JP2587935B2 - Method of planting ice for biological samples in cryomicroscopy - Google Patents
Method of planting ice for biological samples in cryomicroscopyInfo
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Description
本発明は生物試料の凍結過程を低温顕微鏡で観察する
ときに有用な生物試料の植氷方法に関する。TECHNICAL FIELD The present invention relates to a method for planting a biological sample which is useful when observing a freezing process of the biological sample with a cryomicroscope.
精子・受精卵・血球・骨髄細胞・その他、生物組織や
生物細胞を保存するための凍結技術の研究が盛んに行な
われており、これがバイオテクノロジーや医学分野の進
歩に大きく貢献してきている。 この種の研究において凍結用チャンバーを備えた低温
顕微鏡で生物試料の凍結状態などを観察することは、凍
結技術を進歩させる上で重要であるといわれている。 また、生物試料の低温顕微鏡に際してこれを凍結する
ときには、植氷を行なうこと、すなわち、植氷によって
過冷却なしに試料を凍結することが不可欠である。もし
そうでないと、過冷却した後に凍結が始まり、その際の
急激な温度衝撃で生物試料がダメージを受けたり斃死し
たりする。これは凍結速度や凍害防止剤その他諸項につ
いて適正条件を見い出すための観察そのものが無意味に
なるということである。 この種の植氷方法に関する従来技術にはつぎのような
ものがある。 その一つは、金属製の植氷ピンや板を液体窒素（L
N2）のごとき冷媒で冷却し、これを試料に接触させて植
氷するというものである。 他の一つは、ペルチェ素子の冷却端に接続した金属棒
や金属板を試料に接触させて植氷するというものであ
る。Freezing techniques for preserving sperm, fertilized eggs, blood cells, bone marrow cells, and other biological tissues and cells have been actively studied, and have greatly contributed to advances in biotechnology and the medical field. In this type of research, it is said that observing the frozen state of a biological sample with a cryomicroscope equipped with a freezing chamber is important for the advancement of freezing technology. Further, when freezing a biological sample in a cryomicroscope, it is essential to perform ice seeding, that is, to freeze the sample without supercooling by ice seeding. Otherwise, freezing will begin after supercooling, and the sudden thermal shock will damage or die the biological sample. This means that the observation itself for finding appropriate conditions for the freezing speed, the antifreezing agent and other items becomes meaningless. The prior art relating to this type of ice planting method includes the following. One of them is to place a metal ice pin or plate on liquid nitrogen (L
It is cooled with a refrigerant such as N 2 ) and brought into contact with the sample to plant ice. Another method is to contact a sample with a metal rod or a metal plate connected to a cooling end of a Peltier element and to implant ice.
上述した従来技術にはつぎの課題がみられる。その一
つは特別な植氷装置・機器などを必要とすることであ
り、他の一つは冷媒や電気エネルギを必要とすることで
ある。これら以外にも、試料に接触させるピンや金属板
の温度調節が困難であることが指摘されている。とくに
生物試料がこれの凝固点を大きく下回って冷却されるよ
うなケースでは、植氷は可能であるがその周囲部が過冷
却を起こしやすい。The following problems are found in the above-described prior art. One is the need for special ice planting equipment / equipment, and the other is the need for refrigerant or electrical energy. In addition, it has been pointed out that it is difficult to control the temperature of the pin or the metal plate to be brought into contact with the sample. Especially in cases where the biological sample is cooled well below its freezing point, ice-planting is possible but the surroundings are susceptible to overcooling.
本発明は低温顕微鏡観察におけるこのような従来的課
題に鑑み、生物試料の過冷却防止、植氷技術難度の緩
和、特別な植氷装置・機器の省略、冷媒や電気エネルギ
の不要化などをはかることのできる植氷方法を提供しよ
うとするものである。The present invention has been made in view of such conventional problems in cryomicroscopic observation, and aims to prevent overcooling of biological samples, reduce the difficulty of ice-planting technology, omit special ice-planting devices and equipment, and eliminate the need for refrigerants and electric energy. It is intended to provide a method of planting ice that can be used.
本発明の低温顕微鏡観察における生物試料の植氷方法
は、所期の目的を達成するために下記の課題解決手段を
特徴とする。すなわち、スライドガラス上の生物試料を
低温顕微鏡観察のため凍結するときに、多数の微小凹凸
からなる氷結晶発生用の凹凸部が表面の一部に形成され
ているスライドガラスを用いること、および、スライド
ガラスの凹凸部のある表面側に該凹凸部の周縁を跨ぐこ
となく置かれた生物試料であって液体の付着しているも
のを凍結雰囲気下で冷却すること、および、当該冷却状
態において、スライドガラス凹凸部の周縁にある微小凸
起の箇所から氷結晶を発生させてこれをを成長させるこ
とを特徴とする。 本発明方法で用いられるスライドガラスの凹凸部は、
たとえば、ガラスエッチングで形成されたり切削具を用
いる手段で形成されたりするものである。The method of planting a biological sample in a cryomicroscopic observation according to the present invention is characterized by the following means for solving the problem in order to achieve the intended purpose. That is, when the biological sample on the slide glass is frozen for low-temperature microscopy observation, using a slide glass in which an uneven portion for generating ice crystals composed of a large number of minute unevenness is formed on a part of the surface, and A biological sample placed without straddling the periphery of the uneven portion on the surface side with the uneven portion of the slide glass, and the one to which the liquid is attached is cooled under a freezing atmosphere, and in the cooling state, The method is characterized in that ice crystals are generated from small projections on the periphery of the slide glass concave and convex portion and grown. The uneven portion of the slide glass used in the method of the present invention,
For example, it is formed by glass etching or by means using a cutting tool.
本発明において低温顕微鏡観察される生物試料は、通
常、周知の緩衝液に浸漬されており、これがスライドガ
ラス上に載置されるときにも緩衝液がともなうものであ
る。 本発明方法の場合は、このような生物試料をスライド
ガラスの表面側（凹凸部のある側）に置いてこれを凍結
雰囲気下で冷却する。冷却を開始してから凍結点に達す
ると、スライドガラス凹凸部における微小凸起（多数）
の箇所で氷結晶ができる。これは熱容量のきわめて小さ
い微小凸起が他の部分よりも先行して冷却が進み、これ
らの部分だけが過冷却を起して凍結するからである。そ
の後は、これら多数の核から結晶が成長していくので、
生物試料を含む全体が過冷却なしにスムーズに凍結す
る。In the present invention, a biological sample observed with a cryomicroscope is usually immersed in a well-known buffer solution, and when the sample is placed on a slide glass, the sample is accompanied by the buffer solution. In the case of the method of the present invention, such a biological sample is placed on the surface side of the slide glass (the side with the uneven portion) and cooled under a freezing atmosphere. When the freezing point is reached after cooling is started, minute protrusions (many) on the slide glass unevenness
Ice crystals form at the location. This is because the minute protrusions having extremely small heat capacity precede the other parts in cooling, and only these parts cause overcooling and freeze. After that, crystals grow from these many nuclei,
The whole, including the biological sample, freezes smoothly without supercooling.
本発明の低温顕微鏡観察における生物試料の植氷方法
について、これの実施例を添付の図面に基づいて説明す
る。 第１図（ａ）（ｂ）および第２図において、スライド
ガラス１の表面の一部には、氷結晶発生用の凹凸部２が
形成されている。この凹凸部２は、スライドガラス１を
部分的にエッチング処理するとか切削具などを用いる手
段とかで形成された微小凹凸からなる。したがって凹凸
部２には、第１図−Ａ部の拡大図すなわち第２図から理
解できるように、その周縁に多数の微小凸起３がある。 本発明において低温顕微鏡観察される生物試料（図示
せず）すなわち既述の生物組織や生物細胞（精子・受精
卵・血球・骨髄細胞・その他）は、通常、周知の緩衝液
に浸漬されている。このような生物試料は、顕微鏡観察
に際して緩衝液と共にスライドガラス１上に載置され
る。 本発明において用いられる低温顕微鏡は公知ないし周
知のものであって凍結用チャンバを備えている。 本発明方法の場合は、はじめ、生物試料をスライドガ
ラス１上に載置する。具体的には、スライドガラス１に
おける凹凸部２の中央に生物試料を置く。このとき生物
試料が凹凸部２の周縁を跨ぐことのないようにする。つ
ぎに、凍結用チャンバを起動して生物試料の冷却を開始
する。この冷却を開始してから凍結点に達したとき、凹
凸部２の周縁にある各微小凸起３の箇所で植氷の初期現
象が生じて氷結晶ができる。これは既述のとおり、熱容
量のきわめて小さい各微小凸起３が他の部分よりも先行
して冷却され、これらの部分だけが過冷却を起して凍結
するからである。その後は、これらの氷結晶が核にな
り、第３図のような凍結曲線を描きながら結晶を成長さ
せるために、生物試料を含む全体が過冷却なしに凍結す
る。 したがって本発明方法によるときは、単に冷却を進め
ていくだけで自然に植氷が行なうことができる。それゆ
え特別の植氷作業を必要としない。 なお、上記において生物試料を凹凸部２の中央に置く
理由は、当該試料を凹凸部２の周縁に触れて過冷却する
を回避するためである。 本発明方法で用いられる上記以外のスライドガラス１
として第４図（ａ）〜（ｃ）に例示するものをあげるこ
とができる。第４図（ａ）に例示されたスライドガラス
には、四角形の輪郭形状をなす凹凸部２がそのガラス表
面に形成されている。第４図（ｂ）に例示されたスライ
ドガラス１には、互いに平行した二本の棒状凹凸部２が
そのガラス表面に形成されている。第４図（ｃ）に例示
されたスライドガラス１には、円形の輪郭形状をなす凹
凸部２がそのガラス表面に形成されている。このような
スライドガラス１の凹凸部２は、たとえば、ガラスのエ
ッチング処理により形成されるものであるが、これがス
ライドガラス１の表面に対して部分的に形成されるかぎ
り、その形状や数は任意である。こうした凹凸部２をも
つスライドガラス１も、低温顕微鏡観察における生物試
料の植氷方法において既述の内容と同じかそれに準じて
用いられる。An embodiment of the method for planting a biological sample in a cryomicroscope according to the present invention will be described with reference to the accompanying drawings. In FIGS. 1 (a), 1 (b) and 2, a concave / convex portion 2 for generating ice crystals is formed on a part of the surface of the slide glass 1. FIG. The uneven portion 2 is formed of minute unevenness formed by partially etching the slide glass 1 or by using a cutting tool or the like. Therefore, as can be seen from the enlarged view of the portion A in FIG. 1-A, that is, FIG. In the present invention, a biological sample (not shown) observed by a cryomicroscope, that is, the above-mentioned biological tissue or biological cells (sperm, fertilized egg, blood cells, bone marrow cells, etc.) are usually immersed in a well-known buffer. . Such a biological sample is placed on the slide glass 1 together with a buffer solution during microscopic observation. The cryomicroscope used in the present invention is publicly known or well-known, and includes a freezing chamber. In the case of the method of the present invention, first, a biological sample is placed on the slide glass 1. Specifically, a biological sample is placed at the center of the uneven portion 2 on the slide glass 1. At this time, the biological sample is prevented from straddling the periphery of the uneven portion 2. Next, the freezing chamber is activated to start cooling the biological sample. When the freezing point is reached after the start of the cooling, an initial phenomenon of ice planting occurs at each of the small protrusions 3 on the periphery of the uneven portion 2, and ice crystals are formed. This is because, as described above, each of the minute projections 3 having a very small heat capacity is cooled before the other portions, and only these portions cause overcooling and freeze. Thereafter, these ice crystals become nuclei, and the whole including the biological sample is frozen without supercooling in order to grow the crystals while drawing a freezing curve as shown in FIG. Therefore, when the method of the present invention is used, ice can be naturally planted simply by proceeding with cooling. Therefore, no special ice-planting work is required. The reason why the biological sample is placed in the center of the uneven portion 2 in the above is to avoid overcooling the sample by touching the peripheral edge of the uneven portion 2. Other slide glass 1 used in the method of the present invention
4 (a) to 4 (c). In the slide glass illustrated in FIG. 4 (a), an uneven portion 2 having a quadrangular contour is formed on the surface of the glass. In the slide glass 1 illustrated in FIG. 4 (b), two parallel bar-shaped uneven portions 2 are formed on the glass surface. In the slide glass 1 illustrated in FIG. 4 (c), an uneven portion 2 having a circular contour is formed on the glass surface. The uneven portion 2 of the slide glass 1 is formed, for example, by etching the glass. However, as long as the uneven portion 2 is partially formed on the surface of the slide glass 1, the shape and number thereof are arbitrary. It is. The slide glass 1 having such uneven portions 2 is also used in the method of ice-planting a biological sample in low-temperature microscopic observation, which is the same as or similar to the contents described above.
本発明の低温顕微鏡観察における生物試料の植氷方法
は、つぎのような効果を有する。 （１）スライドガラス凹凸部に依存した特有の植氷現象
で生物試料を凍結させるので、生物試料の過冷却を防止
することができる。 （２）凹凸部のあるスライドガラス上に生物試料を載置
して冷却するだけで、生物試料の良好な凍結状態が得ら
れる。したがって凍結のための技術難度がない。 （３）特別な植氷装置・機器が不要である。したがって
設備面での経済性を高めることができる。 （４）植氷のための液体窒素や電力が不要である。した
がってランニングコストを低減することができる。The method of planting a biological sample according to the present invention for cryomicroscopic observation has the following effects. (1) Since the biological sample is frozen by a specific ice-planting phenomenon depending on the uneven portion of the slide glass, it is possible to prevent overcooling of the biological sample. (2) A favorable freezing state of the biological sample can be obtained only by placing the biological sample on a slide glass having an uneven portion and cooling it. Therefore, there is no technical difficulty for freezing. (3) No special ice planting equipment / equipment is required. Therefore, the economical efficiency of equipment can be improved. (4) No liquid nitrogen or electric power for ice planting is required. Therefore, running costs can be reduced.
第１図（ａ）（ｂ）は本発明方法の実施に際して用いら
れるスライドガラスの一例を示した平面図、第２図は第
１図のＡ部を拡大した平面図、第３図は本発明方法にお
ける凍結状況を表で示した説明図、第４図（ａ）〜
（ｃ）は本発明方法で用いられるスライドガラスの他例
を示した平面図である。 １……スライドガラス ２……凹凸部 ３……凸起1 (a) and 1 (b) are plan views showing an example of a slide glass used in carrying out the method of the present invention, FIG. 2 is an enlarged plan view of a portion A in FIG. 1, and FIG. Explanatory diagram showing the frozen state in the method in a table, FIG. 4 (a)-
(C) is a plan view showing another example of the slide glass used in the method of the present invention. 1 ... Slide glass 2 ... Unevenness 3 ... Protrusion
Claims (3)
観察のため凍結するときに、多数の微小凹凸からなる氷
結晶発生用の凹凸部が表面の一部に形成されているスラ
イドガラスを用いること、および、スライドガラスの凹
凸部のある表面側に該凹凸部の周縁を跨ぐことなく置か
れた生物試料であって液体の付着しているものを凍結雰
囲気下で冷却すること、および、当該冷却状態におい
て、スライドガラス凹凸部の周縁にある微小凸起の箇所
から氷結晶を発生させてこれを成長させることを特徴と
する低温顕微鏡観察における生物試料の植氷方法。When a biological sample on a slide glass is frozen for low-temperature microscopic observation, a slide glass having an uneven portion for generating ice crystals formed on a part of its surface is used. And cooling a biological sample to which a liquid is attached on a surface side of the slide glass having an uneven portion without straddling the periphery of the uneven portion in a freezing atmosphere, and A method for seeding a biological sample in a cryomicroscopic observation, wherein ice crystals are generated from small projections on the periphery of the uneven portion of the slide glass and grown in the state.
ングで形成されたものである特許請求の範囲第１項記載
の低温顕微鏡観察における生物試料の植氷方法。2. The method according to claim 1, wherein the concave and convex portions of the slide glass are formed by glass etching.
る手段により形成されたものである特許請求の範囲第１
項記載の低温顕微鏡観察における生物試料の植氷方法。3. The slide glass according to claim 1, wherein the uneven portion is formed by means using a cutting tool.
Item 13. A method for ice-planting a biological sample in cryomicroscopic observation according to the above item.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP62098193A JP2587935B2 (en) | 1987-04-21 | 1987-04-21 | Method of planting ice for biological samples in cryomicroscopy |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP62098193A JP2587935B2 (en) | 1987-04-21 | 1987-04-21 | Method of planting ice for biological samples in cryomicroscopy |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS63263440A JPS63263440A (en) | 1988-10-31 |
| JP2587935B2 true JP2587935B2 (en) | 1997-03-05 |
Family
ID=14213167
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP62098193A Expired - Lifetime JP2587935B2 (en) | 1987-04-21 | 1987-04-21 | Method of planting ice for biological samples in cryomicroscopy |
Country Status (1)
| Country | Link |
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| JP (1) | JP2587935B2 (en) |
Families Citing this family (2)
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|---|---|---|---|---|
| US5804444A (en) * | 1996-10-10 | 1998-09-08 | Tolix Holdings Limited | Hypothermic storage technology for biological material |
| WO1999043994A1 (en) * | 1998-02-26 | 1999-09-02 | Lucid, Inc. | Confocal microscope for facilitating cryosurgery of tissue |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS543378A (en) * | 1977-06-08 | 1979-01-11 | Matsushita Electric Ind Co Ltd | Feed water changeover apparatus for hydroextraction rinse type washing machine |
| JPS56114741A (en) * | 1980-02-14 | 1981-09-09 | Teisan Kk | Cooling and freezing method for sample |
-
1987
- 1987-04-21 JP JP62098193A patent/JP2587935B2/en not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS63263440A (en) | 1988-10-31 |
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