JP2559035B2

JP2559035B2 - 細胞生長調節因子

Info

Publication number: JP2559035B2
Application number: JP61301853A
Authority: JP
Inventors: エムゼアリングジヨイス; シヨーヤブモハメド; マーカードハンス; ビーハンソンマーシア
Original assignee: Oncogen LP
Current assignee: Oncogen LP
Priority date: 1985-12-20
Filing date: 1986-12-19
Publication date: 1996-11-27
Anticipated expiration: 2011-11-27
Also published as: CY1608A; CH675727A5; NZ218634A; IL81017A; GB2185485B; FI865156A0; AT400444B; DK615386D0; CN1017626B; IE863345L; FI865156L; IE59415B1; SG60891G; FI91484B; ES2003180A6; KR870005645A; DK174094B1; IL81017A0; HUT43103A; FI91484C

Description

【発明の詳細な説明】〔産業上の利用分野〕本発明は新規な細胞生長調節因子に関する。

〔従来の技術〕

リンパ球及び単核白血球の両方の白血球は、数種の動
物の腫瘍モデルにおいて腫瘍の生長の阻止を示してい
る。免疫不全のヒトにおける悪性腫瘍の症例の増加は、
白血球が腫瘍の生長の調節に役割を果たしているという
主張を支持する。既に単離され固定された腫瘍の生長を
阻害するか又は免疫の機能を調節するこれらの白血球細
胞により生成されるたん白の因子は、インターフエロン
α−及びｒ−、腫瘍え死因子、リンホトキシン、インタ
ーロイキン−２及び他のリンホカインを含む。単離され
た因子のそれぞれは、異つた活性のスペクトルを有し、
そして他の因子と関連して異つて作用するために、細胞
の生長又は免疫の機能の調節に白血球が生成する因子の
すべての単離及び同定に、永続ししかも強い興味がもた
れている。これらの化合物は、独立して又は一緒に、癌
の治療又は診断、傷の治ゆの促進剤又は免疫不全、自己
免疫、器管移植などの患者の治療の免疫調節剤として用
いられよう。

天然に存在する因子の発見、単離、精製又は固定に当
り、種々の困難に出会う。所望の因子の活性を変性する
ことなく、粗製の原料中の他の因子から目的とする因子
を分離且精製するための方法が、開発されねばならず、
特定の因子の濃縮する分離中の画分を固定されるバイオ
アツセイが開発されねばならず、新規な因子は、既に周
知である因子又は存在ししかも求めている因子の活性を
消極的又は積極的の何れかで影響する他の未知の因子か
ら区別されねばならず、精製された因子は分析されなけ
ればならず、その上精製された因子は、因子の同定及び
分析を行うのに充分な量に濃縮されなければならない。
それ故、単離される因子の数が増すにつれ、その役割及
び機能が、存在する多数の他の因子により不明瞭になる
ので、それぞれの新しい因子は、同定するのに一層困難
になる。

ビーム（Beal）ら〔「キヤンサー・バイオケム・バイ
オフイジ（Cancer Biochem.Biophys.）」（1979）３,93
〜96〕は、正常の細胞よりも変形した細胞において生長
及びDNA合成を阻害するヒトの尿中のペプチドの存在を
報告している。ホーリー（Holley）ら〔「プロス・ナツ
ル・アカデ・サイ（Proc.Natl.Acad.Sci）」（1980）7
7,5989〜5992〕は、上皮細胞生長阻害物の精製を記載し
ている。レタンスキー（Letan−sky）〔「バイサイ．レ
ポ．（Biosci.Rep.）」（1982）２,39〜45〕は、ウシ胎
盤から精製したペプチドが、正常な細胞よりも大きい程
度で腫瘍物においてDANのチミジン取り込み並に腫瘍の
生長を阻害することを報告している。チエン（Chen）
〔「トレンヅバイオケム・サイ（Trends Biochem.Sc
i）」（1982）７,364〜365〕は、癌抑制性を有する腹水
液からのペプチドの単離を報告している。レツデイング
（Redding）及びシヤリー（Schally）〔「プロス．ナツ
ル．アカデ．サイ（Proc.Natl.Acad.Sci.）」79,7014〜
7018〕は、数種の正常及び腫瘍の細胞系に対して抗細胞
分裂促進性活性を示す、ブタの視床下部からの精製した
ペプチドの単離を報告している。ソネ（Sone）ら〔「ガ
ン（Gann）（1984）75,920〜928〕は、或る腫瘍細胞の
生長を生体外で阻害するヒトのマクロフアージにより生
成される因子の製造を報告している。ランソム（Ranso
m）ら〔「キヤンサー・リサ（Cancer Res.）」（1985）
45,851〜862〕は、或る腫瘍細胞系の複製を阻害しそし
てリンホトキシン、インターフエロン及びインターロイ
キン１及び２とは異るように思われる、ロイコレグリン
と呼ばれる因子の単離を報告している。これらの因子の
多くは、充分に分析されておらず、又はそれらの一次製
造も知られていない。

アガルワル（Aggarwal）ら〔「ジエー・バオル・ケム
・（J.Biol.Chem）」（1984）259,686〜691〕は、リン
パ芽球状細胞系により生成されるヒトのリンホトキシン
（LT）を精製且分析し次にLTの配列を確めた〔アガルワ
ルら、「ジエー・バオル・ケム．」（1985）260,233
4〕。リンパ様の細胞により生成されそして免疫調節及
び腫瘍阻害の活性を有するガンマ・インターフエロン
（γ−IF）は、クローンされそして発現された〔グレイ
（Gray）ら、「ネイチユア（Nature）」（1982）295,50
3:508〕。或る腫瘍の生長を阻害しさらにマクロフアー
ジ及び或る白血病細胞系により生成される腫瘍え死因子
（TNF）は、分析されそしてTNFCDNAはイー・コリ（E.co
li）においてクローン且発現された〔ペンニカ（Pennic
a）ら「ネイチユア」（1984）312,724〕。

〔発明の概要〕

白血球から得られる新規なペプチド因子及び生物学的
に活性はそのフラグメントが提供される。その因子は、
細胞の生長の調節例えば腫瘍細胞の生長の阻害及び正常
な線維芽細胞の生長の促進に用いられることが分り、さ
らに免疫機能を調節しよう。因子は、同様な性質を有す
ると報告された他の化合物の配列とは明白に異つたアミ
ノサン配列を有する。

本発明は、細胞くず及び他の白血球蛋白を含まない白
血球蛋白由来のポリペプチド細胞生長調節因子であり、
該ポリペプチドは、腫瘍性細胞の増殖を阻害し、正常の
ヒト線維芽細胞の増殖を刺激し、増殖性且つ細胞毒性ヒ
トＴ細胞応答を阻害することなく、顆粒球性／骨髄球性
骨髄コロニー形成を阻害することなく、ゲル排除クロマ
トグラフィーによる測定で約17〜19kDの分子量及びSDS
−PAGEによる測定で約28kDの分子量を有し、そして1N酢
酸及び1N水酸化アンモニウムに対して比較的不感受性で
あり、56℃の温度での１時間の加熱処理に対して安定で
ある分子からなり、且つ下記のＮ−末端フラグメントの
アミノ酸の部分配列を含む白血球蛋白由来のポリペプチ
ド細胞生長調節因子、及びこのポリペプチド細胞生長調
節因子を有効成分とする細胞生長調節用医薬組成物を提
供する。

第１図は、オンコスタチン（Oncostatin）Ｍのフラグ
メントのアミノ酸配列を示す。

第２図は、（Ａ−Ｃ）がそれぞれ0.5及び100GIA単位
により処理されたA375黒色腫細胞でありそして（Ｄ−
Ｆ）がそれぞれ0.5及び100GIA単位により処理されたW13
8線維芽細胞である、オンコスタチンＭにより処理され
た細胞の一連の顕微鏡写真であり、そして第３図はオン
コスタチンＭのSDS−PAGE分析の写真である。

新規なポリペプチド、ポリペプチド組成物、ポリペプ
チドフラグメント及び突然変異、それらの製法及び用途
が提案され、該組成物は細胞の生長の調節、特に腫瘍細
胞の生長の阻害及び正常な線維芽細胞の生長の促進に活
性を示す。オンコスタチンＭとして呼ばれる目的ポリペ
プチドは、白血球から得られ、例えば刺激されたU937細
胞の調節された媒体又は刺激された正常のヒトの末梢血
液リンパ球（PBL）の調節された媒体から得られる。無
処理のオンコスタチンＭの生物学的活性例えば細胞生長
調節活性又は免疫学的活性を有するポリペプチドのフラ
グメント及び突然変異体も又提供される。

本発明のポリペプチドフラグメントは、少くとも天然
に存在するオンコスタチンＭと免疫学的に交差反応しう
る、生物学的に活性な少くとも８個のアミノ酸の新規な
ポリペプチドである。免疫学的に交差反応しうることに
より、本発明の新規なポリペプチドにより誘発される抗
体が、オンコスタチンＭが変性された状態に少くともあ
るとき無処理のオンコスタチンＭと交差反応することを
意味する。これらのポリペプチドは、それ故、体液中の
オンコスタチンＭの濃度を求めること、オンコスタチン
Ｍへ結合し従つてその活性を調節すること並にアフイニ
テイカラムで用いられるようにオンコスタチンＭを精製
することに用いられる、オンコスタチンＭへの抗体を誘
発するのに有用である。ポリペプチドの一部は、又無処
理のオンコスタチンＭの細胞生長調節活性を保持しよう
が、その活性は無処理のオンコスタチンＭに比べて通常
低下するように、調節されよう。

第１図は、オンコスタチンＭと交差反応しうるポリペ
プチドのアミノ酸配列を示し、第一の配列はオンコスタ
チンＭのＮ末端フラグメントの部分アミノ酸配列を示
す。

本発明のポリペプチドは、第１図に示されたアミノ酸
配列に相当する少なくとも８個の連続したアミノ酸を有
し、しかも３個以上通常１個のアミノ酸によりその配列
とは異なるアミノ酸配列を含んでもよい。その相違は、
アミノ酸のそう入、アミノ酸の欠失又は１個のアミノ酸
の他のものへの置換特に保存的置換の何れかである。通
常、ポリペプチドは、図に示された配列に相当ししかも
１個のアミノ酸による異なる少なくとも10個、さらに普
通には少なくとも12個の連続したアミノ酸を含んでもよ
い。

本発明の目的のために、種々のアミノ酸が多数の下位
のクラスに分割されよう。下記の表は、その下位のクラ
スを示す。

脂肪族中性無極性 GAPVLI 極性 STCMNQ 酸性 DE 塩基性 KR 芳香族 FHYW 保存的置換により、同一の下位のクラス（即ち、中性
の脂肪族、酸性の脂肪族、塩基性の脂肪族又は芳香族）
さらに特に同一の極性からのアミノ酸が互に置換される
ことを意味する。望ましくは、２〜４個の炭素原子又は
５〜６個の炭素原子をアミノ酸は、脂肪族の下位クラス
の単量体の基に限定しよう。

ポリペプチドは、長さが約1000個のアミノ酸を超えな
いだろう。通常それらは、100個より少ないアミノ酸、
さらに普通には50個より少ないアミノ酸を有するだろ
う。従ってポリペプチドは、容易に合成されうる。通
常、ポリペプチドの長さが100個のアミノ酸を超えると
き、これらのポリペプチドは、それぞれ100個より少な
いアミノ酸を有するオンコスタチンＭのフラグメントの
重合体か、又は抗原、酵素、酵素フラグメントなどにフ
ラグメントが融合した融合たん白であろう。特に、高分
子量のポリペプチドが、大きな免疫原性ポリペプチド担
体と共有結合で結合した約100個以下のアミノ酸の少な
くとも１個のポリペプチドフラグメントであって、該担
体は免疫原性をもたらす。このたん白担体の例は、ウシ
血清アルブミン、キーホール・カサガイ（Keyhole limp
et）ヘモシアニンなどである。これらの共役したポリペ
プチドは、適切な宿主生物に抗体を誘発するのに有用で
あろう。

U937細胞は、組織球様リンパ腫細胞系から誘発された
細胞系であり〔サンダーストルム（Sunderstorm）及び
ニルソン（Nilsson）「イント・ジエー・キヤンサー（I
nt.J.Cancer）」（1976）17,565〜577〕、それは種々の
薬剤による処理後マクロフアージの特徴を有する細胞へ
分化するように誘発される〔ハリス（Harris）ら「キヤ
ンサー・レス．（Cancer Res.）」（1985）45,9〜1
3〕。オンコスタチンＭの生成に当つて、U937細胞は、
血清を含みそして適切な誘起剤により処理される従来の
栄養培地で生長されよう。好都合には、ホルボール又は
インゲノール、特にＯ−テトラデカノイルホルボール−
13−アセテート（TPA）が用いられよう。通常、約５〜2
0ng/ml以上の誘起剤が用いられよう。細胞の最初の数
は、約10⁵〜10⁶個の細胞/ml以上である。

充分な時間誘起剤により細胞を処理した後に（一般に
３〜６日間）、上澄み液を除き、細胞を無血清栄養培地
で洗い、付着した細胞を再び無血清培地により洗いそし
て無血清栄養培地例えばRPM1−1640培地において、少く
とも12時間、通常約48時間以下細胞をインキユベートす
る。上澄み液を集めそして細胞を遠心分離により除く。
無細胞上澄み液を実験プランに記載された如く細胞生長
阻害活性（GIA）についてテストした。上澄み液は、約5
0〜500GIA/ml（GIA単位の定義に関する実験参照）。

オンコスタチンＭは、又細胞分裂促進物質により刺激
された正常のヒト末梢血液リンパ球（PBL）からも得ら
れうる。PBLは、フラクシヨンを希釈しそしてそれらを
フイコル（Ficoll）勾配上で遠心分離することにより白
血球フラクシヨンから単離されうる。勾配界面から集め
た細胞は洗われそしてシヨツク溶解されて赤血球細胞を
除く。残つた細胞を遠心分離によりその溶液から集め、
血清及びトロンビンを含むバツフアーに再懸濁し、攪拌
しそして短時間に血小板凝集物を沈降させる。懸濁した
細胞を移し、遠心分離により回収し、血清に再懸濁し、
ナイロンウールを含むカラムに移す。カラムをインキユ
ベートして単球及びＢ−リンパ球を付着させ次に洗う。
多くの末梢血液Ｔ−リンパ球は接着せず、そしてカラム
から溶離する。これらの細胞は、培養培地例えばRPM−1
640培地で37゜で培養され、約100時間適切な誘起剤例え
ばフイトヘマグルチニン（約１〜5mg/）により処理さ
れ、次に上澄み液を集めた。上澄み液を遠心分離して細
胞を除き、そして超過又は透析により濃縮された。

U937細胞又は正常のPBLの何れかから無細胞上澄み液
を単離後、調節された培地を好都合には中空フアイバー
系又は超過膜を用いて濃縮し、次に酢酸により希釈し
（0.1N酢酸の濃度）、次に約10倍に濃縮し、希釈及び濃
縮を繰返す。濃縮物を凍結乾燥し直接用いるか、又は凍
結乾燥された生成物をさらに精製するために用いる。

目的とするオンコスタチンＭは、バイオ−シル（Bio
−sil）TSK250カラムのイソクラテイツク移動相として
水性40％アセトニトリル・0.1％三弗化酢酸を用い、そ
れぞれの画分の活性をモニターしながらゲル浸透クロマ
トグラフイの方法により精製される。精製すると活性画
分に少くとも約0.5〜５×10⁴GIA単位/mlを有する組成物
が得られる。

ゲル浸透クロマトグラフイからの部分的に精製された
生成物は、線形勾配を用いる逆相高速液体クロマトグラ
フイを使用してさらに精製され、その際一次溶媒は水中
の0.1％三弗化酢酸である二次溶媒は0.1％三弗化酢酸を
含むアセトニトリルである。スケジユールは変化しうる
が、一般にクロマトグラフイは、約３〜４時間を要し、
時間の主な部分即ち時間の約50％以上そしてその約80％
以下は、30〜45％の範囲内の二次溶媒を用いる。これら
の条件下で、活性画分は約41〜42％のアセトニトリルで
溶離する。

集められた活性画分は、勾配条件のより早い変化及び
より遅い流速を用いる逆相HPLCを繰返すことにより、さ
らに精製されよう。これらの条件下活性は約40.5〜41.5
％のアセトニトリルで表れる。

逆相HPLCは、次に溶媒系を変えて繰返され、その際二
次溶媒はｎ−プロパノール・0.1％三弗化酢酸である。
線形勾配が用いられ、勾配は23〜35％のｎ−プロパノー
ルの範囲で徐々に変化される。主な活性は、25.5〜27.5
％のプロパノールの範囲内で観察されて、10GIA単位/ng
たん白以上の比活性を有する実質的に均一な生成物が得
られる。通常、生成物は精製されて、少くとも約100GLA
単位/ngたん白、さらに普通には150GIA単位/ngたん白の
比活性をもたらす。

目的とする化合物は、サイズ排除クロマトグラフイに
より測定するとき約17〜19キロダルトン（KD）特に約18
KDの分子量を有することにより特徴付けられる。目的と
する化合物は、さらに還元又は非還元条件下のポリアク
リルアミド・ゲル電気泳動により測定するとき約28KDの
見掛け上の分子量を有することにより特徴付けられる。

精製されたオンコスタチンＭのフラグメントのアミノ
酸配列は、分析された。オンコスタチンは、第１図に示
されるアミノ酸配列を実質的に有する。第１図に関し、
第一の配列は、オンコスタチンＭのＮ−末端を示し、一
方残りの配列は、ポリペプチドの内部フラグメントを示
す。

単離されたオンコスタチンＭの活性な製品は、高マン
ノース及びコンプレツクスＮ−結合オリゴ糖の混合を含
んだ。しかし、オンコスタチンＭの非グリコシル化性製
品は、細胞生長調節活性を維持した。

オンコスタチンＭは、或る細胞株に対するその活性に
よりさらに特徴付けられる。目的とするポリペプチド
は、WI26及びWI38ヒト線維芽細胞並にマウスL929細胞
（腫瘍え死因子に対して感受性がある）並にγ−インタ
ーフエロン感受性ヒト腫瘍細胞系に対して細胞毒性活性
を欠く。又、正常のヒトＴ−リンパ球を阻害せず、又は
100GIA単位/ml以内の濃度の骨髄細胞からの顆粒球様／
骨髄球様のコロニー形成を尾害しないことも分つた。そ
の上、オンコスタチンＭは、WI138及びWI26細胞により
例示される正常のヒトの線維芽細胞の増殖を刺激し、そ
して腫瘍細胞例えばA375、HBT10、A549及びSK−MEL28の
増殖を阻害し、さらに正常の骨髄からのコロニー形成細
胞の生長を増強しよう。オンコスタチンＭは、500GIA単
位/mlの濃度で、混合した白血球培養反応（MLG）におい
てヒトの増殖性又は細胞毒性Ｔ細胞レスポンスを抑制し
なかつた。

目的とするポリペプチドは、温和な酸及び塩基に対し
てさらに56℃の加熱処理に対して安定であることが分つ
た。

目的とするポリペプチドのアミノ酸配列は、市販の配
列を用いて完全に決定されよう。ポリペプチドは、次に
又市販されている自動合成装置を用いて、周知の技術に
従つて合成されよう。

又、目的とするポリペプチドは、組換えDNA技術によ
り生成されよう。部分的なアミノ酸配列から、プローブ
が導き出され、それは次のヒトのゲノム・ライブラリー
をスクリーニングするのに用いられる。ライブラリー
は、cDNAライブラリー又は染色体ライブラリーであろ
う。１種以上のクローンがプローブをアニールするとし
て固定されれば、目的とする遺伝子を含むフラグメント
は、多くのやり方で固定されそして多くの方法で操作さ
れよう。フラグメントは、エンドヌクレアーゼ制限によ
り大きさを縮小され、得られたフラグメントはクローン
され所望の遺伝子の存在についてプローブする。所望の
ペプチドを生成するか又は多量の所望のペプチドを生成
する細胞は、メツセンジヤーRNAの生成に用いられよ
う。メツセンジヤーRNAから、単一鎖のcDNAが生成され
よう。cDNAは、次にアニールされて、もしあるとすれば
少量のポリペプチドを生成する細胞から全メツセンジヤ
ーRNAとなる。アニールれていないcDNAは、次に単離さ
れそしてプローブによりスクリーニングされるds cDNA
を生成するのに用いられよう。

又、DNAフラグメントは、^λgt11にそう入されて、コ
ーデイングフラグメントは、β−ガラクトシダーゼ遺伝
子より下方でしかもその枠に入るだろう。抗体は、オン
コスタチンＭポリペプチドに製造されそして交差反応性
について得られた融合したたん白をスクリーニングする
のに用いられよう。このやり方で、目的とするポリペプ
チドについてコーデイングするフラグメント又はそのフ
ラグメントは、固定されそして所望の遺伝子を同定する
のに用いられよう。

一度完全な遺伝子がcDNA又は染色体DNAの何れかとし
て同定されると、それは次に種々のやり方で操作され
て、発現のために用いられよう。オンコスタチンＭの野
生型転写及び翻訳の調節領域を認識する宿主に、遺伝子
が発現されるとき、その野生型５′−及び３′−調節領
域を有する全遺伝子が、適切な発現ベクターへ導入され
よう。種々の発現ベクターが、ほ乳動物のウイルス例え
ばシアミン（Simian）ウイルス40、アデノウイルス、ウ
シ乳頭腫ウイルス、牛痘ウイルス、昆虫悍状ウイルスな
どからの複製系を用いて存在する。これらの複製系は、
開発されて、遺伝子がそう入される好都合な制限部位を
もたらすと同時に、トランスフエクタントを選択させる
マーカーをもたらす。

遺伝子が天然に存在する野生型転写及び翻訳の調節領
域を認識しない宿主で発現するき、他の操作が要求され
よう。好都合には、種々の３′−転写調節領域が周知で
あり、その上停止コンドンから下方へそう入されよう。
構造遺伝子から上方の非コーデイング５′−領域は、エ
ンドヌクリアーゼ制限、バル（Bal）31切除などにより
除去されよう。又、好都合な制限部位が構造遺伝子の
５′−末端の付近で存在するとき、構造遺伝子は制限さ
れ、そしてアダプターがプロモーター領域（アダプター
が構造遺伝子の失われたヌクレオチドをもたらす）へ構
造遺伝子を結合するのに用いられる。種々の技法が発現
カセツトを用意するために用いられ、該カセツトは転写
の５′−、３′−方向に転写及び翻訳開始領域を有し、
それは又調節の導入をさせる調節配列、開始領域の転写
及び翻訳のコントロールの下の構造遺伝子さらに転写及
び翻訳終了領域を含む。

代表的な転写開始領域又はプロモーターは、細菌で
は、β−ガルプロモーター、TACプロモーター、ラムダ
左及び右プロモーターなど；イーストでは、糖分解酵素
プロモーター例えばADH−Ｉ及びIIプロモーター、GPKプ
ロモーター及びPIGプロモーター、TRPプロモーターな
ど；ほ乳動物の細胞としては、SV40初期及び後期プロモ
ーター、アデノウイルス主要後期プロモーターなどを含
む。既に示した如く、発現カセツトは、適切な細胞の宿
主のエピソームの保持のための複製系内に含まれるか、
又はそれが宿主のゲノムに拡大されるとき複製系なしで
もたらされよう。DNAは、周知の技術例えばりん酸カル
シウムにより沈でんするDNAを用いる変換、細胞にウイ
ルスを接触させるトランスフエクシヨン、細胞中へのDN
Aのマイクロ注入などに従つて、宿主へ導入されよう。

一度構造遺伝子が適切な宿主に導入されると、宿主は
生長しそして構造遺伝子を発現する。或る場合には、構
造遺伝子から上方でしかもそれと読み取り枠内にシグナ
ル配列（分泌の関係にあるリーダー）をもたらすことが
望ましく、それは上澄み液に成熟したポリペプチドをも
たらすために、構造遺伝子の分泌及び分泌の関係にある
リーダーの開裂をもたらす。分泌がもたらされないとき
は、宿主細胞は従来の条件に従つて培養且分解され、そ
して所望の生成物が周知の技術例えばクロマトグラフ
イ、電気泳動、溶媒抽出などに従つて単離且精製され
る。

目的とする化合物は、生体内及び生体外の両方で、広
範囲のやり方で用いられうる。目的化合物は、生体内又
は生体外で用いられうる目的化合物に対する抗体を作る
のに用いられうる。抗体は、目的ポリペプチドを免疫原
として用い、ポリペプチドをほ乳動物の宿主例えばマウ
ス、ウシ、ヤギ、ヒツジ、ウサギなどに特にアジユバン
ト例えば完全なフラインズ・アジユバント、水酸化アル
ミニウムゲルなどとともに注射することにより、従来の
やり方で製造される。宿主は次に採血されそして血液が
ポリクローナル抗体の単離に用いられるか、又はマウス
の場合、末梢血液リンパ球又は脾リンパ球（Ｂ−細胞）
が適切な黒色腫の細胞との融合に用いられて、目的化合
物に対して特異的な抗体のモノクローナル発現のための
染色体を不滅にする。

ポリクローナル又はモノクローナル抗体の何れかが製
造され、それは次にサンプル例えば細胞又は生理学的液
体例えば血清中の目的ポリペプチドの存在の検出又は診
断に用いられよう。抗体は、又目的ポリペプチドを精製
しそしてそれを天然又は合成の源から単離するためのア
フイニテイ・クロマトグラフイに用いられよう。抗体
は、又培養物又は生体内の細胞と結合した目的ポリペプ
チドの量をコントロールし、それにより細胞の生長が変
化されるのに用いられよう。

目的化合物は、目的化合物の受容体の存在を検出する
ためのリガントとして用いられよう。このやり方で、細
胞は目的化合物の受容体の存在及び密度に従つて区別さ
れ、この受容体の存在に対する種々の化合物の効果をモ
ニターする。

目的化合物は、生体外の培養物に用いられて、感受性
のない細胞から区別されるように、目的ポリペプチドに
感受性のある細胞又は細胞系の生長を阻害する。従つ
て、不均一な細胞混合物又は細胞系が、望ましくない細
胞を有せず、この場合望ましくない細胞は目的ポリペプ
チドに対して感受性を有する。目的ポリペプチドは、腫
瘍の症状のとき、例えば注射、病変内、腹腔内、皮下な
どにより、生体内に投与されよう。目的化合物は生体外
で用いられて、自己骨髄移植片のための骨髄からの悪性
腫瘍細胞の排除、又は再注入前の他の組織例えば血液の
悪性腫瘍細胞の増殖の阻害又は排除を行う。

目的ポリペプチドは、又傷例えば皮膚の傷、角膜の傷
並に種々の他の上皮性及び基質性の破壊例えば慢性の潰
瘍、火傷、外科切除、外傷並に中空の上皮性器管例えば
食堂、胃、大腸及び小腸、口、性器及び尿道への損傷を
治療する方法に用いられよう。方法は、生物学的に許容
しうる担体中のオンコスタチンＭを含む治療組成物を局
所に適用することによる。

本発明の組成物は、実質的にすべての皮膚の傷、角膜
の傷並に体の上皮性の中空の器官への損傷を含む広範囲
の傷を治療するのに用いられよう。治療に適した傷は、
外傷から生じたもの例えば火傷、擦傷、切傷など、そし
て外科的方法によるもの例えば外科切除及び皮膚移植を
含む。本発明の組成物による治療に適した他の症状は、
慢性の症状例えば慢性の潰瘍、糖尿病の潰瘍及び他の非
治ゆ（栄養）症状を含む。

オンコスタチンＭは、関係領域への適用のため生理学
上許容しうる担体に導入される。担体の性質は、大きく
変化し、適用の目的とする位置に依存しよう。皮膚への
適用のためには、クリーム又は軟膏のベースが通常好ま
れ、適当なベースは、ラノリン、シルバテン（Silvaden
e）〔マリオン（Marion）〕（特に火傷の治療のた
め）、アクアフオア（Aquaphor）〔デユーク・ラボラト
リーズ（Duke Laboratories）、ソース・ノーウオーク
（South Norwalk）、コネチカツト〕などを含む。所望
ならば、オンコスタチンＭ含有組成物をほう帯及び他の
傷の医薬材料に混入して傷をペプチドに常にふれるよう
にすることができる。エロゾルの適用も用いられよう。

治療組成物中のポリペプチドの濃度は、厳密に要しな
い。ポリペプチドは上皮細胞増殖を誘発する量で存在し
よう。組成物は、代表的には目への点眼又は皮膚へのク
リーム、軟膏又はローシヨンとして、関係領域へ局所的
に適用されよう。目の場合、しばしば用いられることが
望ましく、通常４時間以内の間隔で適用される。皮膚で
は、治ゆ中関係領域へ治療組成物を連続的に維持するこ
とが望ましく、１日２〜４回又はそれ以上治療組成物を
適用する。

目的ポリペプチドの使用量は、投与のやり方、他の活
性化合物の使用などにより変化し、一般に約１μｇ〜10
0μｇの範囲にある。目的ポリペプチドは、生理学的に
許容しうる担体例えば生理食塩水、ホスフエート・バツ
フアー生理食塩水などともに用いられる。用いられる化
合物の量は、生体外の細胞のレスポンス及び目的ポリペ
プチド又は目的ポリペプチドを含む処方に対する実験動
物のレスポンスに基いて実験的に求められよう。目的化
合物は、それ自体又は他の生長因子又は阻害剤又は免疫
調節剤例えばTNF、IL−２、γ−インターフエロン、モ
ノクローナル抗体などともに用いられる。これらの他の
化合物の量は、一般に１μｇ〜100μｇの範囲内であろ
う。部位を見ざす部分例えば抗体への目的物の共役物
が、製造され、その際抗体は特定の悪性腫瘍細胞又は器
管に対して特異的であろう。

〔実施例〕

下記の実施例は説明のためであつて、限定ではない。

実験材料及び方法 U937細胞から単離されたオンコスタチンＭ組織球リンパ腫細胞系からの腫瘍細胞生長阻害因子の生
成 U937細胞即ち組織球リンパ腫細胞系〔サンドストルム
及びニルソン、「イント．ジエー．キヤンサー」（197
6）17、565〜577〕を、10％ウシ胎仔血清（FCS）、ペニ
シリン／ストレプトマイシン（PS）、Ｌ−グルタミン及
び10ng/mlの12−Ｏ−テトラデカノイルホルボール13−
アセテート（TPA）を補給された全量300mlのRPMI 1640
培地中で、４×10⁵個の細胞/mlの濃度で、850cm²のロー
ラー瓶〔コーニング（Corning）C2540〕中で培養した。
４日後、FCS及びTPAを含む上澄み液を除去し、ローラー
瓶を無血清RPMI 1640により５回洗い、除した細胞（１
×10⁵個の細胞/ml）を無血清培地により洗い、そして瓶
に戻し、ローラー瓶１本当りの最終容量を125mlの無血
清RPMI 1640培地とした。１日後、上澄み液を集め、遠
心分離して細胞を除き、0.45ミクロンのナルジーン（Na
lgene）フイルターを通し、中空フアイバー系〔アミコ
ン（Amicon）カートリツジHIP 10−20〕を用いて容量を
150ml（最初の容量1500ml）に濃縮した。オンコスタチ
ンＭを、又150cm²の組織培養フラスコ中の無血清TPA処
理U937細胞の上澄み液から単離した。上澄み液をアミコ
ン・ダイアフロ（Amicon Diaflo）膜PM−10により濃縮
し、10kDを切り捨て、透析した。透析後、濃縮物を酢酸
により希釈して500ml中0.1N酢酸の最終濃度とし、アミ
コンPM10フイルターを用いて50mlに濃縮した。50mlの濃
縮物を0.1N酢酸により400mlに希釈し、同一のフイルタ
ーにより40mlに濃縮した。濃縮物を1N酢酸により希釈
し、得られた沈でんを遠心分離により除去した。得られ
た濃縮物を凍結乾燥した。凍結乾燥した材料を精製工程
に用いた。

ゲル浸透クロマトグラフイバイオーシルTSK−250カラム（600×21.5mm）〔バイ
オラツド（Bio−Rad）〕を高速液体クロマトグラフイ系
に取付けた。粗画分（10mg/ml）を0.1％水性三弗化酢酸
（0.1％TFA）中の40％アセトニトリルに溶解した。混合
物の2mlを注入し、溶離を0.1％TFA中の40％アセトニト
リルの移動相によりイソクラチカルに行つた。流速は2.
5ml/分でありチヤート速度は0.25cm/分に固定された。5
mlの画分を集めた。クロマトグラフイを室温で行つた。
それぞれ画分の部分を蒸発させそしてA375細胞の生長阻
害活性（GIA）について３回アツセイした。

３回の実験からの活性画分（画分21及び22）を集め
た。集めた材料は、合計約4.8×10⁵GIA単位を有した。
因子は、サイズ排除クロマトグラフイ（バイオーシルTS
K−250カラム）により測定して18kDの見掛け分子量を有
することが分つた。

TSK−250画分の逆相高速クロマトグラフイ（HPLC）上述の集めたTSK−250画分を0.1％TFAにより２倍に希
釈した。この混合物を室温でμ−ボンダパツク（Bondap
ak）−C18カラム（7.8×300mm）（C18¹とする）にイソ
クラチカルに注入した。流速を2.0ml/分に固定しチヤー
ト速度を0.25cm/分とした。線状勾配を一次溶媒0.1％TF
A及び二次溶媒アセトニトリル−TFA0.1％の間に用い
た。勾配条件は20分で０〜30％、次に150分で30〜45
％、20分で45〜55％そして10分で55〜100％であつた。
すべての溶媒はHPLCグレードであつた。4mlの画分を集
めそして各画分の一部を生長阻害活性についてアツセイ
した。画分72〜75が活性の大部分を含むことが分つた。
活性画分を41〜52％のアセトニトリル濃度で溶離した。

画分72〜75を集めた。0.1％TFA16mlを集めた画分を加
えた。混合物を室温でμ−ボンダパツク−C18カラム
（3.9×300mm）（C18²とする）に注入した。流速を1ml/
分に固定したチヤート速度を0.25cm/分とした。勾配条
件は10分で０〜35％、100分で35〜45％、10分で45〜100
％であつた。画分を集め一部を採りGIAについてアツセ
イした。多くの活性は40.7〜41.3％のアセトニトリル濃
度のカラムにあつた（保持時間83〜86分）。

活性画分を集め0.1％TFAにより２倍希釈し室温でμ−
ボンダパツク−C18カラム（3.9×300mm）（C18³とす
る）にイソクラチカルに注入した。流速は1ml/分であり
チヤート速度は0.25cm/分であつた。線状勾配を一次溶
媒0.1％TFAと二次溶媒ｎ−プロパノール−TFA（0.1％）
との間に用いた。勾配条件は、20分で０〜23％、120分
で23〜35％であつた。画分を集め各画分の一部をGIAに
ついてアツセイした。多くの活性は25〜26.5％のプロパ
ノール濃度で表れた（保持時間59分）。この明らかに均
一な画分は約300ngのたん白及び約40,000GIA単位を含ん
だ。

DNAへの³H−チミジン結合を用いる細胞生長調節アツセ
イ（GIA）アツセイは、96個の平穴プレート〔コスター（Cos−t
ar）3596〕で行われた。ヒト黒色腫細胞（A375）を感受
性インデイケーター細胞系として用いた。10％FCS及びP
Sを補給された0.1mlのデユルベツコ（Dulbecco）変性イ
ーグル培地（DMEM）中の細胞（３×10³）を各穴に入れ
た。３時間後、0.1mlのテストサンプルを各穴へ加え
た。プレートを３日間37℃でインキユベートした。次に
0.025ml（0.5μCi）の³H−チミジンの溶液（比活性27μ
Ci/μｇ）をインキユベーシヨンの最後の６時間に各穴
へ加えた。細胞をマルチウエル・ハーベスター〔PHD・
セル・ハーベスター（Cell Harvester）、ケンブリツジ
・テクノロジー（Cambridge Technology）〕を用いてガ
ラスフイルターの片に移した。フイルターをシンチレー
シヨンバイアルに移しそれに2mlのシンチレーシヨン液
体〔サイエンチバース（Scienti Verse）II、フイシヤ
ー、サイエンテイフイク・カンパニー（Fisher Scienti
fec Co）〕を加え、³H−チミジン結合を定量するために
シンチレーシヨンカウンターでカウントした。

ソフト寒天コロニー阻害アツセイ（TGI） 10％ウシ胎仔血清（FCS）を含むDMEM中の0.5％寒天
〔アガー・ノーブル（Agar Noble）；デイフコ・ラボラ
トリーズ（Difco Laboratories）、デトロイト、ミシガ
ン〕の0.5mlのベース層を24穴のコスター組織培養プレ
ートに加えた。0.5mlの同一培地−FCS混合物含有0.3％
寒天、１〜2.5×10³個のA375細胞及び種々の濃度でテス
トされるべき因子を寒天のベース層に重ねた。プレート
を空気中５％CO₂の湿つた雰囲気中で37℃でインキユベ
ートしそして同一の培地及び濃度の因子を含む0.3％寒
天0.5mlの添加を７日後行つた。コロニーを未固定且染
色で計算し、６個の細胞より大きいコロニーの数を７日
と14日との間に算えた。

結果 U937細胞から単離されたオンコスタチンＭの配列オンコスタチンＭのＮ末端配列及び内部フラグメント
を、還元且Ｓ−ピリジンエチル化ポリペプチド並にエン
ドプロテナーゼLys−Ｃ及びスタヒロコツカス・アウレ
ウス（Staphylococcus aureus）V8プロテアーゼによる
還元且Ｓ−ピリジンエチル化オンコスタチンＭの酵素分
解物から得られるペプチドのミクロ配列分析により求め
られた。ペプチドフラグメントは揮発性溶媒を用いる逆
相HPLCにより精製された。ペプチドを、モデル470Aたん
白シーケンサ〔アプライド・バイオシステムス・インコ
ーポレーテツド（Applied Biosysteme,Lnc.）〕で自動
化反復エドマン（Edman）デグラデーシヨンにかけた。
フエニルチオヒダントインアミン酸を、溶離のため酢酸
ナトリウムバツフアー／テトラヒドロフラン／アセトニ
トリル勾配を用いる。PTH−C18カラム（2.1×220mm,AB
I）を有する逆相HPLC（アプライド・バイオシステムス
・インコーポレーテツド）により分析した。

得られたアミノ酸配列は、第１図に示されたのと実質
的に同一であつた。

これらの配列と最近のたん白データベース〔PIRリリ
ース（Release）9.0、1986年５月）との比較は、任意の
他の周知の配列とは顕著な配列の類似性を示さなかつ
た。さらに、腫瘍元死因子、リンホトキシン、コロニー
刺激因子、インターロイキン１又は２又はβ−変性生長
因子とも類似性がない。

腫瘍細胞の増殖の阻害及び正常ヒト線維芽細胞の増殖の
増強前述のソフト寒天コロニー阻害アツセイを用いて、下
記の結果が得られた。

＊ A375細胞を、前述の如く最終容量2ml中の因子を含
有又は含有することなく、ソフト寒天に入れた。用いた
因子は、ピークの腫瘍生長阻害活性（GIA）を有するC18
プロパノールカラム画分からであつた。11日後コロニー
の数を算えた１個のコロニーを少なくとも６個の細胞の
集りとして定義した。1 GIA単位は、前述の如くミクロ
穴中のA375細胞への³H−チミジン結合を50％の阻害を生
ぜしめる量として定義された。

次の研究において、種々の処理を行つて、目的ポリペ
プチドの活性に対する、化学上又は物理学上の何れかの
処理の効果を求めた。下記の表は、その結果を示す。

透析された上澄み液が、１規定酢酸及び１規定水酸化
アンモニウムによる不活性化に対して実質的に抵抗する
ことを、上述の結果は立証する。従つて、目的化合物
は、やや強い酸及びやや強い塩酸の両方に比較的不感受
性である。目的化合物は、１時間56℃の熱処理に安定で
あるが、30分90℃ではそうではない。

目的化合物は、又熱安定性についてテストされ、そし
て１時間56℃の露出後その活性を維持することが分つた
が、30分間95℃の露出後ではその活性の実質的にすべて
を失つていた。

次の研究において、種々の腫瘍細胞の腫瘍細胞複製に
対する目的ポリペプチドの能力を調べた。下記の表は、
その結果を示す。

第３表 U937細胞からの精製オンコスタチンＭに
よる腫瘍細胞の複製の阻害 30％の阻害を生じさせるGIA単位腫瘍細胞 ³H−TdR結合 A549（肺癌） 21 HTB10（神経芽腫） 81 A375（黒色腫） 0.3 腫瘍細胞をマイクロ穴に入れ、前述の逆相HPLCにより
精製されたオンコスタチンＭを種々の濃度で加えた。３
日間のインキユベーシヨンの最後の６時間に、0.2mlの
培地中の細胞を³H−チミジン（³H−TdR）（0.5μ Ci/
穴）によりラベルした。１単位腫瘍生長阻害活性（GI
A）を、A375黒色腫細胞への₃H−TdR結合を50％阻害させ
る量として、第１表への説明で規定する。１単位は約10
pgの精製たん白であるとされ、それ故A549、HTB10及びA
375への³H−TdRの30％の阻害を生じさせる濃度（ng/m
l）は、それぞれ約1.4、4.0及び0.15ng/mlであつた。WI
26正常ヒト線維芽細胞への³H−TdR結合は、すべての実
験においてU937因子により抑制されなかつた。

オンコスタチンＭが、複製を阻害する能力において選
択的であり、そして細胞の性質に応じて広い範囲の効果
を有することを、上述の結果は立証する。目的化合物
は、黒色腫細胞例えばA375黒色腫細胞、扁平肺癌細胞例
えばA549及び神経芽腫細胞例えばHTB10に対して有効で
ある。

腫瘍細胞は３×10³個の細胞／穴に加えられ、正常な
線維芽細胞は３時間96穴プレートに1.5×10³個の細胞／
穴で加えられた。A375細胞に対するピーク抗増殖活性を
有するC18³カラムからの画分から得られた精製オンコス
タチンＭを種々の濃度で加え、そして３日後細胞への³H
−チミジン結合をそれぞれの濃度で３個の穴で測定し
た。結果を第４表に示す。

示された結果は、腫瘍細胞（A375、HTB10、A549及びS
K−MEL28）及び正常線維芽細胞（WI26及びWI38）にそれ
ぞれ結合された³H−チミジンの阻害％又は刺激％であ
る。1 GIA単位は、A375細胞への³H−チミジン結合を50
％阻害させるオンコスタチンＭの量として、第１表の説
明に定義される。

腫瘍細胞及び正常のヒトの線維芽細胞への³H−チミジ
ン結合に対する観察された特異的な効果を加えて、又第
２図に示されるように、オンコスタチンＭによる２個の
細胞のタイプの処理（３日間）後に、形態学及び細胞の
数に特異的な効果が観察される。

用いられるオンコスタチンＭは、A375細胞の増殖を阻
害するピーク活性を有するHPLC−C18³カラム画分からの
ものであつた。第２図は、A375黒色腫細胞の一連の顕微
鏡写真であり、それは未処理（Ａ）、５生長阻害活性
（GIA）単位のオンコスタチンＭによる処理（Ｂ）又は1
00単位処理（Ｃ）であつた。WI38線維芽細胞の顕微鏡写
真は、未処理（Ｄ）、５単位のGIAによる処理（Ｅ）又
は100単位処理（Ｆ）であつた。細胞は、0.5％メタノー
ル中のクリスタルバイオレツトにより染められた。倍率
＝63X。

オンコスタチンＭのNaDodSO₄/PAGE 還元条件下で行われるNaDodSO₄にかけられた精製オン
コスタチンＭは、第３図に示されるように、約28KDの見
掛け分子量を有することが分つた。下記のたん白を標準
（レーンＡ）として用いた。卵白アルブミン、Mr＝43K
D、キモトリプシノーゲンα、Mr＝25.7KD;ラクトグロブ
リンβ、Mr＝18.4KD;リゾチーム、Mr＝14.2KD;ウシトリ
プシン阻害剤＝6.2KD;インシユリンＡ及びＢ鎖、Mr＝そ
れぞれ2.3KD及び3.4KD。オンコスタチンＭは、レーンＢ
に適用された。

非還元条件下でPAGEにかけられたオンコスタチンＭ
は、又28KDの見掛け分子量を有し、そしてバンドから電
気溶離されたたん白は、A375細胞の増殖を阻害すること
が分つた。

オンコスタチンＭの合成ペプチドへの抗体の、放射免疫
沈でんにおける¹²⁵IラベルオンコスタチンＭとの反応ａ）ペプチド合成ペプチドはオンコスタチンＭたん白の残基６〜19へ相
当し、そして記述されたベツクマン（Beckman）自動化
装置において固相技術により合成された〔ゼントリー
（Gentry）ら「ジエー・バイオル・ケル」（1983）258,
11219〕。ペプチドは、「ロウーハイ（low−high）」HF
法を用いて樹脂から開発された〔タム（Tma）ら「ジエ
ー．アメリ．ケム．ソサ（J.Amer.Chem.Soc.）」（198
3）105,6442〜6445〕。精製は調整HPLCにより達成され
た。

ｂ）抗体の生成ペプチドを記載されたようにウシγ−グロブリンにカ
ツプリングした〔ゼントリー及びロウトン（Lawton）
「ウイロロジー（Wirology）（1986）152,421〜431〕。
ニユージーランド白色ウサギを、記載された如く皮下の
４個所で注入（５回）した〔ゼントリー及びロウトン
「ウイロロジー」（1986）152,421〜431〕。用いた抗血
清を５回目の注入２週間後に得た。

ｃ）オンコスタチンＭの沃素化部分的に精製したオンコスタチンＭのサンプルを公表
されたやり方〔リンスレー（Linsley）ら「PNAS」（198
5）82,356〜360〕を用いて沃素−125により放射ラベル
した。100,000cpmを含むラベルされた製品の一部を、Ｎ
−末端ペプチド（オンコスタチンＭのＮ末端17個のアミ
ノ酸）（２μｇ）の存在又は不存在下、オンコスタチン
ＭのＮ末端17個のアミノ酸に対するウサギ抗血清と混合
し（最終の希釈1:20）、記載された如く免疫沈でん分析
にかけた〔リンスレーら「バイオケミストー（Biochemi
stry）」（1986）25、2978〜2986〕。

特に、５μｌを含む１本の管は、0.1％BSAを含む10ml
のTNEN〔20mMトリスpH7.5、5mM EDTA.150mM NaCl、0.05
％モニデツト（Monidet）Ｐ−40〕中のＮ末端ペプチド
２μｇとともに、４℃で30分間予めインキユベートさ
れ、0.1％BSA及び40mMジチオスレイトール（DTT）を含
む85入TNEN中のI¹²⁵オンコスタチンＭを加えた。５μ
の抗血清を含む７本の管は、0.1％BSA及び40mM DTTを含
む85μのTNEN中のI¹²⁵オンコスタチンＭとともに、４
℃で30分間インキユベートされ、次に50μの10％ホル
マリン−固定スタヒロコツカス・アウレウス〔パンソル
ビン（Pansorbin）、カルビオケム（Calbiochem）〕を
加えた。

さらに４℃で30分間インキユベーシヨンした後、管を
マイクロフイージし、ペレツトを、PAGE分析にかける前
に1mlのTNENとともに４回洗つた。Mr＝32KDの拡散バン
ドが、免疫沈でん物のSDS/PAGE分析後に観察された。こ
のものの沈でんは、オンコスタチンＭのＮ末端17個のア
ミノ酸に相当する未ラベルペプチドを過剰に包含するこ
とにより阻害され、それは沈でんがこのペプチドに特異
的であることを示した。

オンコスタチンＭの炭水化物組成が、グリコシダーゼ
感受性をテストすることにより求められた。上述のｃに
おけるように製造された免疫沈でん物を、リンスレーら
（1986）により記載された如く、ハツフアー、エンドグ
リコシダーゼＨ又はニユーラミニダーゼにより処理され
た。Ｎ結合高マンノースオリゴ糖に特異性を有する酵素
であるエンドグリコシダーゼＨによる処理では、Mr＝24
KDの低分子量物の出現をもたらした。放射ラベルされた
物質の一部のみが、この酵素に感受性を有し、これはす
べての分子が高マンノースオリゴ糖を含むものではない
ことを示した。ニユーラミニダーゼにより処理では、Mr
＝27KDの単一のバンドの出現がもたらされ、未処理¹²⁵I
ラベルオンコスタチンＭの大きさの不均一性が、糖たん
白中心のシリアル化の分子の不均一性によることを示し
た。オンコスタチンＭの活性製品が、高マンノース及び
コンプレツクスＮ結合オリゴ糖側鎖の混合物を含むこと
を、結果は示した。

正常ヒト末梢血液リンパ球（PBL）から単離されたオン
コスタチンＭ PBLからの腫瘍細胞生長阻害剤の生成ブラツド・バンク（Blood Bank）から得られたPBLを
含む白血球画分をホスフエート・バツフアー生理食塩水
pH7.4（PBS）により１対１に希釈した。35mlの希釈した
血液を、20容量％の50％ナトリウムジアトリゾエートを
含む９％のフイコル（Ficoll）よりなる溶液10mlの下に
置いた（最終の比重1.080）。勾配を850×ｇで30分間室
温で遠心分離した。細胞は勾配の界面から集めそしてPB
Sにより洗つた。赤血球を、0.8％塩化アンモニウム及び
0.1％Na₄−EDTAを含む溶液10〜20mlとともに３〜４分間
シヨツク分解した。

細胞を10分間600×ｇで遠心分離することにより赤血
球分解溶液から集め、そして５％のウシ胎仔血清を含む
RPMI 1640倍地（GIBCO）10mlに再懸濁した。トロンビ
ンを加えて最終濃度を0.5U/mlとした。細胞懸濁液を37
℃で５分間攪拌し、そして血小板凝集物を５分間で沈降
させさ。懸濁した細胞を新しい管に移し、遠心分離によ
り回収し、1mlのウシ胎仔血清に再懸濁し、そして0.5g
のフラツシユされた予め湿つたナイロンウール、タイプ
200〔フエンワン（Fenwal）〕を含むカラムに移した。

ナイロンウールカラムを60分間37℃でインキユベート
して単核及びＢリンパ球を付着させた。カラムを次に３
倍量の５％ウシ胎仔血清を含むPPMI 1640倍地（37℃）
により洗い、そして溶離した接着していない細胞（PB
L）を集めた。

PBL（２×10⁶個の細胞/ml）を、RPMI 1640倍地（10.4
g/）〔FeSO₄・7H₂O（1mg/）、ZnSO₄・7H₂O（2mg/
）、Na₂SeO₃・5H₂O（0.017mg/）、１−アミノエタ
ノール（1mg/）、ヒトトランスフエリン（5mg/）、
ウシ血清アルブミン・リノレン酸共役物〔シグマ（Sigm
a）〕（200mg/）、Ｌ−グルタミン（300mg/）、ペ
ニシリン／ストレプトマイシン（100,000単位／）及
びフイトヘマグルチニン−ｐ〔ウエルカム（Wellcom
e）〕（2mg/）含有〕中で、96時間５％CO₂−95％空気
で、37℃で培養した。上澄み液を集め、遠心分離して細
胞を除去し、超過〔アミコン・、ダイヤフロ膜、YM−
10、10KDカツトオフ〕によ濃縮し、0.1M酢酸に対して透
析した〔スペクトラポア（Spectrapore）３透析チユー
ビング〕。透明は保持物を凍結乾燥した。

ゲル浸透クロマトグラフイ粗画分を1M酢酸（50mg/ml）20mlに溶解し、そして0.5
ml/分の流速で1M酢酸により平衡させられたバイオゲル
（Bio Gel）Ｐ−100カラム（2.6×88cm）に適用した。1
2mlの画分を集めた。各画分の一部を蒸発させそしてA37
5細胞の生長阻害活性（GIA）について３回アツセイし
た。活性画分を集め、凍結乾燥し、記載された如くバイ
オ−シルTSK−250カラム（600×21.5mm）に再クロマト
グラフイした。

TSK−250画分の逆相高速クロマトグラフイ集めたTSK−250画分の最終の精製は、主として記載さ
れた如く逆相HPLCにより達成された。PBL−誘導腫瘍細
胞阻害剤は、それぞれ40〜41％アセトニトリル及び26.5
％−プロパノール濃度でμ−ボンダパツクC18支持体か
ら溶離した。

DNAへの¹²⁵I−ヨードデオキシウリジン結合を用いる細
胞生長調節アツセイこれらのアツセイは、平底96穴組織培養トレイ（コス
ター3596）で行われた。テストサンプル50μ中のヒト
黒色腫細胞A375（４×10³個）を各穴に加えそして37℃
で３日間インキユベートした。細胞を¹²⁵I−IdU（0.05
μCi/穴）により24時間ラベルし、さらに24時間インキ
ユベートした。細胞を３回洗い、マルチプル・サンプル
・ハーベスターで培養し、放射能をガンマカウンターで
カウントした。

結果 PBL誘導腫瘍細胞阻害剤の一つの製品を自動反復エド
マン・デグラデーシヨンにかけた。アミノ末端アミノ酸
配列は次の通りである。

Ｘは同定されなかつたアミノ酸を表す。

この配列とU937因子のそれとの比較は、PBL誘導因子
のＮ−末端との同一性を明らかに示す。

次の研究において、種々の細胞の複製を行うPBL誘導
オンコスタチンＭの能力を調べた。マウスL929細胞は10
00GIA単位/ml以内を用いてPBL誘導オンコスタチンＭに
対して不感受性であつた。ヒト線維芽細胞WI26は刺激さ
れて、1000GIA単位/mlによる処理により生長した。正常
ヒトＴリンパ球増殖（有糸分裂27時間後）は、500GIA単
位/ml以内による影響されなかつた。

新規なポリペプチド及びポリペプチドフラグメントが
提供され、それは細胞生長の調節に用いられることが、
上述の結果から明らかである。化合物は、関係のある細
胞系の性質に応じて、種々の活性を有することが分り、
それはそれ自体又は細胞生長を調節する他の化合物と組
合わさつて用いられよう。それ故目的ポリペプチドは、
生体内又は生体外の両方で、細胞の混合物とともに用い
られる追加のポリペプチドに加えて、選択的に特別なタ
イプの細胞の増殖を低下又は増大させる。

特に、因子は自家骨髄移植のための細胞を処理するの
に用いられうる。因子の使用は、骨髄中の腫瘍細胞の生
長を阻害し、コロニー細胞の形成を刺激しよう。オンコ
スタチンＭは、又上皮細胞の生長を刺激するのに用いら
れて、それにより傷の治ゆを早める。さらに無処理のポ
リペプチド又はそのフラグメントは、免疫源として用い
られて、抗体の形成を誘発する。誘発された抗体は、体
液中に存在するオンコスタチンＭを滴定し、又はそれに
結合することにより因子の活性を調節するのに用いられ
る。その上、精製されたオンコスタチンＭ又はそのフラ
グメントとともにこれらの抗体は、他の試薬特にオンコ
スタチンＭを検出且定量する抗体とともに診断キツトの
一成分として用いられる。

前述の発明は、理解を明確にするために説明及び例に
よりやや詳しく記載されたが、或る変更及び変化は特許
請求の範囲内で行われうることは明らかである。

【図面の簡単な説明】

第１図はオンコスタチンＭのフラグメントのアミノ酸配
列を示し、第２図はオンコスタチンＭにより処理された
細胞の一連の顕微鏡写真であり、第３図はオンコスタチ
ンＭのSDS−PAG分析の顕微鏡写真である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者ハンスマーカードアメリカ合衆国ワシントン州 98040 マーカーアイランドエスイーフオーテイシックスストリート 9222 (72)発明者マーシアビーハンソンアメリカ合衆国ワシントン州 98115 シアトルエヌイーナインテイセブンスストリート 2531

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】細胞くず及び他の白血球蛋白を含まない白
血球蛋白由来のポリペプチド細胞生長調節因子であり、
該ポリペプチドは、腫瘍性細胞の増殖を阻害し、正常の
ヒト線維芽細胞の増殖を刺激し、増殖性且つ細胞毒性ヒ
トＴ細胞応答を阻害することなく、顆粒球性／骨髄球性
骨髄コロニー形成を阻害することなく、ゲル排除クロマ
トグラフィーによる測定で約17〜19kDの分子量及びSDS
−PAGEによる測定で約28kDの分子量を有し、そして1N酢
酸及び1N水酸化アンモニウムに対して比較的不感受性で
あり、56℃の温度での１時間の加熱処理に対して安定で
ある分子からなり、且つ下記のＮ−末端フラグメントの
アミノ酸の部分配列を含むことを特徴とする、白血球蛋
白由来のポリペプチド細胞生長調節因子。
【請求項２】ポリペプチドが下記のＮ−末端フラグメン
トのアミノ酸の部分配列（１）及び内部ペプチドフラグ
メントのアミノ酸の部分配列（２）及び（３）を含む特
許請求の範囲第１項記載のポリペプチド細胞生長調節因
子。
【請求項３】白血球が有糸分裂促進物質で活性化された
正常ヒト末梢血液リンパ球又はホルボールジエステル誘
発ヒト組織球リンパ腫細胞である特許請求の範囲第１項
記載のポリペプチド細胞生長調節因子。
【請求項４】有糸分裂促進物質がフィトヘマグルチニン
である特許請求の範囲第３項記載のポリペプチド細胞生
長調節因子。
【請求項５】細胞くず及び他の白血球蛋白を含まない白
血球蛋白由来のポリペプチド細胞生長調節因子であり、
該ポリペプチドは、腫瘍性細胞の増殖を阻害し、正常の
ヒト線維芽細胞の増殖を刺激し、増殖性且つ細胞毒性ヒ
トＴ細胞応答を阻害することなく、顆粒球性／骨髄球性
骨髄コロニー形成ぽ阻害することなく、ゲル排除クロマ
トグラフィーによる測定で約17〜19kDの分子量及びSDS
−PAGEによる測定で約28kDの分子量を有し、そして1N酢
酸及び1N水酸化アンモニウムに対して比較的不感受性で
あり、56℃の温度での１時間の加熱処理に対して安定で
ある分子からなり、且つ下記のＮ−末端フラグメントの
アミノ酸の部分配列を含む白血球蛋白由来のポリペプチ
ド細胞生長調節因子及び生理学的に許容し得る担体から
なる細胞生長調節用医薬組成物。
【請求項６】ポリペプチドが下記のＮ−末端フラグメン
トのアミノ酸の部分配列（１）及び内部ペプチドフラグ
メントのアミノ酸の部分配列（２）及び（３）を含む特
許請求の範囲第５項記載の医薬組生物。
【請求項７】組成物がポリペプチド細胞生長調節因子を
含み、且つその特異的活性が少なくとも100GIA単位/ng
蛋白である特許請求の範囲第５項記載の医薬組成物。