JP2581566B2 - 鉄コロイド標識抗体及びその製法並びにこれを用いる組織細胞化学的検出方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は医学，生物学実験に於て、細胞や組織の特殊
構成物質を光学顕微鏡（光顕）及び電子顕微鏡（電顕）
を用いて組織細胞化学的に検出する際に用いられる、新
規で有用な鉄コロイド標識抗体に関するものである。

〔従来の技術及びその問題点〕

組織及び細胞内に存在する特殊物質、並びに組織細胞
構成々分の組織細胞化学的検出に用いられる標識抗体と
しては、これまでに、螢光抗体、ペルオキシダーゼ標識
抗体、フェリチン抗体、金コロイド標識抗体等が知られ
ており、一般に広く用いられている。

これら各種標識抗体を用いる組織細胞化学的検出方法
の内、螢光抗体法は紫外線顕微鏡用に開発されたもので
あり、一般光顕用にも、電顕用にも利用できないし、像
も不鮮明である。また、ペルオキシダーゼ標識抗体法
（PAP法）は非常に優れた方法であり、光顕用及び電顕
用に現在広く用いられているが、電顕下では反応生成物
が瀰慢性に現れるために、オスミウム酸、酢酸ウラン、
クエン酸鉛等で後染色した標本では反応生成物の存在が
不明瞭になり勝ちである。この点、フェリチン抗体法や
金コロイド標識抗体法による染色は極めて明瞭な電顕像
を与えるが、光顕的には明瞭な像を期待し難く、而も標
識抗体のサイズが大きい為に組織への浸透性が著しく悪
いと言うデメリットを有する。

〔発明の目的〕

本発明は上記した如き状況に鑑みなされたもので、標
識抗体を用いる組織細胞化学的検出方法に於て光顕的に
も電顕的にも使用でき、而も組織浸透性に優れ何れの場
合にも明瞭な染色像を与える新規で有用な標識抗体を提
供することを目的とする。

〔発明の概要〕

本発明は、抗体タンパクであるIgG又はその抗原結合
分画に、有機酸、アミノ酸又はこれらの塩により安定化
された鉄コロイドを結合させてなる、その特殊抗体とし
ての性格を保持した鉄コロイド標識抗体、及び有機酸、
アミノ酸又はこれらの塩により安定化された鉄コロイド
をpH約7.4〜約7.5に於てIgG又はその抗原結合分画と混
合することを特徴とする鉄コロイド標識抗体の製法、並
びに標識抗体を用い組織抗原染色法により検出を行なう
組織細胞化学的検出方法に於て、標識抗体として、有機
酸、アミノ酸又はこれらの塩により安定化された鉄コロ
イドを結合させてなる鉄コロイド標識抗体を用いること
を特徴とする、組織細胞化学的検出方法の発明である。

即ち、本発明者は上記目的を達成すべく鋭意研究を重
ねた結果、鉄コロイドを標識物質として抗体タンパクの
IgG又はこの抗原結合分画（即ち、Fab,Fab′,F（ab′）
_２等）に結合させた鉄コロイド標識抗体が目的に適う極
めて有用な標識抗体となることを見出し、本発明を完成
させるに到った。

本発明の鉄コロイド標識抗体は、通常下記の如くして
容易に得ることができる。即ち、鉄コロイドとしては通
常、カコジル酸又はその塩で安定化された、所謂カコジ
ル酸鉄コロイド（以下、FeCacと略記する。）を用い、
これをpH約7.4〜約7.5に於て抗体タンパクであるIgG又
はその抗原結合分画（即ち、Fab,Fab′,F（ab′）
_２等）と混合すれば、FeCacはIgG又はその抗原結合分画
と容易に結合してFeCac標識抗体となる。FeCacは、通常
IgG又はその抗原結合分画に対し過剰に用いられるが、
未反応のFeCacは陽イオン交換樹脂を用いたカラムクロ
マトグラフィーにより吸着除去される。未反応FeCacを
除いた後の反応液（FeCac標識抗体溶液）は必要に応じ
て限外過フィルター等により濃縮し、FeCac標識抗体
を単離する。

FeCacは文献、例えば生命の科学37（４）,362−364
（1986）等に記載の方法に従って、例えば0.1MのFeCl₃
溶液１容を撹拌下９容の沸騰水中に加え、室温に冷却後
これに0.1Mカコジル酸緩衝液（pH7.3〜7.4）５容を加え
るとか、或は、例えば0.1MのFeCl₃溶液１容に0.1Mカコ
ジル酸アンモニウム液（0.1Mカコジル酸液にアンモニア
水を加えてpH7.3としたもの）９容を加えて煮沸し、液
の色が赤褐色になった時点で煮沸を止め、室温に冷却後
カコジル酸アンモニウム液で適宜希釈するとかして調製
すればよい。

本発明の鉄コロイド標識抗体は、カコジル酸又はその
塩で安定化された鉄コロイドを用いて調製することが特
に望ましいが、カコジル酸の代りにクエン酸、酢酸、乳
酸、プロピオン酸等の有機酸やそれらの塩類、或はアス
パラギン、アスパラギン酸、ヒスチジン等のアミノ酸や
それらの塩類等を用いて同様に安定化された鉄コロイド
を用いて調製することも可能である。

本発明に係るFeCac標識抗体の結合は極めて安定で、
固定組織の対応抗原と特異的に反応する。即ち、本発明
のFeCac標識抗体はFeCacを結合したことによってその特
殊抗体としての性格が失われるようなことはない。

本発明の鉄コロイド標識抗体を用いて組織や細胞を染
色すれば、光顕的にはプルシアン青反応により、また電
顕的には鉄コロイド粒子の特異的な形と電子不透過性か
ら極めて的確に、後染色を施した組織や細胞の上で目的
とする物質の局在を知ることができる。即ち、光顕観察
の場合には、例えばホルマリン固定パラフィン切片を脱
パラフィンし、４℃で一夜本発明の鉄コロイド標識抗体
溶液と反応させた後、洗浄して余分の抗体を除き、プル
シアン青反応を施し、ケルンエヒトロートで後染色する
と組織の抗原は深青色に染色される。また、電顕観察の
場合には、例えばZamboni固定組織をビブラトームで60
〜100μの切片とし、常法に従って本発明の鉄コロイド
標識抗体で染色すれば組織の抗原の部位に局在してコロ
イド鉄粒子が認められる。

本発明の鉄コロイド標識抗体を用いた組織抗原染色法
はPAP法と比べて操作が簡便で、しかも、PAP法が内因性
ペルオキシダーゼにより、またフェリチン抗体法が内因
性フェリチンにより夫々干渉を受けるのに対し、そのよ
うな弊害は全くない。また、組織浸透性において金コロ
イド標識抗体に優る。

本発明の鉄コロイド標識抗体を用いた組織抗原染色法
によれば、検出対象物質、例えば各種免疫グロブリン、
リンパ球系細胞膜抗原、細胞内酵素（例えば、膵ランゲ
ルハンス島内のグルカゴンやインスリン，或は外分泌細
胞のエラスターゼなど）、癌胎児由来抗原、ウイルス抗
原等の各種抗原類や、Ｓ−100蛋白、ニューロン特異性
エノラーゼ（NSE）等の特異蛋白質等を選択的に且つ極
めて鮮明に染め分けることができるので、その存在や細
胞内局在の分布等を容易に確認することができ、その精
度も極めて高い。

また、本発明の鉄コロイド標識抗体、特にFeCac標識
抗体はウエスタン・ブロッティングにも極めて効果的に
使用し得る。

以下に実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明する
が、本発明はこれら実施例により何ら制約を受けるもの
ではない。

〔実施例〕

実施例 1. 0.1Mの塩化第二鉄溶液１容を９容の沸騰蒸留水中に、
温度が下がらないように注意しながら徐徐に滴下し、鉄
コロイド液を調製した。得られた鉄コロイド液を室温に
冷却し、これに0.1Mのカコジル酸緩衝液（pH7.4）５容
を加え、液のpHを1NのNaOHで7.4〜7.5とした後、この溶
液24容にIgG溶液（25mg/ml）１容を加えてよく撹拌混合
し、過剰の鉄コロイドをアンバーライトCG50（陽イオン
交換樹脂）を用いたカラムクロマトグラフィーにより吸
着除去して、コロイド鉄標識IgGを得た。コロイド粒子
の大きさは30〜50Åであった。

実施例 2. 0.1Mの塩化第二鉄溶液１容に0.1Mのカコジル酸溶液９
容を加え、アンモニア水を用いて溶液のpHを7.3とし
た。この溶液を煮沸し、液が赤褐色に変色した時点で煮
沸を止めて室温に冷却し、鉄コロイド溶液を得た。この
液のpHをアンモニア水を用いて7.4〜7.5とし、以下実施
例１と同様にしてIgG溶液と反応させ、過剰の鉄コロイ
ドを除いて鉄コロイド標識IgGを得た。この方法により
得られたコロイド粒子の大きさは５〜10Åであった。

実施例 3. 鉄コロイド標識抗体による組織抗原の染色
（光顕観察による） ＜操作手順＞ （１）組織を10％ホルマリンで固定し、常法に従って水
洗、脱水後パラフィン切片（４〜６μｍ）とした後、脱
パラフィン、水洗、0.01Mリン酸緩衝液（PBS）洗浄（２
分ずつ２回洗浄）した。

（２）これを10％正常山羊血清（0.01M PBS溶液、pH7.
4）と37℃、30分間インキュベートした後、更に各種抗
原に対応する抗体（ウサギ由来）（約300倍）と４℃で
一夜インキュベートした。

（３）次いで、これを0.1Mカコジル酸緩衝液（pH7.4）
で、４℃で、３回洗浄した。

（４）これを、実施例２の方法で調製したFeCac標識抗
ウサギIgG抗体（山羊由来）（30〜60倍希釈）で30〜60
分染色した。

（５）0.1Mカコジル酸緩衝液（pH7.4）で、４℃で、10
〜20分間洗浄した後、プルシアン青反応（５分間）に付
し、然る後蒸留水で充分に洗浄した。

（６）次いで、ケルンエヒトロートで後染色（５分間）
を施し、脱水、透徹、封入して光顕用試料とした。

＜結果＞ （ｉ）平滑筋肉腫（Leiomyosarcoma）の組織切片を試料
としたものではDesminがに出た。

（ii）神経鞘腫（Schwannoma）の組織切片を試料とした
ものではＳ−100蛋白がに出た。

（iii）乳癌（Mammary Cancer）の組織切片を試料とし
たものでは腺癌の部分がCEAがに出た。

（iv）悪性シュワン氏鞘腫（Malignant Schwannoma）の
組織切片を試料としたものではNSE（Neuron Specific E
nolase）がに出た。

尚、上記（ｉ）〜（iv）何れの場合も特異性に優れた
染色像が得られ、且つ染色像は何れも極めて鮮明で、従
来のPAP法による染色結果とよく一致した。

実施例 4. 鉄コロイド標識抗体による組織抗原の染色
（電顕観察による） FeCac標識抗豚エラスターゼ抗体を用いて前記電顕用
に作製した豚膵臓組織切片を染色し、常法に従い電顕観
察したところ、鉄顆粒が粗面小胞体内腔及び外分泌顆粒
の部分に特異的に現われることが確認できた。尚、操作
手順は以下の通りである。

（１）新鮮豚膵組織小片をZamboni固定液で４℃、24時
間固定。

（２）ビブラトームを用いて60〜100μの切片を作製。

（３）切片を洗浄液〔0.05Mカコジル酸緩衝液（0.3M蔗
糖液）pH7.4〕にて４℃で洗浄。

（４）洗浄後10％の正常家兎血清で20分間（室温）イン
キュベート後、液を捨て、乾燥することなく前記FeCac
標識抗豚エラスターゼ抗体（ウサギ由来,IgG）で一夜、
４℃にて反応させる。

（５）反応後、上記洗浄液にて10分間３回洗浄、洗浄後
１％グルタールアルデヒドにて15分間固定。

（６）固定後、上記洗浄液にて10分間３回洗浄し、２％
オスミウム酸で再固定。

（７）常法に従って脱水後、エポン包埋し超薄切片と
し、未染色のまま又は酢酸ウラン、クエン酸鉛で染色後
観察。

〔発明の効果〕

以上述べた如く、本発明は組織抗原染色法に用いられ
る新規な標識抗体を提供するものであり、本発明の鉄コ
ロイド標識抗体は光顕用にも電顕用にも使用でき、而も
何れの場合には明瞭な染色像を与える点に顕著な効果を
奏するものである。

Claims (4)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】抗体タンパクであるIgG又はその抗原結合
   分画に、有機酸、アミノ酸又はこれらの塩により安定化
   された鉄コロイドを結合させてなる、その特殊抗体とし
   ての性格を保持した鉄コロイド標識抗体。
2. 【請求項２】カコジル酸又はその塩により安定化された
   鉄コロイド（カコジル酸鉄コロイド）を結合させた特許
   請求の範囲第１項記載の標識抗体。
3. 【請求項３】有機酸、アミノ酸又はこれらの塩により安
   定化された鉄コロイドをpH約7.4〜約7.5に於てIgG又は
   その抗原結合分画と混合することを特徴とする鉄コロイ
   ド標識抗体の製法。
4. 【請求項４】標識抗体を用い組織抗原染色法により検出
   を行なう組織細胞化学的検出方法に於て、標識抗体とし
   て、有機酸、アミノ酸又はこれらの塩により安定化され
   た鉄コロイドを結合させてなる鉄コロイド標識抗体を用
   いることを特徴とする、組織細胞化学的検出方法。