JP2553379B2

JP2553379B2 - 抗腫瘍活性を有する発酵乳

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Publication number: JP2553379B2
Application number: JP63156160A
Authority: JP
Inventors: 達足立; 栄一菊池; 重之三橋; 幸夫十河
Original assignee: Snow Brand Milk Products Co Ltd
Current assignee: Snow Brand Milk Products Co Ltd
Priority date: 1988-06-24
Filing date: 1988-06-24
Publication date: 1996-11-13
Anticipated expiration: 2011-11-13
Also published as: JPH024713A

Description

【発明の詳細な説明】産業上の利用分野本発明は、莢膜性粘質物を産生する特定な乳酸球菌と
ゲオトリクム・カンディダムとをスターターとして用
い、乳又は加工乳を発酵させた抗腫瘍活性を有する発酵
乳に関する。

技術的背景これまで、発酵乳や乳酸菌のガン細胞増殖抑制効果に
ついては多くの報告がある。

乳酸菌にガン細胞増殖抑制効果のあることは、ブルガ
リアのBogdanovによりはじめて報告され〔Bogdanov I.
G.et al.FFBS Lett.、57,259−261（1975）〕、ラクト
バチルス・ブルガリクス（L.bulgaricus）細胞壁のグル
コペプチドが、作用物質として単離された。

その後、米国のShahaniらは、スイスマウス（Swiss m
ice）にヨーグルトを経口投与してエーリッヒ（Ehrlic
h）腹水ガン細胞増殖への影響を検討している。また、
ラクトバチルス・アシドフィルス（L.acidophilus）や
ラクトバチルス・ブルガリクス（L.bulgaricus）、ラク
トバチルス・ブルガリクスとストレプトコッカス・テル
モフィルス（Str.thermophilus）を併用して発酵したウ
シ初乳でも16〜40％のガン細胞増殖抑制効果を認めてい
る〔Shahani K.M.et al.J.Food Prot.、46，（５）,385
−386（1983）〕。

Takanoらはラクトバチルス・ヘルベチクス・サブスピ
ーシー・ユーグルティ（L.helveticus ss.jugurti LB）
とカンディダ・ユチリス（Candida utilis A6）をスタ
ーターとしてつくつた酸乳をラツトに与え、大腸ガンの
発生数を検討した。その結果、26週後、酸乳を与えた群
では対照群に比べ、大腸腫瘍の発生数が有意に少なかつ
た〔Takano T.et al.Bifidobacteria Microflora ４，
（１）,31〜37（1985）〕。

Shackelfordらはラクトバチルス・デルブルッキイ・
サブスピーシー・ブルガリクス（L.delbruckiiss.bulga
ricus）あるいはストレプトコッカス・サリバリウス・
サブスピーシー・テルモフィルス（S.salivalius ss.th
ermophilus）でつくつた発酵乳の効果を検討している。
そして、発酵乳を与えた群では実験中の死亡率が少な
く、また、ストレプトコッカス・テルモフィルスでつく
つた発酵乳では、悪性腫瘍の発生が少なかつたという報
告がなされている〔Shackelford L.A.et al.Nutrition
and Cancer、５，（3/4）,159〜164（1983）〕。

Esserらも、腹腔内にＰ−338細胞を移植したマウスに
ラクトバチルス・ブルガリクスを用い乳で培養した上清
をイオン交換して得た画分を腹腔内に投与して、延命効
果のあることを認めている〔Esser P.et al.Milchwisse
nschaft、38，（５）257〜260（1983）〕。

荒井らは、ラクトバチルス・ヘルベチクス・サブスピ
ーシー・ユーグルティを含むスターターでつくつた殺菌
酸乳をICRマウスに経口投与してエーリッヒ（Ehrlich）
腹水ガン細胞の増殖への影響を検討して42％の増殖抑制
を認めた〔荒井幸一郎ら、腸内フローラーと発癌；学会
出版センター、pp105〜123（1981）〕。

また、馬田らは、マウスのSarcoma−180固形腫瘍を用
いて、14種28株のラクトバチルス（Lactobacillus）の
中から抗腫瘍活性の高い菌株をスクリーニングした〔馬
田三夫、Jap.J.Dairy ＆ Food Sci.30、（６）,205〜21
7（1981）〕。

Katoらは、こうして選抜されたラクトバチルス・カゼ
イ（Lactobacillus.casei YIT 9018）（LC9018）が同種
（Sarcoma−180）および同系腫瘍（L 1210 Leukemiaお
よびMCA K−1 tumor）に対して高い抗腫瘍活性を有する
ことを見出した〔Kato L.et al.Gann 72，（１）417〜5
23（1981）〕。

腸内乳酸菌であるビフィドバクテリウム（Bifido bac
terium）でも抗腫瘍効果が認められている。Kohwiら
は、Meth−Ａ細胞を皮下や腹腔内に移植したマウスにバ
チルス・インファンテス（B.infantis）の菌体を腫瘍移
植部位に投与して、腫瘍の退縮や抑制を認めた〔Kohwi
Y.et al.Bifidobacteria Microflora １，（１）,61〜6
8（1982）〕。

乳酸菌の産生する多糖類についての効果も報告されて
いる。神辺、小田らはＳ−180、Ehrlich（腹腔内）、IM
C（solid）を移植したマウスに、L.helveticus var.jug
urtiの産生する多糖類を腹腔内に投与して、延命効果が
認められることを報告している〔神辺道雄、Jap.J.Dair
y ＆ Food Sci.、30，（６）,219〜225（1981）〕、〔O
da M.et al.Agr.Biol.chem.47，（７）,1623〜1625（19
83）〕。

Shiomiらは、Ｓ−180、Ehrlichを移植したマウスにケ
フィール粒から抽出した多糖を経口投与することによ
り、腫瘍細胞の増殖を抑制したとしている〔Shiomi M.e
t al.Jap.J.Med.Sci.Biol.、35，（２）75〜80（198
2）〕。

しかしながら、乳酸球菌に属するストレプトコッカス
・クレモリス（Str.cremoris）およびストレプトコッカ
ス・ラクチス（Str.lactis）の抗腫瘍活性に関する報告
は殆どなされていない。

一方、スカンジナビアにはロングフイル（Ｌngfi
l）、ヴィリー（viili）、ピーマ（piim）、テッテ
（taette）などの伝統的な粘質発酵乳がある。それらの
製造には、スターターとして莢膜産生球菌を用いるのが
特徴で、他に類を見ない。

この粘質発酵乳のうちヴィリー（viili）は、ストレ
プトコッカス・クレモリス（Streptococcus cremori
s）、ストレプトコッカス・ラクチス（Streptococcus l
actis）、ストレプトコッカス・ジアセチラクチス（Str
eptococcus diacetilactis）、及びロイコノストック・
メセンテロイデス・サブスピーシー・クレモリス（Leuc
onostoc mesenteroides subsp.cremoris）からなる混合
スターターを用いて製造され、発酵乳の表面を覆う乳脂
肪層にゲオドリクム・カンディダム（Geotrichum candi
dum）が生育しているのも見受けられる。

発明が解決しようとする課題本発明者らは、上記スカンジナビアの伝統的な粘質発
酵乳に抗腫瘍活性が認められることに注目し、その製造
に用いられる莢膜性粘質物を産生する乳酸球菌を分離し
て抗腫瘍活性を測定したところ、ストレプトコッカス・
クレモリス及びストレプトコッカス・ラクチスの菌体に
抗腫瘍活性を見出し、また、ストレプトコッカス・クレ
モリス及び／又はストレプトコッカス・ラクチスをスタ
ーターとして用いることにより、得られる発酵乳中の抗
腫瘍活性を高めることも見出した。そして、ストレプト
コッカス・クレモリス及び／又はストレプトコッカス・
ラクチスをスターターとして用いて乳を発酵させる際
に、ゲオトリクム・カンディダムを共存させることによ
り、得られる発酵乳中の抗腫瘍活性を一層高めることを
見出し、本発明をなすに至つた。

したがつて、本発明は、莢膜性粘質物を産生する乳酸
球菌、ストレプトコッカス・クレモリス及び／又はスト
レプトコッカス・ラクチスとゲオトリクム・カンディダ
ムとをスターターとして用い、乳又は加工乳を発酵させ
た抗腫瘍活性を有する発酵乳を提供することを課題とす
る。

以下本発明を詳しく説明する。

課題を解決するための手段本発明の特徴は、粘質発酵乳から分離した莢膜性粘質
物を産生する乳酸球菌ストレプトコッカス・クレモリス
及び／又はストレプトコッカス・ラクチスとゲオトリク
ム・カンディダムとをスターターとして用い、乳又は加
工乳を発酵させた抗腫瘍活性を有する発酵乳にある。

本発明において用いる上記微生物は下記受託番号によ
り寄託されている。菌株受託番号ストレプトコッカス・クレモリス（Streptococcus cremoris） SBT 0495 微工研菌寄第10053号ストレプトコッカス・ラクチス（Streptococcus lactis） SBT 1209 微工研菌寄第8308号ゲオトリクム・カンディダム（Geotrichum candidum） SBT 7053 微工研菌寄第10054号本発明において用いる乳又は加工乳は、獣乳であれば
なんでもよく、粉乳を溶解した還元乳を用いてもよい。
また、ゲオトリクム・カンディダムの生育には脂肪分が
不可欠なので、脱脂乳を用いる際には脂肪分を添加する
ことが必要である。

本発明において用いるゲオトリクム・カンディダム
は、バターなどの乳製品から分離されたもの、市販の菌
体などを用いることができる。勿論、粘質発酵乳のヴィ
リーから分離されたものを用いてもよい。

なお、ゲオトリクム・カンディダムは、表面の乳脂肪
層にピロード状に発生し、酸素消費によつて内部を嫌気
的条件に保つていることから、乳酸球菌のスライム形成
能を高める環境を形成していると思われる。

本発明において用いる莢膜性粘質物産生菌は、粘質発
酵乳ヴィリーからホエートリプチケースペプトン寒天培
地を用いて分離した菌株を培養して得られる培養液から
沈澱させて得られる。

上記粘質発酵乳ヴィリーからの菌株の分離および同定
は、下記手順に従つて行つた。

莢膜性粘質物産生菌の分離（培地） 20％還元脱脂乳（W/V）を透析膜（36/32）で透析後、
透析外液にトリプチケースペプトン（BBL）を１％（W/
V）添加し、さらに寒天（OXOID,Agar Bacteriological,
Agar No.1）を１％（W/V）添加し、pHを6.8に調製し培
地（ホエートリプチケースペプトン寒天培地）とした。
培地を115℃、15分間高圧滅菌後、シャーレに注ぎ平板
を作製した。

（分離法） 10％還元脱脂乳中で活性化させたヴィリー（Ｖ社、フ
インランド）1gを光岡の方法によつて得られた希釈液を
用いて順次希釈し10^-6および10^-7希釈液を調製し、これ
らの希釈液をシャーレ１枚当り0.1mlずつ塗抹した。シ
ャーレは20および30℃で３〜６日間嫌気培養（ガスパッ
ク、BBL）した。生じたコロニーのうち粘性を有するも
のを採取し墨汁染色法により莢膜菌であることを確認し
た。莢膜性粘質物産生菌は、ホエートリプチケースペプ
トン寒天培地、カビサイジン添加ホエートリプチケース
ペプトン寒天培地に順次塗抹鈞金し、純粋にした。分離
された莢膜性粘質物産生菌は10％還元脱脂乳に十分分散
させ急速凍結し−80℃の冷凍庫に保存した。

莢膜性粘質物産生菌の同定試験は全て２重に行つた。分離菌の培養は分離した温
度で行つた。

（染色方法） M17培地で20および30℃で72時間培養した菌体を用いH
uckerの変法によるグラム染色を行つた。

（カタラーゼ活性）スライドグラスに３％過酸化水素水を採る。これにM1
7培地で20および30℃で72時間培養した菌を一白金耳加
えよく混合し気泡の有無により判定した。

（運動性および酸素要求性） Harriganらの方法によりYeast Glucose Lemco Agarを
用いて20および30℃で72時間培養後菌の広がりの有無お
よび菌の生育の有無を観察し、運動性および酸素要求性
を調べた。

（グルコースからのガスの発生） Gibson's Semi−Solid Tomato Juice Mediumを用いて
20および30℃で７日間培養後培地に生じる亀裂の有無に
より判定した。

（生育温度） 10、39.5および45℃で１〜７日間培養し菌の生育を観
察した。

（アルギニンからのアムモニアの産生） M17培地を用い菌を20および30℃で72時間培養後ネス
ラー試薬を添加してアムモニアの検出を行つた。

（耐塩性試験） M17培地に2.4および6.5％（W/V）のNaClを加え、20お
よび30℃で72時間培養後培養液の濁度を520nmで測定
し、さらにpHを測定することで生育の有無を判定した。

（生成乳酸の旋光性） M17培地で菌を20および30℃で72時間培養後培地中の
Ｄ−およびＬ−乳酸量をＦ−キットＬ−乳酸（製品番号
139084、ベーリンガー・マンハイム、山之内）およびＤ
（−）−乳酸脱水素酵素（製品番号106941、ベーリンガ
ー・マンハイム、山之内）を用いて定量した。

（pH9.2での生育試験） M17培地で20および30℃で48時間培養した。

（クエン酸からのガスの発生） Semi−solid Citrate Milk Agarを用いて20および30
℃で72時間培養し寒天中の亀裂の有無でガスの産生を判
定した。

培養終了後、ホエートリプチケースペプトン寒天培地
上に生じたコロニーのうち粘性を示すものを白金耳で拾
つた。ヴィリーの20および30℃培養寒天培地から菌株を
採り、それぞれVCS−１、VCS−２およびVCS−３と記号
を与えた。墨汁染色の結果、全て莢膜性粘質物生産菌で
あることが判明した。

上記の分離菌は全て通性嫌気性、グラム陽性で無芽胞
の運動性のない連鎖球菌でカタラーゼ活性はなかつたこ
とから、ストレプトコッカス（Streptococcus）属に分
類された。さらに、グルコースからの炭酸ガスの産生も
ないことから、Homo型乳酸菌であり、生育温度をみる
と、10℃では全ての菌が生育し、45℃では全て生育せ
ず、39.5℃ではVCS−２およびVCS−３は生育しなかつ
た。耐塩性を見ると、２％NaClでは全て生育したが、４
％NaClではVCS−１のみ生育した他、6.5％NaClでは何れ
も生育しなかつた。アルギニンからのアムモニアの産生
およびpH9.2における生育はVCS−１で認められた。

以上の結果からVCS−１は（Streptococcus lactis）V
CS−２およびVCS−３は（Streptococcus cremoris）と
同定した。

以上の結果を表１に示した。

次に、粘質発酵乳から分離した莢膜性粘質物を産生す
る乳酸球菌ストレプトコッカス・クレモリス及びストレ
プトコッカス・ラクチスの抗腫瘍効果について説明す
る。

ストレプトコッカス・クレモリス及びストレプトコッカ
ス・ラクチスの菌体の調製粘質発酵乳ヴィリーから分離したストレプトコッカス
・クレモリスVCS−２及びVCS−３株及びストレプトコッ
カス・ラクチスVCS−１株の各菌株を予め脱脂乳中で培
養したものを、20％（W/V）還元脱脂乳を透析膜（36/3
2）で透析して得られた透析外液にトリプチケースペプ
トン（BBL）を１％添加してpHを6.8に調整した培地（オ
ートクレーブにて115℃、15分間滅菌）に５％（V/V）宛
それぞれ接種した。次いで、VCS−１株及びVCS−２株は
20℃で、VCS−３株は30℃でそれぞれ48時間培養させ
た。得られた各培養液は12,000rpmで30分間遠心分離
し、沈澱した菌体を蒸留水で数回洗浄後、無菌的に凍結
乾燥することで菌体乾燥粉末を得た。乾燥粉末は抗腫瘍
試験まで−80℃の冷凍庫に保存した。

抗腫瘍性効果次に、上述のようにして得られた各菌体乾燥粉末につ
いて、下記手順に従つて抗腫瘍性試験を行つた。

（抗腫瘍性試験）（イ）Sarcoma−180腫瘍細胞１×10⁶個をマウス腋下部
皮下に移植（０日）、24時間後（１日目）より滅菌生理
食塩水0.1mlに懸濁した試料を、腹腔内に１日１回連続
９日間投与した。投与量は還元脱脂乳の場合２、10、5
0、100mg/kg（対照群:15あるいは20匹、試験群：各10
匹）、また、熱安定性および不安定性画分の場合、投与
量は10mg/kg（対照群:8匹、試験群：各６匹）とした。
対照群では生理食塩水のみを投与した。腫瘍移植後21日
目に腫瘍を摘出しその湿重量を秤量し以下の式より平均
腫瘍増殖抑制率を求めた。

試験期間中定期的に腫瘍の径およびマウスの体重を秤
量すると共にマウスの状態も観察した。

（統計分析） Student's t−testを用いた。

上記による試験の結果は表２に示すとおりである。

表２にみられるとおり、VCS−１は10及び50mg投与群
で46％（Ｐ＜0.05）および52％（Ｐ＜0.05）、また、VC
S−２は２および50mg投与群で46％（Ｐ＜0.05）および4
8％（Ｐ＜0.05）、さらにVCS−３は２及び10mgの投与群
で54％（Ｐ＜0.02）および48％（Ｐ＜0.05）と何れも対
照群と比べ有意に腫瘍の増殖を抑制した。このことか
ら、粘質発酵乳の抗腫瘍活性の発現には莢膜性粘質物産
生Streptococciが寄与していると考えられる。

（ロ）上記VCS−１及びVCS−３株の菌体をマウスに投与
してSarcoma−180腹水腫瘍に対する延命効果の試験を下
記により行つた。

ICRマウスの腹腔内にSarcoma−180腫瘍細胞１×10⁶個
を移植、24時間後から各試料を生理食塩水に懸濁（10〜
100mg/kg/day）し１日１回連日９日間腹腔内に投与し
た。対照群には生理食塩水のみを投与した。平均生存日
数から以下の式により延命率を求めた。

結果は表３に示すとおりである。

表３にみられるとおり、VCS−１及びVCS−３のSarcom
a−180腹水腫瘍に対する延命効果を調べた結果、前者で
142％、後者で182％の延命率が得られた。このことから
粘質発酵乳のSarcoma−180腹水腫瘍に対する抗腫瘍効果
には、莢膜性粘質物産生Streptococciが寄与していると
考えられる。

以下、実施例を示して本発明に係る発酵乳の調製及び
その抗腫瘍効果を具体的に説明する。

実施例スターターの調製牛乳を90℃で60分間保持して殺菌した後、約20℃に冷
却した培地に、粘質発酵乳ヴィリーから分離したストレ
プトコッカス・クレモリスSBT 0495（FERM P−1005
3）、ストレプトコッカス・ラクチスSBT 1209（FERM P
−8308）及びゲオトリクム・カンディダムSBT 7053（FE
RM P−7053）の各菌株を５重量％接種し、18.5±0.5℃
で20±２時間培養して、乳酸酸度0.85±0.1％、pH4.50
±0.1のものをスターターとして用いた。

なお、ストレプトコッカス・クレモリス（Ａ）及びス
トレプトコッカス・ラクチス（Ｂ）の菌数は５×10⁷〜
５×10⁸/g、ゲオドリクム・カンディダム（Ｃ）の菌数
は１×10⁶〜１×10⁷/gであつた。

発酵原料液ミックスの調製配合表に従つて各成分を配合し、90〜95℃で５〜10分
間保持して殺菌した後、約20℃に冷却して発酵原料液ミ
ックスとした。

発酵原料液の配合：牛乳 94.0（ｇ）脱脂乳 0.5 生クリーム 0.5 スターター 5.0 発酵乳の調製上述のようにして調製した、発酵原料液ミックスにス
ターターを５±２重量％添加し、18.5±0.5℃で20±２
時間培養して、乳酸酸度0.85±0.1％、pH4.50±0.1とな
つた時点で培養を終了、７℃以下に冷却して発酵乳を得
た。

発酵乳の抗腫瘍性上述のようにして得られた本発明による発酵乳と、比
較例としてのストレプトコッカス・クレモリス（Ａ）及
びストレプトコッカス・ラクチス（Ｂ）をスターターと
して用い、同様にして調製した発酵乳との抗腫瘍性を下
記により調べた結果を表４に示す。

（抗腫瘍性試験） Sarcoma−180腫瘍細胞をICRマウス腋下部皮下へ移植
後、24時間から発酵乳を１日１回連日９日間腹腔内に投
与し、21日後の腫瘍を摘出した。

表４にみられるとおり、平均腫瘍重量は、（Ａ＋Ｂ）
のグループの試験群（比較例）に比べ本発明により、さ
らにゲオトリクム・カンディダムを添加した（Ａ＋Ｂ＋
Ｃ）のグループ試験群は有意に小さかつたことがわか
る。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献特開昭52−154512（ＪＰ，Ａ) 特開昭52−154511（ＪＰ，Ａ) 特開昭52−128207（ＪＰ，Ａ) 特開平１−281073（ＪＰ，Ａ)

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】莢膜性粘質物を産生する特性を有するスト
レプトコッカス・クレモリス及び／又はストレプトコッ
カス・ラクチスとゲオトリクム・カンディダムとをスタ
ーターとして用い、乳又は加工乳を発酵させて成る抗腫
瘍活性を有する発酵乳。