JP2507982B2

JP2507982B2 - Method for producing human carcinoembryonic antigen-reactive monoclonal antibody

Info

Publication number: JP2507982B2
Application number: JP59072429A
Authority: JP
Inventors: 孝一近藤; 伸宏鈴木
Original assignee: Takeda Chemical Industries Ltd
Current assignee: Takeda Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1984-04-10
Filing date: 1984-04-10
Publication date: 1996-06-19
Anticipated expiration: 2011-06-19
Also published as: JPS60214261A

Description

【発明の詳細な説明】産業上の利用分野本発明は、ヒト癌胎児性抗原（以下、CEAと略称する
こともある）反応性モノクローナル抗体の製造法に関す
る。TECHNICAL FIELD The present invention relates to a method for producing a human carcinoembryonic antigen (hereinafter sometimes abbreviated as CEA) reactive monoclonal antibody.

従来の技術 CEAは1965年Goldらによって、ヒト大腸癌組織の過塩
素酸抽出物中に見い出され、しかも胎児期の消化管上皮
にも存在することから癌胎児性抗原（carcinoembryonic
antigen）と名付けられた。CEAは分子量約18万、約50
％の糖を含む蛋白である。CEAは胃癌、大腸癌、膵癌、
肺癌などの種々の癌患者で、癌組織や体液中に比較的高
レベルで検出される場合が多く、癌の診断ならびに予後
管理用として繁用されている。Prior art CEA was found by Gold et al. In 1965 in the perchloric acid extract of human colon cancer tissue, and since it is also present in the gastrointestinal epithelium of the fetal period, carcinoembryonic antigen (carcinoembryonic
antigen). CEA has a molecular weight of about 180,000, about 50
It is a protein containing% sugar. CEA is gastric cancer, colon cancer, pancreatic cancer,
In various cancer patients such as lung cancer, it is often detected at relatively high levels in cancer tissues and body fluids, and it is widely used for diagnosis and prognosis management of cancer.

従来より、CEAの酵素免疫測定法（以下、EIAと略称す
ることもある。）については、サンドイッチ法が繁用さ
れてきた。サンドイッチ法は一般に次のように行なわれ
る。未知量のCEAを含む被検液に担体上に保持された過
剰量の抗体を加えて反応させ（第１反応）、次に酵素で
標識した過剰量の抗体の一定量を加えて反応させる（第
２反応）。担体上に保持された酵素もしくは担体上に保
持されなかった酵素の活性を測定する。第１反応、第２
反応は同時に行なってもよいし時間をずらして行なって
もよい。Conventionally, the sandwich method has been frequently used as the enzyme immunoassay method for CEA (hereinafter sometimes abbreviated as EIA). The sandwich method is generally performed as follows. An excess amount of antibody retained on a carrier is added to a test solution containing an unknown amount of CEA for reaction (first reaction), and then a fixed amount of an enzyme-labeled excess amount of antibody is added for reaction ( Second reaction). The activity of the enzyme retained on the carrier or the enzyme not retained on the carrier is measured. First reaction, second
The reactions may be performed simultaneously or at different times.

第１反応および第２反応で用いられている抗体の同一
の免疫動物で得られた抗血清、あるいは異なる免疫動物
から得られた抗血清、さらにこれらの抗体の１種類と細
胞融合法で得られた１種類のモノクローナル抗体、ある
いは２種類のモノクローナル抗体などが用いられてい
る。Antisera obtained from the same immunized animal of the antibodies used in the first reaction and the second reaction, or antisera obtained from different immunized animals, and further obtained by cell fusion with one of these antibodies Only one type of monoclonal antibody or two types of monoclonal antibodies are used.

発明が解決しようとする問題点 CEAは一般にKrupeyらの方法〔イムノケミストリー（I
mmunochemistry）、第９巻（1972年）、第617頁〕に準
じてヒト大腸癌組織の過塩素酸抽出物を、ゲルクロマト
グラフィー、アフィニティクロマトグラフィーもしくは
電気泳動法の各手法を組み合せて精製されていた。しか
し、これらの方法で得られたCEAは、操作中に強い酸性
溶媒にさらされているため、変性している恐れがあると
いう欠点を有する。このために緩和な条件でCEAを抽出
精製する方法が報告されているが〔キャンサー・リサー
チ（Cancer Research）、第35巻（1975年）、第2928
頁〕、繁雑であり、またその有用性も明らかでない。更
に排出のために用いられるヒト癌化組織としては通常、
大腸癌の転移肝癌が用いられるが原発部組織と完全に一
致する性質を有するものかどうかについては釈明されて
いるとは言えない。更にCEAと共通の抗原決定基を有す
るCEA関連抗原が正常組織や新生児胎便中から発見され
ておりNCA〔Nonspecificcrossreacting antigen;Procee
dings of the National Academy of Sciences of the
U.S.A.第69巻（1972年）、第2492頁〕やNCA−２〔Nonsp
ecificcross-reacting antigen−2;Journal of Immunol
ogy、第111巻（1973年）、第1926頁〕などと名付けられ
ている。これらのCEA関連抗原と交差反応する抗CEA抗体
を利用すると、その交差反応性のためにCEA測定値に影
響を与え、正確な測定値が得られない。Problems to be Solved by the Invention CEA generally uses the method of Krupey et al. [Immunochemistry (I
mmunochemistry), Vol. 9 (1972), p. 617], the perchloric acid extract of human colon cancer tissue has been purified by a combination of gel chromatography, affinity chromatography or electrophoresis. It was However, the CEA obtained by these methods has the drawback that it may be denatured because it is exposed to a strongly acidic solvent during operation. For this reason, a method for extracting and purifying CEA under mild conditions has been reported [Cancer Research, Vol. 35 (1975), No. 2928].
Page], but it is complicated and its usefulness is not clear. Further, human cancerous tissues used for excretion are usually
Although metastatic liver cancer of colorectal cancer is used, it cannot be said that it has been clarified as to whether it has the property of completely matching the tissue of the primary site. Furthermore, a CEA-related antigen having an antigenic determinant common to CEA has been found in normal tissues and neonatal meconium, and NCA (Nonspecific crossreacting antigen; Procee)
dings of the National Academy of Sciences of the
USA Vol. 69 (1972), p. 2492] and NCA-2 [Nonsp
ecificcross-reacting antigen-2; Journal of Immunol
ogy, Vol. 111 (1973), p. 1926] and so on. When an anti-CEA antibody that cross-reacts with these CEA-related antigens is used, the CEA measurement value is affected due to its cross-reactivity, and an accurate measurement value cannot be obtained.

また、EIAで用いられる標識用酵素としては、安定で
高感度測定が可能であり、標識化反応時に損傷を受けな
いことが望ましい。これまでにペルオキシダーゼ、β−
Ｄ−ガラクトシダーゼ，アルカリフオスフアターゼ，グ
ルコースオキシダーゼなどが用いられているが、上記の
酵素のうち、ペルオキシダーゼは分子量約４万の極めて
安定な酵素で、酵素活性も高いため最も繁用されてい
る。In addition, it is desirable that the labeling enzyme used in EIA is stable and capable of highly sensitive measurement, and that it is not damaged during the labeling reaction. So far peroxidase, β-
Although D-galactosidase, alkaline phosphatase, glucose oxidase and the like are used, peroxidase among the above enzymes is an extremely stable enzyme having a molecular weight of about 40,000 and is most commonly used because of its high enzymatic activity.

ペルオキシダーゼをEIAに利用するにあたって、ペル
オキシダーゼと免疫化学的活性物質とを予め結合させる
必要があるが、通常行なわれている方法では、それぞれ
欠点を有し、改善が切望されていた。In order to use peroxidase for EIA, it is necessary to combine peroxidase and an immunochemically active substance in advance. However, the commonly used methods have their respective drawbacks, and improvements have been earnestly desired.

問題を解決するための手段本発明者らは、上記の事情に鑑み更に検討を重ねたと
ころ、CEAを含有する癌化組織から非イオン性界面活性
剤を含む中性塩溶液で抽出することによりCEAを変性さ
せることなく精製できること、またこのようにして精製
されたCEAを用いて製造されたCEA反応性モノクローナル
抗体を、２種の抗CEA抗体を用いるサンドイッチ法によ
るEIAにおいて、該２種の抗体のうち少なくとも一方に
上記モノクローナル抗体を用い、標識剤としてペルオキ
シダーゼを用いこれと抗体とを一般式〔式中、ｎは０ないし５の整数を、Ｒは化学結合または
２価の６員環状炭化水素残基をそれぞれ示す。〕で表わ
される化合物で結合させたものを用いると、CEAを高感
度、高精度でしかも数量のCEAを測定できることを見い
出し、これらの知見に基づいてさらに研究した結果、本
発明を完成した。Means for Solving the Problem The present inventors further studied in view of the above circumstances, and extracted from a cancerous tissue containing CEA with a neutral salt solution containing a nonionic surfactant. The CEA can be purified without denaturation, and the CEA-reactive monoclonal antibody produced by using the CEA purified in this way can be used in the EIA by the sandwich method using the two anti-CEA antibodies. The above-mentioned monoclonal antibody is used for at least one of the [In the formula, n represents an integer of 0 to 5, and R represents a chemical bond or a divalent 6-membered cyclic hydrocarbon residue. The present invention was completed as a result of further research based on these findings, by finding that CEA can be measured with high sensitivity and high accuracy, and a quantity of CEA can be measured by using one bound with a compound represented by the following formula.

本発明は、ヒト癌胎児性抗原を含有する癌化組織か
ら、非イオン性界面活性剤を含む中性塩溶液で抽出し、
ヒト癌胎児性抗原を精製し、これを哺乳動物のリンパ球
に免疫し、これとミエローマ細胞との融合細胞を製造
し、ついでこれをクローニングすることを特徴とするヒ
ト癌胎児性抗原反応性モノクローナル抗体の製造法に関
する。The present invention, from carcinogenic tissues containing human carcinoembryonic antigen, extracted with a neutral salt solution containing a nonionic surfactant,
Human carcinoembryonic antigen-reactive monoclonal antibody characterized by purifying human carcinoembryonic antigen, immunizing it with mammalian lymphocytes, producing fused cells of this with myeloma cells, and then cloning this The present invention relates to a method for producing an antibody.

また、本願明細書においては、ヒト癌胎児性抗原を含
有する癌化組織から、非イオン性界面活性剤を含む中性
塩溶液で抽出し、精製することを特徴とするヒト癌胎児
性抗原の精製法について述べ、さらにヒト癌胎児性抗原
を含有する癌化組織から、非イオン性界面活性剤を含む
中性塩溶液で抽出し、精製されたヒト癌胎児性抗原で免
疫された哺乳動物のリンパ球とミエローマ細胞との融合
細胞から得られたヒト癌胎児性抗原反応性モノクローナ
ル抗体を、担体上に保持された抗体、抗原および標識剤
を結合させた抗体を用いるヒト癌胎児性抗原の免疫化学
的測定法において、担体上に保持される抗体と標識剤を
結合させる抗体とが互いに抗原決定部位を重複しない２
種の抗体のうち少なくとも一方に用い、標識剤としてペ
ルオキシダーゼを用い、これと抗体とを一般式〔式中、ｎは０ないし５の整数を、Ｒは化学結合または
２価の６員環状炭化水素残基をそれぞれ示す。〕で表さ
れる化合物で結合させたものを用いてヒト癌胎児性抗原
を免疫化学的に測定することを特徴とするヒト癌胎児性
抗原反応性モノクローナル抗体の使用法についても開示
する。Further, in the present specification, from a carcinogenic tissue containing human carcinoembryonic antigen, a human carcinoembryonic antigen characterized by being extracted with a neutral salt solution containing a nonionic surfactant and purified. A purification method will be described. Furthermore, from a carcinogenic tissue containing human carcinoembryonic antigen, extracted with a neutral salt solution containing a nonionic surfactant, and purified from a mammal immunized with human carcinoembryonic antigen. Immunization of human carcinoembryonic antigen using a human carcinoembryonic antigen-reactive monoclonal antibody obtained from a fusion cell of lymphocytes and myeloma cells, using an antibody retained on a carrier, an antibody to which an antigen and a labeling agent are bound In the chemical assay method, the antibody retained on the carrier and the antibody to which the labeling agent binds do not overlap with each other in their antigenic determinant sites 2
At least one of the antibodies of the species and peroxidase as a labeling agent [In the formula, n represents an integer of 0 to 5, and R represents a chemical bond or a divalent 6-membered cyclic hydrocarbon residue. ] The method of using a human carcinoembryonic antigen-reactive monoclonal antibody characterized by immunochemically measuring a human carcinoembryonic antigen using a compound bound with the compound represented by

本発明において用いられる担体上に保持された抗体に
おける担体としては、たとえば、ゲル粒子（例、アガロ
ースゲル〔例、セフアロース4B,セフアロース6B（フア
ルマシア・フアインケミカル社（スエーデン）製〕，デ
キストランゲル〔例、セフアデックスＧ−75,セフアデ
ックスＧ−100,セフアデックスＧ−200（フアルマシア
・フアインケミカル社製）〕，ポリアクリルアミドゲル
〔例、バイオゲルＰ−30,バイオゲルＰ−60,バイオゲル
Ｐ−100（バイオラッド・ラボラトリーズ社（米
国））〕，セルロース粒子〔例、アゼセル（旭化成
製），イオン交換セルロース（例、ジエチルアミノエチ
ルセルロース，カルボキシメチルセルロース）〕，物理
的吸着剤〔例、ガラス（例、ガラス球，ガラスロッド，
アミノアルキルガラス球，アミノアルキルガラスロッ
ド），シリコン片，スチレン系樹脂（例、ポリスチレン
球，ポリスチレン粒子），イムノアッセイ用プレート
（例、ヌンク社（デンマーク）製）〕，イオン交換樹脂
（例、弱酸性陽イオン交換樹脂〔例、アンバーライトIR
C-50（ローム・アンド・ハース社（米国）製），ゼオカ
ーブ226（パームチット社（西ドイツ）製）〕，弱塩基
性陰イオン交換樹脂〔例、アンバーライトIR-4B,ダウエ
ックス３（ダウケミカル社（米国）製）〕〕などが挙げ
られる。As the carrier in the antibody retained on the carrier used in the present invention, for example, gel particles (eg, agarose gel [eg, Sepharose 4B, Sepharose 6B (Pharmacia-Huain Chemical Co., Sweden)], dextran gel [ Example, Cefaddex G-75, Cefaddex G-100, Cefaddex G-200 (manufactured by Pharmacia Huaine Chemical Co.)], polyacrylamide gel [eg, Biogel P-30, Biogel P-60, Biogel P-100] (Bio-Rad Laboratories (USA))], cellulose particles [eg, Azecel (manufactured by Asahi Kasei), ion exchange cellulose (eg, diethylaminoethyl cellulose, carboxymethyl cellulose)], physical adsorbent [eg, glass (eg, glass spheres) ， Glass rod ，
Aminoalkyl glass spheres, aminoalkyl glass rods), silicon pieces, styrene resins (eg polystyrene spheres, polystyrene particles), immunoassay plates (eg Nunc (Denmark))], ion exchange resins (eg weakly acidic) Cation exchange resin [eg Amberlite IR
C-50 (made by Rohm and Haas (USA)), Zeocurve 226 (made by Palmchid (West Germany)), weakly basic anion exchange resin [eg, Amberlite IR-4B, Dowex 3 (Dow Chemical) Company (USA))]] and the like.

担体に抗体を保持させるには、公知の常套手段を応用
し得るが、たとえば“代謝",第８巻（1971年），第696
頁に記載されているブロムシアン法，グルタルアルデヒ
ド法などが挙げられる。また、より簡易な方法として物
理的に担体表面に吸着させてもよい。In order to retain the antibody on the carrier, known conventional means can be applied, for example, “Metabolism”, Volume 8 (1971), 696.
The Bromcian method and the glutaraldehyde method described on the page can be used. Further, as a simpler method, it may be physically adsorbed on the surface of the carrier.

本発明で用いられる抗体としてはモノクローナル抗CE
A抗体もしくはポリクローナル抗CEA抗体が用いられる。
抗体の製造における免疫に用いる抗原としては、自体公
知の方法〔Krupeyら，イムノケミストリー（Immunochem
istry），第９巻（1972年），第617頁〕で精製したCEA,
更に望ましくは，ヒト癌組織から非イオン性界面活性剤
を含む中性塩溶液により抽出，精製されたCEA画分が用
いられる。Antibodies used in the present invention include monoclonal anti-CE
A antibody or polyclonal anti-CEA antibody is used.
As an antigen used for immunization in the production of antibodies, a method known per se [Krupey et al., Immunochemistry (Immunochem
istry), Volume 9 (1972), p. 617], CEA,
More preferably, the CEA fraction extracted and purified from human cancer tissue with a neutral salt solution containing a nonionic surfactant is used.

ヒト癌化組織としてはCEAを含有するヒト癌化組織な
らいずれでも用いることができるが、特にヒト大腸癌組
織が望ましい。ヒト大腸癌組織としては、あらゆる段階
の大腸癌組織を用いることができるが、デュークス（Du
kes）ＣもしくはＤの段階のものが望ましい。As the human cancerous tissue, any human cancerous tissue containing CEA can be used, but human colon cancer tissue is particularly preferable. As human colon cancer tissue, any stage of colon cancer tissue can be used.
kes) C or D stage is preferable.

非イオン性界面活性剤としては、細胞成分を可溶化で
きるものならばいずれでも良いが、とりわけエチレンオ
キシド系非イオン性界面活性剤〔例、Tween 20,Tween 4
0,Tween 80,Triton N−101,Triton X−100,Lobrol WX,B
riji96など、シグマ社（米国）製〕が用いられる。Any nonionic surfactant may be used as long as it can solubilize cell components, but especially ethylene oxide nonionic surfactants [eg Tween 20, Tween 4
0, Tween 80, Triton N−101, Triton X−100, Lobrol WX, B
manufactured by Sigma (USA) such as riji96] is used.

中性塩としてはたとえば塩化ナトリウム，塩化カリウ
ム，硫酸ナトリウムなどが良好に用いられる。ヒト癌化
組織あたり、約１ないし10倍量の約0.1ないし４％エチ
レンオキシド系非イオン性界面活性剤を含む約0.05Mな
いし3M塩化ナトリウムもしくは塩化カリウムを抽出用溶
媒として用いることが好ましい。As the neutral salt, for example, sodium chloride, potassium chloride, sodium sulfate, etc. are preferably used. It is preferable to use about 0.05 to 3 M sodium chloride or potassium chloride containing about 1 to 10 times the amount of about 0.1 to 4% ethylene oxide nonionic surfactant per human cancerous tissue as an extraction solvent.

更にCEAの抽出に際しては、抽出効率を向上させるた
め、攪拌、振盪、超音波処理などを行なってもよい。Furthermore, in extracting CEA, stirring, shaking, ultrasonic treatment, etc. may be performed in order to improve extraction efficiency.

上記の方法で得られたCEA抽出液は自体公知の精製手
段（例、ゲルクロマトグラフィー、アフィニティ・クロ
マトグラフィー、ゲル電気泳動法）で更に精製すること
ができる〔Immunochemistry,第９巻（1975年），第2928
頁参照〕。The CEA extract obtained by the above method can be further purified by a purification means known per se (eg, gel chromatography, affinity chromatography, gel electrophoresis) [Immunochemistry, Volume 9 (1975). , 2928
See page.

これらの精製手段によりCEAの純度を蛋白量あたり約
数パーセントから約10パーセントまでに濃縮することが
できる。By these purification means, the purity of CEA can be concentrated to about several percent to about 10 percent per protein amount.

モノクローナル抗CEA抗体はMilsteinらの方法〔ネイ
チュア（Nature），第256巻（1975年），第495頁〕と同
様の方法で作製することができる。例えば、上記精製CE
Aを抗原として免疫して得られたマウス脾細胞とマウス
のミエローマ細胞とを融合させることにより、モノクロ
ーナル抗体CEA抗体を分泌する融合細胞（ハイブリドー
マ）を作製することができる。The monoclonal anti-CEA antibody can be prepared by a method similar to the method of Milstein et al. [Nature, 256 (1975), 495]. For example, the purified CE
By fusing mouse splenocytes obtained by immunization with A as an antigen and mouse myeloma cells, fused cells (hybridomas) secreting the monoclonal antibody CEA antibody can be prepared.

すなわち、ハイブリドーマは精製CEAであらかじめ免
疫しておいたマウス（たとえばBALB/C系）から得られた
脾細胞と、同系マウスのミエローマ細胞（たとえばNS−
1,PS-U1など）とを細胞融合剤（たとえばポリエチレン
グリコール，センダイウィルスなど）の存在下で混合
し、融合、培養することによって得られる。脾細胞とミ
エローマ細胞との混合比は1:1ないし10:1程度が有利に
用いられる。That is, hybridomas consist of splenocytes obtained from a mouse (for example, BALB / C line) pre-immunized with purified CEA and myeloma cells (for example, NS-) of a syngeneic mouse.
1, PS-U1, etc.) in the presence of a cell fusion agent (eg, polyethylene glycol, Sendai virus, etc.), and fused and cultured. The mixing ratio of spleen cells and myeloma cells is advantageously 1: 1 to 10: 1.

ハイブリドーマはヒポキサンチン−アミノプチリン−
チミジン培地〔HAT培地：ネイチュアー，第256巻（1975
年），第495頁〕等を用いて選択的に増殖させることが
できる。Hybridoma is hypoxanthine-aminoputilin-
Thymidine medium [HAT medium: Nature, vol. 256 (1975
, Pp. 495] and the like.

細胞培養液中に目的とする抗体が含まれているかどう
かについては自体公知の酵素免疫測定法を用いて検定す
ることができる。CEAに特異性の高い抗体を産生するハ
イブリドーマはさらに通常の限界希釈法によりモノクロ
ーン化される。得られた目的とするハイブリドーマは通
常の液体培地または哺乳動物の腹腔内で増殖させること
ができる。ハイブリドーマが産生するモノクローナル抗
体は公知の方法（たとえば硫酸アンモニウムによる塩
析,DEAEセルロースカラムクロマトグラフィーなど）に
より濃縮精製される。Whether or not the antibody of interest is contained in the cell culture medium can be assayed using an enzyme immunoassay known per se. A hybridoma producing an antibody highly specific to CEA is further monocloned by a conventional limiting dilution method. The obtained hybridoma of interest can be grown in a normal liquid medium or in the abdominal cavity of a mammal. The monoclonal antibody produced by the hybridoma is concentrated and purified by a known method (for example, salting out with ammonium sulfate, DEAE cellulose column chromatography, etc.).

モノクローナル抗体はCEAに対して反応性が高く、正
常組織や非担癌患者由来の試料に対しては反応性がはる
かに小さい性質を有する抗体が選ばれる。サンドイッチ
法によるEIA用として２種類のモノクローナル抗体が用
いられる場合、それぞれの抗体の抗原決定部位が異なっ
ているものが選ばれる。Monoclonal antibodies are selected which have a high reactivity to CEA and a much lower reactivity to normal tissues and samples derived from non-cancer-bearing patients. When two kinds of monoclonal antibodies are used for EIA by the sandwich method, those having different antigen-determining sites from each antibody are selected.

ポリクローナル抗CEA抗体は通常の方法で調製するこ
とができる。即ち、精製CEAがヒト以外の温血動物に接
種される。ヒト以外の温血動物としては、たとえば哺乳
温血動物（例、ウサギ、ヒツジ、ラット、マウス、モル
モット、ウシ、ウマ、ブタ）、鳥類（例、ニワトリ、ハ
ト、アヒル、ガチョウ、ウズラ）などが挙げられる。該
抗原をヒト以外の温血動物に接種する方法としては、動
物に接種する抗原は抗体を産生するに有効な量でよく、
たとえばウサギに１回約0.1〜10mgを等容量（1ml）の生
理食塩水およびフロインドの完全アジュバントで乳化し
て、背部ならびに後肢掌皮下に４週間おきに５回接種す
ると抗体を産生させ得る場合が多い。The polyclonal anti-CEA antibody can be prepared by a usual method. That is, purified CEA is inoculated into warm-blooded animals other than humans. Examples of warm-blooded animals other than humans include warm-blooded mammals (eg, rabbit, sheep, rat, mouse, guinea pig, cow, horse, pig), birds (eg, chicken, pigeon, duck, goose, quail), etc. Can be mentioned. As a method of inoculating the warm-blooded animal other than human with the antigen, the antigen to be inoculated to the animal may be an effective amount for producing an antibody,
For example, there is a case where an antibody can be produced by emulsifying about 0.1 to 10 mg once in a rabbit with an equal volume (1 ml) of physiological saline and Freund's complete adjuvant and inoculating the dorsal and hindlimb subcutaneously 5 times every 4 weeks. Many.

このようにして、温血動物中に形成された抗体を採取
する方法としては、たとえばウサギでは、通常最終接種
後７日から12日の間に耳静脈から採血し、遠心分離して
血清として得られる。得られた抗血清は、公知の方法に
従って塩析し、通常、CEAを保持させた担体を用いるア
フィニティクロマトグラフィーで吸着した画分を回収す
ることによりポリクローナル抗CEA抗体を精製すること
ができる。In this way, as a method for collecting antibodies formed in warm-blooded animals, for example, in rabbits, blood is usually collected from the ear vein between 7 and 12 days after the final inoculation, and centrifuged to obtain serum. To be The obtained antiserum is salted out in accordance with a known method, and the polyclonal anti-CEA antibody can be purified by collecting the fraction adsorbed by affinity chromatography using a carrier that retains CEA.

本発明で用いられる２種の抗体は、モノクローナル抗
CEA抗体でもポリクローナル抗CEA抗体であってもよい
が、少なくとも一方がモノクローナル抗体であるのが好
ましい。また、抗体分子はIgG,F（ab′）₂もしくはFa
b′であってもよい。The two types of antibodies used in the present invention are monoclonal antibodies.
It may be a CEA antibody or a polyclonal anti-CEA antibody, but at least one is preferably a monoclonal antibody. The antibody molecule is IgG, F (ab ') ₂ or Fa.
It may be b '.

このようにして得られた抗CEAモノクローナル抗体
は、CEAのサンドイッチ法によるEIAにおける試薬として
用いることができる。The anti-CEA monoclonal antibody thus obtained can be used as a reagent in EIA by the sandwich method of CEA.

標識剤であるペルオキシダーゼとしては、種々の起源
のものを用いることができる、その例としてはたとえば
西洋わさび，パイナップル，イチジク，甘諸，ソラマ
メ，トウモロコシなどから得られるペルオキシダーゼが
挙げられ、特に西洋わさびから抽出されたホースラディ
ッシュ・ペルオキシダーゼ（horseradish peroxidase）
（HRP）が好ましい。As the labeling agent, peroxidase of various origins can be used, and examples thereof include peroxidase obtained from horseradish, pineapple, fig, sweet potato, broad bean, corn, etc. Extracted horseradish peroxidase
(HRP) is preferred.

ペルオキシダーゼと抗体とを化合物〔Ｉ〕で結合する
にあたり、あらかじめペルオキシダーゼにチオール基を
導入したものを用いると好都合である。When binding peroxidase and the antibody with compound [I], it is convenient to use peroxidase into which a thiol group has been introduced in advance.

チオール基をペルオキシダーゼに導入する方法として
は、ペルオキシダーゼのアミノ基を介してチオール基を
導入することができる。たとえば、Ｓ−アセチルメルカ
プトサクシニックアンハイドライド（AMSAと略称するこ
ともある;S−acetyl mercaptosuccinic anhydride）,N
−サクシニミジル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオ
ネート〔SPDPと略称することもある;N−succinimidyl3
−（２−pyridyldithio）propionate〕など通常のチオ
ール基導入試験が有利に用いられる。As a method for introducing a thiol group into peroxidase, a thiol group can be introduced via an amino group of peroxidase. For example, S-acetyl mercaptosuccinic anhydride (sometimes abbreviated as AMSA; S-acetyl mercaptosuccinic anhydride), N
-Succinimidyl 3- (2-pyridyldithio) propionate [sometimes abbreviated as SPDP; N-succinimidyl3
A usual thiol group introduction test such as-(2-pyridyldithio) propionate] is advantageously used.

したがって、チオール基をペルオキシダーゼとの間に
一定の基が入っていることとなってもよい。Therefore, a certain group may be included between the thiol group and peroxidase.

AMSAを用いる場合、ペルオキシダーゼ約0.1ないし10m
gを中性の緩衝液（たとえば0.1Mリン酸緩衝液）約0.2な
いし2mlに溶解し、約0.1ないし4mgのAMSAを約0.01ない
し0.1mlかN,N−ジメチルホルムアミドに溶解して加え、
約10〜120分間、約４〜35℃で反応させる。次に約0.2〜
2Mヒドロキシルアミンを加えて約４〜35℃で約１〜60分
間反応させ、ゲルクロマトグラフィーで精製してチオー
ル化ペルオキシダーゼを得ることができる。When using AMSA, peroxidase approximately 0.1 to 10 m
g in about 0.2 to 2 ml of a neutral buffer (e.g. 0.1 M phosphate buffer), about 0.1 to 4 mg of AMSA dissolved in about 0.01 to 0.1 ml or N, N-dimethylformamide,
The reaction is carried out at about 4-35 ° C for about 10-120 minutes. Next about 0.2 ~
The thiolated peroxidase can be obtained by adding 2M hydroxylamine and reacting at about 4-35 ° C for about 1-60 minutes, and then purifying by gel chromatography.

SPDPを用いる場合、ペルオキシダーゼ約0.1ないし10m
gを中性の緩衝液（たとえば0.1Mリン酸緩衝液）約0.1〜
1mlに溶解し、約0.1〜3mgのSPDPのエタノール溶液を加
えて約４〜35℃で約10〜240分間反応させる。ゲルクロ
マトグラフィーで過剰の試薬を除去したのち、ジチオス
レイトール（dithiothreitol）などの還元用試薬を加え
て還元し、更にゲルクロマトグラフィーで精製してチオ
ール化ペルオキシダーゼを得ることができる。When using SPDP, peroxidase approximately 0.1 to 10 m
g to about 0.1 to neutral buffer (eg 0.1M phosphate buffer)
Dissolve in 1 ml, add about 0.1 to 3 mg of SPDP in ethanol and react at about 4 to 35 ° C for about 10 to 240 minutes. After removing the excess reagent by gel chromatography, a reducing reagent such as dithiothreitol is added for reduction, and the product is further purified by gel chromatography to obtain a thiolated peroxidase.

ペルオキシダーゼと抗体とを結合させる化合物とし
て、一般式〔式中、ｎおよびＲは前記と同意義を有する。〕で表わ
される化合物を用いるが、上記式中、Ｒで表わされる２
価の６員環状炭化水素残基としては、飽和のもの、不飽
和のもののいずれでもよい。飽和の２価の６員環状炭化
水素の例としては、たとえば1,2−,1,3−,1,4−シクロ
ヘキシレンが挙げられ、不飽和の２価の６員環状炭化水
素残基の例としては、たとえば1,2−,1,3−,1,4−フェ
ニレンなどが挙げられる。As a compound that binds peroxidase and an antibody, a compound of the general formula [In the formula, n and R have the same meanings as described above. ] The compound represented by the formula
The valent 6-membered cyclic hydrocarbon residue may be either saturated or unsaturated. Examples of the saturated divalent 6-membered cyclic hydrocarbon include, for example, 1,2-, 1,3-, 1,4-cyclohexylene, which is an unsaturated divalent 6-membered cyclic hydrocarbon residue. Examples include 1,2-, 1,3-, 1,4-phenylene and the like.

該化合物〔Ｉ〕において、ｎとしては１ないし５の整
数が好ましく、特に１が好ましい。Ｒとしては２価の６
員環状炭化水素残基が好ましく、特に1,4−シクロヘキ
シレンが好ましい。In the compound [I], n is preferably an integer of 1 to 5, particularly preferably 1. R is divalent 6
Member cyclic hydrocarbon residues are preferred, with 1,4-cyclohexylene being especially preferred.

本発明の方法において用いられる化合物〔Ｉ〕は、た
とえば、ザ・ジャーナル・オブ・バイオケミストリー
（The Journal of Biochemistry）第79巻233頁（1976
年），ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・バイオケミス
トリー（European Journal of Biochemistry）第101巻3
95頁（1979年）、特開昭52-85163号公報、特開昭52-851
64号公報等に記載の方法あるいはこれらの方式に準じて
製造することができる。たとえば、一般式〔式中、Ｘは水酸基またはハロゲン原子を示す。ｎおよ
びＲは前記と同意義を有する。〕で表わされるマレイミ
ド化合物〔II〕と一般式〔式中、Ｙは水素原子またはアルカリ金属原子を示
す。〕で表わされるサクシンイミド化合物〔III〕とを
脱水剤あるいは脱酸剤の存在下で反応させることにより
製造することができる。上記一般式において、ハロゲン
原子としては塩素，臭素などが挙げられ、アルカリ金属
原子としてはたとえばナトリウム，カリウムなどが挙げ
られる。また反応に用いられる脱水剤としてはたとえ
ば、硫酸，ジシクロヘキシカルボジイミドなどが、脱酸
剤としてはたとえばピリジン，トリエチルアミンなどが
挙げられる。The compound [I] used in the method of the present invention is, for example, The Journal of Biochemistry, Vol. 79, p. 233 (1976).
,), European Journal of Biochemistry, Vol. 101, 3
Page 95 (1979), JP-A-52-85163, JP-A-52-851
It can be produced according to the method described in Japanese Patent Publication No. 64 or the like or these methods. For example, the general formula [In the formula, X represents a hydroxyl group or a halogen atom. n and R have the same meaning as described above. ] A maleimide compound [II] represented by the general formula [In the formula, Y represents a hydrogen atom or an alkali metal atom. ] It can manufacture by making it react with the succinimide compound [III] represented by these in the presence of a dehydrating agent or a deoxidizing agent. In the above general formula, examples of the halogen atom include chlorine and bromine, and examples of the alkali metal atom include sodium and potassium. Examples of the dehydrating agent used in the reaction include sulfuric acid and dicyclohexylcarbodiimide, and examples of the deoxidizing agent include pyridine and triethylamine.

前記化合物〔II〕は、たとえば特開昭52-85164号公報
に記載の方法あるいはこれに準じて製造することができ
る。たとえば一般式〔式中、ｎおよびＲは前記と同意義を有する。〕で表わ
される化合物〔IV〕を脱水閉環せしめることにより得ら
れる。該脱水閉環させるには、脱水剤たとえば無水酢酸
又は無水酢酸と酢酸ナトリウム（無水物）を用い、温和
に加熱することにより反応させることができる。The compound [II] can be produced, for example, according to the method described in JP-A-52-85164 or a method analogous thereto. For example, the general formula [In the formula, n and R have the same meanings as described above. ] The compound [IV] represented by the formula [4] can be obtained by dehydration ring closure. For the dehydration ring closure, a dehydrating agent such as acetic anhydride or acetic anhydride and sodium acetate (anhydride) can be used and the reaction can be carried out by mild heating.

さらに別法として、ヘルベティカ・キミカ・アクタ
（Helvetica Chimica Acta）第58巻（1975年）531頁に
記載されている方法あるいはこれに準じて製造すること
ができる。たとえば、一般式〔式中、Ｚはアルキル基を示す〕で表わされるＮ−アル
コキシカルボニルマレイミド〔Ｖ〕と、一般式 NH₂（CH₂）_nRCOOH 〔VI〕〔式中、ｎおよびＲは前記と同意義を有する。〕で表わ
されるアミノ酸〔VI〕とを反応させて、一般式〔式中、ｎおよびＲは前記と同意義を有する。〕で表わ
されるマレイミド化合物〔VII〕を得る。次に一般式〔I
II〕で表わされるサクシンイミド化合物〔III〕を加え
先に述べたと同様の脱水剤もしくは脱酸剤の存在下で反
応させることにより製造することができる。Furthermore, as another method, it can be produced according to the method described in Helvetica Chimica Acta, Volume 58 (1975), page 531, or a method similar thereto. For example, the general formula [In the formula, Z represents an alkyl group] and an N-alkoxycarbonylmaleimide [V] and a general formula NH ₂ (CH ₂ ) _n RCOOH [VI] [wherein n and R have the same meanings as described above] Have. ] By reacting with an amino acid [VI] represented by the general formula [In the formula, n and R have the same meanings as described above. ] The maleimide compound [VII] represented by this is obtained. Next, the general formula [I
It can be produced by adding the succinimide compound [III] represented by II] and reacting in the presence of the same dehydrating agent or deoxidizing agent as described above.

上記一般式〔Ｖ〕で表わされる化合物においてＺで表
わされるアルキルとしては、たとえばメチル，エチルが
挙げられる。Examples of the alkyl represented by Z in the compound represented by the above general formula [V] include methyl and ethyl.

ペルオキシダーゼに化合物〔Ｉ〕で反応させるには、
両者をpH約６ないし８の緩衝液中で約10ないし50℃の温
度で約10分ないし24時間反応させることによって行なわ
れる。該緩衝液としては、たとえばpH7.0の0.1Mリン酸
緩衝液,pH6.3の0.05Mリン酸緩衝液などが挙げられる。To react with peroxidase with compound [I],
It is carried out by reacting both in a buffer solution having a pH of about 6 to 8 at a temperature of about 10 to 50 ° C. for about 10 minutes to 24 hours. Examples of the buffer solution include 0.1M phosphate buffer solution having a pH of 7.0 and 0.05M phosphate buffer solution having a pH of 6.3.

このようにして得られたマレイミド化ペルオキシダー
ゼの精製は、たとえばゲルクロマトグラフィーなどによ
り行なうことができる。該ゲルクロマトグラフィーを行
なう際に用いられる担体としてはたとえばセファデック
スＧ−25〔ファルマシア・ファインケミカル社（スエー
エン）製〕，バイオゲルＰ−２〔バイオ・ラッド・ラボ
ラトリーズ社（米国）製〕などが挙げられる。The maleimidated peroxidase thus obtained can be purified by, for example, gel chromatography. Examples of the carrier used when performing the gel chromatography include Sephadex G-25 [manufactured by Pharmacia Fine Chemicals (Swaen)], Biogel P-2 [manufactured by Bio-Rad Laboratories (USA)] and the like. .

マレイミド化ペルオキシダーゼを抗CEA抗体と反応さ
せる場合、抗CEA抗体IgGあるいはペプシン分解して得ら
れたＦ（ab′）₂画分を、メルカプトエチルアミン類の
存在下で還元し、ゲルクロマトグラフィーによって精製
された抗CEA抗体IgGもしくはFab′とマレイミド化ペル
オキシダーゼとを反応させる。When the maleimidated peroxidase is reacted with the anti-CEA antibody, the anti-CEA antibody IgG or the F (ab ') ₂ fraction obtained by decomposing pepsin is reduced in the presence of mercaptoethylamines and purified by gel chromatography. The anti-CEA antibody IgG or Fab 'is reacted with maleimidated peroxidase.

該反応は、両者を緩衝液中で約０℃ないし40℃の温度
で、約１ないし48時間反応させることにより行なうこと
ができる。該緩衝液としては、たとえばpH6.0の5mMエチ
レンジアミン四酢酸ナトリウム塩を含む0.1Mリン酸緩衝
液などが挙げられる。The reaction can be carried out by reacting both in a buffer solution at a temperature of about 0 ° C. to 40 ° C. for about 1 to 48 hours. Examples of the buffer include 0.1 M phosphate buffer containing 5 mM ethylenediaminetetraacetic acid sodium salt having a pH of 6.0.

このようにして得られたペルオキシダーゼ標識抗体
は、たとえばゲルクロマトグラフィーなどにより精製す
ることができる。該ゲルクロマトグラフィーに用いられ
る担体としては、たとえばウルトロゲルAcA44〔LKB社
（フランス）製〕，セファクリルＳ−200〔ファルマシ
ア・ファインケミカル（スエーデン）製〕などが挙げら
れる。The peroxidase-labeled antibody thus obtained can be purified by, for example, gel chromatography. Examples of the carrier used in the gel chromatography include Ultrogel AcA44 [manufactured by LKB (France)], Sephacryl S-200 [manufactured by Pharmacia Fine Chemical (Sweden)] and the like.

作用本発明の測定方法を以下に具体例に説明する。Action The measuring method of the present invention will be described below in specific examples.

まず、：担体に保持された抗体に、測定すべきCEA
含有の分析対象物を加えて抗原抗体反応を行った後これ
に前記で得られたペルオキシダーゼと抗CEA抗体との結
合物を加えて反応させる。First :: CEA to be measured on the antibody retained on the carrier
After the contained analyte is added and an antigen-antibody reaction is carried out, the peroxidase-anti-CEA antibody conjugate obtained above is added and reacted.

本発明の酵素免疫測定法において測定対象となるCEA
を含む被検試料としては、尿，血清，血漿，髄液あるい
は各種臓器抽出物等が挙げられ、とりわけ尿，血清およ
び血漿が繁用される。CEA to be measured in the enzyme immunoassay of the present invention
Examples of test samples containing urine include urine, serum, plasma, cerebrospinal fluid, various organ extracts, and the like, and urine, serum, and plasma are frequently used.

：で得られた反応生成物にペルオキシダーゼの基質
を加え、生じた物質の吸光度もしくは蛍光強度を測定す
ることにより上記の反応生成物の酵素活性を知る。A substrate of peroxidase is added to the reaction product obtained in step (1), and the enzyme activity of the reaction product is determined by measuring the absorbance or fluorescence intensity of the resulting substance.

：上記−の操作を既知量のCEAの標準溶液に対し
予め行ない、CEAと吸光度もしくは蛍光強度との関係を
標準曲線として作成しておく。: The above-mentioned operation is performed in advance for a standard solution of a known amount of CEA, and the relationship between CEA and absorbance or fluorescence intensity is prepared as a standard curve.

：未知量のCEAを含む分析対象物について得られた吸
光度もしくは蛍光強度を標準曲線にあてはめ、分析対象
物中のCEA含量を測定する。: Apply the absorbance or fluorescence intensity obtained for the analyte containing an unknown amount of CEA to a standard curve and measure the CEA content in the analyte.

本発明のサンドイッチ法によるCEAの免疫化学的測定
法に用いられる定量用キットとしては、〔Ａ〕主として、（１）担体上に保持された抗CEA抗体（２）本発明方法により得られたペルオキシダーゼで
標識化された抗CEA抗体（化合物〔Ｉ〕を用いて結合さ
れている。）上記（１）および（２）の２種の抗体のうち少なくと
も一方はモノクローナル抗体である。The quantification kit used in the immunochemical assay method for CEA by the sandwich method of the present invention includes: [A] mainly (1) an anti-CEA antibody retained on a carrier (2) a peroxidase obtained by the method of the present invention The anti-CEA antibody labeled with (combined with the compound [I]) At least one of the two antibodies (1) and (2) is a monoclonal antibody.

（３）標準CEA （４）上記（２）〜（３）の試薬および被検試料の希
釈に用いる緩衝液（血清と蛋白性物質とを共存せしめた
約10％牛血清および約１％牛血清アルブミン（以下、BS
Aと略称することもある。）を含むpH約６ないし９のリ
ン酸緩衝液またはグリシン緩衝液が挙げられる。），（５）ペルオキシダーゼ活性測定に必要な試薬。その
一例として蛍光法の場合、酵素基質としてｐ−ハイドロ
キシフエニル酢酸と過酸化水素、比色法の場合、ｏ−フ
エニレンジアミンと過酸化水素。酵素基質の溶解に用い
る緩衝液（好ましくはリン酸緩衝液）および酵素反応停
止液。(3) Standard CEA (4) Buffer used for diluting the reagents of (2) to (3) above and the test sample (about 10% bovine serum and about 1% bovine serum in which serum and proteinaceous substances are allowed to coexist) Albumin (hereinafter BS
Sometimes abbreviated as A. A phosphate buffer or glycine buffer having a pH of about 6 to 9 containing). ), (5) Reagents required for peroxidase activity measurement. For example, in the case of the fluorescence method, p-hydroxyphenylacetic acid and hydrogen peroxide are used as enzyme substrates, and in the case of the colorimetric method, o-phenylenediamine and hydrogen peroxide. A buffer solution (preferably a phosphate buffer solution) used for dissolving the enzyme substrate and an enzyme reaction stopping solution.

が挙げられる。Is mentioned.

〔Ｂ〕主として、（１）担体上に保持された抗CEA抗体（２）本発明方法により得られたペルオキシダーゼで
標識化された抗CEA抗体（チオール化されたペルオキシ
ダーゼと抗CEA抗体とが化合物〔Ｉ〕を用いて結合され
ている。），（３）標準CEA, （４）上記（２）〜（３）の試薬および被検試料の希
釈に用いる緩衝液（血清と蛋白性物質とを共存せしめた
約10％ヒツジ血清および約１％牛血清アルブミン（以
下、BSAと略称することもある。）を含むpH約６ないし
９のリン酸緩衝液またはグリシン緩衝液が挙げられ
る。），（５）ペルオキシダーゼ活性測定に必要な試薬。その
一例として蛍光法の場合、酵素基質としてｐ−ハイドロ
キシフエニル酢酸と過酸化水素、比色法の場合、ｏ−フ
エニレンジアミンと過酸化水素。酵素基質の溶解に用い
る緩衝液（好ましくはリン酸緩衝液）および酵素反応停
止液。[B] Mainly (1) anti-CEA antibody retained on a carrier (2) anti-CEA antibody labeled with peroxidase obtained by the method of the present invention (thiolated peroxidase and anti-CEA antibody are compounds [ I]], (3) Standard CEA, (4) Reagents of the above (2) to (3) and a buffer used for diluting the test sample (serum and proteinaceous substance coexistent). A phosphate buffer or a glycine buffer having a pH of about 6 to 9 containing about 10% sheep serum and about 1% bovine serum albumin (hereinafter sometimes abbreviated as BSA) is included. ) Reagents required for peroxidase activity measurement. For example, in the case of the fluorescence method, p-hydroxyphenylacetic acid and hydrogen peroxide are used as enzyme substrates, and in the case of the colorimetric method, o-phenylenediamine and hydrogen peroxide. A buffer solution (preferably a phosphate buffer solution) used for dissolving the enzyme substrate and an enzyme reaction stopping solution.

が挙げられる。Is mentioned.

さらに〔Ｃ〕主として、（１）担体上に保持された抗CEA抗体（２）本発明方法により得られたペルオキシダーゼで
標識化された抗CEA抗体（チオール化されたペルオキシ
ダーゼと抗CEA抗体とが化合物〔Ｉ〕を用いて結合され
ている。）上記（１）および（２）の２種の抗体のうち少なくと
も一方はモノクローナル抗体である。Furthermore, [C] mainly, (1) anti-CEA antibody retained on a carrier (2) anti-CEA antibody labeled with peroxidase obtained by the method of the present invention (thiolated peroxidase and anti-CEA antibody are compounds It is bound using [I].) At least one of the two antibodies (1) and (2) above is a monoclonal antibody.

（３）標準CEA, （４）上記（２）〜（３）の試薬および被検試料の希
釈に用いる緩衝液（血清と蛋白性物質とを共存せしめた
約10％ヒツジ血清および約１％牛血清アルブミン（以
下、BSAと略称することもある。）を含むpH約６ないし
９のリン酸緩衝液またはグリシン緩衝液が挙げられ
る。），（５）ペルオキシダーゼ活性測定に必要な試薬。その
一例として蛍光法の場合、酵素基質としてｐ−ハイドロ
キシフエニル酢酸と過酸化水素、比色法の場合、ｏ−フ
エニレンジアミンと過酸化水素。酵素基質の溶解に用い
る緩衝液（好ましくはリン酸緩衝液）および酵素反応停
止液。(3) Standard CEA, (4) Buffers used for diluting the reagents of (2) to (3) above and the test sample (about 10% sheep serum in which serum and protein substances coexist and about 1% cow) A phosphate buffer or a glycine buffer having a pH of about 6 to 9 containing serum albumin (hereinafter sometimes abbreviated as BSA) is included.) (5) A reagent necessary for measuring peroxidase activity. For example, in the case of the fluorescence method, p-hydroxyphenylacetic acid and hydrogen peroxide are used as enzyme substrates, and in the case of the colorimetric method, o-phenylenediamine and hydrogen peroxide. A buffer solution (preferably a phosphate buffer solution) used for dissolving the enzyme substrate and an enzyme reaction stopping solution.

が挙げられる。Is mentioned.

上記のキットは例えば下記の方法により使用すること
ができる。The above kit can be used, for example, by the following method.

標準CEAもしくは被検液約10ないし200μｌに試薬
（４）を加えて希釈し、一定量の試薬（１）を加えて約
０ないし40℃で約１ないし48時間反応させる。担体を水
洗後、試薬（２）の約10ないし300μｌを加えたのち、
約０ないし40℃で反応させる。約１ないし48時間反応
後、担体を洗浄し担体上に結合しているペルオキシダー
ゼ活性を測定する。即ちペルオキシダーゼの基質液約10
〜1000μｌを加えて約20〜40℃で約0.2〜24時間反応さ
えたのち、酵素反応を停止させ、反応液中の吸光度もし
くは蛍光強度を測定する。Reagent (4) is diluted to about 10 to 200 μl of standard CEA or test solution, a certain amount of reagent (1) is added, and the mixture is reacted at about 0 to 40 ° C. for about 1 to 48 hours. After washing the carrier with water, add about 10 to 300 μl of reagent (2),
React at about 0-40 ° C. After reacting for about 1 to 48 hours, the carrier is washed and the peroxidase activity bound on the carrier is measured. That is, about 10 substrates solution of peroxidase
After adding ~ 1000 µl and reacting at about 20-40 ° C for about 0.2-24 hours, the enzyme reaction is stopped and the absorbance or fluorescence intensity in the reaction solution is measured.

本発明の免疫化学的分析法用試薬を用いれば、通常の
臨床検査室において簡単な操作でCEAの高感度測定が可
能となる。By using the reagent for immunochemical analysis method of the present invention, it becomes possible to measure CEA with high sensitivity in a usual clinical laboratory by a simple operation.

実施例参考例１過塩素酸抽出法による精製およびモノクロ
ーナル抗体の作製（１）抗原の精製 Krupeyらの方法〔イムノケミストリー（Immuno-Chemi
stry），第９巻（1972年），第617頁〕に準じてCEAを精
製した。すなわち大腸癌組織100gを細断し、これに400m
lの蒸留水を加えてホモジナイザーで氷冷下１時間破砕
して懸濁液を調製した。次に、等容量の2M過塩素酸を加
えて室温で30分間攪拌し抽出した。次に遠心分離し、そ
の上清について蒸留水に対して透析したのち凍結感想し
た。次に0.15MNaClを含む0.05Mリン酸緩衝液を用いてセ
ファロース4B〔ファルマシア製（スエーデン）〕のカラ
ム（23cm×100cm）にかけてゲルクロマトグラフィーを
行なった。CEAを含むフラクションを透析し、凍結乾燥
後、更にセファデックスＧ−200のカラム（2.3cm×100c
m）でゲルクロマトグラフィーを行ない、CEA溶出画分を
透析、凍結乾燥してCEAの精製抗原を得た（3mg）。Examples Reference Example 1 Purification by perchloric acid extraction method and production of monoclonal antibody (1) Purification of antigen Method of Krupey et al. [Immuno-Chemi
Stry), Vol. 9, (1972), p. 617]. That is, 100 g of colon cancer tissue is shredded and 400 m
l of distilled water was added, and the mixture was crushed with a homogenizer for 1 hour under ice cooling to prepare a suspension. Next, an equal volume of 2M perchloric acid was added, and the mixture was stirred at room temperature for 30 minutes for extraction. Next, the mixture was centrifuged, and the supernatant was dialyzed against distilled water and then frozen. Then, gel chromatography was carried out using a 0.05 M phosphate buffer containing 0.15 M NaCl on a column (23 cm × 100 cm) of Sepharose 4B [Pharmacia (Sweden)]. The CEA-containing fraction was dialyzed, freeze-dried, and then further separated on a Sephadex G-200 column (2.3 cm × 100 c).
Gel chromatography was carried out with m), and the CEA-eluted fraction was dialyzed and freeze-dried to obtain a purified antigen of CEA (3 mg).

（２）モノクロナール抗CEA抗体の作製前項（１）で得た精製抗原70μｇを生理食塩水150μ
ｌに溶解し、これにフロインドの完全アジュバント〔Er
eund′s complete adjuvant,“免疫の生化学",橘ら著，
第26頁，共立出版株式会社（1967年）〕250μｌを加え
てよく混和して乳剤を作り、これをBALB/Cマウス皮下に
投与した。更に、２週毎に２回，フロインドの不完全ア
ジュバンドを用いて免疫し、最終免疫として精製抗原13
0μｇを生理食塩水に溶解して得た400μｌを静脈投与
し、３日後脾臓を取り出した。次に、Dulbecco′s modi
fied MEM培地でよく洗浄したのち、当該脾細胞１×10⁸
個とマウスミエローマ細胞（P₃U₁）２×10⁷個とを混合
し、700rpmで15分間遠心してペレットをつくった。次に
ポリエチレングリコール6000をRPMI-1640に45％に溶解
した液0.4mlを加えて、更にRPM-1640,15mlを徐々に加え
て希釈したのち、700rpmで15分間遠心分離し、細胞を20
％牛胎児血清を含むRPMI-1640培地100mlに分散させた。
次に24ウエルの培養プレート〔フロー社製（米国）〕に
上記細胞分散液1.0mlずつ注入し、更に２日目,5日目，
および８日目に培養上清の半量をHAT培地におきかえ
た。14日後における培養上清について抗体価を測定した
ところ、計120ウエル中12ウエルに陽性を認めた。(2) Preparation of monoclonal anti-CEA antibody 70 μg of the purified antigen obtained in (1) above was added to 150 μl of physiological saline.
1 Freund's complete adjuvant [Er
eund ′s complete adjuvant, “Immune biochemistry”, Tachibana et al.,
Page 26, Kyoritsu Shuppan Co., Ltd. (1967)] 250 μl was added and mixed well to prepare an emulsion, which was subcutaneously administered to BALB / C mice. Furthermore, immunization was performed twice every two weeks using Freund's incomplete adjuvant, and purified antigen 13 was used as the final immunization.
400 μl obtained by dissolving 0 μg in physiological saline was intravenously administered, and 3 days later, the spleen was taken out. Next, Dulbecco ’s modi
After washing well with fied MEM medium, the splenocytes 1 × 10 ⁸
The cells were mixed with 2 × 10 ⁷ mouse myeloma cells (P ₃ U ₁ ) and centrifuged at 700 rpm for 15 minutes to form a pellet. Next, 0.4 ml of 45% polyethylene glycol 6000 dissolved in RPMI-1640 was added, and 15 ml of RPM-1640 was gradually added to dilute it, and then the cells were centrifuged at 700 rpm for 15 minutes to give 20 cells.
It was dispersed in 100 ml of RPMI-1640 medium containing% fetal bovine serum.
Next, 1.0 ml each of the above cell dispersion was injected into a 24-well culture plate [Flo Inc. (USA)], and then on the second and fifth days,
On day 8 and 8, half of the culture supernatant was replaced with HAT medium. When the antibody titer of the culture supernatant after 14 days was measured, 12 wells out of 120 wells were positive.

次に、これら陽性ハイブリドーマのクローエングを牛
胎児血清20％およびBALB/Cマウス胸腺細胞をフィーダー
（feeder）として加えた。RPMI-1640培地で希釈し、限
界希釈（limiting dilution）法を繰り返して行ない最
終的にはモノクローナル抗CEA抗体を産生する12種類の
ハイブリドーマが得られた。これらを鉱油で処理された
BALB/Cマウスの腹腔内に注入し、２〜３週間後に腹水を
採取することにより、モノクローナル抗CEA抗体を得
た。これらのモノクローナル抗体を硫酸アンモニウム法
で塩析し、それぞれグロブリン画分を得た（M₀〜K₁〜M₀
〜K₁₂）。Next, 20% fetal bovine serum and LB cells of BALB / C mouse thymocytes were added to the clones of these positive hybridomas as a feeder. By diluting with RPMI-1640 medium and repeating limiting dilution method, 12 kinds of hybridomas producing a monoclonal anti-CEA antibody were finally obtained. These were treated with mineral oil
A monoclonal anti-CEA antibody was obtained by injecting BALB / C mice intraperitoneally and collecting ascites after 2-3 weeks. These monoclonal antibodies were salted out with ammonium sulfate method to respectively obtain a globulin fraction (M _₀ ~K ₁ ~M ₀
~ K ₁₂ ).

参考例２過ヨウ素酸架橋法仲根らの方法〔ザ・ジャーナル・オブ・ヒストケミス
トリー・アンド・サイトケミストリー（The Journal of
Histochmistry and Cytochemistry）第22巻（1974年）
第1084頁〕に従って行なった。7mgの西洋わさびペルオ
キシダーゼを1mlの0.3M重炭酸ナトリウム溶液（pH8.1）
にとかし、0.1mlの１％１−フルオロ−2,4−ジニトロベ
ンゼンを加えて室温で１時間反応させた。次に0.06MNaI
O₄1mlを加えて室温で30分間攪拌したのち、0.16Mエチレ
ングリコール水溶液1mlを加えて室温で１時間放置し
た。0.01M炭酸ナトリウム緩衝液（pH9.5）に対して１夜
透析した。Reference Example 2 Periodic Acid Crosslinking Method Nakane et al.'S method [The Journal of Histochemistry and Site Chemistry (The Journal of
Histochmistry and Cytochemistry) Volume 22 (1974)
Page 1084]. 7 mg horseradish peroxidase in 1 ml 0.3 M sodium bicarbonate solution (pH 8.1)
Then, 0.1 ml of 1% 1-fluoro-2,4-dinitrobenzene was added, and the mixture was reacted at room temperature for 1 hour. Then 0.06M NaI
After 1 ml of O ₄ was added and stirred at room temperature for 30 minutes, 1 ml of 0.16M ethylene glycol aqueous solution was added and left at room temperature for 1 hour. It was dialyzed overnight against 0.01 M sodium carbonate buffer (pH 9.5).

後述の実施例１−（２）で得られたモノクローナル抗
CEA抗体ガンマ・グロブリンフラクション（M₀−T₃）5mg
を0.01M炭酸ナトリウム緩衝液（pH9.5）1mlにとかし、
先に調製したアルデヒドペルオキシダーゼと混合して室
温で３時間反応させてから、5mgの水素化硼素ナトリウ
ムに加えて４℃で１夜反応させた。0.15MNaClを含む0.0
1Mリン酸緩衝液（pH7.1）に対して４℃で１夜透析した
後、ウルトロゲルAcA44を充てんしたカラム（1.5cm×45
cm）を用いるゲルクロマトグラフィーにかけ、0.1Mリン
酸緩衝液（pH6.5）で溶出させた。後述の実施例１−
（５）と同様に溶出液の280および403nmの吸光度ならび
に酵素活性を測定して目的フラクションを分取した。得
られたモノクローナル抗CEA抗体−HRP複合体はBSAとし
て0.1％、マーチオレートとして0.005％になるようにし
て４℃で保存した。The monoclonal antibody obtained in Example 1- (2) described below.
CEA antibody gamma globulin fraction (M ₀ -T ₃ ) 5mg
Is dissolved in 1 ml of 0.01 M sodium carbonate buffer (pH 9.5),
After mixing with the aldehyde peroxidase prepared previously, it was made to react at room temperature for 3 hours, then, it added to 5 mg of sodium borohydride, and made to react at 4 degreeC overnight. 0.0 including 0.15 M NaCl
After dialysis against 1M phosphate buffer (pH 7.1) at 4 ° C overnight, a column packed with Ultrogel AcA44 (1.5 cm × 45
cm) and was eluted with 0.1 M phosphate buffer (pH 6.5). Example 1 below
The absorbance at 280 and 403 nm and the enzyme activity of the eluate were measured in the same manner as in (5) to fractionate the target fraction. The obtained monoclonal anti-CEA antibody-HRP complex was stored at 4 ° C. so that the BSA was 0.1% and the merthiolate was 0.005%.

実施例１（１）抗原の精製大腸癌組織200gを細断し、これに600mlの１％Tween20
〔シグマ社（米国）製〕を含む0.15MNaCl溶液を加えて
ホモジナイザーで氷冷下10分間破砕して懸濁液を調製し
た。さらに超音波発生機で氷冷下１時間処理したのち、
12,000rpm20分間遠心分離した。上清を蒸留水に対して
透析したのち凍結乾燥した。次に0.2Mクエン酸緩衝液
（pH6.5）に溶解し、同じ緩衝液を用いて調製したコン
カナバリンＡ結合セファロース4B〔ファルマシア製（ス
エーデン）〕のカラム（2.2cm×26cm）にかけた。カラ
ムに保持された物質をα−メチル−Ｄ−マンノサイドを
含む緩衝液を用いて溶出した。蒸留水に対して透析した
のち凍結乾燥した。次に0.2Mクエン酸緩衝液（pH6.5）
を用いてウルトロゲルAcA-34〔LKB社製（フランス）〕
のカラム（2.3cm×100cm）にかけてゲルクロマトグラフ
ィーを行ない、280×350mlの画分を蒸留水に対して透析
し、凍結乾燥してCEAの精製抗原を得た（5mg）。Example 1 (1) Purification of Antigen 200 g of colorectal cancer tissue was shredded and 600 ml of 1% Tween 20
A 0.15 M NaCl solution containing [Sigma (USA)] was added, and the mixture was crushed with a homogenizer for 10 minutes under ice cooling to prepare a suspension. After treating with an ultrasonic generator for 1 hour under ice cooling,
It was centrifuged at 12,000 rpm for 20 minutes. The supernatant was dialyzed against distilled water and then freeze-dried. Next, it was dissolved in 0.2 M citrate buffer (pH 6.5) and applied to a column (2.2 cm × 26 cm) of Concanavalin A-bound Sepharose 4B [Pharmacia (Sweden)] prepared using the same buffer. The substance retained on the column was eluted with a buffer solution containing α-methyl-D-mannocide. It was dialyzed against distilled water and then freeze-dried. Next, 0.2M citrate buffer (pH 6.5)
Using Ultrogel AcA-34 [LKB (France)]
The column (2.3 cm x 100 cm) was subjected to gel chromatography, and the 280 x 350 ml fraction was dialyzed against distilled water and freeze-dried to obtain a purified antigen of CEA (5 mg).

（２）モノクローナル抗CEA抗体の作製前項（１）で得た精製抗原70μｇを生理食塩水150μ
ｌに溶解し、これにフロインドの完全アジュバント〔Fr
eund′s complete adjuvant,“免疫の生化学",橘ら著，
第26頁，共立出版株式会社（1967年）〕250μｌを加え
てよく混和して乳剤を作り、これをBALB/Cマウス皮下に
投与した。更に、２週毎に２回、フロインドの不完全ア
ジュバンドを用いて免疫し、最終免疫として精製抗原13
0μｇを生理食塩水に溶解して得た400μｌを静脈投与
し、３日後脾臓を取り出した。次に、Dulbecco′s modi
fied MEM培地でよく洗浄したのち、当該脾細胞１×10⁸
個とマウスミエローマ細胞（P₃U₁）２×10⁷個とを混合
し、700rpmで15分間遠心してペレットをつくった。次に
ポリエチレングリコール6000をRPMI-1640に45％に溶解
した液0.4mlを加えて、更にRPMI-1640 15mlを徐々に加
えて希釈したのち、700rpmで15分間遠心分離し、細胞を
20％牛胎児血清を含むRPMI-1640培地100mlに分散させ
た。次に24ウエルの培養プレート〔フロー社製（米
国）〕に上記細胞分散液2.0mlずつ注入し、更に２日目,
5日目，および８日目に培養上清の半量をHAT培地におき
かえた。14日後における培養上清について抗体価を測定
したところ、計72ウエル中９ウエルに陽性を認めた。(2) Preparation of monoclonal anti-CEA antibody 70 μg of the purified antigen obtained in (1) above was added to 150 μl of physiological saline.
1 Freund's complete adjuvant [Fr
eund ′s complete adjuvant, “Immune biochemistry”, Tachibana et al.,
Page 26, Kyoritsu Shuppan Co., Ltd. (1967)] 250 μl was added and mixed well to prepare an emulsion, which was subcutaneously administered to BALB / C mice. Furthermore, immunization with Freund's incomplete adjuvant was performed twice every two weeks, and purified antigen 13 was used as the final immunization.
400 μl obtained by dissolving 0 μg in physiological saline was intravenously administered, and 3 days later, the spleen was taken out. Next, Dulbecco ’s modi
After washing well with fied MEM medium, the splenocytes 1 × 10 ⁸
The cells were mixed with 2 × 10 ⁷ mouse myeloma cells (P ₃ U ₁ ) and centrifuged at 700 rpm for 15 minutes to form a pellet. Next, 0.4 ml of 45% polyethylene glycol 6000 dissolved in RPMI-1640 was added, and 15 ml of RPMI-1640 was gradually added to dilute it, and then centrifuged at 700 rpm for 15 minutes to remove the cells.
It was dispersed in 100 ml of RPMI-1640 medium containing 20% fetal bovine serum. Then, 2.0 ml of each of the above cell dispersions was poured into a 24-well culture plate [Flow (USA)].
On days 5 and 8, half of the culture supernatant was replaced with HAT medium. When the antibody titer of the culture supernatant after 14 days was measured, a positive result was observed in 9 of 72 wells.

次に、これら陽性ハイブリドーマのクローエングを牛
胎児血清20％およびBALB/Cマウス胸腺細胞をフィーダー
（feeder）として加えた。RPMI-1640培地で希釈し、限
界希釈（limiting dilution）法を繰り返して行ない最
終的にはモノクローナル抗CEA抗体を産生する５種類の
ハイブリドーマが得られた。これらを鉱油で処理された
BALB/Cマウスの腹腔内に注入し、２〜３週間後に腹水を
採取することにより、モノクローナル抗CEA抗体を得
た。これらのモノクローナル抗体を硫酸アンモニウム法
で塩析し、それぞれグロブリン画分を得た（M₀〜T₁〜M₀
〜T₆）。Next, 20% fetal bovine serum and LB cells of BALB / C mouse thymocytes were added to the clones of these positive hybridomas as a feeder. By diluting with RPMI-1640 medium and repeating limiting dilution method, five kinds of hybridomas producing monoclonal anti-CEA antibody were finally obtained. These were treated with mineral oil
A monoclonal anti-CEA antibody was obtained by injecting BALB / C mice intraperitoneally and collecting ascites after 2-3 weeks. These monoclonal antibodies were salted out by the ammonium sulfate method to obtain globulin fractions (M _{0 to} T _{1 to} M _0).
~ T ₆ ).

（３）ポリクローナル抗CEA抗体の作製前項（１）で得た精製抗原2mgを生理食塩水1mlに溶解
し、これにフロインドの完全アジュバンド1mlを加えて
よく混和して乳剤を作り、これをウサギの両大腿部筋肉
内および背部皮下数箇所に注射した。以上の操作を３週
毎に５回行ない最終免疫後１週間で採血して抗血清を得
た。硫酸アンモニウム法で塩析してグロブリン画分を調
製したのち、CEA結合セファロース4Bのカラムを用いる
アフィニティ・クロマトグラフィーに供した。カラムに
保持された抗体画分を0.17Mグリシン−塩酸緩衝液（pH
2.3）で溶出することにより、CEAに強い親和性を有する
ポリクローナル抗体を得た。(3) Preparation of polyclonal anti-CEA antibody Dissolve 2 mg of the purified antigen obtained in (1) above in 1 ml of physiological saline, add 1 ml of Freund's complete adjuvant and mix well to form an emulsion. Were injected intramuscularly in both thighs and subcutaneously in the back. The above operation was performed 5 times every 3 weeks, and blood was collected 1 week after the final immunization to obtain antiserum. The globulin fraction was prepared by salting out with the ammonium sulfate method, and then subjected to affinity chromatography using a column of CEA-bound Sepharose 4B. The antibody fraction retained on the column was added to 0.17M glycine-hydrochloric acid buffer solution (pH
By elution with 2.3), a polyclonal antibody having a strong affinity for CEA was obtained.

（４）モノクローナル抗体の反応性の比較前項（２）および参考例１で得られた各種モノクロー
ナル抗体のCEAおよび関連抗原に対する反応性を調べ
た。(4) Comparison of Reactivity of Monoclonal Antibodies The reactivity of the various monoclonal antibodies obtained in the above (2) and Reference Example 1 with CEA and related antigens was examined.

試薬：前項（２）および参考例１で得られたモノクローナ
ル抗CEA抗体感作マイクロプレート西洋わさびペルオキシダーゼ（以下HRPと略称す
る）標識抗CEA抗体複合体〔DAKOBiochemicals社（デン
マーク）製〕 CEAおよびCEA関連抗原緩衝液Ｂ（10％子牛血清、0.15MNaClを含むpH7.0の
0.02Mリン酸緩衝液）、緩衝Ａ（0.15MNaClを含むpH7.0
の0.02Mリン酸緩衝液）ペルオキシダーゼ活性測定に必要な試薬0.02％過酸
化水素と0.15％ｏ−フェニレンジアミンを含むpH4.8の
0.1Mクエン酸−リン酸二ナトリウム緩衝液および反応停
止板（2N−硫酸）。Reagent: Monoclonal anti-CEA antibody-sensitized microplate obtained in the preceding paragraph (2) and Reference Example 1 Horseradish peroxidase (HRP) -labeled anti-CEA antibody complex [DAKO Biochemicals (Denmark)] CEA and CEA-related Antigen buffer B (10% calf serum, pH 7.0 containing 0.15 M NaCl)
0.02M phosphate buffer), buffer A (pH 7.0 containing 0.15M NaCl)
0.02M phosphate buffer) Reagent necessary for peroxidase activity measurement 0.02% hydrogen peroxide and 0.15% o-phenylenediamine containing pH 4.8
0.1M citric acid-disodium phosphate buffer and stop plate (2N-sulfuric acid).

抗体感作マイクロプレートの調製： EIA用イムノプレートＩ〔ヌンク社（デンマーク）
製〕の各ウエルに0.1M炭酸緩衝液（pH9.6）で希釈して
調製した前項（２）あるいは参考例１のモノクローナル
抗CEA抗体溶液（50μg/ml）を100μｌずつ注入して４℃
で一夜放置して感作させた。0.1％BSAを含む0.01Mリン
酸緩衝液（pH7.0）で洗浄したのち、用時まで冷所保存
した。Preparation of antibody-sensitized microplate: EIA immunoplate I [Nunc (Denmark)
100 μl each of the monoclonal anti-CEA antibody solution (50 μg / ml) of the preceding item (2) or Reference Example 1 prepared by diluting each well with 0.1 M carbonate buffer (pH 9.6) at 4 ° C.
I left it overnight and sensitized. After washing with 0.01 M phosphate buffer (pH 7.0) containing 0.1% BSA, it was stored in a cool place until use.

測定：緩衝液Ｂに溶解させたCEA標準溶液100μｌを各ウエル
に注入し、37℃で３時間反応させた。各ウエルを緩衝液
Ａで洗浄後、HRP標識抗CEA複合体溶液（HRPとして30ng/
ウエル）100μｌを加えて25℃で3.5時間さらに反応させ
た。緩衝液Ａで洗浄し、これに0.02％過酸化水素と0.15
％ｏ−フェニレンジアミンを含む0.1Mクエン酸一リン酸
二ナトリウム緩衝液（pH4.8）100μｌを加えて30℃で30
分間反応させ、2N−硫酸100μｌずつ加えて反応を停止
させてから、マイクロプレート用自動比色計〔タイマー
テック・マルチスキャン；フロー社（米国）製〕を用
い、ブランクを対照にして490nmにおける吸光度を測定
した。Measurement: 100 μl of CEA standard solution dissolved in buffer B was injected into each well and reacted at 37 ° C. for 3 hours. After washing each well with buffer A, HRP-labeled anti-CEA complex solution (30 ng / HRP / HRP) was added.
100 μl of well) was added and further reacted at 25 ° C. for 3.5 hours. Wash with buffer A, add 0.02% hydrogen peroxide and 0.15
100 μl of 0.1 M disodium citrate monophosphate buffer (pH 4.8) containing 10% o-phenylenediamine was added to the mixture at 30 ° C.
After reacting for 2 minutes and adding 100 μl each of 2N-sulfuric acid to stop the reaction, use an automatic colorimeter for microplates (Timer Tech Multiscan; manufactured by Flow Co. (USA)) with the blank as a control and the absorbance at 490 nm Was measured.

結果を第１表に示したが、前記（２）で得られたモノ
クローナル抗CEA抗体は、６抗体中４抗体でCEA関連抗原
であるNCA（nonspecific crossreacting antigen）やNC
A−２（nonspecific crossreacting antigen−２）と反
応せず、したがって高い確率でCEAに特異的なモノクロ
ーナル抗CEA抗体の得られることが分った。一方、参考
例１で得られたモノクローナル抗CEA抗体は12抗体中１
抗体（M₀−K₆）だけがNCAならびにNCA−２とは反応せず
残りの11抗体はこれらのCEA関連抗原と反応した。The results are shown in Table 1. The monoclonal anti-CEA antibodies obtained in (2) above are 4 out of 6 antibodies, which are CEA-related antigens such as NCA (nonspecific crossreacting antigen) and NC.
It has been found that it does not react with A-2 (nonspecific crossreacting antigen-2), and thus a CEA-specific monoclonal anti-CEA antibody can be obtained with high probability. On the other hand, the monoclonal anti-CEA antibody obtained in Reference Example 1 was 1 in 12 antibodies.
The remaining 11 antibodies only antibody (M ₀ -K ₆₎ does not react with NCA and NCA-2 reacted with these CEA-related antigens.

（５）ポリクローナル抗CEA抗体（Fab′）−HRP複合
体の製造（ａ）マレイミド基の導入 6mgの西洋わさびペルオキシダーゼ〔ベーリンガーマ
ンハイム社（西ドイツ）製〕を1mlの0.1Mリン酸緩衝液
（pH7.0）に溶解し、50μｌのN,N−ジメチルホルムアミ
ドにとかした結合試薬MMC（一般式〔Ｉ〕において、ｎ
＝1,R＝シクロヘキシレンである化合物）4.8mgを加えて
30℃で60分間攪拌しながら反応させた。生成した沈殿を
遠心分離して除去し、上清をセフアデックスＧ−25のカ
ラム（1.0×45cm）に通し、0.1Mリン酸緩衝液で溶出さ
せた。タンパクを含む画分を分取し、コロジオン膜を用
いて濃縮した。このようにして調製したマレイミド化ペ
ルオキシダーゼにおいてペルオキシダーゼ１分子あたり
導入されたマレイミド基の数は1.0〜1.2個であった（ペ
ルオキシダーゼの分子量を40,000,▲Ｅ^280nm _1%▼＝22.7
5として計算）。 (5) Production of polyclonal anti-CEA antibody (Fab ')-HRP complex (a) Introduction of maleimide group 6 mg of horseradish peroxidase (Boehringer Mannheim (West Germany)) in 1 ml of 0.1 M phosphate buffer (pH 7. 0) and dissolved in 50 μl of N, N-dimethylformamide as a binding reagent MMC (in the general formula [I], n
= 1, R = cyclohexylene) 4.8 mg
The reaction was carried out at 30 ° C. for 60 minutes with stirring. The formed precipitate was removed by centrifugation, and the supernatant was passed through a Sephadex G-25 column (1.0 × 45 cm) and eluted with 0.1 M phosphate buffer. The protein-containing fraction was collected and concentrated using a collodion membrane. In the maleimidated peroxidase thus prepared, the number of maleimide groups introduced per molecule of peroxidase was 1.0 to 1.2 (the molecular weight of peroxidase was 40,000, ▲ E ^{280 nm} _1% ▼ = 22.7).
Calculated as 5).

（ｂ）マレイミド化ペルオキシダーゼと抗CEA抗体
（Fab′フラグメント）との複合体の製造前項（３）で
得られたポリクローナル抗CEA抗体5mgに0.1mgのペプシ
ンを加え30℃で一夜反応後、セファデックスＧ−150カ
ラム（直径2.5cm,長さ55cm）で精製した。得られた抗体
Ｆ（ab′）₂画分を２−メルカプトエチルアミンで還元
し、セファデックス−25のカラムによるゲルクロマトグ
ラフィーで精製してウサギ抗CEA抗体（Fab′フラグメン
ト）を得た。(B) Preparation of complex of maleimidated peroxidase and anti-CEA antibody (Fab ′ fragment) 0.1 mg of pepsin was added to 5 mg of the polyclonal anti-CEA antibody obtained in the above (3), and the mixture was reacted at 30 ° C. overnight, and then Sephadex. It was purified by a G-150 column (diameter 2.5 cm, length 55 cm). The obtained antibody F (ab ') ₂ fraction was reduced with 2-mercaptoethylamine and purified by gel chromatography on a Sephadex-25 column to give a rabbit anti-CEA antibody (Fab' fragment).

上記（ａ）で調製したマレイミド化ペルオキシダーゼ
1.5mgを0.1Mリン酸緩衝液（pH6.0）0.15mlに溶解し、先
に得た抗CEA抗体（Fab′フラグメント）1.8mgをとかし
た5mMエチレンジアミン四酢酸ナトリウム塩を含む0.1M
リン酸緩衝液（pH6.0）0.15mlを加えて４℃で20時間反
応させた。反応後、ウルトロゲルAcA44を充てんしたカ
ラム（1.5×45cm）を用いるゲルクロマトグラフィーに
かけ、0.1Mリン酸緩衝液（pH6.5）で溶出させた。溶出
液の280nmの吸光度ならびに酵素活性を測定した。ペル
オキシダーゼとウサギ抗CEA抗体（Fab′フラグメント）
との複合体が生成していることを、以下の方法で確認し
た。Maleimidated peroxidase prepared in (a) above
0.1 mg containing 5 mM ethylenediaminetetraacetic acid sodium salt prepared by dissolving 1.5 mg in 0.15 ml of 0.1 M phosphate buffer (pH 6.0) and dissolving 1.8 mg of the anti-CEA antibody (Fab ′ fragment) obtained above
Phosphate buffer solution (pH 6.0) 0.15 ml was added and reacted at 4 ° C. for 20 hours. After the reaction, it was subjected to gel chromatography using a column (1.5 × 45 cm) packed with Ultrogel AcA44 and eluted with 0.1 M phosphate buffer (pH 6.5). The absorbance at 280 nm and the enzyme activity of the eluate were measured. Peroxidase and rabbit anti-CEA antibody (Fab 'fragment)
It was confirmed by the following method that a complex with was produced.

まず、酵素活性の測定はギルバルトらの方法〔アナリ
ティカル・ケミストリー（Analytical Chemistry），第
40巻（1968年）,1256頁〕で行なった。即ち、溶出液の
各フラクションンを0.1％ウシ血清アルブミンを含む0.1
Mリン酸緩衝液（pH7.0）で1800倍に希釈した。この10μ
ｌに0.1％ウシ血清アルブミンを含む0.05M酢酸ナトリウ
ム緩衝液（pH5.0）に溶解した0.5％ｐ−ハイドロキシフ
エニル酢酸0.25mlを加えて混合し30℃で５分間インキュ
ベートした。次に0.01％過酸化水素0.05mlを加えて30℃
で20分反応させた。0.1Mグリシン緩衝液（pH10.3）2.5m
lを加えて酵素反応を停止させ、１μg/mlのキニンの蛍
光強度を100とし励起光320nmにおける405nmの蛍光強度
を測定した。結果を第１図に示す。第１図において、は280nmにおける吸光度を、はペルオキシダーゼ活性（蛍光強度として）をそれぞれ
示す。フラクション38付近においてペルオキシダーゼと
抗CEA抗体（Fab′フラグメント）との複合体の生成が極
めて良好であることが分かった。First, the enzyme activity was measured by the method of Gilbalt et al. [Analytical Chemistry, No. 1].
40 (1968), p. 1256]. That is, each fraction of the eluate was 0.1% containing 0.1% bovine serum albumin.
It was diluted 1800 times with M phosphate buffer (pH 7.0). This 10μ
0.25 ml of 0.5% p-hydroxyphenylacetic acid dissolved in 0.05M sodium acetate buffer (pH 5.0) containing 0.1% bovine serum albumin was added to 1 liter and mixed, and the mixture was incubated at 30 ° C. for 5 minutes. Then add 0.05 ml of 0.01% hydrogen peroxide at 30 ℃
And reacted for 20 minutes. 0.1M glycine buffer (pH 10.3) 2.5m
The enzyme reaction was stopped by adding l, and the fluorescence intensity of quinine at 1 μg / ml was set to 100, and the fluorescence intensity at 405 nm at 320 nm of excitation light was measured. The results are shown in Fig. 1. In FIG. Is the absorbance at 280 nm, Indicates the peroxidase activity (as fluorescence intensity), respectively. It was found that the formation of the complex between peroxidase and the anti-CEA antibody (Fab ′ fragment) was very good near fraction 38.

（６）モノクローナル抗CEA抗体（Fab′）−HRP複合
体の製造前項（２）で得られたモノクローナル抗CEA抗体γ−
グロブリンフラクション（M₀−T₃）5mgを0.1M酢酸緩衝
液（pH4.2）1mlに溶解し0.25mgのペプシンを加え37℃で
一夜反応させる。中和後セファデックスＧ−150カラム
（直径2.5cm,長さ55cm）で精製した。得られたＦ（a
b′）₂画分を２−メルカプトエチルアミンで還元し、セ
ファデックスＧ−25のカラムによるゲルクロマトグラフ
ィーで精製してモノクローナル抗CEA抗体（Fab′フラグ
メント）を得た。(6) Production of monoclonal anti-CEA antibody (Fab ′)-HRP complex Monoclonal anti-CEA antibody γ-obtained in the previous section (2)
5 mg of globulin fraction (M ₀ -T ₃ ) is dissolved in 1 ml of 0.1 M acetate buffer (pH 4.2), 0.25 mg of pepsin is added, and the mixture is reacted at 37 ° C overnight. After neutralization, the product was purified on a Sephadex G-150 column (diameter 2.5 cm, length 55 cm). Obtained F (a
b ') ₂ fractions were reduced with 2-mercaptoethylamine and purified by gel chromatography on a Sephadex G-25 column to give a monoclonal anti-CEA antibody (Fab' fragment).

次に前項（５）−（ａ）で調製したマレイミド化ペル
オキシダーゼ1.5mgを0.1Mリン酸緩衝液（pH6.0）0.15ml
に溶解し、先に得たモノクローナル抗CEA抗体（Fab′フ
ラグメント）1.8mgをとかした5mMエチレンジアミン四酢
酸ナトリウム塩を含む0.1Mリン酸緩衝液（pH6.0）0.15m
lを加えて４℃で一夜反応させた。反応後、ウルトロゲ
ルAcA44を充てんしたカラム（1.5×45cm）を用いるゲル
クロマトグラフィーにかけ、0.05Mリン酸緩衝液（pH6.
5）で溶出させた。前項（５）と同様に溶出液の280nmの
吸光度ならびに酵素活性を測定して目的フラクションを
分取した。得られたモノクローナル抗CEA抗体（Fab′）
−HRP複合体はBSAとして0.1％、マーチオレートとして
0.005％になるように調整して４℃で保存した。Then, 1.5 mg of the maleimidated peroxidase prepared in (5)-(a) above was added to 0.15 ml of 0.1M phosphate buffer (pH 6.0).
0.1M phosphate buffer (pH 6.0) 0.15m containing 5mM ethylenediaminetetraacetic acid sodium salt dissolved in the above-mentioned monoclonal anti-CEA antibody (Fab 'fragment) 1.8mg
l was added and reacted at 4 ° C. overnight. After the reaction, it was subjected to gel chromatography using a column (1.5 x 45 cm) packed with Ultrogel AcA44 and 0.05 M phosphate buffer (pH 6.
It was eluted in 5). The absorbance at 280 nm and the enzyme activity of the eluate were measured in the same manner as in the above (5) to fractionate the target fraction. The obtained monoclonal anti-CEA antibody (Fab ')
-HRP complex is 0.1% as BSA and as marthiolate
It was adjusted to 0.005% and stored at 4 ° C.

（７）モノクローナル抗CEA抗体（IgG）−HRP複合体
の製造前項（２）で得られたモノクローナル抗CEA抗体ガン
マグロブリンフラクション（M0-T2）5mgを0.1Mリン酸緩
衝液（pH6.5）1mlに溶解し40μｌのN,N−ジメチルホル
ムアミドにとかした結合試薬MMC（一般式〔Ｉ〕におい
て、ｎ＝1,R＝シクロヘキシレンである化合物）0.22mg
を加えて25℃で45分間撹拌しながら反応させた。生成し
た沈殿を遠心分離して除去し、上清をセファデックスＧ
−25のカラム（1.0×45cm）に通し、0.1Mリン酸緩衝液
（pH6.8）で溶出させた。タンパクを含む画分を分取
し、コロジオン膜を用いて濃縮した。このようにして調
製したマレイミド化IgGにおいてIgG1分子あたり導入さ
れたマレイミド基の数は5.9個であった。(7) Production of monoclonal anti-CEA antibody (IgG) -HRP complex 5 mg of the monoclonal anti-CEA antibody gamma globulin fraction (M0-T2) obtained in the previous section (2) was added to 1 ml of 0.1M phosphate buffer (pH 6.5). 0.22 mg of a binding reagent MMC (n = 1, R = cyclohexylene in the general formula [I]) dissolved in 40 μl of N, N-dimethylformamide and dissolved in
Was added and reacted at 25 ° C. for 45 minutes with stirring. The precipitate formed was removed by centrifugation, and the supernatant was separated with Sephadex G
It was passed through a -25 column (1.0 x 45 cm) and eluted with 0.1 M phosphate buffer (pH 6.8). The protein-containing fraction was collected and concentrated using a collodion membrane. In the maleimidated IgG thus prepared, the number of maleimide groups introduced per IgG molecule was 5.9.

別に、10mgのHRPを1.4mlの0.1Mリン酸緩衝液（pH6.
5）に溶解し、100μｌのエタノールにとかした結合試薬
SPDP〔Ｎ−サクシニミジル−３−（２一ピリジルジチ
オ）一プロピオネート;N−succinimidyl−３−（２一py
ridyldithio）−propionate〕1.25mgを加えて25℃で30
分間攪拌しながら反応させた。反応液はセファデックス
Ｇ−25のカラム（1.0×45cm）に通し0.1M酢酸緩衝液（p
H5.0）で溶出させてSPDPを除去した。次にジチオスレイ
トール（dithiothreitol）17mgを加えて還元し、再びセ
ファデックスＧ−25のカラム（1.0cm×45cm）を用いる
ゲルクロマトグラフィーで精製してチオール化HRPを得
た。Separately, 10 mg of HRP was added to 1.4 ml of 0.1 M phosphate buffer (pH 6.
Binding reagent dissolved in 5) and dissolved in 100 μl ethanol
SPDP [N-succinimidyl-3- (21-pyridyldithio) -propionate; N-succinimidyl-3- (21-py
ridyldithio) -propionate] 1.25 mg and add 30 at 25 ℃
The reaction was allowed to proceed with stirring for a minute. The reaction solution was passed through a Sephadex G-25 column (1.0 x 45 cm) and 0.1 M acetate buffer (p
H5.0) was eluted to remove SPDP. Next, 17 mg of dithiothreitol was added for reduction, and the product was again purified by gel chromatography using a Sephadex G-25 column (1.0 cm × 45 cm) to obtain a thiolated HRP.

次に先に調製し0.2mlに濃縮したマレイミド化IgG3mg
と、0.2mlに濃縮したチオール化HRP6mgとを４℃で16時
間反応させた。反応後、ウルトロゲルAcA44〔LKB社製
（フランス）〕を充てんしたカラム（1.5cm×45cm）を
用いるゲルクロマトグラフィーにかけ、0.1Mリン酸緩衝
液（pH6.5）で溶出させた。前項（５）と同様に溶出液
の280nmの吸光度ならびに酵素活性を測定して目的フラ
クションを分取した。得られたモノクローナル抗CEA抗
体（IgG）−HRP複合体はBSAとして0.1％、マーチオレー
トとして0.005％になるように調整して４℃で保存し
た。Next, 3 mg of maleimidated IgG prepared earlier and concentrated to 0.2 ml
And 6 mg of thiolated HRP concentrated to 0.2 ml were reacted at 4 ° C. for 16 hours. After the reaction, gel chromatography was performed using a column (1.5 cm × 45 cm) packed with Ultrogel AcA44 [LKB (France)], and eluted with 0.1 M phosphate buffer (pH 6.5). The absorbance at 280 nm and the enzyme activity of the eluate were measured in the same manner as in the above (5) to fractionate the target fraction. The obtained monoclonal anti-CEA antibody (IgG) -HRP complex was adjusted to BSA 0.1% and merthiolate 0.005% and stored at 4 ° C.

（８）モノクローナル抗CEA抗体（IgG）−HRP複合体
の製造前項（２）で得られたモノクローナル抗CEA抗体ガン
マグロブリンフラクション（M0−T2）5mgを0.1Mリン酸
緩衝液（pH6.5）1mlに溶解し、0.6mgのＳ−アセチルメ
ルカプトサクシニックアンハイドライド（Ｓ−acetylme
rcapto succinic anhydride）を40μｌのN,N−ジメチル
ホルムアミドに溶解して加え30分間25℃で反応させた。
0.1Mトリス緩衝液（pH7.0）0.2mlおよび1Mヒドロキシル
アミン0.2mlを加えて、さらに５分間30℃で反応させた
のち、セファデックスＧ−25のカラム（1.0×45cm）を
用いるゲルクロマトグラフィーで精製してチオール化モ
ノクローナル抗CEA抗体（IgG）を得た。(8) Production of monoclonal anti-CEA antibody (IgG) -HRP complex 5 mg of the monoclonal anti-CEA antibody gamma globulin fraction (M0-T2) obtained in the previous section (2) was added to 1 ml of 0.1M phosphate buffer (pH 6.5). Dissolved in 0.6 mg of S-acetylmercaptosuccinic anhydride (S-acetylme
rcapto succinic anhydride) was dissolved in 40 μl of N, N-dimethylformamide and added, and the mixture was reacted at 25 ° C. for 30 minutes.
0.2 ml of 0.1 M Tris buffer (pH 7.0) and 0.2 ml of 1 M hydroxylamine were added, and the mixture was further reacted at 30 ° C. for 5 minutes, and then subjected to gel chromatography using a Sephadex G-25 column (1.0 × 45 cm). Purification was performed to obtain a thiolated monoclonal anti-CEA antibody (IgG).

次に前項（５）−（ａ）で調製したマレイミド化ペル
オキシダーゼ1.5mgを0.1Mリン酸緩衝液（pH6.0）0.2ml
に溶解し、先に得たチオール化モノクローナル抗CEA抗
体（IgG）3mgと5mMエチレンジアミン四酢酸ナトリウム
塩とを含む0.1Mリン酸緩衝液（pH6.0）0.2mlを加えて４
℃で一夜反応させた。反応後、ウルトロゲルAcA34を充
てんしたカラム（1.5×45cm）を用いるゲルクロマトグ
ラフィーにかけ、0.1Mリン酸緩衝液（pH6.5）で溶出さ
せた。前項（５）と同様に溶出液の280nmの吸光度なら
びに酵素活性を測定して目的フラクションを分取した。
得られたモノクローナル抗CEA（IgG）−HRP複合体はBSA
として0.1％、マーチオレートとして0.005％になるよう
に調整して４℃で保存した。Then, 1.5 mg of the maleimidated peroxidase prepared in (5)-(a) above was added to 0.2 ml of 0.1M phosphate buffer (pH 6.0).
4 ml of 0.1M phosphate buffer (pH 6.0) containing 3 mg of the thiolated monoclonal anti-CEA antibody (IgG) and 5 mM ethylenediaminetetraacetic acid sodium salt, which was dissolved in
The reaction was carried out at 0 ° C overnight. After the reaction, gel chromatography was performed using a column (1.5 × 45 cm) packed with Ultrogel AcA34, and eluted with 0.1 M phosphate buffer (pH 6.5). The absorbance at 280 nm and the enzyme activity of the eluate were measured in the same manner as in the above (5) to fractionate the target fraction.
The obtained monoclonal anti-CEA (IgG) -HRP complex was BSA.
Was adjusted to 0.1%, and the marthiolate was adjusted to 0.005% and stored at 4 ° C.

実施例２（ａ）各種HRP複合体の比較（感度、非特異的吸着）実施例１で得られた各種HRP複合体の性能について調
べるためEIAを行なった。EIA用の試薬として、次のもの
を用いた。Example 2 (a) Comparison of various HRP complexes (sensitivity, non-specific adsorption) EIA was performed to examine the performance of the various HRP complexes obtained in Example 1. The following were used as reagents for EIA.

試薬：抗CEA抗体感作マイクロプレート実施例１、参考例２で得られたHRP複合体、あるい
はDAKOイムノグロブリン社製（デンマーク）抗CEA抗体H
RP複合体標準CEA 緩衝液Ｂ（10％子牛血清、0.15MNaClを含むpH7.0の
0.02Mリン酸緩衝液），緩衝液Ａ（0.15MNaClを含むpH7.
0の0.02Mリン酸緩衝液）ペルオキシダーゼ活性測定に必要な試薬0.02％過酸
化水素と0.15％ｏ−フェニレンジアミンを含むpH4.8の
0.1Mクェン酸−リン酸二ナトリウム緩衝液および反応停
止液（2N−硫酸）抗体感作マイクロプレートの調製： EIA用イムノプレートＩ〔ヌンク社（デンマーク）
製〕の各ウェルにポリクローナル抗CEA抗体〔ダコ・イ
ムノグロブリン社（デンマーク）製〕を0.1M炭酸緩衝液
（pH9.6）で希釈して調製した抗体溶液（50μg/ml）を1
00μｌずつ注入して４℃で一夜放置して感作させた。0.
1％BSAを含む0.01Mリン酸緩衝液（pH7.0）で洗浄したの
ち、用時まで冷所保存した。Reagent: Anti-CEA antibody-sensitized microplate HRP complex obtained in Example 1 or Reference Example 2 or anti-CEA antibody H manufactured by DAKO Immunoglobulin (Denmark)
RP complex Standard CEA buffer B (10% calf serum, pH 7.0 containing 0.15M NaCl)
0.02M phosphate buffer, buffer A (0.15M NaCl in pH 7.
0.02M phosphate buffer of 0) Reagent necessary for measuring peroxidase activity 0.02% hydrogen peroxide and 0.15% o-phenylenediamine containing pH 4.8
Preparation of antibody-sensitized microplates: 0.1M citrate-disodium phosphate buffer and reaction stop solution (2N-sulfate): Immunoplate I for EIA [Nunc (Denmark)
1) antibody solution (50 μg / ml) prepared by diluting polyclonal anti-CEA antibody [Dako Immunoglobulin (Denmark)] with 0.1 M carbonate buffer (pH 9.6) in each well
00 μl was injected and left at 4 ° C. overnight for sensitization. 0.
After washing with 0.01 M phosphate buffer (pH 7.0) containing 1% BSA, it was stored in a cool place until use.

測定：緩衝液Ｂに溶解させたCEA標準溶液100μｌを各ウェル
に注入し、37℃で３時間反応させた。各ウェルを緩衝液
Ａで洗浄後、実施例１で得られたHRP複合体あるいはダ
コ・イムノグロブリン（DAKO Immunog Iobu Iins）社製
ポリクローナル抗CEA抗体−HRP複合体溶液（それぞれ酵
素活性一定;HRPとして30ng/ウェル）100μｌを加えて25
℃で3.5時間さらに反応させた緩衝液Ａで洗浄し、これ
に0.02％過酸化水素と0.15％ｏ−フェニレンジアミンを
含む0.1Mクエン酸−リン酸二ナトリウム緩衝液（pH4.
8）100μｌを加えて30℃で30分間反応させ、2N−硫酸10
0μｌずつ加えて反応を停止させてから、マイクロプレ
ート用自動比色計〔タイターテック・マルチスキャン・
フロー社（米国）製〕を用い、ブランクを対照にして49
0nmにおける吸光度を測定した。結果を第２表に示した
が、参考例２で得られたHRP複合体およびダコ・イムノ
グロブリン社製HRP複合体〔２ステップグルタルアルデ
ヒド法；イムノケミストリー（Immunochemistry）、第
８巻（1971年）、第1175頁〕と比べて実施例１で得られ
た本発明のHRP複合体はそれぞれウエルへの非特異的吸
着は極めて小さく、また高感度を与えた。Measurement: 100 μl of CEA standard solution dissolved in buffer B was injected into each well and reacted at 37 ° C. for 3 hours. After washing each well with buffer solution A, the HRP complex obtained in Example 1 or a polyclonal anti-CEA antibody-HRP complex solution manufactured by DAKO Immunog Iobu Iins (each having a constant enzyme activity; 30 ng / well) Add 100 μl to 25
It was washed with Buffer A which was further reacted at 3.5 ° C. for 3.5 hours, and 0.1M citric acid-disodium phosphate buffer (pH 4.0.04%) containing 0.02% hydrogen peroxide and 0.15% o-phenylenediamine.
8) Add 100 μl and incubate at 30 ℃ for 30 minutes.
After adding 0 μl each to stop the reaction, an automatic colorimeter for microplates (Titer Tech Multiscan
Flow Co. (USA)], using the blank as a control.
Absorbance at 0 nm was measured. The results are shown in Table 2, and the HRP complex obtained in Reference Example 2 and the HRP complex manufactured by Daco Immunoglobulin [2 step glutaraldehyde method; Immunochemistry, Volume 8 (1971)] , P. 1175], the non-specific adsorption to the well of the HRP complex of the present invention obtained in Example 1 was extremely small and provided high sensitivity.

（ｂ） CEAの免疫化学的測定キットおよびCEAの測定下記のCEA免疫化学的測定キットを用い、下記の操作
法に従って正常人および担癌患者血清中のhCG濃度を測
定した。 (B) CEA Immunochemical Assay Kit and CEA Assay Using the CEA immunochemical assay kit described below, the hCG concentration in the serum of normal and cancer-bearing patients was measured according to the following procedure.

CEAの免疫化学的測定キット：（１）実施例1.（２）で得られたモノクローナル抗CE
A抗体ガンマグロブリンフラクション（M₀-T₄）の15μg/
ml0.01MNaCl−0.01Mリン酸緩衝液（pH8.0）100ml中にポ
リスチレン球（直径4.8mm、Precision Plastics BaIl C
o.,Chicago,U.S.A.）1500個を浸し、５℃で１夜インキ
ュベートし、更に0.1％BSAを含む0.05Mリン酸緩衝液（p
H7.0）で洗浄してなる抗体感作ポリスチレン球（２）実施例１・（７）で得られるペルオキシダーゼ
標識抗CEA抗体複合体（３）０〜200ngの標準CEA （４）上記（３）の試薬および被検試科の希釈上用い
る緩衝液Ｂおよび緩衝液Ａ（前項（ａ）参照）（５）ｏ−フエニレンジアミン（６）上記（２）の試薬の希釈に用いる緩衝液C;0.1
％ウシ血清アルブミン,0.002％メルチオレートを含むpH
7.5の0.1Mリン酸緩衝液（７）上記（５）の溶解に用いる緩衝液D;0.02％過酸
化水素0.002％メルチオレートを含むpH4.8の0.1Mクエン
酸緩衝液（８）停止液;2N硫酸操作方法標準CEA溶液あるいは被検試料50μｌに試薬（４）緩
衝液B250μｌおよび試薬（１）１個を添加し、室温で１
日間反応させた。ポリスチレン球を緩衝液Ａで水洗後、
試薬（６）で希釈した試薬（２）300μｌ（複合体とし
て約30ng）を添加し、４℃で１日間反応させた。ポリス
チレン球を緩衝液Ａで水洗し、試薬（７）で溶解した0.
15％の試薬（５）500μｌを加えて室温で40分間反応さ
せたのち、2N硫酸1.5mlを添加して反応を停止させ、492
nmの吸光度を測定した。上記の方法により、正常人お
よび担癌患者血清中のCEA濃度を側定した。結果は第３
表に示される。CEA immunochemical assay kit: (1) Monoclonal anti-CE obtained in Example 1. (2)
A antibody gamma globulin fraction (M ₀ -T ₄ ) 15 μg /
Polystyrene spheres (diameter 4.8 mm, Precision Plastics BaIl C) in 100 ml of 0.01 M NaCl-0.01 M phosphate buffer (pH 8.0)
(O., Chicago, USA), soak 1500 pieces, incubate at 5 ° C overnight, and add 0.05M phosphate buffer (p.
Antibody-sensitized polystyrene spheres washed with H7.0) (2) Peroxidase-labeled anti-CEA antibody complex obtained in Examples 1 and (7) (3) 0 to 200 ng of standard CEA (4) Above (3) Buffer B and Buffer A used for the dilution of the reagent and the test sample (see (a) above) (5) o-phenylenediamine (6) Buffer C used for the dilution of the reagent of (2) above; 0.1
% Bovine serum albumin, pH containing 0.002% merthiolate
7.5M 0.1M phosphate buffer (7) Buffer D used to dissolve (5) above; 0.02% hydrogen peroxide 0.002% 0.1M citrate buffer containing pH 4.8 (8) Stop solution; 2N Sulfuric acid operation method Add 250 μl of reagent (4) buffer B and 1 reagent (1) to 50 μl of standard CEA solution or test sample, and add 1 at room temperature.
Reacted for days. After washing the polystyrene spheres with buffer solution A,
300 μl of the reagent (2) diluted with the reagent (6) (about 30 ng as a complex) was added and reacted at 4 ° C. for 1 day. Polystyrene spheres were washed with buffer A and dissolved with reagent (7).
After adding 500 μl of 15% reagent (5) and reacting for 40 minutes at room temperature, 1.5 ml of 2N sulfuric acid was added to stop the reaction.
The absorbance at nm was measured. The CEA concentrations in the sera of normal and cancer-bearing patients were determined by the above method. The result is the third
Shown in the table.

測定の結果、正常人血清のCEA値は0.5〜1.2ng/ml（平
均1.0ng/ml）であったが各種癌患者血清のCEA値は高値
を与え最大565ng/mlとなった。 As a result of the measurement, the CEA value of normal human serum was 0.5 to 1.2 ng / ml (average 1.0 ng / ml), but the CEA value of various cancer patient sera increased to a maximum of 565 ng / ml.

発明の効果本発明の試薬を用いると、高感度かつ正確にCEAが測
定され、大腸癌などの消化器癌や他の癌などの診断、予
後管理などに対して極めて有用である。すなわち、本発
明におけるチオール基を導入したペルオキシダーゼで標
識された抗体を用いた場合は、固相に対する非特異的な
吸着が小さいのでCEAの測定の盲検値が小さくしたがっ
て側定の信頼性が増大する。また、本発明で得られたモ
ノクローナル抗体はCEAに対して親和性が強く、他のCEA
関連抗原に対する交差反応性がはるかに小さいので被検
液に同時に存在するCEA関連抗原からの影響を受け難
い。更に、モノクローナル抗体を試薬の構成成分として
いるので製品の供給が容易であり、測定の再現性が高
い。EFFECTS OF THE INVENTION The reagent of the present invention enables highly sensitive and accurate CEA measurement, and is extremely useful for diagnosis and prognosis management of digestive organ cancer such as colon cancer and other cancers. That is, when the antibody labeled with a thiol group-introduced peroxidase in the present invention is used, the non-specific adsorption to the solid phase is small, so that the blinded value of CEA measurement is small and therefore the reliability of side determination is increased. To do. Moreover, the monoclonal antibody obtained in the present invention has a strong affinity for CEA,
Since the cross-reactivity to the related antigen is much smaller, it is less likely to be affected by the CEA-related antigen present in the test solution at the same time. Further, since the monoclonal antibody is used as a component of the reagent, the product can be easily supplied and the reproducibility of the measurement is high.

また、本発明の方法で得られたCEAを免疫原として作
製されたモノクローナル抗CEA抗体は、CEAに対する反応
性が高くしかもCEA関連抗原NCA,NCA−２との交差反応を
有しないモノクローナル抗CEA抗体である頻度が高く、
従ってモノクローナル抗CEA抗体作製方法として有用で
ある。Further, the monoclonal anti-CEA antibody produced by using the CEA obtained by the method of the present invention as an immunogen is a monoclonal anti-CEA antibody which has high reactivity to CEA and does not have a cross-reactivity with CEA-related antigens NCA and NCA-2. Is often
Therefore, it is useful as a method for producing a monoclonal anti-CEA antibody.

これらの選択されたモノクローナル抗CEA抗体は免疫
化学的診断剤を構成する成分として利用することができ
る。例えばサンドイッチ法による酵素免疫試験法におい
ては担体上に保持された抗体および（もしくは）酵素で
標識された抗体におけるモノクローナル抗CEA抗体とし
て用いることができる。これらの診断剤は大腸癌などの
消化器癌や他の癌の診断、予後管理などに利用できる。
更にこれらの抗体は冶療目的にも利用することができ
る。These selected monoclonal anti-CEA antibodies can be used as a component constituting an immunochemical diagnostic agent. For example, in the enzyme immunoassay method by the sandwich method, it can be used as a monoclonal anti-CEA antibody in an antibody retained on a carrier and / or an enzyme-labeled antibody. These diagnostic agents can be used for diagnosis of gastrointestinal cancer such as colorectal cancer and other cancers and prognosis management.
Furthermore, these antibodies can also be used for therapeutic purposes.

[Brief description of drawings]

第１図は、実施例１−（５）で得られたペルオキシダー
ゼとポリクローナル抗CEA抗体（Fab′フラグメント）と
の反応生成物のゲルクロマトグラフィーにおける溶出パ
ターンを表わす。FIG. 1 shows the elution pattern in gel chromatography of the reaction product of the peroxidase obtained in Example 1- (5) and the polyclonal anti-CEA antibody (Fab ′ fragment).

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所Ｇ０１Ｎ 33/574 Ｇ０１Ｎ 33/577 Ｂ 33/577 (Ｃ１２Ｐ 21/08 (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91）Ｃ１２Ｒ 1:91） 9162−4ＢＣ１２Ｎ 15/00 Ｃ ─────────────────────────────────────────────────── ─── Continuation of front page (51) Int.Cl. ⁶ Identification code Internal reference number FI Technical display location G01N 33/574 G01N 33/577 B 33/577 (C12P 21/08 (C12P 21/08 C12R 1: 91) C12R 1:91) 9162-4B C12N 15/00 C

Claims

(57) [Claims]

1. A carcinogenic tissue containing a human carcinoembryonic antigen, extracted with a neutral salt solution containing a nonionic surfactant,
Human carcinoembryonic antigen-reactive monoclonal antibody characterized by purifying human carcinoembryonic antigen, immunizing it with mammalian lymphocytes, producing fused cells of this with myeloma cells, and then cloning this Antibody production method.