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JP2609238B2 - 標的ヌクレオチド配列の検定に有用な試薬複合体を作製するための方法および核酸構築物 - Google Patents
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JP2609238B2 - 標的ヌクレオチド配列の検定に有用な試薬複合体を作製するための方法および核酸構築物 - Google Patents

標的ヌクレオチド配列の検定に有用な試薬複合体を作製するための方法および核酸構築物

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JP2609238B2
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Description

【発明の詳細な説明】 発明の背景 本発明は標的ヌクレオチド配列検定用の試薬複合体の
作製に関し、特に複製可能であり且つ核酸鎖置換検定用
の試薬複合体の必須核酸成分をすべて含む新規な核酸分
子および核酸構築物が本発明方法によつて作製される。
一般的な核酸検定は標識プローブポリヌクレオチドを
使用する。このプローブポリヌクレオチドは検定しよう
とする標的ヌクレオチド配列に相補的な標的結合領域を
含む。まず初めにDNA試料を一本鎖の形で固定し、次に
標識プローブポリヌクレオチドを用いて検索することに
より、もしも固定化試料中に標的ヌクレオチド配列が存
在する場合にはハイブリツドが形成されるであろう。ハ
イブリツドを形成しなかつた標識プローブポリヌクレオ
チドを洗い流し、表面に残存する標識について検定する
ことにより、試料中に標的ヌクレオチド配列が存在する
かどうか、又どのくらいの量で存在するかを測定するこ
とが可能である。フアルコー（Falkow）らの米国特許第
4358535号（1982）を参照されたい。
標的ヌクレオチド配列に相補的なプローブ鎖は使用前
に複製のために種々のベクターにクローニングされる。
２種類のこのような型のベクターは成熟環状一本鎖の形
のウイルス（例えばバクテリオフアージM13およびバク
テリオフアージF1）および二本鎖の形で複製する二本鎖
環状プラスミド（例えばプラスミドpBR322およびpUC）
である。この種のプラスミドが環状一本鎖ウイルスの複
製開始点（例えばM13複製開始点）を与えられると、バ
クテリオフアージに感染した、クローン化標的結合領域
挿入物を含むプラスミドを保有する細胞はウイルス粒子
を生産し、そのうちの若干のウイルス粒子は一本鎖の形
のプラスミドクローン化挿入物DNAを含む。レビンソン
（A.Levinson）らのJ.of Mol.＆ Appl.Genetics,vol.
2、p.507〜517（1984）；デント（L.Dente）らのNuclei
c Acids Res.,vol.11、p.1645〜1655（1983）；ガザー
スキー（R.J.Zagursky）およびバーマン（M.L.Berman）
のGene,vol.27、p.183〜191（1984）を参照されたい。
核酸鎖移動現象が研究された。例えばグリーン（C.Gr
een）およびチベツト（C.Tibbetts）のNucleic Acids R
esearch,vol.9、no.8、p.1905〜1918（1981）を参照さ
れたい。核酸鎖置換を使用して標的ヌクレオチド配列の
存在および濃度を検定することは最初にダイアモンド
（S.E.Diamond）らの米国特許出願第607885号“置換ポ
リヌクレオチド検定法およびそのためのポリヌクレオチ
ド複合試薬”（1984年５月７日付、アライドコーポレー
シヨンとジエネテイクス・インステイチコート社に共同
譲渡された）（米国特許第４、766、062号）に開示され
ている。（1985年12月18日発行のEPA第164876号および1
986年１月８日発行のEPA第167238号を参照されたい。）
この検定用の試薬複合体は２種のポリヌクレオチド：
（１）検定しようとする標的ヌクレオチド配列に相補的
な標的結合領域を含むプローブポリヌクレオチドおよび
（２）プローブポリヌクレオチドの標的結合領域の少な
くとも一部に相補的な対合セグメントを含む標識ポリヌ
クレオチド（または信号鎖）を必要とする。これらのポ
リヌクレオチドはそれぞれ別個にクローン化しうる（す
なわち一方がクローニングにより複製され、他方が化学
的に合成される）が、置換ポリヌクレオチド検定用の試
薬複合体を製造する際にプローブポリヌクレオチドと標
識ポリヌクレオチドとをハイブリダイズする必要がある
という重大な欠点を有する。とりわけ、ハイブリダイズ
した標識ポリヌクレオチドをもたないプローブポリヌク
レオチドや、ハイブリダイズしたプローブポリヌクレオ
チドをもたない標識ポリヌクレオチドがしばしば混在す
る。十分な洗浄および精製によりこのような不完全な試
薬複合体を排除しうるが、この種の処理は避けるのが望
ましい。さらに、その他の単離・精製方法がアンガー
（P.D.Unger）らの米国特許出願第729501号（1985年５
月２日付、アライドコーポレーシヨンに譲渡）（特開昭
61−288158号）に記載されており、この方法は不完全な
試薬複合体の存在を実質的に減少させるが、それでも試
薬複合体とその使用方法に対して望ましくない制限を与
えている。
発明の簡単な説明 本発明は標的ヌクレオチド配列の核酸鎖置換検定法に
有用な試薬複合体の新規な前駆体を作製および複製させ
る方法、ならびに核酸構築物の形の種々の中間構造物を
提供する。試薬複合体の２種のポリヌクレオチド部分を
単一の複製可能な構造物中に組み入れて、その複製可能
な構造物から有効な試薬複合体を作製する一連の簡単な
工程を行うことにより、本発明は先に述べた諸制限を排
除することができる。
従つて、本発明は生物学的試料の核酸に含まれる標的
ヌクレオチド配列を検定するための試薬複合体の作製方
法を提供し、その方法は （ａ）（ｉ）標的ヌクレオチド配列に実質的に相補的な
標的結合領域、および （ii） 標的結合領域の一部に相補的塩基対合により該
構築物中で結合された信号鎖対合セグメント、（標的結
合領域の第二の部分は一本鎖であり、標的結合領域と信
号鎖対合セグメントはリン酸／糖主鎖により共有結合さ
れている） を有する主に一本鎖の形の連続核酸分子を複製により作
り； （ｂ） 信号鎖対合セグメントに近接して第一末端を、
かつ標的結合領域に近接して第二末端を形成し；そして （ｃ） 検出可能な標識を付ける； 各工程から成つている。
多くの場合に、検出可能な標識は信号鎖対合セグメン
トに近接した末端に付けられ、そして上記の三工程方法
はさらに次の工程： （ｄ） 信号鎖対合セグメントの標的結合領域に対する
リン酸／糖主鎖による共有結合を開裂する； から成る第四工程を包含する。
上記の四工程方法では、形成工程（ｂ）（外部末端の
形成）および開裂工程（ｄ）（内部末端の形成）は順に
あるいは同時に行うことができる。標識付着工程（ｃ）
は通常形成工程（ｂ）および開裂工程（ｄ）の一方また
は両方に続いて行われ、そして内部末端、外部末端また
はその他の箇所への標識の結合を包含する。
本発明はさらに生物学的試料の核酸に含まれる標的ヌ
クレオチド配列を検定するための試薬複合体を作製する
のに有用な核酸構築物を提供し、その構築物は （ａ） 標的ヌクレオチド配列に実質的に相補的な標的
結合領域、および （ｂ） 標的結合領域の一部に相補的塩基対合により該
構築物中で結合された信号鎖対合セグメント、 を含み、その場合標的結合領域の第二の部分は一本鎖で
あり、標的結合領域と信号鎖対合セグメントはリン酸／
糖主鎖によつて共有結合されている。
本発明はさらに複製可能な連続核酸分子を提供し、そ
の連続核酸分子は （ａ） 検定しようとする標的ヌクレオチド配列に実質
的に相補的な標的結合領域、および （ｂ） 標的結合領域の一部に相補的な信号鎖対合セグ
メントであつて、標的結合領域の相補的塩基と反対に方
向づけられた信号鎖対合セグメント、 を有し、それにより連続核酸分子は、その相補的核酸分
子から分離されたときに、相補的塩基対合によつて標的
結合領域の一部に信号鎖対合セグメントが結合された二
本鎖セグメントを形成することができる。
上記の複製可能な核酸分子は一本鎖または二本鎖の形
（すなわちその相補鎖と結合した形またはその相補鎖か
ら分離した形）であり得、さらに１つ以上の複製開始点
を含み得る。好ましくは、その複製可能な核酸分子は宿
主細胞による二本鎖形での複製のために、または宿主細
胞が適当なウイルス（その成熟形が一本鎖核酸を含む）
に感染したときに特異な一本鎖構造物を形成する複製の
ために、複製開始点を含む二本鎖形（例えばプラスミ
ド）で複製される。本発明の複製可能な連続核酸分子の
一本鎖形のその後の処理（例えば第1D図を参照）によ
り、本発明の核酸構築物が作製される（例えば第1E図を
参照）。
発明の詳細な説明 本発明書において、次の用語は分子生物学の分野で一
般に認められたそれらの意味に基づいて用いられる： ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチド鎖はペント
ース糖（一般にはリボースまたはデオキシリボース）が
３′,5′−ホスホジエステル結合により互いに結合し、
且つウラシル（自然界ではrUとしてリボースのみに結
合）、チミン（自然界ではdTとしてデオキシリボースの
みに結合）、シトシン（dCまたはrC）、アデニン（dAま
たはrA）およびグアニン（dGまたはrG）のような（これ
らに限定されない）側鎖プリンまたはピリミジン塩基が
炭素−窒素結合により糖の１−炭素原子に結合した線状
高分子構造を意味する。従つて、ポリヌクレオチドはデ
オキシリボ核酸（DNA）鎖およびリボ核酸（RNA）鎖ある
いは両方の型のポリヌクレオチドの連続ヘテロポリマー
を包含する。
このようなポリヌクレオチド鎖の両末端は、ペントー
スの５−炭素原子が他のペントースに結合されていない
（しかしヒドロキシル、モノホスフエートまたはその他
の天然もしくは合成基を保有し得る）５プライム
（５′）末端、およびペントースの３−炭素原子が他の
ペントースに結合されていない（しかし同様にヒドロキ
シル、モノホスフエートまたは天然もしくは合成基を保
有し得る）３プライム（３′）末端と呼ばれる。
相補的塩基対合またはプリン／ピリミジン塩基対合
は、２本の平行でしかも逆向きのポリヌクレオチド鎖上
の向かい合つた塩基側鎖間の水素結合を意味し、天然DN
AではdGがdCと対合し、dAがdTと対合する場合に最も都
合がよい。天然に存在するもの以外の塩基も優先的対合
を示し、例えば５−メチルシトシンはグアニンと優先的
に結合する。例示のために、多くの図面ではこの対合が
平行な直線で表わされ、向かい合つた核酸鎖は平行でし
かも方向（５′−３′の意味で）が反対である。しかし
ながら、二本鎖セグメントの実際の形状は米国特許出願
第607885号の第1D図に模式的に示されるように、通常ら
せん形（いわゆる二重らせん）であることを理解すべき
である。
本明細書で用いるハイブリダイゼーシヨンは、二本鎖
構造物を形成する条件下で２種のポリヌクレオチドを混
合することを意味し、相補的配列またはそれに近い配列
が存在する場合は相補的塩基対合により二本鎖構造物が
形成される。
本発明は初めにその方法について述べるであろう。そ
の後、本方法の初期工程で存在する本発明の連続核酸分
子について説明するだろう。次に、本方法の後期工程で
存在する核酸構築物をさらに説明するだろう。最後に、
試薬複合体（本方法によつて作製される）およびそれら
の用途を説明するだろう。試薬複合体とそれらの使用方
法は、一般に本発明者が共同発明者となつている1984年
５月７日付の米国特許出願第607885号（EPA164876およ
び167238を参照）のような関連発明の一部であることを
理解すべきである。いろいろな使用形体はジエネテイク
ス・インステイチコート社、アライドコーポレーシヨン
または両社に共同で譲渡された種々の関連発明に関係づ
けて説明されるだろう。
本発明はまたコリンズ（Collins）およびダウアテイ
ー（Doughert）の米国特許出願第809992号（1985年12月
16日付、共同譲渡）（米国特許第4,752,566号）に記載
されるように、逆試薬複合体を作製するのに有用であ
る。この逆試薬複合体では、標識が標的結合領域に結合
されるか、またはそれに近接して（製造中および試料と
のハイブリダイゼーシヨンの際に標的結合領域と共に存
在するという意味で）構築物中に組込まれる。この逆試
薬複合体が固定されると、標識された標的結合領域が置
換の生じたときに固定化対合セグメントから容易に分離
されるように、標識結合箇所は一般に対合セグメントに
近接しているか、またはその中にある。米国特許出願第
809992号の内容は逆置換の詳しい論議のために参考とし
てここに引用される。本実施例13および18（米国特許出
願第809971号（欧州特許公開286642号）の実施例９およ
び10、同第809992号の実施例１および２に対応する）は
本発明方法を使用することによる逆試薬複合体の作製を
示している。
本発明方法の出発物質は複製可能な連続核酸分子であ
る。それはウイルス（例えばバクテリオフアージ）、プ
ラスミドまたは他のベクター、もしくは複製微生物（例
えば細菌や酵母）の核酸鎖の形であり得る。好ましく
は、複製可能な核酸分子または核酸鎖はバクテリオフア
ージまたはプラスミドであり、そして宿種細胞中にもと
もと存在するかあるいは宿主細胞中の感染ウイルスによ
つて誘発される複製系により認知される１つ以上の複製
開始点を含む。複製可能な連続核酸分子は通常DNAであ
り、構築物がRNAである本発明の形態は以下に区別して
記載する。
複製可能な連続核酸分子の２つの不可欠な部分は、標
的結合領域と信号鎖対合セグメントである。これらの２
つの核酸配列は生物学的試料中の標的ヌクレオチド配列
を測定または検出するための米国特許出願第607885号の
方法において使用する試薬複合体の対応するセグメント
の前駆体である。従つて、米国特許出願第607885号で論
ずる理由により、標的結合領域（TBR）は十分な特異性
を付与するのに望ましい長さのものであり、通常約35〜
約2000ヌクレオチド長であり、好ましくは約100〜約100
0ヌクレオチド長である。本発明の作製方法は標的結合
領域の選択または大きさになんら実質的な制限を課さな
い。
信号鎖対合セグメント（PS）は試薬複合体中のTBRの
一部（LBR）に相補的塩基対合によつて結合される標識
ポリヌクレオチドの部分（米国特許出願第607885号では
Ｌ、本明細書では信号鎖と呼ばれる）の前駆体である。
米国特許出願第607885号に示すように、LBRの長さは例
えば20〜1000ヌクレオチド、好ましくは50〜500ヌクレ
オチド、より好ましくは100〜300ヌクレオチドである。
LBRよりも長い標的結合領域は米国特許出願第607885号
に論ずるように１つまたは２つ以上の初期結合領域（IB
R）を残す。対合セグメント（PS）はLBRに一致する長さ
であつて、相補的塩基を含み（ただし許容される誤対合
を除く）且つ複製可能な核酸分子中に逆方向で存在す
る。以下により詳しく述べるように、LBR（TBRの一部）
に対するPSの相補的塩基の逆方向は、その相補鎖から単
離されて一本鎖形になつたその連続核酸分子がPSとLBR
との結合した二本鎖領域を形成するのを可能にする。U.
S.S.N.607885に示すように、若干の誤対合塩基がその相
補性の領域中に存在しうる。第1D図に例示（および後
述）するように、LBR−PSのほかに局部的二本鎖の他の
領域が存在でき、複製可能な核酸分子はまだ完全なまま
で存在する。この逆方向反復構造は通常相補鎖からの単
離の際に形成することができるが、このような形成はい
くつかの場合に核酸分子の線状化により、あるいは温度
やイオン強度の選択条件のような他の生化学的、化学的
または物理化学的工程により促進されると考えられる。
連続核酸分子のある好適な形では、制限エンドヌクレ
アーゼによつて標識および切断される制限部位がその相
補鎖から単離された連続核酸分子中にも形成される（第
1D図のBamH I部位を参照されたい）。その部位を開裂さ
せると連続核酸分子が２つの箇所で切断される。これら
の２つの箇所をTBRおよびPSを含み且つ共有的に（リン
酸／糖主鎖により）結合しているセグメントの外側に位
置づけることにより、一定の長さの核酸が複製可能な核
酸分子の残部から単離される。これとは別に、その２つ
の箇所は別の逆方向反復配列（例えば図面中のセグメン
ト16）によつて作られた制限部位であり得る。この長さ
の核酸はLBR/PS二本鎖セグメントを有するか、またはこ
のようなセグメントを形成しうる。TBRもしくはPSの部
分以外のヌクレオチドに対しては何ら限定的最大値が存
在しない。TBRとPSの両方を含み且つTBRの一部（LBR）
にPSが塩基対合されたこの長さの核酸は、本明細書にお
いて核酸構築物と呼ばれる。
以下で論ずるように、核酸構築物は直接に、または転
写開始点を含む長いDNA分子の切断後に、DNA核酸分子か
ら転写されるRNAであり得る。
核酸構築物は２つの末端（５プライム末端および３プ
ライム末端）を有し、そのうちの一方は核酸鎖に沿つて
TBRの外側にあり、他方は核酸鎖に沿つてPSの外側にあ
る。以下でより詳しく論じるように、これらの２つの末
端はそれぞれ試薬複合体を作製する際に使用されるか、
またはこれらの末端の一方とTBRおよびPSの間を切断す
ることによつて作られた新しい末端とが使用される。追
加の切断は２つの新しい末端（第二５′プライム末端お
よび第二３′プライム末端）を生ずるが、通常、最初に
作られた（外部）末端の少なくとも１つが使用される。
本明細書の記述の多くは外部末端が最初に作られ（そ
れにより核酸構築物が得られる）、次に（もしも存在す
るなら）内部切断が行われる方法に関するものである
が、このような順序は逆であつてもよく、また２組の切
断は同時にあるいは介在する精製や分離を行うことなく
なされてもよい。さらに、実施例７の終りで述べるよう
に、連続核酸分子はそれを標識することにより外部また
は内部末端を作ることなく置換／捕獲検定において使用
することができる。
ある時点で、U.S.S.N.607885に記載の方法で使用され
る通常の試薬複合体を作製するために、検出可能な標識
が信号鎖対合セグメントに近接した末端に付けられる。
逆試薬複合体（U.S.S.N.809992を参照）の場合は、一般
に標識が標的結合領域に近接した末端に付けられる。本
明細書において“に近接した”または“に隣接した”と
いう用語は、ポリヌクレオチド鎖に沿つて位相幾何学的
に測定したとき（空間的には区別されるが）十分に接近
しており、標識が試薬複合体を製造する全工程の間中信
号鎖対合セグメントと共に（または逆試薬複合体の場合
は標的結合領域と共に）存在し、且つ信号鎖が標的ヌク
レオチド配列によつてTBR（またはPS）から置換された
場合でもその信号鎖と共に（または逆試薬複合体の場合
は標的結合領域と共に）残存するであろうということを
意味する。検出可能な標識が結合される末端は内部末端
または外部末端のいずれであつてもよく、また５プライ
ム末端または３プライム末端のいずれであつてもよい。
以下で又はU.S.S.N.809992で述べるように、通常のまた
は逆の試薬複合体が置換反応後に捕獲されるならば、例
えば光化学反応または非特異的化学反応によつて標識が
分子の１つ以上の個所にランダムに結合された本発明の
適当な態様が存在する（実施例９参照）。
適当な検出しうる標識には放射性同位体、螢光分子、
酵素および化学ルミネツセント標識を含めたU.S.S.N.60
7885に記載のものが含まれる。その他の適当な検出しう
る標識はいろいろな長さのリボヌクレオチドであり、特
にベアリー（C.Vary）らのU.S.S.N.729503（1985年５月
２日付、アライド・コーポレーシヨンに譲渡）（米国特
許第4,767,699号）に記載されるポリ（リボアデノシ
ン）である。３プライム末端に、種々のこのような標識
が鎖乗長反応により、特にターミナル・デオキシヌクレ
オチジル・トランスフエラーゼ（TdT）を用いて組込ま
れる。リボヌクレオチド（特にリボアデノシン）による
鎖伸長には、上記の特許出願明細書に記載されるような
酵素ポリヌクレオチドホスホリラーゼ（PNP）が用いら
れる。
検出可能な標識はまたスプリント（splint）オリゴヌ
クレオチドを使用する連結反応、化学的修飾、または連
結反応と化学的修飾との併用により結合される。この種
の技術は５プライム末端、３プライム末端、または（特
に連結反応を伴う場合は）特定配列を有する５プライム
もしくは３プライム末端に対して特異的である。
U.S.S.N.607885の試薬複合体に応用される本発明のい
くつかの態様において、標的結合領域（TBR）に近接し
た（内部または外部）末端もまた使用される。一般に、
このような末端は固定化プローブポリヌクレオチド（U.
S.S.N.607885に記載）を作るために固相に結合される
か、あるいはあとで（通常検定法のあとで）固体支持体
に選択的に結合させうるある種の成分（例えばビオチ
ン）に結合される。固定化可能なプローブの使用はU.S.
S.N.607885に記載されている。この種の固定化可能なプ
ローブの別の形体はアンガー（Unger）らのU.S.S.N.729
501（1985年５月２日付、アライド・コーポレーシヨン
に譲渡、係属中）に示されている。同様の方法で、U.S.
S.N.809992の逆試薬複合体のある形体を作るために、対
合セグメント（PS）に近接した（内部または外部）末端
が固相に結合される（固定化される）か、または固定化
可能な状態にされる。末端を固定化可能にする技術には
ビオチニル化dUTPによる伸長、dCTPによる伸長（ポリdC
を形成）、またはビオチンやその他の親和成分の化学的
結合が含まれる。
本発明に従つて作られる試薬複合体は、いろいろな濃
度の多種多様の標的ヌクレオチド配列を検出および測定
するために使用される。とりわけ、標的とされる感染物
質（そのゲノム核酸または他の核酸が標的とされる）を
含む微生物には病原性ウイルス、細菌および真菌；例え
ばサイトメガロウイルスや淋菌（Neisseria gonorrhe
a）が含まれる。標的とされる遺伝子疾患や症状の例に
はβ地中海貧血、α１地中海貧血、ネコ鳴き症候群（cr
i duchat syndrome）およびいくつかの網膜芽腫が含ま
れる。U.S.S.N.607885の方法および試薬は、主として標
的配列を識別するのに多塩基ヌクレオチド欠失、挿入、
置換または転位が関係する場合に、遺伝子疾患または変
異を検出すべく適用される。この方法が、まれである
が、１個の塩基の突然変異による遺伝子疾患に適用され
る場合、置換塩基又は他の突然変異個所の相補体が望ま
しくはプローブポリヌクレオチドの標的結合領域の一部
となり、その際その領域内のその塩基の位置はこの方法
の選択性に影響を与えると思われる。なかでも、構造遺
伝子や調節遺伝子の変化、その発現の変化または相違、
腫瘍遺伝子の活性化または転移が本方法によつて検出さ
れる。構造遺伝子の発現におけるその他の摂動も同様に
検出できる。この種の試薬複合体はまたは組織移植のた
めのHLAタイピング、微生物中の抗生物質耐性遺伝子の
検出、および特定の感染因子または他の微生物について
の食品、医薬品および水試料のスクリーニングに応用で
きる。
個々の試験用の標的配列の選択は、標的微生物または
症状に特異なまたは比較的特異な配列の決定を包含す
る。この標的配列はそれに相補的な標的結合領域を作製
するために使用され、その後適当な長さの信号鎖ポリヌ
クレオチド用対合セグメントがその標的結合領域の一部
へ結合させるために作製されるだろう。この種のセグメ
ントはその後以下で述べるクローニングベクター中に挿
入される。
第1A図は二本鎖核酸10の一実施態様を示し、その上鎖
は本発明の複製可能な核酸分子の一部を形成する。セグ
メント10の上鎖は、左から右へ（すなわち５′から３′
の方向へ）、第一セグメント12、Sma I制限部位を有す
る介在領域、第二セグメント16、Xba IおよびHin IIお
よびPst Iの各制限部位を有する介在領域、ならびに核
酸10の上鎖の３′末端にある第三セグメント14を含む。
平行であるが逆方向の下鎖は完全に相補的であつて、右
から左へ（すなわち５′から３′の方向へ）：第三セグ
メント14に相補的な下鎖のセグメント14′、介在領域、
第二セグメント16に相補的な下鎖のセグメント16′、介
在領域および第一セグメント12に相補的な下鎖のセグメ
ント12′を含む。介在領域は十分に相補的であつて、そ
れぞれ12/12′領域と16/16′領域の間にSma I制限部位
を、そして16/16′領域と14/14′領域の間にXba I、Hin
c IIおよびPst I制限部位を完成する。
核酸10は各種細胞のゲノムDNA、プラスミド、ウイル
スおよび宿主細胞内で二本鎖の形で複製しうるその他の
ベクターを含めた多種多様な二本鎖核酸の一部であり得
る。
第1B図は連続した形（主に一本鎖の形）の第1A図に示
した核酸10の上鎖を示す。上記の論議中で説明したよう
に、一本鎖形は物理化学的方法により製造されるか、あ
るいはM13（複製中は二本鎖の形である）のようなウイ
ルスの天然型でありうる。好ましくは、一本鎖形はウイ
ルス粒子中への通常二本鎖のポリヌクレオチドの一方の
鎖の組込み（例えばM13複製開始点をもつ二本鎖プラス
ミドDNAを含んだ微生物のM13感染）によりもたらされ
る。
第1B図では、一本鎖（上鎖）の正確な塩基配列が、種
々の制限部位および半制限部位と共に示される。“制限
部位”という用語は、特異的制限エンドヌクレアーゼに
よつて認識および開裂される塩基配列をもつ二本鎖領域
を意味する。“半制限部位”という用語は、完全に適合
したヌクレオチドセグメントとハイブリダイズした時に
この種の制限部位を形成する一本鎖ヌクレオチドセグメ
ントを意味する。第1A図からの上鎖のセグメント12およ
び14は互いに相補的であるので、それらはセグメント12
の塩基10〜15（セグメント12の５′末端から数えて）と
セグメント14の対応する塩基とにBamH I制限部位を有す
る22塩基対の二重鎖セグメントを形成する。セグメント
16は自己相補性であるので、この52ヌクレオチドセグメ
ントはセグメント16の塩基９〜14と塩基39〜44にEcoR I
制限部位を有する26塩基対の二重鎖へアピン構造を形成
する。第一介在配列（Sma I半制限部位をもつ）と第二
介在配列（Xba I、Hinc IIおよびPst I半制限部位をも
つ）は、短い一本鎖ヌクレオチド配列によつてセグメン
ト12/14二重鎖とセグメント16二重鎖ヘアピン構造とを
連結する。
第1C図には核酸10への２つの二本鎖ヌクレオチドの挿
入が示される。Sma I部位（第1A図参照）に、左側部分
（LBR）および右側部分（IBR）をもつ二本鎖ポリヌクレ
オチドTBRが挿入される。以下に示すように、LBRとIBR
の組合せはTBRの一方の鎖が検定しようとする標的ヌク
レオチド配列に相補的であるように選ばれるだろう。TB
R挿入物は外側（左側）にLBRを、そして内側（右側）に
IBRをもつようにここでは示されている。Pst I部位（第
1A図参照）には、第一挿入物TBRのLBR部分に実質的に相
同（逆方向）なセグメントPSが挿入される。
本発明の一般性は、ほとんどあらゆる長さの塩基配列
がプローブポリヌクレオチドの標的結合領域TBRとして
使用するための第一挿入物（Sma I部位）として合成さ
れ、クローン化され、または他の方法で作られ、そして
意図する向きで挿入され得ることを考慮することによつ
て認められる。その後、第一挿入物の適当な部分を選択
して、その相補的配列が第二挿入物PS（信号鎖または標
識ポリヌクレオチドの対合セグメントとして最終的に役
立つだろう）として役立つように化学的に合成される
か、複製されるか、またはその両方が行われる。
第1D図は第1C図に示す挿入生成物からの上鎖を含む完
全な環状一本鎖DNA分子（本発明の一本鎖の形の複製し
うる核酸分子である）を示す。それはその相補鎖（セグ
メント10′、12′、14′および16′を含む）から単離さ
れた。各セグメントの５′末端から３′末端の方向に見
ると、環状DNAの主要ループはセグメント12および短い
一本鎖セグメントによつてセグメントLBR、次にセグメ
ントIBR、次にヘアピン16、次にXba IおよびHinc II半
制限部位を含む一本鎖セグメント、次にセグメントPS
（セグメントLBRとハイブリダイズされる）、次に短い
一本鎖配列、次にセグメント14（セグメント12とハイブ
リダイズされる）に連結され、最後に主要ループの他端
（５′末端）に戻つて連結される。主要ループは、それ
が二本鎖の形で存在するときに、二本鎖の形で複製開始
点として役立つセグメントCE（各実施例の実施態様では
col E I origin）を含む。主要ループはまたM13の複製
開始点（M13oriとして表示）をも有する。
第1D図に示す環状の、主として一本鎖のDNAの制限エ
ンドヌクレアーゼBamH I（セグメント12/14内のBamH I
部位；第1B図参照）による切断は、セグメントLBR/セグ
メントPS二重鎖の左に短いDNA片のみを有する第1E図に
示すループをもたらす。温度および塩濃度に応じて、こ
れらのDNA片は一本鎖であるか、あるいは12塩基対合二
重鎖によつてその末端で接合される。特に、５′末端構
造は５′−GATCCGTCGACCCGCCC−LBRであり、３′末端構
造は３′−GCAGCTGGTCGAACCCG−PSであり、８つの下線
を施したヌクレオチドが塩基対合し得る。５′末端のGA
TC突出部分は以下で言及する。
この時点で、第二の各酸構築物、すなわち （ａ） 標的ヌクレオチド配列に実質的に相補的な標的
結合領域（セグメントLBRおよびIBR）、および （ｂ） 標的結合領域の一部（LBR）にその構築物中に
おいて結合された信号鎖結合領域（セグメントPS）、 を含むものが形成され、その場合標的結合領域の第二部
分（IBR）は一本鎖であり、標的結合領域と信号鎖結合
領域とはリン酸／糖主鎖によつて共有結合されている
（ヘアピン16および半制限部位Xba IとHinc IIを含むセ
グメントがPSをIBRに連結する）。この種の構築物はよ
り大きなDNAフラグメントから、例えばヒドロキシアパ
タイトクロマトグラフイーによつて分離することができ
る。
この核酸構築物は今や、現存する３′末端、現存する
５′末端またはヘアピン16のEcoR I制限部位が切断され
たときに生じる３′および５′末端において、種々の化
学的または生化学的修飾を受けやすくなつている。この
ような修飾の第一の例を第1F図および第1G図に示す。
第1E図の核酸構築物から出発して、３′末端（セグメ
ントPSの近く）は第1F図に示すように修飾されて検出可
能な標識Ｔを付けられる。U.S.S.N.607885に記載される
ように純化学的修飾を使用してもよい。この３′末端に
おいて特異的になされる生化学的修飾にて、BamH I制限
エンドヌクレアーゼの作用によつて一本鎖の形で残され
たGATC突出部分に相補的な塩基CTAGをフイルインするこ
とに基づいたもの（５′末端の上記の塩基配列を参
照）、またはターミナル・デオキシヌクレオチジル・ト
ランスフエラーゼのような各種の酵素の作用による３′
末端での伸長化による修飾が含まれる。
上記のような方法で放射性標識ヌクレオチドが３′末
端に付加される。ビオチニル化ウリジンのようなヌクレ
オチドもデオキシヌクレオチジル・ターミナル・トラン
スフエラーゼを用いた伸長化によつて３′末端に付加さ
れ、このような伸長化の後に側鎖ビオチンへのストレプ
トアビジン酵素複合体の結合が続く。これとは別に、一
連のリポアデノシンヌクレオチドがデオキシヌクレオチ
ジル・ターミナル・トランスフエラーゼ、その後のポリ
ヌクレオチドホスホリラーゼの併用によつて付加され
る。“ポリヌクレオチド置換、分離、酵素切断およびア
デノシンホスフエート検出を使用する診断試薬、キツト
および方法”と題するベアリー（C.Vary）らのU.S.S.N.
729503およびU.S.S.N.729502（共に1985年５月２日付）
（それぞれ、米国特許第4,767,699号及び第4,735,897
号）を参照されたい。
どの標識が選ばれようと、第1F図の標識構築物は今や
第1G図に示すように遊離５′末端によつて特異的に固相
に結合される。第1G図の上方を見ると、DNA結合成分AM
が固相に共有結合されており、そしてスプリントオリゴ
ヌクレオチドSPが標識された第二構築物の５′末端と結
合成分AMの３′末端の両方にハイブリダイスれている。
連結反応は標識構築物を固相へ完全に共有結合させる。
その結合工程はいくつかの順序で行われ、１つの好まし
い順序は（１） 結合成分、スプリントオリゴヌクレオ
チドおよび核酸構築物をハイブリダイズさせ、（２）
結合成分とTBRに隣接する構築物の遊離５′末端との間
に共有結合を形成させるべく連結させ、そして（３）
結合成分の他端を支持体に化学的に結合させることであ
る。その後制限エンドヌクレアーゼEcoR Iで消化するこ
とによりその構築物をヘアピン16のところで切断し、プ
ローブポリヌクレオチドＰ（セグメントLBRおよびIBRを
含む）と標識ポリヌクレオチドＬ（第1G図参照）との共
有結合を切断する。この切断は支持体への結合前または
結合後に行われる。標識ポリヌクレオチドは標識Ｔばか
りでなくセグメントPSと半制限部位Hinc IIおよびXba I
とを含む。標識ポリヌクレオチドＬはセグメントPSとセ
グメントLBRの間のプリン／ピリミジン水素結合を介し
てプローブポリヌクレオチドＰに結合されたままであ
る。
U.S.S.N.607885でより詳しく説明したように、この試
薬複合体は今やセグメントLBRおよびIBRに相補的な標的
ヌクレオチド配列の検定に使用される。試料が標的ヌク
レオチド配列を含む場合は、それはプローブポリヌクレ
オチドＰの一本鎖部分IBR（第1G図のプローブＰの右
端）と初めにハイブリダイズして二重鎖構造を形成し、
その後分枝点移動（branch migration）が第1G図の左に
向かつて起こるであろう。分枝点は前後左右に、とりわ
け標識ポリヌクレオチドＬの対合セグメントPSと標的ヌ
クレオチド配列の一部の両方に相補的なセグメントLBR
内で移動するので、終局的に分枝点は標識ポリヌクレオ
チドＬがプローブポリヌクレオチドＰから解離するのに
十分なほど左に移動するだろう。普通の条件下におい
て、標識ポリヌクレオチドＬのこのような置換は、初期
結合領域IBRへの標的ヌクレオチド配列のハイブリダイ
ゼーシヨンの開始後すぐに起こる（一般的には全検定時
間30分以内、微視的レベルではセグメントIBRにおける
初期ハイブリダイゼーシヨン数秒以内）。
結合された完全な試薬複合体を含む固相から置換され
た標識ポリヌクレオチドを含む液相を分離し、次いでい
ずれかの相（好ましくは液相）に含まれる標識Ｔを検出
することによつて、試料中の標的ヌクレオチド配列の存
在および濃度の関数である定性的および定量的測定を行
うことができる。この種の使用方法はU.S.S.N.607885に
より詳しく開示されている。
第1H図は第1F図の標識構築物から作られる固定化しう
る試薬複合体を示す。第1F図の標識構築物を制限エンド
ヌクレアーゼEcoR Iで消化してヘアピン16を開裂し、そ
れによりプローブポリヌクレオチドと標識ポリヌクレオ
チドＬとの共有結合を切断する。セグメントIBRの３′
末端の近くに今や第二の３′末端が作られる。標識Ｔが
鎖伸長を阻止するものであると仮定すると、ビオチニル
化ウリジンの存在下でのターミナル・デオキシヌクレオ
チジル・トランスフエラーゼの作用（EPA63879（1982）
を参照）は、第1H図の修飾プローブＰ′に示すように側
鎖ビオチンを有する一連のウリジンヌクレオチドを結合
させるだろう。この種の側鎖ビオチンは今や固定化アビ
ジンまたはストレプトアビジン（固相に結合されたＡと
して図示）の結合部位として役立つ。U.S.S.N.607885に
示すように、このような親和結合は固定化試薬複合体の
調製の一部として、あるいは特異的置換検定を溶液中で
行つた後の分離手段として役立つものである。
本発明の多くの形態において、構築物内のセグメント
TBRとセグメントPSの間にある２つの内在的半制限部位
は対合して、本方法のある時点で切断される１つの制限
部位（ヘアピン16は第1D図および第1E図に示すようにEc
oR I部位を有する）を形成することができる。このよう
なヘアピンの代わりに他の形の認識しうる切断部位も使
用されるだろう。しかしながら、本発明はこのような部
位の存在する必要がないか、あるいは存在するとしても
本方法の間中に切断される必要がない他の多くの形態を
包含する。但し、このような場合は（１）セグメントLB
Rに相補的塩基対合によつて結合されたセグメントPS
と、（２）相補的塩基対合性セグメントLBRによつて結
合されない（セグメントLBRから置換された）セグメン
トPSとを識別するためのある手段が存在する。U.S.S.N.
607885の第3C図および添附の説明に示すように、プロー
ブポリヌクレオチドにはPSがLBRに結合したときに標識
ポリヌクレオチド上の標識に空間的に接近した第二標識
が存在しうる。PSがLBRから置換された際に、２つの標
識はたとえヌクレオチド鎖によつてまだ結合されていた
としても空間的に分離される。例えば、一方の標識が螢
光体であつて他方の標識が消光体である場合、螢光信号
は標的ヌクレオチド鎖による置換に付された構築物から
選択的に検出することができる。本発明の第1E図に関し
て、この種の構築物はLBRに隣接する（外側）３′末端
に螢光体を結合し、PSに隣接する（外側）５′末端に消
光体を結合することによつて形成される。
第2A図は二本鎖核酸の核酸前駆体110を示す。第2A図
に示すDNAの領域は第1A図に示すものと逆方向でベクタ
ー（M13およびプラスミド複製開始点ならびに選択可能
なマーカーを含む）中の核酸110に配置されたセグメン
ト12、16および14ならびに半制限部位Sma I、Xba I、Hi
nc IIおよびPst Iを含む。
従つて、第2A図において、上鎖は左から右へ（５′か
ら３′の方向へ）：セグメント14′、Pst I、Hinc IIお
よびXba I半制限部位、セグメント16′、Sma I半制限部
位ならびにセグメント12′を含む。第2B図は連続した
（主に一本鎖の）形の第2A図に示す核酸前駆体110の上
鎖を示し、これは第1B図に対応する。
第2B図は逆方向でのセグメントの挿入により上鎖にセ
グメント14′、16′および12′が配置されたことを示し
ている。従つて、Sma I部位は今やセグメント12′が切
断されたときに作られる３′末端に近接しており、Pst
I部位は今やセグメント14′が切断されたときに作られ
る５′末端に近接している。
第2C図は第2A図および第2B図に示す前駆体から作製さ
れる本発明の核酸構築物の第二の実施態様を示す。第2C
図はTBRセグメント（LBRおよびIBRを含む）がSma I部位
に挿入され且つPSセグメントがPst I部位に挿入され、
得られた環状一本鎖DNAが制限エンドヌクレアーゼBamH
Iで切断されたという点で第1E図と類似している。この
構築物は今やセグメントLBRに隣接する遊離３′末端と
セグメントPSに隣接する遊離５′末端を含む。５′末端
への標識の特異的結合は種々の技法を用いて行われる：
すなわち以下で述べるようにポリヌクレオチドキナーゼ
は末端５′ホスフエートをＰ−32標識ホスフエートで置
換することができる。さらに、化学的結合法を用いて
５′末端に螢光、酵素および化学ルミネツセントを含め
た各種の検出可能な標識を結合することができる。ま
た、先に挙げたブラウン（E.Brown）らのU.S.S.N.72970
0に記載されるような、連結または連結と化学的結合の
組合せも使用しうる。
ひとたび標識（５′末端）核酸構築物が形成される
と、それは次に制限エンドヌクレアーゼEcoR Iで消化さ
れる。この酵素はヘアピン16を切断して、第2D図の左側
に示される線状構造を形成する。この線状構造では、標
識ポリヌクレオチドＬは対合セグメントPSとその５′末
端に検出可能な標識Ｔを含む。より長いプローブポリヌ
クレオチドはセグメントLBRおよびIBRを含む。ポリヌク
レオチドＬおよびＰはもはや共有結合されていないが、
それらはPSとLBRの間で水素結合により結合されてい
る。さらに、ポリヌクレオチドＬおよびＰは両方とも遊
離３′末端をもつが、遊離５′末端はプローブポリヌク
レオチドＰのみがもつ。
第2D図の残りに関して、試薬複合体のプローブポリヌ
クレオチドＰの５′末端は結合成分AMおよびスプリント
ポリヌクレオチドSPによつて固体表面SUに固定される。
その後、固定化試薬複合体はダイアモンドらのU.S.S.N.
607887に記載されるように、置換検定法において使用さ
れる。また別法として、第2D図の試薬複合体のプローブ
ポリヌクレオチドＰの５′末端を支持体に結合させるの
ではなく、置換反応を溶解状態で行えるように、プロー
ブポリヌクレオチドＰの５′末端に成分Ｂを結合させる
ことができる（例えばビオチンやイミノビオチンを含む
第二結合成分への連結によりビオチンやイミノビオチン
を結合させる）。置換反応の完了後に、プローブＰの
５′末端の結合成分は全ての完全な試薬複合体を固定化
親和性試薬（例えばストレプトアビジン）で捕獲するた
めに使用される。これらの状況下において、置換された
標識ポリヌクレオチドＬ（もはやプローブポリヌクレオ
チドＰに結合されていない）のみが検出用の固定化親和
性物質を通り抜けるだろう。そして、固定化親和性試薬
のカラムからの溶離液中に検出された標識の量は、置換
反応に使用した試料中に存在する標的ヌクレオチド配列
の存在および濃度に関係してくるだろう。
PSに隣接する類似の５′末端およびTBRに隣接する類
似の３′末端を有する核酸構築物の複製可能な核酸分子
および諸態様もまた、第1A図に示す前駆体鎖10への第1C
図に示す挿入を逆にすることによつて作製できることを
認識すべきである。こうして、Sma I部位にセグメントP
Sが導入され（適当な末端ヌクレオチドを使用）、そし
てPst I制限部位にセグメントTBRが導入されるだろう
（適当な末端ヌクレオチドを使用）。従つて、遊離（外
側）５′または３′末端にどのセグメント（TBRまたはP
S）が近接するかについての特定性は、複製可能な核酸
分子がどの前駆体（第1A図の分子10または第2A図の分子
110）を使用するか、あるいはTBRまたはPSがどの部位
（Sma IまたはPst I）に挿入されるかに基づいて決定さ
れる。Sma IおよびPst I部位は実施例４の前駆体核酸分
子に基づく例示目的のために特定されていると認識すべ
きである。当分野で習熟した者は、セグメントTBRおよ
びPSを所望位置に所望方向で特定的に配置またはクロー
ン化するための他の半制限部位または他の技法を見い出
すことができるだろう。
逆試薬複合体は同様に第1E図または第2C図の構築物か
ら作製することができ、その場合標識の結合は今や標的
結合領域TBR（IBR＋LBR）に近接する末端（第1E図の
５′末端；第2C図の３′末端）に特定的になされる。も
しも対合セグメントPSを固定化することを望むかまたは
固定化可能にすることを望む場合には、適当な化学的ま
たは生化学的修飾が他の外部末端（第1E図の３′末端；
第2C図の５′末端）、もしくはヘアピンの切断後に対合
セグメントPSに近接して形成される内部末端で行われ
る。
第3A、3Cおよび3E図は第1E図の核酸構築物の３種類の
修飾を示す。これらの修飾形はそれぞれ第1C図に示す方
法と類似した方法で作ることができるが、第一挿入物TB
Rの異なる部分に相補的な対合セグメントPSを使用す
る。こうして、第3A図では、標的結合領域TBRの2/5に相
補的な対合セグメントPSがPst I部位（第1A図参照）へ
の挿入のために選ばれた。これらの条件下において、第
3A図の第二構築物はその５′末端付近に相当長い（第1E
図の第二構築物と比較して）一本鎖部分を含み、この部
分は今や標的結合領域の５′末端（TBR−１）を含む。
ヌクレオチド鎖の両末端での比較的短い二重鎖領域の解
離により、今や第1H図に示すものと類似した伸長化のた
めに相当に長い５′末端が作られるだろう。さらに、標
識ポリヌクレオチドＬは第3B図に示す固定化試薬複合体
中の標的結合領域TBRの中央により近接して存在するだ
ろう（第1G図と比較されたい）。
第3C図は第1E図に示すものと類似した核酸構築物を示
すが、標的結合領域TBRの中央付近の標識ポリヌクレオ
チド結合領域LBRに相補的な対合セグメントPSを含む。
この変化は第二構築物の５′一本鎖領域（IBR−３を含
む）の大きさを増大させ、且つセグメントLBRとヘアピ
ン16の間のループ状部分（IBR−４を含む）を減少させ
る。第3D図はこの核酸構築物から作製しうる試薬複合体
を示す。
第3E図は第1E図に示すものと類似した核酸構築物を示
すが、標的結合領域TBRの３′末端のセグメントLBRに相
補的な対合セグメントPSを含む。今や、初期結合領域IB
Rのすべては標識結合領域LBRよりも５′末端に接近して
いる。それ故にヘアピン16は二重鎖PS/LBRに連結するル
ープの大部分を形成する。ひとたび標識が３′末端に結
合されて５′末端が固定化されると（その後ヘアピンEc
oR I制限部位が切断される）、標識ポリヌクレオチドＬ
が固相（プローブポリヌクレオチドの５′末端が結合さ
れる）に対してプローブポリヌクレオチドＰの遠位末端
とハイブリダイズした試薬複合体が作られるだろう。
再び第1D図および第1E図を参照すると、異なる長さの
介在配列を特にセグメント12とセグメントLBRの間に用
意することもできる。前駆体核酸の一部としてまたは挿
入物中のLBRおよびIBRと一緒にそこに挿入された追加の
ヌクレオチドは、外側５′末端とセグメントLBRの間の
第1F図に示す間隔を伸長させるだろう。このような伸長
は（第3A、3Cおよび3E図の構築物と同様に）、IBRを分
割することなくまたはLBRよりも５′末端に接近してIBR
を配置することなく、５′末端結合（例えば、第1G図に
示すような支持体への結合）の間隔を増すことができる
だろう。
RNAから形成される構築物も例えばメルトン（D.A.Mel
ton）らのNucleic Acids Res.,vol.12、p.7035〜7056
（1984）に記載のSP6ベクターを用いて作られる。これ
らのベクター（プロメガ・バイオテク社から市販されて
いる）はpUC12から誘導され、SP6転写プロモーターおよ
びそのプロモーターの隣のポリリンカーを含む。TBRお
よびPSと類似したセグメントを有する対象のフラグメン
トは、互いに対して逆方向でポリリンカー領域内の異な
る部位にクローン化されるだろう。セグメント16の代わ
りに、特異な短いセグメントがTBRとPSの挿入物間に存
在し、この種のセグメントはポリリンカー中の追加のヌ
クレオチドによつて与えられるか、またはTBRとPSの間
の第三の挿入物によつて与えられる。さらに、どの挿入
物にも存在しない制限酸素部位が、SP6プロモーターか
ら最も遠い挿入領域の末端に存在する。
使用に際してはそのプラスミドDNAを作製し、挿入領
域の末端を制限酵素で消化してプラスミドを線状化す
る。全長RNAは精製されたSP6ポリメラーゼを使用するこ
とによりその線状プラスミドから転写される。DNAはDNa
se（RNase不含）消化により除き、RNAをフエノール／ク
ロロホルム抽出およびエタノール沈殿またはセフアデツ
クスカラムクロマトグラフイーにより精製する。最適条
件下において、反応混合物50μ中のプラスミド１μｇ
からRNAが10μｇまでの量で得られる。
この反応の生成物はPSとTBRのLBR領域とが分子内ハイ
ブリダイズした二重鎖領域を有するRNA分子であるだろ
う。TBRとPSは一本鎖RNAセグメントによつて連結され
る。この連結用セグメントに相補的なDNAオリゴマー
（一般には６ヌクレオチド長またはそれ以上である）は
転写後に得られる。このDNAオリゴマーとハイブリダイ
ズされ且つDNA/RNAハイブリツドをRNase H〔ドニス−ケ
ラー（H.Donis−Keller）のNucleic Acids Res.,vol.
7、p.179〜192（1g79）を参照〕で特異的に消化するこ
とにより、TBRとPSを連結するループの特異的切断が達
成されるだろう。
実際には、RNA構築物の作製はDNA同等物の場合の第1A
〜1E図と類似した諸工程を含むが、DNA同等物のBamH I
消化によつて定められたセグメントはSP6プロモーター
と挿入領域に遠位の制限酵素切断部位（例えばSP64構築
物を使用するときにはEcoR I部位;SP65構築物を使用す
るときにはHind III部位）との間の領域の転写によつて
定められる。RNA/RNAハイブリツドセグメントの形成はD
NAオリゴマー/RNAハイブリツド（セグメント16に類似）
の形成と同時に行われるだろう。標識はこのようなハイ
ブリツドの形成および／またはRNaes Hによる切断の前
または後に付けられる。固相への結合および／または標
識化はブラウンらのU.S.S.N.729700に記載の技法を用い
て行われる。
実施例１−アルブミン遺伝子用の標的結合領域および対
合セグメントを含む核酸分子の作製 本実施例は500塩基のヒトアルブミン遺伝子のための
標的結合領域を含む二本鎖形（すなわちその相補鎖を含
む）の複製可能な連続核酸分子の製法について述べる。
出発物質はM13複製開始点を含む大腸菌プラスミドであ
つて、pMLC12およびpMLC13と呼ばれた。これらの２つの
プラスミドはプラスミドpSDL12およびpSDL13の部分的Hi
nd III消化、次にクレノウ（Klenow）末端修復を行うこ
とにより作られた。レビンソン（A.Levinson）らのJ.Mo
l.＆ Appl.Gen.,vol.2、p.507〜517（1984）の第５図お
よび添附の説明を参照されたい。
Ａ） pMLC12/13△M7（Mp7ポリリンカーを有するM13ori
プラスミド）の作製 pMLC12およびpMLC13はEcoR Iで完全消化した。pMLC12
由来の大きいフラグメント（フラグメントＡ）とpMLC13
由来の小さいフラグメント（フラグメントＢ）とを組合
せて連結させ、そしてMC1061（F-;hsdR,△ara−leu769
7、araD139、△lac×74、galU、galK、rpsL、（st
rr）；カサダバンY.コーエン、J.Mol.Biol.,vol138、p.
179〜207を参照）を形質転換した。クロラムフエニコー
ル耐性コロニーを採取し、もとのpMLC12およびpMLC13の
両プラスミドに存在するBamH I切断部位の欠損に基づい
て正しいプラスミド（pMLC12/13△）を同定した。
pMLC12/13△は制限量のEcoR Iを用いて部分消化し、
それにより２つのEcoR I部位のうち一方のみを大部分の
分子において消化した。部分消化された線状pMLC12/13
△をゲル電気泳動により単離した。Mp7DNAはPvu IIで消
化し、383bpフラグメントをゲル電気泳動により単離し
た。このPvu IIフラグメントをEcoR Iで消化して、Mp7
ポリリンカーを含む52bp EcoR Iフラグメントおよび２
つの他のPvu II/EcoR Iフラグメント（約123bpおよび約
208bp）を得た。Mp7由来のEcoR I消化Pvu IIフラグメン
トと部分EcoR I消化線状pMLC12/13△とを連結させ、MC1
061を形質転換させ、そしてクロラムフエニコール耐性
細胞を選別した。その後個々のコロニーを増殖させてDN
Aを生産させた。Mp7由来のEcoR Iポリリンカーを正しく
組込んだプラスミドは、BamH I部位の獲得により同定し
た。この正しいプラスミドはpMLC12/13△M7と命名さ
れ、第4A図に示される。
Ｂ） pMLC12中のアルブミン逆方向反復配列の作製 pMLC12をHinc IIで完全消化した。ヒトアルブミンcDN
Aクローンの一部を含むプラスミドpAlb B6（ローンら、
1980を参照）はPvu IIとHinc IIで完全消化した。クロ
ーン化しようとするフラグメントは915bpのPvu II/Hinc
IIフラグメントである。pMLC12/Hinc IIベクターとpAl
bB6/Pvu II＋Hinc IIとを一緒に連結させ、そしてMC106
1を形質転換した。アルブミンフラグメントを正しく組
込んだクローンは、ハイブリダイゼーシヨン用プローブ
としてalb32mer（５′ACATCCTTTGCCTCAGCATAGTTTTTGC−
AAAC3′）を用いるコロニーハイブリダイゼーシヨン
（グルンスタインおよびホグネス、1976を参照）により
同定した。陽性コロニーを採取して増殖させ、個々のコ
ロニーからのDNAをHind III＋Pst Iで消化して挿入物の
方向性を調べた。ベクター中にアルブミンフラグメント
挿入物を逆方向で含む２種類のプラスミド（F31aおよび
F31c）をその後の工程のために選別した。プラスミドF3
1aおよびF31cを第4B図に示す。
F31aはEcoR I＋BamH Iで完全消化して、２つの大きい
フラグメントを単離した。F31cはEcoR I＋Bgl IIで完全
消化して、小さい（約550bp）フラグメント（EcoR IとB
gl II部位の間）をゲル単離した。F31aおよびF31cから
ゲル単離したそれぞれのフラグメントを一緒に連結させ
DH1（ATCC＃33849）recA-バクテリアを形質転換した。
（注:recA-宿主はrecA媒介機構により逆方向反復配列の
一方または両方のコピーの欠損の可能性を減少させるた
めにこの時点で用いられた。その後の実験はこれらの逆
方向反復クローンがrecA-突然変異の不在下でさえ安定
であることを示した。）次いで、個々のクロラムフエニ
コール耐性コロニーからDNAを単離し、別々にPst I、Ec
oR I＋Hind III、またはBgl II＋BamH Iで消化して正し
い構造をもつクローンを同定した。１つのこのようなク
ローンF41a（第4B図に示す）をその後の分析のために使
用した。
F41aはEcoR IおよびHind IIIで消化して、DNAポリメ
ラーゼＩのクレノウ断片で平滑末端とした。約1500bpフ
ラグメントをゲル電気泳動により単離した。pMLC12/13
△M7はAcc Iで完全消化して、DNAポリメラーゼＩのクレ
ノウ断片で平滑末端とした。pMLC12/13△M7/Acc I＋ク
レノウ断片とF41aからのゲル単離フラグメントとをDNA
リガーゼによつて連結し、MC1061を形質転換した。ゲル
単離フラグメントを組込んだプラスミドはアルブミン32
merを用いるハイブリダイゼーシヨンにより単離し、そ
してPst I、BamH IまたはXba I消化により同定した。pM
LC12/13△M7IVRと命名されたこのプラスミドを第4C図に
示す。
次の工程のために、プラスミドMpTLポリを使用した。
このプラスミドは次式： で表わされる低級オリゴヌクレオチド鎖をリン酸化する
ことによつて前もつて製造された。
連結の後、形成されたStu I部位ゆえに認識されうる
中間部分： をもつダイマーを単離した。このダイマーはDNAポリメ
ラーゼＩのクレノウ断片で修復して次式： （ここで下線を施した塩基がクレノウにより修復された
ものである） で表わされる末端部分を形成させる。この二重鎖は今ま
Mp8/Hinc IIにクローン化され、そしてStu I部位の獲得
に基づいてクローンを採取した。確認のために塩基配列
を決定した後に得られたプラスミドはMpTLポリであつ
た。
pMLC12/13△M7IVRはXba I（このプラスミド内を４回
切断する）で部分消化し、上記のように平滑末端とし、
全長鎖状プラスミドDNAをゲル電気泳動により単離し
た。プラスミドMpTLポリはBamH I＋Hind IIIで完全消化
し、上記のように平滑末端とした。80bp平滑末端フラグ
メントをゲル電気泳動により単離し、そしてゲル単離し
た、線状の、Xba I部分消化、平滑末端化pMLC12/13△M7
IVRと連結させた。このDNAでMC1061を形質転換し、TLポ
リリンカーに相補的なオリゴヌクレオチドによりスクリ
ーニングした。陽性コロニーを採取し、正しいXba I部
位にTLポリリンカーを組込んだプラスミドをStu I＋Bgl
II消化により同定した。pMLC12/13△7IVRTLと命名され
たこのプラスミドは第4D図に示され、第1C図と類似して
いる。
２つの他の作製が上記の第4D図に示すものについて実
施されたが、但しTLポリリンカープラスミドは次のフラ
グメント： ａ） ２つのHae III部位（一本鎖DNAにおいて消化され
るだろう；アルブミンcDNAはHae III部位をもたない）
を含むヒトエリトロポエチンcDNA（ジヤコブらのNatur
e,1985を参照）由来のHinc II/Stu Iフラグメント； ｂ） Xho I、EcoR I、Xba IおよびCla I部位を有する
ポリリンカーを含むF62b（以下の第5A図の説明を参照）
由来のBgl II/平滑化フラグメント； によつて取つて代わられるであろう。
その後これらの３種のクローンは信号鎖をプローブ鎖
から分離するための選択的消化の可能性を提供する。
ｃ） 一本鎖DNAの製造 プラスミドpMLC12/13△M7IVRTL（第4D図参照）で菌株
XS127（argECam）、thi−１、△lacpro XIII/F′lacpro
AB、traD36、lacIq、lacZ△M1S/p3）、またはM13oriプ
ラスミドから一本鎖DNAを作るために使用されるJM101
（ATCC＃33876）を形質転換した。一晩の培養物（約３
×109細胞）は５×1010野生型M13フアージと混合し、SO
BM培地中100mlに希釈し、37℃で５時間増殖させた。一
本鎖DNAは標準方法を使つて培養上清から得た。第4E図
はその相補鎖からこの核酸分子中に形成される一方鎖お
よび二本鎖DNAの領域を模式的に示す。
このDNAをBamH I、Pst I、Xba I、およびEcoR Iを単
独であるいはいろいろな組合せで用いて消化すると、予
測されたフラグメントが得られた。
実施例２−複製可能な核酸分子からの試薬複合体の製造 pMLC12/13△M7IVRTLからの一本鎖DNA（第4E図参照）
をBamH Iで消化し、その結果生じた３′BamH I末端をα
32P−dATPおよび冷dCTP、dGTP、dTTPで修復した。この
反応混合物はDNAポリメラーゼＩのクレノウ断片を熱に
より不活性化するために68℃で10分間インキユベート
し、そしてEcoR Iで完全消化した。得られたDNAは0.12M
リン酸緩衝液（pH6.8）中のヒドロキシアパタイト（HA
P）カラムでクロマトグラフイーを２回行い、ベクター
の主要部分から部分的に二本鎖の標識分子を単離した。
0.12Mリン酸緩衝液中のHAPカラムに結合させて洗浄した
後、その標識構築物は0.3Mリン酸緩衝液を用いてHAPカ
ラムから溶離し、そして濃縮した。
実施例 3. 実施例２の単離した試薬複合体（約12ng）は次に10μ
容量の20mMトリスpH8、1M NaCl、10mM EDTA中単独で
あるいはM13クローンG7cおよびG7e（G7cは逆方向でベク
ターMp8のSma I部位にクローン化されたアルブミンHinc
III/Pvu II915塩基対フラグメントを含み、またG7eは
このDNAを含まない）に由来する一本鎖DNA約300ngと共
に65℃で60分間インキユベートした。標識鎖は競合鎖の
存在下（G7c）で試薬複合体から完全に置換され、そし
て競合鎖の不在下（G7e;DNA不含）で置換されなかつた
（ゲル電気泳動とオートラジオグラフイーで測定）。
実施例 4. 核酸前駆体の作製 次式： で表わされる二本鎖IVポリリンカーを化学合成によつて
製造し、両方の向き（ａおよびｂ）で修飾pUCプラスミ
ド内に挿入した。このプラスミドpUCはビエラ（Viera）
およびメツシング（Messing）のGene,Vol.19,p.259〜26
8（1982）に記載されている。pUCプラスミドはいくつか
の方法で修飾され、そのうちの１つだけ（すなわち、IV
ポリリンカーがその後に付加される部位以外のプラスミ
ドの部位へのSfi Iリンカーの付加）が本実施例に関係
がある。Sfi I部位がGgl II部位に最も接近する向き
（Ａ）のものはSfi IおよびKpn Iで消化し、小さいフラ
グメントを単離した。Sfi I部位がKpn I部位に最も接近
する向き（Ｂ）のものはSfi IおよびKpn Iで消化し、大
きいフラグメントを単離した。これらのゲル単離フラグ
メントを連結させて、MC1061を形質転換した。所望のク
ローン（中央にKpn I部位を有する逆方向のポリリンカ
ーの２つのコピーを含む）はBal II消化、α32P−dATP
およびDNAポリメラーゼＩのクレノウ断片を用いる末端
標識化およびKpn I消化の前後におけるゲル電気泳動に
より同定した。得られたプラスミドはF58aと命名され
た。
F58aはBgl IIで完全消化した。プラスミドpMLC12はBa
mH Iで消化し、ウシ腸アルカリ性ホスフアターゼで処理
して５′ホスフエート基を除いた。２つのDNAを連結さ
せ、MC1061を形質転換してクロラムフエニコール耐性コ
ロニーを選別した。IVポリリンカーを含むBgl IIフラグ
メントを正しく挿入したプラスミドはCla I、Xho Iおよ
びKpn Iのこのプラスミドを線状化する能力により同定
した。正しいクローンはF62bと命名した（第5A図参
照）。
F62bはSac IおよびHind IIIで消化し、DNAポリメラー
ゼＩのクレノウ断片を用いて平滑末端とした。小さい89
bpフラグメントをゲル電気泳動後に単離した。ベクター
pMLC12/13△M7（実施例１、パートＡおよび第4A図を参
照）および89bpフラグメントを連結させ、MC1061を形質
転換し、クロラムフエニコール耐性コロニーを増殖させ
てDNAを得た。89bpフラグメントを含むコロニーはXho I
またはKpn I消化（このプラスミドを線状化するであろ
う）により同定し、挿入物の方向はPst I＋Sac I消化に
よつて調べた。pUDV−ＡおよびpUDV−Ｂ（第5B図参照）
と命名したプラスミドの２つの方向は次のようにして決
定した：方向Ａは２つの253bp Sac I/Pst Iフラグメン
トを生じ、それ故にPst I部位がCAT遺伝子の５′末端に
最も接近していた。方向Ｂは183bpと323bpのSac I/Pst
Iフラグメトを生じ、それ故にPst I部位がCAT遺伝子の
５′末端から最も離れていた。pUDVの両方向の挿入物の
ヌクレオチド配列は、方向Ｂおよび方向Ａについて、そ
れぞれ第1B図および第2B図に示される。
実施例 5. ５′末端連結が固体支持体に対して行われる場合、標
的配列は実施例４で作製したpUDV−Ａの平滑Pst I部位
にクローン化される。クローン化されたフラグメントは
信号鎖に対する相補鎖（LBR）を含む標的結合領域（TB
R）をもつべきである。第一クローニング工程の向きはP
vu IIまたはSac II（ベクターを切断する）および挿入
物DNAを消化する酵素を用いて容易に決定できる。その
後ミニプレプDNA（mini prep DNA）を調製してSma Iで
消化した。これは信号鎖フラグメントをクローン化する
ための平滑末端部位を提供した。信号鎖フラグメントの
向きも同様に決定でき、標的鎖の向きと反対であるもの
が選ばれた。
５′末端連結が信号に対して行われる場合には、同じ
部位へのクローニングが同じフラグメントに対して使用
されるが、ベクターpUDV−Ｂを使用する。
実施例 6. 実施例５で製造したものと類似のベクター（IVポリリ
ンカーをTLポリリンカーと取りかえる）が作られ、その
TLポリリカーの構造はプラスミドMpTLポリ（各末端付近
にEcoR I部位を有し、ポリリンカーの中央にStu I部位
を有する）に関連させて先に述べた通りである。このポ
リリンカーは第1A図および第1B図のセグメント16/16′
に役立つだろう。
実施例 7. プラスミドpUDV−Ａ（実施例４および第2B図参照）を
酵素Pvu IIで消化し、クローン化ポリリンカー配列を含
む399ntフラグメントをゲル単離した（フラグメント
Ａ）。Pvu IIはポリリンカーの外側の、しかし第2B図に
示すlac領域部位内の２つの部位で切断する。ジエフリ
ー・ビエラ（Jeffrey Viera）博士から入手したベクタ
ーpUC118はベクターpUC18（ニユー・イングランド・バ
イオラブス社から市販されている）と類似しているが、
pUC18のNde I部位に挿入されたM13ori配列〔標準M13地
図のヌクレオチド5465（Hgi A1部位）−5941（Aha I部
位）〕を含む。このベクターpUC118をPvu IIで消化し、
プラスミドの複製開始点、アンピシリン耐性遺伝子およ
びM13複製開始点を含む2840ntフラグメントを単離した
（フラグメントＢ）。フラグメントＡとＢを連結させ、
感応バクテリアを形質転換した。重感染が（時計回りの
５′→３′方向で）amp（Bgl I部位を含む）、ColE1 or
i、Pvu II、mp7、Sma I、ヘアピン、Xba I、Hinc II、P
st I、mp7、Pvu II、Bgl I、M13IGを含む鋳型を生ずる
方向で単一挿入物をもつプラスミドを含むコロニーは、
制限マツピングおよびDNA鎖特異的オリゴヌクレオチド
（５′−CGTTGTAAAACGACGGCC−３′）によるハイブリダ
イゼーシヨンにより同定した。得られたプラスミドはp6
1Aと命名され、第1B図に示すような配列を含む鋳型を生
産する。
ラムダフラグメントのクローニング バクテリオフアージラムダゲノムの関連領域の地図は
サンガーらのJ.Mol.Biol.,162:301〜302（1982）に示さ
れている。次の位置にある次の型の制限部位は興味があ
る。 部位 位置 Pst I 16236 Hae III 16322 Xmn I 16914 Kpn I 17058 Hinc II 17077 Hae III 17294 Pst I 17395 この領域を含むラムダのPst IフラグメントはPst Iで
消化してゲル電気泳動を行うことにより単離した。1623
6位から16322位までの86nt Pst I−Hae IIIフラグメン
ト（Ａフラグメント）は、ラムダの単離したPst Iフラ
グメントをHae IIIで消化し、86ntフラグメントを単離
し、Pst I末端をDNAポリメラーゼＩのクレノウ断片で平
滑末端とすることによりサブクローニングした。このフ
ラグメントはその後バクテリオフアージmp7のHinc II部
位にクローニングし、正しいクローン（mp7ラムダＡ）
を特異的オリゴヌクレオチドによるハイブリダイゼーシ
ヨンおよびDNA塩基配列解析によつて同定した。同様
に、16914位から17077位までの163nt Xmn I−Hinc IIフ
ラグメント（Ｄフラグメント）は、ラムダPst Iフラグ
メントをXmn IおよびHinc IIで消化し、生じた163ntフ
ラグメントをゲル単離することによつてサブクローニン
グした。その後、このフラグメントはmp7のHinc II部位
にクローニングし、それによりmp7ラムダＤを得た。
p61Aへのクローニング クローンmp7ラムダＡ（またはmp7ラムダＤ）はBamH I
で消化し、挿入物フラグメントをDNAポリメラーゼＩの
クレノウ断片で平滑化した。次に、このフラグメントを
p61AのSma I部位にクローニングし、意図する方向のも
のはDNA鎖特異的オリゴヌクレオチド＃1091（Ａ用;5′
−CCGTTATCCACGATGGCCTC−３′）または＃1090（Ｄ用;
5′−CATCGCCCGGTACATGGCG−３′）を用いるハイブリダ
イゼーシヨンにより選別し、それによりクローンpA6お
よびpD10をそれぞれ得た。その後、全ラムダPst Iフラ
グメントをpA6またはpD10のPst I部位に挿入し、Kpn I
消化によつて方向を決めた。意図する方向でラムダPst
Iフラグメントを含むクローンの地図は、これらのプラ
スミドの一本鎖形の予期される鋳型の折まげパターンの
図と共に、第3E図（pA6ラムダ2c）および第3C図（pD10
ラムダ1a）として示される構造と類似した構造を示すで
あろう（但し、５′および３′末端がそれぞれ３′およ
び５′末端になる）。
提案された使用方法 クローンpA6ラムダ2cおよびpD10ラムダ1a（それぞれ8
6ntおよび163ntの対合セグメントを含み、また1159ntの
標的結合領域を含む）は大腸菌内で増殖させ、M13を重
感染させ、収穫したDNAをBamH Iで消化した（それぞれ
第3Eおよび3C図と類似する構築物を生じた）。このよう
な構築物の５′末端は以下の実施例11および12の方法を
用いてビオチン成分を含むオリゴヌクレオチドで標識し
た。このような構築物の３′末端は酵素ターミナル・デ
オキシヌクレオチジル・トランスフエラーゼ（TdT）の
作用により、ヌクレオシド三リン酸dCTPで鎖伸長させて
固定化しうるオリゴ−dC尾部を形成させた。この複合体
は今やヘアピン配列を開裂させるために制限エンドヌク
レアーゼEcoR Iで切断することができる。ドアテイー
（Dougherty）らのU.S.S.N.809971（1985年12月16日
付）に記載されるように、ラムダ配列Ａ（16236〜1632
2）またはラムダ配列Ｄ（16914〜17077）の全部または
一部に相補的な配列を有する固定化可能なもしくは固定
化された核酸鎖による捕獲を含めた検定法において、
３′末端のこのような修飾およびヘアピンの切断は任意
である。さらに、遊離末端を必要としないビオチニル化
または他の標識技術を使用する場合には、BamH I切断以
前の収穫DNAが置換および置換された対合セグメントの
捕獲を含む検定法において使用される。
実施例 8. 実施例７に記載のクローニングベクターp61Aが本実施
例でも使用された。エリトロポエチン（EPO）のcDNA配
列に由来する配列は標的結合領域、対合セグメントおよ
び被分析体用に本実施例で使用された。クローンpG61aE
PO3 IIIの関連cDNA領域はジヤコブ（Jacobs）らのNatur
e,Vol.313,p.806〜810（1985）によつて示される地図を
有し、次の制限部位を含む： 部位 位置 EcoR I １（イニシエーターメチオニンコドンか ら６塩基上流に挿入） Kpn I 133 Pst I 188;363 Hinc II 335 Pvu II 365 175塩基対のPst Iフラグメント（188〜363）をp61Aプ
ラスミドDNAのPst I部位にクローン化した。この挿入物
を含むクローンはキナーゼ処理したオリゴヌクレオチド
プローブへのハイブリダイゼーシヨンにより同定した。
一本鎖プラスミドDNAはM13へルパーフアージを重感染さ
せた後に陽性コロニーから得られた。ベクター中のPst
Iフラグメントの方向は、この一本鎖DNAをニトロセルロ
ースフイルターに固定し、それをキナーゼ処理した逆方
向のオリゴヌクレオチドプローブとハイブリダイズさせ
ることにより決定した。プラスミドp61A−EPO3はHinc I
I部位が挿入物の３′末端に最も接近する向きでPst Iフ
ラグメントを含む。
二本鎖プラスミドDNAはp61A−EPO3から単離してSma I
で消化した。ヒトEPO cDNAクローンからの365塩基対のE
coR I−Pvu IIフラグメント（１〜365）はゲル精製し
て、EcoR I部位をDNAポリメラーゼＩのクレノウ断片で
修復した。その後、このフラグメントをp61A−EPO3のSm
a I部位に連結させ、挿入物を含むプラスミドはコロニ
ーを第二挿入物に特異的なキナーゼ処理オリゴヌクレオ
チドプローブでスクリーニングすることにより同定し
た。第二挿入物の向きは得られた二本鎖プラスミドDNA
のKpn I消化を分析することにより決定した。標的結合
領域および対合セグメントを逆方向で含むプラスミドは
166塩基対のKpnフラグメントを含み、一方直線方向でそ
れらを含むプラスミドは264塩基対のKpnフラグメントを
含む。p61A−EPO3−IIは信号鎖と反対方向の標的鎖を含
むものとして同定され、置換複合体の製造のために単離
された。
一本鎖p61A−EPO3−II DNAは実施例１に記載のように
して作製したが、但し一晩の培養物はM13フアージ誘導
体のMK107（実施例９参照）を重感染させ、50μg/mlア
ンピシリンを含む最少培地中100mlに希釈し、その後37
℃で一晩増殖させた。そのDNAはBamH Iで消化し、３′
末端（175nt対合セグメントに近接）を32P−dATPでDNA
ポリメラーゼＩのクレノウ断片により標識した。次い
で、このDNAは第1F図から類推して最終の置換複合体を
作るために、EcoR Iで消化した。
上記の370塩基対のEcoR I−Pvu IIフラグメントもま
た、Acc I部位とEcoR I部位の両方をクレノウで修復し
た後に、M13フアージベクターmp7のAcc I部位にクロー
ン化した。EPO挿入物を含むフアージ、およびそれらの
挿入物の方向はキナーゼ処理したオリゴヌクレオチドプ
ローブを用いるハイブリダイゼーシヨンにより同定し
た。一本鎖鋳型DNAは各方向の陽性フアージから調製
し、BamH Iで消化した。370ヌクレオチド挿入物はゲル
精製して、モデル被分析体として使用した。
３つの置換反応はこの複合体および被分析体不含、誤
つた方向の過剰の被分析体または正しい方向の過剰の被
分析体のいずれかを用いて実施された。被分析体の不在
下または誤つた方向の被分析体の存在下では置換反応が
観察されなかつた。置換は正しい方向の被分析体の存在
下で観察されたが、複合体のEcoR Iによる不完全消化の
ためにこの反応は完全に進行しなかつた。すなわち、こ
のような複合体は被分析体と結合するが、置換反応後に
信号鎖をプローブ鎖から放出させなかつた。
実施例 ９〜13. 本実施例およびその後に続く実施例はドアテイー（Do
ugherty）らのU.S.S.N.809971（1985年12月16日付）に
記載の捕獲方法を示すものであり、上記出願明細書の実
施例２〜10のいくつかに対応する。出発クローンはpMLC
12/13△M7IVRTLであり、その製造は実施例１に記載した
通りであり、またその構造は第4D図（二本鎖形）および
第4E図（一本鎖形）に示される。
構築物p66bは出発クローンから対象の配列を含む二本
鎖Pvu IIフラグメントをゲル単離し、それをM13oriプラ
スミドpUC119（市販のプラスミドpUC19に類似するが、p
UC118と同じM13ori配列を含み、ジエフリー・ビエラ博
士から入手した）のゲル単離Pvu II主鎖と連結させるこ
とにより作製した。一本鎖形は実施例１のようにして得
たが、このDNAでミカエル・ボルカート（Michael Volke
rt）博士から入手した大腸菌宿主菌株MV1193（JM101 de
l（srlR−recA）306::Tn10）を形質転換させた。重感染
はバクテリオフアージM13KO7を用いた。異なるpUC主
鎖、異なる大腸菌宿主菌株および異なる重感染用M13フ
アージの使用はBamH I消化後に増大した収率の同一構築
物をもたらした。
実施例12および13で使用する逆試薬複合体は、p66bの
５′末端をP32で標識することにより得られた。
p66dはp66bのようにして作製されたが、Pvu IIフラグ
メントを逆方向でpUC119ベクターに挿入した。重感染後
に得られたp66dの一本鎖形はp66b鎖の相補体である置換
複合体を含む。従つて、IVRTLヘアピンの開裂前に、p66
bから作られた置換複合体は５′末端に信号鎖を、そし
て３′末端に標的結合領域を含む。
II.モデル被分析体：モデル被分析体はヒトアルブミン
の全cDNAを含むプラスミドpA11Albからの2Kb Hind III
−EcoR Iフラグメントをゲル精製することにより作られ
た。このHind III部位はアルブミンcDNAの３′末端鋳の
Hind III部位である。EcoR I部位は隣接するベクター配
列中に存在する。Hind III−EcoR Iフラグメント上に存
在するベクター配列は以下の実施例には無関係である。
Hind III−EcoR IフラグメントはHind III−EcoR I消化
M13mp8およびM13mp11内に連結させて、それぞれmp8.A11
Albおよびmp11.A11Albを得た。一本鎖DNAはこれらの構
築物を含むフアージから精製され、Hae IIIで部分消化
してこれらのモデル被分析体を線状化した。アルブミン
cDNA配列内にはHae III部位が存在しない。mp8.A11Alb
鋳型DNAはp66b置換複合体の標的結合領域に相補的であ
り、そしてmp11.A11Alb（U.S.S.N.809971の第４図参
照）鋳型DNAはp66d置換複合体のTBRに相補的である。
III.モデル捕獲体：数種のモデル捕獲体は核酸構築物を
捕獲するのに最良の幾何学的形体を与えるように作られ
た。
c1. mp18.AlbTaqPstおよびmp19.AlbTaqPstはヒトアル
ブミンcDNAクローンから350bp Bgl II−Pst Iフラグメ
ントをゲル精製し、それをTag Iで消化し、得られた280
bpフラグメントをAcc I−Pst I mp18およびmp19ベクタ
ー内に連結させることにより作製した。mp19.AlbTaqPst
はp66bの標識鎖の対合セグメント（PS′）に相補的であ
る。mp18.AlbTaqPstはp66d中の対合セグメントに相補的
である。
c2. mp8.AlbBHはアルブミンcDNA由来の500bp Bgl II−
Hinc IIフラグメントをmp8のSma I部位内に連結するこ
とにより作製した。mp8.AlbBH中の挿入物は上記のp66b
置換複合体中の対合セグメントと同じ長さであり且つそ
れに相補的である。
c3. mp7デルタ.AlbXba構築物１＋、２＋、３−および
４−はmp19.AlbTaqPst Rf DNAをXba Iで消化し、末端修
復し、生じた300bpフラグメントをゲル精製し、それをm
p7の6800bpのゲル精製したPvu IIベクター主鎖フラグメ
ントに連結させることによつて作製した。p66b置換複合
体の標識ポリヌクレオチドに相補的な一本鎖アルブミン
DNAを含む２種のフアージ単離物は標識された１＋およ
び２＋であり、一方p66bのプローブポリヌクレオチド鎖
に相補的なアルブミン鎖を含む２種のフアージ単離物は
標識された３−および４−である。構築物１＋および２
＋は、lac遺伝子の一部とポリリンカークローニング配
列の全部がmp7デルタ主鎖から欠失されるという点で、
またアルブミン挿入物が信号鎖の比較的内側の部分に相
補的であるという点でmp19.AlbTaqPstと異なつている
（U.S.S.N.809971の第４図参照）。
c4. ベクター・ラボラトリーズのフォトプローブビオ
チン（商品名;Photoprobe Biotin）を使用することによ
るmp7デルタAlbXba1＋およびmp7デルタAlbXba3−DNAの
ビオチニル化。
捕獲鎖mp7デルタAlbXba1＋またはmp7デルタAlbXba3−
は市販のフオトプローブビオチン（ベクター・ラボラト
リーズ）を用いて、本質的に製造者によつて提案された
方法によりビオチニル化した。
フオトプローブビオチン（500μｇ）を製造者が推せ
んするように500μの水に再懸濁し、−20℃で暗所に
保存した。クローンmp7デルタAlbTaqXba1＋またはmp7デ
ルタAlbXba3−からの鋳型DNA10μｇをエタノール沈殿さ
せ、10μのH2Oに再懸濁した。このDNAを安全光のもと
で10μのフオトプローブビオチン溶液と混合し、ガラ
ス製の微小毛細管ピペツト中にシールし、そして別々の
反応において20分または30分太陽灯（GE赤外線ランプ2J
OR40/1）によつて照射した。全照射法の間中、試料は氷
−H2O浴中に置いた。照射後、試料は毛細管から取り出
し、0.1Mトリス−HCl（pH8.0）10μで希釈し、２−ブ
タノールで２回抽出し、1/10容量の3M酢酸Naおよび２容
量のエタノールの添加後に沈殿させた。沈殿した試料は
0.1mM EDTA（pH8.0）10μ中に再懸濁した。
上首尾の反応はビオチニル化DNAのアリコートを採取
して、捕獲鎖の32塩基セグメントに相補的な32P標識オ
リゴヌクレオチド（cALB 32−mer）とハイブリダイズさ
せることにより監視した。その後、試料の半分（対照）
をアガロースゲル上で直接電気泳動にかけた。残りの半
分は0.2M NaCl、20mMトリス−HCl（pH8.0）、0.1％NP−
40中でパンデツクス・ラボラトリーズから入手したスト
レプトアビジンラテツクスビーズ10μと室温にて10〜
20分混合した。結合工程後に、これらのビーズを遠心
（２分間、エツペンドルフ遠心分離機）により溶液から
取り出し、１回洗浄し、合わせた溶液相を対照試料と平
行なレーンで電気泳動にかけた。電気泳動およびオート
ラジオグラフイー後に、その結果はmp7デルタAlbXba1＋
DNAにハイブリダイズした32P標識オリゴヌクレオチド試
料のほとんど全部がストレプトアビジンラテツクスにさ
らされた試料から除かれたことを示しており、そして大
部分の鋳型DNA（捕獲鎖）が少なくとも１個のビオチン
基を結合していたことを示している。
実施例 10:キナーゼ処理したオリゴヌクレオチドの連
結によるp66b Xba I複合体の標識化は非特異的捕獲を減
少させる この実験において、p66b Xba複合体はキナーゼ処理し
たオリゴヌクレオチドをこの分子の３′末端に連結させ
ることによつて標識化した。配列５′CTAGAGGCCTCTGCA
3′をもつ15塩基オリゴヌクレオチド10pmは32P−ガンマ
ATPおよびポリヌクレオチドキナーゼを用いてその５′
末端を標識した〔マニアチスらのクローニング・マニユ
アル（コールド・スプリング・ハーバー研究所）1982を
参照されたい〕。標識オリゴヌクレオチドは反応混合物
をアミコン社からのセントリコン10過装置を用いて全
容量500μのTE中6000rpmで30分ずつ２回遠心すること
により、組込まれなかつた32P−ガンマATPから分離精製
した。キナーゼ処理したオリゴヌクレオチドおよび1pm
のXba I切断p66bゲル精製複合体をエタノールから一緒
に沈殿させ、TE14μ中に再懸濁した。４μの5Xリガ
ーゼ緩衝液（マニアチスらのマニユアル）および２μ
のDNAリガーゼを加え、この反応混合物を15℃で４時間
インキユベートした。その後、この反応混合物をTEで50
μに希釈し、42℃で10分間加熱して非連結オリゴヌク
レオチドを溶融し、その１％アガロースゲル上で電気泳
動を行つた。電気泳動後、ゲルをエチジウムブロミドで
染色し、紫外線箱を用いて観察した。約66％の複合体が
互いに連結し、こうして0.33pmの複合体のみがキナーゼ
処理したオリゴヌクレオチドへの連結のために利用され
た。標識複合体は精製後に約106cpm/pmの概算上の比活
性を有していた。
置換および捕獲反応は0.001pm（1000cpm）または0.00
5pm（5000cpm）の置換複合体を可変量の被分析体および
0.2pmの捕獲体と共に全容量20μの0.3M NaClおよび0.
1MトリスHl（pH8.0）中65℃で45分間インキユベートす
ることにより実施した。比分析体の不在下において非特
異的捕獲は0.001pmの複合体および0.02pmのmp7、mp19、
mp7デルタAlbXba3−またはmp19.AlbTaqPstを用いた反応
において全く観察されなかつた。これらの反応混合物に
0.01pmの被分析体を加えると100％の置換がおこり、そ
してmp7、mp19またはmp7デルタAlbXba3−を用いた反応
では検出可能な捕獲が生じなかつたが、mp19.AlbTaqPst
を用いた場合は90％以上の捕獲複合体が生じた。被分析
体の不在下で0.005pmの複合体を用いた反応では、検出
可能な捕獲がmp7デルタAlbXba3−の場合に全く観察され
ず、mp7、mp19およびmp19.AlbTaqPstの場合に約0.5％以
下の非特異的捕獲が観察された。mp7およびmp19よりもm
p19.AlbTaqPstの場合にわずかに多いバツクグラウンド
が観察された。0.01pmの被分析体の存在下では、mp7、m
p19またはmp7デルタAlbXba3−に１％以下の捕獲が観察
され、一方mp19.AlbTaqPstに90％以上の捕獲が観察され
た。
これらの結果は、非特異的捕獲のためのより低いバツ
クグラウンドレベルがキナーゼ処理したオリゴヌクレオ
チドへの連結（またはニツクを引き起こさない他の技
術）によつて標識された複合体を使用した場合に得られ
ることを示している。さらに、mp7デルタAlbXba3−によ
る非特異的捕獲の不在は、実験的に検出可能なレベルで
の非特異的捕獲が捕獲概念の固有特性でないことを示し
ている。
実施例 11:BamH I p66bおよびmp7デルタAlbXba捕獲体
による置換および捕獲 一本鎖p66b DNAをBamH Iで完全消化し、共有結合複合
体をゲル精製により単離した。配列５′GATCCGCGGCGGTA
C3′をもつ32P−キナーゼ処理オリゴヌクレオチドを実
施例10に記載したようにして複合体の３′末端に連結し
た。但し、この連結反応では2.4pmの複合体および10pm
のオリゴヌクレオチドを使用した。得られた複合体の比
活性は概算上８×104cpm/pmであつた。
反応は0.01pm Hae III切断mp8.A11Alb被分析体の存在
下または不在下に、0.1pmのDNA捕獲体と共に0.01pm（10
00cpm）または0.03pm（3000cpm）の複合体を最終容量20
μのハイブリダイゼーシヨン緩衝液（0.3M NaCl、0.1
MトリスHCl（pH8.0）および10mM EDTA）中65℃で60分間
インキユベートすることにより行つた。この反応混合物
はゲル電気泳動（１％アガロースゲル）およびオートラ
ジオグラフイーにより分析した。
被分析体の不在下では、次の捕獲体:mp7、mp19、mp7
デルタAlbXba1＋、mp7デルタAlbXba3−またはmp7デルタ
AlbXba4−のどれを用いた場合にも検出可能なバツクグ
ラウンド捕獲が観察されなかつた。複合体0.01pmを含む
反応混合物への被分析体0.01pmの添加は100％置換をも
たらし、mp7デルタAlbXba4−捕獲体の場合には捕獲が観
察されず、mp7デルタAlbXba1＋捕獲体の場合には100％
捕獲が観察された。複合体0.03pmを含む反応混合物への
被分析体0.01pmの添加は約50％の置換をもたらし、mp7
デルタAlbXba4−には捕獲が観察されず、mp7デルタAlbX
ba1＋には置換複合体の完全な捕獲が観察された。
実施例 12:共有結合および非共有結合p66d複合体によ
る置換および捕獲の比較 共有結合p66d置換複合体を作製し、実施例13に記載す
るようにEF21（スプリント（splint）を使用するキナー
ゼ処理16merの連結により５′末端を標識した。得られ
た複合体の比活性は約１×106cpm/pmであつた。
非共有結合p66d複合体は約50μｇの一本鎖鋳型DNAをB
amH IおよびEcoR Iで完全消化することにより作製し
た。完全消化は消化物のアリコートをアルカリ性ゲル上
で電気泳動した後に、ベクター主鎖、標的鎖および信号
鎖に対応する３つのバンドが等モル量ずつあらわれるこ
とにより確かめた。非共有結合p66d複合体は共有結合複
合体のところで述べたように信号鎖の５′末端をキナー
ゼ処理16merのEF21スプリント連結により標識し、得ら
れた比活性は３×106cpm/pmであつた。
表１に概説した４つの反応は全容量50μのハイブリ
ダイゼーシヨン緩衝液中で被分析体としてHae III消化m
p11.A11Alb DNAを、そして捕獲体としてビオチニル化mp
7デルタAlbXba3−を使用して65℃で60分間インキユベー
トすることにより実施した。10μの各反応混合物をゲ
ル電気泳動およびオートラジオグラフイーで分析し、残
りの40μをストレプトアビジンアガロースへの結合に
より分析した。反応混合物当たり200μ充填容量のス
トレプトアビジンアガロースを使用した。結合および洗
浄は実施例13（後記）に記載した通りであるが、但し結
合後にペレツトは室温で30分ずつ３回および65℃で60分
間１回洗浄した。最終ペレツトおよび全ての上清をカウ
ントした。各洗浄後にアガロースに結合したcpmのデー
タを表１に示す。これらの結果は置換および捕獲が共有
結合および非共有結合複合体に対してほぼ同程度に有効
であることを示している。
置換複合体および捕獲体のみを含有する２つの反応混
合物だけでなく、同一反応混合物のゲル分析は、100％
の複合体が非分析体によつて置換され、捕獲体を含むと
きには100％の捕獲が起こつたことを立証した。被分析
体の不在下では捕獲が観察されなかつた。さらに、捕獲
体および被分析体の両方にハイブリダイズした複合体
（すなわち、捕獲された共有結合複合体または第二中間
体）は、非共有結合複合体から置換された信号鎖にのみ
ハイブリダイズした捕獲体と別々に泳動するので、被分
析体（順に置換複合体の標的結合領域にハイブリダイズ
される）にハイブリダイズした捕獲体を含む捕獲中間体
（“第二中間体”）と、捕獲体と置換信号鎖のみを含む
ように分離された非共有結合複合体とを識別することが
できる。この実験において、約90％の捕獲信号は、捕獲
体DNAが被分析体や複合体よりも過剰に存在するという
事実にもかかわらず分離された形で存在し、置換反応の
前に中間構造体を形成すると思われる。
実施例 13:ストレプトアビジンアガロース上での捕捉
による大規模置換および捕獲 Bam p66b置換複合体は、21塩基スプリント（EF21）を
使用して複合体の５′末端に32P−キナーゼ処理オリゴ
ヌクレオチドを連結することにより標識して約106cpm/p
mの比活性とした。10pmのキナーゼ処理16mer（以下に星
印で示す）、10pmのスプリントおよび1pmのp66b Bam
（下縁部分）を10μの1Xリガーゼ緩衝液中22℃で15分
間一緒にインキユベートし、１μのリガーゼを加え、
この反応混合物をさらに30分間インキユベートした。３
種類の分子は以下に示す構造を形成する：＊ CGAAGCTTGGATCCGCGATCCGTCAGCTT…p66b GAACCTAGGCGC
TAGGCAGCT（スプリント） 表２に概説した４つの反応は全容量50μのハイブリ
ダイゼーシヨン緩衝液（実施例14参照）中65℃で30分間
インキユベートした。被分析体および捕獲体としてそれ
ぞれHae III切断mpA11Albおよびビオチニル化mp7デルタ
AlbXba DNAを使用した。その後各反応混合物25μをゲ
ル電気泳動により分析し、残りの25μを次のようにし
てストレプトアビジンアガロースに結合させることによ
り分析した。100μ充填容量のストレプトアビジンア
ガロースは回転させた5mlサーステツト（Sarstedt）管
中500μの結合用緩衝液で15分ずつ２回洗浄し、遠心
によりペレツト化した。25μの反応アリコートを合計
500μの結合用緩衝液に希釈し、上記のように回転さ
せながら15分間インキユベートした。この試料を遠心の
ためにエツペンドルフ管に移し、上清を取り出し、ペレ
ツトを上記のようにTEを用いて室温で15分間１回、次に
65℃で15分ずつ２回、次に室温で60分間、最後に室温で
15分間洗浄した。最終ペレツトと全ての上清をカウント
した。各洗浄後にアガロースに結合したcpmのデータを
表２に示す。これらの結果は、複合体の支持体への結合
が捕獲体および被分析体の存在、ならびに存在する被分
析体の量に依存することを示している。
同一反応混合物のゲル分析は、これらの反応に0.05％
以下の非特異的捕獲が存在することを示している。被分
析体の存在が反応３および４においてそれぞれ約80％と
20％の複合体の捕獲をもたらしたという点で、特異的捕
獲はゲル分離によつて一層効率的に分析された。
本実施例13および以下の実施例14は５′末端での標識
化、従つて対合セグメントよりもむしろ標的結合領域に
近接した末端での標識化を提供することに留意すべきで
ある。この種の形体は1985年12月16日付のコリンズ（Co
llins）らのU.S.S.N.809992の係属中の出願明細書によ
り詳しく記述されている。
実施例 14:複合体および被分析体のプレハイブリダイ
ゼーシヨン、その後の捕獲および捕捉 ２つの追加反応が実施例13に記載のBam p66b複合体を
使用して行われた。これらの反応において、0.1pmの複
合体単独（反応１）または0.1pm複合体および0.05pm Ha
e III切断mp8A11Alb被分析体（反応２）を50μのハイ
ブリダイゼーシヨン緩衝液中65℃で30分間インキユベー
トした。次に、0.16pmのビオチニル化mp7デルタAlbXba1
＋を両方の反応混合物に加え、その後分割して実施例13
のように処理した。但し、全ての洗浄は結合用緩衝液を
用いて室温で行つた。ゲル分析によれば、0.05％以下の
非特異的捕獲および約40％の特異的捕獲が観察された。
ストレプトアビジンアガロースによる分析の結果（表
３）は、捕獲および捕捉が捕獲体DNAを被分析体−依存
置換反応の後に添加しようと（実施例14）、あるいは置
換反応の間中存在させようと（実施例13）ほぼ等しい効
率で起こることを示している。
表 ３ 支持体に結合したcpm 反応 １ ２ 総計： 57860 55210 洗浄1: 10364 18538 洗浄2: 4360 14321 洗浄3: 3046 11983 洗浄4: 3035 9745 洗浄5: 1781 8897 最終： 1124 7428 結合％： 1.9 13.5 実施例 15:核酸鎖置換、捕獲およびビオチン置換 この実験では、実施例12に記載した被共有結合p66d B
amH I/EcoR I切断置換複合体を使用した。被分析体とし
てはHae III切断mp11.A11Alb DNAを使用した。１個のビ
オチンを５′末端にもつ捕獲体は、mp19.AlbTaqPstにハ
イブリダイズした５′ビオチニル化M13シークエンシン
グプライマー（ブラウンらのU.S.S.N.729700に記載の方
法に従つてビオチニル化した）のプライマー伸長化によ
り次のようにして合成した:20μｇのmp19.AlbTaqPst鋳
型および20pmのビオチニル化プライマーを100μの50m
M NaCl、10mMトリスHCl（pH8.0）、10mM MgCl2中で水浴
中にて１分間沸騰させ、次に水浴中で30分間室温へと冷
却させた。３μの5mM dGTP、dCTP、dATP、dTTPおよび
２μのクレノウ断片Pol Iを加え、この反応混合物を
室温で30分インキユベートした。クレノウ断片の１μ
の第二アリコートを加えて、さらに30分インキユベート
した。次に、このDNAをHind IIIにより37℃で２時間消
化し、mp19.AlbTaqPst中の挿入物に相補的な300塩基の
プライマー伸長化フラグメントを切断した。このDNAは
２μの5M NaOHを加えて65℃で10分間インキユベート
することにより変性した。プライマー伸長化フラグメン
トはNA45ペーパー（シユライハーおよびシユエル）を有
する１％アルカリ性アガロースゲル上での電気泳動によ
り分離精製した。DNAの収量はエチジウム染色ゲル上で
標品と捕獲体のアリコートとを比較することにより概算
した。
３つの反応は表４に示すように実施した。反応１およ
び２は50μのハイブリダイゼーシヨン緩衝液中65℃で
60分間インキユベートした（反応３はインキユベートし
なかつた）。その後５μの反応１および２をゲル分析
のために分取した。反応１および２の残部、および反応
３は約200μ充填容量のストレプトアビジンアガロー
スに実施例８のようにして結合させた。洗浄（比較的初
期の実験において捕獲されたDNAが支持体から分離する
原因となりうる）の間中に試料の攪拌を試み且つその攪
拌を最小限に抑えるために、試料はエツペンドルフ管中
のペレツトに1mlの緩衝液を加え、その管を５回逆転さ
せ、それを３分間遠心することにより洗浄した。５回の
洗浄は室温で行われ、最終洗浄は最初の５回の逆転後に
攪拌せずに65℃で30分間実施した。全ての上清および最
終ペレツトをカウントした。その結果を表４に示す。こ
れらのデータからわかるように、この穏やかな洗浄法ま
たはこの新しい比較的小さい単一ビオチニル化捕獲体の
使用は、支持体への捕獲複合体のより安定な結合を促進
するように思われる。ゲル分析から適当なバンドを切り
出してカウントすることにより、約36％の捕獲複合体は
分離して捕獲体−信号鎖ハイブリツドを形成し、一方64
％はこれらの反応条件下で被分析体−複合体−捕獲体中
間体として存在すると思われる。
捕獲された置換鎖のビオチン置換 上記の反応１〜３を使用した。各試料は上記の30分、
60℃洗浄の後の最終アビジン−アガロースペレツトであ
つた。各ペレツトに0.1％NP−40を含む1ml BB（BB＋）
を室温で加え、逆転によつて少しの間攪拌し、遠心して
相分離した（RT洗浄）。その後1ml BB＋（65℃）を加
え、この試料を65℃で５分間インキユベートした。試料
を遠心して相分離させ、1mlのBB＋を用いて室温で２回
洗浄した。合わせた上清相をプールした（65℃/5′／−
bio）。試料３のみについて−ビオチン、65℃洗浄をも
う一度繰り返した。その後、1mMビオチンを含む1mlのBB
＋を全試料に加え、これらを５分間インキユベートし、
遠心し、上記のように洗浄した（65℃/5′＋bio）。最
終ペレツトを3mlのBB＋に再懸諾し、全試料をチエレン
フ（Cherenkov）計数器でカウントした。表５は、各試
料に適用できる場合にはバツクグランド（30cpm）を減
じた後に回収されたカウント数と全カウント数の百分率
（かつこ内）を表わす。
ビオチン置換前の信号対ノイズの比は、反応１のペレ
ツト／反応２のペレツト＝48:1（11174/233）のカウン
ト比として定義される。ビオチン置換によつてもたらさ
れた改良は、反応１中のビオチンによつて放出されたカ
ウント％対反応２または３中のビオチンによつて放出さ
れたカウント％の比により測定される。こうして反応２
と比較することにより、その改良は0.84/0.54＝1.55Xで
ある。反応３について、その改良は0.84/0.06＝14Xであ
る。反応２の試料に見られた貧弱な改良は、反応２の捕
獲体が少量のM13ポリリンカー配列（被分析体の不在下
でビオチニル化捕獲体による若干の捕獲をもたらす）を
含むという事実が原因であるらしい。この捕獲は、少な
いにもかかわらず、ビオチンにより放出されたカウント
へと導くであろう。反応３の試料（複合体のみ）は実際
の置換検定において最も現われそうなバツクグラウンド
の型を表わし、それ故に予測されたバツクグラウンドの
改良を示す良い例である。

Claims (14)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】生物学的試料の核酸中の標的ヌクレオチド
    配列を決定するための試薬を製造するのに有用な核酸構
    築物であって、 （ｉ）該構築物の１つの末端部付近に位置する第１のク
    ローン化ヌクレオチド挿入物、該第１の挿入物が一本鎖
    対合断片（PS）であり、 （ii）該構築物の他の末端部付近に位置する第２のクロ
    ーン化ヌクレオチド挿入物であり、該第２の挿入物は生
    物学的試料中の標的ヌクレオチド配列と実質上相補的で
    ある標的結合領域（TBR）から成り、かつ該TBRは下記の
    及び： 前記PSに実質上相補的であり、かつリン酸／糖主鎖
    により前記PSに共有結合されている第一のヌクレオチド
    配列（LBR）、および 第二のヌクレオチド配列（IBR）、 から成る、（ａ）及び（ｂ）の２つのクローン化された
    挿入物から構成され、 ここで、前記PSと前記LBRとはハイブリダイズして二本
    鎖領域を形成し、前記IBRは前記標的ヌクレオチド配列
    に対して実質上相補的である一本鎖領域を１つ以上形成
    し、それによって前記IBRが標的ヌクレオチド配列に結
    合する、核酸構築物。
  2. 【請求項２】一方の末端は３′末端であり、他方の末端
    は５′末端である、請求項１記載の核酸構築物。
  3. 【請求項３】一方の末端は５′末端であり、他方の末端
    は３′末端であり、請求項１記載の核酸構築物。
  4. 【請求項４】リン酸／糖主鎖に沿ってTBRとPSとの間にD
    NAヘアピンループの制限酵素認識部位を含む、請求項１
    記載の核酸構築物。
  5. 【請求項５】核酸構築物がDNAである請求項１記載の核
    酸構築物。
  6. 【請求項６】PSとLBRがハイブリダイズして約15〜約100
    0塩基対の二本鎖領域を形成する、請求項１記載の核酸
    構築物。
  7. 【請求項７】PSとLBRがハイブリダイズして約20〜約500
    塩基対の二本鎖領域を形成する、請求項１記載の核酸構
    築物。
  8. 【請求項８】IBRがPSとLBRとの間に配置されている、請
    求項１記載の核酸構築物。
  9. 【請求項９】LBRがPSとIBRとの間に配置されている、請
    求項１記載の核酸構築物。
  10. 【請求項１０】LBRがIBR内に配置されている、請求項１
    記載の核酸構築物。
  11. 【請求項１１】生物学的試料の核酸中の標的ヌクレオチ
    ド配列を決定するための試薬を構造するのに有用な核酸
    構築物であって、該構築物は、 （ａ） （ｉ）該構築物の１つの末端部付近に位置する第１のク
    ローン化ヌクレオチド挿入物、該第１の挿入物が一本鎖
    対合断片（PS）であり、 （ii）該構築物の他の末端部付近に位置する第２のクロ
    ーン化ヌクレオチド挿入物であり、該第２の挿入物は生
    物学的試料中の標的ヌクレオチド配列に対して実質上相
    補的である標的結合領域（TBR）から成り、かつ該TBRが
    下記の及び： 前記PSに実質上相補的であり、かつリン酸／糖主鎖
    により前記PSに共有結合されている第一のヌクレオチド
    配列（LBR）、および 第二のヌクレオチド配列（IBR）、 から成り、 ここで、前記PSと前記LBRとはハイブリダイズして二本
    鎖領域を形成し、前記IBRは前記標的ヌクレオチド配列
    に対して実質上相補的である一本鎖領域を１つ以上形成
    し、それによって前記IBRが標的ヌクレオチド配列に結
    合するものである、（ｉ）及び（ii）の２つのクローン
    化された挿入物；及び （ｂ） リン酸／糖主鎖にそって該PSに隣接し、かつTB
    Rとは離れた位置にある検出可能な標識、 とから成る核酸構築物。
  12. 【請求項１２】生物学的試料の核酸中の標的ヌクレオチ
    ド配列を決定するための試薬を製造するのに有用な核酸
    構築物であって、該構築物は、 （ａ） 複製の開始点、 （ｂ） 下記の２つのクローン化された挿入物、 （ｉ）該構築物の１つの末端部付近に位置する第１のク
    ローン化ヌクレオチド挿入物、該第１の挿入物が一本鎖
    対合断片（PS）であり、 （ii）該構築物の他の末端部付近に位置する第２のクロ
    ーン化ヌクレオチド挿入物であり、該第２の挿入物は生
    物学的試料中の標的ヌクレオチド配列に対して実質上相
    補的である標的結合領域（TBR）であり、かつ該TBRが下
    記の： 前記PSに実質上相補的であり、かつリン酸／糖主鎖
    により前記PSに共有結合されている第一のヌクレオチド
    配列（LBR）、および 第二のヌクレオチド配列（IBR）、 から成り、 ここで、前記PSはTBRに対して逆方向に配向しており、
    そして （ｃ） １つの制限部位を形成することができる２つの
    半制限部位であって、これらの半制限部位によってその
    間にTBRとPSとを含有する一定長の核酸を規定する２つ
    の制限部位、 から成る核酸構築物。
  13. 【請求項１３】前記２つの半制限部位はハイブリダイズ
    して、１つの制限部位を形成し、この一定長の核酸は、
    その各末端が半制限部位１つに結合してループを形成
    し、かつPSはLBRに相補的塩基対合によって結合され
    る、請求項12記載の構築物。
  14. 【請求項１４】PS及びTBRの一部がそれぞれ半制限部位
    の１つに近接している、請求項13記載の構築物。
JP61502319A 1985-05-02 1986-04-11 標的ヌクレオチド配列の検定に有用な試薬複合体を作製するための方法および核酸構築物 Expired - Lifetime JP2609238B2 (ja)

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