus Musculus）

<400> 21

Arg Ala Ser

1

<210> 22

<211> 6

<212> PRT

<213> 小鼠（Mus Musculus）

<400> 22

Asn Asn Glu Asp Pro Tyr

1 5

<210> 23

<211> 120

<212> PRT

<213> 小鼠（Mus Musculus）

<400> 23

Asp Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln

1 5 10 15

Ser Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Thr Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp

20 25 30

Tyr Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln Phe Pro Gly Asn Lys Leu Glu Trp

35 40 45

Met Gly Tyr Ile Thr Tyr Thr Gly Arg Thr Ser Tyr Asn Pro Ser Leu

50 55 60

Lys Ser Arg Ile Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Phe

65 70 75 80

Leu Gln Leu Asn Ser Val Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Glu Met Asp Tyr Tyr Gly Ser Thr Leu Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 24

<211> 111

<212> PRT

<213> 小鼠（Mus Musculus）

<400> 24

Lys Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Arg

1 5 10 15

Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Arg Tyr

20 25 30

Gly Asn Ser Phe Ile His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro

35 40 45

Lys Val Leu Ile Tyr Arg Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Phe Pro Ala

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Arg Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asp

65 70 75 80

Pro Val Glu Ala Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Asn

85 90 95

Glu Asp Pro Tyr Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 25

<211> 7

<212> PRT

<213> 小鼠（Mus Musculus）

<400> 25

Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr

1 5

<210> 26

<211> 3

<212> PRT

<213> 小鼠（Mus Musculus）

<400> 26

Tyr Ser Gly

1

<210> 27

<211> 7

<212> PRT

<213> 小鼠（Mus Musculus）

<400> 27

Gly Ile Thr Thr Gly Phe Ala

1 5

<210> 28

<211> 11

<212> PRT

<213> 小鼠（Mus Musculus）

<400> 28

Ser Lys Gly Val Ser Thr Ser Ser Tyr Ser Phe

1 5 10

<210> 29

<211> 3

<212> PRT

<213> 小鼠（Mus Musculus）

<400> 29

Tyr Ala Ser

1

<210> 30

<211> 6

<212> PRT

<213> 小鼠（Mus Musculus）

<400> 30

Ser Arg Glu Phe Pro Trp

1 5

<210> 31

<211> 118

<212> PRT

<213> 小鼠（Mus Musculus）

<400> 31

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Arg Pro Gly Val

1 5 10 15

Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr

20 25 30

Ala Met His Trp Val Lys Gln Ser His Ala Arg Thr Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Val Ile Ser Thr Tyr Ser Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Asp Lys Ala Thr Met Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Glu Leu Ala Arg Met Thr Ser Glu Asp Ser Ala Ile Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Leu Gly Ile Thr Thr Gly Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Leu Val Thr Val Ser Ala

115

<210> 32

<211> 111

<212> PRT

<213> 小鼠（Mus Musculus）

<400> 32

Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Lys Gly Val Ser Thr Ser

20 25 30

Ser Tyr Ser Phe Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Arg Gln Pro Pro

35 40 45

Lys Leu Leu Ile Lys Tyr Ala Ser Tyr Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His

65 70 75 80

Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys His His Ser Arg

85 90 95

Glu Phe Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 33

<211> 7

<212> PRT

<213> 小鼠（Mus Musculus）

<400> 33

Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr

1 5

<210> 34

<211> 3

<212> PRT

<213> 小鼠（Mus Musculus）

<400> 34

Gly Gly Arg

1

<210> 35

<211> 5

<212> PRT

<213> 小鼠（Mus Musculus）

<400> 35

Tyr Tyr Gly Ile Asp

1 5

<210> 36

<211> 7

<212> PRT

<213> 小鼠（Mus Musculus）

<400> 36

Ser Gln Asp Val Thr Thr Ala

1 5

<210> 37

<211> 3

<212> PRT

<213> 小鼠（Mus Musculus）

<400> 37

Trp Ala Ser

1

<210> 38

<211> 6

<212> PRT

<213> 小鼠（Mus Musculus）

<400> 38

His Tyr Ser Ile Pro Trp

1 5

<210> 39

<211> 116

<212> PRT

<213> 小鼠（Mus Musculus）

<400> 39

Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr

20 25 30

Gly Met Ser Trp Ile Arg Gln Thr Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Thr Ile Ser Gly Gly Gly Arg Asp Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Val Lys Asn Asn Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Phe Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Ser Tyr Tyr Tyr Gly Ile Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val

100 105 110

Thr Val Ser Ser

115

<210> 40

<211> 107

<212> PRT

<213> 小鼠（Mus Musculus）

<400> 40

Asp Ile Val Met Thr Gln Pro His Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Arg Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Thr Thr Ala

20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Trp Ala Ser Thr Arg His Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala

65 70 75 80

Glu Asp Leu Ala Leu Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Ser Ile Pro Trp

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 41

<211> 7

<212> PRT

<213> 小鼠（Mus Musculus）

<400> 41

Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Thr

1 5

<210> 42

<211> 3

<212> PRT

<213> 小鼠（Mus Musculus）

<400> 42

Ser Asp Ser

1

<210> 43

<211> 3

<212> PRT

<213> 小鼠（Mus Musculus）

<400> 43

Pro Phe Asp

1

<210> 44

<211> 7

<212> PRT

<213> 小鼠（Mus Musculus）

<400> 44

Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala

1 5

<210> 45

<211> 3

<212> PRT

<213> 小鼠（Mus Musculus）

<400> 45

Ser Ala Ser

1

<210> 46

<211> 6

<212> PRT

<213> 小鼠（Mus Musculus）

<400> 46

His Tyr Ser His Pro Phe

1 5

<210> 47

<211> 114

<212> PRT

<213> 小鼠（Mus Musculus）

<400> 47

Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Thr

20 25 30

Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Ala Ile Asp Pro Ser Asp Ser Tyr Thr Thr Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Ser Thr Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Arg Ser Pro Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val

100 105 110

Ser Ser

<210> 48

<211> 107

<212> PRT

<213> 小鼠（Mus Musculus）

<400> 48

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser His Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala

20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Ala Ile Ser Ser Val Gln Ala

65 70 75 80

Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Ser His Pro Phe

85 90 95

Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 49

<211> 8

<212> PRT

<213> 小鼠（Mus Musculus）

<400> 49

Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Gly Tyr

1 5

<210> 50

<211> 3

<212> PRT

<213> 小鼠（Mus Musculus）

<400> 50

Ser Ser Gly

1

<210> 51

<211> 6

<212> PRT

<213> 小鼠（Mus Musculus）

<400> 51

Arg Asn Trp Tyr Phe Asp

1 5

<210> 52

<211> 13

<212> PRT

<213> 小鼠（Mus Musculus）

<400> 52

Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser Gly Thr Gln Lys Asn Tyr

1 5 10

<210> 53

<211> 3

<212> PRT

<213> 小鼠（Mus Musculus）

<400> 53

Trp Ala Ser

1

<210> 54

<211> 6

<212> PRT

<213> 小鼠（Mus Musculus）

<400> 54

Asp Tyr Thr Phe Pro Leu

1 5

<210> 55

<211> 117

<212> PRT

<213> 小鼠（Mus Musculus）

<400> 55

Asp Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Asp Leu Val Lys Pro Ser Gln

1 5 10 15

Ser Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Thr Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Gly

20 25 30

Tyr Ser Trp His Trp Ile Arg Gln Phe Pro Gly Asn Lys Leu Glu Trp

35 40 45

Met Gly Phe Ile His Ser Ser Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu

50 55 60

Lys Ser Arg Ile Ser Phe Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Phe

65 70 75 80

Leu Gln Leu Ser Ser Leu Thr Asp Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Thr Tyr Arg Asn Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Ala Gly Thr Thr

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 56

<211> 113

<212> PRT

<213> 小鼠（Mus Musculus）

<400> 56

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Thr Val Thr Ala Gly

1 5 10 15

Glu Lys Val Thr Met Arg Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser

20 25 30

Gly Thr Gln Lys Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln

35 40 45

Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val

50 55 60

Pro Asn Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr

65 70 75 80

Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ser Val Tyr Tyr Cys Gln Ser

85 90 95

Asp Tyr Thr Phe Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Leu

100 105 110

Lys

<210> 57

<211> 120

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 人源化变体 - PD1-0103_01的重链可变域VH

<400> 57

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Thr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Thr Ile Ser Gly Gly Gly Arg Asp Ile Tyr Tyr Pro Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Val Leu Leu Thr Gly Arg Val Tyr Phe Ala Leu Asp Ser Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 58

<211> 111

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 人源化变体 - PD1-0103_01的轻链可变域VL

<400> 58

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ala Ser Glu Ser Val Asp Thr Ser

20 25 30

Asp Asn Ser Phe Ile His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro

35 40 45

Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Ser Ser Thr Leu Glu Ser Gly Val Pro Asp

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser

65 70 75 80

Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Tyr

85 90 95

Asp Val Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 59

<211> 111

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 人源化变体 - PD1-0103_02的轻链可变域VL

<400> 59

Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly

1 5 10 15

Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Thr Ser

20 25 30

Asp Asn Ser Phe Ile His Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser Pro

35 40 45

Arg Leu Leu Ile Tyr Arg Ser Ser Thr Leu Glu Ser Gly Val Pro Asp

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser

65 70 75 80

Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Tyr

85 90 95

Asp Val Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 60

<211> 111

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 人源化变体 - PD1-0103_03的轻链可变域VL

<400> 60

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Thr Ser

20 25 30

Asp Asn Ser Phe Ile His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro

35 40 45

Arg Leu Leu Ile Tyr Arg Ser Ser Thr Leu Glu Ser Gly Ile Pro Ala

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser

65 70 75 80

Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Tyr

85 90 95

Asp Val Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 61

<211> 111

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 人源化变体 - PD1-0103_04的轻链可变域VL

<400> 61

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Thr Ser

20 25 30

Asp Asn Ser Phe Ile His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro

35 40 45

Arg Leu Leu Ile Tyr Arg Ser Ser Thr Leu Glu Ser Gly Ile Pro Ala

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser

65 70 75 80

Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Tyr

85 90 95

Asp Val Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 62

<211> 107

<212> PRT

<213> 人（Homo Sapiens）

<400> 62

Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu

1 5 10 15

Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe

20 25 30

Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln

35 40 45

Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser

50 55 60

Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu

65 70 75 80

Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser

85 90 95

Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

100 105

<210> 63

<211> 105

<212> PRT

<213> 人（Homo Sapiens）

<400> 63

Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu

1 5 10 15

Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe

20 25 30

Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val

35 40 45

Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys

50 55 60

Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser

65 70 75 80

His Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu

85 90 95

Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser

100 105

<210> 64

<211> 330

<212> PRT

<213> 人（Homo Sapiens）

<400> 64

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

100 105 110

Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

115 120 125

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

130 135 140

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

145 150 155 160

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

165 170 175

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

180 185 190

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

195 200 205

Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

210 215 220

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu

225 230 235 240

Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

245 250 255

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

260 265 270

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

275 280 285

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn

290 295 300

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

305 310 315 320

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

325 330

<210> 65

<211> 330

<212> PRT

<213> 人（Homo Sapiens）

<400> 65

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

100 105 110

Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

115 120 125

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

130 135 140

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

145 150 155 160

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

165 170 175

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

180 185 190

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

195 200 205

Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

210 215 220

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu

225 230 235 240

Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

245 250 255

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

260 265 270

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

275 280 285

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn

290 295 300

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

305 310 315 320

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

325 330

<210> 66

<211> 330

<212> PRT

<213> 人（Homo Sapiens）

<400> 66

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

100 105 110

Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

115 120 125

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

130 135 140

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

145 150 155 160

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

165 170 175

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

180 185 190

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

195 200 205

Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

210 215 220

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu

225 230 235 240

Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

245 250 255

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

260 265 270

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

275 280 285

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn

290 295 300

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

305 310 315 320

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

325 330

<210> 67

<211> 327

<212> PRT

<213> 人（Homo Sapiens）

<400> 67

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg

1 5 10 15

Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr

65 70 75 80

Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro

100 105 110

Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys

115 120 125

Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val

130 135 140

Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp

145 150 155 160

Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe

165 170 175

Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp

180 185 190

Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu

195 200 205

Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg

210 215 220

Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys

225 230 235 240

Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp

245 250 255

Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys

260 265 270

Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser

275 280 285

Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser

290 295 300

Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser

305 310 315 320

Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys

325

<210> 68

<211> 268

<212> PRT

<213> 人（Homo Sapiens）

<400> 68

Pro Gly Trp Phe Leu Asp Ser Pro Asp Arg Pro Trp Asn Pro Pro Thr

1 5 10 15

Phe Ser Pro Ala Leu Leu Val Val Thr Glu Gly Asp Asn Ala Thr Phe

20 25 30

Thr Cys Ser Phe Ser Asn Thr Ser Glu Ser Phe Val Leu Asn Trp Tyr

35 40 45

Arg Met Ser Pro Ser Asn Gln Thr Asp Lys Leu Ala Ala Phe Pro Glu

50 55 60

Asp Arg Ser Gln Pro Gly Gln Asp Cys Arg Phe Arg Val Thr Gln Leu

65 70 75 80

Pro Asn Gly Arg Asp Phe His Met Ser Val Val Arg Ala Arg Arg Asn

85 90 95

Asp Ser Gly Thr Tyr Leu Cys Gly Ala Ile Ser Leu Ala Pro Lys Ala

100 105 110

Gln Ile Lys Glu Ser Leu Arg Ala Glu Leu Arg Val Thr Glu Arg Arg

115 120 125

Ala Glu Val Pro Thr Ala His Pro Ser Pro Ser Pro Arg Pro Ala Gly

130 135 140

Gln Phe Gln Thr Leu Val Val Gly Val Val Gly Gly Leu Leu Gly Ser

145 150 155 160

Leu Val Leu Leu Val Trp Val Leu Ala Val Ile Cys Ser Arg Ala Ala

165 170 175

Arg Gly Thr Ile Gly Ala Arg Arg Thr Gly Gln Pro Leu Lys Glu Asp

180 185 190

Pro Ser Ala Val Pro Val Phe Ser Val Asp Tyr Gly Glu Leu Asp Phe

195 200 205

Gln Trp Arg Glu Lys Thr Pro Glu Pro Pro Val Pro Cys Val Pro Glu

210 215 220

Gln Thr Glu Tyr Ala Thr Ile Val Phe Pro Ser Gly Met Gly Thr Ser

225 230 235 240

Ser Pro Ala Arg Arg Gly Ser Ala Asp Gly Pro Arg Ser Ala Gln Pro

245 250 255

Leu Arg Pro Glu Asp Gly His Cys Ser Trp Pro Leu

260 265

<210> 69

<211> 150

<212> PRT

<213> 人（Homo Sapiens）

<400> 69

Pro Gly Trp Phe Leu Asp Ser Pro Asp Arg Pro Trp Asn Pro Pro Thr

1 5 10 15

Phe Ser Pro Ala Leu Leu Val Val Thr Glu Gly Asp Asn Ala Thr Phe

20 25 30

Thr Cys Ser Phe Ser Asn Thr Ser Glu Ser Phe Val Leu Asn Trp Tyr

35 40 45

Arg Met Ser Pro Ser Asn Gln Thr Asp Lys Leu Ala Ala Phe Pro Glu

50 55 60

Asp Arg Ser Gln Pro Gly Gln Asp Cys Arg Phe Arg Val Thr Gln Leu

65 70 75 80

Pro Asn Gly Arg Asp Phe His Met Ser Val Val Arg Ala Arg Arg Asn

85 90 95

Asp Ser Gly Thr Tyr Leu Cys Gly Ala Ile Ser Leu Ala Pro Lys Ala

100 105 110

Gln Ile Lys Glu Ser Leu Arg Ala Glu Leu Arg Val Thr Glu Arg Arg

115 120 125

Ala Glu Val Pro Thr Ala His Pro Ser Pro Ser Pro Arg Pro Ala Gly

130 135 140

Gln Phe Gln Thr Leu Val

145 150

<210> 70

<211> 288

<212> PRT

<213> 人（Homo Sapiens）

<400> 70

Met Gln Ile Pro Gln Ala Pro Trp Pro Val Val Trp Ala Val Leu Gln

1 5 10 15

Leu Gly Trp Arg Pro Gly Trp Phe Leu Asp Ser Pro Asp Arg Pro Trp

20 25 30

Asn Pro Pro Thr Phe Ser Pro Ala Leu Leu Val Val Thr Glu Gly Asp

35 40 45

Asn Ala Thr Phe Thr Cys Ser Phe Ser Asn Thr Ser Glu Ser Phe Val

50 55 60

Leu Asn Trp Tyr Arg Met Ser Pro Ser Asn Gln Thr Asp Lys Leu Ala

65 70 75 80

Ala Phe Pro Glu Asp Arg Ser Gln Pro Gly Gln Asp Cys Arg Phe Arg

85 90 95

Val Thr Gln Leu Pro Asn Gly Arg Asp Phe His Met Ser Val Val Arg

100 105 110

Ala Arg Arg Asn Asp Ser Gly Thr Tyr Leu Cys Gly Ala Ile Ser Leu

115 120 125

Ala Pro Lys Ala Gln Ile Lys Glu Ser Leu Arg Ala Glu Leu Arg Val

130 135 140

Thr Glu Arg Arg Ala Glu Val Pro Thr Ala His Pro Ser Pro Ser Pro

145 150 155 160

Arg Pro Ala Gly Gln Phe Gln Thr Leu Val Val Gly Val Val Gly Gly

165 170 175

Leu Leu Gly Ser Leu Val Leu Leu Val Trp Val Leu Ala Val Ile Cys

180 185 190

Ser Arg Ala Ala Arg Gly Thr Ile Gly Ala Arg Arg Thr Gly Gln Pro

195 200 205

Leu Lys Glu Asp Pro Ser Ala Val Pro Val Phe Ser Val Asp Tyr Gly

210 215 220

Glu Leu Asp Phe Gln Trp Arg Glu Lys Thr Pro Glu Pro Pro Val Pro

225 230 235 240

Cys Val Pro Glu Gln Thr Glu Tyr Ala Thr Ile Val Phe Pro Ser Gly

245 250 255

Met Gly Thr Ser Ser Pro Ala Arg Arg Gly Ser Ala Asp Gly Pro Arg

260 265 270

Ser Ala Gln Pro Leu Arg Pro Glu Asp Gly His Cys Ser Trp Pro Leu

275 280 285

<210> 71

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> PD1-0103和PD1-0103人源化变体PD1-0103-0312, PD1-0103-0313, PD1-0103-0314和PD1-0103-0315的最小限度HVR1

<400> 71

Ser Ser Tyr Thr

1

<210> 72

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> PD1-0103和PD1-0103人源化变体PD1-0103-0312, PD1-0103-0313, PD1-0103-0314和PD1-0103-0315的最小限度HVR2

<400> 72

Ser Gly Gly Gly Arg Asp Ile Tyr

1 5

<210> 73

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> PD1-0103和PD1-0103人源化变体PD1-0103-0312, PD1-0103-0313, PD1-0103-0314和PD1-0103-0315的最小限度HVR3

<400> 73

Gly Arg Val Tyr Phe

1 5

<210> 74

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> PD1-0103和PD1-0103人源化变体PD1-0103-0312, PD1-0103-0313, PD1-0103-0314和PD1-0103-0315的最小限度LVR1

<400> 74

Thr Ser Asp Asn Ser Phe

1 5

<210> 75

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> PD1-0103和PD1-0103人源化变体PD1-0103-0312, PD1-0103-0313, PD1-0103-0314和PD1-0103-0315的最小限度LVR2

<400> 75

Arg Ser Ser Thr Leu Glu Ser

1 5

<210> 76

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> PD1-0103和PD1-0103人源化变体PD1-0103-0312, PD1-0103-0313, PD1-0103-0314和PD1-0103-0315的最小限度LVR3

<400> 76

Asn Tyr Asp Val Pro Trp

1 5

<210> 77

<211> 3

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 在依照Kabat编号方式的位置71, 72, 73处包含氨基酸残基RDN的FR-H3片段

<400> 77

Arg Asp Asn

1

Claims

1.一种分离的结合人PD1的抗体，其中该抗体

i)包含SEQ ID NO：57的VH序列和SEQ ID NO：58的VL序列；或

ii)包含SEQ ID NO：57的VH序列和SEQ ID NO：59的VL序列；或

iii)包含SEQ ID NO：57的VH序列和SEQ ID NO：60的VL序列；或

iv)包含SEQ ID NO：57的VH序列和SEQ ID NO：61的VL序列。

2.一种分离的结合人PD1的抗体，其中该抗体包含SEQ ID NO：57的VH序列和SEQ IDNO：58的VL序列。

3.一种分离的结合人PD1的抗体，其中该抗体包含SEQ ID NO：57的VH序列和SEQ IDNO：59的VL序列。

4.一种分离的结合人PD1的抗体，其中该抗体包含SEQ ID NO：57的VH序列和SEQ IDNO：60的VL序列。

5.一种分离的结合人PD1的抗体，其中该抗体包含SEQ ID NO：57的VH序列和SEQ IDNO：61的VL序列。

6.依照权利要求1至5任一项的抗体，其是具有突变L234A，L235A和P329G的全长IgG1抗体，编号依照Kabat的EU索引。

7.一种分离的核酸，其编码依照权利要求1至6任一项的抗体。

8.一种宿主细胞，其包含权利要求7的核酸。

9.一种生成抗体的方法，其包括培养权利要求8的宿主细胞，使得该抗体生成。

10.权利要求9的方法，其进一步包括自该宿主细胞回收该抗体。

11.一种药物配制剂，其包含依照权利要求1至6任一项的抗体和药学可接受载剂。

12.依照权利要求1至6任一项的抗体在制造用于治疗胃癌的药物中的用途。