JP2554528B2

JP2554528B2 - 副腎皮質刺激ホルモン分泌能検査薬

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Publication number: JP2554528B2
Application number: JP63234285A
Authority: JP
Inventors: 順一深田; 裕夫井村; 嘉勝平井
Original assignee: Otsuka Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Otsuka Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1988-09-19
Filing date: 1988-09-19
Publication date: 1996-11-13
Anticipated expiration: 2011-11-13
Also published as: EP0360226A2; US5217714A; EP0360226B1; DE68912250D1; DE68912250T2; EP0360226A3; JPH0283338A

Description

【発明の詳細な説明】本発明は副腎皮質刺激ホルモン（Adrenocorticotropi
c hormone;ACTH）の分泌能検査薬、より詳しくはヒトイ
ンターロイキン１β（IL−１β）誘導体を含有する上記
ACTH分泌能検査薬に関する。

従来技術とその課題副腎皮質より分泌されるステロイドホルモンは、電解
質バランスの保持や糖代謝の調節に関して重要な役割を
果している。この副腎皮質に働きかけ、そのグルココル
チコイド合成能や、ミネラルコルチコイド合成能を変化
させる因子として、副腎皮質ホルモン（ACTH）や、アン
ジオテンシンII、心房性ナトリウム利尿ペプチド等が知
られている。しかして、上記ACTHは副腎皮質におけるグ
ルココルチコイドの合成、分泌調節因子としては最も重
要なものであり、脳下垂体にあるACTH産生細胞により合
成、分泌され、その分泌は更に上位中枢である視床下部
で産生される副腎皮質刺激ホルモン放出ホルモン（Cort
icotropin−releasing hormone;CRH）によりなされてい
る。

このように、下垂体ホルモンの分泌は視床下部によっ
て調節されているため、下垂体前葉ホルモンの分泌異常
症にも、視床下部障害に基因するものと、下垂体自身に
原因があるものとがある。また器質性病変によるものの
他に、最近では機能性ホルモン分泌障害の存在も知られ
ている。

上記下垂体ホルモン分泌機能の検査法として、その機
能低下が疑われる場合と機能亢進が疑われる場合の二つ
に大別され、下垂体機能亢進症の場合は、一回の血中ホ
ルモンレベルの測定が多くの場合診断的価値を有してお
り、特に機能亢進の確認のための分泌抑制刺激試験の実
施は必要ではないが、機能低下が疑われる場合、患者の
下垂体ホルモンの血中レベルをそのまま測定する方法で
は、その測定値が正常人との間でかなり重なり合うた
め、測定価値が低く、一般にはホルモン分泌刺激試験を
行なって、これに対する反応からホルモン分泌能を検査
し、もし機能低下が証明されれば、次にその障害部位を
明らかにするべく検査を進める方法が採用されている。

ACTHの測定の場合、この分泌刺激試験には現在下垂体
に直接作用する放出促進因子としてのCRHを用いるもの
と、視床下部を介するもの、例えばメトピロン（Metyra
pone）、インシュリン等を用いるものとが知られてい
る。このうち、視床下部を介する刺激試験は１）視床下
部−下垂体−副腎と連なる一連のホルモン系全体の機能
状態を一度にチェックできるため、スクリーニング検査
として有用であり、また２）視床下部そのものに障害が
あることを確定診断する時に必須の刺激試験としても有
用であるが、現在一般に用いられている検査薬のうち、
メトピロンは急激な副腎皮質ホルモン合成阻害からショ
ック症状を呈する例が希に存在し、またインシュリン静
脈投与による低血糖誘発法はそのストレスの大きさから
高齢者や冠動脈不全患者等の一部の対象にはその実施が
ひかえられている。

尚、ACTHの分泌が障害されると二次性副腎不全をきた
し、尿中17−OHCS、血漿コーチゾルが低値となり、ACTH
連続負荷に対しては遅延反応が認められ、インスリン低
血糖、リシン−バソプレシン（LVP）に対する血漿ACTH
又はコーチゾールの反応、メトピロンに対する血漿ACT
H、11−デオキシコーチゾール（11−deoxy cortisol）
又は尿中17−OHCSの反応がいずれも不良となることが、
現在の内分泌学的検査により確かめられている。

一方、本出願人は従来よりヒトIL−１β及びその各種
誘導体につき、鋭意研究を重ねてきたが、その過程で、
ある種のヒトIL−１β誘導体が、その本来の生物活性で
あるリンパ球を活性化してインターロイキン２（IL−
２）等の産生や抗体の産生等を亢進させる作用、抗炎症
活性、放射線障害防止作用等とは全く異なって、上記下
垂体ホルモン、殊にACTHの分泌を刺激する能力を有する
事実を発見し、しかもこの刺激作用はメトピロンによる
副腎皮質ホルモン合成阻害やインシュリン投与時に見ら
れる低血糖を伴わず、従ってその利用によれば、殊に下
垂体機能低下症等の患者に対して、全く新しい観点から
下垂体ホルモンの分泌刺激を行なってその分泌能を検査
することができ、かくして新しいホルモン分泌能検査試
薬及び方法を確立した。

課題を解決するための手段即ち、本発明はヒトIL−１β誘導体を含有することを
特徴とするACTH分泌能検査薬に係わる。

本発明のACTH分泌能検査薬は、上記の通りヒトIL−１
β誘導体を有効成分とすることを必須の要件とする。該
ヒトIL−１β誘導体には、LAF（Lymphocyte Activating
Factor）活性を有する153個のアミノ酸配列を有するポ
リペプチド［天然型IL−１β;Proc.Natl.Acad.Sci.,Vo
l.81,7907−7911（1984）;Nature,Vol.315,641（198
5）;Nucleic Acid Research,Vol.13（16）5869（1985）
等参照］のアミノ酸配列の一部を改変させたアミノ酸配
列を有するポリペプチドが包含される。その代表的具体
例は、本出願人の先の出願［特開昭63−152398号公報参
照］に係わる各種誘導体を例示できる。それらの内でも
特に以下のものが好適である。

ヒトIL−１β［７−153］…天然型ヒトIL−１βの１
−６位アミノ酸配列を欠失させたアミノ酸配列を有する
ヒトIL−１β誘導体ヒトIL−１β［１−148］…天然型ヒトIL−１βの149
−153位アミノ酸配列を欠失させたアミノ酸配列を有す
るヒトIL−１β誘導体ヒトIL−１β［Gly⁴］…天然型ヒトIL−１βの４位ア
ミノ酸（Arg）をGlyに置換させたヒトIL−１β誘導体ヒトIL−１β［Leu⁹³］…天然型ヒトIL−１βの93位
アミノ酸（Lys）をLeuに置換させたヒトIL−１β誘導体ヒトIL−１β［des Arg⁹⁸］…天然型ヒトIL−１βの9
8位アミノ酸（Arg）を欠失させたヒトIL−１β誘導体上記各種ヒトIL−１β誘導体は、公知の遺伝子工学的
手法により製造、単離することができ、その具体的操作
等は前記特許公開公報に記載される通りである。

本発明の検査薬は、上記ヒトIL−１β誘導体を有効成
分とし、他の通常のこの種検査薬と同様のものとするこ
とができる。通常上記誘導体はこれを必要に応じて製剤
上の慣用成分等の添加剤と共に、適当な希釈剤により希
釈されて実用薬とされる。ここで用いられる添加剤等と
しては例えばヒトIL−１βの安定化に寄与するヒト血清
アルブミン（HSA）等のアルブミン類やシステイン、グ
リシン等のＬ−型アミノ酸等、更にグルコース、マンニ
トール、イノシトール、ショ糖、マルトース、デキスト
ラン等の糖類、イオン性及び非イオン性界面活性剤等を
例示できる。また希釈剤は通常注射用蒸留水であるが、
これは各種緩衝液、例えばクエン酸−リン酸ナトリウ
ム、クエン酸−クエン酸ナトリウム、酢酸−酢酸ナトリ
ウム、リン酸二ナトリウム−リン酸一ナトリウム、クエ
ン酸−ホウ酸等のpHを４〜８とするものであってもよ
い。

かくして得られるヒトIL−１β誘導体を含有する本発
明検査薬は、その製剤組成物形態に応じた適当な投与経
路、例えば注射剤形態の場合は、静脈内、筋肉内、皮
下、皮内、腹腔内投与等により投与される。製剤中の有
効成分の量及び該製剤の投与量は、その投与方法、投与
形態、使用目的、これを適用される患者等に応じて適宜
選択され、一定ではないが、通常有効成分を約0.00001
〜80重量％程度含有する製剤形態に調製して、この製剤
をこれに含有される有効成分量が一日成人一人当り約0.
01μｇ〜1mg程度となる範囲で投与するのが望ましい。
該投与は、一日１回である必要はなく、一日３〜４回に
分けることもできる。

本発明検査薬を用いたACTH分泌能検査法は、従来の下
垂体刺激試験と同様にして実施することができる。より
詳しくは、検査薬として上記方法により調整されたヒト
IL−１β［７−135］、ヒトIL−１β［１−148］、ヒト
IL−１β［Gly⁴］、ヒトIL−１β［Leu⁹³］、ヒトIL−
１β［des Arg⁹⁸］のうちのいずれかを、一人当たり約
0.01μｇ〜10mgになる範囲で、通常経静脈的に投与し、
投与前及び投与後120分又は240分まで、経時的に採血す
る。血液検体は、血漿又は血清とし、通常ラジオイムノ
アッセイ法により、ACTH、コーチゾル（副腎皮質グルコ
コルチコイドホルモン）又はCRH濃度を測定する。この
試験法における之等血中ホルモン濃度の変化を、健常人
のそれらと比較することによって、汎下垂体機能低下
症、シーハン病、アジソン病、ACTH単独欠損症、ステロ
イド長期投与後症候群、神経性食思不振症、視床下部症
候群、クッシング症候群等の診断に有利に実施できる。

上記本発明の検査薬を用いる検査法によれば、１）視床下部−下垂体−副腎皮質系の機能異常が一度の
検査で診断可能である、２）他の検査法の組合せによって、視床下部病変の確定
診断が可能である、３）好ましくない副作用は殆んど伴われない、殊に本発
明に用いるヒトIL−１β誘導体は、これを生体に投与し
ても発熱を誘起することなく、血中ACTH値の上昇を起こ
すことができる、４）従来の視床下部刺激法と異なるメカニズムで作用す
るため、新しい観点からの機能異常を検出できる、５）試験薬が、本来ヒト体内に存在するものの類似体で
あるため、対異物反応が少ない、等の各種の利点がある。

本発明によれば、以上のように脳下垂体機能の簡便で
安全な測定法を確立でき、また下垂体機能低下症と治療
法を提供することができる。

実施例以下、本発明を更に詳しく説明するための実施例を挙
げる。

実施例１ ACTH分泌能検査薬の調製 IL−１β［７−153］の生理活性食塩水（GIF活性とし
て１×10⁶単位/ml）に、ヒト血清アルブミン（HSA）を
0.5％となるように添加して、過（0.22μｍメンブラ
ンフィルター使用）後、これを無菌的に1mlずつバイア
ル瓶に分注して、凍結乾燥し、注射用製剤を調整した。

かくして得られた製剤は、これを用時注射用蒸留水1m
lに溶解して利用される。

実施例２薬理効果試験Ｉこの例は、本発明検査薬を用いてACTH分泌能検査を行
なったものである。

この試験に有効成分として用いたヒトIL−１β誘導体
は以下のものであり、之等はいずれも特開昭63−152398
号公報に記載されている。

ヒトIL−１β［７−153］…天然型ヒトIL−１βの１
−６位アミノ酸配列を欠失させたアミノ酸配列を有する
ヒトIL−１β誘導体ヒトIL−１β［１−148］…天然型ヒトIL−１βの149
−153位アミノ酸配列を欠失させたアミノ酸配列を有す
るヒトIL−１β誘導体ヒトIL−１β［Gly⁴］…天然型ヒトIL−１βの４位ア
ミノ酸（Arg）をGlyに置換させたヒトIL−１β誘導体ヒトIL−１β［Leu⁹³］…天然型ヒトIL−１βの93位
アミノ酸（Lys）をLeuに置換させたヒトIL−１β誘導体ヒトIL−１β［des Arg⁹⁸］…天然型ヒトIL−１βの9
8位アミノ酸（Arg）を欠失させたヒトIL−１β誘導体上記ヒトIL−１β誘導体は、之等をそれぞれウシ血清
アルブミン100μg/ml含有注射用生理食塩水［大塚製薬
工場社製］にて所定濃度に希釈して用いた。

ウイスター系雄ラット（体重300〜350g）を用い、ペ
ントバルビタール麻酔下に、右心房内へカテーテルを挿
入した後、24時間以上の回復期間をおいて実験を行なっ
た。投与実験には、非特異的ストレスを極力少なくする
ことを目的として作成された特殊ケージを用い、ラット
は実験前夜からこのケージ内に入れておいた〔Fukata
J.et al.,Neuroendocrinology,40,193−200（198
5）〕。

実験当日、ラット５匹を１群として、投与前採血を行
なった後、各ヒトIL−１β誘導体の各々１μｇを無麻酔
・無拘束下で静脈内投与した。採血は投与15分、30分、
60分及び120分後の各４回行ない、１回の採血量は0.6ml
とした。

採血した各サンプルに少量のペパリンを加えた後、４
℃にて血漿分離を行ない、血球成分は採取した血漿と同
量の生理食塩水に再浮遊させ、次回の採血後に静脈に戻
した。

血中ACTH濃度は珪酸法〔Nakao,K.et al.,J.Clin.Inve
st.,62,1395−1398（1978）〕にて抽出した後、NIAMDD
National Pituitary Agencyより提供された抗ACTH抗血
清（ウエスト）を用いて測定した。

この系におけるACTH抽出率は80％、感度は30pg/ml、I
nterassay及びIntraassay C.V.はそれぞれ10％以下であ
った。

統計処理には分散分析を用い、危険率５％で有意と判
定した。

血中ACTH濃度の各時間における変化を下記第１表に
（ｍ±SE、pg/ml）にて示す。

上記の通り、全ての試験群においてヒトIL−１β誘導
体投与後15〜30分以内に最大値となる血中ACTH濃度の有
意な上昇が認められた。一方、それぞれの誘導体の溶媒
として用いたウシ血清アルブミン100μg/ml含有注射用
生理食塩水のみの投与では、血中ACTH濃度には変化が見
られなかった。

また、投与前値及び投与後の最大血中濃度には各群間
で有意差は認められなかった。

実施例３薬理効果試験II この試験は上記試験Ｉにおいて用いた各ヒトIL−１β
誘導体のGIF活性（50％最大U/mg）及びLAF活性（50％最
大U/mg）を調べると共に、之等各誘導体の発熱誘起作用
を調べたものである。

上記GIF活性及びLAF活性は次の方法により測定した。

（１）GIF活性の測定特開昭63−152398号公報記載の方法に従った。

（２）LAF活性の測定オッペンハイム（J.J.Oppenheim et al）の方法〔J.I
mmunol.,116,1466（1976）〕に従い、C3H/He J系マウス
の胸腺細胞を利用して測定したLAF活性により表示し
た。

また、上記発熱誘起作用はSDラット（雄性、160〜220
g）に、ラット血清アルブミンを200μg/mlの割合で含む
PBS（−）に各誘導体を所定量溶解させた溶液を、皮下
に投与し、経時的に各ラットの体温を測定し、その体温
上昇が最高になる６時間後に下記基準により、発熱誘起
力を評価したものである。

〈発熱誘起力評価〉 − ……０≦Δ℃＜１＋ ……１≦Δ℃＜２＋＋……２≦Δ℃＜３得られた結果を下記第２表に示す。

上記第２表及び先の第１表より以下のことが判る。即
ち、本発明検査薬の有効成分として用いるヒトIL−１β
誘導体は、発熱誘起作用が非常に減弱（天然型ヒトIL−
１βの1/1000〜1/10000）とされていながら（第２表参
照）、ACTH分泌能に優れた（天然型ヒトIL−１βと同程
度）性質を有している（第１表参照）。このことは、上
記ヒトIL−１β誘導体の脳下垂体組織に作用してCRHやA
CTHを産生、分泌させる作用は、IL−１分子上の発熱を
誘起させる部位とは異なる部位に活性発現単位があると
考えられる。従って、上記ヒトIL−１β誘導体は脳下垂
体の機能検査や下垂体機能の賦活に簡便且つ安全に応用
できることが明らかである。

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】ヒトインターロイキン１β誘導体を含有す
ることを特徴とする副腎皮質刺激ホルモン分泌能検査
薬。