JP2018093750A - 核酸増幅反応用デバイス - Google Patents

Abstract

【課題】簡単、安全、且つ迅速に遺伝子検査即ち核酸増幅反応を実施できる核酸増幅反応用デバイスの提供。【解決手段】デバイスの上面にノズルから滴下され、核酸を含む液体試料を接受する試料滴下部１０１を有するケーシング１００と、ケーシングの端部から外向きに突出し内部に収納空間を有すると共に、測定装置内に装着可能に形成される反応チューブ２００と、核酸を担持するフィルタ３０１と、ケーシング内に収納され、試料滴下部の真下において、フィルタが液体試料に接液する滴下位置とフィルタが反応チューブの収納空間内に位置決めされる反応位置とを取り得るように、フィルタを支持するフィルタ支持体３００と、接液位置にあるフィルタに圧着してフィルタが接液する液体試料を吸収する圧着位置と、圧着位置から移動してフィルタの移動を自由にする離脱位置とを取り得る吸収材４０１とを備える核酸増幅反応用デバイス。【選択図】図４

Description

本発明は、標的とする核酸の塩基配列を検出又は同定するための核酸増幅反応に用いる核酸増幅反応用デバイスに関する。

本発明は、簡単な測定装置と共に用いることで、好ましくはＰＯＣＴとして臨床の現場に応用可能となる。

ＰＯＣＴとは、Ｐｏｉｎｔ ｏｆ Ｃａｒｅ Ｔｅｓｔｉｎｇの略であり、「被検者の傍らで行われる検査、あるいは被検者自らが行う検査であり、検査時間の短縮及び、その場での検査（被検者に見える検査）という利点を有する検査である。

そして、迅速かつ適切な診療・看護、疾病の予防、健康管理などの医療の質、ＱＯＬ（Ｑｕａｌｉｔｙ ｏｆ ｌｉｆｅ）及び満足度の向上に資するための検査である」と定義されている（ＰＯＣＴガイドライン，日本臨床検査自動化学会発行）。

近年、生命科学分野の発展は著しく、ＤＮＡ及びＲＮＡなどの核酸の解析技術は、広く利用されている。

核酸の解析技術は、例えば、生物学分野では生物種の同定や起源の研究など、医療分野では病気の診断など、また、日常生活に近い分野では食糧の安心・安全のための農産物の産地特定や遺伝子組換え作物の有無などにも利用されている。

医療分野における病気の診断、特に、早期の感染症の迅速診断において、核酸の解析技術のうちＰＣＲ法や等温核酸増幅法などを使用して自己に存在しない外来遺伝子の特徴的な遺伝子配列などの標的核酸を増幅し解析する技術（以下、遺伝子検査と略す）は、従来の感染症診断技術である培養検査や免疫検査（抗原又は抗体などを使用した検査）などと比較して、高感度で特異性の優れた検査の方法である。

そして、遺伝子検査は、ヒトに感染症を引き起こす原因となるほとんどの細菌、真菌、原虫、及び、ウイルスなどの原因微生物を、検出又は同定することが可能であるため、専用の検査室又は実験室を持つ基幹病院など規模の大きな病院、衛生研究所、大学や企業などの研究施設、その他の人員が充実した施設などにおいて頻用されている。

更に、検査薬における遺伝子検査市場は年々拡大してきており、感染症早期診断の観点のみでなく、経済活動の観点からもその重要度を増していくものと考えられている。

しかしながら、遺伝子検査は、一般の人が受診する機会の多い医療施設、例えば、身近にある個人病院又は診療所などにおいて、院内の検査にはほとんど利用されていないのが現状である。

その原因として、遺伝子検査は、実施前に用時の試薬調製や核酸の前処理の操作が必要であり、これらの操作が煩雑で、手間がかかることが挙げられる。

そのため、他の業務と同時に対応することが難しく、このような施設では限られた人員の労力を遺伝子検査に限定することとなり、他の業務に支障を及ぼすなど、施設全体の負担が大きくなることが挙げられる。

又、別の原因として、このような施設において、核酸の前処理を実施するために遠心機やマイクロピペットなどの理化学機器を揃えることや遺伝子検査の自動化機器を導入することは、高額な初期投資費用と維持管理費が必要となることが挙げられる。

更に、別の原因として、このような施設内の医師や看護師などの人員の多くが、遺伝子検査に十分に習熟した人員ではないことが挙げられる。

その一方で、免疫検査、例えば、標識抗体法、免疫比濁法、ラテックス凝集法、及び、イムノクロマトグラフィー法などのＰＯＣＴに対応した検査キットは、専用の検査室又は実験室を持たない医療施設においても、感染症の診断に広く利用されている。

例えば、インフルエンザ抗原迅速検査キットは、厚生労働省が平成２７年度（２０１５／２０１６年）シーズンの提供予定テスト数量としては約２，７９５万人分と発表しており、このことからもＰＯＣＴ化されたインフルエンザ抗原迅速検査キットは全国的に十分に普及したものと考えられている。

しかしながら、感染症の迅速診断、特に早期の迅速診断において、免疫検査では、検体中に含有される抗原又は抗体濃度が低いために十分な検査結果を得ることができず、このような場合は検体中から原因微生物を分離して培養する操作などが行われることがある。

原因微生物の分離培養は、専用の設備及び専門的な知識を有した実施者による無菌的な操作、さらには、数日の期間を必要とするなど、労力と時間を要するものであり、設備の整った規模の大きい病院や大学病院などを除いては容易に実施することはできない。また、培養が困難な微生物なども存在する。

一方、核酸を標的とした遺伝子検査は、免疫検査よりも感度が高い方法と考えられているため、抗原や抗体の確保が困難な場合や高感度な検出結果が求められる場合において非常に有効である。

しかしながら、免疫検査のＰＯＣＴキット並みに簡便化された遺伝子検査のキットが存在しない為、小さな医療施設などで遺伝子検査が実施されることはほとんどなく、多くの場合は検体の回収を行うのみで外部施設に検査委託を行うだけとなり、結果を知るまでに時間がかかってしまっている。

したがって、遺伝子検査をＰＯＣＴ化することは、小さな医療施設においても、迅速な遺伝子検査を実施可能となり、感染症の早期診断における前述の課題を解決するためにも非常に有用となる。

現在、実施されている遺伝子検査の工程は、大きく４つに分割することができる。

それらは、
（１）検体を採取した後、細胞壁や細胞膜を破壊して細胞内の核酸を露出させ固相担体などに捕捉する工程、
（２）有機溶媒などを用いてタンパク質などの夾雑物を洗浄排除又は分離を行い核酸のみを単離する工程、
（３）分離した核酸を鋳型にして核酸増幅反応により標的核酸を増幅させる工程、及び、
（４）核酸増幅反応後に、増幅した標的核酸を直接、またはマーカーを結合させたプローブなどを使用して間接的に検出し、定性又は定量の解析を行う工程
である。

一般的に遺伝子検査を行う場合には、これらの工程を手作業または個別の理化学機器などでひとつずつ行っていくため、作業が非常に煩雑であり時間もかかる。

すなわち前処理においては溶媒の準備、遠心分離、乾燥などの操作が入ることもあり、核酸増幅反応では多くの試薬成分を分取、混合して反応試薬の調製を行う必要がある。

実際の、核酸増幅反応では、温度の上昇・下降の繰り返しが必要であるために専用装置（サーマルサイクラー）も必要である。

増幅産物の検出はゲル電気泳動により増幅産物を検出する方法や、プローブの蛍光物質のシグナルを測定する方法など様々であるが、いずれも専用の測定装置が必要であり、ここでも時間と経費を要する。

また、試薬の調製では酵素などを数μＬから数十μＬ分注するが、量が微量であるため、分注忘れや誤差が発生する可能性があり、多くの作業工程における操作はコンタミネーションを発生しやすいという問題もあった。

このような状況において、パッケージングされた単独のデバイスの中で核酸の捕捉、洗浄、増幅反応、検出まで全てを実行できるようなデバイスも考案されてきている。

特許文献１（特表２００６−５１８２２１号公報）は、サンプルの処理（法）を開示する。

このものでは、剥離可能なシールで分割された９つのセグメントを有し、予めパックされた試薬が使用される。

フレキシブル小管内で各セグメントに必要な試薬液をそれぞれ充填、シール封入しておき、装置の複雑な制御動作により、各セグメントに対してアクチュエータ、クランプを動作させて、順次解放したり押し出したりしながら、混合や洗浄などを行うことができる。

磁性シリカビーズに捕捉、洗浄された遺伝子は、最終的に反応液中に溶出されて増幅反応を経て検出される。

磁性シリカビーズは、磁場供給源で磁場を生成して捕捉されたり、磁場の除去により解放されたりする。

このように、全ての工程がひとつのデバイス内で完結できるが、デバイス内の各エリアの試薬の準備や封入、装置側の複雑な制御機構、磁場の供給源など技術的な難易度は高く、デバイス・装置共に製造コストがかなり高価になると考えられる。

特許文献２（特開２０１４−８９２０１号公報）は、流体制御処理システムを開示する。

これによると、デバイス内の複数のチャンバ、すなわち試料チャンバ、溶解物チャンバ、洗浄チャンバ、廃棄物チャンバ、主要混合チャンバを、ロータリー弁の回転によりポートで選択的に連結する流体制御システムによって、必要な液体成分をマイクロ流路で移動させて流体試料処理領域にて順次、遺伝子の前処理の工程が進められる。

送液には、ピストンの上下運動による減圧や加圧の力が用いられ、最終的な主要混合チャンバ内の混合物は反応容器へとブランチを通って移動して、増幅反応と検出を行う。

こちらも全ての工程がひとつのデバイス内で完結できるが、やはりデバイス内の多くのエリアの試薬の準備や封入、測定装置側のピストンやロータリー弁回転など複雑な制御機構などで、デバイス・測定装置共にかなり製造コストが高価になると考えられる。
特表２００６−５１８２２１号公報 特開２０１４−８９２０１号公報

以上に鑑み本発明は、簡単、安全、且つ迅速に遺伝子検査すなわち核酸増幅反応を実施できる核酸増幅反応用デバイスを提供することを目的とする。

第１の発明に係る核酸増幅反応用デバイスは、上面にノズルから滴下され、核酸を含む液体試料を接受する試料滴下部を有するケーシングと、ケーシングの端部から外向きに突出し内部に収納空間を有すると共に、測定装置内に装着可能に形成される反応チューブと、試料液体に含まれる核酸を担持するフィルタと、ケーシング内に収納され、試料滴下部の真下において、フィルタが液体試料に接液する滴下位置とフィルタが反応チューブの収納空間内に位置決めされる反応位置とを取り得るように、フィルタを支持するフィルタ支持体と、接液位置にあるフィルタに圧着してフィルタが接液する液体試料を吸収する圧着位置と、圧着位置から移動してフィルタの移動を自由にする離脱位置とを取り得る吸収材とを備える。

第２の発明に係る核酸増幅反応用デバイスは、第１の発明に加え、洗浄液を担持する洗浄液ポットと、洗浄液ポット内の洗浄液を試料滴下部へ流動可能とする部材とを更に備える。

好ましくは、フィルタ支持体は、押圧部により駆動されて、滴下位置から反応位置へ移動可能に支持される。
好ましくは、反応チューブは、透明素材からなる。
好ましくは、反応チューブが、核酸増幅反応に必要な試薬の少なくとも一部を保持する。
好ましくは、反応チューブに保持される、核酸増幅反応に必要な試薬の少なくとも一部は、熱融解性の高分子化合物を含み、反応前には固形化またはゲル化されており、核酸増幅反応における加熱で液状となる。
好ましくは、吸収材が、濾紙、高分子吸収材又はガラス繊維濾紙からなる吸水性柔軟素材からなる。
好ましくは、フィルタにシリカ粒子を固着されている。
好ましくは、フィルタが高分子メンブレンからなる。

さらに好ましくは、フィルタが、親水性ＰＴＦＥ（ポリテトラフルオロエチレン）からなる。
好ましくは、フィルタ支持体が、核酸増幅反応に必要な試薬の少なくとも一部を保持する。

本発明によれば、次の利点が得られる。
（１）測定者は、煩雑な試薬調製や操作の処理工程が必要なく、迅速で簡便な遺伝子検査が可能となる。
（２）高感度で精度よい検査ができるのみならず、一般的な遺伝子検査で起こりがちであるコンタミネーションの問題も低減できる。
（３）さらに、核酸増幅反応用デバイスの工夫により、シンプルな駆動操作で遺伝子の捕捉、洗浄、増幅反応などが可能となり、測定装置も含めて遺伝子検査の低コスト化が実現される。

（発明の骨子）
具体的な実施の形態を説明するに先立ち、以下、本発明の骨子を述べる。

比較的簡単な動作で機能するように構成された本核酸増幅反応用デバイスは、そのための操作機構が簡略化されるから、結果的に専用の測定装置も安価に作製できる。

これにより、本発明の遺伝子検査システムを用いると、簡便、迅速であり、さらに低コストで検査を行える。

本発明によると、必要な成分は、ほとんど核酸増幅反応用デバイス１０の中に存在し、試薬の構成数は少なく、操作についても専用の測定装置の簡単な駆動によって行われるため、試薬や測定装置の生産コスト面のメリットがあるのみでなく、測定操作時のトラブルも低減できると考えられる。

本発明によると、測定者は、液体試料をデバイス１０の試料滴下部１０１に滴下して専用の測定装置７００にセットするだけでよく、一定の反応時間後に結果を得ることができる。

デバイス１０が測定装置７００に挿入されると、デバイス１０の反応チューブ２００が、核酸増幅反応が行われる測定装置７００の温調ブロック７０３にしっかりと差し込まれて固定される。

本技術の重要なポイントは、試料滴下部１０１に滴下された試料中の遺伝子を、デバイス１０内のフィルタ３０１上に捕捉・洗浄した後に、核酸増幅反応を行う前述の固定された反応チューブ２００内に移動させることである。

測定前の初期状態においては、デバイス１０内にフィルタ３０１と反応チューブ２００がそれぞれ離れた位置に設置されており、試料滴下部１０１に試料を滴下することで、目的の遺伝子は、試料がフィルタ３０１を通過する際にフィルタ３０１上に捕捉される。

測定装置７００に設けられる押圧子１を駆動して、洗浄液を封入した洗浄液ポット１２０を移動させ、フィルタ３０１に同ポット１２０内の洗浄液を供給して遺伝子の洗浄を行う。

フィルタ３０１は、フィルタ支持体３００に担持されているが、デバイス１０の内部において、支柱５０１が吸収材設置板４００及びフィルタ支持体３００に当接し、フィルタ３０１に吸収材４０１を押さえつけるようにして圧着している。

測定装置７００の押圧子２を駆動して、支柱５０１を移動させると、圧着から解放された、フィルタ支持体３００及びフィルタ３０１は、移動可能な状態となる。

測定装置７００の押圧子３は、デバイス１０の外部からフィルタ支持体３００、就中、その駆動用リブ３０３を移動させて、フィルタ３０１を反応チューブ２００の内部深くまで移動させ、試薬２０１と接触させる。

こうして、フィルタ３０１に捕捉された試料中の遺伝子は、洗浄後に反応チューブ２００に挿入され、反応チューブ２００内にあらかじめ充填された核酸増幅反応用の試薬２０１と共に、測定装置７００の温調ブロック７０３において加温、冷却を繰り返すなどの温度制御を行い、核酸増幅反応を行うことができる。

具体的には、図１に示すように、まず検査者は、遺伝子を抽出するために専用の抽出容器８０１内に患者検体を採取して抽出を行い、滴下ノズル８００を使ってデバイス１０の試料滴下部１０１に滴下する。

そして、図２に示すように、試料の吸収を確認後に、このデバイス１０を専用装置７００に挿入する。

滴下された試料中の遺伝子は、フィルタ支持体３００に担持されたフィルタ３０１上に捕捉され、不要な液体はフィルタ３０１の下面に圧着する吸収材４０１に吸収されることで排除される。

なお、フィルタ３０１上には、遺伝子の捕捉効率を上げるためにシリカ粒子を塗布するのが好ましい。

デバイス１０には、内部に洗浄液が充填された洗浄液ポット１２０が移動可能にセットされており、同ポット１２０の分注口は、突き破り可能な素材でシールされている。

洗浄液ポット１２０は、測定装置７００の押圧子１が外部から力を加えることで移動し、デバイス１０内の突き破り突起１１１によりシール材が突き破られることで、内部の洗浄液がシュート１０１ｂを介して試料滴下部１０１に排出される。

洗浄液は、フィルタ３０１上の遺伝子を洗浄した後に、フィルタ３０１を通過し吸収材４０１に吸収される。

ここで、試料滴下部１０１から供給される試料や洗浄液は、毛細管現象によりフィルタ３０１を通過してスムーズに下面の吸収材４０１まで浸出させる必要があるため、フィルタ３０１は、試料滴下部１０１と吸収材４０１に上下からしっかりと挟み込まれるように圧着されている。

そして、吸収材４０１は、液体を十分に吸収できる容積を持っており、吸収材設置板４００に固定されており、この吸収材設置板４００が、さらに支柱板５００に下方から支えられることで、フィルタ３０１を間接的に押さえて圧着している。

測定装置７００の押圧子２が、支柱板５００を移動させると、吸収材設置板４００の載置部４０２が支柱５０１から外れ、吸収材設置板４００は、フィルタ支持体２００と共に圧着状態から解放される。

このことにより、フィルタ支持体３００のフィルタ３０１も、試料滴下部１０１と吸収材４０１に挟み込まれた圧着状態から解放される。その後、測定装置７００の押圧子３が、フィルタ支持体３００、就中、駆動用リブ３０３を移動させて、フィルタ３０１を反応チューブ２００内へと挿入させる。

反応チューブ２００は、核酸増幅反応及び検出のために必要な試薬２０１をその内部にあらかじめ含んでおり、試薬２０１は、測定装置７００の温調ブロック７０３に挿入された時点で固定されている。

フィルタ支持体３００のフィルタ３０１に捕捉された遺伝子は、反応チューブ２００内に移動して、試薬２０１と接触し、その後、測定装置７００の温調ブロック７０３による温度制御（温度の上昇、下降の繰り返しなど）により遺伝子の増幅反応を行うことができる。

増幅反応後には、測定装置７００の蛍光測定ユニット７０４により、反応チューブ２００内の増幅産物を検出して、目的の遺伝子の有無を判定できる。

このように、本発明は、デバイス１０の内部構造や機構を工夫することで、測定者が試料を滴下して専用測定装置７００に設置するだけで、迅速かつ簡便な遺伝子検査を行えるように構成されている。

以下図面を参照しながら、本発明の実施の形態について、さらに具体的に説明する。

図１は、本発明の一実施の形態における試料滴下時の核酸増幅反応用デバイスの斜視図、図２は、同測定装置の斜視図、図３は、同測定装置の原理を示す平面図、図４は、同核酸増幅反応用デバイスの分解斜視図である。

本核酸増幅反応用デバイス１０は、次の要素を備える。
図１に示すように、上側ケーシング１００は、上面にノズル８００から滴下され、核酸を含む液体試料を接受する試料滴下部１０１を有する。検査者は、核酸を含む液体試料を収納した抽出容器８０１を、そのノズル８００が下向きとなるように手８０２で把持し、ノズル８００から適量を試料滴下部１０１に滴下する。試料滴下部１０１の最底部には、吐出口１０１ａが開設され、その直下にはフィルタ３０１が位置決めされる。

反応チューブ２００は、上側ケーシング１００の図１左側端部から外向きに突出し内部に収納空間を有すると共に、測定装置７００内に装着可能に形成される。

フィルタ３０１は、試料液体に含まれる核酸を担持する。フィルタ支持体３００は、上側ケーシング１００と下側ケーシング６００との内部に収納され、試料滴下部１０１の吐出口１０１ａの真下において、フィルタ３０１が液体試料に接液する滴下位置と、フィルタ３０１が反応チューブ２００の収納空間内に位置決めされる反応位置とを取り得るように、フィルタ３０１を支持する。

吸収材４０１は、接液位置にあるフィルタ３０１に圧着してフィルタ３０１が接液する液体試料を吸収する圧着位置と、圧着位置から移動してフィルタの移動を自由にする離脱位置とを取り得る。

洗浄液ポット１２０は、洗浄液を担持し、洗浄用ポットカバー１１０から洗浄液ポット１２０側へ突出する突き破り突起１１１は、洗浄液ポット１２０のアルミシールを突き破り、洗浄液ポット１２０内の洗浄液を、試料滴下部１０１に臨むように設けられたシュート１０１ｂを介し、試料滴下部１０１へ流動可能とする。

次に、測定装置７００について、図２、図３を参照しながら説明する。図２に示すように、本形態の測定装置７００は、前面が約３０度斜め上方を向くように傾斜する略台形箱形状をなし、その前面に、モニタ画面７０２とドア７０５とが設けられる。

モニタ画面７０２は、検査者に現在の動作状況を表示するものであり、必要に応じてプリンタの機能を追加しても良い。

ドア７０５は、外部から測定装置７００の内部構造を保護するために設けられ、本形態では、ドア７０５の上端縁が蝶番（図示せず。）により、測定装置７００の天板部に開閉自在に取り付けられる。

図２に示すように、ドア７０５を開くと、測定装置７００の前面のうち、右側の部分が外部に露呈する。この部分には、デバイス１０を挿入可能な挿入口７０１が配設される。

検査者は、図１に示した液体試料の滴下を行った後、反応チューブ２００が先を向くようにデバイス１０のデバイス保持部１０２を把持し、デバイス１０を挿入口７０１に差し込む。

挿入口７０１も上述と同様に、約３０度斜め上方に傾斜しているため、デバイス１０も同様に傾いてセットされることになる。

この後、検査者は、測定装置７００に操作指示を与えるだけで良く、核増幅反応に必要なプロセスは、測定装置７００内で自動的に実行される。

デバイス１０は、約３０度の角度で測定装置にセットされ、反応チューブは測定装置の温調ブロック内にしっかり収まるようになっている。

ここでデバイス１０を、角度をつけて斜めに測定装置７００に挿入する理由は、滴下した液が試料滴下部１０１からこぼれ出ることがなく、かつ、反応チューブ２００内において核酸増幅反応のために必要な液状の試薬２０１が、温調ブロック７０３部にとどまるために必要な角度を維持することである。

角度が大き過ぎて垂直方向に近づくと、反応チューブ２００内の試薬２０１は底部に収まり温調ブロック７０３に接しやすくなって、反応は適正に進むが、滴下した試料や洗浄液が操作途中でデバイス１０外に流れ出てしまうリスクがある。

一方、角度が小さ過ぎて水平方向に近づくと、滴下した試料は試料滴下部１０１からこぼれ出るリスクは少なくなるが、反応チューブ２００内の試料２０１が底部にうまく納まらず、その結果、温調ブロック７０３の温度制御が効かず核酸増幅反応がうまく進まないリスクが出てくる。

上述のように、デバイス１０がセットされると、図３に示すように、反応チューブ２００の先端部が、温調ブロック７０３に挿入され、デバイス１０は測定装置７００内で静止する状態となる。

温調ブロック７０３には、ペルチェ素子（図示せず。）が内蔵されており、後述する温度条件に従い、反応チューブ２００内の核酸を含む成分の温度が調整される。

温調ブロック７００がペルチェ素子により温度の上昇、下降を繰り返し、これを反応チューブ２００内の試薬２０１に伝達させて反応させるため、反応チューブ２００は、できるだけ薄い素材で温度伝導率がよいものを用いるとよい。

熱を伝わりやすくするため、反応チューブ２００と温調ブロック７００とは、できるだけ隙間なく接触させることが望ましい。

また、測定装置７００内には、蛍光測定ユニット７０４が収納されている。同ユニット７０４は、蛍光を発する発光体７０４ａと、蛍光の光路を調整して、蛍光を反応チューブ２００内の成分に照射すると共に、反射された蛍光を透過する光学系７０４ｃと、透過された蛍光（試薬２０１が発する蛍光シグナル）を受信し、信号を生成する受光センサ７０４ｂとを有する。

温調ブロック７０３の一部に小さな窓を開けて、蛍光測定ユニット７０４によって、内部の試薬２０１が発する蛍光シグナルを測定することも可能である。

なお、測定装置７００内に位置決めされたデバイス１０に対し、外力を付与する押圧子１、２、３（図６、図１０、図１１参照。）をそれぞれ駆動する、リニア駆動系（図示せず。）が測定装置７００内に設けられている。

次に、図４、図５及び図８等を参照しながら、デバイス１０の内部構造（特に、低い部分）の詳細を説明する。なお、図４では、各部材の上下関係が、組み立て後と概ね一致するように記載されている。

最も低い部材は、下側ケーシング６００であり、下側ケーシング６００は、それより上方の部材を支持するものであるが、図８（ｂ）に示すように、反応チューブ２００とは反対側の底部に、押圧子２を挿通可能とするため、開口部６０２が開けられており、開口部６０２の両脇に、一対のストッパ６０１、６０１が上向きに突設される。

下側ケーシング６００の真上には、支柱板５００が載置される。支柱板５００には、その上の吸収材設置板４００の載置部４０２の下面を支持する、一対の支柱５０１、５０１が立設される。また、支柱板５００の反応チューブ２００の反対側には、開口部６０２を塞がないように、一対のリブが形成される。これらのリブの先端部は、外向きカギ状に曲げられたロック部５０２となっている。さらに、図８（ｂ）に示すように、一対のリブの中央部に、押圧部５０３が形成されている。

ここで、通常の状態では、図８（ｂ）に示すように、ロック部５０２とストッパ６０１とが係合しており、支柱板５００が下側ケーシング６００に対して、長手方向に移動することはない。

しかしながら、押圧子２が開口部６０２内に挿入され、押圧部５０３に長手方向（反応チューブ２００に向く）の外力を及ぼすと、ロック部５０２が弾性変形して内側に撓み、ストッパ６０１から離脱する。

これにより、支柱板５００は、下側ケーシング６００に対して、最大で距離ｄだけ相対移動できるようになる。

吸収材設置板４００は、初期状態において、中段の部品である。吸収材設置板４００は、液を吸収する吸収材４０１（成分等は、別途詳述する。）を支持する部材であり、その反応チューブ２００の反対側において、段差部４０３までほぼ同幅であるが、その後くびれ部４０４が形成され幅狭となり、再び載置部４０２が形成されて幅がくびれ部４０４よりも増加する。

ここで、通常の状態では、図９（ａ）に拡大して示すように、載置部４０２は、支柱５０１の頂部上に載っている。

一方、押圧子２が押圧部５０３を押して上述した係合が解除されると、支柱板５００は最大で距離ｄだけ長手方向に移動する。しかしながら、吸収板設置板４００は、長手方向に移動できないように形成されているため、図９（ｂ）に示すように、支柱５０１と載置部４０２とが分離し、支柱５０１は、くびれ部４０４内へ入り込む。

その結果、吸収材設置板４００は、支えを失い自然落下し、支柱板５００に重なり合う（下段へ落下する）ことになる。

測定装置７００に挿入されたデバイス１０の反応チューブ２００は、図４に示すように測定装置７００内部の温調ブロック７０３にしっかりと固定される。

デバイス１０は、図４のように組み立てられる。主には、上側ケーシング１００、下側ケーシング６００を合わせ、これから突き出した反応チューブ２００からなり、上側ケーシング１００には試料滴下部１０１、デバイス保持部１０２を備えている。

また、上側ケーシング１００には、洗浄液を流すための構造として洗浄液ポット１２０及び洗浄液ポットカバー１１０が装着されている。

デバイス１０内部には、試料滴下部１０１に滴下された試料から目的の遺伝子を捕捉したり、洗浄したり、さらには洗浄後の遺伝子を反応チューブ２００まで移動させるために、フィルタ支持体３００、吸収材設置板４００、支柱板５００などを設置している。

以下、更なる詳細を説明する。図５（ａ）は、本発明の一実施の形態におけるフィルタ支持体の斜視図、図５（ｂ）は、同洗浄液ポットの斜視図、図５（ｃ）は、同洗浄液ポットカバーの斜視図である。

図５（ａ）に示すように、フィルタ支持体３００の先端部に穴が開けられ、この穴に、液体が通過可能な状態でフィルタ３０１が貼付されている。

好ましくは、フィルタ３０１上に、遺伝子を効率よく捕捉できるようシリカ粒子を塗布する。フィルタ３０１に隣接する試薬塗布部３０２には、核酸増幅反応に必要な試薬成分を塗布して乾燥して固定させておくと良い。

試薬成分は、全てを反応チューブ２００内に入れておくこともできるが、より安定性を向上させるためには全ての成分を混合するのではなく分離して設置することが望ましいことから、必要に応じて少なくとも一部の試薬をここに塗布できる様になっている。

Ｏリング３０４は、増幅反応中に反応チューブ２００内の試薬液が蒸発しないように、フィルタ支持体と反応チューブの隙間をなくすよう、しっかりとシールするシール部材である。勿論、他の周知のシール部材を用いても良い。

次に、図５（ｂ）に示すように、洗浄液ポット１２０には、フィルタ３０１上に捕捉された遺伝子を洗浄するための洗浄液が分注され、分注口１２１はアルミシールで封止される。また、洗浄液ポット１２０の側面には、同ポット１２０を移動させるため、一対の突起１２２、１２２が外向きに突設される。

図６（ａ）〜図６（ｃ）に示すように、突起１２２を押圧する押圧子１が移動することにより、洗浄液ポット１２０は、デバイス１０内で移動する。また、この移動の結果、図５（ｃ）に示す、洗浄液ポットカバー１１０から洗浄液ポット１２０に向けて設けられた、突き破り突起１１１が、分注口１２１を封止するアルミシールを突き破り、洗浄液が、シュート１０１ｂを介して試料滴下部１０１へ流出するようになっている。

ここで、突き破り突起１１１は、洗浄液ポット１２０の容積のほとんどを占める大きさを持つため、洗浄液ポット１２０の内部の洗浄液は、突き破り突起１１１に押し出され、その殆どが試料滴下部１０１へと強制的に流出する。

図７（ａ）〜図７（ｃ）は、それぞれ図６（ａ）〜図６（ｃ）に対応する断面図である。

本形態では、洗浄液の供給のため、突き破り突起１１１が洗浄液ポットカバー１１０の内側に成型品として一体に成型されて設置されて、洗浄液ポット１２０のシールを突き破るようにしているが、洗浄液の貯蔵及び供給が行えれば足り、必ずしもこれに限られるものではない。

また、測定装置７００の駆動機構と洗浄液ポット１２０の移動についても、同様の機能を果たすのであれば、この例に限定されるものではない。

図８（ａ）は、フィルタ支持体３００、吸収材４０１、支柱板５００の位置関係を示す。

吸収材４０１は、濾紙や高分子吸収材、ガラス繊維濾紙など比較的柔らかい素材であり、滴下された液体試料や、その後に流出してくる洗浄液を、前記フィルタ３０１を通して吸収する。

そして、吸収材４０１が固定された吸収材設置板４００は、支柱板５００の一対の支柱５０１、５０１に支えられてデバイス１０内で持ち上げられた状態で保持されているため、吸収材４０１はフィルタ３０１下面にしっかりと圧着するようにデバイス内で配置される。

さて、図１０（ａ）〜図１０（ｆ）は、押圧子２がデバイス１０内で移動する際の、デバイス１０の内部の状態を示す断面図である。

押圧子２が下側ケーシング６００の開口部６０２から挿入され、支柱板５００の押圧部５０３に力を加えると、支柱板５００は、初期位置（図１０（ａ））から移動して、図１０（ｂ）の位置を経由し、さらに図１０（ｃ）の位置まで移動する。

そして、支柱５０１が外れた吸収材設置板４００は、支えを失い、図１０（ｄ）の位置を経由して下段（図１０（ｅ）の位置）まで落下する。

同時に、フィルタ支持体３００についても、図１０（ｆ）の位置まで落下し下側ケーシング６００に重なる。これにより、フィルタ支持体３００は、圧着状態から移動可能な状態となり、駆動用リブ３０３の下部が、下側ケーシング６００のスリット（図示せず。）を介して、下側ケーシング６００から更に下方へ突き出すことになる。

その後、図１１（ａ）に示すように、押圧子３が駆動用リブ３０３の下部を押すことにより、フィルタ支持体３００は、図１１（ａ）の位置から、図１１（ｂ）の状態を経由して、先端部のフィルタ３０１及び試薬塗布部３０２が終点（図１１（ｃ）の位置）まで移動する。その結果、図１１（ｃ）に示すように、フィルタ３０１及びそれに担持される核酸は、反応チューブ２００の試薬２０１内に完全に押し込まれる。

なお、反応チューブ２００内には、核酸増幅反応のために必要な試薬２０１が含まれているため、保管時の蒸発を防ぐべく、試薬２０１への入り口をアルミシールしておいても良い。この場合、フィルタ支持体３００の先端部を、尖らせた構造として、アルミシールを突き破るようにするとよい。

なお、試薬２０１の成分は、増幅反応のための酵素、基質、緩衝成分、検出領域に特異的なプライマーセット、蛍光標識プローブなどを含み、保存安定性を向上させるため、これらの試薬を反応チューブ２００内とフィルタ支持体３００の試薬塗布部３０２に分離して設置しても良い。

反応チューブ２００内の試薬２０１は、液体のままではデバイス１０の輸送中や作業中の振動等により反応に適した底部にとどまらないことがあるため、容易に移動しないように反応を開始するまでは、固形またはゲル状に固定されていることが望ましい。

好ましくは、例えば、試薬作製時にアガロースなどの熱融解性の高分子化合物を加熱保温して試薬成分と共にチューブ２００内に分注し、その後に冷却することでゲル化し固定すると良い。こうすることで、デバイス１０が輸送中などに振動や回転などの動きをしても確実に反応チューブ２００の底部に試薬２０１を保持することができる。

核酸増幅反応時には、９５℃などの高温にすることで反応チューブ２００内のゲル化試薬２０１は、融解されて液状となり、容易に核酸増幅反応を開始することができるようになる。

上述のようにして、調製して準備された各部材を、図４のように配置して組み立てることにより、本形態のデバイスを完成させることができる。

（測定）
測定者が実際に測定する際には、抽出容器８０１に液体試料を採取して遺伝子を抽出し、上側ケーシング１００の試料滴下部１０１に必要量を滴下して、専用の測定装置７００にセットするだけであり、操作は非常に簡単である。

なお、試料滴下部１０１の溶液の保持と反応時の液量確保のため、デバイス１０は、測定装置７００に、水平に対し３０度程度傾けて入れるようにする。

その後の以下の工程は、測定者の操作などは必要なく、全てが専用測定装置７００内で自動的に行われる。

滴下された抽出液中の遺伝子は、フィルタ支持体３００に担持されているフィルタ３０１上のシリカ粒子に捕捉される。

滴下された液体は、フィルタ３０１を通過しフィルタ３０１下面に接触して設置された吸収材４０１により、吸収・除去される。

その後、測定装置７００の押圧子１でデバイス１０内の洗浄液ポット１２０を押して、アルミシールを突き破り、洗浄液を試料滴下部１０１へと排出し、フィルタ３０１上のシリカ粒子に捕捉されている遺伝子を洗浄する。

洗浄液もまた、フィルタ３０１を通過して吸収材４０１へと吸収・除去される。

その後、測定装置７００の押圧子２を駆動し、支柱５０１が設けられている支柱板５００を移動させる。

支柱板５００と共に支柱５０１が移動することにより、支柱５０１と載置部４０２との係合が解除され、吸収材設置板４００が最下段へ落下する。

同時に、フィルタ支持体３００も中段から下段へ落下し、その結果、フィルタ３０１は、上側ケーシング１００の試料滴下部１０１と吸収材４０１の間に圧着して挟み込まれていた状態から移動可能な状態になる。

移動可能となったフィルタ支持体３００は、測定装置７００の押圧子３の移動により、フィルタ３０１が反応チューブ２００の試薬２０１内へ押し込まれる。

このようにして、フィルタ３０１に捕捉されていた遺伝子は、反応チューブ２００内へと運ばれて、反応チューブ２００内の試薬２０１と共に、測定装置７００の温調ブロック７０３において増幅反応が開始される。

遺伝子増幅のための温度条件は、測定項目によって異なるが、たとえば９５℃、６５℃の繰り返しによりプライマーのアニーリングと複製反応が起こることで、核酸増幅反応が進められる。

核酸増幅反応の検出は、増幅産物に特異的に反応してシグナルを発する標識プローブなどを用いる。

そしてシグナルの測定は、反応チューブの側面に設置された測定装置７００の受光センサ７０４ｂにより容易になしうる。

すなわち、蛍光測定ユニット７０４の発光体７０４ａが、透明の反応チューブ２００の側面から励起光を当て、受光センサ７０４ｂが、発生する蛍光量を検出・測定する。

測定装置７００は、測定結果をモニター画面７０２に表示するとともに検査結果をプリントアウトすることもできる。

（実施例）
（マイコプラズマ肺炎の診断におけるＰ１遺伝子の検出）
本発明におけるデバイス１０を使用してマイコプラズマ肺炎の原因菌であるマイコプラズマ・ニューモニエのＰ１遺伝子を検出する方法を以下に示す。

（マイコプラズマ検出用のデバイス１０の作製）
フィルタ支持体３００の先端には、穴が開けられてフィルタ３０１が担持されており、遺伝子を捕捉するために５×８ｍｍの帯状に切断した親水性ＰＴＦＥメンブレンからなるフィルタ３０１を同穴に担持させる。

より効率よく遺伝子を捕捉できるよう平均粒径１μｍのシリカ粒子４０μｇをメンブレン上に塗布し乾燥させた。

フィルタ支持体３００の試薬塗布部３０２には、ＤＮＡポリメーラーゼを含む反応試薬１を８μＬを塗布して乾燥した。

洗浄液ポット１２０には、洗浄液として精製水１．２ｍＬを分注して分注口１２１をアルミシールして封入体とした。

吸収材設置板４００は、吸収材４０１として高分子吸収材とガラス繊維濾紙を重ね合わせて２５ｍｍ×２５ｍｍのサイズで２．５ｍｍの厚さに切断した吸収材を設置して完成させた。

反応チューブ２００の内部には、アガロース、マイコプラズマ検出用プライマーセット、Ｑプローブを含む反応試薬２を５０μＬ分注してゲル化し、口をアルミシールして封入体とした。

このようにして準備したフィルタ支持体３００、洗浄液ポット１２０、吸収材設置板４００、反応チューブ２００を上側ケーシング１００、洗浄液ポットカバー１２０、支柱板５００、下側ケーシング６００と組み合わせて、図４に示すように配置し、マイコプラズマ測定用のデバイス１０を組み立てた。

（マイコプラズマの測定）
陽性対照として、マイコプラズマ肺炎の病原体であるマイコプラズマ・ニューモニエ由来の膜タンパク質であるＰ１タンパク質をコードする遺伝子断片を人工合成後、ｐＭＤ２０Ｔベクターに組み込んだプラスミドＤＮＡを生理食塩水に添加したものを使用した。陰性対照は生理食塩水を使用した。

各試料を１５０μＬ分取してカオトロピック塩を含む抽出液５５０μＬに添加した。

組み立てられたマイコプラズマ測定用のデバイス１０の上側ケーシング１００の試料滴下部１０１に各抽出液を１１０μＬ滴下し、フィルタ３０１上に滴下された液が完全に濾過吸収されたことを確認後、専用の測定装置７００に挿入した。

デバイス１０は、測定装置７００のガイドによって反応チューブ２００を水平に対して下方に約３０度傾けた状態で挿入され、測定装置７００の内部では、反応チューブ２００が、温調ブロック７０３及び蛍光測定ユニット７０４に対して、位置決めされる。

その後、測定装置７００の押圧子１を移動させ、洗浄液ポット１２０をスライドさせることにより、洗浄液ポット１２０のアルミシールを破り、洗浄液が試料滴下部１０１に排出される。

洗浄液は、フィルタ３０１上のシリカ粒子に捕捉された遺伝子を洗浄しながら、フィルタ３０１の下にある吸収材４０１に吸収される。

測定装置７００は、洗浄液が濾過されたことを液面センサにより確認後、押圧子２を移動させ、下側ケーシング６００の開口部６０２から内側に突出する押圧子２が、押圧部５０３に力が加えると、支柱板５００のロック部５０２とストッパ６０１の係合が解除され、支柱板５００が移動し、吸収材設置板４００及びフィルタ支持体３００は圧着された固定状態から、移動可能な状態へ遷移する。

その後、駆動用リブ３０３が押圧子３により押され、フィルタ３０１及び試薬塗布部３０２が反応チューブ２００内の試薬２０１に押し込まれる終点まで、フィルタ支持体３００を移動させる。

このような一連の動作によって、反応チューブ２００内において、あらかじめ分注されていた反応試薬２とフィルタ支持体の試薬塗布部３０２に塗布された反応試薬１及びフィルタ３０１のシリカに結合したマイコプラズマ・ニューモニエのＤＮＡが混ざり合うことになる。

測定装置７００は、押圧子３の移動後、（表１）に示す温度プロファイルに従い、温調ブロック７０３の温度を上下させることで、直ちに反応チューブ２００内においてＰＣＲ反応を開始させる。

図１２は、本発明の一実施の形態における陽性対照と陰性対照の測定結果を示すグラフである。

Ｑプローブは、標的遺伝子に結合すると消光するため、陽性試料ではサイクルが進むと蛍光強度が小さくなると期待される。

図１２の陽性対照は、２８サイクル付近から標的遺伝子の増幅に伴う消光が観察されるが、陰性対照は４５サイクルまで、消光は見られない。

以上述べたように、本発明は、体外診断薬の遺伝子検査のＰＯＣＴ化商品に利用可能な核酸増幅法のデバイスに関する。

遺伝子検査は、感度・特異度に優れた検査法であるが、高価な測定装置と熟練した技術が必要であり、容易には小規模病院や開業医などには展開できない状況である。

本発明のデバイス１０は、抽出操作を行った後の液体試料を滴下して、専用の測定装置７００にセットするだけで、デバイス１０中において遺伝子の捕捉、洗浄、増幅反応、検出が可能となり、コンタミネーションの問題も改善され、きわめて簡便で短時間の検査が可能となり、また低価格で広く医療現場に普及することが見込まれる。

本発明の一実施の形態における試料滴下時の核酸増幅反応用デバイスの斜視図 本発明の一実施の形態における測定装置の斜視図 本発明の一実施の形態における測定装置の原理を示す平面図 本発明の一実施の形態における核酸増幅反応用デバイスの分解斜視図 （ａ）本発明の一実施の形態におけるフィルタ支持体の斜視図 （ｂ）本発明の一実施の形態における洗浄液ポットの斜視図 （ｃ）本発明の一実施の形態における洗浄液ポットカバーの斜視図 （ａ）本発明の一実施の形態における押圧子の動作説明図 （ｂ）本発明の一実施の形態における押圧子の動作説明図 （ｃ）本発明の一実施の形態における押圧子の動作説明図 （ａ）本発明の一実施の形態における洗浄液ポットの動作説明図 （ｂ）本発明の一実施の形態における洗浄液ポットの動作説明図 （ｃ）本発明の一実施の形態における洗浄液ポットの動作説明図 （ａ）本発明の一実施の形態におけるフィルタ支持体及び吸収材の斜視図 （ｂ）本発明の一実施の形態における下側ケーシング及び支柱板の斜視図 （ａ）本発明の一実施の形態における支柱の動作説明図 （ｂ）本発明の一実施の形態における支柱の動作説明図 （ａ）本発明の一実施の形態における吸収材の動作説明図 （ｂ）本発明の一実施の形態における吸収材の動作説明図 （ｃ）本発明の一実施の形態における吸収材の動作説明図 （ｄ）本発明の一実施の形態における吸収材の動作説明図 （ｅ）本発明の一実施の形態における吸収材の動作説明図 （ｆ）本発明の一実施の形態における吸収材の動作説明図 （ａ）本発明の一実施の形態におけるフィルタ支持体の動作説明図 （ｂ）本発明の一実施の形態におけるフィルタ支持体の動作説明図 （ｃ）本発明の一実施の形態におけるフィルタ支持体の動作説明図 本発明の一実施の形態における陽性対照と陰性対照の測定結果を示すグラフ

１、２、３ 押圧子
１０ 核酸増幅反応用デバイス
１００ 上側ケーシング
１０１ 試料滴下部
１０１ａ 吐出口
１０１ｂ シュート
１０２ 反応デバイス保持部
１０３ ストッパ
１１０ 洗浄液ポットカバー
１１１ 突き破り突起
１２０ 洗浄液ポット
１２１ 分注口
１２２ 突起
２００ 反応チューブ
２０１ 試薬
３００ フィルタ支持体
３０１ フィルタ
３０２ 試薬塗布部
３０３ 駆動用リブ
３０４ Ｏリング
４００ 吸収材設置板
４０１ 吸収材
５００ 支柱板
５０１ 支柱
５０２ ロック部
５０３ 押圧部
６００ 下側ケーシング
６０１ ストッパ
６０２ 開口部
７００ 測定装置
７０１ 挿入口
７０２ モニタ画面
７０３ 温調ブロック
７０４ 蛍光測定ユニット
７０４ａ 発光体
７０４ｂ 受光センサ
７０５ ドア
８００ 滴下ノズル
８０１ 抽出容器
８０２ 手

Claims (11)

1. 上面にノズルから滴下され、核酸を含む液体試料を接受する試料滴下部を有するケーシングと、
   前記ケーシングの端部から外向きに突出し内部に収納空間を有すると共に、測定装置内に装着可能に形成される反応チューブと、
   前記試料液体に含まれる前記核酸を担持するフィルタと、
   前記ケーシング内に収納され、前記試料滴下部の真下において、前記フィルタが前記液体試料に接液する滴下位置と前記フィルタが前記反応チューブの前記収納空間内に位置決めされる反応位置とを取り得るように、前記フィルタを支持するフィルタ支持体と、
   前記接液位置にある前記フィルタに圧着して前記フィルタが接液する前記液体試料を吸収する圧着位置と、前記圧着位置から移動して前記フィルタの移動を自由にする離脱位置とを取り得る吸収材とを備える核酸増幅反応用デバイス。
2. 洗浄液を担持する洗浄液ポットと、前記洗浄液ポット内の前記洗浄液を前記試料滴下部へ流動可能とする部材とを更に備える請求項１記載の核酸増幅反応用デバイス。
3. 前記フィルタ支持体は、押圧部により駆動されて、前記滴下位置から前記反応位置へ移動可能に支持されている請求項１又は２記載の核酸増幅反応用デバイス。
4. 前記反応チューブは、透明素材からなる請求項１から３のいずれかに記載の核酸増幅反応用デバイス。
5. 前記反応チューブが、核酸増幅反応に必要な試薬の少なくとも一部を保持する請求項１から４のいずれかに記載の核酸増幅反応用デバイス。
6. 前記反応チューブに保持される、前記核酸増幅反応に必要な試薬の少なくとも一部は、熱融解性の高分子化合物を含み、反応前には固形化またはゲル化されており、核酸増幅反応における加熱で液状となりうる請求項５記載の核酸増幅反応用デバイス。
7. 前記吸収材が、濾紙、高分子吸収材又はガラス繊維濾紙からなる吸水性柔軟素材からなる請求項１から６のいずれかに記載の核酸増幅反応用デバイス。
8. 前記フィルタにシリカ粒子を固着されている請求項１記載の核酸増幅反応用デバイス。
9. 前記フィルタが高分子メンブレンからなる請求項１記載の核酸増幅反応用デバイス。
10. 前記フィルタが、親水性ＰＴＦＥ（ポリテトラフルオロエチレン）からなる請求項９核酸増幅反応用デバイス。
11. 前記フィルタ支持体が、核酸増幅反応に必要な試薬の少なくとも一部を保持する請求項１記載の核酸増幅反応用デバイス。

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