JP2643801B2 - ホスファターゼの検出方法 - Google Patents
ホスファターゼの検出方法Info
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は，ホスファターゼ検出用
の蛍光物質に関するものであり，例えば，インサイチュ
ハイブリダイゼーションでゲノム解析のための遺伝子の
染色体マッピングをホスファターゼを利用して作成する
場合や，組織中もしくは細胞中の酸ホスファターゼ及び
アルカリホスファターゼを検出する場合に，極めて有用
なものである。
の蛍光物質に関するものであり，例えば，インサイチュ
ハイブリダイゼーションでゲノム解析のための遺伝子の
染色体マッピングをホスファターゼを利用して作成する
場合や，組織中もしくは細胞中の酸ホスファターゼ及び
アルカリホスファターゼを検出する場合に，極めて有用
なものである。
【０００２】
【従来技術】組織もしくは細胞中のＲＮＡ，又は染色体
ＤＮＡのインサイチュハイブリダイゼーションや特異的
抗原の検出には，ＲＮＡ又は染色体ＤＮＡと結合した上
記抗原に，蛍光物質と結合させた抗体を結合させ，この
蛍光物質の蛍光を検出する蛍光抗体法がよく用いられて
いる。しかし，一つの抗体に結合できる蛍光物質の数は
数分子から数十分子と限られているために，これによっ
て感度が制限されている。かかる蛍光抗体法としては，
例えばＦＩＴＣ結合抗体を用いる方法がある。
ＤＮＡのインサイチュハイブリダイゼーションや特異的
抗原の検出には，ＲＮＡ又は染色体ＤＮＡと結合した上
記抗原に，蛍光物質と結合させた抗体を結合させ，この
蛍光物質の蛍光を検出する蛍光抗体法がよく用いられて
いる。しかし，一つの抗体に結合できる蛍光物質の数は
数分子から数十分子と限られているために，これによっ
て感度が制限されている。かかる蛍光抗体法としては，
例えばＦＩＴＣ結合抗体を用いる方法がある。
【０００３】感度の飛躍的向上のためには，抗体に酵素
を結合させる酵素抗体法が望ましい。酵素抗体法とは，
酵素と結合させた抗体を，ＲＮＡや染色体ＤＮＡと結合
させた抗原に結合させた後，蛍光基質を酵素と反応させ
て蛍光物質を生成させ，この蛍光物質によって発生する
蛍光を検出することにより，ＲＮＡや染色体ＤＮＡと結
合した特異的抗原の検出を行うものである。
を結合させる酵素抗体法が望ましい。酵素抗体法とは，
酵素と結合させた抗体を，ＲＮＡや染色体ＤＮＡと結合
させた抗原に結合させた後，蛍光基質を酵素と反応させ
て蛍光物質を生成させ，この蛍光物質によって発生する
蛍光を検出することにより，ＲＮＡや染色体ＤＮＡと結
合した特異的抗原の検出を行うものである。
【０００４】酵素による蛍光基質の分解反応には制限が
ない。このため，例えば，アルカリホスファターゼによ
る蛍光基質の分解反応を利用した場合では，１分間に約
１０万分子の蛍光基質と反応する。そのため，上記蛍光
抗体法を利用した場合と比べて，蛍光感度を一万倍以上
に向上させることができる。
ない。このため，例えば，アルカリホスファターゼによ
る蛍光基質の分解反応を利用した場合では，１分間に約
１０万分子の蛍光基質と反応する。そのため，上記蛍光
抗体法を利用した場合と比べて，蛍光感度を一万倍以上
に向上させることができる。
【０００５】
【解決しようとする課題】しかしながら，上記ＦＩＴＣ
結合抗体による蛍光抗体法は，励起光による褪色が速
く，室内の一般的な照明環境のもとでは数秒で消失して
しまう。そのため，蛍光が発生した直後に該蛍光を検出
しなければならない。更に，作業は暗室で行わなければ
ならず，作業性がよくない。また，励起光の観察には，
高価なレーザ顕微鏡が必要であり，汎用性が乏しい。
結合抗体による蛍光抗体法は，励起光による褪色が速
く，室内の一般的な照明環境のもとでは数秒で消失して
しまう。そのため，蛍光が発生した直後に該蛍光を検出
しなければならない。更に，作業は暗室で行わなければ
ならず，作業性がよくない。また，励起光の観察には，
高価なレーザ顕微鏡が必要であり，汎用性が乏しい。
【０００６】また，ＦＩＴＣ結合抗体による蛍光は，感
度及び解像度がよくない。そのため，ＲＮＡや染色体Ｄ
ＮＡの特定塩基配列部位の存在位置を知るに当たって，
ＦＩＴＣ結合抗体により発光した染色体上のＤＮＡを撮
影した画像と，染色体全体を撮影した画像とを，画像処
理により重ね合わせなければならないという問題があ
る。
度及び解像度がよくない。そのため，ＲＮＡや染色体Ｄ
ＮＡの特定塩基配列部位の存在位置を知るに当たって，
ＦＩＴＣ結合抗体により発光した染色体上のＤＮＡを撮
影した画像と，染色体全体を撮影した画像とを，画像処
理により重ね合わせなければならないという問題があ
る。
【０００７】そこで，これらの問題を解決するために
Ｅ．Ｊ．Ｍ．Ｓｐｅｅｌらは，蛍光基質である市販のＮ
ａｐｈｔｈｏｌ−ＡＳ／ＭＸ−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ及び
アゾ色素であるＦａｓｔ Ｒｅｄ ＴＲによる蛍光を検
出する酵素抗体法を試みた。この方法は，インサイチュ
ハイブリダイゼーションにおいて，Ｎａｐｈｔｈｏｌ−
ＡＳ／ＭＸ−ｐｈｏｓｐｈａｔｅとＦａｓｔ Ｒｅｄ
ＴＲとをカップリングさせて，蛍光物質の組織もしくは
染色体への沈着能を向上させるものである（Ｔｈｅ Ｈ
ｉｓｔｏｐｃｈｅｍｉｃａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ，ｖｏ
ｌ．２４，１９９２．第９回国際組織化学会議要旨集５
６２頁）。
Ｅ．Ｊ．Ｍ．Ｓｐｅｅｌらは，蛍光基質である市販のＮ
ａｐｈｔｈｏｌ−ＡＳ／ＭＸ−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ及び
アゾ色素であるＦａｓｔ Ｒｅｄ ＴＲによる蛍光を検
出する酵素抗体法を試みた。この方法は，インサイチュ
ハイブリダイゼーションにおいて，Ｎａｐｈｔｈｏｌ−
ＡＳ／ＭＸ−ｐｈｏｓｐｈａｔｅとＦａｓｔ Ｒｅｄ
ＴＲとをカップリングさせて，蛍光物質の組織もしくは
染色体への沈着能を向上させるものである（Ｔｈｅ Ｈ
ｉｓｔｏｐｃｈｅｍｉｃａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ，ｖｏ
ｌ．２４，１９９２．第９回国際組織化学会議要旨集５
６２頁）。
【０００８】このＥ．Ｊ．Ｍ．Ｓｐｅｅｌらの方法で
は，この沈着能の向上によって，上記従来のＦＩＴＣ蛍
光抗体法と比べて褪色が遅くなることは確認できた。し
かし，その反面，上記Ｅ．Ｊ．Ｍ．Ｓｐｅｅｌらの方法
では，感度の面で従来法である上記ＦＩＴＣ蛍光抗体法
をこえることができず，問題の部分的解決に留まった。
そこで，本発明はかかる従来の問題点に鑑み，強い蛍光
を長時間発生させることができ，操作性に優れたホスフ
ァターゼの検出方法を提供しようとするものである。
は，この沈着能の向上によって，上記従来のＦＩＴＣ蛍
光抗体法と比べて褪色が遅くなることは確認できた。し
かし，その反面，上記Ｅ．Ｊ．Ｍ．Ｓｐｅｅｌらの方法
では，感度の面で従来法である上記ＦＩＴＣ蛍光抗体法
をこえることができず，問題の部分的解決に留まった。
そこで，本発明はかかる従来の問題点に鑑み，強い蛍光
を長時間発生させることができ，操作性に優れたホスフ
ァターゼの検出方法を提供しようとするものである。
【０００９】
【課題の解決手段】本発明は，ホスファターゼに，下記
の「化１」の一般式に示す２′−ナフトールＡＳ類リン
酸体を反応させて，該２′−ナフトールＡＳ類リン酸体
にジアゾニウム塩をカップリングさせてアゾ色素を得る
色素生成工程と，該アゾ色素に励起光を照射する励起工
程と，励起光の照射により発生する蛍光を検出する検出
工程よりなり，上記２′−ナフトールＡＳ類リン酸体の
２′置換基Ｘ1 は，フェニル基，メチル基，イソプロピ
ル基，又はメトキシ基のいずれかであることを特徴とす
るホスファターゼの検出方法にある。
の「化１」の一般式に示す２′−ナフトールＡＳ類リン
酸体を反応させて，該２′−ナフトールＡＳ類リン酸体
にジアゾニウム塩をカップリングさせてアゾ色素を得る
色素生成工程と，該アゾ色素に励起光を照射する励起工
程と，励起光の照射により発生する蛍光を検出する検出
工程よりなり，上記２′−ナフトールＡＳ類リン酸体の
２′置換基Ｘ1 は，フェニル基，メチル基，イソプロピ
ル基，又はメトキシ基のいずれかであることを特徴とす
るホスファターゼの検出方法にある。
【００１０】
【化１】
【００１１】本発明において，上記２′−ナフトールＡ
Ｓ類リン酸体のナフタレン環と上記ジアゾニウム塩と
は，ホスファターゼ存在下で，上記カップリング反応に
より，アゾ色素を生成する（図１〜図３参照）。このア
ゾ色素は，一般に上記２′−ナフトールＡＳ類リン酸体
の脱リン酸体とジアゾニウム塩とからなるカップリング
生成物である。また，アゾ色素は，安定な化合物であ
り，強い蛍光を発する蛍光物質である。
Ｓ類リン酸体のナフタレン環と上記ジアゾニウム塩と
は，ホスファターゼ存在下で，上記カップリング反応に
より，アゾ色素を生成する（図１〜図３参照）。このア
ゾ色素は，一般に上記２′−ナフトールＡＳ類リン酸体
の脱リン酸体とジアゾニウム塩とからなるカップリング
生成物である。また，アゾ色素は，安定な化合物であ
り，強い蛍光を発する蛍光物質である。
【００１２】上記「２′−ナフトールＡＳ類リン酸体」
とは，上記化１式におけるベンゼン環の２′位（オルト
位）にのみフェニル基等の上記置換基Ｘ1 が結合してお
り，３′位及び５’位（メタ位）及び４′位（パラ位）
には置換基が結合していないものをいう。
とは，上記化１式におけるベンゼン環の２′位（オルト
位）にのみフェニル基等の上記置換基Ｘ1 が結合してお
り，３′位及び５’位（メタ位）及び４′位（パラ位）
には置換基が結合していないものをいう。
【００１３】例えば，上記ベンゼン環の２′位にフェニ
ル基が結合した２′−ナフトールＡＳ類リン酸体は，３
−ヒドロキシ−Ｎ−２′−ビフェニル−２−ナフタレン
カルボキシアミドホスフェートエステル（３−Ｈｙｄｒ
ｏｘｙ−Ｎ−２′−ｂｉｐｈｅｎｙｌ−２−ｎａｐｈｔ
ｈａｌｅｎｅｃａｒｂｏｘａｍｉｄｅ ｐｈｏｓｐｈａ
ｔｅ ｅｓｔｅｒ，以下ＨＮＰＰと称する）である。こ
の化学構造式を下記「化２」に示す。
ル基が結合した２′−ナフトールＡＳ類リン酸体は，３
−ヒドロキシ−Ｎ−２′−ビフェニル−２−ナフタレン
カルボキシアミドホスフェートエステル（３−Ｈｙｄｒ
ｏｘｙ−Ｎ−２′−ｂｉｐｈｅｎｙｌ−２−ｎａｐｈｔ
ｈａｌｅｎｅｃａｒｂｏｘａｍｉｄｅ ｐｈｏｓｐｈａ
ｔｅ ｅｓｔｅｒ，以下ＨＮＰＰと称する）である。こ
の化学構造式を下記「化２」に示す。
【００１４】
【化２】
【００１５】このＨＮＰＰは，ホスファターゼの存在下
で，ジアゾニウム塩，例えば２−ビフェニルジアゾニウ
ムクロライドと，図１のように反応し，発色性のアゾ色
素を生成する。また，ＨＮＰＰは，ホスファターゼの存
在下で，ジアゾニウム塩としての４−クロロ−２−トル
エンジアゾニウムクロライドと，図２のように反応し，
発色性のアゾ色素を生成する。
で，ジアゾニウム塩，例えば２−ビフェニルジアゾニウ
ムクロライドと，図１のように反応し，発色性のアゾ色
素を生成する。また，ＨＮＰＰは，ホスファターゼの存
在下で，ジアゾニウム塩としての４−クロロ−２−トル
エンジアゾニウムクロライドと，図２のように反応し，
発色性のアゾ色素を生成する。
【００１６】また，例えば，上記ベンゼン環の２′位に
メチル基が結合した２′−ナフトールＡＳ類リン酸体
は，３−ヒドロキシ−Ｎ−２′−メチルフェニル−２−
ナフタレンカルボキシアミドホスフェートエステル（３
−Ｈｙｄｒｏｘｙ−Ｎ−２′−ｍｅｔｈｙｌｐｈｅｎｙ
ｌ−２−ｎａｐｈｔｈａｌｅｎｅｃａｒｂｏｘａｍｉｄ
ｅ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｅｓｔｅｒ，以下ＨＮＭＰＰ
という。）である。この化学構造式を下記「化３」に示
す。
メチル基が結合した２′−ナフトールＡＳ類リン酸体
は，３−ヒドロキシ−Ｎ−２′−メチルフェニル−２−
ナフタレンカルボキシアミドホスフェートエステル（３
−Ｈｙｄｒｏｘｙ−Ｎ−２′−ｍｅｔｈｙｌｐｈｅｎｙ
ｌ−２−ｎａｐｈｔｈａｌｅｎｅｃａｒｂｏｘａｍｉｄ
ｅ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｅｓｔｅｒ，以下ＨＮＭＰＰ
という。）である。この化学構造式を下記「化３」に示
す。
【００１７】
【化３】
【００１８】このＨＮＭＰＰは，ホスファターゼの存在
下でジアゾニウムクロライドと，図３のように反応し，
発色性のアゾ色素を生成する。尚，その他の２′−ナフ
トールＡＳ類については，上記と同様であり，その名称
表示は省略する。
下でジアゾニウムクロライドと，図３のように反応し，
発色性のアゾ色素を生成する。尚，その他の２′−ナフ
トールＡＳ類については，上記と同様であり，その名称
表示は省略する。
【００１９】また，上記２′−ナフトールＡＳ類リン酸
体としては，化４式に示すごとく，ナフタレン環の７位
に，以下に示す置換基Ｘ2 を有しているものを用いるこ
ともできる。上記置換基Ｘ2 としては，Ｈ，Ｂｒ，フェ
ニル基（Ｃ6 Ｈ5 ），メチル基（ＣＨ3 ），イソプロピ
ル基（ＣＨ2 （ＣＨ3 ）ＣＨ3 ）等がある。
体としては，化４式に示すごとく，ナフタレン環の７位
に，以下に示す置換基Ｘ2 を有しているものを用いるこ
ともできる。上記置換基Ｘ2 としては，Ｈ，Ｂｒ，フェ
ニル基（Ｃ6 Ｈ5 ），メチル基（ＣＨ3 ），イソプロピ
ル基（ＣＨ2 （ＣＨ3 ）ＣＨ3 ）等がある。
【００２０】
【化４】
【００２１】上記ホスファターゼは，一般に，組織中も
しくは細胞中に存在しているホスファターゼ，或いは後
述する核酸プローブに標識されたホスファターゼを対象
とする。上記組織としては，例えば，腎臓組織又は肝臓
組織等がある。上記染色体としては，組織内に存在する
内因性のものでも，また組織外に取り出した外因性のも
のでもよい。
しくは細胞中に存在しているホスファターゼ，或いは後
述する核酸プローブに標識されたホスファターゼを対象
とする。上記組織としては，例えば，腎臓組織又は肝臓
組織等がある。上記染色体としては，組織内に存在する
内因性のものでも，また組織外に取り出した外因性のも
のでもよい。
【００２２】また，上記ホスファターゼは，例えば，核
酸プローブ上にある。該核酸プローブは，組織もしくは
細胞中のＲＮＡ，または染色体ＤＮＡとハイブリダイゼ
ーションさせることができる。即ち，まず，ホスファタ
ーゼにより標識された核酸プローブを，組織中もしくは
細胞中のＲＮＡ，又は染色体ＤＮＡの特定塩基配列部位
とハイブリダイゼーションさせる。次いで，この特定塩
基配列部位とハイブリダイゼーションしなかった上記核
酸プローブを除去する。
酸プローブ上にある。該核酸プローブは，組織もしくは
細胞中のＲＮＡ，または染色体ＤＮＡとハイブリダイゼ
ーションさせることができる。即ち，まず，ホスファタ
ーゼにより標識された核酸プローブを，組織中もしくは
細胞中のＲＮＡ，又は染色体ＤＮＡの特定塩基配列部位
とハイブリダイゼーションさせる。次いで，この特定塩
基配列部位とハイブリダイゼーションしなかった上記核
酸プローブを除去する。
【００２３】次に，上記ホスファターゼに２′−ナフト
ールＡＳ類リン酸体を反応させ，該２′−ナフトールＡ
Ｓ類リン酸体をジアゾニウム塩とカップリングさせて，
アゾ色素を得る。その後，上記アゾ色素に励起光を照射
することにより，アゾ色素から発生する蛍光を検出す
る。これにより，上記ＲＮＡ又は染色体ＤＮＡの特定塩
基配列部位を検出することができる。
ールＡＳ類リン酸体を反応させ，該２′−ナフトールＡ
Ｓ類リン酸体をジアゾニウム塩とカップリングさせて，
アゾ色素を得る。その後，上記アゾ色素に励起光を照射
することにより，アゾ色素から発生する蛍光を検出す
る。これにより，上記ＲＮＡ又は染色体ＤＮＡの特定塩
基配列部位を検出することができる。
【００２４】また，上記核酸プローブと上記ホスファタ
ーゼとを結合するに当たっては，一般に，ホスファター
ゼには抗体を，核酸プローブには抗原をそれぞれ結合さ
せた後，この抗体と抗原とを反応させることが行われ
る。また，本発明においては，ホスファターゼとして，
アルカリホスファターゼや酸性ホスファターゼのどちら
にも適用することができる。
ーゼとを結合するに当たっては，一般に，ホスファター
ゼには抗体を，核酸プローブには抗原をそれぞれ結合さ
せた後，この抗体と抗原とを反応させることが行われ
る。また，本発明においては，ホスファターゼとして，
アルカリホスファターゼや酸性ホスファターゼのどちら
にも適用することができる。
【００２５】上記ジアゾニウム塩は，２─ビフェニルジ
アゾニウムクロライド，４─メトキシ─２─ビフェニル
ジアゾニウムクロライド，３─ビフェニルジアゾニウム
クロライド，４─メトキシ─３─ビフェニルジアゾニウ
ムクロライド，２─トルエンジアゾニウムクロライド，
４─クロロ─２─トルエンジアゾニウムクロライド，３
─ブロモ─６─トルエンジアゾニウムクロライド，３─
ブロモ─４─トルエンジアゾニウムクロライド，２─メ
トキシベンゼンジアゾニウムクロライド，２，４─ジメ
トキシベンゼンジアゾニウムクロライド，３─クロロ─
４，６─ジメトキシベンゼンジアゾニウムクロライド，
２─ブロモベンゼンジアゾニウムクロライド，３─アセ
トアミドベンゼンジアゾニウムクロライド，ナフタレン
ジアゾニウムクロライド，３─ヒドロキシ─２─ナフタ
レンジアゾニウムクロライド，２─アントラセンジアゾ
ニウムクロライド，２’，４’−ジメトキシ─４─スチ
ルベンジアゾニウムクロライド，ベンゾチアゾールジア
ゾニウムクロライド，５─ジエチルアミノスルフォニル
─２─メトキシベンゼンジアゾニウムクロライド，４─
メトキシ─２─ニトロジアゾニウムクロライド，２─メ
トキシ─４─ニトロベンゼンジアゾニウム塩，ｐ−ニト
ロベンゼンジアゾニウムテトラフルオロボーレイト，２
─メトキシ─５─クロロベンゼンジアゾニウムクロライ
ド，及び２─メトキシ─３─ジベンゾフランジアゾニウ
ム塩のグループから選ばれたいずれか１種以上のジアゾ
ニウム化合物等である。
アゾニウムクロライド，４─メトキシ─２─ビフェニル
ジアゾニウムクロライド，３─ビフェニルジアゾニウム
クロライド，４─メトキシ─３─ビフェニルジアゾニウ
ムクロライド，２─トルエンジアゾニウムクロライド，
４─クロロ─２─トルエンジアゾニウムクロライド，３
─ブロモ─６─トルエンジアゾニウムクロライド，３─
ブロモ─４─トルエンジアゾニウムクロライド，２─メ
トキシベンゼンジアゾニウムクロライド，２，４─ジメ
トキシベンゼンジアゾニウムクロライド，３─クロロ─
４，６─ジメトキシベンゼンジアゾニウムクロライド，
２─ブロモベンゼンジアゾニウムクロライド，３─アセ
トアミドベンゼンジアゾニウムクロライド，ナフタレン
ジアゾニウムクロライド，３─ヒドロキシ─２─ナフタ
レンジアゾニウムクロライド，２─アントラセンジアゾ
ニウムクロライド，２’，４’−ジメトキシ─４─スチ
ルベンジアゾニウムクロライド，ベンゾチアゾールジア
ゾニウムクロライド，５─ジエチルアミノスルフォニル
─２─メトキシベンゼンジアゾニウムクロライド，４─
メトキシ─２─ニトロジアゾニウムクロライド，２─メ
トキシ─４─ニトロベンゼンジアゾニウム塩，ｐ−ニト
ロベンゼンジアゾニウムテトラフルオロボーレイト，２
─メトキシ─５─クロロベンゼンジアゾニウムクロライ
ド，及び２─メトキシ─３─ジベンゾフランジアゾニウ
ム塩のグループから選ばれたいずれか１種以上のジアゾ
ニウム化合物等である。
【００２６】
【作用及び効果】本発明の検出方法によれば，２′−ナ
フトールＡＳ類リン酸体は，ホスファターゼ存在下でジ
アゾニウム塩と結合し，アゾ色素を生成する。このアゾ
色素は，安定な構造を有し，従来の蛍光物質よりも強い
蛍光を発する。また，その蛍光時間も約３０分間以上で
あり，長時間に渡って蛍光し続ける。それ故，ホスファ
ターゼを高感度で検出することができ，例えば組織中や
細胞中のＲＮＡ，又は染色体ＤＮＡをより高感度に検出
することができる。
フトールＡＳ類リン酸体は，ホスファターゼ存在下でジ
アゾニウム塩と結合し，アゾ色素を生成する。このアゾ
色素は，安定な構造を有し，従来の蛍光物質よりも強い
蛍光を発する。また，その蛍光時間も約３０分間以上で
あり，長時間に渡って蛍光し続ける。それ故，ホスファ
ターゼを高感度で検出することができ，例えば組織中や
細胞中のＲＮＡ，又は染色体ＤＮＡをより高感度に検出
することができる。
【００２７】特に，ジアゾニウム塩として，ビフェニル
ジアゾニウムクロライド系のジアゾニウム塩を用いた場
合には，より感度を向上させることができる。従って，
本発明の検出方法によれば，通常の照射光の下で操作す
ることができ，作業性が良い。また，蛍光検出を暗室で
行う必要もない。上記の効果は，上記アゾ色素が，安定
な構造を有し，細胞，組織，又は染色体への沈着能に優
れた物質であるためであると推定される。
ジアゾニウムクロライド系のジアゾニウム塩を用いた場
合には，より感度を向上させることができる。従って，
本発明の検出方法によれば，通常の照射光の下で操作す
ることができ，作業性が良い。また，蛍光検出を暗室で
行う必要もない。上記の効果は，上記アゾ色素が，安定
な構造を有し，細胞，組織，又は染色体への沈着能に優
れた物質であるためであると推定される。
【００２８】また，強い励起光源下においても褪色が少
ないため，特性的解析のみでなく，定量的解析にも適用
することができる。さらに，２′−ナフトールＡＳ類リ
ン酸体は，ホスファターゼとの反応前では，無蛍光であ
るので，反応液中で容易に発光シグナルを検出して，ホ
スファターゼの有無を容易に確認することができる。
ないため，特性的解析のみでなく，定量的解析にも適用
することができる。さらに，２′−ナフトールＡＳ類リ
ン酸体は，ホスファターゼとの反応前では，無蛍光であ
るので，反応液中で容易に発光シグナルを検出して，ホ
スファターゼの有無を容易に確認することができる。
【００２９】また，上記ＲＮＡ，染色体ＤＮＡに核酸プ
ローブをハイブリダイゼーションさせた後，本発明のホ
スファターゼの検出方法を行なうことにより，ＲＮＡや
染色体ＤＮＡの特定塩基配列部位の存在位置を知ること
ができる。また，ＲＮＡや染色体ＤＮＡの特定塩基配列
部位の存在位置を知るに当たって，該特定塩基配列部位
を染色体全体像とともに，同一の撮影画像に写し出すこ
とができる。そのため，画像処理が容易である。また，
励起光のディフュージョンが少なく，画像が鮮明であ
る。また，励起光の観察には，一般的な蛍光顕微鏡を用
いることができる。
ローブをハイブリダイゼーションさせた後，本発明のホ
スファターゼの検出方法を行なうことにより，ＲＮＡや
染色体ＤＮＡの特定塩基配列部位の存在位置を知ること
ができる。また，ＲＮＡや染色体ＤＮＡの特定塩基配列
部位の存在位置を知るに当たって，該特定塩基配列部位
を染色体全体像とともに，同一の撮影画像に写し出すこ
とができる。そのため，画像処理が容易である。また，
励起光のディフュージョンが少なく，画像が鮮明であ
る。また，励起光の観察には，一般的な蛍光顕微鏡を用
いることができる。
【００３０】また，ジアゾニウム塩の種類を選択するこ
とにより，蛍光シグナルの波長を変えることができる。
そのため，数種の核酸プローブを用いる多色蛍光検出系
にも利用することができる。例えば，ＦＩＴＣプローブ
と一緒に用いる場合にはＨＮＰＰ及び４−クロロ−２−
トルエンジアゾニウムクロライドを使用し，一方ＴＲＩ
ＴＣプローブと一緒に用いる場合にはＨＮＰＰ及びｐ−
ニトロベンゼンジアゾニウムテトラフルオロボーレイト
を，それぞれ使用する。このとき，前者は赤色に，後者
は黄色に発色する。
とにより，蛍光シグナルの波長を変えることができる。
そのため，数種の核酸プローブを用いる多色蛍光検出系
にも利用することができる。例えば，ＦＩＴＣプローブ
と一緒に用いる場合にはＨＮＰＰ及び４−クロロ−２−
トルエンジアゾニウムクロライドを使用し，一方ＴＲＩ
ＴＣプローブと一緒に用いる場合にはＨＮＰＰ及びｐ−
ニトロベンゼンジアゾニウムテトラフルオロボーレイト
を，それぞれ使用する。このとき，前者は赤色に，後者
は黄色に発色する。
【００３１】こうして生成した蛍光性のアゾ色素は，従
来の蛍光物質よりも強い蛍光を有するとともに，組織も
しくは染色体への沈着能に優れた物質であるため，組織
中もしくは細胞中のＲＮＡ，又は染色体ＤＮＡを，より
高感度に検出できる。従って，本発明によれば，インサ
イチュハイブリダイゼーションにおいて，ホスファター
ゼで標識された組織中もしくは細胞中のＲＮＡ，又は染
色体ＤＮＡを，より高感度に検出することができる。以
上のごとく，本発明によれば，強い蛍光を長時間発生さ
せることができ，操作性に優れた，ホスファターゼの検
出方法を提供することができる。
来の蛍光物質よりも強い蛍光を有するとともに，組織も
しくは染色体への沈着能に優れた物質であるため，組織
中もしくは細胞中のＲＮＡ，又は染色体ＤＮＡを，より
高感度に検出できる。従って，本発明によれば，インサ
イチュハイブリダイゼーションにおいて，ホスファター
ゼで標識された組織中もしくは細胞中のＲＮＡ，又は染
色体ＤＮＡを，より高感度に検出することができる。以
上のごとく，本発明によれば，強い蛍光を長時間発生さ
せることができ，操作性に優れた，ホスファターゼの検
出方法を提供することができる。
【００３２】
実施例１ 本例においては，マウス腎臓凍結組織標本中のホスファ
ターゼに，２′−ナフトールＡＳ類リン酸体としての前
記ＨＮＰＰを反応させ，更に該ＨＮＰＰに２−ビフェニ
ルジアゾニウムクロライドを結合させてアゾ色素を得
た。該アゾ色素に励起光を照射し，該励起光の照射によ
り発生する蛍光を検出した。以下，これを詳説する。
ターゼに，２′−ナフトールＡＳ類リン酸体としての前
記ＨＮＰＰを反応させ，更に該ＨＮＰＰに２−ビフェニ
ルジアゾニウムクロライドを結合させてアゾ色素を得
た。該アゾ色素に励起光を照射し，該励起光の照射によ
り発生する蛍光を検出した。以下，これを詳説する。
【００３３】 ２−ビフェニルジアゾニウムクロライ
ドの調製 まず，ｏ−アミノビフェニル５００ｍｇ（０．００３０
ｍｏｌ）を１３．６％塩酸２．４ｍｌ（４モル当量）に
溶かし，超音波処理を１０分したのち，氷温に保つ。氷
温下２５％亜硝酸ナトリウム水溶液０．８ｍｌ（１モル
当量）を攪拌しながらゆっくり滴下する。滴下後，氷温
下で２時間攪拌したのち，飽和塩化亜鉛０．６ｍｌを氷
温下で，攪拌しながら加える。これにより，ジアゾニウ
ムクロライドの塩化亜鉛ダブル塩が析出する。
ドの調製 まず，ｏ−アミノビフェニル５００ｍｇ（０．００３０
ｍｏｌ）を１３．６％塩酸２．４ｍｌ（４モル当量）に
溶かし，超音波処理を１０分したのち，氷温に保つ。氷
温下２５％亜硝酸ナトリウム水溶液０．８ｍｌ（１モル
当量）を攪拌しながらゆっくり滴下する。滴下後，氷温
下で２時間攪拌したのち，飽和塩化亜鉛０．６ｍｌを氷
温下で，攪拌しながら加える。これにより，ジアゾニウ
ムクロライドの塩化亜鉛ダブル塩が析出する。
【００３４】次いで，時々攪拌しながら，０℃で２時間
放置する。次いで，吸引濾過し，ｃｏｌｄエーテルで洗
い，風乾する。これにより，２−ビフェニルジアゾニウ
ムクロライド塩化亜鉛ダブル塩６５０ｍｇを得た。
放置する。次いで，吸引濾過し，ｃｏｌｄエーテルで洗
い，風乾する。これにより，２−ビフェニルジアゾニウ
ムクロライド塩化亜鉛ダブル塩６５０ｍｇを得た。
【００３５】反応溶液の調製 次に，ｐＨ８のトリス塩酸バッファー（Ｔｒｉｓ−ＨＣ
ｌ １００ｍＭ，ＮａＣｌ １００ｍＭ，ＭｇＣｌ2
５０ｍＭ）にＨＮＰＰを１００μｇ／ｍｌの濃度で溶か
した基質溶液と，上記２−ビフェニルジアゾニウムクロ
ライド塩化亜鉛ダブル塩をジメチルホルムアミドに２５
０μｇ／ｍｌの濃度で溶かしたジアゾニウム溶液とを混
合し，反応溶液を調製した。
ｌ １００ｍＭ，ＮａＣｌ １００ｍＭ，ＭｇＣｌ2
５０ｍＭ）にＨＮＰＰを１００μｇ／ｍｌの濃度で溶か
した基質溶液と，上記２−ビフェニルジアゾニウムクロ
ライド塩化亜鉛ダブル塩をジメチルホルムアミドに２５
０μｇ／ｍｌの濃度で溶かしたジアゾニウム溶液とを混
合し，反応溶液を調製した。
【００３６】マウス腎臓凍結組織標本上でのホスファ
ターゼの検出 次に，マウスより腎臓を摘出して−１５℃で凍結させた
後，厚さ約１０ミクロンに切って凍結組織切片を作成し
た。次に，この凍結組織切片を−１５℃のアセトンに数
時間以上浸したのち，４℃の４％パラホルムアミド中で
２０分間スライドグラス上に固定し，リン酸バッファー
（ＮａＣｌ １３０ｍＭ，Ｎａ2 ＨＰＯ4 ７ｍＭ，Ｎ
ａＨ2 ＰＯ4 ３０ｍＭ）で５分ずつ三回洗い，４℃の
リン酸バッファー中で保存した。
ターゼの検出 次に，マウスより腎臓を摘出して−１５℃で凍結させた
後，厚さ約１０ミクロンに切って凍結組織切片を作成し
た。次に，この凍結組織切片を−１５℃のアセトンに数
時間以上浸したのち，４℃の４％パラホルムアミド中で
２０分間スライドグラス上に固定し，リン酸バッファー
（ＮａＣｌ １３０ｍＭ，Ｎａ2 ＨＰＯ4 ７ｍＭ，Ｎ
ａＨ2 ＰＯ4 ３０ｍＭ）で５分ずつ三回洗い，４℃の
リン酸バッファー中で保存した。
【００３７】次に，上記反応溶液中に，上記凍結組織切
片をのせたスライドグラスを浸し，室温にて約５分間反
応を行った。反応後，水で三回洗い，よく水を切った
後，グリセロールを滴下して封入した。
片をのせたスライドグラスを浸し，室温にて約５分間反
応を行った。反応後，水で三回洗い，よく水を切った
後，グリセロールを滴下して封入した。
【００３８】次に，蛍光顕微鏡で，スライドグラス上の
組織切片より発せられる蛍光シグナルの観察を行ったと
ころ，図４（写真，顕微鏡倍率：１００倍，絞り：開
口，露出時間：３０秒）に，偏平状又は粒状の島部分で
示されるように，強い赤色の蛍光が検出された。
組織切片より発せられる蛍光シグナルの観察を行ったと
ころ，図４（写真，顕微鏡倍率：１００倍，絞り：開
口，露出時間：３０秒）に，偏平状又は粒状の島部分で
示されるように，強い赤色の蛍光が検出された。
【００３９】実施例２ 本例においては，ジアゾニウム塩として，実施例１にお
いて用いた２−ビフェニルジアゾニウムクロライドに代
えて，下記のジアゾニウム塩をそれぞれ用い，このもの
と前記ＨＮＰＰとを用いて，実施例１と同様にして，マ
ウス腎臓凍結組織中のホスファターゼを検出した。
いて用いた２−ビフェニルジアゾニウムクロライドに代
えて，下記のジアゾニウム塩をそれぞれ用い，このもの
と前記ＨＮＰＰとを用いて，実施例１と同様にして，マ
ウス腎臓凍結組織中のホスファターゼを検出した。
【００４０】即ち，本例に用いたジアゾニウム塩は，下
記の各種のものである。４─メトキシ─２─ビフェニル
ジアゾニウムクロライド，３─ビフェニルジアゾニウム
クロライド，４─メトキシ─３─ビフェニルジアゾニウ
ムクロライド，２─トルエンジアゾニウムクロライド，
４─クロロ─２─トルエンジアゾニウムクロライド，３
─ブロモ─６─トルエンジアゾニウムクロライド，３─
ブロモ─４─トルエンジアゾニウムクロライド，
記の各種のものである。４─メトキシ─２─ビフェニル
ジアゾニウムクロライド，３─ビフェニルジアゾニウム
クロライド，４─メトキシ─３─ビフェニルジアゾニウ
ムクロライド，２─トルエンジアゾニウムクロライド，
４─クロロ─２─トルエンジアゾニウムクロライド，３
─ブロモ─６─トルエンジアゾニウムクロライド，３─
ブロモ─４─トルエンジアゾニウムクロライド，
【００４１】２─メトキシベンゼンジアゾニウムクロラ
イド，２，４─ジメトキシベンゼンジアゾニウムクロラ
イド，３─クロロ─４，６─ジメトキシベンゼンジアゾ
ニウムクロライド，２─ブロモベンゼンジアゾニウムク
ロライド，３─アセトアミドベンゼンジアゾニウムクロ
ライド，ナフタレンジアゾニウムクロライド，
イド，２，４─ジメトキシベンゼンジアゾニウムクロラ
イド，３─クロロ─４，６─ジメトキシベンゼンジアゾ
ニウムクロライド，２─ブロモベンゼンジアゾニウムク
ロライド，３─アセトアミドベンゼンジアゾニウムクロ
ライド，ナフタレンジアゾニウムクロライド，
【００４２】３─ヒドロキシ─２─ナフタレンジアゾニ
ウムクロライド，２─アントラセンジアゾニウムクロラ
イド，２’，４’−ジメトキシ─４─スチルベンジアゾ
ニウムクロライド，ベンゾチアゾールジアゾニウムクロ
ライド，５─ジエチルアミノスルフォニル─２─メトキ
シベンゼンジアゾニウムクロライド，
ウムクロライド，２─アントラセンジアゾニウムクロラ
イド，２’，４’−ジメトキシ─４─スチルベンジアゾ
ニウムクロライド，ベンゾチアゾールジアゾニウムクロ
ライド，５─ジエチルアミノスルフォニル─２─メトキ
シベンゼンジアゾニウムクロライド，
【００４３】４─メトキシ─２─ニトロジアゾニウムク
ロライド，２─メトキシ─４─ニトロベンゼンジアゾニ
ウム塩，ｐ−ニトロベンゼンジアゾニウムテトラフルオ
ロボーレイト，２─メトキシ─５─クロロベンゼンジア
ゾニウムクロライド，及び２─メトキシ─３─ジベンゾ
フランジアゾニウムクロライド。
ロライド，２─メトキシ─４─ニトロベンゼンジアゾニ
ウム塩，ｐ−ニトロベンゼンジアゾニウムテトラフルオ
ロボーレイト，２─メトキシ─５─クロロベンゼンジア
ゾニウムクロライド，及び２─メトキシ─３─ジベンゾ
フランジアゾニウムクロライド。
【００４４】そして，この結果を全て同じ条件（顕微鏡
倍率：１００倍，絞り：開口，露出時間：３０秒）で撮
像したところ，実施例１と同様に，極めて強い赤色の蛍
光が検出できることがわかった。上記各種ジアゾニウム
塩を用いた場合の，上記ホスファターゼの検出結果を図
５〜図１５に示した。
倍率：１００倍，絞り：開口，露出時間：３０秒）で撮
像したところ，実施例１と同様に，極めて強い赤色の蛍
光が検出できることがわかった。上記各種ジアゾニウム
塩を用いた場合の，上記ホスファターゼの検出結果を図
５〜図１５に示した。
【００４５】即ち，図５には４─メトキシ─２─ビフェ
ニルジアゾニウムクロライドを，図６には３─ビフェニ
ルジアゾニウムクロライドを，図７には４─メトキシ─
３─ビフェニルジアゾニウムクロライドを，図８には４
─クロロ─２─トルエンジアゾニウムクロライドを，図
９には２─トルエンジアゾニウムクロライドを用いた場
合に示した。
ニルジアゾニウムクロライドを，図６には３─ビフェニ
ルジアゾニウムクロライドを，図７には４─メトキシ─
３─ビフェニルジアゾニウムクロライドを，図８には４
─クロロ─２─トルエンジアゾニウムクロライドを，図
９には２─トルエンジアゾニウムクロライドを用いた場
合に示した。
【００４６】また，同様に，図１０には３─ブロモ─６
─トルエンジアゾニウムクロライドを，図１１には３─
ブロモ─４─トルエンジアゾニウムクロライドを，図１
２には２─メトキシベンゼンジアゾニウムクロライド
を，図１３には２，４─ジメトキシベンゼンジアゾニウ
ムクロライドを，図１４にはベンゾチアゾールジアゾニ
ウムクロライドを，図１５には２─メトキシ─３─ジベ
ンゾフランジアゾニウムクロライドを用いた場合につい
て示した。
─トルエンジアゾニウムクロライドを，図１１には３─
ブロモ─４─トルエンジアゾニウムクロライドを，図１
２には２─メトキシベンゼンジアゾニウムクロライド
を，図１３には２，４─ジメトキシベンゼンジアゾニウ
ムクロライドを，図１４にはベンゾチアゾールジアゾニ
ウムクロライドを，図１５には２─メトキシ─３─ジベ
ンゾフランジアゾニウムクロライドを用いた場合につい
て示した。
【００４７】図５〜図１５のうち，図７と図１２は，上
記撮影写真をトレースしたものである。他の図は，上記
撮影写真である。上記の各図から知られるように，ホス
ファターゼの存在する位置には，極めて強い赤色の蛍光
が検出された。即ち，上記の図７，図１２においては，
黒線で囲まれた偏平状或いは粒状の島部分が上記蛍光部
分を示している。また，他の写真においては，粒状，偏
平状等に白色がかって見える部分が上記蛍光部分を示し
ている。また，写真では差異を検出しにくいが，図５〜
図７に示すように，ビフェニルジアゾニウムクロライド
系のジアゾニウム塩を用いた場合には，バックグラウン
ドが低く，特に明確に判断することができる。
記撮影写真をトレースしたものである。他の図は，上記
撮影写真である。上記の各図から知られるように，ホス
ファターゼの存在する位置には，極めて強い赤色の蛍光
が検出された。即ち，上記の図７，図１２においては，
黒線で囲まれた偏平状或いは粒状の島部分が上記蛍光部
分を示している。また，他の写真においては，粒状，偏
平状等に白色がかって見える部分が上記蛍光部分を示し
ている。また，写真では差異を検出しにくいが，図５〜
図７に示すように，ビフェニルジアゾニウムクロライド
系のジアゾニウム塩を用いた場合には，バックグラウン
ドが低く，特に明確に判断することができる。
【００４８】実施例３ 本例においては，マウス腎臓凍結組織中のホスファター
ゼを検出した。そして，実施例１で用いたＨＮＰＰと２
−ビフェニルジアゾニウムクラロイドとを混合した反応
溶液の代わりに，ＨＮＰＰとＦａｓｔ Ｒｅｄ Ｂ（ｇ
ｒｅｅｎ）（ＳＩＧＭＡ社製）〔２−メトキシ−４−ニ
トロベンゼンジアゾニウムクロライド〕とを用いて反応
溶液を調製した。反応溶液中のＨＮＰＰの濃度は１００
μｇ／ｍｌ，上記Ｆａｓｔ Ｒｅｄ Ｂ（ｇｒｅｅｎ）
の濃度は２．５ｍｇ／ｍｌとした。
ゼを検出した。そして，実施例１で用いたＨＮＰＰと２
−ビフェニルジアゾニウムクラロイドとを混合した反応
溶液の代わりに，ＨＮＰＰとＦａｓｔ Ｒｅｄ Ｂ（ｇ
ｒｅｅｎ）（ＳＩＧＭＡ社製）〔２−メトキシ−４−ニ
トロベンゼンジアゾニウムクロライド〕とを用いて反応
溶液を調製した。反応溶液中のＨＮＰＰの濃度は１００
μｇ／ｍｌ，上記Ｆａｓｔ Ｒｅｄ Ｂ（ｇｒｅｅｎ）
の濃度は２．５ｍｇ／ｍｌとした。
【００４９】その他については，実施例１と同様にマウ
ス腎臓凍結組織標本上でのホスファターゼの検出を行っ
た。蛍光顕微鏡でスライドグラス上の組織切片より発せ
られる蛍光シグナルの観察を行ったところ，図１６（写
真，顕微鏡倍率：１００倍，絞り：開口，露出時間：３
０秒）に，偏平状又は粒状の島部分で示されるように，
強い黄色の蛍光が検出された。
ス腎臓凍結組織標本上でのホスファターゼの検出を行っ
た。蛍光顕微鏡でスライドグラス上の組織切片より発せ
られる蛍光シグナルの観察を行ったところ，図１６（写
真，顕微鏡倍率：１００倍，絞り：開口，露出時間：３
０秒）に，偏平状又は粒状の島部分で示されるように，
強い黄色の蛍光が検出された。
【００５０】実施例４ 本例においては，キイロショウジョウバエ唾線染色体標
本における特異的ＤＮＡ配列（ｉｎ ｓｉｔｕ）の検出
を行った。即ち，まず，Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌ
ａｎｏｇａｓｔｅｒの３齢幼虫より唾線を取り出し，ス
ライドグラス上に展開し，検体ＤＮＡを０．０７ＮのＮ
ａＯＨ溶液中でアルカリ変性させた。次に，Ｇ６ＰＤ
（Ｇｌｕｃｏｓｅ−６−Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ｄｅｈｙ
ｄｒｏｇｅｎａｓｅ）遺伝子配列の一部を核酸プローブ
としてハイブリダイゼーションを行った。
本における特異的ＤＮＡ配列（ｉｎ ｓｉｔｕ）の検出
を行った。即ち，まず，Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌ
ａｎｏｇａｓｔｅｒの３齢幼虫より唾線を取り出し，ス
ライドグラス上に展開し，検体ＤＮＡを０．０７ＮのＮ
ａＯＨ溶液中でアルカリ変性させた。次に，Ｇ６ＰＤ
（Ｇｌｕｃｏｓｅ−６−Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ｄｅｈｙ
ｄｒｏｇｅｎａｓｅ）遺伝子配列の一部を核酸プローブ
としてハイブリダイゼーションを行った。
【００５１】核酸プローブはランダムプライム法により
ディゴキシゲニンで標識した。ハイブリダイゼーション
後の洗いののち，仔ウシ血清アルブミンによりブロッキ
ング処理を行ない，ベーリンガーマンハイム社のプロト
コールに従い，アルカリホスファターゼ標識抗ディゴキ
シゲニン抗体を，ディゴキシゲニンに，結合させた。
ディゴキシゲニンで標識した。ハイブリダイゼーション
後の洗いののち，仔ウシ血清アルブミンによりブロッキ
ング処理を行ない，ベーリンガーマンハイム社のプロト
コールに従い，アルカリホスファターゼ標識抗ディゴキ
シゲニン抗体を，ディゴキシゲニンに，結合させた。
【００５２】次に，余分な抗体を洗った後，ＨＮＰＰ及
びＦａｓｔ Ｒｅｄ ＴＲ〔４−クロロ−２−メチルベ
ンゼンジアゾニウムクロライド〕の入った反応溶液（Ｈ
ＮＰＰ：１００μｍ，Ｆａｓｔ Ｒｅｄ ＴＲ：２．５
ｍｇ／ｍｌ）へ上記スライドグラスを浸し，３７℃で２
時間反応させたところ，染色体上に赤色のバンドが検出
された。
びＦａｓｔ Ｒｅｄ ＴＲ〔４−クロロ−２−メチルベ
ンゼンジアゾニウムクロライド〕の入った反応溶液（Ｈ
ＮＰＰ：１００μｍ，Ｆａｓｔ Ｒｅｄ ＴＲ：２．５
ｍｇ／ｍｌ）へ上記スライドグラスを浸し，３７℃で２
時間反応させたところ，染色体上に赤色のバンドが検出
された。
【００５３】比較例１ 本比較例においては，実施例１で用いたＨＮＰＰの代わ
りに，同量のＮａｐｈｔｈｏｌ ＡＳ−ＭＸ Ｐｈｏｓ
ｐｈａｔｅ〔３−ヒドロキシ−Ｎ，２′，４′−ジメチ
ルフェニルナフタレンカルボキシアミドホスフェートエ
ステル〕を用いて基質溶液を調製し，その他は実施例１
と同様に，マウス腎臓凍結組織標本上でのホスファター
ゼの検出を行った。結果は図１７の写真に示すように，
蛍光が実施例１と比較して著しく弱いものであった。即
ち，図１７は，上記ホスファターゼの検出結果として，
実施例１と同様に撮影写真をトレースしたものである。
同図において，黒線で囲まれた偏平状或いは粒状の島部
分が上記ホスファターゼの蛍光部分を示している。
りに，同量のＮａｐｈｔｈｏｌ ＡＳ−ＭＸ Ｐｈｏｓ
ｐｈａｔｅ〔３−ヒドロキシ−Ｎ，２′，４′−ジメチ
ルフェニルナフタレンカルボキシアミドホスフェートエ
ステル〕を用いて基質溶液を調製し，その他は実施例１
と同様に，マウス腎臓凍結組織標本上でのホスファター
ゼの検出を行った。結果は図１７の写真に示すように，
蛍光が実施例１と比較して著しく弱いものであった。即
ち，図１７は，上記ホスファターゼの検出結果として，
実施例１と同様に撮影写真をトレースしたものである。
同図において，黒線で囲まれた偏平状或いは粒状の島部
分が上記ホスファターゼの蛍光部分を示している。
【００５４】比較例２ 本比較例においては，実施例１で用いたＨＮＰＰの代わ
りに，同量のＮａｐｈｔｈｏｌ ＡＳ−ＢＩ Ｐｈｏｓ
ｐｈａｔｅ〔７−ブロモ−３−ヒドロキシ−Ｎ，２′−
メトキシフェニルナフタレンカルボキシアミドホスフェ
ートエステル〕を用いて基質溶液を調製し，その他は実
施例１と同様に，マウス腎臓凍結組織標本上でのホスフ
ァターゼの検出を行った。結果は，比較例１と同様に蛍
光が著しく弱いものであった。
りに，同量のＮａｐｈｔｈｏｌ ＡＳ−ＢＩ Ｐｈｏｓ
ｐｈａｔｅ〔７−ブロモ−３−ヒドロキシ−Ｎ，２′−
メトキシフェニルナフタレンカルボキシアミドホスフェ
ートエステル〕を用いて基質溶液を調製し，その他は実
施例１と同様に，マウス腎臓凍結組織標本上でのホスフ
ァターゼの検出を行った。結果は，比較例１と同様に蛍
光が著しく弱いものであった。
【００５５】実施例５ 本例においては，３−ヒドロキシ−Ｎ−２′−ビフェニ
ル−２−ナフタレンカルボキシアミドホスフェートエス
テル（ＨＮＰＰ）と，２−ビフェニルジアゾニウムクロ
ライドとを合成し，これらを用いてマウス腎臓凍結組織
中のホスファターゼを検出した。以下，これを詳説す
る。
ル−２−ナフタレンカルボキシアミドホスフェートエス
テル（ＨＮＰＰ）と，２−ビフェニルジアゾニウムクロ
ライドとを合成し，これらを用いてマウス腎臓凍結組織
中のホスファターゼを検出した。以下，これを詳説す
る。
【００５６】ＨＮＰＰの合成法 まず，２−ヒドロキシ−３−ナフトエ酸１８ｇ（０．１
ｍｏｌ）と脱水キシレン２００ｍｌと２−アミノビフェ
ニル１５ｇ（０．０９ｍｏｌ）とを，ジムロート冷却管
を付けた３００ｃｃ容量ナス型フラスコに入れ，８０℃
で１０分間攪拌する。
ｍｏｌ）と脱水キシレン２００ｍｌと２−アミノビフェ
ニル１５ｇ（０．０９ｍｏｌ）とを，ジムロート冷却管
を付けた３００ｃｃ容量ナス型フラスコに入れ，８０℃
で１０分間攪拌する。
【００５７】次いで，三塩化リン（０．０３ｍｏｌ）を
加え，この混合物を２時間還流する。その後，その反応
液を熱いままデカンテーションして上清液を取る。次い
で，この上清液を４℃で冷却し，沈澱物を析出される。
次いで，この沈澱物を濾過し，キシレンにより洗い，更
に蒸留水で洗う。次に，この沈澱物を３％塩酸水溶液に
入れ，加熱した後濾過し，冷却し，沈澱物を析出され
る。その後，この沈澱物を熱水で洗い，乾燥する。次い
で，この沈澱物を再結晶化させて，化学式「化５」で表
される３−ヒドロキシ−Ｎ−２′−ビフェニル−２−ナ
フタレンカルボキシアミドを得た。
加え，この混合物を２時間還流する。その後，その反応
液を熱いままデカンテーションして上清液を取る。次い
で，この上清液を４℃で冷却し，沈澱物を析出される。
次いで，この沈澱物を濾過し，キシレンにより洗い，更
に蒸留水で洗う。次に，この沈澱物を３％塩酸水溶液に
入れ，加熱した後濾過し，冷却し，沈澱物を析出され
る。その後，この沈澱物を熱水で洗い，乾燥する。次い
で，この沈澱物を再結晶化させて，化学式「化５」で表
される３−ヒドロキシ−Ｎ−２′−ビフェニル−２−ナ
フタレンカルボキシアミドを得た。
【００５８】
【化５】
【００５９】次いで，この３−ヒドロキシ−Ｎ−２′−
ビフェニル−２−ナフタレンカルボキシアミド５．０９
ｇ（０．０１５ｍｏｌ）をジオキサン２００ｍｌに溶か
し，五塩化リン１５．６ｇ（０．０７５ｍｏｌ）を加え
て，５０℃で１時間攪拌する。そして，４００ｍｌの氷
冷水にゆっくり流し込み，結晶化させ，これを濾過す
る。
ビフェニル−２−ナフタレンカルボキシアミド５．０９
ｇ（０．０１５ｍｏｌ）をジオキサン２００ｍｌに溶か
し，五塩化リン１５．６ｇ（０．０７５ｍｏｌ）を加え
て，５０℃で１時間攪拌する。そして，４００ｍｌの氷
冷水にゆっくり流し込み，結晶化させ，これを濾過す
る。
【００６０】次に，この濾過された結晶を十分乾燥させ
た後，できるだけ微量のＮ，Ｎ′−ジメチルホルムアミ
ドに溶解させる。そして，この溶液を０．２Ｎ炭酸ナト
リウム水溶液に注ぎ，そのまま０℃で２時間攪拌する。
次いで，この溶液中の結晶を２回吸引濾過して除去し
た。次に，０．４５μｍのろ過紙のついたミニカップ
（ミリポア社製）で再度吸引濾過し，その濾液に３Ｎ塩
酸を加え，再結晶化させた。次に，この結晶を含む懸濁
液を濾過し，十分蒸留水で洗った後，乾燥させて，上記
化３式に示すＨＮＰＰ（３−ヒドロキシ−Ｎ−２′−ビ
フェニル−２−ナフタレンカルボキシアミドホスフェー
トエステル）１．４ｇを得た。
た後，できるだけ微量のＮ，Ｎ′−ジメチルホルムアミ
ドに溶解させる。そして，この溶液を０．２Ｎ炭酸ナト
リウム水溶液に注ぎ，そのまま０℃で２時間攪拌する。
次いで，この溶液中の結晶を２回吸引濾過して除去し
た。次に，０．４５μｍのろ過紙のついたミニカップ
（ミリポア社製）で再度吸引濾過し，その濾液に３Ｎ塩
酸を加え，再結晶化させた。次に，この結晶を含む懸濁
液を濾過し，十分蒸留水で洗った後，乾燥させて，上記
化３式に示すＨＮＰＰ（３−ヒドロキシ−Ｎ−２′−ビ
フェニル−２−ナフタレンカルボキシアミドホスフェー
トエステル）１．４ｇを得た。
【００６１】 ２−ビフェニルジアゾニウムクロライ
ドの合成法 まず，ｏ−アミノビフェニル５００ｍｇを１３．６％塩
酸に懸濁させ，超音波処理を１０分間行なった後，氷温
下に保つ。次いで，氷温下で２５％亜硝酸ナトリウム水
溶液８１２μｌを加え，０℃で２時間攪拌した。そして
攪拌しながら，飽和塩化亜鉛水溶液６００μｌを加え
て，さらに０℃で時々攪拌しながら２時間放置し，結晶
を析出させた。次いで，この結晶を濾過して，冷エーテ
ルで洗った後，十分風乾して，２−ビフェニルジアゾニ
ウムクロライド塩化亜鉛ダブル塩６５０ｍｇを得た。
ドの合成法 まず，ｏ−アミノビフェニル５００ｍｇを１３．６％塩
酸に懸濁させ，超音波処理を１０分間行なった後，氷温
下に保つ。次いで，氷温下で２５％亜硝酸ナトリウム水
溶液８１２μｌを加え，０℃で２時間攪拌した。そして
攪拌しながら，飽和塩化亜鉛水溶液６００μｌを加え
て，さらに０℃で時々攪拌しながら２時間放置し，結晶
を析出させた。次いで，この結晶を濾過して，冷エーテ
ルで洗った後，十分風乾して，２−ビフェニルジアゾニ
ウムクロライド塩化亜鉛ダブル塩６５０ｍｇを得た。
【００６２】 反応溶液の調製 次に，ｐＨ８のトリス塩酸バッファー中に，上記ＨＮＰ
Ｐ及び２─ビフェニルジアゾニウムクロライドを溶解さ
せて，反応溶液を調製した。この反応溶液において，Ｈ
ＮＰＰは２．５×１０-4ｍｏｌ／リットル，２─ビフェ
ニルジアゾニウムクロライドは８．８×１０-4ｍｏｌ／
リットルである。
Ｐ及び２─ビフェニルジアゾニウムクロライドを溶解さ
せて，反応溶液を調製した。この反応溶液において，Ｈ
ＮＰＰは２．５×１０-4ｍｏｌ／リットル，２─ビフェ
ニルジアゾニウムクロライドは８．８×１０-4ｍｏｌ／
リットルである。
【００６３】 マウス腎臓凍結組織標本上でのホスフ
ァターゼの検出 次に，マウスより腎臓を摘出し，−１５℃で凍結させ凍
結組織切片を作成した。−１５℃のアセトンに数時間以
上浸したのち，４℃の４％パラホルムアミド中で２０分
間スライドグラス上に固定し，リン酸バッファーで５分
ずつ３回洗い，４℃のリン酸バッファー中で保存した。
ァターゼの検出 次に，マウスより腎臓を摘出し，−１５℃で凍結させ凍
結組織切片を作成した。−１５℃のアセトンに数時間以
上浸したのち，４℃の４％パラホルムアミド中で２０分
間スライドグラス上に固定し，リン酸バッファーで５分
ずつ３回洗い，４℃のリン酸バッファー中で保存した。
【００６４】次に，上記凍結組織切片をのせたスライド
グラスを上記反応溶液中に浸し，室温にて約５分間反応
を行った。反応後，水で三回洗い，よく水を切った後，
グリセロールで封入した。次に，蛍光顕微鏡により，凍
結組織切片中のホスファターゼの蛍光シグナルの観察を
行ったところ，図１８に，偏平状又は粒状の島部分で示
されるように，強い赤色の蛍光が検出された。
グラスを上記反応溶液中に浸し，室温にて約５分間反応
を行った。反応後，水で三回洗い，よく水を切った後，
グリセロールで封入した。次に，蛍光顕微鏡により，凍
結組織切片中のホスファターゼの蛍光シグナルの観察を
行ったところ，図１８に，偏平状又は粒状の島部分で示
されるように，強い赤色の蛍光が検出された。
【００６５】この際に，比較のため，市販のＮａｐｈｔ
ｈｏｌ ＡＳ−ＭＸ Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ及びＮａｐｈ
ｔｈｏｌ ＡＳ−ＢＩ Ｐｈｏｓｐｈａｔｅと比較した
が，前者の蛍光はＨＮＰＰを用いた場合に比べ著しく弱
かった。また，後者においては，更に弱く検出が困難で
あった。
ｈｏｌ ＡＳ−ＭＸ Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ及びＮａｐｈ
ｔｈｏｌ ＡＳ−ＢＩ Ｐｈｏｓｐｈａｔｅと比較した
が，前者の蛍光はＨＮＰＰを用いた場合に比べ著しく弱
かった。また，後者においては，更に弱く検出が困難で
あった。
【００６６】実施例６ 本例においては，以下に示す〜の各ジアゾニウム塩
を用いて，実施例５と同様にマウス腎臓凍結組織中のア
ルカリフォスファターゼを検出した。 Ｆａｓｔ Ｒｅｄ ＴＲ（ｒｅｄ）〔４−クロロ−２
−メチルベンゼンジアゾニウムクロライド〕， Ｆａｓｔ Ｒｅｄ Ｂ（ｇｒｅｅｎ）〔２−メトキシ
−４−ニトロベンゼンジアゾニウムクロライド〕， Ｆａｓｔ Ｒｅｄ ＧＧ（ｇｒｅｅｎ）〔４−ニトロ
ベンゼンジアゾニウムクロライド〕，
を用いて，実施例５と同様にマウス腎臓凍結組織中のア
ルカリフォスファターゼを検出した。 Ｆａｓｔ Ｒｅｄ ＴＲ（ｒｅｄ）〔４−クロロ−２
−メチルベンゼンジアゾニウムクロライド〕， Ｆａｓｔ Ｒｅｄ Ｂ（ｇｒｅｅｎ）〔２−メトキシ
−４−ニトロベンゼンジアゾニウムクロライド〕， Ｆａｓｔ Ｒｅｄ ＧＧ（ｇｒｅｅｎ）〔４−ニトロ
ベンゼンジアゾニウムクロライド〕，
【００６７】Ｆａｓｔ Ｂｏｒｄａｕｘ ＧＰ（ｒｅ
ｄ）〔４−メトキシ−２−ニトロベンゼンジアゾニウム
クロライド〕， Ｆａｓｔ Ｒｅｄ ＩＴＲ（ｇｒｅｅｎ）〔５−ジエ
チルアミノスルホニル−２−メトキシベンゼンジアゾニ
ウムクロライド〕， Ｎａｐｈｔｈａｎｉｌ Ｄｉａｚｏ Ｒｅｄ ＲＣ
（ｒｅｄ）〔５−クロロ−２−メトキシベンゼンジアゾ
ニウムクロライド〕， Ｎａｐｈｔｈｔａｌｅｎｅ ｄｉａｚｏｕｉｕｍ ｓ
ａｌｔ， ３−ｍｅｔｈｏｘｙｄｉｂｅｎｚｏｆｕｒａｎ ｄｉ
ａｚｏｕｍｉｕｍ ｓａｌｔ。 その結果，実施例５と同様に強い蛍光が検出された。
ｄ）〔４−メトキシ−２−ニトロベンゼンジアゾニウム
クロライド〕， Ｆａｓｔ Ｒｅｄ ＩＴＲ（ｇｒｅｅｎ）〔５−ジエ
チルアミノスルホニル−２−メトキシベンゼンジアゾニ
ウムクロライド〕， Ｎａｐｈｔｈａｎｉｌ Ｄｉａｚｏ Ｒｅｄ ＲＣ
（ｒｅｄ）〔５−クロロ−２−メトキシベンゼンジアゾ
ニウムクロライド〕， Ｎａｐｈｔｈｔａｌｅｎｅ ｄｉａｚｏｕｉｕｍ ｓ
ａｌｔ， ３−ｍｅｔｈｏｘｙｄｉｂｅｎｚｏｆｕｒａｎ ｄｉ
ａｚｏｕｍｉｕｍ ｓａｌｔ。 その結果，実施例５と同様に強い蛍光が検出された。
【００６８】実施例７ 本例においては，マウス肝臓凍結組織標本上でのホスフ
ァターゼの検出を行った。即ち，まず，ｐＨ８のトリス
塩酸バッファー中に，実施例５と同様のＨＮＰＰ及び２
−ビフェニルジアゾニウムクロライドを溶解させて，反
応溶液を調製した。
ァターゼの検出を行った。即ち，まず，ｐＨ８のトリス
塩酸バッファー中に，実施例５と同様のＨＮＰＰ及び２
−ビフェニルジアゾニウムクロライドを溶解させて，反
応溶液を調製した。
【００６９】また，マウスより肝臓を摘出し，液体窒素
で凍結させ凍結組織切片を作成した。−７０℃のアセト
ンに一晩浸したのち，４℃で保存した。次に，上記凍結
組織切片を９５％エタノールに浸し，スライドグラス上
にのせ，これを乾燥させた。次に，このスライドグラス
を上記反応溶液中に浸し，３７℃にて約５分間反応を行
った。反応後，このスライドグラスを水で洗い，水で封
入した。
で凍結させ凍結組織切片を作成した。−７０℃のアセト
ンに一晩浸したのち，４℃で保存した。次に，上記凍結
組織切片を９５％エタノールに浸し，スライドグラス上
にのせ，これを乾燥させた。次に，このスライドグラス
を上記反応溶液中に浸し，３７℃にて約５分間反応を行
った。反応後，このスライドグラスを水で洗い，水で封
入した。
【００７０】次に，蛍光顕微鏡により，図１９に示すご
とく，凍結組織切片中のホスファターゼの蛍光シグナル
の観察を行ったところ，強い赤色の蛍光が検出された。
図１９は，上記組織の顕微鏡写真（倍率１００倍）をト
レースしたものである。同図中，黒い曲線状部分が，上
記ホスファターゼの蛍光部分を示している。この際に，
比較例のため，市販のＮａｐｈｔｈｏｌ ＡＳ−ＭＸ
Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ及びＮａｐｈｔｈｏｌ ＡＳ−ＢＩ
Ｐｈｏｓｐｈａｔｅと比較した。前者の蛍光はＨＮＰ
Ｐを用いた場合に比べ，著しく弱かった。また，後者の
場合には，更に蛍光が弱く，検出困難であった。
とく，凍結組織切片中のホスファターゼの蛍光シグナル
の観察を行ったところ，強い赤色の蛍光が検出された。
図１９は，上記組織の顕微鏡写真（倍率１００倍）をト
レースしたものである。同図中，黒い曲線状部分が，上
記ホスファターゼの蛍光部分を示している。この際に，
比較例のため，市販のＮａｐｈｔｈｏｌ ＡＳ−ＭＸ
Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ及びＮａｐｈｔｈｏｌ ＡＳ−ＢＩ
Ｐｈｏｓｐｈａｔｅと比較した。前者の蛍光はＨＮＰ
Ｐを用いた場合に比べ，著しく弱かった。また，後者の
場合には，更に蛍光が弱く，検出困難であった。
【００７１】実施例８ 本例においては，ヒト中期染色体標本上でのヒトのαサ
テライトＤＮＡの検出（マルチコピーの検出）を行っ
た。即ち，まず，ヒト末梢血リンパ球より作成した中期
染色体標本を，７５℃で１０分間加熱して変性させた。
次に，ＰＣＲによりビオチン標識したヒトのαサテライ
トＤＮＡを作成し，これを核酸プローブとして上記中期
染色体にハイブリダイゼーション（ｉｎ ｓｉｔｕ）を
行った。次に，上記核酸プローブをハイブリダイゼーシ
ョンさせた上記中期染色体を洗った。
テライトＤＮＡの検出（マルチコピーの検出）を行っ
た。即ち，まず，ヒト末梢血リンパ球より作成した中期
染色体標本を，７５℃で１０分間加熱して変性させた。
次に，ＰＣＲによりビオチン標識したヒトのαサテライ
トＤＮＡを作成し，これを核酸プローブとして上記中期
染色体にハイブリダイゼーション（ｉｎ ｓｉｔｕ）を
行った。次に，上記核酸プローブをハイブリダイゼーシ
ョンさせた上記中期染色体を洗った。
【００７２】次に，この中期染色体に，脱脂粉乳水溶液
を用いてブロッキング処理を施し，アルカリホスファタ
ーゼ標識抗ビチオン抗体を結合させた。次に，余分な抗
体を除去し，ＨＮＰＰ及び２−ビフェニルジアゾニウム
クロライドを溶解させた反応溶液中において，室温雰囲
気中で３０分間反応させた。染色体はヘキスト−キナク
リンで対比染色した。次に，蛍光顕微鏡を用いて，上記
染色体の観察を行ったところ，図２０に示すごとく，染
色体のセントロメア領域に強い赤色の蛍光シグナルが検
出できた。また，同一の撮影画像上で，鮮明な染色体の
青い蛍光分染パターンが検出できた。即ち，上記図２０
は，上記染色体に顕微鏡写真をトレースしたものであ
る。同図中，長尺状部分２（斜線部分）は染色体の蛍光
分染パターンを示す。また，長尺状部分２の中に示され
る黒丸１は，染色体中のセントロメア領域の赤い蛍光シ
グナルを示す。
を用いてブロッキング処理を施し，アルカリホスファタ
ーゼ標識抗ビチオン抗体を結合させた。次に，余分な抗
体を除去し，ＨＮＰＰ及び２−ビフェニルジアゾニウム
クロライドを溶解させた反応溶液中において，室温雰囲
気中で３０分間反応させた。染色体はヘキスト−キナク
リンで対比染色した。次に，蛍光顕微鏡を用いて，上記
染色体の観察を行ったところ，図２０に示すごとく，染
色体のセントロメア領域に強い赤色の蛍光シグナルが検
出できた。また，同一の撮影画像上で，鮮明な染色体の
青い蛍光分染パターンが検出できた。即ち，上記図２０
は，上記染色体に顕微鏡写真をトレースしたものであ
る。同図中，長尺状部分２（斜線部分）は染色体の蛍光
分染パターンを示す。また，長尺状部分２の中に示され
る黒丸１は，染色体中のセントロメア領域の赤い蛍光シ
グナルを示す。
【００７３】実施例９ 本例においては，ヒト染色体標本上でのヒトのｃ−ｍｙ
ｃ遺伝子の検出（シングルコピーの検出）を行った。即
ち，まず，ヒトの末梢血リンパ球より作成した染色体標
本を，７５℃で１０分間加熱して変性させた。次に，ニ
ックトランスレーションによりビオチン標識したヒトの
ｃ−ｍｙｃ遺伝子（２．４ｋｂ）を核酸プローブとし
て，上記変性染色体標本にハイブリダイゼーション（ｉ
ｎ ｓｉｔｕ）させた。次に，実施例８と同様に処理を
行った後，ＨＮＰＰ１００μｇ／ｍｌ及び２−ビフェニ
ルジアゾニウムクロライド２５０μｇ／ｍｌを溶解させ
た反応溶液中において，室温下で３０分間ずつ４回繰り
返し反応させた。染色体はヘキスト−キナクリンで対比
染色した。
ｃ遺伝子の検出（シングルコピーの検出）を行った。即
ち，まず，ヒトの末梢血リンパ球より作成した染色体標
本を，７５℃で１０分間加熱して変性させた。次に，ニ
ックトランスレーションによりビオチン標識したヒトの
ｃ−ｍｙｃ遺伝子（２．４ｋｂ）を核酸プローブとし
て，上記変性染色体標本にハイブリダイゼーション（ｉ
ｎ ｓｉｔｕ）させた。次に，実施例８と同様に処理を
行った後，ＨＮＰＰ１００μｇ／ｍｌ及び２−ビフェニ
ルジアゾニウムクロライド２５０μｇ／ｍｌを溶解させ
た反応溶液中において，室温下で３０分間ずつ４回繰り
返し反応させた。染色体はヘキスト−キナクリンで対比
染色した。
【００７４】次に，蛍光顕微鏡を用いて，上記染色体を
観察したところ，図２１に示すごとく，第８染色体に強
い赤色の蛍光シグナルが検出できた。また，同一の撮影
画像上に鮮明な緑色の染色体の蛍光分染パターンが検出
できた。即ち，上記図２１は，上記第８染色体の顕微鏡
写真をトレースしたものである。同図中，偏平部分４
（斜線部分）は第８染色体の緑色の蛍光分染パターンを
示す。また，偏平部分４の中に示される黒丸３は，赤色
の蛍光シグナルを示す。また，本例においては，２．４
ｋｂという短鎖の核酸プローブを特定塩基配列部位にハ
イブリダイゼーションさせて，該特定塩基配列部位を検
出することができた。
観察したところ，図２１に示すごとく，第８染色体に強
い赤色の蛍光シグナルが検出できた。また，同一の撮影
画像上に鮮明な緑色の染色体の蛍光分染パターンが検出
できた。即ち，上記図２１は，上記第８染色体の顕微鏡
写真をトレースしたものである。同図中，偏平部分４
（斜線部分）は第８染色体の緑色の蛍光分染パターンを
示す。また，偏平部分４の中に示される黒丸３は，赤色
の蛍光シグナルを示す。また，本例においては，２．４
ｋｂという短鎖の核酸プローブを特定塩基配列部位にハ
イブリダイゼーションさせて，該特定塩基配列部位を検
出することができた。
【００７５】実施例１０ 本例においては，ＨＮＭＰＰ（３─ヒドロキシ─Ｎ−
２’─メチルフェニル─２─ナフタレンカルボキシアミ
ドホスフェート）を合成し，これを用いて実施例５と同
様にマウス腎臓凍結組織標本上でのホスファターゼの検
出を行った。
２’─メチルフェニル─２─ナフタレンカルボキシアミ
ドホスフェート）を合成し，これを用いて実施例５と同
様にマウス腎臓凍結組織標本上でのホスファターゼの検
出を行った。
【００７６】即ち，まず，２─ヒドロキシ─３─ナフト
エ酸５ｇ（０．０２７ｍｏｌ）と脱水キシレン４０ｍｌ
と２─アミノトルエン（０．０２３ｍｏｌ）をジムロー
ト冷却管を付けた３００ｃｃ容量ナス型フラスコに入
れ，８０℃で１０分間攪拌する。次いで，三塩化リン
（０．０１ｍｏｌ）を加える。そして，この混合物を２
時間還流する。次に，その反応液を熱いままデカンテー
ションして上清液を取る。次いで，この上清液を４℃に
冷却し，析出した沈澱物を濾過する。
エ酸５ｇ（０．０２７ｍｏｌ）と脱水キシレン４０ｍｌ
と２─アミノトルエン（０．０２３ｍｏｌ）をジムロー
ト冷却管を付けた３００ｃｃ容量ナス型フラスコに入
れ，８０℃で１０分間攪拌する。次いで，三塩化リン
（０．０１ｍｏｌ）を加える。そして，この混合物を２
時間還流する。次に，その反応液を熱いままデカンテー
ションして上清液を取る。次いで，この上清液を４℃に
冷却し，析出した沈澱物を濾過する。
【００７７】次に，この沈澱物をキシレン，次いで蒸留
水で洗浄する。次いで，この沈澱物を３％塩酸水溶液に
入れ，加熱した後，これを濾過し，冷却する。次いで，
濾別された沈澱物を熱水で洗い，乾燥する。次に，この
沈澱物を再結晶して，以下に示す化学式「化６」で表さ
れる３─ヒドロキシ─Ｎ−２’─メチルフェニル─２─
ナフタレンカルボキシアミドを得た。
水で洗浄する。次いで，この沈澱物を３％塩酸水溶液に
入れ，加熱した後，これを濾過し，冷却する。次いで，
濾別された沈澱物を熱水で洗い，乾燥する。次に，この
沈澱物を再結晶して，以下に示す化学式「化６」で表さ
れる３─ヒドロキシ─Ｎ−２’─メチルフェニル─２─
ナフタレンカルボキシアミドを得た。
【００７８】
【化６】
【００７９】次に，この３─ヒドロキシ─Ｎ−２’─メ
チルフェニル─２─ナフタレンカルボキシアミド５ｇ
（０．０１５ｍｏｌ）をジオキサン２００ｍｌに溶か
し，五塩化リン１５．６ｇ（０．０７５ｍｏｌ）を加え
て，５０℃で１時間攪拌する。そして，４００ｍｌの氷
冷水中にゆっくり流し込み，結晶化させ，その結晶を濾
過する。次に，この結晶を充分乾燥させ，できるだけ微
量のＮ，Ｎ’−ジメチルホルムアミドに溶解させる。次
に，この溶液を０．２Ｎ炭酸ナトリウム水溶液に注ぎ，
そのまま０℃で２時間攪拌する。
チルフェニル─２─ナフタレンカルボキシアミド５ｇ
（０．０１５ｍｏｌ）をジオキサン２００ｍｌに溶か
し，五塩化リン１５．６ｇ（０．０７５ｍｏｌ）を加え
て，５０℃で１時間攪拌する。そして，４００ｍｌの氷
冷水中にゆっくり流し込み，結晶化させ，その結晶を濾
過する。次に，この結晶を充分乾燥させ，できるだけ微
量のＮ，Ｎ’−ジメチルホルムアミドに溶解させる。次
に，この溶液を０．２Ｎ炭酸ナトリウム水溶液に注ぎ，
そのまま０℃で２時間攪拌する。
【００８０】次に，この炭酸ナトリウム水溶液中の結晶
を２回吸引濾過して除去し，さらにミニカップ（ミリポ
ア社製）で吸引濾過する。次に，その濾液に３Ｎ塩酸を
加え，結晶化させる。次に，この懸濁液を濾過し，十分
蒸留水で洗った後，乾燥させる。これにより，前記化３
式で表される３─ヒドロキシ─Ｎ−２’─メチルフェニ
ル─２─ナフタレンカルボキシアミドホスフェート８０
０ｍｇを得た。
を２回吸引濾過して除去し，さらにミニカップ（ミリポ
ア社製）で吸引濾過する。次に，その濾液に３Ｎ塩酸を
加え，結晶化させる。次に，この懸濁液を濾過し，十分
蒸留水で洗った後，乾燥させる。これにより，前記化３
式で表される３─ヒドロキシ─Ｎ−２’─メチルフェニ
ル─２─ナフタレンカルボキシアミドホスフェート８０
０ｍｇを得た。
【００８１】次に，得られた３−ヒドロキシ−Ｎ−２’
−メチルフェニル−２−ナフタレンカルボキシアミドホ
スフェートを用いて，実施例５と同様にしてマウス腎臓
凍結組織標本上でのホスファターゼの検出を行った。そ
の結果，図２２に，偏平状又は粒状の島部分で示される
ように，マウス腎臓凍結組織切片中のホスファターゼの
蛍光シグナルが強い赤色の蛍光として検出された。
−メチルフェニル−２−ナフタレンカルボキシアミドホ
スフェートを用いて，実施例５と同様にしてマウス腎臓
凍結組織標本上でのホスファターゼの検出を行った。そ
の結果，図２２に，偏平状又は粒状の島部分で示される
ように，マウス腎臓凍結組織切片中のホスファターゼの
蛍光シグナルが強い赤色の蛍光として検出された。
【００８２】実施例１１ 本例においては，７─ブロモ─３─ヒドロキシ─Ｎ−
２’─ビフェニル─２─ナフタレンカルボキシアミドホ
スフェートエステルを合成し，これを用いて実施例５と
同様にマウス腎臓凍結組織標本上でのホスファターゼの
検出を行った。
２’─ビフェニル─２─ナフタレンカルボキシアミドホ
スフェートエステルを合成し，これを用いて実施例５と
同様にマウス腎臓凍結組織標本上でのホスファターゼの
検出を行った。
【００８３】即ち，まず，塩化シアヌール５ｇをアセト
ン１００ｍｌに溶かした後，ナフトールＡＳ−ＢＩ（Ｓ
ｉｇｍａ製）１０ｇを加え，更に１０％仮性ソーダ２４
ｍｌを加え，３時間攪拌した。そして，３％仮性ソーダ
５００ｍｌを勢いよく注ぎ入れ，６０℃で５時間攪拌し
た後，更に一晩室温で攪拌する。
ン１００ｍｌに溶かした後，ナフトールＡＳ−ＢＩ（Ｓ
ｉｇｍａ製）１０ｇを加え，更に１０％仮性ソーダ２４
ｍｌを加え，３時間攪拌した。そして，３％仮性ソーダ
５００ｍｌを勢いよく注ぎ入れ，６０℃で５時間攪拌し
た後，更に一晩室温で攪拌する。
【００８４】次に，この溶液を濾過し，その濾液中のア
セトンをエバポレーターで除去した。次いで，この溶液
に濃塩酸を加える。そして，析出してきた結晶を酢酸エ
チルで抽出し，脱水した後，乾燥する。これにより，７
─ブロモ─３─ヒドロキシ─Ｎ−２─ナフタレンカルボ
ン酸を得た。
セトンをエバポレーターで除去した。次いで，この溶液
に濃塩酸を加える。そして，析出してきた結晶を酢酸エ
チルで抽出し，脱水した後，乾燥する。これにより，７
─ブロモ─３─ヒドロキシ─Ｎ−２─ナフタレンカルボ
ン酸を得た。
【００８５】次に，この７─ブロモ─３─ヒドロキシ─
Ｎ−２─ナフタレンカルボン酸５ｇ（０．０２７ｍｏ
ｌ）と脱水キシレン４０ｍｌと２─アミノビフェニル
（０．０２３ｍｏｌ）とを，ジムロート冷却管を付けた
１００ｍｌ容量ナス型フラスコに入れ，８０℃で１０分
間攪拌する。
Ｎ−２─ナフタレンカルボン酸５ｇ（０．０２７ｍｏ
ｌ）と脱水キシレン４０ｍｌと２─アミノビフェニル
（０．０２３ｍｏｌ）とを，ジムロート冷却管を付けた
１００ｍｌ容量ナス型フラスコに入れ，８０℃で１０分
間攪拌する。
【００８６】次いで，三塩化リン（０．０１ｍｏｌ）を
加え，この混合物を２時間還流する。次に，この反応液
を熱いままデカンテーションして上清液を取る。次い
で，この上清液を４℃に冷却し，沈澱物を析出させる。
そして，この沈澱物を濾過し，キシレン，次いで蒸留水
で洗う。次に，この沈澱物を３％塩酸水溶液に入れ，加
熱した後，濾過し，冷却する。次に，沈澱物を熱水で洗
い，乾燥する。次に，この沈澱物を再結晶して，化学式
「化７」で表される７─ブロモ─３─ヒドロキシ─Ｎ−
２’─ビフェニル─２─ナフタレンカルボキシアミドを
得た。
加え，この混合物を２時間還流する。次に，この反応液
を熱いままデカンテーションして上清液を取る。次い
で，この上清液を４℃に冷却し，沈澱物を析出させる。
そして，この沈澱物を濾過し，キシレン，次いで蒸留水
で洗う。次に，この沈澱物を３％塩酸水溶液に入れ，加
熱した後，濾過し，冷却する。次に，沈澱物を熱水で洗
い，乾燥する。次に，この沈澱物を再結晶して，化学式
「化７」で表される７─ブロモ─３─ヒドロキシ─Ｎ−
２’─ビフェニル─２─ナフタレンカルボキシアミドを
得た。
【００８７】
【化７】
【００８８】次に，この７─ブロモ─３─ヒドロキシ─
Ｎ−２’─ビフェニル─２─ナフタレンカルボキシアミ
ド４ｇ（０．０１ｍｏｌ）をジオキサン１２０ｍｌに溶
かし，五塩化リン１１．２６ｇ（０．０５ｍｏｌ）を加
えて，５０℃で１時間攪拌する。そして，２５０ｍｌの
氷冷水にゆっくり流し込み，結晶化させ，その結晶を濾
過する。この結晶を十分乾燥させた後，できるだけ微量
のＮ，Ｎ’─ジメチルホルムアミドに溶解させる。
Ｎ−２’─ビフェニル─２─ナフタレンカルボキシアミ
ド４ｇ（０．０１ｍｏｌ）をジオキサン１２０ｍｌに溶
かし，五塩化リン１１．２６ｇ（０．０５ｍｏｌ）を加
えて，５０℃で１時間攪拌する。そして，２５０ｍｌの
氷冷水にゆっくり流し込み，結晶化させ，その結晶を濾
過する。この結晶を十分乾燥させた後，できるだけ微量
のＮ，Ｎ’─ジメチルホルムアミドに溶解させる。
【００８９】次いで，この溶液を０．２Ｎ炭酸ナトリウ
ム水溶液に注ぎ，そのまま０℃で２時間攪拌する。そし
て，その間に析出した結晶を２回吸引濾過した。次い
で，ミニカップ（ミリポア社製）で吸引濾過し，そのろ
液にＮＨＣｌを加え，結晶化させた。次に，この懸濁液
を吸引濾過し，得られた結晶を乾燥させた。これによ
り，「化８」で表される７─ブロモ─３─ヒドロキシ─
Ｎ−２’─ビフェニル─２─ナフタレンカルボキシアミ
ドホスフェートエステル１．１９ｇを得た。
ム水溶液に注ぎ，そのまま０℃で２時間攪拌する。そし
て，その間に析出した結晶を２回吸引濾過した。次い
で，ミニカップ（ミリポア社製）で吸引濾過し，そのろ
液にＮＨＣｌを加え，結晶化させた。次に，この懸濁液
を吸引濾過し，得られた結晶を乾燥させた。これによ
り，「化８」で表される７─ブロモ─３─ヒドロキシ─
Ｎ−２’─ビフェニル─２─ナフタレンカルボキシアミ
ドホスフェートエステル１．１９ｇを得た。
【００９０】
【化８】
【００９１】次に，得られた７−ブロモ−３−ヒドロキ
シ−Ｎ−２’−ビフェニル−２−ナフタレンカルボキシ
アミドホスフェートエステルを用いて，実施例５と同様
にしてマウス腎臓凍結組織標本上でのホスファターゼの
検出を行った。その結果，実施例５の同様に，図２３
に，偏平状又は粒状の島部分で示されるように，マウス
腎臓凍結組織切片中のホスファターゼの蛍光シグナルが
強い赤色の蛍光として検出された。
シ−Ｎ−２’−ビフェニル−２−ナフタレンカルボキシ
アミドホスフェートエステルを用いて，実施例５と同様
にしてマウス腎臓凍結組織標本上でのホスファターゼの
検出を行った。その結果，実施例５の同様に，図２３
に，偏平状又は粒状の島部分で示されるように，マウス
腎臓凍結組織切片中のホスファターゼの蛍光シグナルが
強い赤色の蛍光として検出された。
【００９２】実施例１２ 本例においては，実施例５と同様の方法により，マウス
腎臓凍結組織標本中のホスファターゼを検出した場合の
ｄｉｆｆｕｓｉｏｎ度合及びアゾ色素の比蛍光強度，励
起波長（λｅｘ），蛍光波長（λｅｍ）を測定した。本
検出方法においては，図２４に示すごとく，２′−ナフ
トールＡＳ類リン酸体としてＨＮＰＰを２種類のジアゾ
ニウム塩と反応させた（試料１，２）。これらのジアゾ
ニウム塩は，ベンゼン環の２位モノ置換体である。
腎臓凍結組織標本中のホスファターゼを検出した場合の
ｄｉｆｆｕｓｉｏｎ度合及びアゾ色素の比蛍光強度，励
起波長（λｅｘ），蛍光波長（λｅｍ）を測定した。本
検出方法においては，図２４に示すごとく，２′−ナフ
トールＡＳ類リン酸体としてＨＮＰＰを２種類のジアゾ
ニウム塩と反応させた（試料１，２）。これらのジアゾ
ニウム塩は，ベンゼン環の２位モノ置換体である。
【００９３】また，比較例として，ジアゾニウム塩にお
けるベンゼン環の４位の水素（Ｈ）が塩素（Ｃｌ）に置
換されたもの（試料３）と，２位及び５位の水素がＣ6
Ｈ5とＯＣＨ3 に置換されたもの（試料４）と，２位及
び４位の水素がＣＨ3 とＢｒに置換されたもの（試料
５）とについても，上記と同様の測定を行なった。
けるベンゼン環の４位の水素（Ｈ）が塩素（Ｃｌ）に置
換されたもの（試料３）と，２位及び５位の水素がＣ6
Ｈ5とＯＣＨ3 に置換されたもの（試料４）と，２位及
び４位の水素がＣＨ3 とＢｒに置換されたもの（試料
５）とについても，上記と同様の測定を行なった。
【００９４】その結果を図２５に示した。図２５中，
「Ｘ3 」は，図２４に示すごとく，アゾ色素において，
アゾ基に結合したベンゼン環及び該ベンゼン環の側鎖を
示す。「Ｐｈ」はＣ6 Ｈ5 （フェニル基）を示す。「λ
ｅｘ」は，励起波長を示す。「λｅｍ」は，蛍光波長を
示す。「比ＦＬ」は，相対比蛍光強度を示し，次の実施
例１３における試料６を１とし，本例の試料１〜５と比
較した。また，「ｄｉｆｆｕｓｉｏｎ」は，組織標本中
での蛍光領域の拡散を示し，「△」は中程度の拡散を，
「×」は拡散の程度が大きいことを示す。
「Ｘ3 」は，図２４に示すごとく，アゾ色素において，
アゾ基に結合したベンゼン環及び該ベンゼン環の側鎖を
示す。「Ｐｈ」はＣ6 Ｈ5 （フェニル基）を示す。「λ
ｅｘ」は，励起波長を示す。「λｅｍ」は，蛍光波長を
示す。「比ＦＬ」は，相対比蛍光強度を示し，次の実施
例１３における試料６を１とし，本例の試料１〜５と比
較した。また，「ｄｉｆｆｕｓｉｏｎ」は，組織標本中
での蛍光領域の拡散を示し，「△」は中程度の拡散を，
「×」は拡散の程度が大きいことを示す。
【００９５】同図より，本発明にかかる試料１，２のよ
うに，ベンゼン環の２位にフェニル基又はメチル基を有
するジアゾニウム塩は，比ＦＬが高く，ｄｉｆｆｕｓｉ
ｏｎも全くなかった。それに比較して試料３〜５は，比
ＦＬも弱くｄｉｆｆｕｓｉｏｎも見られた。この結果か
ら２位のみへのモノ置換が構造的に良いことが分かる。
うに，ベンゼン環の２位にフェニル基又はメチル基を有
するジアゾニウム塩は，比ＦＬが高く，ｄｉｆｆｕｓｉ
ｏｎも全くなかった。それに比較して試料３〜５は，比
ＦＬも弱くｄｉｆｆｕｓｉｏｎも見られた。この結果か
ら２位のみへのモノ置換が構造的に良いことが分かる。
【００９６】実施例１３ 本例においては，実施例１０にかかる方法により，マウ
ス腎臓凍結標本中のホスファターゼを検出した場合のｄ
ｉｆｕｓｉｏｎ度合い，及びアゾ色素の励起波長，蛍光
波長，相対比蛍光強度を測定した。本検出方法において
は，図２６に示すごとく，２′−ナフトールＡＳ類リン
酸体としてＨＭＮＰＰを２種類のジアゾニウム塩と反応
させた（試料６，７）。
ス腎臓凍結標本中のホスファターゼを検出した場合のｄ
ｉｆｕｓｉｏｎ度合い，及びアゾ色素の励起波長，蛍光
波長，相対比蛍光強度を測定した。本検出方法において
は，図２６に示すごとく，２′−ナフトールＡＳ類リン
酸体としてＨＭＮＰＰを２種類のジアゾニウム塩と反応
させた（試料６，７）。
【００９７】また，比較例として，ジアゾニウム塩にお
けるベンゼン環の４位の水素基がＣｌに置換されたもの
（試料８）と，２位及び５位の水素がＣ6 Ｈ5 とＯＣＨ
3 に置換されたもの（試料９）と，２位及び４位の水素
基がＣＨ3 とＢｒに置換されたもの（試料１０）とにつ
いても，上記と同様の測定を行った。
けるベンゼン環の４位の水素基がＣｌに置換されたもの
（試料８）と，２位及び５位の水素がＣ6 Ｈ5 とＯＣＨ
3 に置換されたもの（試料９）と，２位及び４位の水素
基がＣＨ3 とＢｒに置換されたもの（試料１０）とにつ
いても，上記と同様の測定を行った。
【００９８】その結果を，実施例１２の図２５と同様
に，図２７に示した。また，「比ＦＬ」は，試料６を１
とし，他の試料７〜１０と比較した。同図より，本発明
のように，ジアゾニウム塩のベンゼン環の２位がフェニ
ル基，メチル基であるものはｄｉｆｆｕｓｉｏｎが少な
かった。それに比べて比較例としての試料８〜９は，か
なりｄｉｆｆｕｓｉｏｎしていた。この結果より２位の
みへのモノ置換が構造的には良いことが分かる。
に，図２７に示した。また，「比ＦＬ」は，試料６を１
とし，他の試料７〜１０と比較した。同図より，本発明
のように，ジアゾニウム塩のベンゼン環の２位がフェニ
ル基，メチル基であるものはｄｉｆｆｕｓｉｏｎが少な
かった。それに比べて比較例としての試料８〜９は，か
なりｄｉｆｆｕｓｉｏｎしていた。この結果より２位の
みへのモノ置換が構造的には良いことが分かる。
【図１】本発明の，ＨＮＰＰと２−ビフェニルジアゾニ
ウムクロライドとの反応を示す説明図。
ウムクロライドとの反応を示す説明図。
【図２】本発明の，ＨＮＰＰと４−クロロ−２−トルエ
ンジアゾニウムクロライドとの反応を示す説明図。
ンジアゾニウムクロライドとの反応を示す説明図。
【図３】本発明の，ＨＮＭＰＰとジアゾニウム塩との反
応を示す説明図。
応を示す説明図。
【図４】実施例１の，ＨＮＰＰとジアゾニウム塩（２−
ビフェニルジアゾニウムクロライド）とを用いることに
より，ホスファターゼが検出されたマウス腎臓組織の顕
微鏡写真（倍率１００倍）に示された，生物の形態写
真。
ビフェニルジアゾニウムクロライド）とを用いることに
より，ホスファターゼが検出されたマウス腎臓組織の顕
微鏡写真（倍率１００倍）に示された，生物の形態写
真。
【図５】実施例２の，ＨＮＰＰとジアゾニウム塩（４−
メトキシ−２−ビフェニルジアゾニウムクロライド）と
を用いることにより，ホスファターゼが検出されたマウ
ス腎臓組織の顕微鏡写真（倍率１００倍）に示された，
生物の形態写真。
メトキシ−２−ビフェニルジアゾニウムクロライド）と
を用いることにより，ホスファターゼが検出されたマウ
ス腎臓組織の顕微鏡写真（倍率１００倍）に示された，
生物の形態写真。
【図６】実施例２の，ＨＮＰＰとジアゾニウム塩（３−
ビフェニルジアゾニウムクロライド）とを用いることに
より，ホスファターゼが検出されたマウス腎臓組織の顕
微鏡写真（倍率１００倍）に示された，生物の形態写
真。
ビフェニルジアゾニウムクロライド）とを用いることに
より，ホスファターゼが検出されたマウス腎臓組織の顕
微鏡写真（倍率１００倍）に示された，生物の形態写
真。
【図７】実施例２の，ＨＮＰＰとジアゾニウム塩（４−
メトキシ−３−ビフェニルジアゾニウムクロライド）と
を用いることにより，ホスファターゼが検出されたマウ
ス腎臓組織の顕微鏡写真（倍率１００倍）に示された，
生物の形態説明図。
メトキシ−３−ビフェニルジアゾニウムクロライド）と
を用いることにより，ホスファターゼが検出されたマウ
ス腎臓組織の顕微鏡写真（倍率１００倍）に示された，
生物の形態説明図。
【図８】実施例２の，ＨＮＰＰとジアゾニウム塩（４−
クロロ−２−トルエンジアゾニウムクロライド）とを用
いることにより，ホスファターゼが検出されたマウス腎
臓組織の顕微鏡写真（倍率１００倍）に示された，生物
の形態写真。
クロロ−２−トルエンジアゾニウムクロライド）とを用
いることにより，ホスファターゼが検出されたマウス腎
臓組織の顕微鏡写真（倍率１００倍）に示された，生物
の形態写真。
【図９】実施例２の，ＨＮＰＰとジアゾニウム塩（２−
トルエンジアゾニウムクロライド）とを用いることによ
り，ホスファターゼが検出されたマウス腎臓組織の顕微
鏡写真（倍率１００倍）に示された，生物の形態写真。
トルエンジアゾニウムクロライド）とを用いることによ
り，ホスファターゼが検出されたマウス腎臓組織の顕微
鏡写真（倍率１００倍）に示された，生物の形態写真。
【図１０】実施例２の，ＨＮＰＰとジアゾニウム塩（３
−ブロモ−６−トルエンジアゾニウムクロライド）とを
用いることにより，ホスファターゼが検出されたマウス
腎臓組織の顕微鏡写真（倍率１００倍）に示された，生
物の形態写真。
−ブロモ−６−トルエンジアゾニウムクロライド）とを
用いることにより，ホスファターゼが検出されたマウス
腎臓組織の顕微鏡写真（倍率１００倍）に示された，生
物の形態写真。
【図１１】実施例２の，ＨＮＰＰとジアゾニウム塩（３
−ブロモ−４−トルエンジアゾニウムクロライド）とを
用いることにより，ホスファターゼが検出されたマウス
腎臓組織の顕微鏡写真（倍率１００倍）に示された，生
物の形態写真。
−ブロモ−４−トルエンジアゾニウムクロライド）とを
用いることにより，ホスファターゼが検出されたマウス
腎臓組織の顕微鏡写真（倍率１００倍）に示された，生
物の形態写真。
【図１２】実施例２の，ＨＮＰＰとジアゾニウム塩（２
−メトキシベンゼンジアゾニウムクロライド）とを用い
ることにより，ホスファターゼが検出されたマウス腎臓
組織の顕微鏡写真（倍率１００倍）に示された，生物の
形態説明図。
−メトキシベンゼンジアゾニウムクロライド）とを用い
ることにより，ホスファターゼが検出されたマウス腎臓
組織の顕微鏡写真（倍率１００倍）に示された，生物の
形態説明図。
【図１３】実施例２の，ＨＮＰＰとジアゾニウム塩
（２，４−ジメトキシベンゼンジアゾニウムクロライ
ド）とを用いることにより，ホスファターゼが検出され
たマウス腎臓組織の顕微鏡写真（倍率１００倍）に示さ
れた，生物の形態写真。
（２，４−ジメトキシベンゼンジアゾニウムクロライ
ド）とを用いることにより，ホスファターゼが検出され
たマウス腎臓組織の顕微鏡写真（倍率１００倍）に示さ
れた，生物の形態写真。
【図１４】実施例２の，ＨＮＰＰとジアゾニウム塩（ベ
ンゾチアゾールジアゾニウムクロライド）とを用いるこ
とにより，ホスファターゼが検出されたマウス腎臓組織
の顕微鏡写真（倍率１００倍）に示された，生物の形態
写真。
ンゾチアゾールジアゾニウムクロライド）とを用いるこ
とにより，ホスファターゼが検出されたマウス腎臓組織
の顕微鏡写真（倍率１００倍）に示された，生物の形態
写真。
【図１５】実施例２の，ＨＮＰＰとジアゾニウム塩（２
−メトキシ−３−ジベンゾフランジアゾニウムクロライ
ド）とを用いることにより，ホスファターゼが検出され
たマウス腎臓組織の顕微鏡写真（倍率１００倍）に示さ
れた，生物の形態写真。
−メトキシ−３−ジベンゾフランジアゾニウムクロライ
ド）とを用いることにより，ホスファターゼが検出され
たマウス腎臓組織の顕微鏡写真（倍率１００倍）に示さ
れた，生物の形態写真。
【図１６】実施例３の，ＨＮＰＰとジアゾニウム塩（Ｆ
ａｓｔ Ｒｅｄ Ｂ（ｇｒｅｅｎ））とを用いることに
より，ホスファターゼが検出されたマウス腎臓組織の顕
微鏡写真（倍率１００倍）に示された，生物の形態写
真。
ａｓｔ Ｒｅｄ Ｂ（ｇｒｅｅｎ））とを用いることに
より，ホスファターゼが検出されたマウス腎臓組織の顕
微鏡写真（倍率１００倍）に示された，生物の形態写
真。
【図１７】比較例１の，Ｎａｐｈｔｈｏｌ ＡＳ／ＭＸ
Ｐｈｏｓｐｈａｔｅとジアゾニウム塩（２−ビフェニ
ルジアゾニウムクロライド）とを用いることにより，ホ
スファターゼが検出されたマウス腎臓組織の顕微鏡写真
（倍率１００倍）に示された，生物の形態説明図。
Ｐｈｏｓｐｈａｔｅとジアゾニウム塩（２−ビフェニ
ルジアゾニウムクロライド）とを用いることにより，ホ
スファターゼが検出されたマウス腎臓組織の顕微鏡写真
（倍率１００倍）に示された，生物の形態説明図。
【図１８】実施例５の，ＨＮＰＰと２−ビフェニルジア
ゾニウムクロライドとを用いることにより，ホスファタ
ーゼが検出されたマウス腎臓凍結組織の顕微鏡写真（倍
率１００倍）に示された，生物の形態写真。
ゾニウムクロライドとを用いることにより，ホスファタ
ーゼが検出されたマウス腎臓凍結組織の顕微鏡写真（倍
率１００倍）に示された，生物の形態写真。
【図１９】実施例７の，ＨＮＰＰと２−ビフェニルジア
ゾニウムクロライドとを用いることにより，ホスファタ
ーゼが検出されたマウス肝臓凍結組織の顕微鏡写真（倍
率１００倍）に示された，生物の形態説明図。
ゾニウムクロライドとを用いることにより，ホスファタ
ーゼが検出されたマウス肝臓凍結組織の顕微鏡写真（倍
率１００倍）に示された，生物の形態説明図。
【図２０】実施例８の，ＨＮＰＰと２−ビフェニルジア
ゾニウムクロライドとを用いることにより，ホスファタ
ーゼが検出されたヒト中期染色体におけるαサテライト
ＤＮＡ（マルチコピー）の顕微鏡写真（倍率１００倍）
に示された，生物の形態説明図。
ゾニウムクロライドとを用いることにより，ホスファタ
ーゼが検出されたヒト中期染色体におけるαサテライト
ＤＮＡ（マルチコピー）の顕微鏡写真（倍率１００倍）
に示された，生物の形態説明図。
【図２１】実施例９の，ＨＮＰＰと２−ビフェニルジア
ゾニウムクロライドとを用いることにより，ホスファタ
ーゼが検出されたヒト染色体における単一コピー遺伝子
（ｃ−ｍｙｃ，ｃＤＮＡ ２．４ｋｂ）の顕微鏡写真
（倍率１００倍）に示された，生物の形態説明図。
ゾニウムクロライドとを用いることにより，ホスファタ
ーゼが検出されたヒト染色体における単一コピー遺伝子
（ｃ−ｍｙｃ，ｃＤＮＡ ２．４ｋｂ）の顕微鏡写真
（倍率１００倍）に示された，生物の形態説明図。
【図２２】実施例１０の，ＨＮＭＰＰ（３−ビドロキシ
−Ｎ−２′−メチルフェニル−２−ナフタレンカルボキ
シアミドホスフェート）と２−ビフェニルジアゾニウム
クロライドとを用いることにより，ホスファターゼが検
出されたマウス腎臓凍結組織の顕微鏡写真（倍率１００
倍）に示された，生物の形態写真。
−Ｎ−２′−メチルフェニル−２−ナフタレンカルボキ
シアミドホスフェート）と２−ビフェニルジアゾニウム
クロライドとを用いることにより，ホスファターゼが検
出されたマウス腎臓凍結組織の顕微鏡写真（倍率１００
倍）に示された，生物の形態写真。
【図２３】実施例１１の，７−ブロモ−３−ヒドロキシ
−Ｎ−２′−ビフェニル−２−ナフタレンカルボキシア
ミドホスフェートエステルと２−ビフェニルジアゾニウ
ムクロライドとを用いることにより，ホスファターゼが
検出されたマウス腎臓凍結組織の顕微鏡写真（倍率１０
０倍）に示された，生物の形態写真。
−Ｎ−２′−ビフェニル−２−ナフタレンカルボキシア
ミドホスフェートエステルと２−ビフェニルジアゾニウ
ムクロライドとを用いることにより，ホスファターゼが
検出されたマウス腎臓凍結組織の顕微鏡写真（倍率１０
０倍）に示された，生物の形態写真。
【図２４】実施例１２の，ＨＭＰＰと各種ジアゾニウム
塩との反応を示す説明図。
塩との反応を示す説明図。
【図２５】実施例１２の，ＨＭＰＰと各種ジアゾニウム
塩とを用いてマウス腎臓凍結組織中のホスファターゼの
ｄｉｆｆｕｓｉｏｎ度合い，アゾ色素のλｅｘ，λｅｍ
の値を示す説明図。
塩とを用いてマウス腎臓凍結組織中のホスファターゼの
ｄｉｆｆｕｓｉｏｎ度合い，アゾ色素のλｅｘ，λｅｍ
の値を示す説明図。
【図２６】実施例１３の，ＨＭＮＰＰと各種ジアゾニウ
ム塩との反応を示す説明図。
ム塩との反応を示す説明図。
【図２７】実施例１３の，ＨＭＮＰＰと各種ジアゾニウ
ム塩とを用いてマウス腎臓凍結組織中のホスファターゼ
のｄｉｆｆｕｓｉｏｎ度合い，アゾ色素のλｅｘ，λｅ
ｍの値を示す説明図。
ム塩とを用いてマウス腎臓凍結組織中のホスファターゼ
のｄｉｆｆｕｓｉｏｎ度合い，アゾ色素のλｅｘ，λｅ
ｍの値を示す説明図。
Claims (6)
- 【請求項１】 ホスファターゼに，下記の「化１」の一
般式に示す２′−ナフトールＡＳ類リン酸体を反応させ
て，該２′−ナフトールＡＳ類リン酸体にジアゾニウム
塩をカップリングさせてアゾ色素を得る色素生成工程
と，該アゾ色素に励起光を照射する励起工程と，励起光
の照射により発生する蛍光を検出する検出工程よりな
り，上記２′−ナフトールＡＳ類リン酸体の２′置換基
Ｘ1 は，フェニル基，メチル基，イソプロピル基，又は
メトキシ基のいずれかであることを特徴とするホスファ
ターゼの検出方法。 【化１】 - 【請求項２】 請求項１において，上記ホスファターゼ
は，組織中もしくは細胞中に存在していることを特徴と
するホスファターゼの検出方法。 - 【請求項３】 請求項１，又は２において，上記ホスフ
ァターゼは，核酸プローブ上にあることを特徴とするホ
スファターゼの検出方法。 - 【請求項４】 請求項３において，上記核酸プローブ
は，組織中もしくは細胞中のＲＮＡ，又は染色体ＤＮＡ
とハイブリダイゼーションしていることを特徴とするホ
スファターゼの検出方法。 - 【請求項５】 請求項１において，上記ジアゾニウム塩
は，２─ビフェニルジアゾニウムクロライド，４─メト
キシ─２─ビフェニルジアゾニウムクロライド，３─ビ
フェニルジアゾニウムクロライド，４─メトキシ─３─
ビフェニルジアゾニウムクロライド，２─トルエンジア
ゾニウムクロライド，４─クロロ─２─トルエンジアゾ
ニウムクロライド，３─ブロモ─６─トルエンジアゾニ
ウムクロライド，３─ブロモ─４─トルエンジアゾニウ
ムクロライド，２─メトキシベンゼンジアゾニウムクロ
ライド，２，４─ジメトキシベンゼンジアゾニウムクロ
ライド，３─クロロ─４，６─ジメトキシベンゼンジア
ゾニウムクロライド，２─ブロモベンゼンジアゾニウム
クロライド，３─アセトアミドベンゼンジアゾニウムク
ロライド，ナフタレンジアゾニウムクロライド，３─ヒ
ドロキシ─２─ナフタレンジアゾニウムクロライド，２
─アントラセンジアゾニウムクロライド，２’，４’−
ジメトキシ─４─スチルベンジアゾニウムクロライド，
ベンゾチアゾールジアゾニウムクロライド，５─ジエチ
ルアミノスルフォニル─２─メトキシベンゼンジアゾニ
ウムクロライド，４─メトキシ─２─ニトロジアゾニウ
ムクロライド，２─メトキシ─４─ニトロベンゼンジア
ゾニウム塩，ｐ−ニトロベンゼンジアゾニウムテトラフ
ルオロボーレイト，２─メトキシ─５─クロロベンゼン
ジアゾニウムクロライド，及び２─メトキシ─３─ジベ
ンゾフランジアゾニウム塩のグループから選ばれたいず
れか１種以上のジアゾニウム化合物であることを特徴と
するホスファターゼの検出方法。 - 【請求項６】 請求項１において，上記２′−ナフトー
ルＡＳ類リン酸体は，そのナフタレン環の７位に，Ｂ
ｒ，フェニル基，メチル基，及びイソプロピル基のグル
ープから選ばれたいずれかの置換基を有することを特徴
とするホスファターゼの検出方法。
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