JP2641326B2 - ポリ（３−ヒドロキシカルボン酸）の遊離方法 - Google Patents
ポリ（３−ヒドロキシカルボン酸）の遊離方法Info
- Publication number
- JP2641326B2 JP2641326B2 JP2406885A JP40688590A JP2641326B2 JP 2641326 B2 JP2641326 B2 JP 2641326B2 JP 2406885 A JP2406885 A JP 2406885A JP 40688590 A JP40688590 A JP 40688590A JP 2641326 B2 JP2641326 B2 JP 2641326B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- cells
- lysis
- expression
- hydroxycarboxylic acid
- granules
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
- C12P7/62—Carboxylic acid esters
- C12P7/625—Polyesters of hydroxy carboxylic acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Polyesters Or Polycarbonates (AREA)
- Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、３−ヒドロキシカルボ
ン酸のホモ−および／またはコポリマーを、天然または
キメラ溶菌遺伝子を用いて溶菌を引き起こすことによ
り、当該ポリマーを含むグラム陰性菌の細胞から遊離す
る方法に関する。
ン酸のホモ−および／またはコポリマーを、天然または
キメラ溶菌遺伝子を用いて溶菌を引き起こすことによ
り、当該ポリマーを含むグラム陰性菌の細胞から遊離す
る方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】３−ヒドロキシカルボン酸のホモ−およ
び／またはコポリマーとは、グラム陰性菌例えばアルカ
リゲネス（Alcaligenes ),アチオロジウム（Athiorhodi
um),シュードモナス（Pseudomonas ),リゾビウム（Rhiz
obium ),スピリリウム（Spirillium）により生産され貯
蔵され得るものを意味する。特に、これらは、３−ヒド
ロキシ酪酸（ＰＨＢ）のおよび３−ヒドロキシ吉草酸
（ＰＨＶ）のホモ−および／またはコポリマーである。
しかしながら、これらの細菌は、別のポリ（３−ヒドロ
キシカルボン酸）をも貯蔵し得る。ＰＨＢおよびＰＨＶ
の生産および貯蔵方法は、例えば、ヨーロッパ特許公開
第０，０１５，６６９号、ヨーロッパ特許公開第０，０
４６，３４４号およびヨーロッパ特許公開第０，０５
２，４５９号に記載されている。
び／またはコポリマーとは、グラム陰性菌例えばアルカ
リゲネス（Alcaligenes ),アチオロジウム（Athiorhodi
um),シュードモナス（Pseudomonas ),リゾビウム（Rhiz
obium ),スピリリウム（Spirillium）により生産され貯
蔵され得るものを意味する。特に、これらは、３−ヒド
ロキシ酪酸（ＰＨＢ）のおよび３−ヒドロキシ吉草酸
（ＰＨＶ）のホモ−および／またはコポリマーである。
しかしながら、これらの細菌は、別のポリ（３−ヒドロ
キシカルボン酸）をも貯蔵し得る。ＰＨＢおよびＰＨＶ
の生産および貯蔵方法は、例えば、ヨーロッパ特許公開
第０，０１５，６６９号、ヨーロッパ特許公開第０，０
４６，３４４号およびヨーロッパ特許公開第０，０５
２，４５９号に記載されている。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】Slaterら, J. Bacteri
ol. 170,4431および次頁 (1988) から、細胞内でのＰＨ
Ｂの生産の原因である酵素が、ＰＨＢを生産しない細菌
細胞中に、例えば大腸菌（Escherichia coli）中にクロ
ーニングされ得、そして適当なプラスミドを用いて発現
され得、この場合において、次にクローン化酵素が細胞
内でＰＨＢ合成を引き起こすことが知られている。
ol. 170,4431および次頁 (1988) から、細胞内でのＰＨ
Ｂの生産の原因である酵素が、ＰＨＢを生産しない細菌
細胞中に、例えば大腸菌（Escherichia coli）中にクロ
ーニングされ得、そして適当なプラスミドを用いて発現
され得、この場合において、次にクローン化酵素が細胞
内でＰＨＢ合成を引き起こすことが知られている。
【０００４】微生物の細胞からポリ（３−ヒドロキシカ
ルボン酸）を遊離することは、当該ポリマーが容易に溶
解する抽出剤を用いて乾燥細胞から当該ポリマーを抽出
することにより引き起こされ得る。このような方法は、
例えば、ヨーロッパ特許公開第１５，１２３号に記載さ
れている。これは必然的に、先ず細胞を破壊し従って適
切な抽出剤に浸透性にすることを伴う。これらの方法の
欠点は、抽出剤により細胞からポリマーを溶解すること
のみならずある細胞成分、特に脂質が溶解し、次いでこ
れらの不純物をポリマーから分離する必要があることで
ある。
ルボン酸）を遊離することは、当該ポリマーが容易に溶
解する抽出剤を用いて乾燥細胞から当該ポリマーを抽出
することにより引き起こされ得る。このような方法は、
例えば、ヨーロッパ特許公開第１５，１２３号に記載さ
れている。これは必然的に、先ず細胞を破壊し従って適
切な抽出剤に浸透性にすることを伴う。これらの方法の
欠点は、抽出剤により細胞からポリマーを溶解すること
のみならずある細胞成分、特に脂質が溶解し、次いでこ
れらの不純物をポリマーから分離する必要があることで
ある。
【０００５】ポリ（３−ヒドロキシカルボン酸）を湿っ
た細胞から遊離する一つの可能性は、ヨーロッパ特許公
開第１４５，２２３号に記載されている。これは、細胞
材料を酵素的におよび／または界面活性物質を用いて溶
解させ、その際当該ポリマーは溶解しないままであるこ
とを伴う。細胞材料の溶解は、この場合、数段階で行わ
れ、そしてそれでも溶解は不完全でありかつ溶解しない
細胞成分がポリマー中に残る。
た細胞から遊離する一つの可能性は、ヨーロッパ特許公
開第１４５，２２３号に記載されている。これは、細胞
材料を酵素的におよび／または界面活性物質を用いて溶
解させ、その際当該ポリマーは溶解しないままであるこ
とを伴う。細胞材料の溶解は、この場合、数段階で行わ
れ、そしてそれでも溶解は不完全でありかつ溶解しない
細胞成分がポリマー中に残る。
【０００６】グラム陰性菌を、クローン化溶菌遺伝子の
発現により破壊することも同様に知られている。例え
ば、ドイツ特許公開第３，７１５，８４０号は、大腸菌
（E. coli ）細胞を、温度誘発プロモータにより制御さ
れるキメラ溶菌遺伝子を用いて溶菌することを記載して
おり、この場合、細胞は約３０〜７０分以内に溶菌され
る。
発現により破壊することも同様に知られている。例え
ば、ドイツ特許公開第３，７１５，８４０号は、大腸菌
（E. coli ）細胞を、温度誘発プロモータにより制御さ
れるキメラ溶菌遺伝子を用いて溶菌することを記載して
おり、この場合、細胞は約３０〜７０分以内に溶菌され
る。
【０００７】Witte, Lubitz, Eur. J. Biochem. 180, 3
93及び次頁 (1989) は、大腸菌（E.coli ）を、バクテ
リオファージ溶菌遺伝子Ｅを用いて溶菌することを研究
しそして、溶菌の際に直径約３０〜１００ｎｍの小さい
トランスメンブラン溶菌トンネルの形成があり、当該ト
ンネルを通って細胞内容物が周囲の媒質中に拡散し得る
ことを見出した。細胞は約３０〜６０分以内に溶菌され
る。このトンネルは非常に小さいので、その大きさが細
胞のほぼ全容積を満たすポリマーを遊離するために当該
方法を用いることは大規模では時間を消費しすぎる。
93及び次頁 (1989) は、大腸菌（E.coli ）を、バクテ
リオファージ溶菌遺伝子Ｅを用いて溶菌することを研究
しそして、溶菌の際に直径約３０〜１００ｎｍの小さい
トランスメンブラン溶菌トンネルの形成があり、当該ト
ンネルを通って細胞内容物が周囲の媒質中に拡散し得る
ことを見出した。細胞は約３０〜６０分以内に溶菌され
る。このトンネルは非常に小さいので、その大きさが細
胞のほぼ全容積を満たすポリマーを遊離するために当該
方法を用いることは大規模では時間を消費しすぎる。
【０００８】本発明者は、今や、驚くべきことに小さい
トンネルではなくて、その直径が細胞のほぼ全横断面か
らなる開口部の形成があり、細胞エンベロープはその原
形を保持しそして細胞壁に固定された脂質は細胞内に残
り、水性媒質中でポリ（３−ヒドロキシカルボン酸）顆
粒の完全な分離が可能である、ポリ（３−ヒドロキシカ
ルボン酸）顆粒を、当該顆粒を含むグラム陰性菌の細胞
から、クローン化された天然またはキメラ溶菌遺伝子の
発現により遊離する方法を見出すことができた。
トンネルではなくて、その直径が細胞のほぼ全横断面か
らなる開口部の形成があり、細胞エンベロープはその原
形を保持しそして細胞壁に固定された脂質は細胞内に残
り、水性媒質中でポリ（３−ヒドロキシカルボン酸）顆
粒の完全な分離が可能である、ポリ（３−ヒドロキシカ
ルボン酸）顆粒を、当該顆粒を含むグラム陰性菌の細胞
から、クローン化された天然またはキメラ溶菌遺伝子の
発現により遊離する方法を見出すことができた。
【０００９】
【課題を解決するための手段】本発明は、従って、溶菌
遺伝子発現の誘導前に、２価カチオンのイオン強度を
０．０５〜０．５ｍｏｌ／ｌの間に上昇させ、溶菌遺伝
子の発現を、温度の上昇により引き起こし、細胞を回収
し、２価カチオンの除去後、未だ湿った細胞を水または
緩衝液中に再懸濁して自然溶菌を開始させ、その結果ポ
リマー顆粒が自然溶菌により遊離されることを特徴とす
る、クローン化された天然またはキメラ溶菌遺伝子の発
現によりポリ（３−ヒドロキシカルボン酸）顆粒を含む
グラム陰性菌の細胞からポリ（３−ヒドロキシカルボン
酸）顆粒を遊離する方法に関する。
遺伝子発現の誘導前に、２価カチオンのイオン強度を
０．０５〜０．５ｍｏｌ／ｌの間に上昇させ、溶菌遺伝
子の発現を、温度の上昇により引き起こし、細胞を回収
し、２価カチオンの除去後、未だ湿った細胞を水または
緩衝液中に再懸濁して自然溶菌を開始させ、その結果ポ
リマー顆粒が自然溶菌により遊離されることを特徴とす
る、クローン化された天然またはキメラ溶菌遺伝子の発
現によりポリ（３−ヒドロキシカルボン酸）顆粒を含む
グラム陰性菌の細胞からポリ（３−ヒドロキシカルボン
酸）顆粒を遊離する方法に関する。
【００１０】当該方法を実施するため、ポリ（３−ヒド
ロキシカルボン酸）を生産するグラム陰性菌に、適当な
クローン化溶菌遺伝子の発現による溶菌のために、生体
プログラムを組み込む。溶菌遺伝子は、天然溶菌遺伝
子、例えばバクテリオファージＰｈｉＸ１７４の溶菌遺
伝子Ｅまたはキメラ溶菌遺伝子であり得る。例えばプラ
スミドｐＳＨ２（第１図）またはｐＡＷ１３上のバクテ
リオファージＰｈｉＸ１７４のクローン化溶菌遺伝子Ｅ
が好ましくは使用される。プラスミドｐＡＷ１３の製造
のため、λｐＬプロモーターの制御下に遺伝子Ｅを含
む、プラスミドｐＳＢ１２からのＰｓＨ／ＢａｍＨＩフ
ラグメント(Blasiら, J. Gen. Microbiol. 131, (198
5), 1107及び次頁) をｐＡＣＹＣ１７７のＰｓＨ／Ｂａ
ｍＨＩ開裂部位に挿入する。得られるプラスミドを次い
でＰｓｔＩで切断し、その後ｂｌａ遺伝子の破壊のため
にＴ４ＤＮＡポリメラーゼで処理する。この方法におい
て得られるプラスミドｐＡＷ１３は、λｐＬプロモータ
ーの制御下に溶菌遺伝子Ｅを運ぶ。ポリ（３−ヒドロキ
シカルボン酸）を生産するそして溶菌のために生体プロ
グラムを組み込まれ得るグラム陰性菌の例は、アルカリ
ゲネス（Alcaligenes ),アルチオロジウム（Althiorhod
ium ), シュードモナス（Pseudomonas ), リゾビウム
（Rhizobium ), スピリリウム（Spirillium) および大
腸菌（Escherichia coli）であり、その中にＰＨＢ／Ｐ
ＨＶ−生産酵素をクローニングする。
ロキシカルボン酸）を生産するグラム陰性菌に、適当な
クローン化溶菌遺伝子の発現による溶菌のために、生体
プログラムを組み込む。溶菌遺伝子は、天然溶菌遺伝
子、例えばバクテリオファージＰｈｉＸ１７４の溶菌遺
伝子Ｅまたはキメラ溶菌遺伝子であり得る。例えばプラ
スミドｐＳＨ２（第１図）またはｐＡＷ１３上のバクテ
リオファージＰｈｉＸ１７４のクローン化溶菌遺伝子Ｅ
が好ましくは使用される。プラスミドｐＡＷ１３の製造
のため、λｐＬプロモーターの制御下に遺伝子Ｅを含
む、プラスミドｐＳＢ１２からのＰｓＨ／ＢａｍＨＩフ
ラグメント(Blasiら, J. Gen. Microbiol. 131, (198
5), 1107及び次頁) をｐＡＣＹＣ１７７のＰｓＨ／Ｂａ
ｍＨＩ開裂部位に挿入する。得られるプラスミドを次い
でＰｓｔＩで切断し、その後ｂｌａ遺伝子の破壊のため
にＴ４ＤＮＡポリメラーゼで処理する。この方法におい
て得られるプラスミドｐＡＷ１３は、λｐＬプロモータ
ーの制御下に溶菌遺伝子Ｅを運ぶ。ポリ（３−ヒドロキ
シカルボン酸）を生産するそして溶菌のために生体プロ
グラムを組み込まれ得るグラム陰性菌の例は、アルカリ
ゲネス（Alcaligenes ),アルチオロジウム（Althiorhod
ium ), シュードモナス（Pseudomonas ), リゾビウム
（Rhizobium ), スピリリウム（Spirillium) および大
腸菌（Escherichia coli）であり、その中にＰＨＢ／Ｐ
ＨＶ−生産酵素をクローニングする。
【００１１】細菌細胞を、慣用の方法で、発酵する、即
ちポリ（３−ヒドロキシカルボン酸）の生産に適した基
質上に、例えばエネルギー源として炭水化物を用いて、
使用する細菌により約２８〜３７℃の温度で培養する。
この点について、温度を溶菌遺伝子の温度感性プロモー
ターが発酵の間に溶菌を引き起こさないように十分に低
く保つことに注意すべきである。
ちポリ（３−ヒドロキシカルボン酸）の生産に適した基
質上に、例えばエネルギー源として炭水化物を用いて、
使用する細菌により約２８〜３７℃の温度で培養する。
この点について、温度を溶菌遺伝子の温度感性プロモー
ターが発酵の間に溶菌を引き起こさないように十分に低
く保つことに注意すべきである。
【００１２】次いで、２価カチオン濃度は、例えばＭｇ
ＳＯ４、ＣａＣＯ３等を添加することによって、約０．
０５〜０．５ｍｏｌ／ｌ、好ましくは約０．１〜０．３
ｍｏｌ／ｌに増加する。溶菌は、温度を約４２℃に上昇
させることによって引き起こされ、その始まりは２価カ
チオンの高イオン強度によってなお妨げられる。細胞は
穏やかな遠心分離により回収され、そして湿った細胞材
料は次いで水または水性の緩衝液中に再懸濁され、その
際細胞は自然に破壊され、そして細胞質内容物およびそ
の中に含まれるポリ（３−ヒドロキシカルボン酸）顆粒
は数分以内に遊離される。水は、蒸留水、脱イオン水ま
たは水道水であり得る。使用され得る水性の緩衝液は
０．００１〜０．０１ｍｏｌ／ｌＴｒｉｓＨＣｌ、０．
００１〜０．０１ｍｏｌ／ｌＫＨ２／Ｋ２ＨＰＯ４緩衝
液等である。
ＳＯ４、ＣａＣＯ３等を添加することによって、約０．
０５〜０．５ｍｏｌ／ｌ、好ましくは約０．１〜０．３
ｍｏｌ／ｌに増加する。溶菌は、温度を約４２℃に上昇
させることによって引き起こされ、その始まりは２価カ
チオンの高イオン強度によってなお妨げられる。細胞は
穏やかな遠心分離により回収され、そして湿った細胞材
料は次いで水または水性の緩衝液中に再懸濁され、その
際細胞は自然に破壊され、そして細胞質内容物およびそ
の中に含まれるポリ（３−ヒドロキシカルボン酸）顆粒
は数分以内に遊離される。水は、蒸留水、脱イオン水ま
たは水道水であり得る。使用され得る水性の緩衝液は
０．００１〜０．０１ｍｏｌ／ｌＴｒｉｓＨＣｌ、０．
００１〜０．０１ｍｏｌ／ｌＫＨ２／Ｋ２ＨＰＯ４緩衝
液等である。
【００１３】遊離されたポリマー顆粒、細胞質内容物お
よび空の細胞エンベロープは、適当な分離方法によっ
て、例えば密度勾配遠心分離によって分離され得る。
よび空の細胞エンベロープは、適当な分離方法によっ
て、例えば密度勾配遠心分離によって分離され得る。
【００１４】
【実施例】例１ クローニングベクターｐＳＨ２の構築（第１図） プラスミドｐＳＨ１（S. Haist, PhiX174 specific vec
tor constructions, diploma thesis, Munich 1989) を
酵素ＦｓｐＩで適当な制限緩衝液中で切断すると、平滑
断面を持つ５６９７ｂｐおよび１９６９ｂｐフラグメン
トを生じる。２つのフラグメントをゲル電気泳動によっ
て分離しそして「Gene Clean」(Bio 101Inc. により供
給される）を用いて精製する。
tor constructions, diploma thesis, Munich 1989) を
酵素ＦｓｐＩで適当な制限緩衝液中で切断すると、平滑
断面を持つ５６９７ｂｐおよび１９６９ｂｐフラグメン
トを生じる。２つのフラグメントをゲル電気泳動によっ
て分離しそして「Gene Clean」(Bio 101Inc. により供
給される）を用いて精製する。
【００１５】プラスミドpBluescript ｐＳＫ（−）（St
ratageneにより供給される）を、平滑断面を形成する制
限酵素ＳｓｐＩおよび５’−突出断面を形成するＡｆｌ
ＩＩＩを用いて適当な制限緩衝液中で切断すると、１６
９７ｂｐ、７１２ｂｐおよび５５５ｂｐの３つのフラグ
メントを生じる。７１２ｂｐフラグメントを「Gene Cle
an」を用いて溶離し、そして５’−突出断面をＫｌｅｎ
ｏｗポリメラーゼで満たす。ｐＳＨ１からの５６９７ｂ
ｐフラグメントをＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて適当な緩
衝液中でこの７１２ｂｐフラグメントと結合する。
ratageneにより供給される）を、平滑断面を形成する制
限酵素ＳｓｐＩおよび５’−突出断面を形成するＡｆｌ
ＩＩＩを用いて適当な制限緩衝液中で切断すると、１６
９７ｂｐ、７１２ｂｐおよび５５５ｂｐの３つのフラグ
メントを生じる。７１２ｂｐフラグメントを「Gene Cle
an」を用いて溶離し、そして５’−突出断面をＫｌｅｎ
ｏｗポリメラーゼで満たす。ｐＳＨ１からの５６９７ｂ
ｐフラグメントをＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて適当な緩
衝液中でこの７１２ｂｐフラグメントと結合する。
【００１６】例２：大腸菌（E. coli ）ＰＣ１３６３
（Phabagen Collection, Utrecht University)のトラン
スフォーメーション 大腸菌（E. coli ）ＰＣ１３６３のトランスフォーメー
ションを既知の方法で、例えばManiatisら Molecular C
loning, Cold Spring Harbor Laboratory, NewYork (19
82)に記載された方法により行う。
（Phabagen Collection, Utrecht University)のトラン
スフォーメーション 大腸菌（E. coli ）ＰＣ１３６３のトランスフォーメー
ションを既知の方法で、例えばManiatisら Molecular C
loning, Cold Spring Harbor Laboratory, NewYork (19
82)に記載された方法により行う。
【００１７】この目的のため、蒸留水（ｐＨ７）１００
０ｍｌ中ペプトン１０ｇ、酵母抽出物５ｇ、ＮａＣｌ５
ｇからなる栄養培地であるLurea Broth ５ｍｌに大腸菌
（E.coli ）PC 1363 のプレ培養菌１ｍｌを接種しそし
て３７℃で振とうする。細胞を遠心分離により回収しそ
して氷中で１５０ｍｍｏｌ／ｌＫＣｌ、５０ｍｍｏｌ／
ｌＭｇＣｌ2 および１ｍｍｏｌ／ｌＴｒｉｓＨＣｌから
なるトランスフォーメーション緩衝液２５ｍｌ中で懸濁
する。再開した遠心分離後、細胞を２ｍｌのトランスフ
ォーメーション緩衝液中で再懸濁する。このサスペンシ
ョン０．１ｍｌをプラスミドＤＮＡ（ｐＳＨ２（ｐ１５
Ａ）およびｐＳＢ２０−ＰＨＢ（ｐＨＢ１）（Slaterら
J. Bacteriol. 170, 第4431頁及び次頁 (1988))と混合
しそして、約１時間後、１．２ｍｌのLurea broth を２
８℃で添加する。トランスフォーマントは、プラスミド
の抗生物質抵抗性標識に従って選択される。
０ｍｌ中ペプトン１０ｇ、酵母抽出物５ｇ、ＮａＣｌ５
ｇからなる栄養培地であるLurea Broth ５ｍｌに大腸菌
（E.coli ）PC 1363 のプレ培養菌１ｍｌを接種しそし
て３７℃で振とうする。細胞を遠心分離により回収しそ
して氷中で１５０ｍｍｏｌ／ｌＫＣｌ、５０ｍｍｏｌ／
ｌＭｇＣｌ2 および１ｍｍｏｌ／ｌＴｒｉｓＨＣｌから
なるトランスフォーメーション緩衝液２５ｍｌ中で懸濁
する。再開した遠心分離後、細胞を２ｍｌのトランスフ
ォーメーション緩衝液中で再懸濁する。このサスペンシ
ョン０．１ｍｌをプラスミドＤＮＡ（ｐＳＨ２（ｐ１５
Ａ）およびｐＳＢ２０−ＰＨＢ（ｐＨＢ１）（Slaterら
J. Bacteriol. 170, 第4431頁及び次頁 (1988))と混合
しそして、約１時間後、１．２ｍｌのLurea broth を２
８℃で添加する。トランスフォーマントは、プラスミド
の抗生物質抵抗性標識に従って選択される。
【００１８】例３：大腸菌（E. coli ）ＰＣ１３６３の
発酵および溶菌（ｐＳＢ２０、ｐＳＨ２）Lurea Broth
１０ｍｌに例２と同様にして調製されたE. coli のオー
バーナイト培養菌(overnight culture) を接種しそして
光学密度ＯＤ600 が０．２〜０．９になるまで２８℃で
培養する。次いで２ｍｏｌ／ｌのＭｇＳＯ4 溶液を、最
終濃度が０．２ｍｏｌ／ｌになるまで添加しそして当該
混合物を２８℃で３０分間インキュベートする。次いで
温度を４２℃に上昇させそして３０分後、細胞を遠心分
離により（７０００ｒｐｍ、５分）４℃で回収し、そし
て細胞材料を１０ｍｌの蒸留水中で再懸濁する。溶菌は
懸濁の間に１０分以内に起こる。
発酵および溶菌（ｐＳＢ２０、ｐＳＨ２）Lurea Broth
１０ｍｌに例２と同様にして調製されたE. coli のオー
バーナイト培養菌(overnight culture) を接種しそして
光学密度ＯＤ600 が０．２〜０．９になるまで２８℃で
培養する。次いで２ｍｏｌ／ｌのＭｇＳＯ4 溶液を、最
終濃度が０．２ｍｏｌ／ｌになるまで添加しそして当該
混合物を２８℃で３０分間インキュベートする。次いで
温度を４２℃に上昇させそして３０分後、細胞を遠心分
離により（７０００ｒｐｍ、５分）４℃で回収し、そし
て細胞材料を１０ｍｌの蒸留水中で再懸濁する。溶菌は
懸濁の間に１０分以内に起こる。
【００１９】蔗糖を溶菌した細胞混合物に５５％の最終
濃度まで添加し、次いでそれを３ｍｍｏｌ／ｌＥＤＴＡ
中５０、４５および４０％濃度の蔗糖溶液の層で覆う。
１６時間の遠心分離（４℃、37,000 rpm、SW41Ti) 後、
勾配を分別し、そしてタンパク質含有量、密度およびＰ
ＨＢ／ＰＨＶ含有量を測定する。１．２４ｇ／ｍｌ（未
溶菌細胞）、１．２２ｇ／ｍｌ（細胞ゴースト）および
１．２０ｇ／ｍｌ（ＰＨＢ／ＰＨＶ）の密度を有する３
つのフラクションが得られる。これにより６０〜８０％
のＰＨＢ／ＰＨＶ顆粒が遊離される。
濃度まで添加し、次いでそれを３ｍｍｏｌ／ｌＥＤＴＡ
中５０、４５および４０％濃度の蔗糖溶液の層で覆う。
１６時間の遠心分離（４℃、37,000 rpm、SW41Ti) 後、
勾配を分別し、そしてタンパク質含有量、密度およびＰ
ＨＢ／ＰＨＶ含有量を測定する。１．２４ｇ／ｍｌ（未
溶菌細胞）、１．２２ｇ／ｍｌ（細胞ゴースト）および
１．２０ｇ／ｍｌ（ＰＨＢ／ＰＨＶ）の密度を有する３
つのフラクションが得られる。これにより６０〜８０％
のＰＨＢ／ＰＨＶ顆粒が遊離される。
【００２０】
【発明の効果】本発明によれば、その直径が細胞のほぼ
全横断面からなる開口部が形成され、細胞エンベロープ
はその原形を保持しそして細胞壁に固定された脂質は細
胞内に残るため、グラム陰性菌の細胞から水性媒質中で
ポリ（３−ヒドロキシカルボン酸）顆粒を完全に分離す
ることができる。本発明は、特許請求の範囲請求項１記
載の発明に関するものであるが、以下の発明も、その実
施の態様として包含している： （１）使用する溶菌遺伝子がバクテリオファージＰｈｉ
Ｘ１７４のクローン化溶菌遺伝子Ｅである、請求項１記
載の方法。 （２）２価カチオンの濃度が０．１〜０．３ｍｏｌ／ｌ
の間に上昇される、請求項１記載の方法。 （３）２価カチオンの濃度が、ＭｇＳＯ４またはＣａＣ
Ｏ３の添加によって上昇される、請求項１記載の方法。 （４）アルカリゲネス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）がグ
ラム陰性菌として使用される、請求項１記載の方法。 （５）クローン化大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）がグラム陰性
菌として使用される、請求項１記載の方法。
全横断面からなる開口部が形成され、細胞エンベロープ
はその原形を保持しそして細胞壁に固定された脂質は細
胞内に残るため、グラム陰性菌の細胞から水性媒質中で
ポリ（３−ヒドロキシカルボン酸）顆粒を完全に分離す
ることができる。本発明は、特許請求の範囲請求項１記
載の発明に関するものであるが、以下の発明も、その実
施の態様として包含している： （１）使用する溶菌遺伝子がバクテリオファージＰｈｉ
Ｘ１７４のクローン化溶菌遺伝子Ｅである、請求項１記
載の方法。 （２）２価カチオンの濃度が０．１〜０．３ｍｏｌ／ｌ
の間に上昇される、請求項１記載の方法。 （３）２価カチオンの濃度が、ＭｇＳＯ４またはＣａＣ
Ｏ３の添加によって上昇される、請求項１記載の方法。 （４）アルカリゲネス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）がグ
ラム陰性菌として使用される、請求項１記載の方法。 （５）クローン化大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）がグラム陰性
菌として使用される、請求項１記載の方法。
【図１】第１図は、プラスミドｐＳＨ２の構築を遺伝子
地図を用いて示す図である。
地図を用いて示す図である。
フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｐ 7/42 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 7/42 Ｃ１２Ｒ 1:05） (56)参考文献 Ｊ．ＢＡＣＴＥＲＩＯＬ．，170 （10），4431−4436（1988) ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬ．ＬＥＴＴ．, 11（12），845−850（1989) ＥＵＲ．Ｊ．ＢＩＯＣＨＥＭ．，180 （２），393−398（1989) 国際公開第87／553号パンフレット （1987)
Claims (1)
- 【請求項１】 溶菌遺伝子発現の誘導前に、２価カチ
オンのイオン強度を０．０５〜０．５ｍｏｌ／ｌの間に
上昇させ、溶菌遺伝子の発現を、温度の上昇により引き
起こし、細胞を回収し、２価カチオンの除去後、未だ湿
った細胞を水または緩衝液中に再懸濁して自然溶菌を開
始させ、その結果ポリマー顆粒が自然溶菌により遊離さ
れることを特徴とする、クローン化された天然またはキ
メラ溶菌遺伝子の発現によりポリ（３−ヒドロキシカル
ボン酸）顆粒を含むグラム陰性菌の細胞からポリ（３−
ヒドロキシカルボン酸）顆粒を遊離する方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| AT2942/89 | 1989-12-27 | ||
| AT2942/89A AT393134B (de) | 1989-12-27 | 1989-12-27 | Verfahren zur freisetzung von poly-3-hydroxycarbonsaeuren |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH04293487A JPH04293487A (ja) | 1992-10-19 |
| JP2641326B2 true JP2641326B2 (ja) | 1997-08-13 |
Family
ID=3542776
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2406885A Expired - Lifetime JP2641326B2 (ja) | 1989-12-27 | 1990-12-26 | ポリ（３−ヒドロキシカルボン酸）の遊離方法 |
Country Status (8)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5149644A (ja) |
| EP (1) | EP0435028B1 (ja) |
| JP (1) | JP2641326B2 (ja) |
| AT (2) | AT393134B (ja) |
| DE (1) | DE59010176D1 (ja) |
| DK (1) | DK0435028T3 (ja) |
| ES (1) | ES2083417T3 (ja) |
| GR (1) | GR3019235T3 (ja) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| NL8900827A (nl) * | 1989-04-04 | 1990-11-01 | Rijksuniversiteit | Microbiologische bereiding van polyesters. |
| DE4433134A1 (de) * | 1994-09-16 | 1996-03-21 | Buck Chem Tech Werke | Verfahren zur Herstellung von Polyhydroxyfettsäuren sowie rekombinanter Bakterienstämme zur Durchführung des Verfahrens |
| CN103869107A (zh) * | 2012-12-12 | 2014-06-18 | 昆山威典电子有限公司 | 电路板检测治具用开盖机构 |
Family Cites Families (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE383754C (de) * | 1919-12-18 | 1923-10-19 | Siemens Schuckertwerke G M B H | Regulierung fuer elektrisch beheizte Dampfkessel u. dgl., bei denen der Kesselinhalt selbst als Heizwiderstand dient |
| DE3061384D1 (en) * | 1979-02-21 | 1983-01-27 | Ici Plc | A process for the extraction of poly-3-hydroxy-butyric acid from microbial cells |
| EP0015699A1 (en) * | 1979-03-02 | 1980-09-17 | Kenco Chemicals (Bolton) Limited | A method and apparatus for manufacturing fire-lighters |
| US4520016A (en) * | 1980-06-17 | 1985-05-28 | Kabigen Ab | Bacteriolytic proteins |
| EP0046344B1 (en) * | 1980-08-19 | 1985-06-19 | Imperial Chemical Industries Plc | Fermentation process |
| DE3173154D1 (en) * | 1980-11-18 | 1986-01-16 | Ici Plc | Beta-hydroxybutyrate polymers |
| EP0091224B1 (en) * | 1982-04-05 | 1988-05-04 | Imperial Chemical Industries Plc | Process for producing a shaped article of beta-hydroxybutyrate polymer |
| EP0145233B2 (en) * | 1983-11-23 | 1991-11-06 | Imperial Chemical Industries Plc | Separation processfor a 3-hydroxybutyrate polymer |
| JPS61115489A (ja) * | 1984-11-10 | 1986-06-03 | House Food Ind Co Ltd | 溶菌酵素の製造法 |
| DE3875367T2 (de) * | 1987-04-28 | 1993-03-25 | Mitsubishi Gas Chemical Co | Verfahren zur herstellung eines d-(-)-3-hydroxybutyrat- und d-(-)-3-hydroxyvalerat-einheiten enthaltenden zufallscopolymers. |
| DE3715840A1 (de) * | 1987-05-12 | 1988-12-01 | Boehringer Mannheim Gmbh | Fuer ein lytisch wirksames, chimaeres protein kodierende rekombinante dna und ihre verwendung |
-
1989
- 1989-12-27 AT AT2942/89A patent/AT393134B/de not_active IP Right Cessation
-
1990
- 1990-12-15 DK DK90123287.6T patent/DK0435028T3/da active
- 1990-12-15 DE DE59010176T patent/DE59010176D1/de not_active Expired - Fee Related
- 1990-12-15 EP EP90123287A patent/EP0435028B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1990-12-15 AT AT90123287T patent/ATE135046T1/de not_active IP Right Cessation
- 1990-12-15 ES ES90123287T patent/ES2083417T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1990-12-26 JP JP2406885A patent/JP2641326B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1990-12-26 US US07/633,785 patent/US5149644A/en not_active Expired - Fee Related
-
1996
- 1996-03-07 GR GR950402272T patent/GR3019235T3/el unknown
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬ．ＬＥＴＴ．，１１（１２），８４５−８５０（１９８９） |
| ＥＵＲ．Ｊ．ＢＩＯＣＨＥＭ．，１８０（２），３９３−３９８（１９８９） |
| Ｊ．ＢＡＣＴＥＲＩＯＬ．，１７０（１０），４４３１−４４３６（１９８８） |
| 国際公開第８７／５５３号パンフレット（１９８７） |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DE59010176D1 (de) | 1996-04-11 |
| GR3019235T3 (en) | 1996-06-30 |
| ATA294289A (de) | 1991-01-15 |
| EP0435028A3 (en) | 1991-10-16 |
| ES2083417T3 (es) | 1996-04-16 |
| JPH04293487A (ja) | 1992-10-19 |
| EP0435028A2 (de) | 1991-07-03 |
| EP0435028B1 (de) | 1996-03-06 |
| US5149644A (en) | 1992-09-22 |
| ATE135046T1 (de) | 1996-03-15 |
| DK0435028T3 (da) | 1996-04-01 |
| AT393134B (de) | 1991-08-26 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP3079276B2 (ja) | 組換え体ｄｎａ、それを含むシュードモナス属菌及びそれを用いたリパーゼの製造法 | |
| JP2002508929A (ja) | リノール酸イソメラーゼ | |
| US4806480A (en) | Novel E. coli hybrid plasmid vector conferring sucrose fermenting capacity | |
| JPH0787788B2 (ja) | イソペニシリンｎ合成酵素をコ−ドしているｄｎａ化合物および組換えｄｎａ発現ベクタ− | |
| JP2596544B2 (ja) | 高温で活性なｄ―ヒダントイナーゼを含有する大腸菌の製法 | |
| JP2641326B2 (ja) | ポリ（３−ヒドロキシカルボン酸）の遊離方法 | |
| JPS6062982A (ja) | 組換えｄνａ，該組換えｄνａを有する細菌及び該細菌を用いるｌ−スレオニン又はｌ−イソロイシンの製造法 | |
| US4612287A (en) | Plasmids containing a gene coding for a thermostable pullulanase and pullulanase-producing strains of Escherichia coli and Bacillus subtilis containing the plasmids | |
| US5518907A (en) | Cloning and expression in Escherichia coli of the Alcaligenes eutrophus H16 poly-beta-hydroxybutyrate biosynthetic pathway | |
| US4237231A (en) | Method of purifying glucose isomerase and a composition for storing same | |
| JPS5879996A (ja) | プラスミドｐＡＣ１およびその取得方法 | |
| JP3489604B2 (ja) | ５−アミノレブリン酸合成酵素遺伝子 | |
| JP2759209B2 (ja) | キシラナーゼ遺伝子を含む組換えｄｎａ | |
| JPH0255036B2 (ja) | ||
| JPH06102029B2 (ja) | Ｌ−トリプトフアンの製造法 | |
| JP4903004B2 (ja) | ロドコッカス属に属する細菌の形質転換方法 | |
| JPH0665307B2 (ja) | バチルスズブチリスのグルコン酸オペロンおよびプロモ−タ− | |
| DE4003827A1 (de) | Verfahren zur freisetzung von poly-3-hydroxycarbonsaeuren | |
| JPS63209589A (ja) | Ｎａｌ（ｎ―アシルノイラミン酸アルドラーゼ）の製造方法 | |
| JPH0556786A (ja) | リパーゼ産生遺伝子を含むｄｎａ断片 | |
| Seifert et al. | Continuous reactive extraction of Penicillin G | |
| JPH01137980A (ja) | 耐熱性トリプトファン合成酵素遺伝子及び該遺伝子を導入した新規な組換え微生物 | |
| JPH02261384A (ja) | Ｄｎａ断片、耐熱性エンド型セルラーゼ、及びその製造方法 | |
| JPS59179081A (ja) | プラスミドｐＴＰ１１０２ | |
| JPS59159775A (ja) | エシエリチア・コリ |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 19970304 |