JP2550106B2 - 光分散検出型電気泳動装置 - Google Patents
光分散検出型電気泳動装置Info
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- Japan
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- fluorescence
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- G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
- G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
- G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
- G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
- G01N21/6428—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes"
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- G01N27/26—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating electrochemical variables; by using electrolysis or electrophoresis
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- G01N27/447—Systems using electrophoresis
- G01N27/44704—Details; Accessories
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Description
【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明はDNAあるいはRNAなどの電気泳動分離光検出装
置に係り、特に複数の蛍光色素で標識された試料からの
波長の異なる蛍光を検出するのに好適な光分散検出型電
気泳動装置に関する。
置に係り、特に複数の蛍光色素で標識された試料からの
波長の異なる蛍光を検出するのに好適な光分散検出型電
気泳動装置に関する。
従来、DNA上の塩基配列決定はオートラジオグラフイ
を用いて、分離パターンを写真に転写することにより行
なつていた。しかし、放射性元素を使用する煩雑さに加
えて手間と時間のかかる難点があつた。そこでDNAを蛍
光標識して電気泳動分離中のDNA断片を実時間で検出す
る方式が注目されている。（エル，エム，スミス等ネー
チヤー321,674（1986）（L.M.Smith etal nature 321,6
74（1986）））この方法では特定のDNA末端を保持する
と共に末端あるいは途中に蛍光標識を行ない、他の末端
の核酸の持つ塩基がアデニン（Ａ）であるDNAフラグメ
ント群、シトシン（Ｃ）、チミン（Ｔ）、あるいはグア
ニン（Ｇ）で終わる四種のフラグメント群を作製する。
この時各塩基群を標識する蛍光体には発光波長の異なる
ものを用いる。これら四つの断片群をいつしよにしてゲ
ル電気泳動分離を行なう。電気泳動速度は短いDNA断片
ほど早いので、試料注入口から一定距離の所をレーザー
で照射すると短い断片から順次照射領域を通過し蛍光を
発する。塩基種により発光波長が異なるので波長から塩
基種が決定され、泳動時間から長さが決定できる。
を用いて、分離パターンを写真に転写することにより行
なつていた。しかし、放射性元素を使用する煩雑さに加
えて手間と時間のかかる難点があつた。そこでDNAを蛍
光標識して電気泳動分離中のDNA断片を実時間で検出す
る方式が注目されている。（エル，エム，スミス等ネー
チヤー321,674（1986）（L.M.Smith etal nature 321,6
74（1986）））この方法では特定のDNA末端を保持する
と共に末端あるいは途中に蛍光標識を行ない、他の末端
の核酸の持つ塩基がアデニン（Ａ）であるDNAフラグメ
ント群、シトシン（Ｃ）、チミン（Ｔ）、あるいはグア
ニン（Ｇ）で終わる四種のフラグメント群を作製する。
この時各塩基群を標識する蛍光体には発光波長の異なる
ものを用いる。これら四つの断片群をいつしよにしてゲ
ル電気泳動分離を行なう。電気泳動速度は短いDNA断片
ほど早いので、試料注入口から一定距離の所をレーザー
で照射すると短い断片から順次照射領域を通過し蛍光を
発する。塩基種により発光波長が異なるので波長から塩
基種が決定され、泳動時間から長さが決定できる。
四種の波長の異なる蛍光を識別するために、透過波長
の異なる四種のフイルターを回転させたりしている。ま
た、複数個の試料の測定を可能とするため、平板型ゲル
を用いた装置が米国アプライド バイオシステムズ（Ap
plied Biosystems）社から市販されている。この装置で
はレーザービームを細く絞りゲル平面の一点を照射す
る。ここから出た蛍光は回転フイルターを通過して受光
部で検出される。多数試料の測定ではレーザー照射位置
と検出部を連動させて一直線上を走査して情報を得てい
る。
の異なる四種のフイルターを回転させたりしている。ま
た、複数個の試料の測定を可能とするため、平板型ゲル
を用いた装置が米国アプライド バイオシステムズ（Ap
plied Biosystems）社から市販されている。この装置で
はレーザービームを細く絞りゲル平面の一点を照射す
る。ここから出た蛍光は回転フイルターを通過して受光
部で検出される。多数試料の測定ではレーザー照射位置
と検出部を連動させて一直線上を走査して情報を得てい
る。
上記従来技術では検出部に受光される受光量を多くす
るという点で配慮がされていなかつた。すなわち、泳動
板上の10cmの領域を判定しようとすると各地点をレーザ
ーが照射する時間は、仮にレーザビーム幅を0.5mmとす
ると１回の走査時間（通常１秒程度）の1/200となつて
しまう。更に４つの塩基に対応して４つのフイルターが
回転するので着目する１つの塩基群あたりの計測時間は
更に1/4になり、結局、全体の計測時間の1/800程度が１
地点、１塩基種の計測に用いられるだけで受光量が少な
く高感度が得られない。
るという点で配慮がされていなかつた。すなわち、泳動
板上の10cmの領域を判定しようとすると各地点をレーザ
ーが照射する時間は、仮にレーザビーム幅を0.5mmとす
ると１回の走査時間（通常１秒程度）の1/200となつて
しまう。更に４つの塩基に対応して４つのフイルターが
回転するので着目する１つの塩基群あたりの計測時間は
更に1/4になり、結局、全体の計測時間の1/800程度が１
地点、１塩基種の計測に用いられるだけで受光量が少な
く高感度が得られない。
本発明の目的は回転フイルターを用いることなく、単
純な機構ですべての計測時間にわたつて各波長の蛍光を
受光できる高感度な光分散検出型電気泳動装置を提供す
ることにある。
純な機構ですべての計測時間にわたつて各波長の蛍光を
受光できる高感度な光分散検出型電気泳動装置を提供す
ることにある。
上記目的は測定領域を同時に照射し、発する蛍光を直
視プリズムで波長分散させると同時にレンズ系でイメー
ジ増幅器上に結像させ、二次元検出器を用いて検出する
ことにより達成される。
視プリズムで波長分散させると同時にレンズ系でイメー
ジ増幅器上に結像させ、二次元検出器を用いて検出する
ことにより達成される。
すなわち集光レンズの前面に直視プリズムを設置し、
波長分散と結像を同時に行なう事により達成される。
波長分散と結像を同時に行なう事により達成される。
通常の単一プリズムと異なり複数のプリズムを組み合
わせた直視プリズム（複合プリズム）では出射後の光路
が入射前とあまり変化なく、波長による分散だけをひき
おこす。このため蛍光線画像を歪めることなくレンズ系
を用いて波長分散した型でイメージ増幅器あるいは高感
度二次元検出器上に結像する事ができる。
わせた直視プリズム（複合プリズム）では出射後の光路
が入射前とあまり変化なく、波長による分散だけをひき
おこす。このため蛍光線画像を歪めることなくレンズ系
を用いて波長分散した型でイメージ増幅器あるいは高感
度二次元検出器上に結像する事ができる。
蛍光線画像を水平方向に取るとすると上下方向に波長
分散した蛍光像が並ぶことになる。上下方向の位置で波
長を識別し、水平方向の座標から照射されている部分の
位置を識別する。上下方向分散は異なる蛍光体で標識さ
れた塩基種の違いを表わしており、左右は装填位置の違
いを反映しており、試料の違いを表わすことになる。
分散した蛍光像が並ぶことになる。上下方向の位置で波
長を識別し、水平方向の座標から照射されている部分の
位置を識別する。上下方向分散は異なる蛍光体で標識さ
れた塩基種の違いを表わしており、左右は装填位置の違
いを反映しており、試料の違いを表わすことになる。
以下、本発明の一実施例を第１〜２図により説明す
る。第１図は全体の装置構成を示したものである。第２
図は塩基配列決定の原理を、第３図は組合せプリズムの
動作原理を示したものである。
る。第１図は全体の装置構成を示したものである。第２
図は塩基配列決定の原理を、第３図は組合せプリズムの
動作原理を示したものである。
配列を決定しようとするDNA（検体）16の片方の末端
に蛍光標識（Ｆ）を行ない、他の末端がアデニン（Ａ）
塩基で終わる断片群（｛Ａ｝フアミリー）を作製する。
同様の断片群（ファミリー）を他の塩基、シトシン
（Ｃ），グアニン（Ｇ），チミン（Ｔ）についても作製
する。ただし、標識蛍光体の種類を断片群毎に変えてお
く。これら断片群を１つにまとめて泳動ゲル上に装填し
電気泳動を行なう。一つの試料（検体）について一個の
泳動路を使用する。本実施例では複数の泳動路が確保で
きるので多くの試料（検体）を同時に測定することがで
きる。DNA断片は短いものほど早く泳動するので、泳動
始点から一定距離の所を光で照射し通過するDNAフラグ
メントから出る蛍光を観測すると泳動時間から塩基長が
わかり、蛍光波長から末端塩基種がわかる。
に蛍光標識（Ｆ）を行ない、他の末端がアデニン（Ａ）
塩基で終わる断片群（｛Ａ｝フアミリー）を作製する。
同様の断片群（ファミリー）を他の塩基、シトシン
（Ｃ），グアニン（Ｇ），チミン（Ｔ）についても作製
する。ただし、標識蛍光体の種類を断片群毎に変えてお
く。これら断片群を１つにまとめて泳動ゲル上に装填し
電気泳動を行なう。一つの試料（検体）について一個の
泳動路を使用する。本実施例では複数の泳動路が確保で
きるので多くの試料（検体）を同時に測定することがで
きる。DNA断片は短いものほど早く泳動するので、泳動
始点から一定距離の所を光で照射し通過するDNAフラグ
メントから出る蛍光を観測すると泳動時間から塩基長が
わかり、蛍光波長から末端塩基種がわかる。
複数泳路を含む励起光の線状照射部のゲルや蛍光体等
から発せられる蛍光線画像は励起光をカツトするフイル
ター４を通過し直視プリズム14で波長分散させられ、結
像レンズ５でイメージ増幅器６上に波長分散画像として
結像する。波長分散した増幅画像は二次元検出器７によ
り受光される。二次元検出器７上の水平方向（泳動方向
に垂直な方向）の位置が照射部座標、即ち泳動路の区別
を表し、垂直方向（泳動方向）が波長分散される方向に
対応する。二次元検出器７上の１本の水平方向の受光素
子ライン、または水平方向の複数の受光素子ラインで波
長分散された蛍光像を受光する。従って、波長分散され
た蛍光像を二次元検出器７上の垂直方向の異なった４ヵ
所の位置で得る。該信号は検出回路９に入力され、信号
検出の様子はモニター８上に見る事ができる。また、検
出回路９からの信号はメモリ10,計算機11,出力機器12に
よつて処理、分析することができる。なお、上記二次元
検出器７として、複数のラインセンサーを配列したもの
を使用しても良い。
から発せられる蛍光線画像は励起光をカツトするフイル
ター４を通過し直視プリズム14で波長分散させられ、結
像レンズ５でイメージ増幅器６上に波長分散画像として
結像する。波長分散した増幅画像は二次元検出器７によ
り受光される。二次元検出器７上の水平方向（泳動方向
に垂直な方向）の位置が照射部座標、即ち泳動路の区別
を表し、垂直方向（泳動方向）が波長分散される方向に
対応する。二次元検出器７上の１本の水平方向の受光素
子ライン、または水平方向の複数の受光素子ラインで波
長分散された蛍光像を受光する。従って、波長分散され
た蛍光像を二次元検出器７上の垂直方向の異なった４ヵ
所の位置で得る。該信号は検出回路９に入力され、信号
検出の様子はモニター８上に見る事ができる。また、検
出回路９からの信号はメモリ10,計算機11,出力機器12に
よつて処理、分析することができる。なお、上記二次元
検出器７として、複数のラインセンサーを配列したもの
を使用しても良い。
励起波長488nmを用いFITC（発光波長515nm）およびそ
の異性体（発光波長535nm,555nmおよび575nm）を蛍光体
に使用した場合の例を説明する。第３図に示したように
屈折率n2およびn3のプリズムを組み合わせて使用する
時、波長による屈折角の分散∂u out/∂λは次式で与え
られる。
の異性体（発光波長535nm,555nmおよび575nm）を蛍光体
に使用した場合の例を説明する。第３図に示したように
屈折率n2およびn3のプリズムを組み合わせて使用する
時、波長による屈折角の分散∂u out/∂λは次式で与え
られる。
α２は第１プリズムの頂角、n2は屈折率、n1は空気の
屈折率、n3は第２プリズムの屈折率である。nd2,nd3は
第１および第２プリズムを構成するガラスのnd値であ
り、νd2およびνd3はνｄ値である。λＦ＝0.4861μm,
λＣ＝0.6563μｍである。α２を15゜とし、第１プリズ
ム材にSFS1を、第２プリズム材にFK5を用いると、第２
プリズムの頂角α３は となる。また、 νd2＝21,nd2＝1.92 νd3＝70 nd3＝1.4 であるので、波長による屈折角の分散は、 となる。ここで 波長差Δλ＝20nmとし、結像位置Ｌ＝60mmとすると分散
Δｌは Δｌ＝0.095・Δλ・Ｌ ＝0.11（mm） となる。すなわち、イメージ増幅器上で0.11mmの分散が
得られる。より大きな分散が必要な実施例ではα２を30
゜としＬ＝100mmとして分散を0.36mmと大きくし、波長
識別を十分行なえるようにした。
屈折率、n3は第２プリズムの屈折率である。nd2,nd3は
第１および第２プリズムを構成するガラスのnd値であ
り、νd2およびνd3はνｄ値である。λＦ＝0.4861μm,
λＣ＝0.6563μｍである。α２を15゜とし、第１プリズ
ム材にSFS1を、第２プリズム材にFK5を用いると、第２
プリズムの頂角α３は となる。また、 νd2＝21,nd2＝1.92 νd3＝70 nd3＝1.4 であるので、波長による屈折角の分散は、 となる。ここで 波長差Δλ＝20nmとし、結像位置Ｌ＝60mmとすると分散
Δｌは Δｌ＝0.095・Δλ・Ｌ ＝0.11（mm） となる。すなわち、イメージ増幅器上で0.11mmの分散が
得られる。より大きな分散が必要な実施例ではα２を30
゜としＬ＝100mmとして分散を0.36mmと大きくし、波長
識別を十分行なえるようにした。
なお、イメージ増幅器の位置分解能は約0.03mmであ
る。
る。
本発明によれば、光路を大きく変化する事なく波長分
散をすることができるので、蛍光画像をゆがませる事な
く波長分散して計測できる。本方式は回転フイルターで
交互に異なる波長を受光する必要がなく、単純な機構で
すべての計測時間にわたつて各波長の蛍光を受光できる
ので非常な高感度が得られる。
散をすることができるので、蛍光画像をゆがませる事な
く波長分散して計測できる。本方式は回転フイルターで
交互に異なる波長を受光する必要がなく、単純な機構で
すべての計測時間にわたつて各波長の蛍光を受光できる
ので非常な高感度が得られる。
第１図は装置の構成図、第２図はDNA塩基配列決定の原
理図、第３図は直視プリズムの例である。 １……ゲル板、２……レーザー、３……ミラー、４……
反射フイルター、５……レンズ、６……イメージ増幅
器、７……二次元検出器、８……モニター、９……検出
回路、10……メモリ、11……計算機、12……出力機器、
13……レーザー光、14……直視プリズム、15……DNAバ
ンド、16……目的とするDNA、17……泳動板、18……サ
ンプルウエル、19……入射光、20……第１プリズム、21
……第２プリズム、22……第３プリズム。
理図、第３図は直視プリズムの例である。 １……ゲル板、２……レーザー、３……ミラー、４……
反射フイルター、５……レンズ、６……イメージ増幅
器、７……二次元検出器、８……モニター、９……検出
回路、10……メモリ、11……計算機、12……出力機器、
13……レーザー光、14……直視プリズム、15……DNAバ
ンド、16……目的とするDNA、17……泳動板、18……サ
ンプルウエル、19……入射光、20……第１プリズム、21
……第２プリズム、22……第３プリズム。
Claims (10)
- 【請求項１】蛍光体で標識された試料が泳動する複数の
泳動路を有する泳動分離手段と、前記蛍光体を励起し蛍
光を発生させる励起手段と、 異なる材質からなる複数のプリズムから構成され、前記
蛍光を前記蛍光体の種類に応じた波長の光に分散させる
複合プリズムを含み、該複合プリズムにより分散された
光を検出する光検出手段とを有することを特徴とする光
分散検出型電気泳動装置。 - 【請求項２】特許請求の範囲第１項に記載の光分散検出
型電気泳動装置において、 前記複合プリズムは、断面形状が三角形である第１、第
２、第３のプリズムから構成され、前記第１のプリズム
は前記蛍光の入射面側に、前記第２のプリズムは前記蛍
光の出射面側に、前記第３のプリズムは前記第１のプリ
ズムと前記第２のプリズムとの間にそれぞれ配置され、
前記第１のプリズムと前記第２のプリズムは同一形状を
有する同一の材質で構成され、前記第３のプリズムは、
前記第１及び第２のプリズムの頂角より大なる頂角を有
し、前記第１及び第２のプリズムの屈折率より小なる屈
折率を有することを特徴とする。光分散検出型電気泳動
装置。 - 【請求項３】特許請求の範囲第１項に記載の光分散検出
型電気泳動装置において、 前記励起手段は、前記複数の泳動路と交叉する方向か
ら、前記蛍光体を励起するレーザ光を照射する手段を有
することを特徴とする光分散検出型電気泳動装置。 - 【請求項４】特許請求の範囲第３項に記載の光分散検出
型電気泳動装置において、 前記複合プリズムの前記蛍光の入射面側に、前記レーザ
光を遮断するフイルターが配置されることを特徴とする
光分散検出型電気泳動装置。 - 【請求項５】特許請求の範囲第１項に記載の光分散検出
型電気泳動装置において、 前記試料が核酸試料であり、核酸断片群毎にそれぞれ異
なる蛍光体が標識され、前記核酸試料の塩基配列決定を
行なうことを特徴とする光分散検出型電気泳動装置。 - 【請求項６】蛍光体で標識された試料が泳動する複数の
泳動路を有する泳動分離手段と、前記複数の泳動路と交
叉する方向から、前記蛍光体を励起するレーザビームを
照射し、蛍光を発生させる励起手段と、 異なる材質からなる複数のプリズムから構成され、前記
蛍光を前記蛍光体の種類に応じた波長の光に分散させる
複合プリズムと、 該複合プリズムにより分散された光を集光する集光レン
ズと、 該集光レンズにより集光された光を検出する光検出器と
有することを特徴とする光分散検出型電気泳動装置。 - 【請求項７】異なる蛍光体で標識された試料が泳動する
複数の泳動路を有する泳動分離手段と、 前記複数の泳動路と交叉する方向から、前記蛍光体を励
起するレーザビームを照射し、蛍光を発生させる励起手
段と、 前記複数の泳動路の前記レーザビームが照射される領域
に対向して配置され前記レーザ光を遮断するフイルター
と、 異なる材質からなる複数のプリズムから構成され、前記
蛍光を前記蛍光体の種類に応じた波長の光に分散させる
複合プリズムと、 該複合プリズムにより分散された光を集光する集光レン
ズと、 該集光レンズにより集光された光を増幅するイメージ増
幅器と、 該イメージ増幅器により増幅された光を検出する光検出
器と有することを特徴とする光分散検出型電気泳動装
置。 - 【請求項８】異なる蛍光体で標識された試料を泳動分離
する手段と、 前記蛍光体を励起し蛍光を発生させる手段と、 前記蛍光を分光したままで集光する手段と、 集光された光を検出する手段と有することを特徴とする
光分散検出型電気泳動装置。 - 【請求項９】異なる蛍光体で標識された試料を泳動分離
する手段と、 前記蛍光体を励起し蛍光を発生させる手段と、 前記蛍光を分光し集光する手段と、 集光された光を検出する手段と有することを特徴とする
光分散検出型電気泳動装置。 - 【請求項１０】蛍光体で標識された試料が泳動する複数
の泳動路を有する泳動分離手段と、前記複数の泳動路と
交叉する方向から、前記蛍光体を励起するレーザビーム
を照射し、蛍光を発生させる励起手段と、 前記蛍光を前記蛍光体の種類に応じた波長の光に分散さ
せるプリズムと、 該プリズムにより分散された光を集光する集光レンズ
と、 該集光レンズにより集光された光を検出する光検出器と
有することを特徴とする光分散検出型電気泳動装置。
Priority Applications (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP62272945A JP2550106B2 (ja) | 1987-10-30 | 1987-10-30 | 光分散検出型電気泳動装置 |
| US07/259,311 US4832815A (en) | 1987-10-30 | 1988-10-18 | Wavelength dispersion electrophoresis apparatus |
| DE3850341T DE3850341T2 (de) | 1987-10-30 | 1988-10-24 | Gerät zur Elektrophorese mittels Wellenlängendispersion. |
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