JP2583555B2

JP2583555B2 - ヒト免疫不全ウイルス（ｈｉｖ）の検出と治療のための方法および物質

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Publication number: JP2583555B2
Application number: JP63038258A
Authority: JP
Inventors: 典也大野
Original assignee: Nissin Food Products Co Ltd
Current assignee: Nissin Food Products Co Ltd
Priority date: 1987-02-19
Filing date: 1988-02-19
Publication date: 1997-02-19
Anticipated expiration: 2012-02-19
Also published as: ATE106945T1; DE3889945T2; EP0280468A3; ATE147759T1; EP0280468A2; JPS63294795A; AU1190388A; EP0468601B1; AU609447B2; DE3889945D1; DE3855761D1; DE3855761T2; EP0280468B1; EP0468601A1

Description

【発明の詳細な説明】〔産業上の利用分野〕本発明は、一般に、ヒト免疫不全ウィルス（HIV）に
よる感染の診断ならびに治療に有用な、方法と物質に関
する。

具体的には、本発明は、免疫学的活性を有するポリペ
プチド、好ましくは、抗体または抗体断片、そして、最
も好ましくはモノクローナル抗体であって、ヒトリンパ
球T₄タンパクに対するイディオタイプの抗体と反応し、
さらに、in vitroおよびin vivoにおいてHIV感染の中和
を可能とする方法でHIVウィルス粒子と反応するものに
関する。

さらに本発明は、HIV感染に対する防護反応を生じる
ワクチン組成物に有用な、免疫学的活性のあるポリペプ
チドに関する。

〔従来の技術および発明が解決しようとする問題点〕

ヒトのAIDSの因子の疫学および免疫学に関する最新技
術は、Laurence,『AIDSの免疫系（The Immune System i
n AIDS）』，Scientific American,1985年12月、pp.84
−93;Gallo,『最初のヒトレトロウィルス（The First H
uman Retrovirus）』，Scientific American,1986年12
月,pp.88−98;Gallo,『AIDSウィルス（The AIDS Viru
s）』，Scientific American,1987年１月,pp.47−56;Le
vy等、Science，225,840−842（1984）；『AIDSに対す
る起動性（Mobilizing Against AIDS）』,Institute of
Medicine,National Academy of Sciences,ハーバード
大学出版局（Cambridge,Mass.1986）;Lane等，Ann.Rev.
Immunol.，3,pp.477−500（1985）に要約されている。

HIV感染におけるヒトのＴリンパ球のT₄表面糖タンパ
クの役割は、Dalgleish等、Nature，312,pp.763−767
（1984）;Klatzman等，Science, 312,767−768（1986）;
Klatzman等，Science, 225,pp.59−62（1984）;McDougal
等，J.Immunol.，135,pp.3151−3162（1985）；およびM
addon等，Cell，47,pp.333−348（1986）にあるよう
に、広範囲にわたって研究されている。さらに、Marrac
k等、『Ｔ細胞とそのリセプター（The T Cell and Its
Receptor』、Scientific American,1986年２月,pp.36−
45;およびMcDougal等，Science, 231,382−385（198
6）を参照されたい。

最近では、可溶性のCD4が、HIV感染の処置において治
療的有用性をもつ可能性があることが推定されている。
Fisher等，Nature，331,76−77（1988）;Hussey等、Ibi
d,pp.78−81;Deen等，Ibid,pp.82−83;およびTraunecke
r等，Ibid,pp.84−86を参照されたい。これら論文は全
て、in vitroでの可溶性CD4によるHIVの感染中和に関す
るものである。推定される可溶性CD4治療剤の用途にお
いて考えられる欠点の一つは、CD4の、Ｂ細胞、マクロ
ファージ、および単球を含むその他の免疫細胞の表面に
存在するクラスII主要組織適合遺伝子複合体（『MH
C』）分子との公知の反応性であり、従って、CD4を治療
に使用する前に、CD4を修飾する（例えば、截断する）
必要があるかもしれないという示唆が得られる。

in vitroおよびin vivoにおいて、抗体がHIV感染を中
和する可能性、特に、保護免疫を高める目的で能動免疫
を用いる試みに関する多くの報告が、文献に見られる。
例えば、Matthews等，Proc.Nat′l.Acad.Sci.（USA），
83,pp.9709−9713（1986）;Norman,『AIDS療法：臨床試
験を実現するための新たな努力（AIDS Therapy:A New P
ush For Clinical Trials）』Science, 230,pp.1355−13
58（1985）およびこのシリーズの以前の記事;Newmark,N
ature，324,pp.304−305（1986）；およびScientific A
merican,1987年２月,86〜88頁の『AIDS:希望....と警告
（AIDS:Hope......And Warninge）』の見出しで始まる
記事、およびNew Scientist,1986年12月18日,7頁の『Ｔ
タンパクはAIDSウィルスを挫くことが出来るか？（Can
Protein T Thwart The AIDS Virus...?）』の見出しで
始まる記事を参照されたい。さらに、Mitsuya等，Natur
e，325,773−778（1987）;Kennedy等，Science, 231,155
6−1559（1986）,Chanh等，EMBO Journal，５（11）,30
65−3071（1986）;Chanh等，Eur.J．Immunol.，16,1465
−1468（1986）;Putney等，Science, 234,1392−1395（1
986）；およびMatshushita等，要約W.3.2,p.106,『後天
性免疫不全症候群（AIDS）に関する第３回国際会議（II
I International Conference on Acquired Immuno−def
iciency Syndrome（AIDS））』,1987年６月１〜５日。

本発明の背景に関連するものとして、発表された抗イ
ディオタイプの免疫学的役割に関する調査結果には興味
深いものがある。例えば、Kennedy等，『抗イディオタ
イプと免疫性（Anti−Ideotypes and Immunity）』，Sc
ientific American,1986年７月,pp.48−56;Jerne,『免
疫系（The Immune System）』，Scientific American,1
973年７月,pp.52〜60;Marx,『抗原を用いずに抗体を作
る（Making Antibodies Without The Antigenes）』，S
cience, 228,pp.162−165（1985）;Finberg等，CRC Crit
ical Rviewsin in Immunology，７,269−284（1987）；
およびKennedy等，Science, 232,pp.220−223（1986）を
参照されたい。

さらに、抗HIV免疫療法とHIV表面タンパクに対する抗
イディオタイプ抗体の産生との潜在的な相関関係につい
ては、前出野Normanの文献を参照されたい。

特に、本発明の背景に関連するものとして、McDougal
等，J.Immunology, 137,2937−2955（1986）に報告され
た研究があり、この報告には、『４つの候補のCD4モノ
クローナル抗体〔OKT4A,OKT4D,OKT4FおよびLeu−3a（時
には、『抗Leu3a』と称する）の各々に対して作成した
ウサギの抗イディオタイプ血清は、〔HIV〕ウィルスと
反応せず、またCD4⁺T細胞へのウィルスの結合を抑制し
なかった』と記載されている。この記載事項は、最近、
サンフランシスコにおいて1987年３月１〜４日に開催さ
れた第７回年次DNA/ハイブリドーマ会議においてRanald
C.Kennedyが口頭で発表し、Bio/Technology，5,421−4
22（1987）に報告されているもの、ならびに、ワシント
ンD.C.で1987年６月１〜５日に開催された後天性免疫不
全症候群（AIDS）に関する第３回国際会議（要約TH.9.5
を参照のこと）で口頭発表し、1987年６月11日の、New
Scientist.第26頁に報告されているものと比較する必要
がある。これらの発表にて、抗T₄抗体に対するポリクロ
ーナル抗血清の開発、および、それらの抗血清が、HIV
を認識し、in vitroにてHIV感染を部分的に中和する能
力について説明がなされた。さらに、後者の発表におい
ては、モノクローナル抗イディオタイプ抗体の調製につ
いての説明があり、これの開発は、Chanh等，Proc.Na
t′l.Acad.Sci.（USA），84,3891−3895（1987年６月）
にも記載されている。

当該技術分野においては、生物学的液体および組織試
料中に、HIV粒子ならびにHIV感染細胞が存在するか否か
を診断するための新しい方法と材料が現在も引き続き求
められており、さらに、HIV感染をin vivoで中和するた
めの新ためな手段、ならびにHIV感染に対する免疫学的
防護を与える予防接種方法の開発が強く求められてい
る。

〔問題点を解決するための手段及び作用・効果〕

本発明は、精製且つ単離された免疫学的活性を有する
ポリペプチド、好ましくは、抗体またはその断片、最も
好ましくは、モノクローナル抗体であって、ヒトリンパ
球T₄タンパクに対するイディオタイプの抗体（好ましく
は、モノクローナル抗体）と反応するものを提供する。

本発明のポリペプチドは、ヒトのＴリンパ球やヒトの
神経系細胞のような宿主細胞がHIVに感染する際に、宿
主細胞表面のT₄タンパクに吸着する上で不可欠なHIVウ
ィルス粒子の部位に対して、免疫学的に特異的な反応性
を有する単離および精製したポリペプチドである。

本発明のポリペプチドは、特に、in vitroでのHIV感
染の中和株に関係しない能力、SDS−PAGEによって決定
された分子量が、約60,000から80,000のHIVタンパクと
の特異的な反応性、ならびにヒト免疫細胞表面と関連す
るクラスII主要組織適合性分子との非反応性によって特
徴付けできる。

従って、その態様の一つにおいて、免疫学的活性を有
する生成物が得られるが、これら生成物は、HIV粒子な
らびにHIV感染細胞表面への特異な免疫結合によって
『応答』するが、これら生成物は、前述の表面タンパク
とは直接的な免疫学的関係無しに生じる。

本発明の精製かつ単離されたポリペプチドは、生物学
的液体中のHIVの検出または定量のために、その検出方
法が、HIV粒子と本発明の反応性ポリペプチド（例え
ば、抗体）との免疫結合に基づく分析方法に用いるのに
特に適したものである。

さらに、本発明に従って産生された抗体、またはその
断片は、HIV感染細胞表面と選択的に免疫反応を行い、
それによって、液体および組織試料内のHIV感染細胞の
検出、ならびに感染および非感染の双方の細胞を含む細
胞集団からのHIV感染細胞の分離に有効な試薬を提供す
る。

このように、本発明のポリペプチドは、HIV感染細胞
の分離ないしは選択的破壊を含めた診断および治療装置
に有効である。

本発明の精製かつ単離された免疫学的な活性を有する
物質はさらに、HIVに感染しやすい動物の抗HIV治療に用
いるのに特に適している。前述の一方法によれば、例え
ば、本発明のモノクローナル抗体の免疫学的に有効な量
を、すでにHIVに感染している動物またはHIVに感染する
危険のある動物に付与し、HIV感染に関する受動免疫を
つくる。その他の方法によると、HIV感染した細胞を、
例えば、in vitroにて、動物の非感染細胞から分離さ
せ、後者の細胞を動物に戻すこととができる。

下記の詳細な説明の欄で述べるように、本発明の抗体
関連ポリペプチドは、好ましくは、先ずヒトのリンパ球
T₄糖タンパク（CD4決定基）に対する単一特異性抗体
（好ましくは、モノクローナル抗体）を産生させ、続い
て最初の生成過程で形成された抗体のT₄イディオタイプ
領域に対する抗体（好ましくは、モノクローナル抗体）
を調製することによって得られる。

一例として、本発明の抗体のイディオタイプ領域に関
して得られる構造情報を用いて、大腸菌、酵母、昆虫お
よび哺乳類細胞等の原核宿主および真核宿主の培養を経
て、有用な抗体断片（fab′およびｆ（ab′）_２断片
等）を産生することが可能となっている。

さらに、形質転換したマウス骨髄腫細胞あるいはハイ
ブリドーマ細胞（特に、Ｈ鎖欠失変異株細胞）を産生宿
主として、キメラ抗体（例えば、マウス／ヒト抗体）を
調製することは、本発明の範囲に含まれる。診断および
治療の用途がある二特異性抗体を産生するハイブリッド
ハイブリドーマ細胞も、考えられる。

さらにHIVサブユニットワクチン物質の産生に、組換
法を適用することができる。例えば、本発明のモノクロ
ーナル抗体は、形質転換あるいは形質変換されたウィル
スあるいは原核宿主中でのHIVのDNAの発現生成物のスク
リーニングに好適であり、天然の免疫学的に重要な（糖
タンパクを含む）HIVタンパクのアミノ酸配列の全て、
あるいは一部のDNAの単離を可能とするものと期待され
る。適切な宿主中において、このようなDNAが存在する
ことにより、高レベルのワクチン物質の産生が可能とな
るものと思われる。

本発明は、その望ましい態様において、モノクローナ
ル抗モノクローナル抗ヒトリンパ球T₄抗体として特徴付
けられる抗体関連ポリペプチドを提供する。特に好まし
くは、モノクローナル抗OKT4およびOKT4A抗体であり、
そのいずれもが60〜80KdのHIVタンパクと反応する。現
在、最も好ましいものは、モノクローナル抗OKT4A抗体
であり、これらは多数のHIV株のHIV感染のin vitro中和
の能力が非常に大きく、またHIV感染細胞の捕体仲介細
胞崩壊に関係する。

本発明は、他の態様において、抗原／抗体反応におい
て、ヒトのリンパ球T₄タンパクに対するモノクローナル
抗体と特異な免疫反応を示す『抗イディオタイプ』のモ
ノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞系を初
めて提供するものである。実例を示すと、本発明はネズ
ミから得た新規のハイブリドーマ細胞系、JT4C8、JT4C1
2、JT4C16、JT1−1F3、JT1−1F3−E5、JT1−1D7、およ
びJT2−N15を提供する。これらは、培養中の増殖細胞の
上清の一成分として、モノクローナル抗体を生成する
が、このモノクローナル抗体は、抗T₄イディオタイプと
特異な反応を示し、さらに、in vitroとin vivo双方でH
IV感染の中和が期待できるような方法で、HIVウィルス
粒子タンパクと反応を示す。

ハイブリドーマ細胞系JT4C8は、New York州Plum Isia
ndに所在する合衆国農務省の管轄下にある、Maryland州
Rockvilleに所在するAmercan Type Culture Collection
に、1987年２月18日に寄託され、A.T.C.C.受託番号HB93
85が付与されている。

ハイブリドーマ細胞系JT4C12は、New York州Plum Isl
andに所在する合衆国農務省の管轄下にある、Maryland
州Rockvilleに所在するAmerican Type Culture Collect
ionに、1987年２月18日に寄託され、A.T.C.C.受託番号H
B9387が付与されている。

ハイブリドーマ細胞系JT4C16は、New York州Plum Isl
andに所在する合衆国農務省の管轄下にある、Maryland
州Rockvilleに所在するAmerican Type Culture Collect
ionに、1987年２月18日に寄託され、A.T.C.C.受託番号H
B9386が付与されている。

ハイブリドーマ細胞系JT1−1F3は、英国Wiltshire州S
alisburyに所在するEuropean Collection of Animal Ce
ll Culturesに、1987年６月25日に受理され、ECACC受託
番号87062501が付与されている。

ハイブリドーマ細胞系JT1−1F3−E5は、英国Wiltshir
e州Salisburyに所在するEuropean Collection of Anima
l Cell Culturesに、1987年６月25日に寄託され、ECACC
受託番号87062502が付与されている。

ハイブリドーマー細胞系JT1−1D7は、茨城県に所在す
る通商産業省工業技術院微生物工業技術研究所に、1988
年１月29日に寄託され、受託番号FERM BP−1685が付与
されている。

である。

ハイブリドーマ細胞系JT2−N15は、茨城県に所在する
通商産業省工業院微生物工業技術研究所に、19886年１
月29日に寄託され、受託番号はFERM BP−1684が付与さ
れている。

本発明は、さらに別の態様において、公知のアフィニ
ティ精製法によって、HIVサブユニットワクチン物質の
産生を可能とするものであり、この精製法によって、HI
Vタンパク画分（分子量の範囲が約60,000から約80,00
0、特に、約65,000から67,000）は、本発明の抗体を用
いて調製された選択免疫吸収剤を用いて単離される。

本発明の種々の態様と利点は、本発明の下記の詳細な
説明と添付の図面を参照して、発明の具体的な実施例と
説明を考察することによって明らかになるであろう。

〔実施例〕

以下の実施例は、本発明によるJT4C8P、JT4C12、JT4C
16、JT1−1F3、JT1−1F3−E5、JT1−1D7およびJT2−N15
を含む一連のハイブリドーマ細胞系を生成し、それから
抗CD₄に対するモノクローナル抗体を単離し、さらに、
これらモノクローナル抗体を増幅し、かつ特性を明らか
にするプロセスを例示する。

具体的には、実施例１では、市販されている抗T₄モノ
クローナル抗体『OKT4』に対する抗体を産生するための
ネズミ宿主の刺激、その脾臓細胞と骨髄腫細胞の融合、
ハイブリドーマ細胞のスクリーニング、クローニングお
よび増殖、さらにそこからのモノクローナル抗体の単離
を述べている。

実施例２は、産生されたモノクローナル抗体の特徴
を、螢光免疫学的検定、HIVとの反応性を調べるための
ウエスタンブロット分析、およびin vitroでのHIV感染
の中和を行う能力を調べるためのスクリーニングによる
検定に関する。

実施例３は、市販されている抗体『OKT4A』に対する
モノクローナル抗体を、その増殖用培地内にて生じるハ
イブリドーマ細胞系の発生の第１方法に関する。

実施例４は、産生したモノクローナル抗体を、免疫螢
光検定、ウエスタンブロット分析、in vitro中和検定、
ELISA検定、および螢光細胞染色検定の各方法によって
調べ、特徴を把握することに関する。

実施例５は、市販されている抗体『OKT4A』に対する
モノクローナル性抗体を増殖培地中に産生することが可
能なハイブリドーマ細胞系の発生の第２の方法、ならび
に、産生されたモノクローナル抗体の特徴をウエスタン
ブロット分析およびin vitro中和検定によって把握する
ことに関する。

実施例１本発明の実施の一態様に従い、OiおよびHerzenberg,S
elected Methods Cell Immunology,351−372（199）、
およびGodding,『ハイブリドーマによる抗体産生（Anti
body Production By Hybridomas）』，J.Immunol.Met
h.,39,pp.285−308（1980）に記載されているような標
準的な免疫学的技法を用いて、ハイブリッド腫瘍細胞系
を生成する。モノクローナル抗T₄を用いて高度免疫化さ
れたマウス脾臓細胞を、ポリエチレングリコールの存在
の下で、マウス骨髄腫細胞系と融合させる。それぞれの
『ハイブリドーマ（hybridomas）』細胞培養の増殖物か
ら得た上清中に、所望の抗体活性が存在するか否かを試
験する。選択したハイブリドーマ細胞をクローン化し、
特異性の高い抗体T₄活性を有する抗体を培養増殖物の上
清中に産生する、細胞系を増殖させる。

A.免疫処置各BALB/Cマウスに対し、脾臓にモノクローナル抗ヒト
リンパ球T₄抗体（OKT4,Ortho Diagnostics,Rahway,N.
J.）を注射する処置を行った。

凍結乾燥された1mgのOKT4を1mlの蒸留水で元に戻し
た。透析を用いて、元のリン酸塩緩衝液を除去し、代わ
りに50mMのMES緩衝液（Sigma Cehemicals）、pH6.0を加
えた。次にこの物質に対し、EPLC〔登録商標〕装置（Ph
armacia,Laboratory Separation Division,Piscataway,
N.J.08854）を用いて高圧液体クロマトグラフィー分離
を行った。

分離は、塩勾配を０から0.5MのNaClに変化した他は、
記載された手順に従い、MonoQカラムを用いて行った。
各々0.5mlの画分のアリコート（20μｌ）について、新
たに収集したヒトリンパ球（1mlあたり10⁵細胞）を用い
て活性を検定した。具体的には、細胞とHPLC画分を混合
し、遠心分離した。それから細胞を数回にわたって洗浄
し、リン酸塩緩衝食塩水（PBS）中に再び懸濁させた。
この細胞を用いて、FITCで標識付けした５μｇのラビッ
ト抗マウス1gGを培養した。遠心沈澱の後に、細胞ペレ
ットを再びPBS中に懸濁し、結果を、螢光細胞計数器（f
luorometric cell counter）を用いて読み取った。最高
の活性を示す画分をプールし、SDS−PAGEで分析したと
ころ、純度が90％を上回ることがわかった。

４匹のマウスの各々に，最初に合計約100μｌの接種
物（マウス１匹あたり約1.5μｇのOKT4）を脾臓注射し
た。14日後、そして28日後に、各々のマウスに100μｌ
の接種物をブースター注射した。

最後のブースターから４日後にマウスを殺し、その脾
臓を無菌状態でとり出し、Dulbecco′s Modified Eagl
e′s Medium（Gibco）を入れたペトリ皿（氷上）に入れ
た。脾臓の脂肪組織および結合組織を切除し、100ゲー
ジのステンレス鋼メッシュに通した。得られた個々の脾
臓細胞は、1000回転／分で10分間に渡って遠心分離を行
い、ペレット状にした。細胞ペレットは、培養液（上記
のもの）を用いて２度洗浄し、RPMI1640中に再び懸濁さ
せた。細胞濃度は、0.2％のトリパンブルーの存在の下
で、血球計で計数することによって測定した。

Balb/c株から誘導したマウス骨髄腫細胞NS1/1.Ag4.1
を、熱不活化した15％ウマ血清（Pel−Freeze）を含む
培養液RPMI1640内で増殖させた。これらの細胞は、1000
回転／分で10分間にわたって遠心分離することによって
ペレット状にし、抗生物質を含まないRPMI1640で洗浄し
た。細胞濃度は同じ培養液中に再び懸濁させた後に計数
して測定した。

脾臓細胞とNSI/1細胞を４対１の割合で組合せ、1000
回転／分で10分間にわたって遠心分離した。上清を吸引
して除去し、ポリエチレングリコール（PEG）1500、分
子量500〜600を用いて、37℃で細胞融合を行った。この
手順は、下記の物質を所定時間中に加え、常にゆっくり
を攪拌を行いながら実施した。RPMI1640中に50％のPEG
を含む1.0mlを１分間にわたって加えて、１分間の攪拌
を行い、さらに15％のウマ血清を含むPRMI1640 1.0mlを
１分間にわたって添加し、さらに、15％のウマ血清を含
むRPMI1640 1.0mlを１分間にわたって添加し、さらに15
％のウマ血清を含むPRMI16408μを２分間にわたって
添加した。

得られた融合細胞を、1000回転／分で、10分間にわた
って遠心分離し、15％ウマ血清ならびにペニシリンG100
ユニットおよびストレプトマイシン100mg/mlを含むRPMI
1640中に再び懸濁させた。これらの細胞は、あらかじめ
５％の二酸化炭素内で平衡化した96ウェル組織培養盤の
各ウェル当たり0.1mlずつ分配した。培養盤は、37℃の
５％二酸化炭素内で、一晩インキュベートした。

第２日目に、各々のウェルに、15％ウマ血清を含むRP
MI1640中に0.1mlのHAT培地（ヒポキサンチン13.6μg/m
l、アミノプテリン0.176μg/mlおよびチミジン3.88μg/
ml）を注入した。この培地は、選択的に脾臓細胞−NSI/
1雑種を生すので、融合されていないNSI/1細胞、または
他の細胞と融合した細胞をスクリーニングする。成体の
マウスから得た融合していない最初の脾臓細胞は、培養
下では数日間以上生存することはない。

第３、４、６、９および12日目に、各々のウェルから
0.1mlの培養液を取り出し、新たに15％ウマ血清を含有
するRPMI1640中の新鮮なHAT0.1mlを加えた。第15、19、
23および27日目には、各々のウェルから0.1mlの培養液
を取り出し、15％ウマ血清と上記の濃度の同じヒポキサ
ンチンとチミジンのみを含むPRMI1640の0.1mlを代わり
に注入した。第18日目には、すべてのウェルから取り出
した培養物の上清をスクリーニングし、OKT4に特異な抗
体が検出されるか否かを調べた。

螢光結合免疫吸着剤検定（FLISA）を用いて、OKT4に
対する抗体を産生するハイブリドーマの検出を行った。
96ウェル組織培養盤の各ウェルを、ラビット抗マウスIg
G Fc3.0μg/mlを含む炭酸塩−重炭酸酸溶液100μｌで、
37℃で、一晩にわたってコートした。ウェルは、0.05％
のトウィーン20（Tween20）を含むPBSで10度洗浄した。
ウェルは、20％のウマ血清を用いて、37℃で、１時間に
わたってブロックした。ブロック剤は、上記と同じPBS/
トウィーン20を用いて、２度洗浄して除去した。

各々のハイブリドーマウェルから得た培養液の20μｌ
のアリコートならびにPBS80μｌを、コートしたウェル
内で、室温で、１時間に渡ってインキュベートし、それ
から４℃で、一晩、インキュベートした。ウェルは、0.
05％のトウィーン20を含むPBSで10度洗浄し、さらに150
μl/ウェルのマウス血清（８μg/ml）でブロックし、37
℃で、３時間、さらに、４℃で、２時間に渡ってインキ
ュベートした。

FITCで標識付けしたOKT4（0.3μg/ml）100μｌを、各
ウェルに入れ、４℃で、一晩、暗所でインキュベートし
た。ウェルは上記と同じように、PBS/トウィーン20溶液
で、10度洗浄した。個々のウェルには、５×10^-5N水酸
化ナトリウムと5.6×10^-4N水酸化アンモニウム溶液200
μｌを加えた。組織培養盤は、15分間、室温に保ち、
それから１分間振盪した。

タイターテックマイクロティトレーション（Titertek
Microtitration）１×８盤に移した後、Corona Electr
icモデルMTP 100Fマイクロプレートリーダー（micropla
te reader）を用いて螢光検定を行った（励起490nm;放
射530nm）。

2710個のウェルをスクリーニングしたところ、その内
の19個がOKT4と反応し、はっきりと陽性であった。19個
の陽性クローンに、JT4C1〜JT4C19の名称を付けた。

陽性のウェルから得たハイブリドーマ細胞の正式のク
ローニングは、３ウェルあたり約１個の細胞の割合とな
るように、ウェルを追加して細胞を希釈することによっ
て行った。一般に、活性を示したウェルからの正式をク
ローニングによって、同じハイブリドーマ細胞のサブク
ローンとみられる正式のクローンが産生されたが、いく
つかの例では３世代にわたって異なるクローン固体群が
出現した。同じ最初のウェルから得られたサブクローン
には、親番号と追加の番号を用いて名称を付けた（例え
ば、ウェルJT4C7から得たクローンは、JT4C7−１、JT4C
7−２のように命名した）。

実施例２実施例１に述べた陽性クローンが産生した抗体の特性
を明らかにするために試験を行い、最初の免疫原に対す
るモノクローナル抗体の相対的な親和性を測定し、さら
に、HIVウィルス粒子タンパクとの免疫反応性を調べる
ウエスタンブロット分析によって、抗体のスクリーニン
グを行い、さらに抗体のスクリーンを行って、HIVウィ
ルスの感染中和能力を調べた。

A.相対的の親和性の滴定ラビット抗マウスIgG Fcの種々の希釈物が、試験ウェ
ル内で析出した以外は、実施例１の抗体スクリーニング
に用いたものと同一の一般的な方法に従って螢光結合検
定を実施した。クローンJT4C1からJT4C−13およびJT4C1
6から得た抗体の螢光試験結果を、第１表に示す。JT4C7
の種々のサブクローンの螢光試験結果を、第２表に示
す。

第１表のデータは、クローンJT4C1、JT4C2およびJT4C
4の抗体が、比較的親和性が高いことを示している。ク
ローンJT4C11およびJT4C13から得られた抗体は、比較的
親和性が低く、試験を行った残りのクローンの抗体の親
和性は中程度である。

これに対応して、第２表は、JT4C7のサブクローンの
内、クローンJT4C7−12およびJT4C7−９が、この試験方
法における相対的親和性が、それぞれ最高、最低である
ことを示している。

B.ウエスタンブロット分析実施例１で確認された19個の陽性クローン全てから得
られた抗体に関して、ウエスタンブロット分析によって
検定を行い、HIVウィルス粒子のタンパクとの免疫反応
性を調べた。

具体的には、HTLV−IIIB粒子は、SDS（0.1％）および
ジチオチリオチル（0.003M）で破壊し、得られた物質を
7.5％のポリアクリルアミドゲル上に置き、さらに標準
的な方法を用いてゲルを電気泳動させ、得られた物質を
硝酸セルロースフィルター紙に移した。フィルターは、
最初にPBS中の20％の熱不活性化ウマ血清と共に、１時
間にわたってインキュベートし、それからPBSで洗浄し
た。その後、フィルターは各クローンの抗体上清と共
に、室温で３時間にわたってゆっくりと振盪しながらイ
ンキュベートし、その後、４℃で一晩の間ゆっくりと振
とうしながらインキュベートした。PBS/トウィーン20で
洗浄し、さらに、上記方法と同様に、20％ウマ血清で１
時間、再ブロッキングを行い、ペルオキシダーゼで標識
付けしたラビット抗マウス1gG10μｇを加え、その混合
物を室温で４時間にわたってインキュベートした。PBS/
トウィーン20で10度洗浄した後に，標準的な手段によっ
て色付けした。

クローンJT4C8、JT4C12およびJT4C16から得た抗体は
全て、約60,000〜80,000の分子量を有するHIVタンパク
と強く反応した。これらの抗体が、それらの発現には何
の役割をも果たさないHIVタンパクと免疫反応する能力
は、これら抗体が、in vitroおよびin vivoにおいてHIV
の中和を行う能力を有することを、はっきりと予測させ
るものである。

上記したウエスタンブロット方法において反応を示し
た抗体のインタイプ分析によって、JT4C12およびJT4C16
の抗体は、IgG₃イソタイプであることが判明した。

C.HIVの中和ハイブリドーマ培養の上清を下記の方法で試験し、HI
V中和能力を調べた。

３日間培養したものの上清を、完全培地〔500mlのRPM
I1640;100×ペニシリン／ストレプトマイシン6ml;100×
Ｌ−グルタミン6ml;FCS100ml;および、ポリブレンスト
ック（1mg/ml）〕で1:5に希釈した。

培地希釈試料200μｌを、24ウェルマイクロタイター
のウェルの内、２つの除いて残り全てのウェルに加え、
２つのウェルには同量の培地のみを入れた。『培地の
み』のウェルの１つにさらに培地を追加し、残りのウェ
ルにはそれぞれ高力値HIVウィルスストックを加えた。
プレートを、プラスチック製袋に入れて密封し、４℃に
おいて、１〜1.5時間にわたって培養し、約15分間放置
して、17℃に戻した。

H9細胞を完全培地において、37℃で、密度１×10⁶細
胞/mlで30分間培養し、それから、遠心分離を行った後
に、新鮮な完全培地に密度５×10⁶細胞/mlに再懸濁させ
た。細胞懸濁液200μｌを各ウェルに加え（合わせて600
μｌとなる）、プレートを37℃で１時間にわたって培養
し、次に、150μｌを、１ウェル当たり2.0mlの新鮮完全
培地を入れた複製用プレートに移した。培養物を、二酸
化炭素培養器の中で、37℃で培養した。４日後、培養物
を分割し、新鮮な完全培地を追加した。培養開始から第
７日目に、IFAおよび逆転写酵素法による中和スクリー
ニングのための試料を調製した。

〔Guroff等，Nature，316,72−74（1985）;Matthews
等，Proc.Nat′l.Acad.Sci.（USA）,83,9709−9713（19
86）；およびPoiesz等，Proc.Nat′l Acad.Sci.（US
A），77,7415−7419（1980）を参照のこと。〕第一の中和スクリーニング方法においては、結果は基
本的に陰性であるか、あるいは決定的ではなかった。し
かし、第一の試験と同時に開始した第二の方法において
は、試験されたJT4C1−19シリーズの15個のクローンの
内、12個のクローンは、IFAあるいはRT試験、あるいは
両試験において中和活性を示し、さらに、試験したJT4C
7の６つのサブクーロンの内、５つの中和特性を示し
た。これらの検定において、100％の中和活性を示した
ヒトAIDS（HTLV−IIIB）患者血清と比較すると、上記の
中和活性は全て『部分的』であった。

実施例３実施例１の一般的なハイブリドーマ形成およびスクリ
ーニング方法を、市販されているOKT4Aと名付けられた
（Ortho Diagnostics,Rahway,N.J.）モノクローナル抗
ヒトリンパ球T4抗体を用いて実施した。この抗体は、Mo
no S（Mono Qではなく）カラムを用いて精製したもので
ある。

具体的な免疫処理方法は、最初の注射が腹膜を通して
なされるものであり、かつ精製した抗体約15μｇを用い
る点で、実施例１の手順とは僅かに異なる。２度目の腹
膜を介した接種は７日後であり、精製した抗体約10μｇ
を用いた。13日後に、抗体約５μｇを最終ブースターと
して処置した。スクリーニングを行った2090ウェルの
内、34個はOKT4Aとの反応に高い陽性を示し、その内の1
0個は、高活性（約200のバックグラウンドに対して、螢
光値が1000以上）を示した。

これら10個の陽性クローンは、JT1−ID11、JT1−1F
3、JT1−1G2、JT1−6E12、JT1−6F12、JT2−8E9、JT3−
2C4、JT3−5A11、JT3−6D9およびJT3−6E8と名付けた。

実施例４実施例３に記載の陽性クローンによって産生された抗
体の特性を明らかにするために、基本的に実施例２に記
述された方法に従って試験を実施した。

すなわち、上清抗体は、ウェスタンブロット検定にお
いて、分子量が約60,000から約80,000のHIVタンパクと
反応した。反応の中心を占めたものは、分子量が約67,0
0のタンパクであり、ある抗体は、分子量が78,000のタ
ンパクと反応した。重要なことであるが、通常は、主な
免疫的に重要なHIVエンベロープ糖タンパクとして特徴
づけられる、41kDあるいは120kD断片との反応が認めら
れなかった。最も強い反応を示した抗体の内で、２つは
IgMイソタイプであり、クローンJT1−1F3の抗体はIgG₁
イソタイプであった。下記の第３表に、JT1−1F3抗体を
用いた螢光結合検定の結果を示す。

実施例２（Ｃ）と同時に実施されて中和試験でも、最
初は陰性結果を示し、２度目の試行において、PT検定で
僅かな中和能があることを示した。しかしながら、IgG₁
分泌JT1−1F3クローンを、腹水増幅およびHIVタンパク
との反応性を調べる抗体ELISAスクリーニングのために
選択した。

最初のELISAスクリーニングでは、種々の濃度のHTLV
−IIIBタンパク（それぞれ濃度が、40、20、10、５、2.
5、1.25、0.625、0.313、0.156、0.078、0.039および0.
020μg/mlのもの）をマイクロタイター盤に塗布し、阻
止（20％ウマ血清/PBS、37℃、２時間）した後、一晩乾
燥させた。培養上清（20mlと80mlのPBS）あるいはHAT培
地対照を、一次抗体として加えた。室温で、１時間培養
し、４℃で、一晩貯蔵した後、ペルオキシダーゼ複合ウ
サギ抗マウスIgG（５％ウマ血清/PBS中に0.3μg/ml）を
二次抗体として加えた。室温で２時間培養した後、培養
基（McIlvan′ｓ緩衝液中の0.5mg/mlのｏ−フェニレン
ジアミン、pH5.5;3％過酸化水素10ml）を加えた。室温
で、20分間培養した後、0.4M硫酸を50μｌ加えて、反応
を停止させた。吸収度を、492〜610nmの波長で測定し
た。試験の結果を、第１図に図示する。

この結果は、HIVが1.25μｇのレベルで検出可能であ
ったこと、そして、ウィルスが40μｇになるまで反応が
漸増したことを示している。

種々の濃度〔10⁶、６×10⁵、４×10⁵、２×10⁵、６×
10⁴、４×10⁴、２×10⁴、１×10⁴、６×10³、４×10³、
２×10³細胞./ml〕の未感染のH9細胞膜調製物を最初に
塗布したプレート上で、BLISA方法で繰り返した。この
試験の結果を、第２図に図示する。この結果は、未感染
の調製物とは反応性がないことを示している。

最後に、HTLV−IIIB HIV変異株、AL1212Cと名付けら
れたHaitian HIV変異株（Dr.David Hall,Massachusetts
General Hospital、ボストン、マサチューセッツ州か
ら入手したもの）、および906と名付けられたAfrican H
IV変異株（Dr.Herome,Groopman,New England Deaconess
Hospital,ボストン、マスチューセッツ州から入手した
もの）から得た上記と同じの種々の濃度のタイミングを
用いて、HIVタンパクELISAを行った。第３図に図示する
ように、JT1−1F3抗体は、これら３つのHIV変異株すべ
ての共通エピトープを認識した。

腹水液から得たJT1−1F3抗体を、上記のRT検定および
シンシチウム誘導によって、in vitroにて中和活性を示
すか否かについて試験した。この方法では、種々のレベ
ルのJT1−1F3抗体（腹水液IgG画分）、陰性対照（腹水
液／プリスタン）、およびHTLV−IIIB感染患者の血清の
形の陽性対照を比較した。この方法に従い、HIV株III
B、AL1212Cおよび906をモノクローナル抗体JR1−1F3、
対照腹水あるいは中和ヒト血清（リン酸緩衝溶液中で1:
5に希釈）を用いて、４℃で、90分間培養した。そし
て、H9細胞（５×10⁶）を、各ウェルに添加し、37℃で、１時間にわたり培養した。各ウェル
からアリコート（150μｌ）を取り出し、新鮮な培地2.0
mlに加えた。４日目にこの培養物を、1:1に分割した。
４日目と７日目に、逆転写酵素活性とシンシチウム誘導
の観察を行った。この方法での７日目の結果を、第４表
に示すが、この表中では相対的シンシチウム誘導は、以
下のように表示する。

（−）0/200細胞；（＋／−）１〜5/200細胞；（＋）＞10％細胞；（＋＋）＞細胞の25％；および（＋＋＋）＞細胞の50％。

第４表に示した結果は、変異株に対して完全な特異性
を有する感染患者血清に対する中和化活性と比較して、
JT1−1F3抗体で試験した全ての３つのHIV変異株に対す
るin vitro中和活性を明示しており、モノクローナル抗
体が重要なタイプ共通エピトープを認識することを示し
ている。

JT1−1F3抗体反応種の分子量を、免疫ブロッティング
によって決定した。精製したHTLV−IIIB（５μｇと10μ
ｇ）を、SDS−PAGEおよびクーマシーブルー／シルバー
染色（第４図のレーンＢおよびＣ）を用いて分析した。
同様のアリコートを、SDS−PAGEによって分析し、ニト
ロセルロース紙に移し、JT1−1F3抗体との反応性を分析
した。単一の反応性種が、約67kdにおいて（第４図；レ
ーンＥおよびＦ）検出された。

JT1−1F3抗体のHTLV−IIIB分離物との反応性を、その
他のHIV株との反応性と比較した。ELISAによる同様なパ
ターンの反応性が、HTLV−IIIB、ALIZIZCおよび906株に
ついて認められた。さらに、JT1−1F3抗体と、３つのHI
V株のそれぞれを用いてウェスタンブロット分析を行っ
た結果、同様な分子量の抗体との反応性があることが分
かった（第５図）。これらの結果は、モノクローナル抗
体JT1−1F3が、様々なHIV株に見られる関連抗原あるい
は同一抗原と反応することを示している。

JT1−1F3抗体に関する上記の結果は、当該抗体の、HI
Vウィルス感染細胞を検出における有効性を示唆してい
る。この点について、JT1−1F3抗体（腹水液IgG画分）
の未感染およびHIV感染H9細胞への結合を観察した。JTI
−1F3の結合の程度は、フルオレセイン標識ウサギ抗マ
ウスIgGによって測定した。

第6A図に示すように、抗体の未感染H9細胞への検出可
能な結合は全く無かった。これとは対照的に、抗体のHT
LV−IIIB−感染H9細胞への凝集性および分散性結合が検
出された（第6B図）。906およびAL1212C株によって感染
したH9細胞を用いた場合にも、同様な結果が得られた
（第6Cおよび6D図）。

この方法を、AIDS患者の造血細胞に適用した。Ficoll
−Hypaque分離によって、AIDS患者の末梢血液から単核
細胞を採取し、JT1−1F3との反応性を調べた。第6E図に
示すように、これらの細胞の場合には、凝集性および分
散性を示す螢光免疫染色パターンが検出され、このパタ
ーンはHIV感染H9細胞の場合の結果と似通っていた。

クラスII主要組織適合遺伝子複合体（『MHC』）表面
成分を有する細胞（すなわち、ヒトＢ細胞系MD1および
正常な末梢血液単核細胞）との反応性について、抗体JT
1−1F3のスクリーニングを行ったところ、大きな反応性
を示されなかったが、これは注目すべきことである。

JT1−1F3のサブクローニングの結果、JT1−1F3よりも
漸次的に高レベルのIgG₁抗体を産生するサブクローンJT
1−1F3−E5 とJT1−1D7が選別された。JT1−1F3,JT1−1F3−E5およ
びJT1−ID7の比較中和検定データを、第５表に示す。こ
れら３つのハイブリドーマによって産生された抗体に対
する、ELISA検定様式内での反応性を、第６表に示す。

実施例５実施例１および３のハイブリドーマ形成ならびにスク
リーニングの方法にOKT4Aを用いた、免疫処置方法を下
記のように変更して、繰り返し実施した。最初の免疫処
置には、Mono S精製OKT4A抗体10μｇの腹腔内注射を含
み、２度目の腹腔内注射（７μｇ）を17日後に行い、最
後の静脈投与の７μｇは18日後に投与した。融合および
スクリーニングの後に、JT2−N15と名付けたIgG₁−産生
陽性クローンをさらに研究するために選抜した。JT1−1
F3とそのサブクローンJT1−1F3−E5およびJT1−1D7と同
様に、クローンJT2−N15も、モノクローナル抗体を産生
し、この抗体は、分子量約65,000〜67,000のHIVタンパ
クを用いたウエスタンブロット分析において反応した。
JT2−N15を増殖させた倍地は、ELISA検定に陽性を示し
た。HIV−IIIB感染に対する予測中和検定の結果を、第
７表に示す。

第７表 JT2−N15によるHIV−IIIBの中和 RT活性／中和％ 1.非感染H9 157/− 2.HIV 121940 3.HIV＋1.5mg/抗体ml 343/98.54.HIV＋750mg/抗体ml 569/96.6 腹水手法によって増幅された抗イディオタイプ抗体の
中和活性を調べるための他のスクリーニング方法におい
て、下記のプロトコールが最も活性の高い腹水調製物を
もたらすことが予め確認されていた。５週齢から８週齢
のマウスに、Pristane0.5〜1.gmlを投与して『感作』さ
せ、２週間後にハイブリドーマ細胞２〜８×10⁶（望ま
しくは約５×10⁶）を注射する。腹水の採取は、接種か
ら２週間後に開始し、採取された最初の腹水（約３〜5m
l）は、最も高い中和活性を示した。さらに３日後に実
施された腹水の２度目の採取では、８〜10mlの腹水の活
性は前回よりも低かった。生存している動物からの３度
目の採取では、一般に、３〜5mlの腹水が得られたが、
それらは時として、１度目と２度目の採取によって得た
物質のいずれよりも活性がかなり低かった。第４表およ
び第５表のJT1−1F3について示された中和データは、３
回の採取によって得た腹水をプールしたものに基づいた
ものであるが、第５表および第７表のJT1−1F3−E5、JT
1−1D7およびJT2−N15についてのデータは１度目と２度
目の採取分だけプールした腹水物質に基づくものであ
る。

上記の各実施例は、市販されているモノクローナル抗
体調製物OKT4およびOKT4Aを用いる方法に関するもので
あったが、その他の市販されている抗体、例えば、Leu3
a（Becton−Dickenson,Immunocytometry Systems,マウ
スティン・ビュー、カリフォルニア州）も、本発明によ
る抗イディオタイプ抗体の産生に同様に適しているもの
と思われる。ヒトT₄細胞、T₄糖タンパクを産生するヒト
Ｔリンパ芽球細胞、そして最初の抗原として組み換えヒ
トT₄タンパク分離物を用いて、公知のハイブリドーマ手
法によって調製された、市販されていない抗体（好まし
くは、モノクローナル抗体）も同様に適している。さら
に、JT1−1F3とそのサブクローンならびにJT2−N15によ
って産生された抗体は、イソタイプIgG₁であるが、異な
るイソタイプの抗体も同様に有用であると考えられる。
例えば、イソタイプIgG₂の抗体は、補体仲介細胞崩壊反
応を含む方法においてさらに有用性が高いと考えられ
る。

本発明の方法の操作性の確認は、Chanh等の報告，R.
N.A.S.（USA），84,3891−3895（1987.6）によってもた
らされた。この報告では、Leu3aに対するモノクローナ
ル抗体（HF1.7と名付けられた）は、HIV−IIIB感染のin
vitro中和が可能であったことが報告された。しかしな
がら、HF1.7の中和活性は『弱い』とされており〔Weis
s,Nature, 331,p.15（1988.1）を参照のこと〕、HIV−II
IB以外の株に及ぶことは実証されていない。その上、上
記実施例のモノクローナル抗体である抗OKT4およびOKT4
Aと異なり、Chanh等の抗−Leu3a抗体は、前出のChanhの
文献の第3894頁の第４図に示されるように、gp120以外
の何らかのHIV誘導タンパクと反応することは一切示さ
れていない。〔さらに、ポリクローナル抗Leu3a抗体に
関するDalgleish等，The Lancet，ii,pp.1047−1050,19
87年11月７日をも参照のこと。〕これまで述べた例は、ネズミ由来のハイブリドーマ細
胞調製物に関連しているが、ハイブリッドハイブリドー
マ（例えば、マウス／ヒト）、特に、ヒト／ヒトハイブ
リドーマを調製して用いることは本発明の範囲内であ
る。このヒト／ヒトハイブリドーマは、例えば,Borreba
eck,TIBTECH,1986年６月,pp.147−153;Abrams等，Metho
ds in Enzymology,121,pp.107−119（1986）;Kozbor
等，Methods in Enzymology,121,pp.120−140（1986）;
Suresh等，Methods in Enzymology,121,pp.210−228（1
986）；およびMasuho等，Biochem,＆Biophys.Res.Com
m.，135（２）,pp.495−500（1986）に示されたのと同
様の方法で調製される。さらに、Klausner,『単一鎖抗
体が現実となる（‘Single Chain'Become a Realit
y）』,Bio/Technology,4,pp.1041−42（1986）,Klausne
r,『「免疫学的な宇宙戦争」の無台装置（Stage Set Fo
r‘Immunological Star Wars'）』，Bio/Technology，
5,867−868（1987）およびMarx,『特製抗体（Antibodie
s Made To Order）』，Science，229,455−456（1986）
も参照のこと。

従って、上記した具体的なハイブリドーマの産生、お
よびモノクローナル抗体の認識と単離の方法は、本発明
の実施の範囲を何ら限定するものではないことは明瞭で
あろう。例えば、Methods in Enzymology,Vol.121,『免
疫学的手法、パート１（Immunological Techniques,Par
t I）』,Langone等編,Academic press,Inc.（ニューヨ
ーク,1986）に所載の論文に示されているように、ここ
に示したものと同じ結果を得るための代替方法が数多く
存在する。

本発明の診断および治療方法に用いる免疫学的活性を
有するポリペプチドを、適切に形質転換あるいは形質変
換を行った培養原核細胞および真核細胞宿主内におい
て、これらポリペプチドをコードするDNA配列の発現に
よって産生することも、本発明の範囲に含まれる。

本発明の抗HIV治療法は、HIV感染のin vivoでの中和
に関連する受動免疫を生み出すために、本発明の抗体あ
るいは抗体断片の有効量を、HIVに感染した動物またはH
IV感染の危険性のある動物に付与するものとして理解さ
れよう。この点については、免疫学的に効果的な抗HIV
治療剤を調製するために、本発明の生成物を免疫学的に
許容できる希釈剤、アジェバンドおよび基剤と組み合わ
せることが考えられる。

本発明の抗HIV治療法は、さらに、モノクローナル抗
モノクローナル抗ヒトリンパ球と反応する生成学的な活
性を有するHIVタンパク画分を用いる能動免疫法をも包
含する。この生成物は、HIVタンパクと本発明の抗体と
の免疫学的反応混合物を形成し、続いて、好ましいタン
パクの単離を行う周知の親和性精製プロセスによって、
ウィルス調製物から直接に得ることができる。一例とし
て、実施例４の方法にて、JT1−1F3によって認識された
分子量が60,000〜80,000のHIVタンパクは、ワクチンに
用いるための第一候補である。本発明の抗体を用いて免
疫学的に認識（あるいは、精製）することができるHIV
DNAに基づく組換発現生成物についても、このことは当
てはまるものと考えられる。

ポリペプチド生成物を用いて、血液等の生物学的液体
中のHIV粒子を、検出かつ定量する本発明の診断法は、
本発明による受動免疫法の恩恵を受ける動物の予備的な
スクリーニング、および本発明の治療的投与の観察の主
要部分を占めるものと考えられる。

本発明の抗体がHIV感染細胞と選択的な反応を示すと
いう知見は、種々の診断および治療面の用途を示唆する
ものである。この用途には、おそらく抗体の有無を調べ
るスクリーニングに基づく検定では容易に検出できない
感染初期における、HIV感染の検出のための組織（例え
ば、リンパ系細胞）および体液（例えば、血液）試料の
組織学的なスクリーニングが含まれる。本発明の抗体に
よる感染細胞の検出は、感染細胞と非感染細胞とからな
る細胞群から、感染細胞を分離することを可能とする。
このように、本発明の抗体を用いることによって、感染
したリンパ球を除去ないしは選択的に殺すために、AIDS
患者の血液を体外で処理することが考えられる。さら
に、本発明の範囲には、感染した細胞の細胞崩壊を行う
ために、補足された循環補体と共役する本発明の抗体を
用いたin vivoでの治療を含む。このような治療的プト
ロコールの実行可能性を支持するものとしては、HIV感
染H9細胞のin vitro補体依存細胞崩壊に、抗体JT1−1D7
が関与する能力に関する暫定的な陽性の試験結果があ
る。

抗体に選択的な反応特性があるので、感染細胞への薬
剤あるいは毒素の生体への投与、および、例えば、エフ
ェクターＴ細胞活性の『焦点を合わせる』ことを可能と
するような二重決定要素を含む二特異性抗体の開発のた
めに、これらの抗体を用いること期待できる。例えば,S
tearz等，Proc.Nat′l,Acad,Sci.（USA），83,1453−14
57（1986）を参照のこと。

本発明は、T₄タンパクの免疫学的な特性をその基礎に
おいており、このT₄タンパクは、特定のHIV変異株によ
るものではなく、あらゆる変異株（例えば、AL1212C、9
06、ARC、LAV、HTLV−IIIRF、HTLV−IIIB）によるHIV感
染の共通レセプターとなると考えられるので、本発明の
診断および治療法はあらゆるHIV変異株に関連する感染
の検出および治療に適用できるものと考えられる。本発
明のポリペプチドを、診断および研究手段として用いる
ことによって、HIVと宿主細胞との相互作用の性質に関
する追加情報が得られるものと思われる。一例を挙げる
と、本発明のモノクローナル抗体は、細胞のHIV感染に
関連する同定および会合プロセスにおいて特異的に且つ
必然的に相互作用を行うHIVと、宿主細胞の表面タンパ
クの領域の一次、二次および三次構造を精密に確定する
のに役立つものと思われる。そして、この情報は、合成
および組換えペプチド免疫原を用いることによって、本
発明の免疫学的に活性のある物質の生成を可能とするで
あろう。

これまで述べた詳細な説明は、明瞭な理解を得るため
にのみなされたものであり、当業者には数多くの変更が
可能と思われるので、この説明に不要な限定を見出すべ
きではない。

【図面の簡単な説明】

第１図〜第３図は、HIVならびに非感染細胞タンパクを
用いた本発明の抗体の免疫反応性試験の結果を示すグラ
フ；第４図〜第５図は、本発明の抗体ならびにHIVタンパク
を含む免疫学的ブロット検定の結果を表す図；および第6A図〜第6E図は、本発明の抗体を用いた感染細胞およ
び非感染細胞の免疫螢光染色検定の結果を示す写真であ
る。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所Ｃ１２Ｎ 15/02 Ｇ０１Ｎ 33/577 ＢＧ０１Ｎ 33/569 9162−4ＢＣ１２Ｎ 15/00 Ｃ 33/577 9281−4Ｂ 5/00 Ｂ微生物の受託番号ＡＴＣＣＨＢ９３８７微生物の受託番号ＦＥＲＭＢＰ−１６８５微生物の受託番号ＥＣＡＣＣ８７０６２５０１微生物の受託番号ＥＣＡＣＣ８７０６２５０２微生物の受託番号ＦＥＲＭＢＰ−１６８４前置審査 (56)参考文献特開昭61−286756（ＪＰ，Ａ) Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＶＳＡ，84［11］（1987）Ｐ．3891 −3895 Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，137［９］（1986）Ｐ．2937−2944 ＡｒｃｈｉｖｅｓｏｆＶｉｒｏｌｏｇｙ，91［１−２］（1986）Ｐ．11− 12 Ｓｃｉｅｎｃｅ，228（1985）Ｐ．593 −595

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】HIVウィルスによって感染した細胞の細胞
表面のT₄タンパクへのHIVウィルス粒子の吸着部位に対
して免疫学的に特異的な反応性を有する単離および精製
した抗体であって；前記抗体が、in vitroにてHIV感染を中和する能力と、O
KT4抗体あるいはOKT4A抗体と特異的な免疫学的反応性を
有する、ことを特徴とする単離および精製した抗体。
【請求項２】前記抗体が、SDS−PAGEによって決定され
た60,000〜80,000の分子量を有するHIVタンパクと特異
的な免疫反応性を有する特許請求の範囲第１項に記載の
抗体。
【請求項３】前記HIVタンパクが、SDS−PAGEによって決
定された65,000〜67,000の分子量を有する特許請求の範
囲第２項に記載の抗体。
【請求項４】前記抗体が、クラスIIの組織適合性分子と
免疫学的に非反応性である特許請求の範囲第１項に記載
の抗体。
【請求項５】前記抗体が、マウス由来の抗体あるいはそ
の抗体断片である特許請求の範囲第１項に記載の抗体。
【請求項６】前記抗体が、モノクローナル抗体あるいは
モノクローナル抗体断片である特許請求の範囲第５項に
記載の抗体。
【請求項７】JT4C8（ATCC HB 9385）、JT4C12（ATCC HB
9387）、JT4C16（ATCC HB 9386）、JT1−1F3（ECACC 8
7062501）、JT1−1F3−E5（ECACC 870652502）、JT1−D
7（FERM BP−1685）、およびJT2−N15（FERM BP−168
4）からなるグループから選択されたハイブリドーマ細
胞系であって、前記ハイブリドーマ細胞系が； HIVウィルスによって感染した細胞の細胞表面のT₄タン
パクへのHIVウィルス粒子の吸着部位に対して免疫学的
に特異的な反応性を有する抗体、すなわち、in vitroに
てHIV感染を中和する能力と、OKT4抗体あるいはOKT4A抗
体と特異的な免疫学的反応性を有するマウス由来の抗体
を産生することを特徴とするハイブリドーマ細胞系。
【請求項８】ヒト以外の動物に対する抗HIV療法であっ
て、下記工程、すなわち； HIVウィルスによって感染した細胞の細胞表面のT₄タン
パクへのHIVウィルス粒子の吸着部位に対して免疫学的
に特異的な反応性を有する単離および精製した抗体の免
疫学的に有効な量を、HIVに感染しやすいヒト以外の動
物に投与する工程を含み、前記抗体が、in vitroにてHIV感染を中和する能力と、O
KT4抗体あるいはOKT4A抗体と特異的な免疫学的反応性を
有する単離および精製した抗体である、ことを特徴とす
るヒト以外の動物に対する抗HIV療法。
【請求項９】生物学的液体中のHIVを検出および定量す
る方法であって、下記工程、すなわち； HIVと特異的な免疫学的結合を形成することができる免
疫学的反応性抗体とHIVとの間の免疫学的反応を検出す
る工程を含み、前記抗体が、in vitroにてHIV感染を中和する能力と、O
KT4抗体あるいはOKT4A抗体と特異的な免疫学的反応性を
有する単離および精製した抗体であることを特徴とする
生物学的液体中のHIVを検出および定量する方法。
【請求項１０】液体あるいは組織試料中のHIV感染宿主
細胞を検出および定量するための方法であって、下記工
程、すなわち； HIVウィルスによって感染した細胞の細胞表面のT₄タン
パクへのHIVウィルス粒子の吸着部位に対して免疫学的
に特異的な反応性を有する単離および精製した抗体と、
前記試料を含んだ免疫学的反応混合物を形成し、およ
び、前記感染細胞表面への前記抗体の免疫学的結合を検出す
る工程を含み、前記抗体が、in vitroにてHIV感染を中和する能力と、O
KT4抗体あるいはOKT4A抗体と特異的な免疫学的反応性を
有する単離および精製した抗体である、ことを特徴とす
る液体あるいは組織試料中のHIV感染宿主細胞を検出お
よび定量するための方法。
【請求項１１】前記免疫学的結合の検出工程が、下記工
程、すなわち；前記抗体に検出可能な標識物質を結合し、および結合した当該標識物質を定量する、工程を含む特許請求の範囲第10項に記載の方法。
【請求項１２】前記抗体が、前記免疫学的反応混合物に
含まれている特許請求の範囲第11項に記載の方法。
【請求項１３】HIV感染細胞およびHIV非感染細胞を含む
細胞集団からHIV感染細胞を分離する方法であって、下
記工程、すなわち； HIVウィルスによって感染した細胞の細胞表面のT₄タン
パクへのHIVウィルス粒子の吸着部位に対して免疫学的
に特異的な反応性を有する単離および精製した抗体と、
前記細胞集団を含んだ免疫学的反応混合物を形成し；お
よび前記抗体の感染細胞への選択的結合に基づいて、非感染
細胞から感染細胞を分離する工程を含み、前記抗体が、in vitroにてHIV感染を中和する能力と、O
KT4抗体あるいはOKT4A抗体と特異的な免疫学的反応性を
有する単離および精製した抗体であることを特徴とす
る、HIV感染細胞およびHIV非感染細胞を含む細胞集団か
らHIV感染細胞を分離する方法。
【請求項１４】液体試料からHIVタンパクを単離する方
法であって、下記工程、すなわち； HIVウィルスによって感染した細胞の細胞表面のT₄タン
パクへのHIVウィルス粒子の吸着部位に対して免疫学的
に特異的な反応性を有する単離および精製した抗体と、
前記液体試料を接触させて、免疫学的反応混合物を形成
し；および前記反応混合物からHIVタンパクを単離する工程を含
み、前記抗体が、in vitroにてHIV感染を中和する能力と、O
KT4抗体あるいはOKT4A抗体と特異的な免疫学的反応性を
有する単離および精製した抗体である、ことを特徴とす
る液体試料からHIVタンパクを単離する方法。
【請求項１５】精製および単離したHIVタンパクであっ
て；（ａ）SDS−PAGEによって決定された60,000から80,000
の分子量を有し；および（ｂ）OKT4抗体あるいはOKT4A抗体と特異的な免疫学的
反応性を有することを特徴とする、精製および単離したHIVタンパク。
【請求項１６】前記HIVタンパクが、SDS−PAGEによって
決定された65,000から67,000の分子量を有する特許請求
の範囲第15項に記載の精製および単離したHIVタンパ
ク。
【請求項１７】前記HIVタンパクが、OKT4抗体あるいはO
KT4A抗体を含む免疫吸収剤を用いたアフィニティ精製を
経て生成された生成物である、特許請求の範囲第15項に
記載の精製および単離したHIVタンパク。