JP2562085B2 - 酵素の安定化方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、酵素が水溶液状態で安
定性を維持できる酵素の安定化方法、安定化された酵素
結合物に関する。

【０００２】

【従来の技術】酵素は温和な条件で触媒反応を行うこと
ができるため、近年、臨床検査、生化学、食品工業等の
分野で酵素の利用が盛んに行われている。酵素の利用に
際しては、あらかじめ酵素溶液として存在するものを用
いるのが便利であるが、しかし一般に酵素は不安定なも
のであり、特に溶液中での酵素の安定性は低い。そこ
で、これまでにも酵素の溶液中での安定化が種々に試み
られてきた。例えば酵素溶液にグルタミン酸ソーダ、ア
ルブミン、スキムミルク等のアミノ酸又は蛋白質、シュ
クロース、マルトース等の糖類、グルタチオン、メルカ
プトエタノール等の還元剤、グリセロール、ソルビトー
ル等の多価アルコール及びカルシウム塩、マグネシウム
塩等の塩類をそれぞれ添加する方法、或いはデキストラ
ン等の水溶性高分子を酸化したのち還元剤でアルデヒド
体とし、このものに酵素を共有結合で固定化させる安定
化方法（特開昭６４−６０３８０号）がある。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】酵素溶液にいわゆる安
定化剤を添加し、酵素を安定化させる方法は、酵素の種
類により安定な添加剤が異なるのが一般的であり、その
ため用いる酵素に応じて特定の安定化剤を選択する必要
があった。

【０００４】酵素を水溶性高分子に共有結合法で固定化
する方法は酵素の汎用的安定化方法として優れている
が、しかしこの方法は、酵素を固定化する際に酵素の回
収率が低いという欠点がある。例えば特開昭６４−６０
３８０号での固定化酵素の回収率は５０％以下である。
このように、これまでは溶液中での酵素を安定化するに
際して汎用可能でかつ効率的な方法は存在しなかった。

【０００５】

【課題を解決するための手段】そこで本発明者らは、溶
液中での酵素を安定化するための汎用可能でかつ効率的
方法を求め鋭意検討した。そして溶液中の酵素をアニオ
ン型に解離させたのちカチオン型の水溶性高分子とイオ
ン結合させることにより、効率的に酵素を安定化させる
ことを知り、本問題を解決できたのである。

【０００６】即ち本発明は溶液中の酵素の解離をアニオ
ン型としたのちカチオン型水溶性高分子を添加し、酵素
と水溶性高分子とをイオン結合させることを特徴とする
酵素の安定化方法、水溶性高分子イオン結合酵素に関す
る。

【０００７】本発明に使用する酵素としては、動物、植
物及び微生物由来のいずれでもよい。又酵素の種類とし
てはいわゆる加水分解酵素、酸化還元酵素、転移酵素等
のいずれでもよい。具体例を挙げると加水分解酵素のグ
ルコアミラーゼ、リパーゼ、トランスグルコシダーゼ、
酸化還元酵素のグルコースデヒドロゲナーゼ、グルコー
スオキシダーゼ、転移酵素のトランスグルタミナーゼ等
である。

【０００８】本発明においてはまず酵素を溶液中でアニ
オン型に解離させる必要がある。酵素は蛋白質であり、
溶液中に固有の等電点を有している。従って、酵素がア
ニオン型を示すためには溶液のｐＨを適当な緩衝液を用
いて酵素の等電点より高いｐＨとすればよい。この際に
当然のことながら酵素の失活を起こさないよう留意する
必要がある。

【０００９】適当な緩衝液としては例えばリン酸緩衝
液、トリス塩酸緩衝液、酢酸緩衝液、グッド緩衝液、Ｔ
ＥＡ／ＨＣｌ（トリエタノールアミン塩酸）緩衝液等で
ある。

【００１０】又本発明に用いるカチオン型水溶性高分子
としては、ＤＥＡＥ−デキストラン、ポリエチレンイミ
ン等である。

【００１１】溶液中でアニオン型に解離した酵素とカチ
オン型水溶性高分子とのイオン結合法としては、特別な
操作を必要としない。単に水溶性高分子に酵素を加え数
分間室温で攪拌するのみでよい。このように極めて簡単
なためイオン結合の際に酵素の失活はほとんど認められ
ない点が本発明の特徴である。

【００１２】以下、実施例にて本発明を具体的に説明す
る。

【実施例】実施例１ グルコースデヒドロゲナーゼ（以下ＧＤＨともいう）
（天野製薬社製、ｐＩ６．０）を５０ｍＭリン酸緩衝液
（ｐＨ７．０）に溶解し（酵素濃度０．１ｕ／ｍｌ）、
この酵素溶液にＤＥＡＥ−デキストラン（ファルマシア
製）を１０００〜１５０００ｐｐｍそれぞれ添加し、２
５℃及び５０℃での経時変化を調べ、ＤＥＡＥ−デキス
トランイオン結合の酵素の安定性を調べた。その結果は
表１に示される。なおＧＤＨの活性測定法は次のとおり
である。

【００１３】Ｄ−グルコース ５ｍＭ、ＮＡＤ ０．３
ｍＭを含むリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）５０ｍＭに酵素
溶液を加えて光度計セル内にて２５℃で反応させ、３４
０ｎｍにおける吸光度の増大を調べることにより行っ
た。反応の１分間に１μｍｏｌｅのＮＡＤＨを生成する
酵素活性を１単位とした。

【００１４】

【表１】

【００１５】表１より明らかなようにＤＥＡＥ−デキス
トラン添加により５０℃でのＧＤＨの溶液安定性が約５
０倍増大している。

【００１６】実施例２ グルコースデヒドロゲナーゼ（天野製薬社製、ｐＩ
６．０）を５０ｍＭトリエタノールアミン塩酸緩衝液
（ｐＨ７．０）に溶解し（酵素濃度０．００１ｍｇ／ｍ
ｌ）、この酵素溶液にＰＥＩを２４６，４９１，９６６
ｐｐｍとなるようそれぞれ添加し、５０℃での経時変化
を調べ、ＰＥＩイオン結合酵素の安定性を調べた。活性
測定は、緩衝液をリン酸緩衝液にかえてトリエタノール
アミン塩酸緩衝液を用いる以外は実施例１に準じて行っ
た。結果は表２に示される。

【００１７】

【表２】

【００１８】表２より明らかなようにＰＥＩ ５００ｐ
ｐｍ添加により無添加に比してＧＤＨの５０℃での溶液
安定性が約２４７０倍も増大している。

【００１９】実施例３ グルコースオキシダーゼ（以下ＧＯともいう、天野製薬
社製、ｐＩ ４．５）を１００ｍＭトリス塩酸緩衝液
（ｐＨ７．７）に溶解し（酵素活性２０．２ｕ／ｍ
ｌ）、この酵素溶液に５０００ｐｐｍ又は１５０００ｐ
ｐｍ濃度になるようにＤＥＡＥ−デキストラン、３００
ｐｐｍ濃度になるようにＰＥＩを添加し、６０℃で１５
分放置後残存活性を測定し、ＧＯの酵素安定化に及ぼす
ＤＥＡＥ−デキストラン及びＰＥＩイオン結合酵素の安
定性を調べた。その結果は表３に示される。なお、ＧＯ
活性測定法は以下に示される。

【００２０】０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）１０
０ｍｌ中にｏ−ジアニシジン６６ｍｇを含む試薬を作成
した後セルに該試薬２．４ｍｌを加え、次いで１０％グ
ルコース液０．５ｍｌ、ペルオキシダーゼ（５００ｕ／
ｍｌ）を０．０１ｍｌ加え２５℃５分予熱後、酵素液
（０．１ｕ／ｍｌになるよう０．１Ｍリン酸緩衝液で調
整）０．１ｍｌを加え、５分間の吸光度変化を４３６ｎ
ｍで測定する。１分間に１μｍｏｌｅの過酸化水素を生
成するのに要する酵素量を１単位とする。

【００２１】

【表３】

【００２２】但し、表３において、＊はＤＥＡＥ−デキ
ストランを、＊＊はＰＥＩを示す。表３より明らかなよ
うにＤＥＡＥ−デキストラン濃度１５０００ｐｐｍ添加
により無添加に比して４．１倍ＧＯの安定性が向上して
いることがわかる。

【００２３】実施例４ トランスグルコシダーゼ（天野製薬社製、ｐＩ ４．５
〜５．０）を１０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）に溶解
し（酵素活性１．７４６ｕ／ｍｌ）、この酵素溶液にＤ
ＥＡＥ−デキストランを５０００ｐｐｍ又は１５０００
ｐｐｍ濃度になるよう添加し、６５℃、１時間放置後の
残存活性を調べ、ＤＥＡＥ−デキストランイオン結合ト
ランスグルコシダーゼの安定性を調べた。その結果は表
４に示される。なお、トランスグルコシダーゼ活性測定
法は以下のとおりである。

【００２４】イソマルトース０．３ｇを量り、０．０１
Ｎ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）を加えて溶解し、１００ｍ
ｌとしたものを基質とし、試験管に該基質２ｍｌを入れ
４０℃、５分予熱後、酵素溶液０．５ｍｌを加え４０℃
６０分反応する。反応後０．３Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐ
Ｈ８．０）２．５ｍｌを加え振り混ぜる。この液０．２
ｍｌを試験管にとり、これに４−アミノアンチピリン−
フェノールグルコースオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ
発色試薬３ｍｌを加え、よく振り混ぜた後４０℃２０分
放置し、５００ｎｍにおける吸光度を測定する。６０分
間に１ｍｇのグルコースを生成する酵素力を１単位とす
る。

【００２５】

【表４】

【００２６】表４より明らかなようにＤＥＡＥ−デキス
トラン濃度１５０００ｐｐｍ添加によりトランスグルコ
シダーゼの６５℃での安定性が約１７倍増大している。

【００２７】実施例５ グルコアミラーゼ（天野製薬社製、ｐＩ ３．８〜４．
０）を１０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）に溶解し（酵
素活性０．９８３ｕ／ｍｌ）、この酵素溶液にＤＥＡＥ
−デキストランを１５０００ｐｐｍ又は４５０００ｐｐ
ｍ濃度になるよう添加し、６０℃、１時間放置後の残存
活性を調べ、ＤＥＡＥ−デキストランイオン結合グルコ
アミラーゼの安定性を調べた。その結果は表５に示され
る。なお、グルコアミラーゼ活性測定法は以下のとおり
である。

【００２８】可溶性デンプン２．３８１ｇを量り、約５
０ｍｌの沸騰水に溶解し、水で１００ｍｌとしたものを
基質とし、試験管に該基質１ｍｌ及び０．０２Ｎ酢酸緩
衝液（ｐＨ５．０）１ｍｌを量り、４０℃で５分間以上
放置した後、酵素液０．５ｍｌを加え振り混ぜる。これ
を４０℃６０分反応後、沸騰水浴中に入れ５分間加熱
し、流水中で冷却する。この液０．１ｍｌを試験管にと
り、これに４−アミノアンチピリン−フェノール グル
コースオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ発色試薬３ｍｌ
を加え、よく振り混ぜた後４０℃で２０分間放置し、５
００ｎｍにおける吸光度を測定する。６０分間に１ｍｇ
のグルコースを生成する酵素力を１単位とする。

【００２９】

【表５】

【００３０】表５より明らかなようにＤＥＡＥ−デキス
トラン濃度４５０００ｐｐｍ添加によりグルコアミラー
ゼの６０℃での安定性が約２．５倍増大している。

【００３１】実施例６ トランスグルタミナーゼ（特開平１−２７４７１号に記
載された方法にて調製、ｐＩ８．９）を０．１Ｍ炭酸緩
衝液（ｐＨ１０．０）に溶解し（酵素濃度１．３ｕ／ｍ
ｌ）、この酵素溶液中にＰＥＩ ２５０ｐｐｍ又は７５
０ｐｐｍになるよう添加し、３７℃で２時間後の残存活
性を調べ、ＰＥＩイオン結合トランスグルタミナーゼの
安定性を調べた。その結果は表６に示される。なお、ト
ランスグルタミナーゼ活性測定法は以下のとおりであ
る。

【００３２】 試薬Ａ ０．２Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ６．０） ０．１Ｍヒドロキシルアミン ０．０１Ｍ還元型グルタチオン ０．０３Ｍベンジルオキシカルボニル−Ｌ−グルタミニ
ルグリシン 試薬Ｂ ３Ｎ−塩酸 １２％−トリクロロ酢酸 ５％ＦｅＣｌ₃・６Ｈ₂Ｏ（０．１Ｎ−ＨＣｌに溶解） 上記溶液の１：１：１の混合液を試薬Ｂとする。 酵素液の０．０５ｍｌに試薬Ａ０．５ｍｌを加えて混合
し３７℃で１０分間反応後、試薬Ｂを加えて反応停止と
Ｆｅ錯体の形成を行った後５２５ｎｍの吸光度を測定す
る。対照としてあらかじめ熱失活させた酵素液を用いて
同様に反応させたものの吸光度を測定し、酵素液との吸
光度差を求める。別に酵素液のかわりにＬ−グルタミン
酸γ−モノヒドロキサム酸を用いて検量線を作成し、前
記吸光度差より生成されたヒドロキサム酸の量を求め、
１分間に１μモルのヒドロキサム酸を生成する酵素活性
を１単位とした。

【００３３】

【表６】

【００３４】表６より明らかなようにＰＥＩ ７５０ｐ
ｐｍ濃度ではトランスグルタミナーゼの３７℃での安定
性が約４．３倍増大している。

【００３５】実施例７ リパーゼ（商品名リパーゼＦ「アマノ」、天野製薬社
製、１５０００ｕ／ｇ）を０．０５Ｍリン酸緩衝液（ｐ
Ｈ７．０）に溶解し（酵素濃度１５０ｕ／ｍｌ）、アニ
オン型に解離させ、次いでＤＥＡＥ−デキストランを５
０００ｐｐｍになるよう添加し、３７℃５時間後の残存
活性を調べ、ＤＥＡＥ−デキストランイオン結合リパー
ゼの安定性を調べた。その結果は表７に示される。なお
リパーゼ活性測定法は次のとおりである。

【００３６】オリーブ油１．０ｍｌと酵素溶液１．０ｍ
ｌ、トリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）５ｍｌを混合し、
３７℃３０分間反応させた（６００ｒｐｍで攪拌）。次
いで２０ｍｌのアセトン−エタノール（１：１）を加え
反応停止し、１％フェノールフタレイン溶液を指示薬と
して０．１Ｎ ＫＯＨで適定した。１分間に１μｍｏｌ
ｅの脂肪酸を遊離する酵素量を１０単位とする。

【００３７】

【表７】

【００３８】表７より明らかなようにＤＥＡＥ−デキス
トラン無添加のリパーゼは失活が認められるのに対し、
添加した場合は全く失活が認められなかった。

【００３９】

【発明の効果】本発明により溶液中での酵素の汎用的か
つ効率的な安定化方法が可能となり、臨床検査、生化
学、食品工業分野での酵素利用の拡大が期待できる。

Claims (4)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】酵素を該酵素の等電点より高いｐＨの緩衝
   液に溶解して溶液中の酵素の解離をアニオン型としたの
   ちカチオン型水溶性高分子を添加し、酵素と水溶性高分
   子とをイオン結合させることを特徴とする酵素の溶液中
   での安定化方法。
2. 【請求項２】 カチオン型水溶性高分子がＤＥＡＥ−デ
   キストラン又はポリエチレンイミンである請求項１記載
   の酵素の安定化方法。
3. 【請求項３】酵素を該酵素の等電点より高いｐＨの緩衝
   液に溶解して溶液中でアニオン化せしめた酵素とカチオ
   ン型水溶性高分子とをイオン結合させて得られる水溶性
   高分子イオン結合酵素。
4. 【請求項４】 酵素がグルコースデヒドロゲナーゼ、グ
   ルコースオキシダーゼ、リパーゼ、グルコアミラーゼ、
   トランスグルコシダーゼ、トランスグルタミナーゼのう
   ちのいずれかである請求項３記載の水溶性高分子イオン
   結合酵素。