JP2554329B2 - 粒子の分離方法 - Google Patents
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- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B04—CENTRIFUGAL APPARATUS OR MACHINES FOR CARRYING-OUT PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES
- B04B—CENTRIFUGES
- B04B5/00—Other centrifuges
- B04B5/04—Radial chamber apparatus for separating predominantly liquid mixtures, e.g. butyrometers
- B04B5/0442—Radial chamber apparatus for separating predominantly liquid mixtures, e.g. butyrometers with means for adding or withdrawing liquid substances during the centrifugation, e.g. continuous centrifugation
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Description
【発明の詳細な説明】 〔発明の分野〕 本発明は、粒子分離分野、より詳細には生物細胞を混
合物から分離する方法に関する。
合物から分離する方法に関する。
粒子分離方法は、多岐にわたり様々に応用されてい
る。医学分野で開発されつつある治療技術は効率的血液
処理を必要としている。血液の血球成分は典型的には遠
心分離および／または水力分級（eleutriation）によつ
て分離される。血液から細胞集団を望ましくない細胞汚
染を最小に抑えて分離することは、医学分野にとつて重
要である。
る。医学分野で開発されつつある治療技術は効率的血液
処理を必要としている。血液の血球成分は典型的には遠
心分離および／または水力分級（eleutriation）によつ
て分離される。血液から細胞集団を望ましくない細胞汚
染を最小に抑えて分離することは、医学分野にとつて重
要である。
以下の参考文献は粒子を混合集団から分離する方法を
開示している。米国特許第4,350,283号は、遠心分離的
水力分級によつて特定の粒子をそれらの混合集団から連
続分離するための遠心分離ローターを開示している。こ
のローターは、遠心分離駆動軸に支持されるようにして
あり、またローター回転軸に対し対称的に配設された少
くとも２個の等間隔の細長空洞を備えた水力分級セル収
納手段を有している。ローターの細長空洞の各々と連絡
する流体導入および導出通路を有する流体配送スピンド
ルがローター内に配設される。水力分級液は外部ポンプ
によりローターを通してポンプ給送される。
開示している。米国特許第4,350,283号は、遠心分離的
水力分級によつて特定の粒子をそれらの混合集団から連
続分離するための遠心分離ローターを開示している。こ
のローターは、遠心分離駆動軸に支持されるようにして
あり、またローター回転軸に対し対称的に配設された少
くとも２個の等間隔の細長空洞を備えた水力分級セル収
納手段を有している。ローターの細長空洞の各々と連絡
する流体導入および導出通路を有する流体配送スピンド
ルがローター内に配設される。水力分級液は外部ポンプ
によりローターを通してポンプ給送される。
英国特許第1,313,753号は、微粒状固体物質の粒度分
析を行うための方法および装置を開示した。この方法
は、固体物質の懸濁液を回転ボール（bowl）遠心分離器
に導入しそして水力分級液をその懸濁液中を流通させる
ことから成つている。水力分級された粒子は受け容器に
集められる。この方法は、微粒状固体粒子から粒度0.1
〜５ミクロンの粒子を分離するのに特に適していると記
載されている。装置の方は、供給水力分級液を保管する
ための液溜め、導入口および導出口を有する遠心分離室
および前記液溜めを遠心分離室と接続する導管手段より
成つている。
析を行うための方法および装置を開示した。この方法
は、固体物質の懸濁液を回転ボール（bowl）遠心分離器
に導入しそして水力分級液をその懸濁液中を流通させる
ことから成つている。水力分級された粒子は受け容器に
集められる。この方法は、微粒状固体粒子から粒度0.1
〜５ミクロンの粒子を分離するのに特に適していると記
載されている。装置の方は、供給水力分級液を保管する
ための液溜め、導入口および導出口を有する遠心分離室
および前記液溜めを遠心分離室と接続する導管手段より
成つている。
DE2,918,384（抄録）は、生物細胞を分画（分離）す
るためのモジユラー・システムを開示している。細胞懸
濁液を細胞破砕装置内に送り、次いで、１個またはいく
つかの直列接続ローター（例えば水ひ装置／ローターを
有する向流遠心分離器）に通す。細胞核、粒子画分およ
びリボゾームの分離が開示されている。このモジユラー
・システムは生物学的材料の移動すべき行路を短縮す
る。
るためのモジユラー・システムを開示している。細胞懸
濁液を細胞破砕装置内に送り、次いで、１個またはいく
つかの直列接続ローター（例えば水ひ装置／ローターを
有する向流遠心分離器）に通す。細胞核、粒子画分およ
びリボゾームの分離が開示されている。このモジユラー
・システムは生物学的材料の移動すべき行路を短縮す
る。
以下の参考文献は、血液成分の分離方法および装置を
開示している。米国特許第4,268,393号は、全血から血
小板に富む血漿（platelet rich plasma、略してPRP）
を分離するための装置を開示している。血液サンプルを
チエンバーに入れそして遠心力にかける。比較的少量の
食塩水をそのチエンバーの遠心的に外側端に注入しそれ
によつてPBPをチエンバーから集収袋に排出させる（dis
placed）。赤血球および白血球はチエンバー内で安定平
衡状態に保たれる。好ましい態様では、血液サンプルを
支持するチエンバーを遠心力の影響下に食塩水を充填し
た崩壊可能なキヤビテイにぶつけることにより食塩水を
血液サンプルに注入する。
開示している。米国特許第4,268,393号は、全血から血
小板に富む血漿（platelet rich plasma、略してPRP）
を分離するための装置を開示している。血液サンプルを
チエンバーに入れそして遠心力にかける。比較的少量の
食塩水をそのチエンバーの遠心的に外側端に注入しそれ
によつてPBPをチエンバーから集収袋に排出させる（dis
placed）。赤血球および白血球はチエンバー内で安定平
衡状態に保たれる。好ましい態様では、血液サンプルを
支持するチエンバーを遠心力の影響下に食塩水を充填し
た崩壊可能なキヤビテイにぶつけることにより食塩水を
血液サンプルに注入する。
米国特許第4,304,357号は、血液を血漿に富む成分と
血漿に乏しい成分とに分離するための方法および装置を
開示している。全血を収容した処理袋と流体作動ダイア
フラムを有する可撓性浸出パウチを遠心分離ローターの
血液処理チエンバー内に位置させる。このチエンバーは
一対の凹凸のある（contoured）サポート・シユーと、
ローター回転中心の最も近いところのサポート・シユー
の内壁に対設された圧力プレートとより成る。排出液を
排出パウチに導入すると、血液または血液成分は、強制
的に処理袋から出されそして受け容器に集められる。
血漿に乏しい成分とに分離するための方法および装置を
開示している。全血を収容した処理袋と流体作動ダイア
フラムを有する可撓性浸出パウチを遠心分離ローターの
血液処理チエンバー内に位置させる。このチエンバーは
一対の凹凸のある（contoured）サポート・シユーと、
ローター回転中心の最も近いところのサポート・シユー
の内壁に対設された圧力プレートとより成る。排出液を
排出パウチに導入すると、血液または血液成分は、強制
的に処理袋から出されそして受け容器に集められる。
米国特許第4,416,654号および第4,464,167号は特定の
細胞を分離するための方法を開示している。２ポート遠
心分離フエレシス・ボール（pheresis bowl）が遠心分
離および高速水力分級に用いられる。特別な態様では、
低密度流体、好ましくは血漿を遠心分離された細胞を通
してポンプ給送して細胞をそれらの沈降速度に従つて水
力分級することにより赤血球不含血小板が血液から分離
されている。
細胞を分離するための方法を開示している。２ポート遠
心分離フエレシス・ボール（pheresis bowl）が遠心分
離および高速水力分級に用いられる。特別な態様では、
低密度流体、好ましくは血漿を遠心分離された細胞を通
してポンプ給送して細胞をそれらの沈降速度に従つて水
力分級することにより赤血球不含血小板が血液から分離
されている。
米国特許第4,322,298号は沈降速度の異なる微粉状固
体粒子の懸濁液を分画するための方法および装置を開示
している。全血からの血小板に富む血漿（PRP）の分離
は、血液サンプルを遠心分離しそしてその外側遠心端に
大量の食塩水を注入することにより行われる。この食塩
水は赤血球が袋の他端から沈降した後にPBPを血液サン
プルから排出する。好ましい装置は大型遠心分離容器に
嵌装されるべくした支持体内に保持される相互接続され
た袋の閉鎖系として設計される。
体粒子の懸濁液を分画するための方法および装置を開示
している。全血からの血小板に富む血漿（PRP）の分離
は、血液サンプルを遠心分離しそしてその外側遠心端に
大量の食塩水を注入することにより行われる。この食塩
水は赤血球が袋の他端から沈降した後にPBPを血液サン
プルから排出する。好ましい装置は大型遠心分離容器に
嵌装されるべくした支持体内に保持される相互接続され
た袋の閉鎖系として設計される。
米国特許第4,098,456号は、口部規定リムを有する遠
心分離カツプ、一対の分離可能なカツプ構成半体、およ
びカツプ内の可撓性袋位置の上端を把持するための手段
を開示している。その可撓性袋は血液を洗浄しそして血
液成分を分離するのに特に望ましいとして記載されてい
る。その袋は、導入口と導出口のほかに、遠心分離後血
球にアクセスするための第３のシールされたポートを含
んでいる。血液細胞洗浄は洗浄溶液を血液細胞を通して
排出させることにより行われる。
心分離カツプ、一対の分離可能なカツプ構成半体、およ
びカツプ内の可撓性袋位置の上端を把持するための手段
を開示している。その可撓性袋は血液を洗浄しそして血
液成分を分離するのに特に望ましいとして記載されてい
る。その袋は、導入口と導出口のほかに、遠心分離後血
球にアクセスするための第３のシールされたポートを含
んでいる。血液細胞洗浄は洗浄溶液を血液細胞を通して
排出させることにより行われる。
米国特許第4,269,718号は、寸法および／または密度
において非類似の微細固体粒子例えば血小板および他の
血液細胞を分離するための方法および装置を開示してい
る。血小板の分離は、チエンバー内で血液サンプルを遠
心力にかけ、そして比較的小量の食塩水をそのチエンバ
ーの遠心的に外側の端に注入して血小板を血液サンプル
から排出することにより行われる。好ましい装置におい
ては、血液サンプルを支持するチエンバーを遠心力の作
用下に食塩水の充填されたキヤビテイ中に推進させるこ
とによつて食塩水を血液サンプル中に導入する。
において非類似の微細固体粒子例えば血小板および他の
血液細胞を分離するための方法および装置を開示してい
る。血小板の分離は、チエンバー内で血液サンプルを遠
心力にかけ、そして比較的小量の食塩水をそのチエンバ
ーの遠心的に外側の端に注入して血小板を血液サンプル
から排出することにより行われる。好ましい装置におい
ては、血液サンプルを支持するチエンバーを遠心力の作
用下に食塩水の充填されたキヤビテイ中に推進させるこ
とによつて食塩水を血液サンプル中に導入する。
これらの文献は、異なる沈降特性を有する粒子を混合
物から分離する遠心水力分級法を開示するものである。
混合物を遠心力にかけると共に分離液が目的粒子の沈降
速度よりも高い速度で前記力に抗してポンプ給送され
る。その分離液は目的粒子よりも軽い、すなわち低密度
のものである。分離された粒子は該粒子の表面上の移動
液から生じる粘性抗力によつて排出される。高密度小粒
子はそれより低密度で大きい粒子と同じ粘性抗力効果を
有し得るので、密度の異なる粒子の分離には水力分級は
効果的でない。多くの粒子分離方法、特に血液細胞の分
離方法においては、粒子密度に基づく分離が望ましい。
本発明の方法は、水力分級法よりも改良された異なる密
度を有する粒子の分離方法を提供するものである。
物から分離する遠心水力分級法を開示するものである。
混合物を遠心力にかけると共に分離液が目的粒子の沈降
速度よりも高い速度で前記力に抗してポンプ給送され
る。その分離液は目的粒子よりも軽い、すなわち低密度
のものである。分離された粒子は該粒子の表面上の移動
液から生じる粘性抗力によつて排出される。高密度小粒
子はそれより低密度で大きい粒子と同じ粘性抗力効果を
有し得るので、密度の異なる粒子の分離には水力分級は
効果的でない。多くの粒子分離方法、特に血液細胞の分
離方法においては、粒子密度に基づく分離が望ましい。
本発明の方法は、水力分級法よりも改良された異なる密
度を有する粒子の分離方法を提供するものである。
Boyum,Scandinavian Journal of Clinical and Labor
atory Investigations,21:77（1968）は、単核細胞およ
び顆粒球の人血からの単離方法を開示している。この参
考文献の開示によれば、抗凝固処理血を遠沈管中のイソ
パーク（Isopaque）とフイコール（Ficoll）の混合物の
頂部の上に重層して遠心分離したところ細胞要素は２つ
の主画分、すなわち、遠沈管底部に沈降する顆粒球と赤
血球、および界面に残る血小板に分かれた。単核細胞歩
留は、血液を遠心分離前に食塩水で希釈するとほぼ100
％であるとされた。本発明の方法においては、閉鎖装置
でしかも分離に先立つて希釈することなく単核細胞を血
液細胞混合物から分離することができる。
atory Investigations,21:77（1968）は、単核細胞およ
び顆粒球の人血からの単離方法を開示している。この参
考文献の開示によれば、抗凝固処理血を遠沈管中のイソ
パーク（Isopaque）とフイコール（Ficoll）の混合物の
頂部の上に重層して遠心分離したところ細胞要素は２つ
の主画分、すなわち、遠沈管底部に沈降する顆粒球と赤
血球、および界面に残る血小板に分かれた。単核細胞歩
留は、血液を遠心分離前に食塩水で希釈するとほぼ100
％であるとされた。本発明の方法においては、閉鎖装置
でしかも分離に先立つて希釈することなく単核細胞を血
液細胞混合物から分離することができる。
本発明は、所定の粒子を該粒子含有混合物から分離す
るための方法を提供する。その混合物は遠心分離チエン
バー内に支持され、またそのチエンバーに遠心力がかけ
られる。排出流体（displacing fluid）をその遠心力に
抗してチエンバー内を強制通過させることによつて所定
粒子が混合物から分離される。排出流体は所定粒子の密
度よりも大きいあるいはそれと等しい密度を有する。本
発明はまた単核細胞が特定の方法により血液細胞混合物
から分離される改良された養子免疫伝達療法（adoptive
transfer therapy）をも提供する。
るための方法を提供する。その混合物は遠心分離チエン
バー内に支持され、またそのチエンバーに遠心力がかけ
られる。排出流体（displacing fluid）をその遠心力に
抗してチエンバー内を強制通過させることによつて所定
粒子が混合物から分離される。排出流体は所定粒子の密
度よりも大きいあるいはそれと等しい密度を有する。本
発明はまた単核細胞が特定の方法により血液細胞混合物
から分離される改良された養子免疫伝達療法（adoptive
transfer therapy）をも提供する。
本発明方法は、所定粒子を該粒子を含有する混合物か
ら該混合物中の粒子の相対密度に基づいて分離する。本
明細書に用いられる「所定粒子」とは混合物のより高密
度の成分から分離すべき粒子を意味する。「混合物」と
いう用語は、２以上のタイプの固体または半固体粒子の
様々な割合での組合せのことである。混合物中の粒子の
サイズは臨界的ではない。好ましくは、所定粒子は、約
１μｍ〜約0.25cm、そして最も好ましくは約２μｍ〜約
20μｍの直径を有する。本発明方法の分離に適した粒子
としては例えば生物細胞、粉砕鉱石、触媒粒子およびポ
リマー粒子などが挙げられる。好ましい態様において
は、所定粒子は生物細胞、そして最も好ましくは血液細
胞である。
ら該混合物中の粒子の相対密度に基づいて分離する。本
明細書に用いられる「所定粒子」とは混合物のより高密
度の成分から分離すべき粒子を意味する。「混合物」と
いう用語は、２以上のタイプの固体または半固体粒子の
様々な割合での組合せのことである。混合物中の粒子の
サイズは臨界的ではない。好ましくは、所定粒子は、約
１μｍ〜約0.25cm、そして最も好ましくは約２μｍ〜約
20μｍの直径を有する。本発明方法の分離に適した粒子
としては例えば生物細胞、粉砕鉱石、触媒粒子およびポ
リマー粒子などが挙げられる。好ましい態様において
は、所定粒子は生物細胞、そして最も好ましくは血液細
胞である。
本発明方法により血液細胞混合物から単核細胞が効果
的に分離されることを見出した。「単核細胞」という表
現は、リンパ球と単球のことである。単核細胞にはリン
ホカインのひとつであるインターロイキン−２（IL−
２）で処理されると抗腫瘍反応性を有するリンホカイン
活性化キラー（LAK）細胞を生じることのできるリンパ
球の含まれることが知られている。全血および処理され
た血液画分は、単核細胞の分離に適した混合物である。
好ましくは、単核細胞は全血の遠心分離により調製され
た白血球に富む血液細胞混合物から分離される。
的に分離されることを見出した。「単核細胞」という表
現は、リンパ球と単球のことである。単核細胞にはリン
ホカインのひとつであるインターロイキン−２（IL−
２）で処理されると抗腫瘍反応性を有するリンホカイン
活性化キラー（LAK）細胞を生じることのできるリンパ
球の含まれることが知られている。全血および処理され
た血液画分は、単核細胞の分離に適した混合物である。
好ましくは、単核細胞は全血の遠心分離により調製され
た白血球に富む血液細胞混合物から分離される。
本発明方法で分離された単核細胞は、その望ましくな
い細胞の混入が最小限に抑えられており、またRosenber
g,Journal of the National Cancer Institute,75(4):5
95（1985）およびRosenbergほか、New England Journal
of Medicine,313(23):1485（1985）（その関連開示を
本明細書の記載の一部を含める）に開示されているよう
な養子免疫療法に有用である。本発明方法により血液細
胞混合物から分離された単核細胞をリンホカインのひと
つであるIL−２と接触させると該単核細胞中のリンホカ
イン活性化キラー（LAX）細胞を活性化して抗腫瘍反応
性を有するリンホカインを生じる。それら活性化LAK細
胞は腫瘍増殖を抑えるべく組織に導入することができ
る。この方法のもうひとつの長所は、血液細胞を希釈す
ることなく大量に分離することができるという点であ
る。
い細胞の混入が最小限に抑えられており、またRosenber
g,Journal of the National Cancer Institute,75(4):5
95（1985）およびRosenbergほか、New England Journal
of Medicine,313(23):1485（1985）（その関連開示を
本明細書の記載の一部を含める）に開示されているよう
な養子免疫療法に有用である。本発明方法により血液細
胞混合物から分離された単核細胞をリンホカインのひと
つであるIL−２と接触させると該単核細胞中のリンホカ
イン活性化キラー（LAX）細胞を活性化して抗腫瘍反応
性を有するリンホカインを生じる。それら活性化LAK細
胞は腫瘍増殖を抑えるべく組織に導入することができ
る。この方法のもうひとつの長所は、血液細胞を希釈す
ることなく大量に分離することができるという点であ
る。
本発明方法において、混合物は遠心分離チエンバー内
に支持される。本明細書で用いられる「支持される」と
いう表現は粒子が遠心分離チエンバー内に保持されるこ
とを意味する。好ましくは、それら粒子は該粒子の混合
物中の易動度を高める支持流体の混合される。支持流体
は混合物中の粒子と相容性を有するべきであり、また所
定粒子の密度より低い密度を有するべきである。例えば
血液細胞などの細胞混合物は、様々な液体例えば食塩
水、緩衝された食塩水およびその他の、選択された細胞
の自然環境のそれに類似した浸透圧を有する細胞毒性の
ない流体に支持することができる。血漿は、血液細胞を
分離するのに適した支持液となる。本発明の一態様にお
いては、遠心分離チエンバーを遠心力にかけながらその
チエンバーに混合物を導入する。この態様においては、
チエンバー内の乱流が最小限に抑えられる速度で混合物
を導入すべきである。
に支持される。本明細書で用いられる「支持される」と
いう表現は粒子が遠心分離チエンバー内に保持されるこ
とを意味する。好ましくは、それら粒子は該粒子の混合
物中の易動度を高める支持流体の混合される。支持流体
は混合物中の粒子と相容性を有するべきであり、また所
定粒子の密度より低い密度を有するべきである。例えば
血液細胞などの細胞混合物は、様々な液体例えば食塩
水、緩衝された食塩水およびその他の、選択された細胞
の自然環境のそれに類似した浸透圧を有する細胞毒性の
ない流体に支持することができる。血漿は、血液細胞を
分離するのに適した支持液となる。本発明の一態様にお
いては、遠心分離チエンバーを遠心力にかけながらその
チエンバーに混合物を導入する。この態様においては、
チエンバー内の乱流が最小限に抑えられる速度で混合物
を導入すべきである。
適当な遠心分離チエンバーは、遠心力をかけることの
できる容器である。様々な適当な遠心分離チエンバーが
当該技術分野において周知である。本発明方法は、円筒
状、錐状、トロイド状のチエンバーで、あるいはその他
の、目的とする粒子分離に悪影響を与えるような不規則
さのないチエンバーで行うことができる。このチエンバ
ーは、外側遠心分離端に物質を導入するための手段、お
よび内側遠心分離端を通して物質を排出させるための手
段を有するべきである。好ましくは、遠心分離チエンバ
ーはトロイド状チエンバーである。
できる容器である。様々な適当な遠心分離チエンバーが
当該技術分野において周知である。本発明方法は、円筒
状、錐状、トロイド状のチエンバーで、あるいはその他
の、目的とする粒子分離に悪影響を与えるような不規則
さのないチエンバーで行うことができる。このチエンバ
ーは、外側遠心分離端に物質を導入するための手段、お
よび内側遠心分離端を通して物質を排出させるための手
段を有するべきである。好ましくは、遠心分離チエンバ
ーはトロイド状チエンバーである。
前記チエンバーは遠心力にかけられる。遠心力の量は
臨界的でない。その力は、浸出流体よりも高密度の粒子
に対する排出流体の作用を最小限に抑えると共に所定粒
子を混合物のより高密度な成分から遠ざかる方向に遠心
力に抗して浮遊させるのに充分なものとすべきである。
好ましくは単核細胞を血液細胞から分離する場合、遠心
力は約100×ｇ〜約15,000×ｇ、最も好ましくは約400×
ｇ〜約2,000×ｇである。遠心力は、遠心分離ローター
内でチエンバーを回転させることによつて発生させる。
様々な適当な遠心分離ローターが当該技術分野において
知られている。
臨界的でない。その力は、浸出流体よりも高密度の粒子
に対する排出流体の作用を最小限に抑えると共に所定粒
子を混合物のより高密度な成分から遠ざかる方向に遠心
力に抗して浮遊させるのに充分なものとすべきである。
好ましくは単核細胞を血液細胞から分離する場合、遠心
力は約100×ｇ〜約15,000×ｇ、最も好ましくは約400×
ｇ〜約2,000×ｇである。遠心力は、遠心分離ローター
内でチエンバーを回転させることによつて発生させる。
様々な適当な遠心分離ローターが当該技術分野において
知られている。
本発明方法においては、そのチエンバーを通して排出
流体を遠心力に抗して通過させることによつて所定粒子
を混合物から分離する。その排出流体は所定粒子の密度
よりも高いあるいはそれと同じ密度を有する。選択され
た排出流体の密度と同じかそれよりも低い密度を有する
所定粒子は、遠心力に抗して混合物のより高密度の成分
から遠ざかる方向に浮遊する。排出流体は実質的に均一
な密度を有するべきであり、また所定粒子と相容性を有
するべきである。好ましくは、排出流体は、所定粒子の
密度と等しいかまたはそれよりも高く、しかも混合物の
より高密度の成分よりも低い密度を有する。好ましい態
様では、混合物を遠心力にかけて混合物を成層させてか
ら排出流体を遠心力に抗してチエンバー内を強制通過さ
せる。「混合物を成層させる」という表現は、遠心分離
チエンバー内に支持された粒子をそれぞれの密度に従つ
て層（layersまたはstrata）に分離することを意味す
る。
流体を遠心力に抗して通過させることによつて所定粒子
を混合物から分離する。その排出流体は所定粒子の密度
よりも高いあるいはそれと同じ密度を有する。選択され
た排出流体の密度と同じかそれよりも低い密度を有する
所定粒子は、遠心力に抗して混合物のより高密度の成分
から遠ざかる方向に浮遊する。排出流体は実質的に均一
な密度を有するべきであり、また所定粒子と相容性を有
するべきである。好ましくは、排出流体は、所定粒子の
密度と等しいかまたはそれよりも高く、しかも混合物の
より高密度の成分よりも低い密度を有する。好ましい態
様では、混合物を遠心力にかけて混合物を成層させてか
ら排出流体を遠心力に抗してチエンバー内を強制通過さ
せる。「混合物を成層させる」という表現は、遠心分離
チエンバー内に支持された粒子をそれぞれの密度に従つ
て層（layersまたはstrata）に分離することを意味す
る。
生物細胞の分離に適した排出流体としては例えばコロ
イド性懸濁液、高分子量の塩の溶液、ポリマーと高分子
量の塩との混合物、およびその他の望ましい密度を有す
る生物学的に不活性な溶液などが挙げられる。好ましく
は、生物細胞は、A.B.Pharmacia社（スウエーデン国ウ
プサラ）からFicoll−Paqueという登録商標の下に入手
できるナトリウム ジアトリゾエートと400,000の分子
量を有する多糖類との混合物を用いて分離される。血液
細胞混合物から単核細胞を分離するための好ましい排出
流体は、約1.06g/ml〜約1.08g/ml、最も好ましくは約1.
07g/ml〜約1.08g/mlの密度を有する。
イド性懸濁液、高分子量の塩の溶液、ポリマーと高分子
量の塩との混合物、およびその他の望ましい密度を有す
る生物学的に不活性な溶液などが挙げられる。好ましく
は、生物細胞は、A.B.Pharmacia社（スウエーデン国ウ
プサラ）からFicoll−Paqueという登録商標の下に入手
できるナトリウム ジアトリゾエートと400,000の分子
量を有する多糖類との混合物を用いて分離される。血液
細胞混合物から単核細胞を分離するための好ましい排出
流体は、約1.06g/ml〜約1.08g/ml、最も好ましくは約1.
07g/ml〜約1.08g/mlの密度を有する。
排出流体を遠心力に抗してチエンバー内を強制通過さ
せる速度は臨界的ではない。その速度は、目的とする分
離が合理的な時間量でチエンバー内で過度の乱流が生じ
ることなく行われるようなものとすべきである。その速
度はまた、排出流体よりも高い密度を有する混合物中の
粒子の直線速度が、目的の分離を行う排出流体の直線速
度よりも十分小さくなるようなものとすべきである。
「直線速度」とは物質が遠心分離チエンバーの外側遠心
端から該チエンバーの内側遠心端に向かつて移動する速
度のことである。好ましくは、その速度は、排出流体の
密度よりも高密度を有する混合物中の粒子に正の直線速
度を生じるのに必要な速度よりも小さくする。排出流体
をチエンバー内を強制通過させるのに適した手段には、
ポンプ給送および遠心力または重力による差圧が含まれ
る。目的の分離を行つた後、選択された排出流体よりも
低いかそれと等しい密度を有する所定粒子を集収する。
好ましくは、これら粒子は、それらが遠心分離チエンバ
ーの内側遠心端から外に出る際に集収される。
せる速度は臨界的ではない。その速度は、目的とする分
離が合理的な時間量でチエンバー内で過度の乱流が生じ
ることなく行われるようなものとすべきである。その速
度はまた、排出流体よりも高い密度を有する混合物中の
粒子の直線速度が、目的の分離を行う排出流体の直線速
度よりも十分小さくなるようなものとすべきである。
「直線速度」とは物質が遠心分離チエンバーの外側遠心
端から該チエンバーの内側遠心端に向かつて移動する速
度のことである。好ましくは、その速度は、排出流体の
密度よりも高密度を有する混合物中の粒子に正の直線速
度を生じるのに必要な速度よりも小さくする。排出流体
をチエンバー内を強制通過させるのに適した手段には、
ポンプ給送および遠心力または重力による差圧が含まれ
る。目的の分離を行つた後、選択された排出流体よりも
低いかそれと等しい密度を有する所定粒子を集収する。
好ましくは、これら粒子は、それらが遠心分離チエンバ
ーの内側遠心端から外に出る際に集収される。
本発明方法は、バツチ式、連続式、あるいはそれらの
組合せで行うことができる。好ましくは、この方法は、
閉鎖装置、最も好ましくは、遠心分離チエンバーと配管
により接続された貯蔵袋より成る閉鎖装置で行われる。
この装置は、遠心分離チエンバー内を通して排出流体を
強制通過させるための手段を含むかまたはそれに接続す
ることができる。この装置は、チエンバーおよび貯蔵袋
を囲繞できる複数の空洞を含む遠心分離ローター内に置
かれる。このローターは、チエンバーを通して排出流体
を強制通過させるための手段を有する。好ましくは、こ
の手段を蠕動ポンプとし、また装置を滅菌接続装置とコ
ンパチブルなものとする。
組合せで行うことができる。好ましくは、この方法は、
閉鎖装置、最も好ましくは、遠心分離チエンバーと配管
により接続された貯蔵袋より成る閉鎖装置で行われる。
この装置は、遠心分離チエンバー内を通して排出流体を
強制通過させるための手段を含むかまたはそれに接続す
ることができる。この装置は、チエンバーおよび貯蔵袋
を囲繞できる複数の空洞を含む遠心分離ローター内に置
かれる。このローターは、チエンバーを通して排出流体
を強制通過させるための手段を有する。好ましくは、こ
の手段を蠕動ポンプとし、また装置を滅菌接続装置とコ
ンパチブルなものとする。
本発明の方法を次の実施例で更に説明する。実施例
中、特に断らない限り、部および％は数によるものと
し、そして度は摂氏である。Sanderson,Cell Separatio
n:Methods and Selected Applications.Vol.1,（Academ
ic Press,Inc.社、1982年）には、正常人血液細胞につ
いて次の比重範囲が報告されている：白血球1.065〜1.0
75g/ml;単球1.058〜1.068g/ml;顆粒球1.078〜1.09g/ml;
および赤血球1.04〜1.1g/ml。IL−２処理単核細胞の腫
瘍細胞に対する細胞毒性は以下の手順に従つて、実質的
にSelected Methods in Cellular Immunology,ed.B.B.M
ichell et al.（W.H.Freeman,サンフランシスコ、1980
年）の134〜137頁（その関連開示を本明細書の記載の一
部に含める）に開示されている方法と同様に測定した。
中、特に断らない限り、部および％は数によるものと
し、そして度は摂氏である。Sanderson,Cell Separatio
n:Methods and Selected Applications.Vol.1,（Academ
ic Press,Inc.社、1982年）には、正常人血液細胞につ
いて次の比重範囲が報告されている：白血球1.065〜1.0
75g/ml;単球1.058〜1.068g/ml;顆粒球1.078〜1.09g/ml;
および赤血球1.04〜1.1g/ml。IL−２処理単核細胞の腫
瘍細胞に対する細胞毒性は以下の手順に従つて、実質的
にSelected Methods in Cellular Immunology,ed.B.B.M
ichell et al.（W.H.Freeman,サンフランシスコ、1980
年）の134〜137頁（その関連開示を本明細書の記載の一
部に含める）に開示されている方法と同様に測定した。
LAK活性アツセイ ４時間51Cr放出アツセイを用いてIL−２処理単核細胞
の細胞毒性を測定した。米国メリーランド州ウオーカー
スビル（Walkers ville）、M.A.Bioproducts社から商業
的に入手できる緩衝された溶液であるRPMI1640;Gibco C
o.社（米国ニユーヨーク州グランドアイランド（Grand
Island））から商業的に入手できるペニシリンとストレ
プトマイシンの組成物であるPen−strep;Gibco Co.社か
ら商業的に入手できる抗生物質と抗糸状菌の組成物であ
る１％（容量による）のABM;およびGibco Co.社から商
業的に入手できるCO2緩衝剤である20mMのHEPESを含む細
胞培養培地に単核細胞を１×106個細胞/mlとなるよう懸
濁した。この細胞培養培地を1500pM組換えIL−２と10％
（容量による）人血清と混合した。得られた混合物を37
゜で３〜５日間インキユベートした。そのインキユベー
シヨン時間経過後、非付着性細胞を採取し、そして10％
（容量による）人血清を補給した前記細胞培養培地に再
懸濁した。
の細胞毒性を測定した。米国メリーランド州ウオーカー
スビル（Walkers ville）、M.A.Bioproducts社から商業
的に入手できる緩衝された溶液であるRPMI1640;Gibco C
o.社（米国ニユーヨーク州グランドアイランド（Grand
Island））から商業的に入手できるペニシリンとストレ
プトマイシンの組成物であるPen−strep;Gibco Co.社か
ら商業的に入手できる抗生物質と抗糸状菌の組成物であ
る１％（容量による）のABM;およびGibco Co.社から商
業的に入手できるCO2緩衝剤である20mMのHEPESを含む細
胞培養培地に単核細胞を１×106個細胞/mlとなるよう懸
濁した。この細胞培養培地を1500pM組換えIL−２と10％
（容量による）人血清と混合した。得られた混合物を37
゜で３〜５日間インキユベートした。そのインキユベー
シヨン時間経過後、非付着性細胞を採取し、そして10％
（容量による）人血清を補給した前記細胞培養培地に再
懸濁した。
200万個のBurkittリンパ腫細胞（Raji,ATCC CCL86）
を37℃で１時間、0.4mlのトリス−ホスフエート緩衝食
塩水中50μCiのNa2 51CrO2と共にインキユベートした。
次にそれら細胞を５％（容量による）牛胎児血清を含む
前記の緩衝された溶液（RPMI1640）で４回洗浄し、そし
て10％（容量による）人血清を含む緩衝された溶液（RP
MI−1640）に105個細胞/mlの濃度となるように再懸濁し
た。それらIL−２処理単核細胞と51Cr処理リンパ球細胞
を丸底微量力価測定プレートに、細胞比5:1、20:1およ
び50:1（単核細胞：リンパ腫細胞）となるよう添加し
た。それらプレートを200×ｇで５分間遠心分離し、37
゜で４時間インキユベートし、そして再度200×ｇで遠
心分離した。得られた上清0.1mlを各ウエルから取り、
そしてガンマー計数器で計数した。IL−２処理単核細胞
と混合されなかつた51Cr処理リンパ球細胞の上清と溶解
された51Cr処理リンパ腫細胞もガンマー計数器で計数し
た。毒性％は次式より計算した。式中、「実験値cpm」
は、IL−２処理単核細胞と51Cr処理リンパ腫細胞の混合
物からの上清の１分あたりの計数値を意味し、「自発値
cpm」は、51Cr処理リンパ腫細胞の上清の１分あたりの
計数値を意味し、そして「合計値cpm」は、溶解された
51Cr処理リンパ腫細胞の上清の１分あたりの計数値を意
味する。
を37℃で１時間、0.4mlのトリス−ホスフエート緩衝食
塩水中50μCiのNa2 51CrO2と共にインキユベートした。
次にそれら細胞を５％（容量による）牛胎児血清を含む
前記の緩衝された溶液（RPMI1640）で４回洗浄し、そし
て10％（容量による）人血清を含む緩衝された溶液（RP
MI−1640）に105個細胞/mlの濃度となるように再懸濁し
た。それらIL−２処理単核細胞と51Cr処理リンパ球細胞
を丸底微量力価測定プレートに、細胞比5:1、20:1およ
び50:1（単核細胞：リンパ腫細胞）となるよう添加し
た。それらプレートを200×ｇで５分間遠心分離し、37
゜で４時間インキユベートし、そして再度200×ｇで遠
心分離した。得られた上清0.1mlを各ウエルから取り、
そしてガンマー計数器で計数した。IL−２処理単核細胞
と混合されなかつた51Cr処理リンパ球細胞の上清と溶解
された51Cr処理リンパ腫細胞もガンマー計数器で計数し
た。毒性％は次式より計算した。式中、「実験値cpm」
は、IL−２処理単核細胞と51Cr処理リンパ腫細胞の混合
物からの上清の１分あたりの計数値を意味し、「自発値
cpm」は、51Cr処理リンパ腫細胞の上清の１分あたりの
計数値を意味し、そして「合計値cpm」は、溶解された
51Cr処理リンパ腫細胞の上清の１分あたりの計数値を意
味する。
実施例４、５および６と比較実験Ａ、ＢおよびＣにお
いて細胞毒性は３回ずつ行つて測定した。
いて細胞毒性は３回ずつ行つて測定した。
実施例 １ 約２インチの内径を有する円筒状遠心分離チエンバー
内で単核細胞を血液細胞混合物から分離した。チエンバ
ーの各端部は錐状をなし該チエンバーの直線辺距離は約
3.6inとし、端から端までの距離は約4.6inとした。その
チエンバーに滅菌ホスフエート緩衝食塩水を充填しそし
て約900×ｇの遠心力にかけた。遠心分離により約450ml
の全血から調製された40mlの白血球に富む血液細胞混合
物を、シリンジを用いてチエンバーの外側遠心端にポン
プ給送した。その白血球に富む血液細胞混合物は約２×
1011個の赤血球と約２〜４×109個の白血球を含有し
た。その白血球集団は、約１〜２×109個の顆粒球、約
0.8〜1.6×109個のリンパ球および約0.2〜0.4×109個以
下の単球を含有した。遠心分離器頂部の窓とチエンバー
下方のストロボ光により、混合物がチエンバーの外側端
に留まるのを見ることができた。
内で単核細胞を血液細胞混合物から分離した。チエンバ
ーの各端部は錐状をなし該チエンバーの直線辺距離は約
3.6inとし、端から端までの距離は約4.6inとした。その
チエンバーに滅菌ホスフエート緩衝食塩水を充填しそし
て約900×ｇの遠心力にかけた。遠心分離により約450ml
の全血から調製された40mlの白血球に富む血液細胞混合
物を、シリンジを用いてチエンバーの外側遠心端にポン
プ給送した。その白血球に富む血液細胞混合物は約２×
1011個の赤血球と約２〜４×109個の白血球を含有し
た。その白血球集団は、約１〜２×109個の顆粒球、約
0.8〜1.6×109個のリンパ球および約0.2〜0.4×109個以
下の単球を含有した。遠心分離器頂部の窓とチエンバー
下方のストロボ光により、混合物がチエンバーの外側端
に留まるのを見ることができた。
細胞混合物のポンプ給送完了後直ちに、A.B.Pharmaci
a社（スウエーデン国ウプサラ）よりFicoll−Paqueとい
う商標名の下に商業的に入手できるナトリウムジアトリ
ゾエートと分子量400,000の多糖類との混合物を蠕動ポ
ンプ（peristatic pump）により4ml/分の速度でチエン
バーの外側端にポンプ給入した。前記多糖類・ナトリウ
ムジアトリゾエート混合物の密度は1.077g/mlであつ
た。この多糖類・ナトリウムジアトリゾエート混合物を
７分間ポンプ給送後、明確な細胞層が混合物残部から分
離した。その細胞層がチエンバーの内側遠心端から強制
排出されるまでこのポンプ給送を続けた。チエンバーの
内側端から強制排出されているサンプルを集めその白血
球含量を分析した。結果を第１表に示す。
a社（スウエーデン国ウプサラ）よりFicoll−Paqueとい
う商標名の下に商業的に入手できるナトリウムジアトリ
ゾエートと分子量400,000の多糖類との混合物を蠕動ポ
ンプ（peristatic pump）により4ml/分の速度でチエン
バーの外側端にポンプ給入した。前記多糖類・ナトリウ
ムジアトリゾエート混合物の密度は1.077g/mlであつ
た。この多糖類・ナトリウムジアトリゾエート混合物を
７分間ポンプ給送後、明確な細胞層が混合物残部から分
離した。その細胞層がチエンバーの内側遠心端から強制
排出されるまでこのポンプ給送を続けた。チエンバーの
内側端から強制排出されているサンプルを集めその白血
球含量を分析した。結果を第１表に示す。
第１表 サンプル 容量（ml） 密度（g/ml） 白血球総数 １ 13 N.D. 1.3×109 ２ 5 1.071 5.2×107 ３ 20 1.073 7.2×107 ４ 25 1.073 6.4×107 ５ 22 1.074 1.6×107 ６ 35 1.074 2.8×107 N.D.−測定せず サンプル１は、集められた白血球の約85％を含有して
いることが分かり、また65％リンパ球、17％単球および
13％大顆粒リンパ球を有する100％単核細胞より成つて
いた。遠心分離チエンバーからの残りのものは約100％
の顆粒球と赤血球より成ることが分かつた。
いることが分かり、また65％リンパ球、17％単球および
13％大顆粒リンパ球を有する100％単核細胞より成つて
いた。遠心分離チエンバーからの残りのものは約100％
の顆粒球と赤血球より成ることが分かつた。
実施例 ２ 血液細胞混合物が血漿、白血球および赤血球の層に成
層するまで（約10分）は多糖類・ナトリウム ジアトリ
ゾエート混合物をポンプ給送しないことのほかは、実施
例１に記載の手順を実質的に繰り返した。遠心力は約90
0×ｇとし、多糖類・ナトリウム ジアトリゾエート混
合物を4.5ml/分の速度で添加した。チエンバーの内側端
から強制排出されつつあるサンプルを集めそして白血球
含量を分析した。その結果を第２表に示す。
層するまで（約10分）は多糖類・ナトリウム ジアトリ
ゾエート混合物をポンプ給送しないことのほかは、実施
例１に記載の手順を実質的に繰り返した。遠心力は約90
0×ｇとし、多糖類・ナトリウム ジアトリゾエート混
合物を4.5ml/分の速度で添加した。チエンバーの内側端
から強制排出されつつあるサンプルを集めそして白血球
含量を分析した。その結果を第２表に示す。
第２表 サンプル 容量（ml） 密度（g/ml） 白血球総数 １ 15 1.029 2.6 ×106 ２ 7.5 1.066 1.06×109 ３ 19 1.073 1.13×108 ４ 17 N.D. 1.04×108 ５ 22 1.074 1.62×108 ６ 20 N.D. 1.18×108 N.D.−測定せず サンプルは第３表に示される白血球含量より成ること
が分かつた。
が分かつた。
実施例 ３ 実施例２に記載の手順と同様の手順に従つて、45mlの
濃縮血液細胞サンプルから単核細胞を分離した。15％リ
ンパ球、２％単球および83％顆粒球の細胞集団を有する
サンプルを遠心分離チエンバーにポンプ給送し、そして
血漿、白血球および赤血球の層に成層させた（約20
分）。遠心力は約900×ｇとし、単糖類・ナトリウムジ
アトリゾエート混合物を約5.6ml/分の速度で添加した。
118mlの多糖類・ナトリウムジアトリゾエート混合物を
遠沈管にポンプ給送後、血漿がチエンバーの内側端から
強制排出され始めた。更に14mlの多糖類・ナトリウムジ
アトリゾエート混合物をチエンバーにポンプ給送後、細
胞がチエンバーの内側端から強制排出され始めた。更に
19mlの多糖類・ナトリウムジアトリゾエート混合物をチ
エンバーにポンプ給送し、そして得られた遠心分離エク
ソデート（exodate）を集めた。遠心分離エクソデート
に対する差別的白血球計数の結果、88％リンパ球、９％
単球、２％大顆粒リンパ球および１％顆粒状の細胞集団
が示された。全部で1.1×109個の血液細胞が集められ
た。
濃縮血液細胞サンプルから単核細胞を分離した。15％リ
ンパ球、２％単球および83％顆粒球の細胞集団を有する
サンプルを遠心分離チエンバーにポンプ給送し、そして
血漿、白血球および赤血球の層に成層させた（約20
分）。遠心力は約900×ｇとし、単糖類・ナトリウムジ
アトリゾエート混合物を約5.6ml/分の速度で添加した。
118mlの多糖類・ナトリウムジアトリゾエート混合物を
遠沈管にポンプ給送後、血漿がチエンバーの内側端から
強制排出され始めた。更に14mlの多糖類・ナトリウムジ
アトリゾエート混合物をチエンバーにポンプ給送後、細
胞がチエンバーの内側端から強制排出され始めた。更に
19mlの多糖類・ナトリウムジアトリゾエート混合物をチ
エンバーにポンプ給送し、そして得られた遠心分離エク
ソデート（exodate）を集めた。遠心分離エクソデート
に対する差別的白血球計数の結果、88％リンパ球、９％
単球、２％大顆粒リンパ球および１％顆粒状の細胞集団
が示された。全部で1.1×109個の血液細胞が集められ
た。
実施例 ４ 第１図に示された装置においてリユーコフオレシス
（leukphoresis）から得た血液細胞と血漿の混合物から
単核細胞を分離した。置換可能なフイード袋１および３
を配管によつて遠心分離チエンバー４の外側遠心端に接
続した。60mlシリンジ２と蠕動ポンプ７とを置換可能な
フイード袋１および３の間で配管に接続した。置換可能
な集収袋６を配管により遠心分離チエンバー４の内側遠
心分離端に接続した。
（leukphoresis）から得た血液細胞と血漿の混合物から
単核細胞を分離した。置換可能なフイード袋１および３
を配管によつて遠心分離チエンバー４の外側遠心端に接
続した。60mlシリンジ２と蠕動ポンプ７とを置換可能な
フイード袋１および３の間で配管に接続した。置換可能
な集収袋６を配管により遠心分離チエンバー４の内側遠
心分離端に接続した。
遠心分離チエンバー４をバイパスラインで置換し、そ
してフイード袋３を装置からはずした。得られた装置を
６％（容量による）過酸化水素の溶液をフイード袋１か
ら集収袋６に通すことにより滅菌した。次に滅菌食塩水
をフイード袋１から集収袋６に通して装置から過酸化水
素を除去した。遠心分離チエンバー４を滅菌し、食塩水
でフラツシユし、装置に接続し、そして遠心分離器９の
遠心分離ローター８に入れた。リユーコフオレシスから
得られた190mlの血液細胞と血漿との混合物を含むフイ
ード袋（サンプルＡと指称する）をフイード袋３として
滅菌的に接続し、そして配管をb.点で閉じた。遠心分離
９を開始し、そして蠕動ポンプ７と60mlシリンジ２をポ
ンプ給送源として用いて滅菌食塩水をフイード袋１から
装置に導入することによつて装置を脱気した。
してフイード袋３を装置からはずした。得られた装置を
６％（容量による）過酸化水素の溶液をフイード袋１か
ら集収袋６に通すことにより滅菌した。次に滅菌食塩水
をフイード袋１から集収袋６に通して装置から過酸化水
素を除去した。遠心分離チエンバー４を滅菌し、食塩水
でフラツシユし、装置に接続し、そして遠心分離器９の
遠心分離ローター８に入れた。リユーコフオレシスから
得られた190mlの血液細胞と血漿との混合物を含むフイ
ード袋（サンプルＡと指称する）をフイード袋３として
滅菌的に接続し、そして配管をb.点で閉じた。遠心分離
９を開始し、そして蠕動ポンプ７と60mlシリンジ２をポ
ンプ給送源として用いて滅菌食塩水をフイード袋１から
装置に導入することによつて装置を脱気した。
シリンジ・プランジヤーを下げ、蠕動ポンプ７を停止
し、ａ点およびｂ点を開きそしてｃ点を閉じた状態で前
記プランジヤーを上行させて約50mlの血液細胞混合物を
シリンジ２中に引き入れた。次にｂ点を閉じ、ｃ点を開
きそしてシリンジ２中の混合物を装置に注入した。血液
細胞が遠心分離チエンバー４に入つて行くのが見えた。
実質的にすべての混合物が遠心分離チエンバー４に注入
されるまでこの手順を繰り返した。細胞を約10分間放置
沈降させた。この間に、1.075の密度を有する実施例１
に記載のものと同様の250mlの多糖類・ナトリウムジア
トリゾエート混合物を含む袋をフイード袋１として装置
に取着した。多糖類・ナトリウムジアトリゾエート混合
物をｃ点にポンプ給送して食塩水の配管を清浄した。次
に多糖類・ナトリウムジアトリゾエート混合物を4ml/分
の速度で遠心分離チエンバー４にポンプ給送しながらそ
のチエンバーを900×ｇの遠心力にかけた。約135mlの多
糖類・ナトリウムジアトリゾエート混合物をチエンバー
４にポンプ給送した後、食塩水と血漿と混合物を含んだ
集収袋６を滅菌袋で置き換えて後続の画分を集収した。
45mlのサンプル（サンプルＢと称する）を袋６に集めそ
して白血球含量を分析した。結果は第４表に示すとおり
である。
し、ａ点およびｂ点を開きそしてｃ点を閉じた状態で前
記プランジヤーを上行させて約50mlの血液細胞混合物を
シリンジ２中に引き入れた。次にｂ点を閉じ、ｃ点を開
きそしてシリンジ２中の混合物を装置に注入した。血液
細胞が遠心分離チエンバー４に入つて行くのが見えた。
実質的にすべての混合物が遠心分離チエンバー４に注入
されるまでこの手順を繰り返した。細胞を約10分間放置
沈降させた。この間に、1.075の密度を有する実施例１
に記載のものと同様の250mlの多糖類・ナトリウムジア
トリゾエート混合物を含む袋をフイード袋１として装置
に取着した。多糖類・ナトリウムジアトリゾエート混合
物をｃ点にポンプ給送して食塩水の配管を清浄した。次
に多糖類・ナトリウムジアトリゾエート混合物を4ml/分
の速度で遠心分離チエンバー４にポンプ給送しながらそ
のチエンバーを900×ｇの遠心力にかけた。約135mlの多
糖類・ナトリウムジアトリゾエート混合物をチエンバー
４にポンプ給送した後、食塩水と血漿と混合物を含んだ
集収袋６を滅菌袋で置き換えて後続の画分を集収した。
45mlのサンプル（サンプルＢと称する）を袋６に集めそ
して白血球含量を分析した。結果は第４表に示すとおり
である。
IL−２中で３日間インキユベーシヨンした後のサンプ
ルＢのLAK活性を測定した。その結果は第５表および第
２図に示すとおりである。
ルＢのLAK活性を測定した。その結果は第５表および第
２図に示すとおりである。
比較実験 Ａ 実施例４で用いたリユーコフオレシスからの血液細胞
と血漿の混合物10mlをGibco Co.社から商業的に入手で
きる滅菌食塩水であるSelig−mann's Balanced Salt So
lution（SBSS）で1:1（容量比）希釈し、そして50ml遠
沈管中で実施例４に記載の多糖類・ナトリウムジアトリ
ゾエート混合物20mlに重層した。その遠沈管を約400×
ｇの遠心力に約25分間かけた。食塩水の多糖類・ナトリ
ウムジアトリゾエート混合物との間の界面にある細胞層
をピペツト処理により集収し、そして前述の滅菌食塩水
中で３回、400×ｇで10分間、200×ｇで10分間および20
0×ｇで10分間洗浄した。IL−２中で３日間インキユベ
ーシヨンした後、得られた細胞のLAK活性を測定した。
その結果は第５表および第２図に示すとおりである。
と血漿の混合物10mlをGibco Co.社から商業的に入手で
きる滅菌食塩水であるSelig−mann's Balanced Salt So
lution（SBSS）で1:1（容量比）希釈し、そして50ml遠
沈管中で実施例４に記載の多糖類・ナトリウムジアトリ
ゾエート混合物20mlに重層した。その遠沈管を約400×
ｇの遠心力に約25分間かけた。食塩水の多糖類・ナトリ
ウムジアトリゾエート混合物との間の界面にある細胞層
をピペツト処理により集収し、そして前述の滅菌食塩水
中で３回、400×ｇで10分間、200×ｇで10分間および20
0×ｇで10分間洗浄した。IL−２中で３日間インキユベ
ーシヨンした後、得られた細胞のLAK活性を測定した。
その結果は第５表および第２図に示すとおりである。
実施例 ５ リユーコフオレシスからの血液細胞と血漿の混合物15
4mlを用いて実施例４に記載の手順を実質的に繰り返し
た。分離中に混合物を約100×ｇの遠心力にかけた。IL
−２中で５日間インキユベーシヨンした後の得られた細
胞のLAK活性を測定した。結果は第５表および第３図に
示すとおりである。
4mlを用いて実施例４に記載の手順を実質的に繰り返し
た。分離中に混合物を約100×ｇの遠心力にかけた。IL
−２中で５日間インキユベーシヨンした後の得られた細
胞のLAK活性を測定した。結果は第５表および第３図に
示すとおりである。
比較実験 Ｂ 実施例５で用いたリユーコフオレシスからの血液細胞
と血漿の混合物10mlを用いて比較実験Ａに記載の手順を
実質的に繰り返した。IL−２中で５日間インキユベーシ
ヨンした後の、得られた細胞のLAK活性を測定した。結
果は第５表および第３図に示すとおりである。
と血漿の混合物10mlを用いて比較実験Ａに記載の手順を
実質的に繰り返した。IL−２中で５日間インキユベーシ
ヨンした後の、得られた細胞のLAK活性を測定した。結
果は第５表および第３図に示すとおりである。
実施例 ６ リユーコフオレシスからの血液細胞と血漿の混合物18
5mlを用いて実施例４に記載の手順を実質的に繰り返し
た。分離中に混合物を約100×ｇの遠心力にかけた。IL
−２中で４日間インキユベーシヨンした後の、得られた
細胞のLAK活性を測定した。結果は第５表および第４図
に示すとおりである。
5mlを用いて実施例４に記載の手順を実質的に繰り返し
た。分離中に混合物を約100×ｇの遠心力にかけた。IL
−２中で４日間インキユベーシヨンした後の、得られた
細胞のLAK活性を測定した。結果は第５表および第４図
に示すとおりである。
比較実験 Ｃ 実施例５に用いたリユーコフオレシスからの血液細胞
と血漿の混合物10mlを用いて比較実験Ａを実質的に繰り
返した。IL−２中で４日間インキベーシヨンした後の、
得られた細胞のLAK活性を測定した。結果は第５表およ
び第４図に示すとおりである。
と血漿の混合物10mlを用いて比較実験Ａを実質的に繰り
返した。IL−２中で４日間インキベーシヨンした後の、
得られた細胞のLAK活性を測定した。結果は第５表およ
び第４図に示すとおりである。
第１図は単核細胞を血液細胞混合物から分離するのに用
いられる装置を様式化して示した図である。 第２、３および４図は、血液細胞混合物から分離された
IL−２（インターロイキン−２）処理単核細胞の腫瘍細
胞に対する細胞毒性を示している。 1,3……フイード袋、２……シリンジ、４……遠心分離
チエンバー、６……集収袋、７……蠕動ポンプ、８……
遠心分離ローター。
いられる装置を様式化して示した図である。 第２、３および４図は、血液細胞混合物から分離された
IL−２（インターロイキン−２）処理単核細胞の腫瘍細
胞に対する細胞毒性を示している。 1,3……フイード袋、２……シリンジ、４……遠心分離
チエンバー、６……集収袋、７……蠕動ポンプ、８……
遠心分離ローター。
Claims (4)
- 【請求項１】血液細胞の混合物を遠心分離チエンバー内
に支持し、該チエンバーに遠心力をかけて、該血液細胞
を分離して成層させ、該チエンバーの外側遠心分離端か
ら、遠心力に抗して排出流体を該チエンバーに強制給送
し、それにより該血液細胞中の所望の細胞層を該混合物
から分離することとし、その際に、処理が閉鎖系によっ
てなされるとともに該排出流体は該所望の細胞層の密度
より高いかまたはそれに等しい密度を有するものであ
る、血液細胞を分離する方法。 - 【請求項２】所望の血液細胞が約１μｍ〜約0.25cmの直
径を有する特許請求の範囲第１項記載の方法。 - 【請求項３】所望の血液細胞が単核血液細胞である特許
請求の範囲第１項記載の方法。 - 【請求項４】排出流体が約1.06g/ml〜約1.08g/mlの密度
を有する特許請求の範囲第３項記載の方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US844959 | 1986-03-27 | ||
| US06/844,959 US4708710A (en) | 1986-03-27 | 1986-03-27 | Particle separation process |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS62237914A JPS62237914A (ja) | 1987-10-17 |
| JP2554329B2 true JP2554329B2 (ja) | 1996-11-13 |
Family
ID=25294059
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP62070531A Expired - Lifetime JP2554329B2 (ja) | 1986-03-27 | 1987-03-26 | 粒子の分離方法 |
Country Status (7)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4708710A (ja) |
| EP (1) | EP0239091B1 (ja) |
| JP (1) | JP2554329B2 (ja) |
| AT (1) | ATE77758T1 (ja) |
| CA (1) | CA1299551C (ja) |
| DE (1) | DE3780050T2 (ja) |
| ES (1) | ES2032768T3 (ja) |
Families Citing this family (22)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA2013021C (en) * | 1989-11-29 | 1995-05-09 | Richard Lewis Columbus | Blood collection device |
| DE4305346A1 (de) * | 1993-02-20 | 1994-08-25 | Kloeckner Humboldt Deutz Ag | Vorrichtung und Verfahren zur naßmechanischen Aufbereitung von Feststoffen |
| US5674173A (en) * | 1995-04-18 | 1997-10-07 | Cobe Laboratories, Inc. | Apparatus for separating particles |
| US6053856A (en) * | 1995-04-18 | 2000-04-25 | Cobe Laboratories | Tubing set apparatus and method for separation of fluid components |
| US6022306A (en) * | 1995-04-18 | 2000-02-08 | Cobe Laboratories, Inc. | Method and apparatus for collecting hyperconcentrated platelets |
| EP0824380B1 (en) * | 1995-04-18 | 2002-01-09 | Gambro, Inc., | Particle separation method |
| US5951877A (en) * | 1995-04-18 | 1999-09-14 | Cobe Laboratories, Inc. | Particle filter method |
| US5961842A (en) * | 1995-06-07 | 1999-10-05 | Baxter International Inc. | Systems and methods for collecting mononuclear cells employing control of packed red blood cell hematocrit |
| WO1997043045A1 (en) * | 1996-05-15 | 1997-11-20 | Cobe Laboratories, Inc. | Method and apparatus for reducing turbulence in fluid flow |
| US5792038A (en) * | 1996-05-15 | 1998-08-11 | Cobe Laboratories, Inc. | Centrifugal separation device for providing a substantially coriolis-free pathway |
| US5904645A (en) * | 1996-05-15 | 1999-05-18 | Cobe Laboratories | Apparatus for reducing turbulence in fluid flow |
| AUPO488697A0 (en) * | 1997-01-31 | 1997-02-20 | Australian Red Cross Society (Western Australian Division) | Method and means for separating blood |
| US5980760A (en) * | 1997-07-01 | 1999-11-09 | Baxter International Inc. | System and methods for harvesting mononuclear cells by recirculation of packed red blood cells |
| US6051146A (en) * | 1998-01-20 | 2000-04-18 | Cobe Laboratories, Inc. | Methods for separation of particles |
| JP3263666B2 (ja) * | 1998-07-24 | 2002-03-04 | 明 奥村 | 遠心ローター上の容器内の液体試料を該ローター上の他の容器内に移送する方法 |
| US6153113A (en) | 1999-02-22 | 2000-11-28 | Cobe Laboratories, Inc. | Method for using ligands in particle separation |
| US6334842B1 (en) | 1999-03-16 | 2002-01-01 | Gambro, Inc. | Centrifugal separation apparatus and method for separating fluid components |
| US6354986B1 (en) | 2000-02-16 | 2002-03-12 | Gambro, Inc. | Reverse-flow chamber purging during centrifugal separation |
| US7279107B2 (en) | 2002-04-16 | 2007-10-09 | Gambro, Inc. | Blood component processing system, apparatus, and method |
| WO2014127122A1 (en) | 2013-02-18 | 2014-08-21 | Terumo Bct, Inc. | System for blood separation with a separation chamber having an internal gravity valve |
| US12214038B2 (en) * | 2014-07-22 | 2025-02-04 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Compositions and methods for cancer immunotherapy |
| DE102017201439A1 (de) * | 2017-01-30 | 2018-08-02 | Fresenius Medical Care Deutschland Gmbh | Vorrichtung und Verfahren zum automatischen Entlüften und Befüllen eines Katheters |
Family Cites Families (16)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US3498454A (en) * | 1968-02-20 | 1970-03-03 | Polaroid Corp | Counter-current centrifugal device and use |
| GB1313753A (en) * | 1969-04-10 | 1973-04-18 | English Clays Lovering Pochin | Particle size analysis |
| US3825175A (en) * | 1973-06-06 | 1974-07-23 | Atomic Energy Commission | Centrifugal particle elutriator and method of use |
| US4098456A (en) * | 1977-03-29 | 1978-07-04 | Baxter Travenol Laboratories, Inc. | Centrifuge system having collapsible centrifuge bags |
| DE2918834A1 (de) * | 1979-05-10 | 1980-11-20 | Gerd Prof Dr Brunner | Biologische zellfraktionierung |
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| US4269718A (en) * | 1980-05-05 | 1981-05-26 | The Institutes Of Medical Sciences | Process and device for centrifugal separation of platelets |
| US4268393A (en) * | 1980-05-05 | 1981-05-19 | The Institutes Of Medical Sciences | Apparatus for centrifugal separation of platelet-rich plasma |
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| US4350283A (en) * | 1980-07-01 | 1982-09-21 | Beckman Instruments, Inc. | Centrifugal elutriator rotor |
| JPS5782753A (en) * | 1980-11-10 | 1982-05-24 | Hitachi Ltd | Method and device for analysis with automatic setting of reaction limit |
| US4322298A (en) * | 1981-06-01 | 1982-03-30 | Advanced Blood Component Technology, Inc. | Centrifugal cell separator, and method of use thereof |
| JPS5836631A (ja) * | 1981-08-27 | 1983-03-03 | Mochida Pharmaceut Co Ltd | 固相と液相との反応方法及び装置 |
| US4464167A (en) * | 1981-09-03 | 1984-08-07 | Haemonetics Corporation | Pheresis apparatus |
| US4416654A (en) * | 1981-09-03 | 1983-11-22 | Haemonetics Corporation | Pheresis apparatus |
| JPS58170558A (ja) * | 1982-04-01 | 1983-10-07 | Inoue Japax Res Inc | 固液分離装置 |
-
1986
- 1986-03-27 US US06/844,959 patent/US4708710A/en not_active Expired - Lifetime
-
1987
- 1987-03-24 CA CA000532804A patent/CA1299551C/en not_active Expired - Lifetime
- 1987-03-25 AT AT87104386T patent/ATE77758T1/de not_active IP Right Cessation
- 1987-03-25 EP EP87104386A patent/EP0239091B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1987-03-25 DE DE8787104386T patent/DE3780050T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1987-03-25 ES ES198787104386T patent/ES2032768T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1987-03-26 JP JP62070531A patent/JP2554329B2/ja not_active Expired - Lifetime
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| ES2032768T3 (es) | 1993-03-01 |
| EP0239091A3 (en) | 1988-01-20 |
| CA1299551C (en) | 1992-04-28 |
| ATE77758T1 (de) | 1992-07-15 |
| EP0239091B1 (en) | 1992-07-01 |
| DE3780050D1 (de) | 1992-08-06 |
| JPS62237914A (ja) | 1987-10-17 |
| EP0239091A2 (en) | 1987-09-30 |
| US4708710A (en) | 1987-11-24 |
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