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JP2556869B2 - 触媒的性質を示す抗体結合サイトを有する分子 - Google Patents
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JP2556869B2 - 触媒的性質を示す抗体結合サイトを有する分子 - Google Patents

触媒的性質を示す抗体結合サイトを有する分子

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Description

【発明の詳細な説明】 本出願は、1984年９月７日に出願した米国特許願第64
8,406号、現在の米国特許第4,659,567号の部分継続出願
である、1986年９月17日に出願した米国特許願第908,31
3号の部分継続出願であり、前記二つの特許願の開示内
容は本明細書中において参考にしている。
本発明は抗体、抗原及び免疫原に関するが、特に結合
することによりアミド又はエステル加水分解遷移状態の
四面体炭素原子を安定化し、触媒の性質を示すエピトー
プを含む分子に関する。
リガンドと受容体の結合は、生物学上の系において多
くの重大な役割を果たす。そのような現象の例には、オ
キシヘモグロビンを形成する酸素分子のデオキシヘモグ
ロビンとの結合、及びたんぱく質及びトリプシンのよう
なプロテアーゼ間のように使用する基質の酵素との結合
がある。生物学上の結合現象の更に別の例には、抗原と
抗体との結合、及び補体成分C3のいわゆるCR1受容体と
の結合がある。
多くの薬剤及びその他の治療剤も結合現象に依存する
とされている。たとえば、モルヒネのような鎮静剤は脳
内の特異な受容体と結合すると報告されている。鎮静剤
の作用物質及び拮抗物質は、モルヒネのような薬剤とそ
れらの結合サイトに関して競うことであると報告されて
いる。
モルヒネ及びその誘導体のような人造薬剤でありリガ
ンド、及びエンドルフィン及びホルモンのような生物学
上の系内に天然に存在するリガンドは生物学上の系内に
天然に存在する受容体と結合し、そこで一緒に処理され
るであろう。そのような結合は、特にトリプシンやパパ
インのような酵素によりたんぱく質が加水分割されて構
成ポリペプチドになったり、脂肪が分解されてグリセリ
ンと３つのカルボン酸になったりするようなアミド及び
エステル結合の加水分解を含む多くの生物学の現象とな
る。
免疫学上の結合は、経験的に結合相互作用を触媒プロ
セスへ変換するように使用しうる。ジェンクス・ダブリ
ュー・ピー（Jencks,W.P.）による（Catalysis in Chem
istry Enzymology 第288頁（1969年ニューヨークのマグ
ローヒル（Mcgraw−Hill））参照。しかしながら、反応
性基を抗体の結合サイトへ導入する試みは成功していな
い。ロイヤー・ジー・ピー（Royer,G.P.）によるAdv.Ca
tal、第29巻197頁（1980年）参照。ある種の単クローン
抗体は、抗体により認識されている同種のハプテン上の
活性化されたエステル付加物と反応する求核的残基を含
むと報告されている。コーン（Kohn）らによるFEBS Let
t.第111巻第427頁（1980年）、コーンらによるBiochem.
Biophys.Acta第629巻第339頁（1980年）及びコーンらに
よるFEBS Lett.第100巻第137頁（1979年）参照。これら
の報文では、求核試薬のアシル化速度がハプテンフラグ
メントの結合サイトの近接により加速されると推測され
ている。
これらの概念は興味深いけれども、酵素に必須の結合
エネルギー利用の気候が提出されていないので厳密には
限界がある〔ダブリュー・ピー・ジェンクスによりAdv.
Enzymol.第43巻第219頁（1975年）参照〕。それはさて
おき、強い結合により安定な状態となる場合には、錯体
の遅い解離速度が触媒反応を妨げるであろう。これらの
欠陥は所望の抗体を誘い出すハプテンとして遷移状態の
アナログを用いることにより償いうる。このハプテン
（本明細書においては“アナログ配位子”と呼ぶ）は触
媒系において阻害剤の役割を仮定しうる。
アミド及びエステル結合の加水分解は、現在容認され
ている化学理論によれば水性媒体中カルボニル炭素原子
における反応よりはじまり、（ａ）アミド又はエステル
の酸部分の炭素原子、（ｂ）２つの酸素原子（一方はカ
ルボニル基からであり、他方はヒドロキシルイオン又は
媒体の水分子からである）、及び（ｃ）エステルのアル
コール部分の酸素原子又はアミドのアミン部分の窒素原
子に結合している四面体の炭素原子を含む遷移状態を形
成すると考えられている。そのような反応の遷移状態
は、定義により単離しうる中間体と比べて単離できない
有効な頭で考えた概念である。
前述の加水分解の遷移状態は単離でないけれども、多
くの科学文献において論じられている。そのうちのいく
つかについて後述する。
前述のアミド及びエステルの加水分解の遷移状態は十
分理解されているとされているが、たんぱく質のような
特定のアミド、又は脂肪のようなエステルがそのような
遷移状態を経て反応する受容体結合サイトのトポロジー
のパラメータ、たとえば寸法、形状及び電荷は十分には
理解されていない。それ故、複数の結合サイトのトポロ
ジーが公知で、そのようなサイトにおいて結合する配位
子の相互作用を検出することができれば有利であろう。
不幸なことに、生物学上の加水分解における受容体結合
サイトのトポロジーは、Ｘ線結晶構造が決定されている
比較的少数の酵素以外は一般的には知られていない。
この結合サイトのトポロジーの知識の欠如は、いくぶ
んかは受容体の多くの結合サイトの細胞内の位置に関す
る知識さえ欠如しているために生ずる。更に、位置が判
明している受容体の結合サイトについては、結合サイト
の科学的な正体、たとえばたんぱく質や炭水化物の組成
が一般的には知られていない。従って、研究者は一般的
には受容体結合サイトのトポロジー的要求営を理解しよ
うとすること、従って要求を満たしうる治療剤を案出し
ようとすることが妨げられる。
従って研究者は治療剤が有用であるか否かを確認する
ためには動物又は細胞培養検出において治療剤を選別し
なければならない。そのような方法は有用ではあるが、
高価であり時間がかかる。
酵素のような加水分解受容体のトポロジー及び化学的
反応性が公知である場合でも、加水分解プロテアーゼの
ような酵素は典型的には基質、すなわちポリペプチド鎖
を特定アミノ酸残基に隣接して分解する。分解はたんぱ
く質のポリペプチド鎖内で数回生ずる。そのような比較
的ランダムな分解はたんぱく質のポリペプチドマップを
得るには有用であるが、特定のアミノ酸残基シークエン
スの製造が望まれる場合には比較的ランダムな分解は有
用ではない。
たとえば、現代の遺伝学的工業技術はlac Zの遺伝子
のような仲介物遺伝子の転写生成物に融合した望ましい
たんぱく質又はポリペプチドを含む融合たんぱく質の調
製に有用である。しかしながら、そのような融合たんぱ
く質の使用は、仲介物遺伝子生成物のフラグメントの存
在により妨げられている。従って、そのような融合生成
物を望ましい融合ポリペプチド又はたんぱく質部分と望
ましくないそれらに分解するようなたんぱく質分解酵素
様の分子を開発できたら有利であろう。
近年、ラーナー（Lerner）、トラモンタノ（Tramonta
no）及びジャンダ（Janda）はエステルを触媒的に加水
分解する単クローン抗体を報告した〔Science第234巻第
1566頁（1986年）〕。トラモンタノ及びラーナーはまた
米国特許第4,656,567号においてもエステルを加水分解
するのに単クローン抗体を使用することについて記載し
ている。ポラック（Pollack）、ジャコブズ（Jacobs）
及びシュルツ（Schultz）はカーボネートの加水分解を
触媒するMOPC167と命名された〔レオン（Leon）らによ
るBiochem.第10巻第1424頁（1971年）〕骨髄腫たんぱく
質を報告した〔Science第234巻第1570頁（19863
年）〕。
ラーナー及びトラモンタノによる２つの開示において
は、カルボン酸エステル又はカーボネートエステルの四
面体加水分解遷移状態の安定なアナログを表わすように
合成されたホスホネート対して抗体を産生させた。ポラ
ックらが主として考察した抗体は、構造的に加水分解さ
れたカーボネートのアナログに類似したホスホネートに
たまた結合した骨髄腫たんぱく質であった。従って、ラ
ーナー及びトラモンタノらの研究においては、加水分解
される基質が予め選択されており、所望の生成物と同様
に免疫生を与えるアナログ及び加水分解抗体が合成され
た。ポラックらは骨髄腫たんぱく質の特異性を知ってか
ら加水分解される基質を分子設計した。ポラックらはま
たラーナーらのそれに関する概念と同様なカーボネート
の加水分解用の支持された触媒抗体及びアナログ支持体
系の存在を報告した（前記）。この系に関する検出はジ
ャコブズらによるJ.Am.Chem.Soc.第109巻第2174頁（198
7年）においても報告されている。
発行された特許願WO85/02414号においては、触媒とし
て抗体を使用する可能性が考察され、ｏ−ニトロフェニ
ル−β−Ｄ−ガラクトシドの加水分解における多クロー
ン性血清の使用に関するデータが提供されている。この
出願において有用な抗体は、反応体、反応中間体より反
応体、生成物又は反応中間体のアナログへ誘導しうると
記載されている。“アナログ”という用語は、異性体、
同族体、又は化学構造が反応体と似ているその多の化合
物を含むと定義されており、アナログに高められた抗体
は反応体との免疫学的反応に関与するが必ずしもアナロ
グの反応を触媒しない。
この明細書に提供されたデータは、基質（反応体）ガ
ラクトシドの分解が比較的濃厚な抗体配合物（1:10及び
1:20希釈度）を用いると18時間にわたっておこるという
ことのみを示す。触媒反応が主張されているけれども、
主張された触媒抵抗の変化が示されず、分解された基質
がガラクトシドの百分率も示されていないので触媒活性
は示されていない。この出願は、研究されている基質の
濃度（未指定）における吸光度の線形性を仮定して、多
クローン性抗体の約10倍の基質をβ−Ｄ−ガラクトシダ
ーゼが分解することを示した。
この出願に提供されたデータから、使用した抗体配合
物のリシン残基の末端アミノ基によりｏ−ニトロフェニ
ル基の求核置換が生ずることが可能である。従って、観
察された吸光度はε−アミノリシニルｏ−ニトロフェニ
ルアニリンの形成、又はε−アミノリシニルガラクトシ
ド及びｏ−ニトロフェノールの形成によるものであり、
それらの反応はいずれも、抗体が変化するよりむしろ消
費されたことから触媒反応ではないであろう。
本発明は、予め選択した反応体リガンドのカルボン酸
アミド又はエステル結合を触媒的に加水分解しうる抗体
結合サイト又はイディオタイプを含むポリアミドを含む
受容体分子に関する。抗体結合サイトは、（ａ）予め選
択したカルボン酸アミド又はエステル結合を踏む反応体
リガンド、及び（ｂ）予め選択した反応体リガンドのカ
ルボン酸アミド又はエステル結合のカルボニル炭素原子
の位置に類似した位置に燐原子のような四面体結合原子
を含む反応体リガンドに類似したリガンドと（免疫反応
して）結合する。そのように結合している反応体リガン
ドの加水分解遷移状態は、（ａ）エステル又はアミドの
酸部分のα−炭素原子、（ｂ）２つの酸素原子、及び
（ｃ）エステルの酸素原子又はアミドの窒素原子と結合
している四面体炭素原子を含む。
反応体リガンドの加水分解遷移状態に高められたイデ
ィオタイプを含む分子は、リガンドの加水分解遷移状態
のアナログを含むアナログリガンド分子（好ましくはた
んぱく質キャリヤーと結合して共役を形成）を用いて免
疫性を与えることにより産生するか誘導される。免疫生
を与えるアナログリガンド加水分解遷移状態分子は燐の
ような四面体に結合した中心原子を含み、それは（ａ）
類似したリガンドアミド又はエステルの酸部分の炭素原
子（酸部分のα−炭素）、（ｂ）２つの酸素原子及び
（ｃ）第三の酸素原式又は窒素原子（第三の酸素原子又
は窒素原子はリガンドの類似したエステル又はアミドの
α−炭素に結合している）に直接結合している。
アナログリガンド分子の燐原子のような四面体の中心
原子に直接結合している前記（ａ）の酸部分のα−炭素
原子は、少くとも５原子、更に好ましくは少くとも約15
原子を含み、前記（ｃ）の第三の酸素又は窒素原子のよ
うな置換フェニル基を含む連鎖中に含まれる。中心原子
に直接結合している前記（ｂ）の２つの酸素原子のう
ち、一方の酸素原子は（ｉ）オキソ基の形で中心原子と
二重結合しているか、（ii）ヒドロキシル基の一部であ
るか、（iii）C1〜C4低級アルキル基を含むアルコキシ
基の酸素である。中原子に結合している第二の酸素原子
は、中心原子と一重結合しており、−OR2基（但し、式
中のR2は水素（Ｈ）又はC1〜C4の低級アルキル基であ
る）である。アナログリガンド分子の中心原子に結合し
ている前記（ｃ）の第四の原子は、リガンドの類似した
エステル又はアミド部分のエステルのアルコール酸素原
子又はアミン窒素原子である。第四の原子は少くとも５
個、更に好ましくは少くとも15個の原子を含む連鎖の一
部であり、連鎖の残りはR3を構成する。
四面体状に結合した中心原子は珪素でもよいが、好ま
しくはアナログリガンドが四面体炭素遷移状態に対応す
る燐のまわりに置換基が配置した有機燐化合物であるよ
うに燐である。イオン加状態のホスホネート−塩基酸は
またカルボニル中心における求核攻撃において発生する
電荷をシミュレートしている。更に、酵素的ペプチド加
水分解のホスホンアミデート及びホスホルアミデート阻
害剤が遷移状態の擬態として記載された。ギャラーディ
（Galardy）らによるBiochemistry 第22巻第1990頁（1
983年）；バートレット（Bartlett）らによるBiochemis
try 第22巻第4618頁（19836年）；トルセット（Thorse
tt）らによるProc.Natl.Acad.Sci.USA 第79巻第2176頁
（1982年）；ジャコブセン（Jacobsen）らによるJ.Am.C
hem.Soc.第103巻第654頁（1981年）；カム（Kam）らに
よるBiochemistry 第18巻第3032頁（1979年）及びウェ
ーバー（Weaver）らによるJ.Mol.Biol.第114巻第119頁
（1977年）参照。
本発明の一実施例においては、カルボン酸エステルの
加水分解における遷移状態アナログとして機能するモノ
アリールホスホネートエステルが合成され、特異性単ク
ローン抗体を製造するためのアナログリガンドとして使
用された。ある種のこれらの抗体は特定のアリールカル
ボン酸エステルと反応して螢光アルコールを放出する。
反応は化学量論的であるように見えるが、活性はアルカ
リ条件下又はヒドロキシルアミンのような求核試薬で処
理することにより再生するので、触媒的であると言及し
うる。
ある種の代表的な抗体（受容体）はホスホネートアナ
ログリガンドにも同様に配列しているｐ−トリフロオロ
アセトアミド置換基を含むカルボン酸エステルとのみ反
応する。この位置にアセトアミド基を有する類似したカ
ルボン酸エステルは基質として機能しない。これらの受
容体について飽和動力学を観察し、低pH値における動力
学パラメータが本明細書において報告されている。初期
速度はpH8以上では更に速い反応となる。ホスホネート
アナログリガンドは反応の競争阻害剤である（ki＝35n
M）。一方エステル加水分解のカルボキシレート生成物
はあまり有効でない阻害剤である（Ki＝7000nM）。抗体
たんぱく質の側鎖基の化学的変性により、リシのアシル
化又はチロシンのニトロ化における活性の部分的な低
下、及びヒスチジンの変性にのける活性の劇的な低下が
示された。
その他の代表的な受容体は、前述の反応体リガンド双
方の加水分解を触媒する。後者の受容体のうち、反応体
リガンド特異性は触媒的加水分解を提供しつつ相対的に
変化しうる。
結果を、抗体結合サイトのアミノ酸残基が求核及び／
又は一般的な塩基触媒反応に関与する機構により考察し
た。本発明のいくつかの代表的な抗体の性質は、触媒的
加水分解の機構が、脱アシル化工程が律速段階である酵
素的アシル交換反応の例であることを示唆し、得られた
結果は酵素的機能が免疫学的特異性から誘導しうること
を示す。
従って、本発明は広義には反応体リガンド及び反応体
リガンドの加水分解遷移状態のアナログを含むアナログ
リガンドに関することが認められる。それらの分子は、
アナログリガンドが燐のような炭素でない中心原子を含
むのに対し、反応体リガンドはアミド又はエステルのカ
ルボニル基を含む点で異なる。反応体リガンド及びアナ
ログリガンドはまた、アナログリガンドにより模倣され
た遷移状態が単離できないのに対し、アナログリガンド
はハプテンとし使用される十分な安定性を有しなければ
ならないので中心原子に結合した２つの酸素原子（ｂ）
の置換反応が異なる。更に、抗体結合サイトは鋭い特異
性をを示しうるけれども、反応体リガンドの構造は触媒
的加水分解を保持しつつ変化しうる。
本明細書に記載されている研究においては、ホスホネ
ートモノアリールアミド及びエステルは、好ましくは単
クローンであり、アリールカルボン酸エステラーゼであ
る抗体を生ずる遷移状態のアナログとして機能する。要
するにこれらの抗体は、機能的には真の酵素としてエス
テルを加水分解し、古典的には抗体として抗原と結合す
る固有の結合エネルギーを表わす。
加水分解遷移状態のアナログを含む代表的な免疫性を
与えるアナログリガンド分子は構造式： で表わされる。但し、式中の ＸはＯ又はNHであり、 R1は であり、 （但し、式中のR9はCF3又は である。） R2はＨ又はC1〜C4の低級アルキルであり、R3は 又は であり、 （但し、式中のR4はＨ又は であり、R5は であり、ｎは１乃至８の整数である。） アナログリガンド加水分解遷移状態分子は反応性リガ
ンドではないがそれ自体リガンドであり、それも本発明
に関する。それらのリガンド分子は比較的分子の寸法が
小さいので、受容体分子の製造を誘導するために免疫原
として使用する場合、あるいは阻害剤分子として単独に
使用する場合には典型的には大きなキャリヤー分子に結
合させる。そのような比較的小さな分子は通常ハプテン
と呼ばれる。これらのアナログリガンド分子はまた典型
的には、反応性メルカプタン、スクシンイミドあるいは
免疫原として使用するためにハプテンアナログリガンド
分子をキャリヤーに結合させる手段を提供するその他の
基のような結合原子又は基を含有する。
構造的に前述のアナログリガンド分子に対応する代表
的な反応体リガンド分子は以下の構造式： で表わされる。但し、式中の ＸはＯであり、 R7−は−CH3又は であり、 （但し、式中のR9はCH3又はCF3である。） R8−は である。
（但し、式中のR4、R5及びｎは前述のとおりであり、R
10はＨ又はNHCOR11であり、式中のR11はC1〜C6の低級ア
ルキル又は、ハロ又はカルボキシアルキルのような置換
C1〜C6低級アルキルである。） 本発明の抗体結合サイトを含む分子はそれ自体受容体
であり、抗体結合サイトを含む分子（受容体）と、同様
なあるいは同一のエピトープ領域を含む異なる構造物の
リガンドとの巻に形成される受容体−リガンド錯体の分
子内反応性パターンの研究により抗体−ハプテン相互作
用の立体配置の選択に関する情報を提供する。
特定のアミド又はエステルの加水分解遷移状態に結合
する多クローン性受容体分子の調製法にも関する。本明
細書においては、前述の加水分解遷移状態アナログを含
むハプテンアナログリガンド分子が免疫学的共役として
キャリヤーに結合して提供される。このようにして提供
される共役を、生理学的に許容しうる希釈剤に溶解又は
分散させ接種材料を形成する。接種材料を、ハプテンア
ナログ配位子に抗体を誘導するのに十分な量だけ哺乳動
物のホストに注射することにより導入する。そのように
して誘導された抗体が得られる免疫性を与えるハプテン
アナログリガンドと免疫反応する得られた抗体を次いで
回収する。
特に好ましい実施において単クローン抗体を調製す
る。本明細書においては、前述の免疫性を与える技術を
用い、得られた抗体を、免疫性を与えるハプテンリガン
ドアナログと（免疫反応するために）結合する能力につ
いて分析する。免疫性を与えるハプテンアナログリガン
ドと抗体が結合している動物の脾臓から得られる細胞の
ような免疫グロブリンを製造する細胞を回収し、ハイブ
リドーマ細胞を形成する骨髄腫細胞と融合させる。ハイ
ブドーマ細胞は培養媒体中で生長させ、生長しているハ
イブリドーマ細胞の上澄み媒体を、免疫性を与えるハプ
テンアナログリガンドと結合している抗体の存在につい
て分析する。次いでそのような結合抗体を上澄み液が含
むハイブリドーマ細胞を、培養媒体上澄み液から、ある
いはハイブリドーマが導入されたホスト哺乳動物の腹水
から所望の単クローン抗体を調製するために増殖させ
る。
前述の多クローン性又は単クローン抗体は本発明の受
容体として使用しうる。あるいは、抗体のいわゆるFc又
はFc′部分を、酵素分解により、それぞれFab又はＦ（a
b′）２抗体部分のような免疫性を与えるハプテンアナ
ログリガンドと結合している抗体結合サイト（イディオ
タイプを含むポリアミド）を得ることにより除去しう
る。
多クローン性、単クローン及びイディオタイプを含む
ポリアミド受容体はまたアミド又はエステルリガンドの
加水分解遷移状態と結合する。そのような結合が典型的
には反応体リガンドを触媒的に加水分解する。
本発明はいくつかの利益及び利点を提供する。利益の
一は、結合サイトのトポロジー的要求が研究される特定
のリガンドにあっている受容体の調製である。
本発明の別の利益は、所定のサイトにおいてアミド又
はエステルリガンドを加水分解し、かつ触媒的な性質示
す受容体の調製である。
本発明の利点は、調製しうる受容体の特異性のために
ポリペプチドやたんぱく質のような複数の異なる加水分
解性結合を含むリガンドを予め選択した特定の加水分解
性結合において加水分解しうるということである。
本発明の別の利点は、特定の予め選択したリガンドの
加水分解遷移状態と結合し、触媒的性質を示すためにそ
のようなリガンドの触媒的加水分解反応を研究する手段
を提供する受容体の提供である。
本発明の更に別の利益及び利点が以下の開示から当業
者には明らかとなろう。
この開示の一部を構成する添付図面のうち、第1A図は
金属ペプチダーゼの遷移状態について提案された構造を
示す。部分的に加水分解したアミドの金属への二座配位
が亜鉛ペプチダーゼによるペプチド分解の機構において
生ずると提案された相互作用を安定化する一モデルであ
る。示されたモデルは、亜鉛イオンが熱分解において五
配位になることによりカルボニル結合を分極とすると同
時に、求核水分子を放出することを示唆する近年の証拠
により支持されている。モンジンゴ（Monzingo）らによ
るBiochemistry第23巻第5724頁（1984年）及びハンガウ
ァー（Hongauer）らによるBiochemistry第23巻第5730頁
（1984年）。
第1B図は、示されたモデルによる遷移状態の立体配置
をシミュレートしたホスホンアミデートアナログと金属
酵素との相互作用を示す。
第２図は、エステル分解の性質を有する単クローン抗
体の調製及び分析に使用するアナログリガンド及びリガ
ンドを示す。置換基Ｒ及びＲ′の正体は以下のとおりで
ある。
化合物１、３及び7:R＝NHCOCF3、 Ｒ′＝NHCOCH3、 化合物２及び4:R＝NHCOCF3 Ｒ′＝NHCO（CH2）4COON（COCH2）２、 化合物8:R＝NHCOCF3、Ｒ′＝NHCO（CH2）2COOH、 化合物9:R、Ｒ′＝NHCOCH3、 化合物10:R＝NHCOCF3、Ｒ′＝Ｈ、 化合物11:R＝NHCOCH3、Ｒ′＝NHCOCF3。
第３図は、第１表に記載した条件（pH8.0及び23℃に
おける50mM燐酸塩緩衝液）下HPLCにより決定されたカル
ボン酸エステル（化合物７）の加水分解速度を示す。
（▲）無触媒（バックグラウンド）の加水分解速度。
（□）0.5μモルの非特定単クローンIgGの効果。
（■）0.1μモルのハイブリドーマP3 6D4からの抗化合
物４単クローン抗体。重ね合わせた曲線は、データの点
に適合する理論的な指数減衰を表わす。
第４図は、ハイブリドーマP3 6D4からの抗化合物４
単クローン抗体による化合物７の加水分解に関するライ
ンウィーバー・バークのプロットを示す。第２表に記載
した反応の最初の直線部分の初期速度を測定することに
より分光測光で速度を決定した。基質濃度は初期平衡中
に消費される量について補正した。（■）阻害剤不在
下。
（▲）50nMのホスホネート（化合物３）で阻害。
（◆）100nMのホスホネート（化合物３）で阻害。
第５図は、抗化合物４単クローン抗体と異なるカルボ
ン酸エステル（化合物５及び化合物７）と反応において
観察された相違する化学を説明する提案されたスキーム
を示す。結合サイトのヒスチジン残基は、四面体の中間
体の形成及び破壊中に求核的（上の経路）又は一般的な
塩基（下の経路）触媒として作用すると仮定されてい
る。良好な脱離基を有するエステルは、律速段階である
中間体の形成が容易であるため上の経路により反応す
る。不十分な脱離基を有するエステルの場合には、律速
段階である中間体の破壊が、一般的な塩基触媒反応であ
る下の経路の類似する段階に比べて触媒されないのでこ
の上の経路は妨げられる。
本発明は、エステル又はアミドの加水分解の反応中の
遷移状態の形成を凝態する反応態リガンドのアナログに
より誘導された抗体及びイディオタイプを含むポリアミ
ド（抗体結合サイト又はパラトープ）部分である、集合
的に受容体と呼ぶ分子に関する。受容体分子（抗体及び
イディオタイプを含むポリアミド）はアナログリガンド
及び反応体リガンドと結合し、反応体リガンドの予め選
択した部分の加水分解遷移状態を安定化すると考えら
れ、それにより反応体リガンドに関して触媒的性質を示
す。
本明細書に記載されている研究は、各々が一種以上の
反応体リガンドを触媒的に加水分解しうる12種の単クロ
ーン受容体分子について考察する。これらの受容体分子
は異なるアナログリガンドを用いた免疫処置により誘導
された。従って、構造が記載されているアナログリガン
ドに対応する反応体リガンドの加水分解に抗体触媒を調
製して用いる本発明の大要を示す。
抗体及び酵素は、共に機能が特異な目的分子との結合
能力に依存するたんぱく質である。非触媒錯体が抗体−
抗原結合の通常の結果であるのに対し、酵素反応におけ
る酵素の基質への結合は典型的には化学的触媒反応とな
る点で酵素反応は免疫反応とは異なる。
酵素は、たんぱく質と結合して加水分解反応の遷移状
態を安定化することによりたんぱく質の加水分解を触媒
するとされている。一般的には、酵素反応の速度は、反
応の遷移状態を安定化する、すなわち遷移状態の自由エ
ネルギー、従って反応の活性化自由エネルギーを低下さ
せる酵素の能力のために非酵素反応の速度に比べて増大
されている〔ジェンクス・ダブリュー・ピーによるAdv.
Enzymology 第43巻第219頁（1975年）及びポーリング・
エル（Pauling,L.）によるAmer.Scientist 第36巻第58
頁（1948年）〕。この理論は、推定される遷移状態をモ
デル化すると考えられる物質が競争阻害剤として酵素に
しばしば強く結合しているという観察から支持される。
ラインハード・ジー（Leinhard,G.）によるScience 第1
8巻第149頁（1973年）及びウルフェンデン・アール（Wo
lfenden,R.）によるAcc.Chem、Res.第５巻第10頁（1972
年）。更に、酵素は対応する基質又は生成物と結合する
よりずっと強く反応体の遷移状態配置と結合することに
より反応の自由エネルギーの低下を伴うと考えられてい
る。
このことは、酵素の固有結合エネルギーが、基質又は
生成物の結合から測定しうる値よりずっと大きいことを
意味する。本質に、酵素の結合エネルギーは化学反応を
行うのに用いられる〔ジェンクス・ダブリュー・ピーに
よるXVII Internaional Solvay Conference（1983年11
月）〕。
遷移状態の適するアナログと最適結合するように調製
された受容体が触媒として機能するであろうという転換
命題がある。この結果の論証が酵素の機能と受容体の構
造との関係を完成させ、人造酵素の設計の有用な方法を
提供する。
本明細書に記載されている免疫学的加水分解の背後に
ある基体的な考えは、選択的に結合することにより、特
定の反応体リガンドとの結合時にアミド又はエステル結
合の加水分解の遷移状態を安定化するという所定の特異
性を有する抗体の調製にアナログリガンドを使用するこ
とに関する。アナログリガンドは、関連する基質と結合
し、その加水分解を安定化する能力を有する抗体の調製
を誘導する加水分解における高エネルギー遷移状態のコ
ンホメーションを擬態する。
そのような選択的な結合及び安定化の結果、加水分解
反応の活性化エネルギーは低下し、触媒反応の基準に合
格する。この性質を示す抗体は、結合の加水分解を受け
る基質反応体リガンドの結合特性に似るように化学的に
変性された合成アナログを用いた免疫処置、すなわち、
特定反応の遷移状態アナログを用いた免疫処置より得る
ことができる。
抗体が結合反応体リガンドのエステル又はアミド結合
を加水分解する機構は、“誘導適合”モデルにより考え
ることができる。ゆるく結合した基質は変形したり転移
したりして抗体の結合配置に適合するので、再編制によ
り結合が加水分解するような所定のアミド又はエステル
結合を化学的に再編制することにより応力を除去しう
る。
“受容体”という用語は、本明細書においては、反応
体リガンド、阻害剤リガンド、又はアナログリガンドと
結合する生物学的に活性な分子を意味して使用される。
本発明の受容体分子は抗体であり、実質的に完全な抗体
又は抗体のイディオタイプを含むポリアミド部分であ
る。受容体分子の生物学的活性は、少くとも生理学的pH
値及びイオン強度において水性媒体中で混合した時に受
容体が抗原反応体リガンド、阻害剤又はアナログリガン
ドと結合することにより立証さる。好ましくは、受容体
は約５乃至約９のpH値及び蒸溜水のイオン強度乃至約１
モル濃度の塩化ナトリウムのイオン強度において抗原配
位子と結合する。
抗体のイディオタイプを含むポリアミド部分（抗体結
合サイト）はイディオタイプを含み、配位子又はアナロ
グ配位子と結合する抗体分子の部分である。そのような
部分は公知の酵素的分解技術により抗体から調製された
Fab、Fab′、及びＦ（ab′）２フラグメントを含む。た
とえば、一般的にはテオフィロポウラス（Theofilopoul
os）及びディクソン（Dixon）による米国特許第4,342,5
66号参照。特にFabフラグメントに関する加速された加
水分解速度は負のIgのそれと同じであると報告している
ポラック（Pollack）らのScience第234巻第1570頁（198
7年）参照。イディオタイプを含むポリアミドが得られ
る抗体は高められているか免疫原により誘導されている
と記載されているので、イディオタイプを含むポリアミ
ド受容体は抗体からイディオタイプを含むポリアミドを
得るには分解過程が典型的には必要であることを理解し
て“高められている”か“誘導されている”と考察され
ている。しかしながら、完全な抗体が好ましく、本発明
の受容体分子の説明に用いられている。
本発明に有用な受容体は好ましくは単クローン抗体で
ある。“単クローン抗体”は一種類の受容体分子を分泌
するハイブリドーマと呼ばれる単細胞のクローンより製
造される受容体である。ハイブリドーマ細胞は、抗体製
造細胞及び骨髄腫細胞又はその他の自己永続性細胞腺か
ら融合する。
本発明の単クローン抗体を調製する技術は公知であ
る。そのような受容体は、コーラー（Kohler）及びミル
スタイン（Milstein）によるNature第256巻第495頁（19
75年）にはじめて記載された。この文献は本明細書にお
いても参考にしている。単クローン抗体は、典型的には
ハイブリドーマ組織培養又はハイブリドーマ組織が導入
された哺乳動物から得られる腹水から得られる。双方の
方法が本明細書に記載されている。
単クローン受容体は、特定の免疫性を与えるアナログ
リガンド及び反応体リガンドのような特定のエピトープ
との結合における独特な特異性、並びに多クローン性抗
体に比べて比較的高い特異性触媒活性のために本発明に
おいては好ましい。多クローン性抗体の調製も本発明に
おいて使用しうるが、典型的には免疫性を与えるアナロ
グリガンドに結合するフラクションと、抗原キャリヤー
のそれのような外部のエピトープに結合するフラクショ
ンに分離しなければならない。
アナログリガンドに結合する多クローン性抗体は、親
和性ソーバント（sobant）のようなアナログリガンドを
用いた親和性分離により分離しうる。適する免疫反応に
十分な時間抗体配合物と親和性ソーバントを混合及び保
持した後、親和性ソーバントを抗体配合物の残存部分か
ら分離する。
親和性ソーバントに結合した、分離された残存抗体部
分はアナログリガンドに結合する抗体を含有する。一
方、抗体配合物の分離された残存部分中の抗体は外部の
エピトープと結合する。その後これらの親和性結合抗体
を、pH2においてグリシン塩酸塩でソーバントを洗浄す
るような、結合実在物を親和性ソーバントと分離する通
常の方法により単離しうる。
リガンドは、受容体分子抗体結合サイトと免疫反応又
は結合する分子又は錯体として本明細書においては定義
されている。本明細書においては２種類のリガンドが考
えられる。その一はアナログリガンドであり、受容体分
子の製造を誘導する免疫原及び受容体分子シンターゼ触
媒反応の阻害剤として使用される。その二はリガンド、
反応体リガンド又は反応体リガンド基質と呼ばれ、触媒
反応を受ける分子である。アナログリガンドは実質的に
触媒反応に対して不活性である。
前述のように、アミド又はエステル結合の加水分解に
おいて遷移状態のコンホメーションを擬態するために、
特定の所定のサイトにホスホンアミデート又はホスホネ
ート部分を含むアミド又はエステルリガンドの化学的ア
ナログが合成された。そのようなアナログは、たんぱく
分解酵素の阻害において遷移状態アナログとしてホスホ
ンアミデートが使用されたことが公知であるので本発明
の候補といえる〔バートレット（Bartlett）らによるBi
ochemistry第22巻第4618頁（19836年）〕。
ポリペプチド又はたんぱく質のアミド結合の加水分解
は、ハプテン免疫原として使用する場合には実質的に加
水分解しないアナログリガンドが必要である。ある種の
タンパク分解酵素の阻害に関して記載されているホスホ
ンアミデート（バートレットらによる同上の文献及びジ
ャコブセンらによるJ.Am.Chem.Soc.第103巻第654頁（19
81年））はまた、本発明において有用な受容体を誘導す
るように変性しうる。
短いポリペプチド鎖は、所定の特異性サイトにおいて
同族たんぱく質を認めかつ結合する抗体の製造を誘導し
うる。本発明はポリペプチドを用いた先行技術の研究の
主要工程を進行させる。本発明においては、抗体（受容
体）はハプテン第一分子（アナログリガンド）に免疫性
を与えることにより誘導され、第一分子ばかりでなく、
第二の関連分子（反応体リガンド）も認め、かつ結合す
る。その第二の分子との結合においては、受容体は予め
選択した、免疫性を与えるハプテン第一分子のトポロジ
ーに対応するトポロジーのエステル又はアミドの加水分
解（本明細書においては触媒的であることが示されてい
る）を引きおこす。トポロジー、すなわち寸法、形状及
び電荷の対応により、配位子の加水分解がおこるサイト
を予め選択する手段を提供する。アナログリガンド又は
反応体リガンドの構造を似せた阻害剤リガンドも受容体
分子と結合する。
従って、比較的小さい免疫性を与えるハプテンアナロ
グリガンドの合成により、複数のアミド又はエステル結
合をみうる別の分子内のエステル又はアミド結合を認
識、結合及び触媒的分解する受容体分子の製造を誘導す
ることができる。このようにして、前述の一般的に設計
された融合たんぱく質のようなたんぱく質又はポペプチ
ドの選択された所定のアミド結合の加水分解をひきおこ
す受容体を調製しうる。
この結果は、これまで知られていないたんぱく質分解
酵素の活性を免疫グロブリンに与えうることを意味す
る。
更に、免疫処置に使用するハプテンアナログリガンド
においてホスホンアミデート又はホスホネートの立体配
位で分解されるアミド又はエステル結合を選択すること
により、抗体の活性を随意に予め決定したサイトに向け
ることができる。このことについてはアナログリガンド
内に四面体の含燐結合をもっていないヒドロキシクマリ
ン部分の環内エステル結合（ラクトン）が加水分解され
ないのに対し、ヒドロキシクマリンエステルの場合アナ
ログリガンドの含燐結合に対応する環外エステル結合が
分解されることが本明細書に示されている。
従って、局部的なシークエンスが目的とする分子を含
む結合（ポリペプチド）のシークエンスに適合するたん
ぱく質の分解のような選択的な結合分解の方法が記載さ
れる。たんぱく質の化学、生化学、及び医学におけるそ
のような方法の適用には制限がない。
本明細書においても参考にしている出願人の米国特許
第4,659,567号における開示は、一部はｐ−ニトロフェ
ニル及びクマリニルエステルの加水分解に関する。化合
物は、たとえば免疫学的研究における燐エステルより対
応するｐ−ニトロフェニル及びクマリニル炭素の繊維状
態アナログとして作用するように調製される。たとえ
ば、たんぱく質キャリヤーに結合したC1を選定した化合
物に生じた抗体を単離し、アナログリガンド化合物C1に
対応するリガンドエステルの加水分解の分析において選
別した。加水分解により活性抵抗の検出を容易にするた
めに、その反応における螢光４−メチル−ウンベリフェ
ロン分子の遊離を利用した。そのような抗体が実際にク
マリンエステルを加水分解した。
抗体及び抗体のイディオタイプを含むポリアミド部分
は、ハプテンエステル又はアミドアナログリガンド加水
分解遷移状態分子により誘導された。出願人の特許にお
いて定義したようなハプテン分子は、（ａ）炭素原子、
（ｂ）２つの酸素原子及び（ｃ）第三の酸素原子又は窒
素原子（第三の酸素原子又は窒素原子は配位子の類似し
たエステル又はアミドのアルコール又はアミン部分の炭
素原子（α−炭素）に結合している）に直接結合した四
面体状に結合した中心燐又は珪素原子を含む。
前述の研究は、抗体とリガンドの一重結合がハプテン
の構造の機構に基づく設計により化学的触媒の反応に従
うという主張を支持する。ホスホネート部分に関する結
合相互作用はアシル交換反応において立体電子的に類似
している遷移状態又は四面体中間体を安定化するのを助
ける。前述の特許に記載された結果により説明されるよ
うに、安定なアシル化された抗体を形成する抗体結合サ
イトの必須残基にアシルが移動すると思われるので、前
述のプロセスは真に触媒的ではなかった。遷移状態アナ
ログの設計においてそのような機構は示されないのでこ
の結果は予期せぬものである。活性加水分解サイト又は
その付近の官能基は競争する２つのアシル交換反応機構
に従うこと、及び最もエネルギーの低い経路は基質の選
択に伴ない変化することが可能である。低いレベルのエ
ステラーゼ活性を検出する分析に有用な不安定なエステ
ルは、抗体において求核基にアシルが移動する可能性が
ある。
一層安定なリガンドを有する化学的に反応性の単クロ
ーン抗体は、非常に特異性なエステラセーゼ活性を示す
ことが証明された。使用する特定なハプテンの構造的特
徴に関連するカルボン酸エステルは、遷移状態アナログ
による特異な阻害を含む酵素の多くの特性を示す触媒反
応における抗体により受け入れられる。
エステル分解の遷移状態及びハプテン（アナログリガン
ド）の設計 アナログリガンドの設計は、形成される生成物の構造
から擬態される結合形成の遷移状態を経て、アナログリ
ガンドへと逆向きに考える。アミド又はエステルの加水
分解を含む反応は、一般的な概念の代表的な例を提供
し、エステル又はアミドの加水分解反応の実例として本
明細書では用いられている。
アシル交換反応プロセスは、カルボニル付加−除去の
機構を特徴とする。それ故、アシル基はこの遷移状態に
おいては四面体特性度が変化する。ダブリュー・ピー・
ジェンクスによるCatalysis in Chemistry and Enzymol
ogy第10章（ニューヨークのマグロウヒル1969年）。ア
シル交換反応を触媒する酵素は、アシル中心のまわりに
四面体配位を有する反応体リガンドと結合することが期
待される。このことは、アミド又はエステルの直接水和
を触媒する酵素と同時に、リガンド（基質）と酵素間の
共有結合が一時的に形成されるセリンとたんぱく質分解
酵素においてもほんとうである〔ウェステリク（Wester
ik）らによるJ.Biol.Chem.第247巻第8195頁（1972
年）；アール・シー・トンプソン（R.C.Thompson）によ
るBiochemistry第12巻第47頁（1973年）及びインペラリ
（Imperali）らによるBiochemistry第25巻第3760頁（19
86年）〕。前者の場合は、切断しやすいアミド単位の代
わりにホスフェート、ホスホネート又はホスホンアミデ
ート基を含む四面体配位を有する化合物により阻害され
る〔ウェーバー（Weaver）らによるJ.Mol.Biol.第114巻
第119頁（1977年）及びジャコブソンらによるJ.Am.Che
m.Soc.第103巻第654頁（1981年）〕。
燐を含む天然産及び合成物質が金属ペプチダーゼの阻
害剤として研究されている。これらの酵素においては、
遷移状態は金属の配位球に水和アミドを含むと思われる
〔ダブリュー・エヌ・リプスコーム（W.N.Lipscomb）に
よるAcc.Chem.Res.第15巻第232頁（1982年）〕。従って
遷移状態のアナログの完全な状況は、金属イオン又はそ
の他の成極サイトに対するリガンドとして阻害剤のホス
ホノ基を有するであろう（第１図参照）〔ウェーバーら
によるJ.Mol.Biol.第114巻第119頁（1977年）及びクリ
スチャンソン（Christianson）らによるJ.Am.Chem.Soc.
第108巻第545頁（1986年）〕。しかしながら金属ペプチ
ダーゼにおける金属イオンの役割は明らかには理解され
ていない。四面体中間体内でのプロトン移動工程が律速
段階かもしれないアミド加水分解においては多くの機能
を有するかもしれない。〔エル・エム・セイレ（L.M.Sa
yre）によるJ.Am.Chem.Soc.第108巻第1632頁（1986
年）〕。
カルボン酸エステルの加水分解は、遷移状態のホスホ
ネートを含むアナログが接近するアシル交換の簡単な例
である。荷電ホスホネート基の結合は触媒反応に導く遷
移状態における安定化相互作用を記載しうる。エステル
加水分解反応は一般的に、抗体に適する周囲条件下にお
いて都合のよい自然速度で進行する。従って小さな速度
の加速であっても容易に検出しうる。
本発明のアナログリガンド及び反応体リガンドの構造
は、いくつかの基準に従って選択された。それらには、
有機燐前駆物質、対応するカルボン酸の入手可能性及び
安定性、カルボン酸調製の化学的合成の便利性、及び免
疫学的表示の種々のスキームへの適応性が含まれる。
必要な特徴を提供する基礎的な分子単位は、たとえば
第２図の化合物１〜４に示される置換アリールフェニル
酢酸アナログ構造である。芳香族環にアミノ置換基を含
有することにより、たとえばベンジル基又はフェノール
基のいずれかにハプテンを提出するための免疫原キャリ
ヤーたんぱく質とカップリングするための機能性付加物
が備わっている。その構造はまた金属結合サイトを創造
するためにフェノール環に更に付加物を含むことを許容
する。この構造は金属エステラーゼの構造を有する抗キ
レート抗体を製造するのに望ましい。
フェノール構造にｏ−アミノエチル基を誘導するのに
ジピコリン酸ハライドを用いて前記のような可能性につ
いて研究した（第２図の化合物３及び４参照）。この付
加物のホスホニル及びアシルエステルの脱アルカリ化を
金属キレートの形成が可能なリガンドに暴露する。しか
しながら、コバルト、亜鉛及び銅のような二価の遷移金
属を用いて決定したこのリガンドの錯体の固有の安定性
は、免疫処置プロセスにおいて本来の形を保持すること
を期待するにはあまりにも低い。実際に、化合物３と二
価の金属イオンとの1:1キレートの形成定数は、滴定分
析によれば104〜105M-1である。たとえば安定なハプテ
ンキレートを生成するために、三価のコバルトとの一層
安定な錯体を使用すれば一層意義深い結果が得られるか
もしれない。
従って、本発明は一般的にはリガンドの予め選択した
アミド又はエステル結合を加水分解しうる好ましくは単
クローンの受容体に関し、受容体は（ａ）予め選択した
反応体のエステル又はアミド結合の四面体状加水分解遷
移状態を形成しうる反応体リガンド及び（ｂ）予め選択
した反応体のエステル又はアミド結合のカルボニル基炭
素原子により占められている位置に四面体状に結合した
燐原子を有するリガンドのアナログと結合する抗体結合
サイトを含む。四面体状に結合した燐原子は以下の原子
と直接結合している： （ｉ）類似した反応体リガンドエステル又はアミドの酸
部分の炭素原子（α−炭素）、 （ii）２つの酸素原子（一方は燐原子と二重結合で結合
して酸素がオキソラジカルであり、もう一方は燐原子及
び水素又はC1〜C4の低級アルキルのいずれかと結合して
いる）、及び （iii）類似したエステル又はアミドの炭素原子、すな
わちエステル又はアミドのアルコール又はアミン部分の
α−炭素に結合している第三の酸素原子又は窒素原子。
環状アミド又はエステルが反応体リガンドである場合
には、分子に明白な酸及びアミン又はアルコール部分は
ない。しかしながら、有機化学に精通している人々には
定義によりアミド及びエステルが酸及びアミン又はアル
コール部分を含まなければならないことを理解するであ
ろう。従って、分子の酸部分に少くともカルボニル炭素
及びそれが直接結合しているα−炭素を含むような分子
及び分子のアミン又はヒドロキシル部分にアミノ又はヒ
ドロキシル基及びそれが直接結合しているα−炭素を含
むような分子には実在しない境界線をひくことができ
る。
別の実施例においては、本発明は反応体リガンド分子
における予め選択したエステル又はアミド結合を触媒的
に加水分解する方法に関する。この方法は、（ａ）有効
量の前述の受容体の一と反応体リガンドとを水性媒体中
で混合し、（ｂ）混合物をリガンド分子が受容体と結合
し、受容体分子が予め選択した結合を加水分解するのに
十分な時間保持する工程を含む。そのような加水分解の
生成物は、所望であればその後回収しうる。
本発明の加水分解法は、反応混合物の一部として水性
媒体を用いる。そのような媒体は典型的には水及び緩衝
塩を含む。更に、媒体は塩化ナトリウムのようなその他
の塩、並びにたんぱく質を含む媒体中にしばしば見い出
される水溶性のカルシウム及びマグネシウム塩を含有し
うる。鉄、亜鉛及びコバルト塩のようなその他の水溶性
多価金属塩も存在しうるし、反応体リガンドが２つの別
々の分子から成る場合には有用な錯化剤である。メタノ
ール、エタノール、アセトニトリル、ジメチルスルホキ
シド、ジオキサン、ヘキサメチルホスホルアミド及びN,
N−ジメチルホルムアミドのような有機溶媒も存在しう
る。反応体リガンド及び受容体分子を乳化する界面活性
剤も存在しうる。水性媒体中に存在する成分の重要な特
徴は、そのような成分が実質的に受容体分子を変性する
ことによるなどして触媒反応に干渉したり阻害したりし
ないということである。更に、水性媒体は実質的に、受
容体分子により触媒される結合切断反応を阻害する塩、
一般的にたんぱく質、特に酵素を含まない。
水性媒体のpH値は、典型的には約５乃至約９であり、
好ましくは約6.0乃至約8.0である。触媒反応が実質的に
干渉されたり阻害されたりしない限り、pH値は前記の値
より大きくても小さくても使用しうる。
触媒反応は典型的には周囲温度において、すなわち約
20乃至約25℃において周囲圧力下で実施する。しかしな
がら、大気圧下において水性媒体のほぼ凍結点より低温
及び媒体のほぼ沸点より高温も使用しうる。公知のよう
に、受容体分子のようなたんぱく質は水性媒体が沸騰す
るような高温、たとえば約100℃においては変性する傾
向があるので約40℃未満のような温度が好ましい。多分
子動力学式に従う反応は温度の低下に伴ない速度が低下
することも公知である。従って、最低温度は約15℃が好
ましい。
反応体リガンドは、水性媒体中における溶解度までの
量だけ反応混合物中に存在する。不溶性反応体配位子を
含む二相系も使用しうるが、通常は使用しない。通常使
用する反応体リガンドの濃度は約0.1μＭ乃至約10mMで
あり、その量は反応体リガンドの溶媒媒体中における溶
解度の関数である。生成物自体が所望の場合には、反応
機構や反応動力学が研究されているような低濃度と比べ
て比較的高濃度を使用する。
有効量の受容体分子も存在する。有効量とは、典型的
には触媒量であり、受容体は反応体リガンドに対して約
1:2乃至約1:10,000のモル比で使用され、約1:10乃至約
1:100のモル比が好ましい。受容体分子の反応体リガン
ドに対する割合は、典型的には受容体分子の反応体リガ
ンドに対する特異性活性及び反応を実施する使用者の目
的に存在する。従って、生成物が所望である場合には、
比較的高濃度の受容体及び高い割合の反応体リガンドに
対する受容体が使用される。反応の反応機構及び動力学
が研究されている場合には、典型的には低濃度及び低い
割合が使用される。化学量論量又はそれ以下の受容体も
使用しうるが、受容体は触媒分子であるから、化学量論
量を使用してもむだである。従って、少くとも触媒量の
受容体を使用する。
本明細書において考察したように、代表的な受容体は
ATCC受入番号がHB9168、HB9169、HB9500、HB9501、HB95
02、HB9503、HB9504、HB9505、HB9506、HB9507、HB950
8、及びHB9507であるハイブリドーマより分泌され、反
応体リガンド分子は以下に示す構造を有する。
アナログリガンド及びリガンドの調製 以下に、第２図に示される化合物１〜11、並びに化合
物12〜22の調製について記載する。記載が容易であるた
め、化合物（アナログリガンド）３、４、１及び２、及
び化合物（反応体リガンド）５、６、７、８、10、11及
び９の順に記載する。化合物１〜４及び12の触媒的分解
の阻害剤、すなわちそれぞれ阻害剤1i、2i、3i、4i及び
12iの調製についても記載する。ジエチル４−トリフル
オロアセトアミドベンジルホスホネート（化合物Ａ） ジエチル４−アミノベンジルホスフェート（0.74g、
3.04mM）を5mlのメチレンクロライド（水素化カルシウ
ム上で新たに蒸留したもの）に溶かした撹拌溶液にピリ
ジン（0.32ml、4mM）を添加する。混合物を４℃に冷却
し、無水トリフルオロ酢酸（0.5ml、3.54mM）を５分間
にわたって撹拌溶液に滴下する。溶液を室温（約23℃）
に暖めながら撹拌を15分間継続する。溶離剤としてメチ
レンクロライド及び酢酸エチルの1:1混合物を用いた薄
層クロマトグラフィーにより反応の完了は指示される
（Rf 0.2）。溶液の50mlの酢酸エチルで希釈する。有機
溶液を0.5MのHCl 25mlで続けて２回洗浄し、次いで無水
硫酸マグネシュウム上で乾燥させる。蒸発させると黄色
い油状物が得られ、このものを溶離剤としてメチレンク
ロライド及び酢酸エチルの1:1混合物を用いシリカゲル
上でフラッシュクロマトグラフィーにより精製する。ホ
スホネート（化合物Ａ）（0.877g、収率85％）が無色の
結晶物質として得られる。
CDCl3中100MHz 1H−NMR:δ10.61（広幅１本線、1
H）、7.53（２本線、Ｊ＝8.22Hz、2H）、7.17（２組の
２本線、Ｊ＝8.67Hz及び2.5Hz、2H）、4.02（Ｐ、Ｊ＝
7.18Hz、２（2H））、3.10（２本線、Ｊ＝21.62Hz、2
H）及び1.26（３本線、Ｊ＝7.05Hz、２（3H）。
エチルクロロ４−トリフルオロアセトアミドベンジルホ
スホネート（化合物Ｂ） ホスホネート（化合物Ａ）（0.1g、0.29mM）を5mlの
クロロホルム（水素化カルシウム上で新たに蒸留したも
の）に溶かした溶液に５塩化燐（PCl5）（0.070g、0.35
mM）を添加する。混合物を50℃において２時間攪拌す
る。反応の完了は、薄層クロマトグラフィーにより指示
される（アリコートを除去し、メタノール及びトリエチ
ルアミン中で急冷する）。クロマトグラフィーは溶離剤
としてメチレンクロライド及び酢酸エチルの1:1混合物
を用いて実施する（Rf 03）。固体の亜硫酸水素ナトリ
ウムを加熱し、反応混合物に泡だたせることにより残存
するPCl5を急冷する。溶媒を蒸発させると黄色い油状物
が得られ、このものに30mlの無水ジエチルエーテルの添
加すると白色結晶固体が得られる。沈殿物を30mlのジエ
チルエーテルで連続して３回洗浄するとクロロホスホネ
ート（化合物Ｂ）（0.086g、収率89％）が得られる。化
合物Ｂは吸湿性であるために更に精製することなく直接
使用する。
CDCl3中における100Mz 1H−NMR:δ9.09（広幅１本
線、NH）、7.55（２本線、Ｊ＝7.72Hz、2H）、7.28（多
重線、2H）、4.29（Ｐ、Ｊ＝7.12Hz、2H）、3.52（２本
線、Ｊ＝20.5Hz、2H）及び1.39（３本線、Ｊ＝7.07Hz、
3H）。
２−ヒドロキシ−５−ニトロベンジルヘキサメチレンテ
トラミン臭化水素酸塩（化合物Ｃ） ヘキサメチレンテトラミン（1.88g、8.1mM）を20mlの
クロロホルム（水素化カルシウム上で新たに蒸留したも
の）に溶解させる。２−ヒドロキシ−５−ニトロベンジ
ルブロマイド（1.137g、8.1mM）を撹拌溶液に添加す
る。スラリーを一昼夜還流し、このものを冷却すると光
沢のある黄色い沈殿物が得られる。沈殿物を濾過し、50
mlの冷たいクロロホルムで連続して３回洗浄し、真空乾
燥することにより3.010g（収率100％）の第四塩（化合
物Ｃ）が得られる。化合物Ｃの融点は181〜184℃であ
る。
（CD3）2SO中における100MHz 1H−NMR:8.06（２本
線、Ｊ＝2.79Hz、1H）、7.96（２組の２本線、Ｊ＝8.92
及び2.74Hz、1H）、6.92（２本線、Ｊ＝8.87Hz、1H）、
4.91（広幅１本線、6H）及び3.84（１本線、2H）。
２−ヒドロキシ−５−ニトロベンジルアミン塩酸塩（化
合物Ｄ） 15mlのエタノールに化合物Ｃ（0.250g、0.67mM）及び
濃HCl（0.56ml、0.67mM）を添加する。溶液が透明にな
るまで黄色いスラリを2.5時間還流する。冷却すると白
色沈殿物（臭化アンモニウム塩）が形成される。沈殿物
を濾過し、濾液を濃縮して乾燥させると灰色がかった白
色の沈殿物が得られる。沈殿物をアセトン中で撹拌し、
スラリを濾過すると0.128g（94％）のアミン（化合物
Ｄ）が得られる。溶離剤として水酸化ナトリウム／メチ
レンクロライド／メタノールの1.2％/5/1混合物を用い
て薄層クロマトグラフィーを実施する。（Rf 0.2）。生
成物はニンヒドリン試験でプラスを示す。アミン（化合
物Ｄ）の融点は248〜251℃（分解を伴う）である。
（CD3）2SO中における100MHz 1H−NMR:δ7.93（２本
線、Ｊ＝3.10Hz、1H）、7.83（２組の２本線、Ｊ＝9.23
及び3.07Hz）、6.14（２本線、Ｊ＝9.17Hz、1H）、及び
3.80（１本線、2H）。
２−ヒドロキシ−５−ニトロベンズアミド、６−メチル
エステルピリジン（化合物Ｅ） ２−ヒドロキシ−５−ニトロベンジルアミン塩酸塩
（化合物Ｄ）（0.259g、1.27mM）を、ジピコリン酸モノ
メチルエステルクロライド（0.254g、127mM）のメチレ
ンクロライド（水素化カルシウム上で新たに蒸留したも
の）溶液に添加すると、スラリが得られ、このものをは
げしく撹拌すると、トリエチルアミン（0.53ml、3.81m
M）を滴下すると黄色い溶液が得られるが、トリエチル
アミンを完全に添加するとオレンジ色に変わる。反応の
完了は、溶離剤としてメチレンクロライド及びエタノー
ル39:1混合物と用いた薄層クロマトグラフィーにより示
される（Rf 0.2）。溶液を50mlの酢酸エチルで希釈し、
0.5M HCl 25mlで連続して３回、次いで塩水で洗浄す
る。無水硫酸マグネシウム上で乾燥し、溶媒を蒸発させ
ると、0.375gの生成物が得られる。このものを、溶離剤
としてメチレンクロライド及びエタノールの19:1混合物
を用いシリカゲル上でフラッシュクロマトグラフィーに
より精製する。アミド（化合物Ｅ）（0.310g、74％）
が、融点236〜238℃の不透明な固体として得られた。
（CD3）2SO中における100MHz 1H−NMR:δ11.39（広幅
１本線、NH）、9.15（多重線、1H）、8.34〜8.01（多重
線、4H）、6.98（２本線、Ｊ＝9.3Hz、1H）、4.52（２
本線、Ｊ＝4.521Hz、2H）及び3.92（１本線、3H）。
化合物Ｆの調製 化合物Ｅ（0.1g、0.3mM）を化合物Ｂ（0.099g、0.3m
M）のメチレンクロライド（水素化カルシウム上で蒸
留）溶液に添加する。スラリをはげしく撹拌し、トリエ
チルアミン（0.66ml、9mM）を滴下すると黄色が揺れ動
く。トリエチルアミンの添加が完了すると、溶液は透明
になる。溶液を更に15分撹拌する。反応の完了は、溶離
剤としてメチレンクロライド及びエタノールの20:1混合
物を用いた薄層クロマトグラフィーにより指示される
（Rf 0.6）。30mlの酢酸エチルで希釈し、0.5M HCl 30m
lで連続して２回、次いで塩水で洗浄した後無水硫酸マ
グネシウムで乾燥し、溶媒を蒸発させると黄色い油状物
が得られる。更にこの生成物を、溶離剤としてメチレン
クロライド及びエタノールの35:1混合物を用いたフラッ
シュクロマトグラフィーシリカゲルで精製する。ニトロ
ホスホネート（化合物Ｆ）（0.154g、収率82％）が白色
フォームとして得られる。
CDCl3中における100MHz 1H−NMR:δ9.41（広幅１本
線、NH）、8.51〜7.93（多重線、5H）、7.71（２本線、
Ｊ＝8.20Hz、2H）、7.55（２本線、Ｊ＝8.89Hz、1H）、
7.35（２組の２本線、Ｊ＝8.62及び2.51Hz、2H）、4.45
（２本線、Ｊ＝6.54Hz、2H）、4.24（多重線、2H）、4.
01（１本線、3H）、3.46（２本線、Ｊ＝20.8Hz、2H）及
び1.27（３本線、Ｊ＝6.94Hz、3H）。
化合物Ｇの調製 化合物Ｆ（0.061g、97mM）のエタノール撹拌溶液に濃
塩酸（200ml、6.6mM）を添加する。撹拌を停止し、0.03
2gのパラジウムを炭素に支持させたものを添加する。反
応混合物を水素雰囲気下に置き、１時間はげしく撹拌す
る。反応の完了は、溶離剤としてメチレンクロライド及
びエタノールの20:1混合物を用いた薄層クロマトグラフ
ィーにより指示される（Rf 0.4）。生成物はニンヒドリ
ン試験でプラスを示す。25mlの酢酸エチルで希釈し、セ
ライトで濾過する。濾塊を25mlの酢酸エチルで連続して
２回洗浄する。有機層を塩基性になるまで５％の亜硫酸
水素ナトリウム水溶液で洗浄し、その後25mlの塩水で連
続して２回洗浄し、無水硫酸マグネシウム上で乾燥させ
蒸発させると、次の工程に適する純度の透明な油状物と
してアミン（化合物Ｇ）（0.038g、収率69％）が得られ
る。
CDCl3中における100mHz 1H−NMR:δ0.95（広幅１本
線、NH）、8.42〜7.92（多重線、3H）、7.71（２本線、
Ｊ＝8.33Hz、2H）、7.35（２本線、Ｊ＝8.84Hz、1H）、
7.15（２組の２本線、Ｊ＝8.37及び2.31Hz、2H）、6.75
（２本線、Ｊ＝3.22Hz、1H）、1.51（２組の２本線、Ｊ
＝8.80及び3.91Hz、1H）、4.92（２本線、Ｊ＝6.85Hz、
2H）、4.10（多重線、2H）、4.05（１本線、3H）、3.39
（２本線、Ｊ＝21.38Hz、2H）及び1.22（３本線、Ｊ＝
6.95Hz、3H）。
化合物３の調製 アミン（化合物Ｇ）（0.063g、0.106mM）の試料を8ml
のメチレンクロライド（水素化カルシウム上で蒸留）に
溶解させる。無水酢酸（0.150ml、1.35mM）を添加し、
次いでトリエチルアミン（0.075ml、1.02mM）を添加す
る。反応は完了するまで、溶離剤としてメチレンクロラ
イド及びメタノールの9:1混合物を用いて薄層クロマト
グラフィーにより追跡する（Rf 0.2）。35mlの酢酸エチ
ルで希釈し、0.5MのHCl 20mlで続けて３回、次いで10％
の炭酸水素ナトリウム及び塩水で洗浄する。溶媒を蒸発
させ、溶離剤としてのメチレンクロライド及びメタノー
ルの10:1混合物を用いてシリカゲル上でフラッシュクロ
マトグラフィーにより精製すると化合物３（0.045g、収
率67％）が得られる。1ml/分の流速で20分間30〜90％の
アセトニトリル水溶液を用いて分析RP−C18カラム（Vyd
ac 218TP54）上HPLCにより調べると、化合物３は分析的
には純粋である。
CDCl3中における100MHz 1H−NMR:δ9.61（広幅１本
線、NH）、8.41〜8.22（多重線、4H）、8.21〜7.59（多
重線、3H）、7.58〜7.14（多重線、4H）、4.22（多重
線、4H）、4.05（１本線、3H）、3.40（２本線、Ｊ＝2
1.25Hz、2H）、2.12（１本線、3H）及び1.23（３本線、
Ｊ＝6.93Hz、3H）。
化合物４の調製 アミン（化合物Ｇ）（0.035g、59mM）のテトラヒドロ
フラン（ベンゾフェノンの存在下ナトリウム上で蒸留）
撹拌溶液を窒素雰囲気下注射器によりスクシンイミジル
アジポイルクロリドの0.5M溶液0.140mlで処理する。こ
の溶液にトリエチルアミン（0.025ml、180mM）を添加す
る。反応は完了するまで、溶離剤としてメチレンクロラ
イド及びエタノールの5:1混合物を用いた薄層クロマト
グラフィーにより追跡する（Rf 0.6）。25mlの酢酸エチ
ルで希釈し、次いで0.5MのHCl 25mlで続けて２回、及び
塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥して溶媒を
蒸発させると、黄色い油状物が得られる。この生成物を
溶離剤としてメチレンクロライド及びエタノールの10:1
混合物を用いシリカゲル上でフラッシュクロマトグラフ
ィーにより更に生成する。ニトロホスホネート（化合物
４）（0.036g、収率82％）が白色フォームとして得られ
る。前述のようなカラムを用い、1ml/分の流速で25分間
30〜90％のアセトニトリル水溶液を用いて溶離させるHP
LCによれば、ピークが１つ得られ、この生成物は分析的
には純粋であることが示される。
CDCl3中における100MHz 1H−NMR:δ9.29（幅広１本
線、NH）、8.43〜8.25（多重線、4H）、8.24〜7.67（多
重線、3H）、7.66〜7.10（多重線、3H）、4.24（多重
線、4H）、4.05（１本線、3H）、3.40（２本線、Ｊ＝2
1.30Hz、2H）、2.84（１本線、4H）、2.65（多重線、2
H）、2.38（多重線、2H）、1.79（多重線、4H）及び1.2
6（３本線、Ｊ＝6.91Hz、3H）。
阻害剤3iの調製 ホスホネート（化合物３）（0.065g、0.1mM）を2.5ml
のアセトニトリル（水素化ナトリウム上で蒸留）に溶解
させる。この溶液によう化ナトリウム（0.306g、2m
M）、次いでトリメチルシリルクロライド（0.26ml、2m
M）を添加すると、オレンジ色の溶液が得られる。混合
物を60℃に加熱する。12時間加熱及び撹拌した後、前述
のカラムを用い、1ml/分の流速で20分間30〜90％のアセ
トニトリル水溶液を用いて溶離させるHPLCによれば、42
％において１つの主要なピークが観察された。溶液を室
温に冷却し、次いで酢酸エチル及びｎ−ブタノールの5
0:50混合物10mlで希釈する。有機層を塩水の溶液と共に
撹拌し、オレンジ色が消えるまで固体の亜硫酸水素ナト
リウムを添加する。層状物を分離し、水性相は10mlの酢
酸エチル及びｎ−ブタノールで続けて抽出する。有機層
は一緒にして硫酸ナトリウム上で乾燥させ、酢酸ナトリ
ウム（0.030g）を用いて緩衝する。溶媒を回転エバポレ
ータにより除去すると、白色粉末（0.088g、収率145
％）が得られる。この生成物を5mlの水に溶解させ、０
℃に冷却する。得られた溶液は6MのHClで酸性とし、pH2
にする。酸性溶液を親液化すると0.085gの阻害剤3iが得
られた。次いでこのものをC18 WatersA逆相Sep−Pack
（MA州ミルフォード（Milford）のミリポア・コーポレ
ーション（Millipore Corp.）、ウォーターズ・アソー
シエイツ（Waters Associates）を用い、10％のアセト
ニトリル水溶液で溶離すると、フラクション４、５及び
６が回収された。フラクションを一緒にしてHPLCで再チ
ェックすると、42％において１つのピークが示された。
溶液を親液化した。
化合物4iの調製（免疫処置に使用） 化合物４の試料23.5mを2mlのアセトニトリル（水素化
カルシウム上で蒸留）に溶解させる。次いでこのもの
を、阻害剤3iを非ブロックするのに使用した手順で処理
する。前述のカラムを用い、1ml/分の流速で30分間30〜
90％のアセトニトリル水溶液を用いて溶離させるHPLCに
よれば、49％において１つの主要なピーク4iが得られ、
試料は分析的には純粋である。有機相を酢酸ナトリウム
で緩衝し、溶媒を除去すると化合物4i（0.036g、収率16
2％）が得られた。この生成物はまだ無機塩で汚染され
ているけれども、試料はたんぱく質キャリヤー（BSA及
びKLHを含む）とのカップリングに適する。化合物4iは
加水分解しやすい（NHS基）ので、デシケーター中０℃
で貯蔵すべきである。化合物4iの純度は、ジアゾメタン
処理によりチェックしうる。反応は、溶離剤としてメチ
レンクロライド及びエタノールの10:1混合物を用いた薄
相クロマトグラフィーにより追跡し（Rf 0.4）、化合物
４との共スポットである１つのスポットが示された。DM
SO中100MHz 31P−NMR:δ22.2（１本線）。
化合物Ｈの調製 ホスホニルクロライド（化合物Ｂ）（0.726g、2.2m
M）を乾燥クロロホルム（水素化カルシウム上で蒸留）
中に溶解させる。これにｐ−ニトロフェノール（0.305
g、2.2mM）及びトリエチルアミン（0.32ml、2.5mM）を
添加する。反応混合物を10分間撹拌し、反応の完了は溶
離剤としてメチレンクロライド及びエタノールの1:1混
合物を用いた薄層クロマトグラフィーにより示される
（Rf 0.8）。50mlの酢酸エチルで希釈し、0.5MのHCl 50
mlで続けて３回、飽和炭酸水素ナトリウム及び塩水洗浄
し、乾燥及び蒸発すると化合物Ｈが得られる。更に、溶
離剤としてメチレンクロライド及びエタノールの2:1混
合物を用いてシリカゲル上でフラッシュクロマトグラフ
ィーによる精製を実施すると、ホスホネート（化合物
Ｈ）（0.626g、収率66％）が得られた。
CDCl3中における100MHz 1H−NMR:δ8.79（幅広１本
線、NH）、8.19（２本線、Ｊ＝9.44Hz、2H）、7.54（２
本線、Ｊ＝8.21Hz、2H）、7.25（２組の２本線、Ｊ＝8.
57及び2.62Hz、2H）、7.20（２本線、Ｊ＝9.13Hz、1
H）、4.17（ｐ、Ｊ＝7.15Hz、2H）、3.35（２本線、Ｊ
＝21.77Hz、2H）及び1.29（３本線、Ｊ＝6.94Hz、3
H）。
化合物Ｉの調製 化合物Ｈ（0.250g、0.63mM）の試料を、化合物Ｆの還
元に関して記載したのと同様な方法で還元する。アミン
（化合物Ｉ）が透明なフォーム（0.130g、収率51％）と
して得られる。溶離剤としてメチレンクロライド及びエ
タノールの1:1混合物を用い薄層クロマトグラフィーを
実施した（Rf 0.3）。生成物のニンヒドリン試験はプラ
スである。
CDCl3中における100MHz 1H−NMR:δ851（広幅１本
線、NH）、7.63（２本線、Ｊ＝8.19Hz、2H）、7.31（２
組の２本線、Ｊ＝8.61及び2.51Hz、2H）、7.24（２本
線、Ｊ＝8.91Hz、2H）、6.61（２本線、Ｊ＝8.06Hz、2
H）、4.18（ｐ、Ｊ＝7.18Hz、2H）、3.39（２本線、Ｊ
＝21.55Hz、2H）及び1.24（３本線、Ｊ＝7.18Hz、3
H）。
化合物１の調製 メチレンクロライド（水素化カルシウム上で新たに蒸
留）の溶液に化合物Ｉ（0.030g、0.075ml）を添加す
る。化合物Ｇのアシル化についてすでに記載したのと同
様な方法で化合物Ｉのアシル化を実施する。化合物１が
フォームとして得られる（0.024、収率73％）。溶離剤
としてメチレンクロライド及びエタノールの4:1混合物
を用い薄層クロマトグラフィーを実施した（Rf 0.3）。
CDCl3中における100MHz 1H−NMR:δ9.57（広幅１本
線、NH）、8.28（広幅１本線、NH）、7.50（２本線、Ｊ
＝8.21Hz、2H）、7.39（２本線、Ｊ＝8.34Hz、2H）、7.
18（２組の２本線、Ｊ＝8.31及び2.59Hz、2H）、4.13
（ｐ、Ｊ＝7.3Hz、2H）、3.26（２本線、Ｊ＝21.73Hz、
2H）、2.07（１本線、3H）及び1.24（３本線、Ｊ＝7.10
Hz、3H）。
化合物２の調製 化合物４の合成においてすでに記載したのと同様な方
法で化合物Ｉ（0.168g、0.42mM）を反応させる。透明な
ガラスとして化合物２が得られる（0.188g、収率71
％）。
CDCl3中における100MHz 1H−NMR:δ9.35（広幅１本
線、NH）、8.39（広幅１本線、NH）、7.53（２本線、Ｊ
＝8.15Hz、2H）、7.41（２本線、Ｊ＝8.29Hz、2H）、7.
19（２組の２本線、Ｊ＝8.30及び2.57Hz、2H）、4.15
（p.J＝7.21Hz、2H）、3.25（２本線、Ｊ＝21.67Hz、2
H）、2.85（１本線、4H）、2,61（多重線、2H）、2.33
（多重線、2H）、1.79（多重線、4H）及び1.23（３本
線、Ｊ＝7.23Hz、3H）。
阻害剤1iの調製 ホスホネート（化合物１）（0.030g、68mM）を3mlの
アセトニトリル（水素化カルシウム上で新たに蒸留）中
に溶解される。トリメチルシリルブロマイド（0.1ml、7
6mM）をゆっくり添加し、反応混合物を50℃に45分間加
熱する。溶液を室温に冷却させる。イソプロパノール及
び水の3:7混合物を用いた逆相薄層クロマトグラフィー
により反応の完了は示される（Rf 0.8）。酢酸エチル及
びｎ−ブタノールの1:1混合物30mlで希釈し、0.5MのHCl
30mlで連続して２回、及び塩水で洗浄し、乾燥及び蒸発
させる阻害剤1i（0.023g、収率83％）が得られた。この
ものを更に阻害剤3iについて記載した方法に従って精製
した。
（CD3）2SO中における100MHz 1H−NMR:δ9.15（広幅
１本線、NH）、8.17（広幅１本線、NH）、7.71〜6.95
（多重線、8H）、2.23（２本線、Ｊ＝21.65Hz、2H）、
及び2.09（１本線、3H）。
阻害剤2iの調製（免疫処置に使用） 20mgの化合物２の試料を2mlのアセトニトリル（水素
化カルシウム上で新たに蒸留）に溶解させた。次いでこ
れをトリメチルシリルブロマイド（0.05ml、31mM）で処
理し、50℃に２時間加熱する。反応の完了は溶離剤とし
てメチレンクロライド及びエタノールの2:1混合物を用
いた薄層クロマトグラフィーにより示される（Rf 0.
7）。溶媒を回転エバポレータにより除去し、残留物を
酢酸エチル及びｎ−ブタノールの1:1混合物20ml中に溶
解させる。有機層を25mlの水で連続して２回、次いで塩
水で洗浄する。有機層を濃縮すると白色粉末の化合物2i
が得られる（0.017g、収率87％）。このものはたんぱく
質カップリングに適することが見い出され、更に精製す
る必要はない。
化合物５の調製 10％のアセトニトリル水溶液に４−アミノフェニル酢
酸（1.5g）及び炭酸ナトリウム（1.5g）を溶解させた溶
液に、−10℃において無水トリフルオロ酢酸を添加し
た。溶液を6NのHCl（0.2ml）で酸性とし、真空中で濃縮
した。ジクロロメタン及びメタノールの9:1混合物を用
いシリカで濾過すると1.4g（収率57重量％）のｐ−トリ
フルオロアセトアミドフェニル酢酸が得られた。溶離剤
としてクロロホルム及びメタノールの5:1混合物を用い
てシリカゲル上で薄層クロマトグラフィーを実施すると
Rf値は0.35であった。
1H−NMR（CDCl3中）：δ3.15（１本線、2H）、δ7.02
（２組の２本線、4H）、δ10.4（広幅１本線、NH）。
前述の酸（0.6g）のチオニルクロライド中に溶解さ
せ、溶液を40℃に２時間加熱した。チオニルクロライド
を真空中で除去し、残留物をジクロロメタン（5ml）中
に溶解させ、７−ヒドロキシクマリン（0.40g）及びト
リエチルアミン（0.70g）のジクロロメタン（5ml）溶液
に添加した。10分後酢酸エチル（50ml）で溶液を希釈
し、５％のHCl、次いで塩水で洗浄した。有機溶液を乾
燥させ濃縮した。溶離剤としてジクロロメタン及び酢酸
エチルの15:1混合物を用いたシリカゲルクロマトグラフ
ィーにより精製すると、白色固体として0.83g（収率81
重量％）の化合物５が得られた。溶離剤としてジクロロ
メタン及び酢酸エチルの9:1混合物を用いて薄層クロマ
トグラフィーを実施するとRf値は0.78であった。
1H−NMR（CD3CN中）：δ3.95（１本線、2H）、δ6.40
（２本線、1H）、δ7.0〜7.7（多重線、7H）、δ7.85
（２本線、1H）、δ9.2（広幅１本線、NH）。
化合物６の調製 ｐ−トリフルオロアセトアミドフェニルアセチルクロ
ライドをＮ−ヒドロキシスクシンイミド及びトリエチル
アミンのジクロロメタン溶液で処理すると、化合物５に
ついて前述したようにして精製した後白色固体として化
合物６が得られた。溶離剤としてクロロホルム及びメタ
ノールの5:1混合物を用いてシリカゲル薄層クロマトグ
ラフィーを実施すると、Rf値は0.35であった。
1H−NMR（CD3CN中）：δ3.15（１本線、2H）、δ7.02
（２組の２本線、4H）及びδ10.4（広幅１本線、NH）。
化合物７の調製 ４−トリフルオロアセトアミドフェニル酢酸及びチオ
ニルクロライドの混合物を40℃に２時間加熱する。真空
中で揮発性成分を除去した。残留物をジクロロメタン中
に溶解させた。４−アセトアミドフェノール（１当
量）、次いでトリエチルアミンを添加した。生成物（化
合物７）を精製し、前述の化合物について記載した抽出
及びクロマトグラフィー法により単離した。
化合物８の調製 ４−トリフルオロアセトアミドフェニルアセチルクロ
ライドを、ｐ−ニトロフェノール及びトリエチルアミン
のジクロロメタン溶液で処理した。ｐ−ニトロフェニル
エステルが抽出及びシリカゲルクロマトグラフィーによ
り得られた。
ｐ−ニトロフェニルエステルを、木炭に支持させた10
％のパラジウム上メタノール及び蟻酸中で撹拌した。水
素ガスを混合物に２時間バブンリングした。次いで混合
物を酢酸エチルで希釈し、濾過した。濾液を５％の炭酸
水素ナトリウム水溶液及び塩水で洗浄し、濾過して濃縮
すると、ｐ−アミノフェニルエステルが得られた。
このエステルを、無水琥珀酸及びトリエチルアミンの
ジクロロメタン溶液と反応させると化合物８が得られ
た。
化合物10の調製 ４−トルフルオロアセトアミドフェニルアセチルクロ
ライド及びフェノールをジクロロメタン中に溶解させ、
トリエチルアミンで処理した。前述の方法を用い、抽出
及びシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより生成物
（化合物10）が分離された。
化合物11の調製 ４−アセトアミドフェニル酢酸を、アセトニトリル及
び炭酸水素ナトリウム水溶液中４−アミノフェニル酢酸
及び無水酢酸から調製した。
４−ニトロフェノールを、HClのメタノール溶液中木
炭に支持させたH2/パラジウムを用いて還元し、アセト
ニトリル水溶液中無水酢酸でアセチル化することにより
２工程で４−トリフルオロアセトアミドフェノールを調
製した。
この酸及び４−トリフルオロアセトアミドフェノール
の混合物のジクロロメタン溶液を、ビス（２−オキソ−
３−オキサゾリジニル）ホスフィン酸クロライド（BOP
−Cl、ウィスコンシン州ミルウォーキーのアルドリッチ
・ケミカル・カンパニー（Aldrich Chemical Co.）より
入手した市販の試薬）及びトリエチルアミンで室温にお
いて1.5時間処理した。すでに記載した分離方法に従っ
て化合物11を得た。
化合物９の調製 同様な方法により、この酸及び４−アセトアミドフェ
ノールの混合物をジクロロメタン中BOP−Cl及びトリエ
チルアミと結合させた。すでに記載された方法による同
様な分離によりエステル（化合物９）を得た。
pKa及び安定度定数Ｋの決定： pKa及び安定度定数（Ｋ）の決定は全てマーテル（Mar
tell）の方法に従って実施する。この方法は、研究して
いる金属イオンの不存在下及び存在下における特定化合
物（約1.4mMの濃度）の電位差滴定による。支持電解質
としての0.1MのNaClO4を用い、イオン強度を一定に保持
した。全ての測定は窒素雰囲気下25℃±0.01℃において
実施した。
化合物Ｊの調製 ２−メチル−８−ニトロキナリジン（0.5g、2.66×10
-3モル）を、15mlのメタノール及び0.081mlの濃HCl（１
当量）と共に25mlの丸底フラスコに入れる。混合物を５
分間攪拌し、0.250gのパラジウムを炭素上に支持させた
ものを添加する。得られた混合物を水素ガスの雰囲気下
におき、ニトロ基を還元する。25分間の撹拌後、溶媒と
してヘキサン／酢酸エチル（1/1）を用いシリカゲル上
薄層クロマトグラフィーにより反応混合物について反応
の完了をチェックする。出発物質は観察されない。生成
物のRf値は0.85であり、ニンヒドリン試験では黒に着色
する。
還元した反応混合物を50mlの酢酸エチル（EtOAc）で
希釈し、セライト床で濾過し、真空中で濃縮する。得ら
れた油状物を再び50mlのEtOAcに溶解させ、炭酸水素ナ
トリウムの飽和水溶液、次いで塩化ナトリウムの飽和水
溶液で抽出し、硫酸ナトリウム上で乾燥させる。真空中
で溶媒を除去すると、0.353gの黄色い固体が得られる
（収率84％）。
CDCl3中における100MHz 1H−NMR（内部基準としてのT
MSに関して）:7.95（２本線、Ｊ＝7.92Hz、1H）、7.4〜
6.8（多重線、4H）、5.0（広幅１本線、2H）、2.75（１
本線、3H）。
化合物12の調製 化合物Ｊ（0.037g、2.34×10-4モル）を窒素雰囲気下
で25mlの丸底フラスコに入れる。化合物Ｊを溶解させる
ためにテトラヒドロフラン（THF;ml）を添加し、得られ
た溶液を−78℃に冷却する。ブチルリチウムの溶液（11
0ml、2.5Mヘキサン溶液）を５分間にわたってゆっくり
添加すると黒紫色の溶液が得られる。更に５分間撹拌し
た後化合物Ｂを添加し、得られた混合物を室温に暖め
る。溶液の色は明るい緑色になる。溶媒としてEtOAc/CH
2Cl2（1/1）を用いたシリカ上の薄層クロマトグラフィ
ーは生成物のRf値が0.4であることを示す。
真空中で溶媒を除去し、得られた物質を20mlのEtOAc
に再び溶解させ、0.5MのHCl及び塩化ナトリウムの飽和
水溶液で洗浄し、次いで硫酸ナトリウム上で乾燥させ
る。真空中で溶媒を除去すると、フラッシュクロマトグ
ラフィーで処理した後0.042g（収率40％）の化合物12が
得られる。
CDCl3中における100MHz 1H−NMR（内部基準としてのT
MSに関して）:10.4（広幅１本線、1H）、8.0（２本線、
Ｊ＝7.7Hz、1H）、7.7（２本線、Ｊ＝7.9Hz、1H）、7.4
〜6.8（多重線、7H）、4.2（ｐ、Ｊ＝5.2Hz）、3.35
（２本線、Ｊ＝20.1Hz、2H）、2.6（１本線、3H）、1.3
（３本線、Ｊ＝6.2Hz）。
化合物Ｋの調製 化合物12（0.010g、2.22×10-5モル）を5mlの丸底フ
ラスコに入れ、それに、1.5mlのメタノール及び8mgの固
体炭酸ナトリウム（8.88×10-5モル）、次いで200mlの
水を添加する。溶媒としてEtOAc/CH2Cl2（1/1）を用い
シリカ上のTLCにより反応を追跡した。生成物のRf値は
0.35であった。12時間後35℃の温度において反応を停止
する。
反応混合物をEtOAcで希釈し、飽和塩化ナトリウムで
洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥させる。その後真空中
で溶媒を除去すると、6.5mgの化合物Ｋ（収率83％）が
得られる。
CDCl3中における100MHz 1H−NMR（内部基準としてのT
MSに関して）:8（２本線、Ｊ＝7.1Hz、1H）、7.7〜6.0
（多重線、9H）、6.6（２本線、Ｊ＝7.1Hz、1H）、4.2
（多重線、2H）、3.3（２本線、Ｊ＝20.1Hz、2H）、2.7
（１本線、3H）、1.3（３本線、Ｊ＝.6Hz、3H）。
化合物Ｌの調製 化合物Ｋ（0.0065g、1.84×10-5モル）を5mlの丸底フ
ラスコに入れ、それに2mlのCH2Cl2、16.4mg（４×10-5
モル）のスクシンイミジルグリタリルクロライド（本明
細書中後述のアジポイル誘導体の場合と同様な方法で調
製した）及びトリエチルアミン（0.003ml、４×10-5モ
ル）を添加する。ただちに着色が観察される。溶媒とし
てEtOAc/CH2Cl2（1/1）を用いシリカゲル上TLCにより反
応を追跡すると、生成物のRf値は0.3である。反応混合
物を全部で30分間撹拌し、次いでEtOAcで希釈し、0.5M
のHCl及び飽和塩化ナトリウムで洗浄し、硫酸ナトリウ
ム上で乾燥させた、真空中で溶媒を除去し、フラッシュ
クロマトグラフィーで処理すると、3.5mgの化合物Ｌ
（収率34％）が得られた。
CDCl3中における100MHz 1H−NMR（内部基準としてのT
MSに関して）:8.0（２本線、Ｊ＝7.1Hz、1H）、7.8〜7.
0（多重線、10H）、4.2（多重線、2H）、3.3（２本線、
Ｊ＝20.2Hz、2H）、2.9（１本線、4H）、2.7（１本線、
3H）、2.6〜1.9（多重線、6H）、1.3（３本線、Ｊ＝6.5
Hz）。
化合物13の調製 化合物Ｌ（0.012g）を窒素ガス雰囲気下乾燥NMRに入
れ、次いで1mlの乾燥CDCl3を添加する。25mlのトリメチ
ルシリルブロマイド（TMSBr）を２回管に添加し、管を
まわし、その後38℃の水浴中に１時間置く。ホスホンア
ミデートのエチルエステルの分解を、NMRスペクトルデ
ータにより追跡する。
エチルエステルの分解が完了した後、NMR管の内容物
を乾燥した10mlの丸底フラスコに窒素雰囲気下で入れ
る。真空ポンプを用いて真空中で溶媒を除去する。得ら
れた固体を混合ヘキサンで洗浄し、再び真空ポンプを用
いて乾燥させる。
固体の酢酸ナトリウム（0.058mg）を前述の洗浄及び
乾燥した固体と混合し、10mlのメタノールを含む2mlの
アセトニトリル溶液を添加する。得られた混合物を実質
的に溶解している全てのものと共に撹拌するが、少量の
白色固体は溶解しないままである。この溶液を凍結さ
せ、親液化すると、黄色い不純物固体（38mg）が得られ
る。
化合物13の純度は、以下の勾配の逆相Ｃ−18カラムを
用い15分間ジメチルホルムアミド中に溶解させた後HPLC
により分析する。
％Ａ ％Ｂ 25 75 70 30 Ａ＝アセトニトリル Ｂ＝水−0.1％のトリフルオロ酢酸 3.8分に１つの主要なピークが観察される。そのピー
クを与える物質は０℃において５日間安定である。化合
物13は更に精製することなくキャリヤーとカップリング
し、免疫処置に使用される。
化合物12iの調製 化合物12（15mg、3.3×10-5モル）を、約1mlのCDCl3
と共に乾燥NMR管に添加する。溶液を撹拌し、35mlのTMS
Brを２回添加する。得られた溶液を更に撹拌し、次いで
水浴中で38℃に１時間加熱する。反応の進行をNMRによ
り追跡する。
反応の完了時に溶液を管から除去し、10mlの丸底フラ
スコに入れ、真空ポンプで乾燥するとオレンジ色の固体
が得られる。固体を10mlのヘキサンで２回洗浄し、再び
乾燥させる。
固体酢酸ナトリウム三水和物（45mg）をオレンジ色の
固体と混合し、50μのメタノールを含む2mlのアセト
ニトリル溶液を添加する。それによりオレンジ色の固体
は黄色い溶液となる。
HPLC及び以下の勾配の逆相Ｃ−18カラムを15分間用い
ることにより純度を再び分析する。
％Ａ ％Ｂ 25 75 90 10 Ａ＝アセトニトリル Ｂ＝水−0.1％のトリフルオロ酢酸 所望の生成物である化合物12iはカラムから5.80分後
に１つの主要なピークとして溶離する。この物質は3.5
〜7.3のpH値において少くとも11日間室温において安定
である。
化合物12iをジアゾメタンのメタノール溶液で処理す
ると、生成物が同一である証拠として対応するメチルエ
ステルが得られる。
分取HPLCにより得られた化合物12iのCD3CN中における
100MHz 1H−NMR（内部基準としてのTMSに関して）:9.0
（広幅１本線、1H）、8.3（２本線、Ｊ＝7.3Hz、1H）、
7.8〜6.8（多重線、9H）、3.3（２本線、Ｊ＝21.0Hz、2
H）。
基質リガンドエステルを製造する一般的操作 ４−アセトアミドフェニル酢酸（５ミリモル）、BOP
−Cl（５ミリモル）、トリエチルアミン（10ミリモル）
およびヒドロキシ化合物（5.2ミリモル）のジクロロメ
タン（10ml）中の懸濁液を室温（20〜25℃）で１時間か
くはんする。固相にシリカを用いたRf値は次のとおりで
あった：化合物 Rf値 溶媒 16 0.45 CH2Cl2/EtoH（20/1） 17 0.8 CH2Cl2/EtoHAc（1/1） 22 0.7 CH2/Cl2EtoHAC（1/1） 21 0.5 CH2/Cl2EtoHAC（1/1） 水（10ml、炭酸水素ナトリウムで塩基性にした）で処
理した後、有機相をデカントし、硫酸ナトリウム上で乾
燥する。溶媒を除去すると残留物が得られ、それは、上
記したTLC溶媒を用いたフラッシュクロマトグラフィー
後に下記のエステル反応物リガンド基質を与える。
化合物16 収率＝49％、CDCl3中100MHzにおけるプロトンNMR（内
部標準TMSに関し）:8.0（ブロード二重線、Ｊ＝7.2Hz、
1H）、7.7〜7.1（多重線、9H）、4.05（一重線、2H）、
2.75（一重線、3H）、2.1（一重線、3H）。
化合物17 収率＝62％。CDCl3中100MHzにおけるプロトンNMR（内
部標準TMSで）:7.8〜7.0（多重線、12H）、3.95（一重
線、2H）、2.0（一重線、3H） 化合物21 収率＝13％。ジメチルスルホキシド−d6中100MHzにお
けるプロトンNMR（内部標準TMSで）:7.6（多重線、2
H）、7.3（多重線、2H）、6.9（多重線、4H）、3.4（一
重線、2H）、1.9（一重線、3H）、1.8（一重線、3H）。
化合物22 収率＝58％。CDCl3中100MHzにおけるプロトンNMR（内
部標準TMSに関し）:7.6〜6.95（多重線、9H）、3.8（一
重線、2H）、2.1（一重線、3H）。
化合物20 化合物20は化合物５と同様に製造される。
化合物18の製造 α−ナフトール（0.3515g;2.44×10-3モル）をCH2Cl2
5mlに溶解し、生じた溶液を０℃に冷却する。塩化アセ
チル（0.26ml;3.66×10-3モル）をかくはん下に加え、
次にトリエチルアミン（1.02ml;7.32×10-3モル）を滴
加する。多量の沈殿が速やかに形成され、それがかくは
んを停止させる。さらにCH2Cl25mlを加え、反応混合物
に加温する。
CH2Cl2の最後に添加の５分後に、ヘキサン/CH2Cl2（1
/1）を溶媒として用いてシリカ上で薄層クロマトグラフ
を始めると出発物質を存在しないことが示される。
酢酸エチルを反応混合物に加え、反応混合物を水性炭
酸水素ナトリウム、0.5M−HCl、次いで飽和水性塩化ナ
トリウムで抽出する。その後有機層を硫酸ナトリウム上
で乾燥する。カラムクロマトグラフィーによる精製後に
透明液体63mgが得られる：収率＝42％。
CDCl3中100MHzにおけるプロトンNMR（内部標準TMSに
関し）:8.0〜7.2（多重線、7H）、2.45（一重線、3
H）。
化合物19の製造 ４−Ｎ−アセチルフェニル酢酸（0.00030g;1.55×10
-4モル）をメタノール5mlに溶解する。ジアゾメタンの
ジエチルエーテル中の溶液を、添加後混合溶液が黄色を
保つまで滴加する。陽イオン交換樹脂ビーズをH+形で反
応溶液に、溶液が無色になるまで混合する。
溶媒を減圧で除去すると0.032g（100％収率）になる
白色固体が得られる。CH2Cl2/EtOAc（1/1）を溶媒とし
て用いるシリカ上のTLCは残留出発物質のないきれいな
反応を示す。
CDCl3中100MHzにおけるプロトンNMR（内部標準TMSに
関し）:7.2（二重線、Ｊ＝7.7Hz、2H）、6.8（二重線、
Ｊ＝7.8Hz、2H）、3.95（ｓ、3H）、3.2（ｓ、2H）。
基質リガンドアミドを製造する一般的操作 カルボン酸（10ミリモル）、トリエチルアミン（20ミ
リモル）およびアミン（10ミリモル）のかくはんジクロ
ロメタン溶液（20ml）を10℃に冷却し、BOP−Cl（10ミ
リモル）を加える。溶解は典型的には25℃で30分内に生
ずる。反応混合物を室温で１時間かくはんする。EtOAc/
CH2Cl2を溶媒として用いるシリカ上のTLCにより反応の
進行をモニターする。化合物14はこれらの条件のもとで
0.6のRf値を示す。
水（20ml）および4M−HClを反応混合物に加えて１〜
1.5のpH値にする。沈殿したアミドを濾過する。残留有
機層を炭酸水素ナトリウムの溶液で洗浄し、次いで蒸発
させるとさらにアミド生成物が得られる。TLC溶媒でシ
リカ上でフラッシュクロマトグラフィーを行なうと精製
された生成物が得られる。
化合物14 収率＝51％。CDCl3中100MHzにおけるプロトンNMR（内
部標準TMSに関し）:10.0（ブロード一重線、1H）、8.7
（多重線、1H）、8.0（多重線、1H）、7.6〜7.1（多重
線、8H）、3.95（一重線、2H）、2.6（一重線、3H）、
2.2（一重線、3H）。
同様に化合物15 が製造される。
スクシンイミジルアジポイルクロリド（カップリング
剤）の製造 アジピン酸モノメチルエステル（5.4g、33.3ミリモ
ル）の塩化チオニル（15ml）中の溶液を40℃で２時間加
熱した。次いで混合物を濃縮し、減圧で蒸留（20mmHgで
沸点119℃）すると酸クロリドメチルエステル3.58g（60
％重量収率）が得られた。これをジクロロメタン20mlに
溶解し、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（2.75g、24.0
ミリモル）、次いでトリエチルアミン（4.2ml、30ミリ
モル）を加えた。混合物を10分間かくはんし、次いで酢
酸エチルで希釈し、0.5M−HClおよびブラインで洗浄し
た。溶液を無水硫酸マグネシウム上で乾燥し、濾過し、
濃縮するとメチルスクシンイミジルアジパート4.5g（8
7.5％重量収率）が無色油状物質として得られた。
プロトンNMR（CDCl3中）：δ3.73（一重線、3H）、δ
2.90（一重線、4H）、δ2.70（多重線、2H）、δ2.37
（多重線、2H）、およびδ1.79（多重線、4H）。
メチルスクシンイミジルアジパート（4.5g、17.5ミリ
モル）、クロロトルメチルシラン（11.1ml、87.5ミリモ
ル）およびヨウ化ナトリウム（13.1g、87.5ミリモル）
のアセトニトリル10ml中の溶液を12時間加熱還流した。
次いで混合物を室温に冷却し、酢酸エチルで希釈した。
反応混合物を５％亜硫酸水素ナトリウム水で有機溶液が
無色になるまで繰返し洗浄した。次いでブラインで洗浄
し、無水硫酸マグネシウム上で乾燥し、濾過し、濃縮す
るとアジピン酸モノスクシンイミジルエステル3.2g（71
％重量収率）が白色固体として得られた。
プロトンNMR（CDCl3中）：δ3.90（一重線、4H）、δ
2.70（多重線、2H）、δ2.4（多重線、2H）、δ1.80
（多重線、4H）。
アジピン酸スクシンイミジルエステル（1.00g、3.80
ミリモル）と塩化チオニル（5ml）との混合物を３時間4
0℃で加熱し、次いで室温に冷却し、減圧濃縮した。残
留物を乾燥ヘキサンとともに数時間かくはんし、油状物
質を分離し、真空で乾燥するとスクシンイミジルアジポ
イルクロリド0.97g（90％重量収率）が得られた。これ
を乾燥テトラヒドロフランに溶解して５モル溶液にな
し、そのままそれをタンパク質担体へのカップリングに
適する化合物の製造に用いた。
プロトンNMR（CDCl3中）：δ3.00（多重線、2H）、δ
2.90（一重線、4H）、δ2.70（多重線、2H）、δ1.80
（多重線、4H）。
ホスホナート化合物１および４とのタンパク質結合体
はホスホナートの冷水中の溶液〔２ミリグラム（mg）/m
l〕0.5ミリリットル（ml）をタンパク質（KLHまたはBS
A、5mg/ml）のリン酸ナトリウム緩衝液（pH7.2、0.2M）
中の溶液1.0mlに加え、４℃で２時間穏やかにかくはん
することにより製造される。
化合物１〜４のアミノベンジルホスホナートに対する
トリフルオロアセチル基の導入は塩化ホスホニルを必要
とする後の合成段階を簡単にする。化合物３および４の
ジピコリン酸部分は抗体とこれらの構造のフェノール部
分との間の付加結合相互作用を与える。
ｐ−トリフルオロアセトアミドベンジルホスホナート
のニトロフェニルエステルはニトロ基のアミン官能への
還元およびこのヘテロ二官能アジピン酸誘導体例えば記
載したスクシンイミジルアジポイルクロリドによるアシ
ル化によりハプテンを担体タンパク質にカップリングさ
せる図式中の中間体として有用である。フェノール環中
のＮ−ヒドロキシスクシンイミジル活性化エステル部分
（化合物２および４）は水性緩衝剤溶液中の担体タンバ
ク質（KLBまたはBSA）に対する効率的なカップリングを
可能にする。
スクシンイミジルグルタロイルクロリドを同様に製造
して使用した。
IV 結合体および接種材料の製造 ハプテンアナログ−リガンド分子とタンパク質担体例
えばキーホールリンペットヘモシアニン（KLH）との結
合体は、例えばMBS（ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−
ヒドロキシスクシンイミドエステル）のようなカップリ
ング剤で担体を活性化し、アナログ−リガンドのチオー
ル基に対するカップリングにより製造することができ
る。例えばリウ（Liu）ほか、バイオケミストリー（Bio
chem.）、80、690（1979）参照。またよく知られるよう
に、中間体結合基により化合物をその担体に結合させる
ことがしばしば有利である。
有用な担体はよく知られ、一般にタンパク質そのもの
である。そのような担体の適例はキーホールリンペット
ヘモシアニン（KLH）、エデスチン、チログロブリン、
アルブミン例えばウシ血清アルブミンまたはヒト血清ア
ルブミン（それぞれBSAまたはHSA）、赤血球例えばヒツ
ジ赤血球（SRBC）、破傷風毒素、コレラ毒素並びにポリ
（Ｄ−リシン:D−グルタミン酸）などである。
担体の選択は抗原の決定基部分よりも抗原の最終意図
用途により多く依存し、本発明に特定的には含まれない
基準に基く。例えば、結合体が実験動物に使用されれ
ば、個々の動物中で不適当な反応を生じない担体を選ぶ
べきである。
担体−ハプテン結合体は生理学的に許容される希釈剤
の水性組成物例えば生理食塩水、PBS、または無菌水に
溶解または分散させて接種材料に形成される。アジュバ
ント例えば完全または不完全フロインドアジュバントま
たはミヨウバンもまた接種材料中に含ませることができ
る。接種材料は、よく知られているように、抗体の生起
に用いる動物に抗体の誘導に十分な量で例えば注射によ
り導入される。
免疫原結合体の適例は、その合成を適応させて炭素原
子の直鎖をスペーシング成分としてフェノール基（アナ
ログ−リガンドエステルのアルコール部分）上に結合さ
せることによりホスホナートエステルから製造された。
免疫原結合体の他の適例はその合成を適応させて炭素原
子の側鎖をスペーシング成分としてアナログ−リガンド
の酸部分上に結合させることによりホスホンアミドから
製造された。アジピン酸エステルまたはグルタル酸エス
テル付加物のたわみ性炭素鎖が担体タンパク質に対する
共有結合的結合により課せられた配座拘束に基く免疫反
応性に対する偏りを減少させることが結論された。この
目的のために製造された二官能性試薬はまた担体のリシ
ン残基とのアミド結合の形成による結合に対し前活性化
カルボキシル基を供給する。この研究に用いた個々のカ
ップリング法は後に記載される。ホスホン酸エステルを
その構造のフェノール部分のアミノ基を通してキーホー
ルリンペットヘモシアニン（KLH）にカップリングさせ
た。
本発明に従って、中間体連結剤は好ましくは次のよう
に製造されたスクシンイミジルアジポイルまたはグルタ
ロイルクロリドである。
Ｖ 単クローン性受容体の製造 前記KLH結合体をマウス（129G1X+系）の免疫処置に使
用し、ニーマン（Niman）ほか、プロシーディングズ・
オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス
（Proc.Natl.Acad.Sci.）、USA、77、4524（1980）およ
びニーマン（Niman）ほか、「単クローン性抗体および
Ｔ細胞生成物（Monoclonal Antibodies and T−Cell Pr
oducts）」、カッツ（Katz,D.H.）編、23〜51〔CRCプレ
ス（CRC Press,Boca Raton,FL）1982〕に記載されたよ
うに単クローン性抗体を得た。本発明のハイブリドーマ
の形成に用いたリンパ球は任意の動物例えば霊長類、齧
歯類（例えばマウスまたはラット）、ウサギ、モルモッ
ト、ウシ、犬、ヒツジ、豚などから得ることができる。
適切なように、宿主を免疫原、この場合ハプテンアナロ
グ−リガンド、の注射により感作し、次いでブースター
を注射し、次いで脾臓を分離することができる。
骨髄腫細胞系はリンパ球と同じ種からであることが好
ましい。従って、融合ハイブリッド例えばマウス−マウ
スハイブリッド〔シュルマン（Shulman）ほか、ネーチ
ャー（Nature）、276、269（1978）〕またはラット−ラ
ットハイブリッド〔ガルフレ（Galfre）ほか、ネーチャ
ー（Nature）、277、131（1979）〕が典型的に使用され
る。しかし若干のラット−マウスハイブリッドもまたハ
イブリドーマの形成に首尾よく使用された〔ゴッデイン
グ（Goding）、「細胞融合による単クローン性抗体の生
成（Production of Monoclonal Antibodies by Cell Fu
sion）」、「ツールとしての抗体（Antibody as a Too
l）」、マーシャロニス（Marchalonis）ほか編、ジョン
・ワイリー・アンド・サンズ社（John Wiley ＆ Sons L
td.）、273頁（1982）〕。本発明における使用に適する
骨髄腫系にはMPC−11（ATCC CRL167）、P3X63−Ag8.65
3（ATCC CRL1580）、Sp210−Ag14（ATCC CRL1581）、
P3X63−Ag8U.1（ATCC CRL1597）、Y3−Ag1.2.3〔コレ
クション・ナショナレ・ド・クルチュレス・ド・ミクロ
オルガニスムズ（Collection Nationale de Cultures d
e Microorganisms,Paris,France）に寄託、No.I−07
8〕、およびP3X63Ag8（ATCC TIB9）が含まれる。非分
泌性マウス骨髄腫系Sp210またはSp210−Ag14は本発明に
おける使用に好ましい。
最後に生成されるハイブリドーマ細胞は、よく知られ
るようにそのような細胞に対する普通の試薬管内組織培
養法に従って培養することができる。より好ましくは、
同様によく知られた技術を用いてハイブリドーマ細胞を
動物中で培養し、生じた腹水から単クローン性受容体を
得る。腹水の生成に用いた動物はスクリップス・クリニ
ック・アンド・リサーチ・ファウンデーション（Scripp
s Clinic and Research Foundation,La Jolla,Californ
ia）のマウスコロニー中の交配めす129G1X+マウスであ
ったが、しかしマウス以外の動物をハイブリドーマの調
製に用いるとき、マウスまたはその動物型を腹水の生成
に用いることができる。
殊に、単クローン性受容体の適例はコーラー（Kohle
r）ほか、ネーチャー（Nature）、256、495（1975）の
標準ハイブリドーマ技術により生成された。特定的に
は、めす129G1X+マウスを結合体（例えばKLHに結合した
化合物４）100ミクログラムのリン酸塩緩衝食塩水（PB
S）、pH7.4と完全フロインドアジュバントとの1:1混合
物300ミクロリットル中の接種材料の腹腔内注射により
免疫処置した。２週間後にマウスに再び同様の方法でPB
S（pH7.4）と10mg/mlのミヨウバンとの1:1混合物300ミ
クロリットル中の前記結合体50ミクログラムを注射し
た。さらに８週間後にマウスをPBS（pH7.4）200ミクロ
リットル中の結合体50ミクログラムで静脈内免疫処置し
た。脾臓を４日後にマウスから取出し、脾細胞を骨髄腫
細胞に融合させた。
脾細胞をプールし、単個細胞浮遊液を作った。次いで
核形成脾細胞（1.4×108）を細胞融合促進剤（ポリエチ
レングリコール200）の存在下に３×107のSp210非分泌
性骨髄腫細胞に融合させた。個々の単クローン性抗体を
生成するハイブリドーマを、脾細胞を96ウェルプレート
に播種し、非融合骨髄腫細胞の成長を支持しない4500mg
/lグルコース（10％）、10％ウシ胎仔血清（FCS）、ヒ
ポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジン（すなわ
ちHAT培地）を含むダルベッコ変性イーグル培地（DME
M）中で成長させることにより選別した。
２〜３週間後に各ウェル中の細胞クローン上の上澄み
の試料をとり、ELISA検定（後記の酵素結合抗体免疫吸
着検定）により化合物４に対する抗体の存在について試
験した。陽性ウェルを限界希釈により２回クローン化し
た。２クローニング後、化合物４特異性抗体を生成し続
けたクローンを膨張させて多量の上澄みを生成させた。
ハイブリドーマおよびそれから生成され、ここに記載し
た単クローン性受容体は研究室呼称「P36D4」および「P
3 8D2」により確認され、その個々の物質は文脈から明
らかである。
他の２つの触媒単クローン性受容体は、免疫原として
抗原担体に結合した化合物2iを用いる他の融合により同
様に調製された。これらの２触媒受容体分子およびそれ
らのハイブリドーマは「P2 50D8」および「P2 57G4」
と称された。これらの２受容体は化合物５、９および11
を接触的に加水分解することができた。化合物７が接触
的に加水分解されたかどうかに関する証拠は現在明らか
でない。
他の32のハイブリドーマが抗原担体としてのKLHに結
合した免疫原として化合物13を用いて生起された。化合
物13の約25分子が毎KLH分子に結合し、同様の結合効率
がBSAで認められた。
免疫原は免疫を起させるために周囲血液pH値で少くと
も２日の半減期を有すべきである。先の研究〔バルトレ
ット（Bartlett）ほか、ジャーナル・オブ・ジ・アメリ
カン・ケミカル・ソサエティー（J.Am.Chem.Soc.）、10
3、654（1981）〕はアルキルホスホンアミダートが２〜
５のpH値範囲で単に分台の半減期を有することができる
が、pH8.5において安定性が５℃の温度で明確でないと
思われたことを示した。化合物13は室温および7.3のpH
値で11日の半減期を有することが認められた。3.5およ
び6.2のpH値で分解の微侯が認められなかった。
マウスを化合物13−KLH結合体で３〜４週間にわたっ
て高度免疫処置した。固相抗原としてミクロタイタープ
レートウェルに結合した化合物13−BSA結合体を用いるE
LISAで血清を検定した。クローン化したハイブリドーマ
もまたELISA検定を用いてスクリーニングした。
化合物13と免疫反応した32の単クローン性受容体の中
の８つは１つまたはそれ以上の反応体リガンドエステル
を接触的に加水分解した。これらの触媒のそれぞれを適
当なアナログ−リガンドにより阻害することができた。
従って、比較的高い割合の誘導単クローン性受容体がエ
ステル分解反応を触媒することができた。この比較的高
い割合の有用な受容体が誘導される理由は知られていな
いが、しかし、ホスホナート酸素原子またはアナログ−
リガンドのキノリン核に比較してホスホンアミダート基
窒素原子の存在に基くことができた。これらの８つの触
媒単クローン性受容体およびそれを分泌するハイブリド
ーマは研究室呼称「QPN1 7E5」、「QPN1 12C9」、「Q
PN1 13E10」、「QPN1 17G8」、「QPN1 21G2」、「QP
N1 22F5」、「QPN1 37G2」および「QPN1 44A2」によ
り確認される。接頭辞「QPN1」はこれらのハイブリドー
マおよび受容体を論ずるときにしばしば省略される。
ハイブリドーマはアメリカン・タイプ・カルチャー・
コレクション（American Type Culture Collection,Roc
kville,MD）に下記ハイブリドーマ寄託表に示されるよ
うに寄託された。
この寄託は、保管期間が寄託の日から30年、または寄
託当局における寄託に対する最新の請求後５年間、ある
いはこの出願から完成される米国特許の実施可能期間の
いずれか長いものであるべきであるブタペスト条件要件
に従ってなされた。ハイブリドーマは寄託当局において
生存していなくなれば再寄託される。
ここにしばしばハイブリドーマP3 6D4から生成さ
れ、高められまたは分泌された受容体の使用について説
明される。しかし、同様の結果がハイブリドーマP3 8D
2により生成される受容体を用いて得ることができ、ま
た得られたことが理解されるであろう。
本発明の単クローン性受容体はハイブリドーマを哺乳
動物例えばマウスの腹腔に、例えば注射により導入する
ことにより生成させることができる。好ましくは、既に
言及したように同系または半同系哺乳動物が米国特許第
4,361,549号に記載のように使用され、その開示は参照
によりここに加入される。ハイブリドーマの導入は適当
な成長期間、例えば１〜２週間、後に抗体を生成するハ
イブリドーマの形成を生じ、生成される受容体の高い濃
度を生じ、それを宿主マウスの血流および腹腔滲出液
（腹水）から回収することができる。宿主マウスはまた
それらの血液および腹水中に正常受容体を有し、正常受
容体の濃度は典型的には単クローン性受容体濃度の約５
％にすぎない。
ハイブリドーマ上澄み中に存在する単クローン性受容
体は精製することなく使用でき、あるいは受容体をマウ
スの腹水または血清から標準法例えば免疫吸着剤例えば
セフアロース（Sepharose）6Bまたは4B〔ファルマシア
・ファイン・ケミカルズ（Pharmacia Fine Chemicals,P
iscataway,NJ）製〕に結合したAD169感染細胞を用いる
アフィニティークロマトグラフィーを使用し次に酸性緩
衝液例えばグリシン塩酸塩を約2.5のpH値で用いて免疫
吸着剤から溶出させることにより回収することができ
る。
この研究において、IgG画分は典型的にはマウス腹水
から45％飽和硫酸アンモニウムにより沈殿させ、次いで
塩化ナトリウム溶出でDEAE−セファセル（Sephacel）上
のクロマトグラフィーにより得た。100mM塩で溶出させ
た画分を透析し、濃縮した。タンパク質濃度はロウリー
（Lowry）法により測定した〔ジャーナル・オブ・バイ
オロジカル・ケミストリー（J.Biol.Chem.）、193、265
（1951）〕。生じた分離IgG画分を含む濃縮溶液は典型
的には、ハイブリドーマP3 6D4またはP3 8D2から分泌
されたレセプターに対してトリスーHCl（50mM、pH6.5）
を用いて20mg/mlで、またハイブリドーマQPN1 7E5、QP
N1 12C9、QPN1 13E10、QPN1 17G8、QPN1 21G2、QPN
1 22F5、QPN1 37G23およびQPN1 44A2から分泌された
レセプターに対して0.01Mアジ化ナトリウムを含む50mM
リン酸ナトリウム（pH8.0）を用いて４〜5mg/mlでレセ
プターの貯蔵溶液に調製した。
VI 酵素結合抗体免疫吸着検定（ELISA） リガンドの結合および化学修飾の効果はELISAにより
力価の範囲内の一定濃度で抗体で、試薬またはリガンド
濃度を変えて検定した。試薬とハプテンとの1000:1比未
満で力価が５％低下すれば阻害が報告される。
検定は平底ポリビニルミクロタイタープレート〔ダイ
ナテク（Dynatech,Alxandria,VA）製〕中で行なった。
例示的には、ウェルを、リン酸塩緩衝食塩水（PBS）中
の抗原リガンドとしてBSAに結合した化合物４を含む溶
液で、溶液50ミクロリットル毎ウェルを用いてコートし
た。リガンドは１ミクログラム毎ミリリットルでコート
された。次いでプレートを乾燥オーブン中37℃で一液イ
ンキュベートした。乾燥したプレートは使用するまで４
℃で貯蔵した。ELISA検定の前に、乾燥プレートを２
回、各0.1％ポリオキシアルキレン（20）ソルビタンモ
ノラウラート（ツイーン20）および0.02％チメロサール
（Thimerosal）（ナトリウムエチルマーキュリチオサリ
シレート）〔シグマ（Sigma,St.Louis,MO）製〕を含む1
0ミリモル（mM）PBS、pH7.4、で２分間洗浄することに
より戻した。
非特異的結合を低下させるために、ハイブリドーマ上
澄みを、希釈剤として0.1％BSAを含む洗浄緩衝液中に1:
2に希釈した。その後希釈したハイブリドーマ上澄み50
ミクロリットルを各ウェルに加え、ジャイロシェーカー
上で４℃で１時間インキュベートして単クローン性抗体
含有上澄みを結合した化合物４に接触させた。各２分の
２回の洗浄後、1:1000に希釈したペルオキシダーゼ標識
ヤギ抗マウスIgG＋IgM〔タゴ（Tago,Burlingame,CA）
製〕50ミクロリットルを各ウェルに加え、反応混合物を
４℃で１時間インキュベートして標識抗体を結合単クロ
ーン性抗体に結合させた。
結合ペルオキシダーゼ活性の検定に用いた基質は使用
直前に調製し、0.12％H2O2を含む80mMクエン酸塩−リン
酸塩緩衝液、pH6.0、中のｏ−フェニレンジアミン〔シ
グマ（Sigma,St.Louis,MO）製〕400ミクログラム/mlか
ら構成した。最後の２回の洗浄後、基質溶液50ミクロリ
ットルを各ウェルに加え、暗所で15分間発色させた。４
モル（Ｍ）H2SO425ミクロリットルを各ウェルに加える
ことにより発色を停止させ、492ナノメートル（nm）に
おける光学濃度をマルチスカン（Multiskan）ELISAプレ
ートリーダーで測定した。化合物４に対して生じた多ク
ローン性抗体はアナログ−リガンドに免疫反応（結合）
することが認められ、同様に化合物13に対して生じた多
クローン性抗体は類似体−リガンドと免疫反応した。
VII 加水分解検定および動力学的測定 反応物リガンド例えば化合物５および20に対するエス
テル開裂を７−ヒドロキシクマリンおよび４−メチル−
７−ヒドロキシクマリンが生成するときの螢光の増加の
測定により測定した。パーキン・エルマー（Perkin−El
mer）LS−５螢光分光計を、励起に355ナノメートル（n
m）を用い発光を455nmで測定する所定波長で操作した。
クマリンエステル５の貯蔵溶液をジオキサン中に調製
し、トリス−HCl（50mM、pH7）またはリン酸ナトリウム
（50mM、pH4〜９）中に所望濃度に希釈した。
反応は23℃で行ない、抗体溶液（1mg/ml）のアリコー
トを基質溶液に加えて100nMの最終タンパク質濃度を与
えることにより開始させた。最終螢光値は豚肝臓エステ
ラーゼにより基質の加水分解により測定した。観察され
た反応速度は自発加水分解に対して補正した。反応動力
学は擬一次条件下の初速度の測定により調べた。活性タ
ンパク質濃度は反応の終りに螢光値から補外した。動力
学的パラメーターはデータを双曲線カーブに適合させ、
二重逆数プロットから得た。阻害定数は少くとも５つの
阻害剤濃度でラインウィーバー・バーク（Lineweaver−
Burk）プロットデータから決定した。データはすべて最
小自乗法分析により調べた。
化合物14および15に対するアミド開裂は遊離アミノキ
ナルジンまたはアミノナフタレンの生成について、遊離
アミノキナルジンまたはアミノナフタレンのジアゾ化試
薬による誘導体化から生ずるアゾ染料の増加の測定によ
り分析することにより検定した。
触媒反応は単クローン性抗体５ミクロモル（μＭ）、
アミド反応物リガンド基質50〜75μＭおよび下記緩衝液
を含む全量100ミクロリットル（μ）の反応混合物を
調製することにより行なった。上記混合物に含まれる緩
衝液は用いるpHにより次のように変更した:pH5、10ミク
ロモル（mM）酢酸ナトリウム、10mM塩化ナトリウム;pH
7.2、10mMリン酸ナトリウム、0.15モル（Ｍ）塩化ナト
リウム;pH8.0、50mMリン酸ナトリウム。この検定でスク
リーニングしたアミド含有基質をジメチルホルムアミド
（DMF）の100倍濃貯蔵溶液１μ中の上記混合物に加え
た。単クローン性抗体は濃貯蔵溶液から上記混合物に加
えた。生じた混合物を96ウェル平底ミクロタイタープレ
ート〔コスター（（Costar,Cambridge,MA）製〕のウェ
ルに入れ、湿り蒸気環境室中に23℃で維持した。次いで
アミノキナルジンまたはアミノナフタレンの生成を、
２、３、５または６日後に下記のように検定した。
触媒した反応により生じたアミノキナルジンまたはア
ミノナフタレン生成物は初めに5M−HCl20μ、アセト
ン80μおよび0.5％（w/v）亜硫酸ナトリウム10μを
反応混合物に混合して第２混合物を形成し、第２混合物
を室温で３分間維持することにより測定した。その後、
2.5％（w/v）スルファミン酸アンモニウム10μを加え
て第３混合物を形成し、それを室温で２分間維持した。
さらに0.5（w/v）Ｎ−（１−ナフチル）エチレンジアミ
ン二塩酸塩10μを加えて第４混合物を形成し、次いで
それを室温で15分間維持した。その後第４混合物中に存
在する生じたアゾ染料をモデルEL309自動化ミクロプレ
ートリーダー〔バィオーテク・インストルメンツ（Bio
−Tek Instruments,Winooski,VT）製〕を用いてアミノ
キナルジンに対し540ナノメートル（nm）で吸光度分光
法により測定した。
この検定を用いて10μＭのアミノキナルジンの存在を
肉眼で認めることができた。ナノモル量が自動化マイク
ロプレートリーダーで検出できた。
VIII タンパク質の修飾および不活性化 螢光生成物の導入なくジオキサン中の活性化したエス
テル（化合物８）をIgG（5mg/ml）のトリス−HCl（50m
M、pH6.5）中の溶液にエステル（化合物８）５モル毎モ
ルIgGの比で加えることにより抗体調製物を不活性化し
た。活性の喪失がクマリンエステル（化合物５）との反
応により確認された。
類似の方法で試薬のジオキサン溶液を既知濃度で抗体
を加えることによりタンパク質修飾を行なった。溶液を
30分間インキュベートした後セファデックス（Sephade
x）G25に通して濾過した。残留活性を対照試料と比較し
た。エステル（化合物８）で不活性化したIgG（5mg/m
l）のアリコートを４容積のリン酸塩緩衝液（50mM、pH4
〜９、1pH単位間隔）で希釈した。pH変化を記録し、試
料を４℃で24時間貯蔵した。各試料を0.2Mリン酸塩緩衝
液pH7中のクマリンエステル（化合物５）の溶液50容積
中へ希釈することにより活性を検査し、加水分解速度を
対照試料と比較した。
IX 免疫検定およびエステル分解検定により選別した単
クローン性抗体 多クローン性受容体を使用できるけれども、本発明は
好ましくは単クローン性受容体を用いる。単クローン性
受容体は所定特異性を有する均一免疫グロブリンの連続
源を与える。単クローン性抗体がないと、単に免疫応答
の変動が、同一動物種内でも結果の再現を非常に困難に
する〔ミルステイン（C.Milstein）、サイエンス（Scie
nce）、231、1261（1986）〕ためとしても障害に遭遇す
る。
この研究の方策は所定免疫処置プロトコルからできる
だけ多くの特有のクローン特異性を発生させることおよ
びこれらの中で免疫反応性についで初期選別することで
あった。相当の力価の抗体を生ずるハイブリドーマのみ
をエステル分解検定に考慮した。従って、典型的な調製
において、抗ハプテン抗体を分泌する約50〜100クロー
ンが化合物4iを免疫原として用いた特定融合試験で確認
された。この約2/3が培養において生存しなかった。残
りをサブクローンし、そのアイソタイプを決定した。相
当の力価（1:64より大きい）のIgGを生成するハイブリ
ドーマを腹水腫瘍中で増殖させて抗体を多量に生成させ
た〔ニーマン（Niman）ほか、「単クローン性抗体およ
びＴ細胞生成物（Monoclonal Antibodies and T−Cell
Products）」、カッツ（D.H.Katz）編、〔シー・アール
・シー（CRC,Boca Raton,FL）、1982〕、23〜51頁〕。
螢光エステル分解検定に対し、エステル分解検定のた
めに設計した基質は７−ヒドロキシクマリンまたは４−
メチル−７−ヒドロキシクマリンとそれらのアシル化誘
導体との螢光の大きな差異に基いた。クマリンエステル
の加水分解における螢光の変化はナノモル濃度で容易に
検出することができる。フェノール誘導体例えば化合物
4iを免疫原として用いた場合、または二環化合物例えば
キノリン誘導体様化合物13を免疫原として用いた場合に
クマリン環のフェノール特性がそれをハプテン結合部位
中へ収容することを可能にする。
トリフルオロアセトアミドフェニルアセチルエステル
は加水分解の程度に従って挙動しそれに比例して455nm
（355nmで励起）における螢光強度を示した。７−ヒド
ロキシクマリンの螢光強度はpH依存性であり、7.0以上
で鋭敏に増加する。検定のためのpHの実用範囲はpH8.0
以上のエステル化合物５の加水分解の速やかな自発速度
により制限される。初めにエステルをタンパク質の濃度
より約４倍大きい濃度で用い、混合物をpH7.2で10分間
インキュベートした。バックグラウンド以上の螢光の変
化を記録した。
１研究において、２つの別個の融合試験からホスホナ
ート2iに対する28の単クローン性抗体ハプテン抗体を検
定した。これはいずれも螢光検定においてクマリンエス
テル（化合物５）と反応性でなかった。ハプテンとして
の化合物4iに対する抗体を同様に検定した。12のガンマ
グロブリンが前記のようにスクリーニングされた。化合
物５はこの大きいハプテンのアシル部分においてのみ相
同であるが、しかし、これらのうち３つを除いてすべて
ここに記載したELISA検定において小さいホスホナート
２と交差反応した。このうち２つに対し、インキュベー
ションの初めの５分中に起る螢光変化が認められ、それ
は完全加水分解に対するものの約５％に相当する。加水
分解のバックグラウンド速度はこの初期反応が安定した
後回復した。
従って、単エステル化合物５は少くとも螢光法を用い
るこれらの活性化の確認に十分であった。しかし、これ
はクマリンエステルを包含しない狭い構造特異性を有す
ることができる他の活性の存在を精密には確認しない。
この点は次の研究により単クローン性受容体P3 6D4に
対して示された。
Ｘ 活性化したエステルの単クローン性受容体P3 6D4
結合部位指向トランスアルキレーション A.タンパク質に対するトランスアシレーション この抗体仲介エステル分解の性質は、反応の特異性お
よび動力学を含めて上に記載した。反応の化学量論およ
び生成物の化学的挙動から安定なアシル化した抗体が結
合部位中の求核基に対するエステルのトランスアシレー
ションから形成されるとの仮定が導かれた。
アシル化誘導体のエステル分解による７−ヒドロキシ
クマリンの抗体増強生成はトリフルオロアセトアミドフ
ェニルアセチル化合物５に特有である。この過程は化合
物５のトリフルオロメチル基に代るメチル基の明らかに
小さい構造変化を有するクマリンエステルで検出されな
い。反応性Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（化
合物６）もまた抗体と特異的に結合して不活性生成物を
生ずるので、反応はおそらくこの脱離基によって規定さ
れない。反応の停止は螢光の増加速度がバックグラウン
ド水準へ戻ることにより認められる。螢光の正味の変化
は加えたタンパク質の量に比例する。この濃度はロウリ
ー（Lowry）検定〔ロウリー（Lowry）ほか、ジャーナル
・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（J.Biol.Che
m.）、193、265（1951）〕から独立に知られ、IgGの平
均分子量を150,000であると仮定すると、化学量論はエ
ステル１モル毎結合部位モルの反応に一致する。反応は
二次動力学に従って進行し、初速度は酵素様飽和を示
す。
予備的観察にはまた速度のpH依存性が含まれた。pH7
と比較してpH8における最も穏やかな速度上昇が活性部
位塩基または求核試薬のイオン化を示唆する。活性タン
パク質が高いpH値またはヒドロキシルアミンに対する不
活性生成物の暴露により回収されたので、この生成物は
結合部位の特定残基はアシル化される化学修飾タンパク
質として系統的に示された。この反応を遮断するホスホ
ナートアナログ−リガンド（化合物1iおよび3i）の能力
がその阻害定数に関して示される。２阻害剤（化合物1i
および3i）に対する阻害定数は化合物５との化学量論的
反応でそれぞれ100nMおよび35nMに評価された。一方、
化合物７で認められた接触反応においてこれらの化合物
はそれぞれ0.80ミクロモル（μＭ）および0.16μＭの阻
害定数Kiを有する。
さらにチロシンおよびヒスチジン特異性試薬によるタ
ンパク質の不活性化が認められた。ハプテンはこの不活
性化もまた遮断することができる。テトラニトロメタン
またはジエチルピロカーボネートでトランスアシル化生
成物を初し、次いでpH9.0において脱アシル化すること
によりアシルイミダゾールまたはアシルチロシンの存在
の間を識別することができない。アシル化したタンパク
質はどちらの試薬によっても不可逆不活性化から保護さ
れる。これは単にアシル基の共有結合および非共有結合
相互作用が結合部位におけるヒスチジンのカルボエトキ
シル化およびチロシンのニトロ化をともに妨害するのに
十分であることを意味する。
ジピコリン酸を含むハプテンの使用を支持する初めの
意図はリガンドが金属キレートとして免疫的に認識され
るかどうかを決定することであった〔レアドン（Reardo
n）ほか、ネーチャー（ロンドン）〔Nature（Londo
n）〕、316、265（1985）〕。免疫原としてハプテン−
担体結合体上の金属イオン配位を課する試みを行なわな
かったけれども、抗ハプテン抗体がキレート形態を許容
できる可能性が残った。従って、クマリン試薬（化合物
５）による抗体増強エステル分解に対する添加ピコリン
酸および添加亜鉛の効果を調べた。主反応に対する効果
が100ミリモルまでの添加亜鉛およびピコリン酸で認め
られなかった。痕跡量の金属イオンの包含が反応に作用
させるために加えたEDTAの破壊により排除された。
トランスアシレーション機構に対して提案された作業
仮説はヒスチジン包含の意味および反応物リガンドと抗
体との間の共有結合の明らかに異常な形成を考慮する。
共有結合機構はホスホナートエステルにより示唆されな
いので、観察された機構は活性の研究に用いた基質の個
々の選択の結果である予期機構の経路からの偏りを示す
ことができた。
ヒスチジンのトランスアシレーションにおける求核試
薬としての触媒的役割はイミダゾールに観察された求核
／酸−塩基触媒二元性をほのめかす〔ベンダー（Bende
r）ほか、「酵素触媒作用の生物化学（The Bioorganic
Chemistry of Enzymatic Catalysis）」、150頁、〔ワ
イリー（Wiley,New York）、1981〕）。イミダゾールに
対してその機構の選択がトランスアシレーション中の脱
離基の塩基性度により決定される。イミダゾールがタン
パク質構造により与えられる活性部位の関係において、
この機構の選択は酵素による共有結合または非共有結合
触媒作用として表わされよう。この実証にはエステル基
質を修飾して反応中に排出されるフェノラート（脱離
基）の塩基性度を変化させ同時に結合に適切な構造の類
似を保持することが必要であった。
B.エステラーゼ活性：溶媒に対するトランスアシル化 アナログ−リガンド（またはハプテン）により示唆さ
れた脱離基構造はカップリング付加物の部位を共有する
ための短かいパラ置換基による二置換フェノール環であ
る。アセトアミド基を遊離ハプテンアナログ−リガンド
阻害剤中のこの結合の代りに用いた（化合物1iおよび3
i）。類似の反応体リガンド基質はエステルのアルコー
ル部分として２−ピコリニルカルボキサミドメチル−４
−アセトアミドフェノールを有するであろう。
最初の試験として、ホスホナート（化合物1i）に類似
する４−アセトアミドフェノールのエステル（化合物
７）を調製した。構造上重要なオルト置換基が存在しな
いとエステルの結合ポテンシャルが減少できるであろう
が、しかしエステル結合の化学的反応性に激しい影響を
与えないであろう。結合の差異はこの構造単位により異
なるホスホナート（化合物1iまたは3i）の阻害定数を比
較することにより検定することができる。セクションＸ
（Ａ）に示したように、２阻害剤（化合物1iおよび3i）
に対する阻害定数は化合物５との化学量論的反応でそれ
ぞれ100nMおよび35nMに評価された。（化合物７）で認
められた接触反応においてこれらの化合物はそれぞれ0.
80ミクロモルおよび0.16ミクロモルの阻害定数Kiを有し
た。おそらく桁の大きさの結合寄与がこの構造のためで
ある。
そのようなエステルおよびそれらの加水分解生成物の
間に分光学的差異がなく、プロセスのクロマトグラフ分
析が推奨された。第３図を参照すると化合物（５μＭ）
およびハイブリドーマP3 6D4からの単クローン性抗体
（0.1μＭ）のリン酸塩緩衝液（50mM、pH8.0）中の混合
物を高速液体クロマトグラフィー（HPLC）により時間中
分析した。エステルの促進加水分解はそのピークの低下
および予期生成物に相当する２つの新ピークの同時生成
から明らかであった。これらの条件下にエステルは60〜
80分中に完全に消費され、その時間中にバックグラウン
ド速度が約12〜16％の加水分解を占める。クロマトグラ
フのプロフィルは豚肝臓エステラーゼによる処理により
生じたものと同様である。クマリンエステル（化合物
５）との化学量論的反応において不活性であった非特異
性抗体または抗ハプテン抗体はこの能力を示さない。
厳密な反応物リガンド基質特異性は、芳香族環中の種
々の置換型変化を有するアリールエステルによる加速加
水分解を検出できないことにより認められる。表１を参
照すると、スクシニル化エステル（化合物８）は相当す
るアセトアミド（化合物７）より多少遅い速度で受容体
により加水分解された。この速度の差異はまた豚肝臓エ
ステラーゼで認められる。それはタンパク質と相互作用
する荷電スクシナートの好ましくない静電気あるいは疏
水性抗体結合部位または酵素用語で活性部位に結合する
親水性リガンドの不利益を意味することができる。基質
として許容されない類似のエステルには化合物９が含ま
れ、それは化学量論的反応においてもまた認められたの
でトリフルオロメチル基の絶対的要件を示す。
＊ 単クローン性抗体（ハイブリドーマP3 6D4から）
によるおよび豚肝臓エステラーゼ〔シグマ・ケミカル社
（Sigma Chemical Co.,St.Louis,MO）、EC3.1.1.1〕に
よるカルボン酸エステルの加水分解を分析用RP−C18カ
ラム〔バイダク（Vydac）218TP54〕上のイソクラティッ
クエリューション〔アセトニトリル：水＋0.1％トリフ
ルオロ酢酸（35:65）〕によるHPLCにより、1.0ml/分の
流量および245nmにセットした検出器で測定した。初期
基質濃度は５ミクロモルであり、内部標準（アセトフェ
ノン）の濃度は50mMリン酸塩緩衝液pH8.0中10ミクロモ
ルであった。保持時間（分）は次のとおりであった：ア
セトフェノン、5.0;化合物７、8.3;化合物８、6.7;化合
物９、4.1;化合物10、11.1（40％アセトニトリル溶
離）；化合物11、82。抗体濃度は15ミクログラム/ml
（0.1ミクロモル）であり、エステラーゼの濃度は5.5ミ
クログラム/mlであった。反応混合物は25℃に保ち、ア
リコートを２〜20分間隔で分析した。３個またはそれ以
上の測定値を用いて曲線をプロットし、それから反応の
半減期を評価する（第３図参照）。
a.エステルはバックグラウンド加水分解速度より速く消
費されなかった。
b.反応は非常に速くHPLCにより正確に測定できない。
c.速度定数はエステルの５濃度で初期速度を測定するこ
とにより分光測光（245nm）で決定した。
フェノールのアセトアミド基により課せられた特異性
が一層顕著である。フェニルエステル（化合物10）は４
−アセトアミドエステル（化合物７）とほぼ同じ反応性
であり、クマリンエステル（化合物５）よりもハプテン
構造に一層一致する。さらに再び受容体は加水分解速度
に対する影響を有しない。化合物７のトリフルオロアセ
チルおよびアセチル基が相互交換されたエステル（化合
物11）は、フェノールおよびベンジル部分の類似性がこ
の種の相互交換を可能にすれば結合部位中のエステル結
合の逆配向に対して特有の選択を与える。しかし、この
可能性はこのエステルの加速加水分解により示されな
い。一方、これらのエステルのすべての加水分解は豚肝
臓の無差別のエステラーゼにより促進される。化学的選
択性は触媒抗体のきわだった特徴であり、免疫認識の精
巧な結合特異性の反映と考えることができる。
化合物７で認められた飽和速度が緩衝剤水溶液中のそ
の限定された溶解度の結果でなかったことを示すために
化合物８を調製することが望まれた。スクシニル化エス
テル（化合物８）は100ミクロモルまでの濃度でリン酸
塩緩衝液（50mM、pH8.0）中に容易に溶解するが、化合
物７の溶液は15ミクロモル以上の濃度で多少濁る。
反応動力学は245ナノメートルにおける吸収変化によ
り分光測光的に測定した。擬一次速度は酵素様飽和を示
し、第４図に示されるように、ホスホナートアナログ−
リガンドはラインウィーバー・バーク分析において競争
的阻害剤として挙動する。これらの基質で得られた動力
学的パラメータは表２にホスホナート（化合物３）で得
られた阻害定数とともに示される。これらの条件下にバ
ックグラウンド速度以上の促進は化合物７に対して約96
0倍、および化合物８に対して約200倍である（バックグ
ラウンド加水分解速度について補正した）。
＊ 表２に示した動力学的パラメーターはエステル（化
合物７および８）の単クローン性抗体P3 6D4による加
水分解に対してである。サーモスタット調温セルホルダ
ーを備えたパーキン・エルマー・ラムダ4B分光光度計を
用いて245nmで吸収変化を測定した。リン酸塩緩衝液（5
0mM、pH8.0）中0.5〜50ミクロモルの濃度で基質を入れ
たセルを25℃で前平衡させた。貯蔵溶液中の活性IgGの
濃度は、クマリンエステル（化合物５）と反応させ、ヒ
ドロキシクマリンの生成を螢光により測定することによ
り見出した。動力学的試験は100nMIgGを与えるように計
算した抗体貯蔵溶液（50mMリン酸塩緩衝液、pH8.0中）
のアリコートの添加により開始した。混合物を２〜３分
間平衡させ、次いで速度を次の10分間の間測定した。完
全加水分解に対する吸収変化をエステラーゼによる処理
により測定した。動力学的パラメーターはラインウィー
バー・バークプロットから得た（第４図参照）。阻害定
数は化合物３の少くとも４つの阻害濃度によるプロット
の傾斜から決定した。データは線形回帰により解析し
た。
これらの測定を行なったpH値は多分最適ではない。予
備的指標はこの反応が先に論じたクマリンエステルによ
るトランスアシレーションよりもpH値に対し一層鋭敏で
あることを示唆する。触媒反応はpH7.0でほとんど検出
できない。一層の動力学的研究はこれらの基質による真
の速度促進を規定することができる。ピコリニル基を含
むハプテンのすべてのエピトープを含むエステルに大き
い速度差を予想することができる。
エステル化合物７および抗体の反応混合物に対するピ
コリン酸またはピコリン酸および塩化亜鉛の添加は観察
された速度に対する影響を有しなかった。これは結合部
位がハプテン構造の２つのフラグメントを同時に収容で
きないことを示唆するが、しかし決定的には示さない。
１つ以上の基質または基質および補助因子に同時に結合
する酵素の能力に関連するので、その状態が確認に非常
に重要であろう。この状態にはおそらく水分子が結合部
位の充填においてエステルに対し相補的であるような相
互作用が含まれる。
C.求核対一般塩基機構および触媒作用 ヒスチジンがエステル分解抗体の活性に臨界的である
ことの指標はトランスアシレーションの機構に関する最
初の手がかりを与えた。イミダゾールの求核特性はよく
確認されている。しかし、酵素が求核触媒作用のために
ヒスチジンのイミダゾール基を用いる証拠は存在しな
い。一方、一般酸−塩基触媒作用におけるヒスチジンの
イミダゾール基の機能は酵素機構中に広く認められてい
る〔ウオルシュ（C.Walsh）、「酵素反応機構（Enzymat
ic Reaction Mechanisms）」、43頁、フリーマン（Free
man,San Francisco）、1979〕。
求核および一般塩基触媒としてのイミダゾールの二元
的役割がエステル加水分解の機構に関して理解される。
これらの機構間の転移は２つの可能な四面体中間体から
の生成物形成の相対速度：アシル基に対するイミダゾー
ルの付加から誘導されるもの対ヒドロキシド付加から誘
導されるもの、により決定される。比較的不安定な７−
ヒドロキシクマリンエステルはイミダゾール付加物を形
成し、それがクマリンアルコキシドの喪失によりアシル
イミダゾール中間体に容易にこわれることができる。こ
の段階は安定性の小さいアルコキシドを形成する劣った
脱離基で一層困難になる。７−ヒドロキシクマリン（pK
a8.3）は４−アセトアミドフェノール（pKa9.9）より実
質的に良好な脱離基である。４−アセトアミドフェニル
エステル化合物５は従って水またはヒドロキシドと四面
体付加物を形成し、おそらくその分解が触媒される（第
５図参）。
別の機構の存在に対する証拠として、抗体結合部位と
化合物５との反応の生成物が化合物７との触媒反応中の
中間体でないことが決定された。実際に化合物５を受容
体と化合物７との混合物に加えるとそれが触媒の特異的
不活性化剤として作用する。受容体が基質化合物７で顕
著な不活性化なく数百倍も回転することが認められるの
で、２つのエステルはかなり正確に識別される。両機構
を通る受容体による触媒作用は結合相互作用がこれらの
２段階過程中のいずれかの遷移状態を安定化できること
を意味する。しかし、設計目的のみに対し一般塩基過程
が適切であり、第２段階（生成物への分解）が律速であ
る。
この一般塩基機構を通る触媒作用に対する結合の寄与
は４−アセトアミドフェニルエステル（化合物７）およ
び単純フェニルエステル（化合物10）の異なる挙動によ
り最もよく示される。脱離基としてのフェノール（pKa
9.89）は４−アセトアミドフェノールに等しく、しかも
化合物10の加水分解は受容体P3 6D4により触媒されな
い。どちらも化学量論的反応が明らかでないけれども化
合物10はアシル基に対して穏当な構造を有する。
従って、このリガンドはタンパク質に結合できるけれ
ども、相互作用は固有のエステラーゼ機能の発現に適当
でない。化合物７のアセトアミド基に対する結合の効果
は律速遷移状態の安定化あるいはその遷移状態に比較し
て四面体中間体の不安定化に十分である。
基質構造の一層の改善はピコリナート置換基の付加に
おけるように、触媒作用における結合相互作用の完全な
大きさを明らかにするであろう。この系において、低い
KM値が触媒作用に対する付加的結合相互作用の寄与をつ
いには圧倒する不利益が存在する。遷移状態相補性基準
はKcat/KMが最大化される傾向があることを確信させる
ことができ、Kcat/KMの所定値で速度（Kcat）の最大化
は基質（高KM）の弱い結合に依存する〔フェルシュト
（A.Fersht）、「酵素構造および機構（Enzyme Structu
re and Mechanism）」、２版、311〜346頁、フリーマン
（Freeman,San Francisco）、1985）〕。
VI 他の８単クローン性受容体の結合部位により指向さ
れるトランスアシレーション A.反応体リガンドとの反応性 種々の触媒活性が21G2、7E5、37G2、13E10、12C9、44
A2、17G8および22F5と称される８つの単クローン性受容
体により示される。この多様性は加水分解をそれらが触
媒する反応体リガンド基質、およびこれらの反応体リガ
ンド基質の自発バックグラウンド加水分解速度と比較し
て認められた加水分解速度の両方に関して示される。10
基質に対する予備的相対反応性は表３に示される。
1.触媒および自然加水分解に消費された混合反応体リガ
ンドの百分率として示した予備初期加水分解。「−」＝
加水分解が認められず。反応はすべて、他に記載しなけ
れば50mMリン酸塩緩衝液中のpH8.0で行なった。加水分
解百分率は下記を除いてヒタチ（Hitachi）モデル655A
−12液体クロマトグラフをC18バイダク201TP54カラムで
用いたHPLCにより測定した。アセトニトリルと0.1％ト
リクロロ酢酸を含む水との混合物〔28:72〜50:50（v/
v）〕を溶離剤として用いた。化合物５および20の加水
分解は螢光データを用いて検定した。
2.受容体分子（Rec.）および反応体リガンド（Lig.）の
ミクロモル単位の濃度、各受容体分子に対し150,000ド
ルトンの分子量と仮定した。
3.基質として用いた反応体リガンド（Lig.）。
4.反応を起させた時間。
5.示した時間の自発加水分解百分率。
6.50mMリン酸塩緩衝液中pH7.2で反応を行なった。
接触加水分解反応性と基質として用いた反応体リガン
ドの構造との相関が若干の特徴を示す。
第１に、８単クローン性受容体のそれぞれが回転し、
上記または他の研究において反応体リガンドの化学量論
量（受容体濃度に関し）以上の加水分解を触媒した。従
って、受容体3P 6D4と反応した化合物５から形成され
たものに類似する比較的安定な中間体が、エステル反応
体リガンドのアルコール部分のpKa値に関係なくこれら
の８受容体分子のいずれとも形成されなかった。
第２に、α−ナフトキシおよびクマリンオキシエステ
ルを含む化合物17および５の加水分解を受容体のすべて
を触媒したが、フェノキシおよびメトキシエステルを含
む化合物22および19の加水分解をそれぞれ８受容体中５
つが触媒しまたは触媒しなかったのでエステル反応体リ
ガンドの２環アルコール部分が単環より好ましかった。
第３に、エステルの酸部分中の環の代りに水素を有し
た化合物18の加水分解を、12C9を除いてすべての受容体
が触媒し、またフェノキシエステル、化合物22、の加水
分解を８受容体中５つが加水分解したので、中心原子、
反応体リガンド中のカルボニル炭素、に結合した酸素に
結合したフェニル環が認識された主エピトープであると
思われる。これらの同じ５受容体のみがまた４−メチル
クマリンオキシエステル、化合物20、の加水分解を触媒
した。
第４に、アミド、化合物14および15、のいずれの加水
分解も受容体が触媒しなかった。反応性を欠く理由は未
知であり、試験中である。
第５に、エステル反応体リガンドのアルコール部分の
酸素原子からガンマの窒素原子を有する反応体リガンド
基質；すなわち化合物16および22、は反応しなかった。
これはイソ構造のクマリンオキシエステルおよび類似構
造のα−ナフタレンオキシエステルにより示されたすぐ
れた反応性を考えると意外であった。
アルコール部分のアルコール原子にガンマの窒素原子
を有する反応体リガンド基質が接触加水分解されない理
由は知られていない。１つの可能性は反応体リガンドの
窒素原子（化合物16またはアナログ−リガンド、ここで
化合物13）は用いたpH値で正荷電し、受容体分子結合部
位のアミノ酸残基がそれを安定化する位置にあることで
ある。しかし、その機構はガンマ窒素が、荷電窒素原子
に与えられた安定化により影響されないアミドの部分で
ある化合物21の加水分解のないことを考慮していない。
化合物16および21の両方の反応性を説明する他の可能
性はガンマ窒素上の孤立電子対が受容体分子結合部位ア
ミノ酸残基例えばアスパラギン酸またはグルタミン酸の
カルボキシル基、ヒスチジン残基のイミダゾール、また
はシスティンのメルカプタンにより安定化されることで
ある。ガンマ窒素が存在するときに安定化基が加水分解
を阻害する傾向があるが、ガンマ窒素が存在しないと先
の安定化基が加水分解を援助することができる。酵素触
媒加水分解反応における援助はカルボキシル、イミダゾ
ールおよびメルカプタン基に対しよく証明されている。
B.動力学的研究 反応動力学を、単クローン性受容体37G2および22F5に
対する基質として３つの反応体リガンドを用いて調べ
た。初速度からのデータは通常の酵素−基質系に対する
ミカエリス−メンテン（Michaelis−Menten）反応機構
を支持した。初速度は化合物17に対してUV−可視分光光
度計を用いて271nmで、並びに化合物５および20に対し
て螢光分光計を両化合物に対し355nmの励起波長および4
55nmの発光波長を用いて追跡した。
化合物12iの存在および不在下に得た化合物17、５お
よび20の接触加水分解に対するラインウィーバー・バー
クプロットは第４図について論じたように調製した。特
定的に、化合物17は100および300ナノモル（nM）の阻害
剤濃度で、２〜16μＭの濃度で存在した。化合物５は10
0および200nMの阻害剤濃度で１〜10μＭの濃度で存在し
た。化合物20は25〜100nの阻害剤濃度で２〜20μＭの濃
度で存在した。これらのプロットから誘導された動力学
パラメータは表４に示される。
＊ 化合物20および５を用いた螢光検定はパーキン・エ
ルマー螢光分光光度計〔モーデッドLS−5;オークブロッ
ク（Oakbrook,IL）〕中で50mMリン酸塩緩衝液中8.0のpH
で200ナノモルの受容体（150,000ドルトンの分子量を基
にした）を用いて行なった。反応体リガンドはジオキサ
ンに溶解し、上記量に混合した。反応溶液２ミリリット
ルを用い、２容積パーセントのジオキサン濃度であっ
た。化合物17による検定は反応体リガンドとして上記緩
衝液中500ナノモルの受容体（150,000ドルトンの分子量
を基にした）を用い、ジオキサンに溶解した反応体リガ
ンドおよび２容積％の全ジオキサン濃度を用いた。
表４から知見できるように、これらの研究から得られ
た動力学的パラメーターは一般に表２に示したものに類
似した。しかし興味深いことに、受容体P3 6D4で認め
られた脱離基効果は表４のどの受容体にも認められなか
った。従って、受容体P3 6D4はおそらく加水分解開裂
の求核機構により７−ヒドロキシクマリンエステル（ク
マリンのpKa約8.3）と比較的安定なＮ−アシルヒスチジ
ンを形成すると思われるが、一方その受容体は脱離基
（ｐ−アセトアミドフェノール）が高いpKa値（約9.9）
を有したエステルに対して一般塩基機構による加水分解
開裂を触媒すると思われた。これに関し、比較的安定な
中間体が形成されず、３接触加水分解のそれぞれが中間
体形成によるよりもむしろ遷移状態により進行すると思
われた。さらに、約9.3および約8.3のpKa値を有する脱
離基アルコール部分を有する反応体リガンド、α−ナフ
トールおよびクマリン誘導体は研究した単クローン性受
容体のそれぞれと類似のKcat値を示した。単クローン性
受容体37G2および22F5との反応体リガンドとして用いた
化合物17および５に対して認められた接触反応に基く促
進の差異は主に自発非接触速度の関数であり、それはア
ルコールが低pKa値を有するエステルに対し約４倍早か
った。
VII 論 議 接触機構も酵素とこれらのリガンドとの相互反応も多
くの場合に十分に理解されていないので遷移状態類似体
呼称は酵素の研究において慎重に容認される。詳細な調
査はしばしばそのようなタイトルに対する明確な主張に
優先する〔バートレット（Bartlett）ほか、バイオケミ
ストリー（Biochemistry）、22、4618（1983）およびイ
ンペラリ（Imperali）ほか、バイオケミストリー（Bioc
hemistry）、25、3760（1986）〕。
ここに記載したように、ホスホナート構造は、化学反
応機構の理解に関連するので定義によりこのアイデンテ
ィティーを得た。免疫受容体中の予想機能を強要するこ
とにより、よそがその目的を満たし、理論的に誘導した
酵素−遷移状態相補性の原理に対する納得できる証拠を
提供する。その機能は特有であり、酵素触媒作用の生理
学的由来に無関係である。これは天然酵素により高めら
れる別個の化学に役立つことを要しない「酵素様」触媒
作用の研究として特定の意義を有する。確かな機構を系
統的に表わすことができる反応の触媒作用は注目される
であろう。
酵素系に対する以後の研究の方向および焦点は既存酵
素の詳細な理解に依存しない。しかし、天然酵素の研究
は常に触媒作用の模範と見なされねばならない。酵素機
構の研究からの一層有用な情報は人工触媒作用に対する
設計に支持されることができる。酵素はその初期状態に
おいて特有の特異性の単クローン性抗体のように単に特
殊化したタンパク質にすぎない。タンパク質単独は生命
過程のすべての化学を示すことができない。従って生物
は進化して細胞外成分を引入れ、それがタンパク質に結
合して広大な配列の酵素活性を形成した。化学反応の範
囲に熱望する酵素に対しては補助因子を提供されねばな
らない。遷移状態結合中に金属キレートを包含させる試
みはそのような計画の１例である。天然に見出された補
助因子は免疫結合を、例えば酸化的、電子輸送またはハ
イブリッド転移活性の触媒作用に支持されることができ
る系を規定する有用なモデルであろう。
所望特異性の抗体を得る方法は医学および生物学にお
いて広範な応用を生じた。これらはすべて他の活性また
は性質を抗体−抗原複合体に結合させる若干の結合した
状態で抗原認識の普通の機能を用いる。単純な結合相互
作用は抗体の不変の性質であると思われる。
これらの研究において、新しい動力学的機能の遂行に
抗体−抗原結合のポテンシャルエネルギーを利用するた
めに化学機構の知識を用いた。この基礎的研究の成功は
一層興味深くかつおそらく有用なタンパク質を免疫系か
ら引出すための機構的設計の適用を促進するであろう。
予定した特異性の抗体に加水分解活性を与える能力は部
位特異性試薬または触媒を意のままに作ることができる
ことを示唆する。その期待の基本的関心を別として、そ
れはタンパク質化学に対する大きな実用的利益を有す
る。
前記は本発明の例示として意図されるがしかし限定で
はない。本発明の真の精神および範囲を逸脱することな
く多くの変形および変更を行なうことができる。
【図面の簡単な説明】
第1A図は金属ペプチダーゼの遷移状態の提案された構造
を示す図、 第1B図は示されたモデルによる遷移状態の立体配置をシ
ミュレートしたホスホンアミデートアナログと金属酵素
との相互作用を示す図、 第２図はエステル分解の性質を有する単クローン抗体の
調製および分析に使用するアナログリガンドおよびリガ
ンドを例示する図、 第３図は第１表に記載した条件下にHPLCにより決定され
たカルボン酸エステル（化合物７）の加水分解速度を示
すグラフ、 第４図はハイブリドーマP3 6D4からの抗化合物４単ク
ローン抗体による化合物７の加水分解に関するラインウ
ィバー・バークのブロットを示すグラフ、 第５図は抗化合物４単クローン抗体と異なるカルボン酸
エステル（化合物５および化合物７）との反応において
観察された相違する化学を説明する提案されたスキーム
を示す図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ０７Ｃ 69/157 9546−4Ｈ Ｃ０７Ｃ 69/157 233/54 9547−4Ｈ 233/54 237/22 9547−4Ｈ 237/22 Ｃ０７Ｄ 207/46 Ｃ０７Ｄ 207/46 213/81 213/81 215/32 215/32 215/40 215/40 311/16 １０１ 311/16 １０１ Ｃ０７Ｆ 9/60 9450−4Ｈ Ｃ０７Ｆ 9/60 (Ｃ１２Ｎ 9/00 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） 微生物の受託番号 ＡＴＣＣ ＨＢ９５０５ 微生物の受託番号 ＡＴＣＣ ＨＢ９５０６ 微生物の受託番号 ＡＴＣＣ ＨＢ９５０７ 微生物の受託番号 ＡＴＣＣ ＨＢ９５０８ 微生物の受託番号 ＡＴＣＣ ＨＢ９５０９ 微生物の受託番号 ＡＴＣＣ ＨＢ９１６８ 微生物の受託番号 ＡＴＣＣ ＨＢ９１６９ (72)発明者 リチャード エイ ラーナー アメリカ合衆国 カリフォルニア州 92037 ラ ジョラ ローズランド 7750

Claims (7)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】反応体リガンドの予め選択したカルボン酸
    アミド又はエステル結合を触媒的に加水分解しうる抗体
    結合サイトを含む受容体分子であって、前記抗体結合サ
    イトが、 （ａ） 前記予め選択したカルボン酸アミド又はエステ
    ル結合を含む反応体リガンド、及び （ｂ） 前記反応体リガンドの前記予め選択したカルボ
    ン酸アミド又はエステル結合のカルボニル炭素原子と類
    似した位置に四面体状に結合した原子を含む前記反応体
    リガンドに類似したリガンドに結合する受容体分子。
  2. 【請求項２】前記四面体状に結合した原子が燐原子であ
    り、該燐原子が、 （ｉ）前記類似したリガンドエステル又はアミドの酸部
    分の炭素原子、 （ii）２つの酸素原子であって、その一方は前記燐原子
    と二重結合により結合し、他方は前記燐原子及び水素又
    はC1〜C4の低級アルキルとそれぞれ一重結合している２
    つの酸素原子、 （iii）前記類似したエステル又はアミドのアルコール
    又はアミン部分のα−炭素原子に結合している第三の酸
    素原子又は窒素原子、 に直接結合している特許請求の範囲第１項記載の受容体
    分子。
  3. 【請求項３】単クローンである特許請求の範囲第１項記
    載の受容体分子。
  4. 【請求項４】前記単クローンが、ATCC受入番号がHB916
    8、HB9169、HB9500、HB9501、HB9502、HB9503、HB950
    4、HB9505、HB9506、HB9507、HB9508及びHB9509から選
    ばれるハイブリドーマにより分泌される特許請求の範囲
    第３項記載の受容体分子。
  5. 【請求項５】反応体リガンド分子中の予め選択したエス
    テル又はアミドを触媒的に加水分解する方法であって、
    以下の工程： （ａ） 有効量の受容体分子と前記反応体リガンド分子
    を水性媒体中で混合して混合物を形成し、前記受容体分
    子が、前記予め選択したカルボン酸アミド又はエステル
    結合を触媒的に加水分解しうる抗体結合サイトを含み、
    前記抗体結合サイトが、 （ａ） 前記予め選択したカルボン酸アミド又はエステ
    ル結合を含む反応体リガンド、及び （ｂ） 前記反応体リガンドの前記予め選択したカルボ
    ン酸アミド又はエステル結合のカルボニル炭素原子と類
    似した位置に四面体状に結合した原子を含む前記反応体
    リガンドに類似したリガンドに結合し、かつ （ｂ） 前記混合物を、前記リガンド分子が前記受容体
    分子と結合し、前記受容体分子が前記予め選択した結合
    を加水分解するのに十分な時間保持すること、 を含む方法。
  6. 【請求項６】前記受容体が単クローンである特許請求の
    範囲第５項の方法。
  7. 【請求項７】前記加水分解の生成物を回収する工程を更
    に含む特許請求の範囲第５項の方法。
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Families Citing this family (30)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5229272A (en) * 1989-04-25 1993-07-20 Igen, Inc. Catalytic antibody components
US4963355A (en) * 1986-06-23 1990-10-16 Igen, Inc. Production of antibody catalysts
DE3889041T2 (de) * 1987-09-02 1994-10-27 Igen Inc Herstellung von Immunonähe-Katalysatoren.
US6702705B1 (en) * 1988-05-04 2004-03-09 Igen International, Inc. Prodrugs activated by targeted catalytic proteins
ZA893284B (en) * 1988-05-04 1990-03-28 Igen Inc Peptide analogs and their use as haptens to elicit catalytic antibodies
US5215889A (en) * 1988-11-18 1993-06-01 The Regents Of The University Of California Catalytic and reactive polypeptides and methods for their preparation and use
US5236825A (en) * 1989-01-17 1993-08-17 Scripps Clinic And Research Foundation Polyvalent metal ion-containing antibody combining site catalysts
US5429936A (en) * 1989-04-21 1995-07-04 The Regents Of The University Of California Antibody-mediated juxtaposition of reactive moieties
US5236836A (en) * 1989-04-25 1993-08-17 Igen, Inc. Autoantibodies which enhance the rate of a chemical reaction
US5194585A (en) * 1989-04-25 1993-03-16 Igen, Inc. Inhibitors of catalytic antibodies
US5658753A (en) * 1989-04-25 1997-08-19 Paul; Sudhir Catalytic antibody components
US5599538A (en) * 1989-04-25 1997-02-04 Igen, Inc. Autoantibodies which enhance the rate of a chemical reaction
US6048717A (en) * 1989-04-25 2000-04-11 Igen International, Inc. Inhibitors of catalytic antibodies
DK547589D0 (da) * 1989-11-02 1989-11-02 Novo Nordisk As Fremgangsmaade til fremstilling af organiske forbindelser
US5444155A (en) * 1991-09-10 1995-08-22 The Scripps Research Institute Molecules with antibody combining sites that induce asymmetry
US5250426A (en) * 1991-10-22 1993-10-05 The Scripps Research Institute Molecules with antibody combining sites that induce asymmetry
US5463028A (en) 1992-04-03 1995-10-31 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Reagents for generating a polyclonal hydrolytic antibody response against cocaine and the monoclonal hydrolytic antibodies against cocaine derived through these reagents
JP2721296B2 (ja) * 1993-09-08 1998-03-04 株式会社蛋白工学研究所 糖エステル誘導体を位置選択的に加水分解する触媒抗体
US5571681A (en) * 1994-03-10 1996-11-05 The Scripps Research Institute Chemical event selection by suicide substrate conjugates
GB9510830D0 (en) * 1995-05-27 1995-07-19 Zeneca Ltd Proteins
JP2002515965A (ja) * 1995-08-18 2002-05-28 ダブリュー． ランドリ，ドナルド 抗体触媒反応の調節による有機化合物の検出
US5948658A (en) 1996-06-25 1999-09-07 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Anti-cocaine catalytic antibody
BR0015145A (pt) * 1999-10-29 2002-07-16 Wakamoto Pharma Co Ltd Anticorpo monoclonal, hibridoma, método de imunoensaio e kit para diagnose
EP2825553B1 (en) 2012-03-14 2018-07-25 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Multispecific antigen-binding molecules and uses thereof
IL296285A (en) 2015-07-06 2022-11-01 Regeneron Pharma Multispecific antigen-binding molecules and uses thereof
EP3448891A1 (en) 2016-04-28 2019-03-06 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of making multispecific antigen-binding molecules
DK3635009T3 (da) 2017-06-07 2026-03-30 Regeneron Pharma Sammensætninger og fremgangsmåder til internalisering af enzymer
US12258597B2 (en) 2018-02-07 2025-03-25 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions for therapeutic protein delivery
KR102871690B1 (ko) 2018-04-30 2025-10-16 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 Her2 및/또는 aplp2에 결합하는 항체 및 이중특이적 항원-결합 분자 및 접합체 그리고 이들의 용도
BR112020023145A2 (pt) 2018-05-17 2021-02-02 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. anticorpo anti-cd63 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, molécula de ligação ao antígeno biespecífica, proteína terapêutica de múltiplos domínios, polinucleotídeo composição farmacêutica, e, composto

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU3745285A (en) * 1983-11-29 1985-06-13 Igen, Inc. Method of catalyzing chemical reactions
US4659567A (en) * 1984-09-07 1987-04-21 Scripps Clinic & Research Foundation Molecules with antibody combining sites that bind to hydrolytic transition states
US4792446A (en) * 1986-06-23 1988-12-20 Igen, Inc. Production of antibody catalysts
US4963355A (en) * 1986-06-23 1990-10-16 Igen, Inc. Production of antibody catalysts

Also Published As

Publication number Publication date
FI94026B (fi) 1995-03-31
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