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JP2533100B2 - ポリヌクレオドの誘導方法 - Google Patents
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JP2533100B2 - ポリヌクレオドの誘導方法 - Google Patents

ポリヌクレオドの誘導方法

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JP2533100B2
JP2533100B2 JP61503532A JP50353286A JP2533100B2 JP 2533100 B2 JP2533100 B2 JP 2533100B2 JP 61503532 A JP61503532 A JP 61503532A JP 50353286 A JP50353286 A JP 50353286A JP 2533100 B2 JP2533100 B2 JP 2533100B2
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Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、一般に、誘導したポリヌクレオチドの製造
方法、特に、合成ポリヌクレオチドの３′末端の誘導に
関する。
〔従来の技術および発明が解決しようとする問題点〕 官能基を核酸に結合させることによって、核酸の検出
および定量を行うことが可能である。ハイブリダイゼー
ション検定法においては、標識した核酸プローブを用い
て、相補的なヌクレオチド配列を有する標的核酸の試料
中の存在を調べる。標的核酸はその後、ハイブリダイゼ
ーションによって支持体に結合した核酸プローブに固定
されて、『サンドイッチ』を形成する。このようなサン
ドイッチは、支持体に結合された標識の量として検出可
能である。機能化技術は、核酸をレポーター基に結合す
るための反応基への結合、ならびに、支持体上の反応基
への核酸の結合の双方に用いることができる。従って、
核酸を誘導する方法は、ハイブリダイゼーション検定の
ための物質の調製において特に有効である。
ハイブリダイゼーション検定に用いるプローブの標識
付けの方法としては、放射性同位元素（例えば、32P、3
Hまたは125I）をプローブと結合させる方法がある。し
かしながら、放射性標識を検出するための二つの通常採
られている方法には、特有の困難性があるため、これら
方法の有用性は限定されている。一般的な検出技法の一
つであるオートラジオグラフィーは、写真乳剤中で銀イ
オンを還元して銀粒子を形成させる方法であり、この方
法は時間を要するという難点がある。他の一般的な検出
技法であるシンチレーションカウンティング法は、高価
な装置を必要とし、かつ一定の作業の遅れが慢性的に生
じる。さらに、放射性同位元素は、人体に対する安全上
の理由から特別に取扱う必要がある。
125Iなどの幾つかの放射性同位体の貯蔵寿命は、比較
的短いので、臨床診断における放射性同位体の有用性は
さらに限定される。
非放射性標識付けシステムにおいて検出を可能にする
ために、レポーター基を用いてプローブの『標識付け』
を行い、さらに、シグナルをレポーター基と会合させる
ことで検出が可能となる。レポーターは、プローブの存
在または位置を表示するために用いる薬剤である。シグ
ナルそのものは、直接的に感知できるものであり、分離
したシグナル分子、または分離可能なシグナル分子によ
って発生する。標識は、正確にはシグナル分子を取り込
むタイプのレポーターである。
標識をプローブに結合する方法が、Ward等の欧州特許
出願63,879号に開示されている。Wardは、ビオチンレポ
ーター分子がプリンまたはピリミジン環に共有結合した
プローブの製造方法を開示している。選択されたビオチ
ン、プリンおよびピリミジンは、次に、酵素法によっ
て、プローブを構成する核酸のリン酸ジエステル構造内
に直接取り込まれる。しかしながら、この酵素法は費用
が嵩む上に、操作が難しいという問題点がある。
また、タンパク質によって標識をプローブに結合する
手順をとる方法もある。一本鎖ポリオウィルスRNAを、
ビオチンのＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルと反
応するタンパク質に自然連鎖させて、アビジン被覆した
球の特異的な結合によって検出可能で、かつビオチン化
したレポーター基を有するRNAプローブが得られる。Ric
hards等，Proc.Natl. Acad.Sci.(USA), 76:676−680
（1979）。同様に、ビオチン標識したチトクロームＣ
は、ホルムアルデヒドの存在下での反応によってRNAに
連結され、その後にアビジン被覆した球を標識付けする
ことができる。Manning等，Chromosoma（Berl.），53:1
07−117（1975）。にもかかわらず、標識付けを必要と
する核酸の全てが自然にタンパク質と結合することはな
く、また、核酸のチトクローム結合の位置ならびに量は
容易に予測できないので、末端標識付けのための化学合
成手法が求められている。
一つの化学合成方法として、核酸を酸化して３′−ア
ルデヒドに変換し、さらにアルキルジアミンまたはポリ
アミンを用いて縮合し、ビオチンの結合を行うレポータ
ー基を調製する方法がある。Broker等，Nucleic Acids
Res.，５:363−384（1978）。同様に、核酸の過沃素酸
塩酸化によって得たアルデヒドを用いて、核酸に蛍光標
識を結合することもできる。Bauman等，J.Histochem.，
Cytochem.，29;227−237（1981）。しかしながら、自動
化された核酸合成プロセスにおいて、支持体に結合した
ポリヌクレオチドに、レポーター基を結合させる技術が
望まれている。
５′標識付けの他の方法では、ビオチンを２−（ビオ
チニルアミド）エタノールに変換し、さらに、リン酸化
した重合体支持ヌクレオチドに縮合する。ビオチンのア
ミノエタノール誘導体を、リボース環の５′水酸基に縮
合し、ヌクレオチドの保護を取り除けば、安定したリン
酸ジエステル結合が得られる。Kempe等，Nucleic Acids
Res.，13:45−57（1985）。しかしながら、この方法に
よって特異的なレポーター基が結合するので、種々の望
ましいレポーター基を結合するのに用いることが可能
な、一般的な反応機能性を有するオリゴヌクレオチドの
調製を教示するものではない。
溶液中のヌクレオチドは、保護された６−アミノ−１
−ヘキサノールリン酸塩を用いた縮合によってアミン化
される。Baker等，J.Biol.Chem.，22:7135−7147（197
2）。しかし、これら方法の実施は困難であり、これま
で、固相合成には組み込まれていない。
アフィニティークロマトグラフィーによるヌクレアー
ゼの精製を行うための、ヌクレオチドを支持体に結合す
る他の方法では、ｐ−アミノフェノールで３′−誘導し
た１個のヌクレオチドを、リンカーによってゲルマトリ
ックスに結合させる。このリンカーは、臭化シアンおよ
びアジドを用いて、3,3′−ジアミノジプロピルアミン
をマトリックスに結合させることによって形成する。得
られたアミン化ゲルを無水コハク酸で処理し、そして、
カルボジイミドを用いてアミン化ヌクレオチドに結合す
る。Cuatrecasas,J.Biol.Chem.，12:3059-3065（197
8）。しかしながら、アミン化ヌクレオチドそのものの
調製は、手間を要する煩雑な手順を経て溶液中で実施さ
れる。Baker等，J.Biol.Chem.，22:7135−7147（1972）
を参照のこと。
よって、固相合成を行うポリヌクレオチドに、レポー
ター基を一般的に結合させる方法および組成が求められ
ているのである。
〔問題点を解決するための手段及び作用・効果〕
本発明は、上述した諸問題に鑑みて、機能化した３′
末端を有する調製された核酸の製造方法を提供するもの
である。
本発明の方法の第１態様では、カルボキシル酸で機能
化させた固相支持体、あるいはアミンで機能化させた固
相支持体を、選択した無水物で処理するか、あるいは、
一方の末端にてカルボキシル成分を含む分子と反応させ
ることによって、支持体と無水物残基の間にアミド結合
を形成し、そこにカルボキシル酸による機能を付与す
る。
本発明の方法の第２態様では、カップリング剤の存在
下で、第１態様で得た生成物を、選択したヒドロキシア
ルキルアミンリンカーと結合させる。この第２態様で得
られる生成物は、２個のアミド結合（アミン機能を付与
したビーズを用いる）および遊離水酸基を有する重合支
持体である。
本発明の方法の第３態様では、ポリヌクレオチド連鎖
すなわち支持体の化学合成であり、遊離ヒドロキシル基
から開始し、さらにリンカーと核酸の間にリン酸エステ
ル結合を行う。
支持体上てポリヌクレオチド合成が完了した後、本方
法の第３態様で得た生成物を、アンモニア含有溶液中で
処理することによって、第一級アミン機能が付与された
３′末端を有するポリヌクレオチドを、支持体から加水
分解する。
〔実施例〕
本発明による望ましい方法では、合成時にアミノ基を
ポリヌクレオチドの３′末端に結合させる。固相支持体
は、多孔性でも非多孔性でもよく、すなわち、調整済ポ
アグラス、シリカゲル、ポリスチレン、アガロース、ま
たはセファデックス等の重合支持体でもよい。最適であ
るとは言い難いが、ニトロセルロース試験紙等の支持体
を用いることもできる。カルボキシル酸基を用いてもよ
いが、支持体は、望ましくはアミンで機能化させる。
アミン機能が付与された固相支持体は、無水コハク酸
または無水ピリミジン等の無水物で処理する。加水分解
による除去が容易であり、また形成されるアミド結合が
対称性である等の理由で、無水フタル酸が、現在のとこ
ろ最も望ましい無水物である。
無水物の使用は便利ではあるが、２つの末端カルボキ
シル酸成分を有するいかなる分子も用いることもでき、
これらの官能基を、ｐ−ニトロフェノールおよびジシク
ロヘキシルカルボジイミド（DCC）またはNHSを用いて活
性化させ、さらに、その結果得られた分子を固相支持体
に縮合することができる。
縮合反応剤中の化合物の中で、リンカーとして使用す
るのに適したものは、末端アミノ基および末端水酸基を
有する直鎖アミノアルコールを含む１−ヒドロキシアル
キルアミンである。この態様において、鎖中の炭素原子
は10個を超えず、１から６個の範囲であることが望まし
い。このようなアミノアルコールとしては、メタノール
アミン、エタノールアミン、プロパノールアミン、ブタ
ノールアミン、ペンタノールアミン、ヘクサノールアミ
ン、ヘプタノールアミン、オクタノールアミン、ノナノ
ールアミン、およびデカノールアミンがある。しかし、
原理的には、ポリヌクレオチドとの結合と、カルボキシ
ル機能を付与した支持体との結合とを、それぞれ形成す
るために用いることができる水酸基ならびにアミン基を
有する分子であれば、別段限定されないのは勿論であ
る。例えば、カルボキシル機能を還元した後に、ポリリ
シン鎖を用いることもできるが、支持体に結合するアミ
ン基だけが露出しており、他の基は全て適切なブロック
基によって保護されていることが、その際に必要とされ
る。同様に、リンカー分子と支持体の間のアミド結合の
形成と、競合あるいは阻害するその他の反応基をブロッ
クすることが望ましい。
本発明に従って使用できるポリヌクレオチド生成のた
めの化学合成法としては、トリエステル合成、リン酸ト
リエステル法、テトラゾライド誘導体およびヌクレオシ
ドリン酸塩を用いる固相合成法、ならびに1984年３月14
日に公開された英国特許出願GB2,125,798号およびCarut
hers等，米国特許第4,415,732号に記載されたホスホラ
ミダイト法がある。
アンモニア溶液を用いて支持体結合した核酸配列を処
理すると、先に生成したアミド結合の加水分解が起こ
り、それによって、その３′末端に遊離第一級アミン機
能を含むアルキル鎖を有する生成オリゴヌクレオチド
が、溶液中に遊離放出される。オリゴヌクレオチドが、
一旦溶液から回収されると、遊離アミンは、容易にレポ
ーター基への結合を行うことができる。
第一級アミン機能を３′末端に付与したオリゴヌクレ
オチドの合成過程を例示した以下の実施例を参照して、
本発明の方法を詳細に説明する。
実施例１ 50μmolのアミノ基を含んだ、アミン機能を有する調
整済ポアグラス（イリノイ州、ロックランドに所在のPi
erce Chemical社から入手できる）500mgを、無水ピリジ
ン2mlと４−ジメチルアミノピリジン61mgの存在下で、
無水フタル酸、無水コハク酸あるは無水ピリジンのいず
れかの250mg（1mol）と、室温で、30分間反応させた。
得られた重合体を、塩化メチレン、エチルアルコール、
およびエーテルで洗浄し、乾燥させた。
次に、それぞれの重合体（450mg、すなわち45mmol）
を、溶液中で、塩化メチレン1.5mlとジシクロヘキシル
カルボジイミド（DCC）330mgと、室温で、30分間反応さ
せた。ビーズよりも上層の溶液は傾瀉を行い、塩化メチ
レン2ml中の６−アミノ−１−ヘキサノール（117mg/モ
ル）の溶液で置換し、室温で、約８時間放置した。同様
の処理によって、各々の活性重合体の別の450mgを溶液
に入れ、傾瀉した後に、そのビーズを同等の条件下に
て、塩化メチレン2ml中の１モルのヘキサノールアミン
溶液と反応させた。
このようにして溶液から得られた６つのヒドロキシ機
能を付与したエステルは、以下の化学式を有するもので
あった。
（３）CPG−NH−CO−CH2−CH2−CO−NH−CH2−CH2−OH （４）CPG−NH−CO−CH2−CH2−CO−NH−(CH2)6−OH 各ヒドロキシメチルエステルは、オリゴヌクレオチド
を合成する支持体として用いることができるが、上記の
１、２、３および５の支持体だけを、オリゴヌクレオチ
ド合成の用途に用いた。オリゴヌクレオチド鎖を伸長す
るためのホスホラミダイト法（Caruthers、米国特許4,4
15,732号を参照）を用いて、ジメトキシトリチル基によ
って３′末端をブロックしたデオキシチミジン鎖を、支
持体の活性ヒドロキシ基によって各支持体上に合成し
た。これらの手順によって、13個のチミジンをポリヌク
レオチドに取り入れた時点で、支持体とのアミド結合を
加水分解し、３′端に遊離第一級アミン基を有する遊離
オリゴヌクレオチドを放出した。その結果、１グラム当
たり37〜40μmolのジメトキシトリチル（DMTr）基を含
む、支持体に保持された連鎖40mg各々を、室温において
濃縮水酸化アンモニウム（40mg当たり2ml）によって処
理した。その後、各溶液100μｌを採取して、乾燥させ
た。この処置によるペプチド結合加水分解率を調べるた
めに、乾燥した生成物に、0.1M ｐ−トルエンスルホン
酸を添加し、498nmの分光測光によってDMTr基を定量し
た。
室温において、、各溶液中のアミド結合の加水分解
（すなわち、溶液中へのDMTr−DNAの放出）を測定し
た。その結果を、下記の第１表に示した。
第１表 時間 保持体／結合 加水分解率％ 18時間 1/フタル酸アミド結合 57％ 18時間 2/フタル酸アミド結合 57％ 18時間 3/コハク酸アミド結合 23％ 18時間 5/ピリジンアミド結合 63％ 42時間 1/フタル酸アミド結合 92％ 42時間 2/フルタ酸アミド結合 92％ 42時間 3/コハク酸アミド結合 53％ 42時間 5/ピリジンアミド結合 100％ この結果によると、３′末端を機能化したオリゴヌク
レオチドが溶液中に最大限に放出されるのは、本発明の
方法に用いる無水物が、支持体中に対称アミド結合を生
じる場合であることがわかる。
以下の実施例において、本発明の方法の効率を調べ
た。
実施例２ 誘導された固相支持体上での合成によるオリゴデオキ
シヌクレオチドの３′末端の機能化効率を試験するため
に、下記の配列： （７）５′HO−AACAACTCCCTAACCCCTGCTTTTTAAAGAC を有するデオキシオリゴヌクレオチドを、40mg（約２
μmole）の各々の支持体（８）および（９）上にて、化
学的に合成した。
化学合成は、縮合反応に、５′−ジメトキシトリチル
−３′−メトキシ−NN′−ジメチルアミノホスホラミダ
イトを用いた固相亜リン酸塩法（Caruthers等，米国特
許4,415,732号）によって実施した。固相支持体（８）
上の最初の合成サイクルでは、５′−ジメトキシトリチ
ル−デオキシシチジル−３′−メトキシ−NN′−ジメチ
ルアミノホスホラミダイトを使用した。これ以降の工程
における、２つの支持体上の合成サイクルは共に同じと
した。最終サイクルの後に、ジメトキシトリチル基はDN
Aから除去され、さらに、合成サイクルが同一の２個の
支持体から、２個のオリゴデオキシヌクレオチドが除か
れた。最終サイクルの後に、ジメトキシトリチル基をDN
Aから除去し、さらに、30℃で、18時間、2mlの15M水酸
化アンモニウムを用いて、２つのオリゴデオキシヌクレ
オチドを支持体から取り出し、その後に保護を取り除い
た〔Matteucci等，J.Am.Chem.Soc.,103,3185−3191（19
81）〕。
オリゴデオキシヌクレオチドは、変性条件（7M尿素）
下で、12％のポリアクリルアミドゲル電気泳動によって
精製した。各レーンの最低速度泳動バンド（全紫外線吸
収物質の90％以上に相当する）をゲルから切断した。２
つのオリゴデオキシヌクレオチドをゲルから抽出し、10
mMのトリエチルアンモニウム重炭酸塩、pH7.0を用い
て、10mlのセファデックスG50/40（シグマ）カラムで脱
塩した。オリゴデオキシヌクレオチドの分光分析による
定量を行い、凍結乾燥した。
ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって生成物を分
析したところ、この生成物は均質であり、また支持体
（８）から得たデオキシオリゴヌクレオチドは、支持体
（９）から得たデオキシオリゴヌクレオチドよりも、か
なりゆっくりした移動度で泳動することがわかった。支
持体（８）から得たデオキシオリゴヌクレオチドの化学
式を、以下のように決定した。
さらに支持体（９）から得たデオキシオリゴヌクレオ
チドは、同じデオキシヌクレオチド配列であるが、最初
のデオキシヌクレオチドの３′末端が欠けていた。
精製工程後に回収した生成物の収量を、以下の第２表
に示した。
下記の実施例にて、３′−フルオレセイン標識オリゴ
ヌクレオチドを調製した。
実施例３ ３′−アミンオリゴデオキシヌクレオチドを、実施例
１の方法に従って調製した。他のオリゴデオキシヌクレ
オチドも調製した。これは最初のものと同じではある
が、32P標識をも組み込んでおり、また1540cpm/fmの比
放射能を示した。100mM炭酸ナトリウム緩衝液17μｌ中
の32P標識オリゴデオキシヌクレオチド2.95nmolに、DMS
O中の25mMフルオレシインイソチオシアン酸塩（ウィス
コンシン州、ミルウォーキー所在のAldrich Chemical
社）17μmolを加えた。この溶液を撹拌した後、37℃
で、１時間、インキュベートした。さらに、炭酸塩緩衝
液17μｌと、フルオレシインイソチオシアン酸塩溶液17
μｌを加えた。37℃で、２時間置いた後に、オリゴデオ
キシヌクレオチドをエタノール沈澱させ、6M尿素、15％
ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって精製した。
生成物はオートラジオグラフィーによって同定し、適
切なバンドを分離し、さらに溶出剤として10mMトリエチ
ルアンモニウム重炭酸塩（TEAB）を用いて、セファデッ
クスG50/50カラムによって溶離、ゲル濾過を行った。生
成物を分離したところ、30％収量（0.75μmole）であっ
た。
ポリアクリルアミドゲル電気泳動ならびにオートラジ
オグラフィーによって生成物を分析した結果、生成物は
均質であり、また開始物質よりも特有のゆっくりとした
移動度で泳動することが分かった。
生成物の紫外線分光分析の結果、この生成物は下記に
示すように、フルオレシイン機能が付与されたデオキシ
オリゴヌクレオシドの正しい分光特性を有することがわ
かった。
Am＝26.36×104 A260＝0.20 A260／A280＝1.86 Am（フルオレシイン）＝7.5×104 A495＝0.06 以下の実施例にて、３′−ビオチン標識付けしたオリ
ゴデオキシヌクレオチドを調製した。
実施例４ 標識付けしていない３′アミン核酸200pmol、およびp
H8.3の100mMの炭酸ナトリウム緩衝液40μmolに、ビオチ
ン−Ｎ−ヒドロキシスクシニミドエステル溶液（DMSO中
で10mg/ml）40μmolを加えた。この溶液を撹拌し、25℃
で、30分間インキュベートした。さらに重炭酸塩緩衝液
40μｌ、およびビオチン−Ｎ−ヒドロキシスクシニミド
エステル溶液40μｌを添加した。
30分後に、生成物をエタノール沈澱させ、6mol尿素−
20％ポリアクリルアミドゲルによる電気泳動によって精
製した。適切なバンドを、オートラジオグラフィーで同
定、分離し、ゲル溶離し、さらにセファデックスG50/50
カラムにおいてゲル濾過を行った。生成物を、放射性標
識で分析したところ、40％収量で分離され、20％ポリア
クリルアミドゲル上において均質であった。
下記の実施例では、ニトロセルロースフィルターに結
合した相補的標的DNAへの、３′末端修飾したオリゴヌ
クレオチドのハイブリダイゼーションを行った。
実施例５ 核酸の３′を修飾させること、また、例えば、ビオチ
ンあるいはフルオレシインを用いてさらに機能性を付与
することの影響を調べるために、（上記のようにして合
成を行った）32P−標識付した３′アミンポリヌクレオ
チドを、ニトロセルロースに結合させた相補的標的DNA
にハイブッリドさせた。次に、これらのハイブリダイゼ
ーション錯体を、洗浄条件を次第に厳しい条件に変えて
洗浄し、本発明による３′末端の修飾が、これらの核酸
配列のハイブリダイゼーションに利用できる程度に及ぼ
す影響を調べた。
具体的には、20μｇのプラスミドpUC18sac−１を、制
限酵素Hind IIIを用いて消化し、線状化した。１μｇの
線状化プラスミドDNAを含む部分試料（２μｌ）を、ニ
トロセルロースフィルター上にスポットした。このニト
ロセルロースフィルターを、3MMのワットマン濾紙上で
飽和した0.5M水酸化ナトリウム、1.5M塩化ナトリウムに
浸して、前述のDNAを変性させた。次に、1.5M塩化ナト
リウム、0.5M Tris、pH8.0、で飽和した3MMのワットマ
ン濾紙にこの物質を暴露して中和し、さらに２×SSPEで
飽和した3MMのワットマン濾紙に移した。
そして、ニトロセルロースを30分間風乾し、80℃で、
２時間、保温した。５×SSPEならびに各々0.2％のウシ
血清アルブミン、Ficollおよびポリビニルピロリドン中
で、50℃で、３時間プレハイブリダイゼーションを行っ
た。ハイブリダイゼーションは、1pmolの32P−ポリヌク
レオチドプローブ、200mgの変性ヒト胎盤DNA、および各
々0.2％のウシ血清アルブミン、Ficollおよびポリビニ
ルピロリドン、さらに0.2％のSDSを含む５×SSPE溶液2m
l中において、50℃で、15分間ニトロセルロースをイン
キュベートすることによって行った。次に、ニトロセル
ロースを、第３表に示すように種々の温度において、６
×SSC中で、５分間にわたって３回洗浄した。フィルタ
ーに残った放射能を、液体シンチレーションカウンティ
ングによって測定した。50％のハイブリダイゼーション
プローブが保持された温度が、その核酸の溶解温度であ
ると判断した。
第３表 ３′フルオレシイン標識核酸 温度（℃） ハイブリダイゼーション（％） 60 100 65 96 70 76 75 30 80 16 ３′アミン核酸 温度（℃） ハイブリダイゼーション（％） 60 100 65 70 70 44 75 13 80 2 下記の核酸の理論溶解温度Tmは78％である。Suggs
等，Developmental Biology Using Purified Genes,Bro
wn等の編集,Academic Press,New York,683−693頁（198
1）。
第４表 Tm ３′フルオレシイン標識ヌクレオチド 72℃ ３′アミン核酸 67℃ 第３表および第４表を比較すれば、核酸の３′末端修
飾は、ハイブリダイゼーションTmにほとんど影響しない
ことが容易にわかる。
以上の説明を考慮すれば、当業者が、本発明の様々な
変更を想到することが考えられる。例えば、ヒドロキシ
アルキルアミンとして、還元カルボキシル基を有するポ
リリシンを使用することによって、多重レポーター基
（すなわち、ポリリシン成分の複数個のアミン基におけ
る）をポリヌクレオチドに結合することができる。従っ
て、特許請求の範囲の欄に示した限定のみを、本発明に
課すべきである。

Claims (5)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】リンカーによってアミノ基が結合したポリ
    ヌクレオチドを調製する方法であって、以下の工程、す
    なわち； 保持体結合したカルボキシル基およびヒドロキシア
    ルキルアミンリンカー分子のアミノ基をアミド結合し； 前記リンカーの水酸基にて、３′端から５′端の方
    向に、ポリヌクレオチドを合成し；および 前記カルボキシル基と前記リンカーのアミノ基の間
    にあるアミド結合を加水分解する、 工程を含む、ことを特徴とするリンカーによってアミノ
    基が結合したポリヌクレオチドを調製する方法。
  2. 【請求項２】前記ポリヌクレオチドが、デオキシリボ核
    酸である特許請求の範囲第１項に記載の方法。
  3. 【請求項３】前記ポリヌクレオチドが、リボ核酸である
    特許請求の範囲第１項に記載の方法。
  4. 【請求項４】前記リンカーが、１から10個の炭素原子を
    含む特許請求の範囲第１項に記載の方法。
  5. 【請求項５】前記リンカーが、メタノールアミン、エタ
    ノールアミン、プロパノールアミン、ブタノールアミ
    ン、ペンタノールアミン、ヘクサノールアミン、ヘプタ
    ノールアミン、オクタノールアミン、ノナノールアミ
    ン、およびデカノールアミンからなるグループから選択
    される特許請求の範囲第４項に記載の方法。
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