JP2647072B2 - ポリオウイルスｃＤＮＡ - Google Patents
ポリオウイルスｃＤＮＡInfo
- Publication number
- JP2647072B2 JP2647072B2 JP57501652A JP50165282A JP2647072B2 JP 2647072 B2 JP2647072 B2 JP 2647072B2 JP 57501652 A JP57501652 A JP 57501652A JP 50165282 A JP50165282 A JP 50165282A JP 2647072 B2 JP2647072 B2 JP 2647072B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- cdna
- poliovirus
- plasmid
- cells
- dna
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
- C12Q1/701—Specific hybridization probes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
- C12N2770/00011—Details
- C12N2770/32011—Picornaviridae
- C12N2770/32611—Poliovirus
- C12N2770/32622—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/8215—Microorganisms
- Y10S435/822—Microorganisms using bacteria or actinomycetales
- Y10S435/848—Escherichia
- Y10S435/849—Escherichia coli
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Virology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】 〔技術分野〕 本発明は微生物学分野に関し、更に特定すれば遺伝学
的処理をなされた微生物を生産するための組換体DNA技
術に関する。
的処理をなされた微生物を生産するための組換体DNA技
術に関する。
人ピコルナウイルスの一種であるポリオウイルスは重
大な人間の病気の原因なので幅広く研究されている。こ
れらの研究によればポリオウイルスは直径が25〜30nmの
小さな二十面体からなり、VP1,VP2,VP3,VP4と呼ばれる
４種のポリペプチドから構成される。この蛋白コート内
に分子量が2.7×106ダルトンの病原性RNA＋鎖の１本鎖
が封入されている。このサイズは約2500のアミノ酸をコ
ードできる約7500個の塩基に等しい。
大な人間の病気の原因なので幅広く研究されている。こ
れらの研究によればポリオウイルスは直径が25〜30nmの
小さな二十面体からなり、VP1,VP2,VP3,VP4と呼ばれる
４種のポリペプチドから構成される。この蛋白コート内
に分子量が2.7×106ダルトンの病原性RNA＋鎖の１本鎖
が封入されている。このサイズは約2500のアミノ酸をコ
ードできる約7500個の塩基に等しい。
ポリオウイルスに関しては幅広い研究がなされている
が、このウイルスの研究、検出、生産に利用できる現在
の技術にはポリオウイルスに対する抗体を生産するに使
う技術と同様に依然多くの問題がある。例えば、ポリオ
ウイルスRNAをポリオウイルス検出に実際には使用でき
ないことが確認される時に検出技術改良の必要がわか
る。実際に使用できないのはポリオウイルスRNAが供給
不足で、不安定で、通常は他ポリオウイルスRNAに結合
しないからである。
が、このウイルスの研究、検出、生産に利用できる現在
の技術にはポリオウイルスに対する抗体を生産するに使
う技術と同様に依然多くの問題がある。例えば、ポリオ
ウイルスRNAをポリオウイルス検出に実際には使用でき
ないことが確認される時に検出技術改良の必要がわか
る。実際に使用できないのはポリオウイルスRNAが供給
不足で、不安定で、通常は他ポリオウイルスRNAに結合
しないからである。
今日、ポリオウイルスの存在を検出するための主要分
析法はサンプルを、人細胞系を用いてウイルスの存在を
検出するプラーク分析法で分析する生物学的技術であ
る。
析法はサンプルを、人細胞系を用いてウイルスの存在を
検出するプラーク分析法で分析する生物学的技術であ
る。
Dulbecco,R.とVogt,M.との“J.Exptl.Med."99,167頁（1
954）を参照されたい。この方法は比較的時間をとり、
かつ高価である。
954）を参照されたい。この方法は比較的時間をとり、
かつ高価である。
その多くがポリオウイルス程には幅広く研究されてい
ない他RNAウイルスは研究、検出、生産或は、ワクチン
や抗体の生産においてはポリオウイルスの場合に似た、
或はそれ以上のやつかいな問題を提示している。
ない他RNAウイルスは研究、検出、生産或は、ワクチン
や抗体の生産においてはポリオウイルスの場合に似た、
或はそれ以上のやつかいな問題を提示している。
本発明はRNAウイルス配列表現相補型DNA（RNAウイル
スcDNA）の生産とかかるRNAウイルスcDNAの使用法に関
する。
スcDNA）の生産とかかるRNAウイルスcDNAの使用法に関
する。
一態様においてはウイルスRNAを逆転写し、生成cDNA
分子を組換体DNAベクターに挿入することでRNAウイルス
cDNAを生産する。ついで適当な細胞を組換体DNAベクタ
ーで変異させ、クローニングし、RNAウイルスcDNAの生
産に充分な条件で増殖させる。ついでこのcDNAをクロー
ニング細胞培地から取り出してそのまま使うか、特定用
途のために更に変更できる。
分子を組換体DNAベクターに挿入することでRNAウイルス
cDNAを生産する。ついで適当な細胞を組換体DNAベクタ
ーで変異させ、クローニングし、RNAウイルスcDNAの生
産に充分な条件で増殖させる。ついでこのcDNAをクロー
ニング細胞培地から取り出してそのまま使うか、特定用
途のために更に変更できる。
一特定態様では細菌を遺伝学的処理技術で転換させて
ポリオウイルス二本鎖相補型DNA（dscDNA）を生産でき
る様にする。この方法ではポリオウイルス一本鎖（ss）
RNAを逆転写してポリオウイルスss cDNAを提供し、これ
を伸長してds cDNAとし、ついで細菌プラスミドに挿入
してキメラプラスミドを作り出す。ds cDNAを含むこの
キメラプラスミドをついで、細菌細胞をキメラプラスミ
ドで形質転換することにより細菌細胞に挿入する。この
様に形質転換された細菌細胞をついでクローニングし、
クローナル細胞系を細胞培地で増殖させてキメラプラス
ミドを複製する。ポリオウイルスds cDNAは複製キメラ
プラスミドの酵素開裂で回収できる。
ポリオウイルス二本鎖相補型DNA（dscDNA）を生産でき
る様にする。この方法ではポリオウイルス一本鎖（ss）
RNAを逆転写してポリオウイルスss cDNAを提供し、これ
を伸長してds cDNAとし、ついで細菌プラスミドに挿入
してキメラプラスミドを作り出す。ds cDNAを含むこの
キメラプラスミドをついで、細菌細胞をキメラプラスミ
ドで形質転換することにより細菌細胞に挿入する。この
様に形質転換された細菌細胞をついでクローニングし、
クローナル細胞系を細胞培地で増殖させてキメラプラス
ミドを複製する。ポリオウイルスds cDNAは複製キメラ
プラスミドの酵素開裂で回収できる。
この方法で、比較的多量のRNAウイルスcDNAを合理的
コストで微生物学的に生産できる。一方、RNAウイルスc
DNAはウイルスRNAに特異結合するのでポリオウイルス等
のRNAウイルスの検出のための分析に使用できる。かか
る分析は急速かつ容易に達成でき、RNAウイルス検出に
極度に高感度である可能性を持つ。
コストで微生物学的に生産できる。一方、RNAウイルスc
DNAはウイルスRNAに特異結合するのでポリオウイルス等
のRNAウイルスの検出のための分析に使用できる。かか
る分析は急速かつ容易に達成でき、RNAウイルス検出に
極度に高感度である可能性を持つ。
RNAウイルスcDNAはより多くのRNAウイルス抗原やかか
る抗原に対する抗体の生産にも使用できる。これら方法
でウイルスRNAに対するcDNAは前述の如く生産される。
抗原生産には抗原生産を刺激できるcDNAを選んで、抗原
生産できる細胞に挿入し、その後に細胞を抗原生産に適
当な条件で培養し、ついで抗原を採取する。抗体生産に
は採取抗原を用いて、用いられた原ウイルスに対する抗
体を生産できる宿主を免疫にする。モノクロナール抗体
は抗体生産細胞を用いて宿主から既知技術、例えば交雑
細胞系の形成、で生産できる。
る抗原に対する抗体の生産にも使用できる。これら方法
でウイルスRNAに対するcDNAは前述の如く生産される。
抗原生産には抗原生産を刺激できるcDNAを選んで、抗原
生産できる細胞に挿入し、その後に細胞を抗原生産に適
当な条件で培養し、ついで抗原を採取する。抗体生産に
は採取抗原を用いて、用いられた原ウイルスに対する抗
体を生産できる宿主を免疫にする。モノクロナール抗体
は抗体生産細胞を用いて宿主から既知技術、例えば交雑
細胞系の形成、で生産できる。
驚くべきことには、本明細書記載の方法で生産され、
細胞にトランスフエクシヨンされたポリオウイルスcDNA
分子自体が感染性であることが発見された。かかる感染
性cDNA分子はウイルス系の抗原、抗体、ワクチンの生産
においてその片割れであるRNA分子にまさる可能性を秘
めている。例えばcDNA分子は既知組換体DNA技術で突然
変異化できる。この突然変異化cDNAは培養細胞トランス
フエクシヨンすることができ、生成ウイルス粒子は所望
変異を含む。かかるRNAウイルス粒子はワクチン生産に
おいてその野生型のものより顕著な利点を提供できる。
細胞にトランスフエクシヨンされたポリオウイルスcDNA
分子自体が感染性であることが発見された。かかる感染
性cDNA分子はウイルス系の抗原、抗体、ワクチンの生産
においてその片割れであるRNA分子にまさる可能性を秘
めている。例えばcDNA分子は既知組換体DNA技術で突然
変異化できる。この突然変異化cDNAは培養細胞トランス
フエクシヨンすることができ、生成ウイルス粒子は所望
変異を含む。かかるRNAウイルス粒子はワクチン生産に
おいてその野生型のものより顕著な利点を提供できる。
第１図はポリオウイルスds cDNAを含む細菌キメラプ
ラスミドの生産を例示する略図である。
ラスミドの生産を例示する略図である。
第２図は本明細書記載の方法で生産できたポリオウイ
ルスcDNAを用いる分析の一態様を示すブロツク図であ
る。
ルスcDNAを用いる分析の一態様を示すブロツク図であ
る。
第３図は本発明で生産された分離ポリオウイルスds c
DNAの全長を示す略図である。
DNAの全長を示す略図である。
第４図は２種のポリオウイルスds cDNA（PVR104とPVR
105）を接合して１つの同寸法ポリオウイルds cDNA（PV
R106）を生産するに用いる方法を例示する略図である。
105）を接合して１つの同寸法ポリオウイルds cDNA（PV
R106）を生産するに用いる方法を例示する略図である。
本明細書において用語“ポリオウイルスRNA"、“ポリ
オウイルスcDNA"、“ピコルナウイルスRNA"、“ピコル
ナウイルスcDNA"、“ウイルスRNA"等はRNA又はDNA分子
の全体かその有意部分を意味する。即ち、用語“ポリオ
ウイルスcDNA"はポリオウイルスRNA分子全体または有意
部分に相補的なDNAを意味するために使用されている。
オウイルスcDNA"、“ピコルナウイルスRNA"、“ピコル
ナウイルスcDNA"、“ウイルスRNA"等はRNA又はDNA分子
の全体かその有意部分を意味する。即ち、用語“ポリオ
ウイルスcDNA"はポリオウイルスRNA分子全体または有意
部分に相補的なDNAを意味するために使用されている。
ウイルスRNA cDNA生産用の本明細書に記載の方法で
は科学文献記載の基本的な遺伝子接合技術を用いる。例
えば、1980年12月２日にStanley N.CohenとHerbert W.B
oyerとに交付されたアメリカ特許4227224号の公報はこ
れら技術のうちの多くが述べられている。それ故、Cohe
nとBoyerとの特許発明の教示内容を参照により本明細書
に含める。
は科学文献記載の基本的な遺伝子接合技術を用いる。例
えば、1980年12月２日にStanley N.CohenとHerbert W.B
oyerとに交付されたアメリカ特許4227224号の公報はこ
れら技術のうちの多くが述べられている。それ故、Cohe
nとBoyerとの特許発明の教示内容を参照により本明細書
に含める。
ポリオウイルスds cDNA生産に用いることのできる技
術を、これら技術を例示している略図である第１図を参
照しながら更に特定して記述する。
術を、これら技術を例示している略図である第１図を参
照しながら更に特定して記述する。
ポリオウイルス１型を用いる。かかるウイルスは浮遊
液培地で上皮細胞を増殖させ、培地にポリオウイルス１
型を感染させることで得ることができる。ついで感染細
胞を界面活性剤で溶菌してウイルス粒子を放出させ、遠
心精製する。
液培地で上皮細胞を増殖させ、培地にポリオウイルス１
型を感染させることで得ることができる。ついで感染細
胞を界面活性剤で溶菌してウイルス粒子を放出させ、遠
心精製する。
ポリオウイルスss RNAはこの精製ウイルス粒子からフ
エノール−クロロホルム抽出で抽出できる。抽出ss RNA
をついでエタノール沈殿で沈殿させる。
エノール−クロロホルム抽出で抽出できる。抽出ss RNA
をついでエタノール沈殿で沈殿させる。
このポリオウイルスss RNAをついで例示した如くポリ
オウイルスds cDNAの合成に使う。まず、ポリオウイル
スss RNAをRNA依存性DNAポリメラーゼである酵素である
逆転写酵素を使つて逆転写する。Kacian,D.L.とMyersと
のJ.C.（1976）PNAS 73:2191〜５を参照されたい。典
型的にはトリス−HC1緩衝剤、PH8.3,マグネシウムイオ
ン（Mg++）、ジチオスレイトール、４種のデオキシヌク
レオシド トリホスフエート（dATP,dCTP,dGTP,TTP）、
生成物をモニターするための少くとも１種の被標識化デ
オキシヌクレオシド トリホスフエートを反応混合物に
加える。ポリオウイルスRNAのポリ（Ａ）末端に交雑し
て逆転写開始部位を提供するプライマーとしてオリゴ
（dT）も加える。反応混合物を、酸素にゲノムの３′ポ
リ（Ａ）から出発して５′末端に続く相補型ss DNAコピ
ーを合成させる条件下で培養する。反応はエチレンジア
ミン四酢酸（EDTA）添加で停止できる。
オウイルスds cDNAの合成に使う。まず、ポリオウイル
スss RNAをRNA依存性DNAポリメラーゼである酵素である
逆転写酵素を使つて逆転写する。Kacian,D.L.とMyersと
のJ.C.（1976）PNAS 73:2191〜５を参照されたい。典
型的にはトリス−HC1緩衝剤、PH8.3,マグネシウムイオ
ン（Mg++）、ジチオスレイトール、４種のデオキシヌク
レオシド トリホスフエート（dATP,dCTP,dGTP,TTP）、
生成物をモニターするための少くとも１種の被標識化デ
オキシヌクレオシド トリホスフエートを反応混合物に
加える。ポリオウイルスRNAのポリ（Ａ）末端に交雑し
て逆転写開始部位を提供するプライマーとしてオリゴ
（dT）も加える。反応混合物を、酸素にゲノムの３′ポ
リ（Ａ）から出発して５′末端に続く相補型ss DNAコピ
ーを合成させる条件下で培養する。反応はエチレンジア
ミン四酢酸（EDTA）添加で停止できる。
ついでアルカリでRNA型を除き、ジユクロース密度勾
配の利用でss cDNA分子を分画する。典型的には大分子
が保持される。ついでこれら大分子を、トリス−HCl緩
衝剤、pH7.5、Mg++、ジチオスレイトール、４−デオキ
シヌクレオチド トリホスフエート、DNAポリメラーゼ
Ｉのクレノウ（Klenow）フラグメントを含む別の反応混
合物に入れる。この反応混合物を、DNAポリメラーゼＩ
に分子の３′末端に形成された中衛でのcDNA分子開始重
合を成長させるに充分な条件に維持する。一典型例では
反応混合物を、例示の如く第２の相補型DNAストランド
の形成に普通充分な約30分間37゜で培養する。Humphrie
s等の（1978）Nucleic Acids Res.,５:905〜24を参照さ
れたい。
配の利用でss cDNA分子を分画する。典型的には大分子
が保持される。ついでこれら大分子を、トリス−HCl緩
衝剤、pH7.5、Mg++、ジチオスレイトール、４−デオキ
シヌクレオチド トリホスフエート、DNAポリメラーゼ
Ｉのクレノウ（Klenow）フラグメントを含む別の反応混
合物に入れる。この反応混合物を、DNAポリメラーゼＩ
に分子の３′末端に形成された中衛でのcDNA分子開始重
合を成長させるに充分な条件に維持する。一典型例では
反応混合物を、例示の如く第２の相補型DNAストランド
の形成に普通充分な約30分間37゜で培養する。Humphrie
s等の（1978）Nucleic Acids Res.,５:905〜24を参照さ
れたい。
ついでS1ヌクレアーゼを用いて分子一端のループ部分
を開く。BhatとPiatigorsky（1975）のPNAS，76:3299〜
3303を参照されたい。
を開く。BhatとPiatigorsky（1975）のPNAS，76:3299〜
3303を参照されたい。
ついで、末端トランスフエラーゼとdCTPを用いてds c
DNAの３′末端にオリゴ（dC）をつける。Boyer等（197
7）の“Recombinant Molecules:Impact on Science and
Society"（R.F.BeersとE.G.Bassett,eds.）９〜20頁、
Raven,N.Y.を参照されたい。有尾ds DNAはアガロースゲ
ルで電気泳動でき、ついで最大フラグメントを電気泳動
でゲルスライスから溶出させる。これにより組換体DNA
分子を形成するために、両端に開裂細菌プラスミドに結
合される“粘性”末端として役立つポリ（Ｃ）を有する
ds cDNAを残留させる。
DNAの３′末端にオリゴ（dC）をつける。Boyer等（197
7）の“Recombinant Molecules:Impact on Science and
Society"（R.F.BeersとE.G.Bassett,eds.）９〜20頁、
Raven,N.Y.を参照されたい。有尾ds DNAはアガロースゲ
ルで電気泳動でき、ついで最大フラグメントを電気泳動
でゲルスライスから溶出させる。これにより組換体DNA
分子を形成するために、両端に開裂細菌プラスミドに結
合される“粘性”末端として役立つポリ（Ｃ）を有する
ds cDNAを残留させる。
プラスミドPBR322を使つてキメラプラスミド形成を例
示できる。プラスミドPBR322は被選択性マーカーを含む
ことを知られている良く特性化されたプラスミドであ
る。このプラスミドはテトラサイクリン耐性をコードす
る一遺伝子とアンピシリン耐性をコードする一遺伝子と
を含む。ポリオウイルスds cDNA配列がアンピシリン耐
性遺伝子に挿入されるので、首尾よく形質転換された細
胞細菌はアンピシリン感受性（AmpS）、テトラサイクリ
ン／耐性（TetR）であり、後者が形質転換された細胞の
マーカーとなる。
示できる。プラスミドPBR322は被選択性マーカーを含む
ことを知られている良く特性化されたプラスミドであ
る。このプラスミドはテトラサイクリン耐性をコードす
る一遺伝子とアンピシリン耐性をコードする一遺伝子と
を含む。ポリオウイルスds cDNA配列がアンピシリン耐
性遺伝子に挿入されるので、首尾よく形質転換された細
胞細菌はアンピシリン感受性（AmpS）、テトラサイクリ
ン／耐性（TetR）であり、後者が形質転換された細胞の
マーカーとなる。
制限酵素Pst Iを使いアンピシリン／耐性コード遺伝
子でプラスミドpBR322を切る。ついで生成直鎖状プラス
ミドに末端転移酵素とdGTPとを使いオリゴ（dG）の尾を
つけて直線開裂プラスミド鎖に“粘性”末端を生成す
る。これらプラスミド鎖はフエノール抽出で精製でき
る。
子でプラスミドpBR322を切る。ついで生成直鎖状プラス
ミドに末端転移酵素とdGTPとを使いオリゴ（dG）の尾を
つけて直線開裂プラスミド鎖に“粘性”末端を生成す
る。これらプラスミド鎖はフエノール抽出で精製でき
る。
ついでオリゴ（dG）の尾のついたプラスミドDNAとオ
リゴ（dC）の尾のついたポリオウイルスds cDNAとを溶
解ハイブリダイズする。これは、これらDNA種を0.1MNaC
l中で等モル比で混合し、68゜で２分加熱し、45゜で３
〜４時間培養することで達成できる。ボイヤー等の1977
年の論文を参照されたい。
リゴ（dC）の尾のついたポリオウイルスds cDNAとを溶
解ハイブリダイズする。これは、これらDNA種を0.1MNaC
l中で等モル比で混合し、68゜で２分加熱し、45゜で３
〜４時間培養することで達成できる。ボイヤー等の1977
年の論文を参照されたい。
ついで、Pst I部位を再生し、プラスミドDNAを増殖
し、組換体プラスミドを含むクローンを確認するために
交雑プラスミド−ポリオウイルスds cDNAを大腸菌に挿
入する。Dagert,M.とFhrlich,S.D.（1979）のGene,23〜
28頁を参照されたい。この交雑分子が挿入されると一本
鎖ギヤツプは細菌により修復される。この再生により、
Pst I酵素が追つて確認して切り、複製プラスミドのた
めのポリオウイルスds cDNA配列を分離できるPst I部位
が提供される。
し、組換体プラスミドを含むクローンを確認するために
交雑プラスミド−ポリオウイルスds cDNAを大腸菌に挿
入する。Dagert,M.とFhrlich,S.D.（1979）のGene,23〜
28頁を参照されたい。この交雑分子が挿入されると一本
鎖ギヤツプは細菌により修復される。この再生により、
Pst I酵素が追つて確認して切り、複製プラスミドのた
めのポリオウイルスds cDNA配列を分離できるPst I部位
が提供される。
ついで、交雑分子で形質転換された大腸菌をテトラサ
イクリン存在下で選択し、追つてアンピシリン感受性ス
クリーニングにかけることができる。ついで、TetrAmpS
として確認されたクーロンを、単離クーロン中に特異的
ポリオウイルス配列を検出するためにコロニーハイブリ
ダイゼーションで分析できる。GrunsteinとHogness（19
77）のPNAS 72:3961〜５を参照されたい。
イクリン存在下で選択し、追つてアンピシリン感受性ス
クリーニングにかけることができる。ついで、TetrAmpS
として確認されたクーロンを、単離クーロン中に特異的
ポリオウイルス配列を検出するためにコロニーハイブリ
ダイゼーションで分析できる。GrunsteinとHogness（19
77）のPNAS 72:3961〜５を参照されたい。
Tetr Ampsは寒天培地表面のニトロセルロースフイル
ター上で増殖できる。このニトロセルロース上でコロニ
ーを溶菌させてDNAをフイルターに固定する。ついでフ
イルター上のDNAを密閉ポリエチレンバツグ中で32P−被
標識化ポリオウイルスcDNAとハイブリダイズする。フイ
ルターを洗い、乾燥してオートラジオグラフをとればど
のコロニーが特異的ポリオウイルス配列を含むかが明ら
かになる。これらコロニーからのDNAは被標識化ポリオ
ウイルスcDNAにハイブリダイズし、フイルターをＸ線フ
イルムに暴露すると暗色スポツトとして現われるからで
ある。
ター上で増殖できる。このニトロセルロース上でコロニ
ーを溶菌させてDNAをフイルターに固定する。ついでフ
イルター上のDNAを密閉ポリエチレンバツグ中で32P−被
標識化ポリオウイルスcDNAとハイブリダイズする。フイ
ルターを洗い、乾燥してオートラジオグラフをとればど
のコロニーが特異的ポリオウイルス配列を含むかが明ら
かになる。これらコロニーからのDNAは被標識化ポリオ
ウイルスcDNAにハイブリダイズし、フイルターをＸ線フ
イルムに暴露すると暗色スポツトとして現われるからで
ある。
陽クローンからのプラスミドDNAは既知技術で得るこ
とができる。例えばMeagher等（1977）、Guerry（197
3）の論文を参照されたい。
とができる。例えばMeagher等（1977）、Guerry（197
3）の論文を参照されたい。
DNAはPst Iでの消化後にアガロースゲルでの電気泳動
分析に付すことができる。pBR322と陽クローンから得ら
れた交雑プラスミドの消化パターンを比較すると挿入DN
Aの長さが示される。
分析に付すことができる。pBR322と陽クローンから得ら
れた交雑プラスミドの消化パターンを比較すると挿入DN
Aの長さが示される。
当業者ならば当然、以上の態様で特定して述べた材
料、条件以上の材料、条件も使用できることがわかる。
例えば、ポリオウイルス１型を用いたが所望なら２型も
３型も使用できると考えられる。更に、大腸菌以外の細
菌細胞も使用できることは明白である。例えば枯草菌も
多くの他細菌株と同様に使用できる。
料、条件以上の材料、条件も使用できることがわかる。
例えば、ポリオウイルス１型を用いたが所望なら２型も
３型も使用できると考えられる。更に、大腸菌以外の細
菌細胞も使用できることは明白である。例えば枯草菌も
多くの他細菌株と同様に使用できる。
当業者に明らかな如く、以上に述べた方法はポリオウ
イルスに限定されず、他RNAウイルスでも等しく適用で
きる。当然の事ながらこれはRNAの一本鎖の＋鎖からな
るゲノムを持つRNAウイルスに対しては特に真実であ
る。これらにはポリオウイルス以外のピコルナウイル
ス、例えばコクサツキーウイルス、リノウイルス、口蹄
疫ウイルス等；トガウイルス、例えばＡ型（アルフアウ
イルス）とＢ型（フラビウイルス）；が該当する。
イルスに限定されず、他RNAウイルスでも等しく適用で
きる。当然の事ながらこれはRNAの一本鎖の＋鎖からな
るゲノムを持つRNAウイルスに対しては特に真実であ
る。これらにはポリオウイルス以外のピコルナウイル
ス、例えばコクサツキーウイルス、リノウイルス、口蹄
疫ウイルス等；トガウイルス、例えばＡ型（アルフアウ
イルス）とＢ型（フラビウイルス）；が該当する。
同様に、細菌プラスミドをポリオウイルスcDNA配列の
生産に用いたが、他の組換体DNAベクターも使用でき
た。他組換体DNAベクターの例はフアージ、動物ウイル
ス、イーストである。組換体DNAベクターの増殖を可能
にする宿主を当然選択する。
生産に用いたが、他の組換体DNAベクターも使用でき
た。他組換体DNAベクターの例はフアージ、動物ウイル
ス、イーストである。組換体DNAベクターの増殖を可能
にする宿主を当然選択する。
本発明により生産されたDNAウイルスcDNA、例えばポ
リオウイルスcDNA、の１つの有意な用途はRNAウイルス
の存在を検出するための分析である。典型的なポリオウ
イルス分析では患者からのサンプル、例えば脳脊髄液、
を第２図に例示の如く分析できる。患者からのサンプル
のRNA画分をまず単離するが、これはフエノール抽出と
エタノール沈殿とで達成できる。このRNA画分は純粋で
ある必要はないが、ポリオウイルスが原サンプル中に存
在するならばポリオウイルスRNAを含む画分でなければ
ならない。ポリオウイルスcDNAをまず例えばトリチウ
ム、ヨウ素、32P等の放射性物質で標識化し、ついで、
被標識化ポリオウイルスcDNAを存在するポリオウイルス
RNAに結合させる条件下でRNA画分と共に培養する。培養
後に未結合の被標識化ポリオウイルスcDNAを分離し、つ
いで結合した被標識化cDNAポリオウイルスをシンチレー
ション計数器その他の手段で検出する。
リオウイルスcDNA、の１つの有意な用途はRNAウイルス
の存在を検出するための分析である。典型的なポリオウ
イルス分析では患者からのサンプル、例えば脳脊髄液、
を第２図に例示の如く分析できる。患者からのサンプル
のRNA画分をまず単離するが、これはフエノール抽出と
エタノール沈殿とで達成できる。このRNA画分は純粋で
ある必要はないが、ポリオウイルスが原サンプル中に存
在するならばポリオウイルスRNAを含む画分でなければ
ならない。ポリオウイルスcDNAをまず例えばトリチウ
ム、ヨウ素、32P等の放射性物質で標識化し、ついで、
被標識化ポリオウイルスcDNAを存在するポリオウイルス
RNAに結合させる条件下でRNA画分と共に培養する。培養
後に未結合の被標識化ポリオウイルスcDNAを分離し、つ
いで結合した被標識化cDNAポリオウイルスをシンチレー
ション計数器その他の手段で検出する。
血清や生検等の他患者サンプルも当然用いてもよい。
更に、本分析は下水等のポリオウイルスを含む他液体サ
ンプルでも達成できる。同様にポリオウイルス以外のRN
Aウイルスにも本分析は使用できる。
更に、本分析は下水等のポリオウイルスを含む他液体サ
ンプルでも達成できる。同様にポリオウイルス以外のRN
Aウイルスにも本分析は使用できる。
例示されてはいないが固相分析も達成できる。更に、
標識は放射性同位体である必要はなく、酵素、光学的標
識等でもよい。
標識は放射性同位体である必要はなく、酵素、光学的標
識等でもよい。
本発明により生産されるRNAウイルスcDNAの第２の有
意な用途はRNAウイルス又はウイルス粒子に対する抗体
の生産である。
意な用途はRNAウイルス又はウイルス粒子に対する抗体
の生産である。
抗体はウイルスRNAを逆転写してcDNAを提供し、このc
DNAを組換体DNAベクターに挿入し、該組換体DNAベクタ
ーが増殖できる細胞の形質転換することにより生成でき
た。ついでこの形質転換細胞をクローニングしてcDNAを
複製できる細胞系を生産し、この細胞系をcDNA生産に充
分な条件で培養し、ついでcDNAを細胞培地から採取でき
た。細胞内で抗原合成を指示できる特異的cDNAを選択、
単離し、ついで抗原を生成する様に細胞に挿入できた。
ついで動物等の宿主をこの抗原で免疫して宿主に原RNA
ウイルス又はその一部に対する抗体を生産させた。
DNAを組換体DNAベクターに挿入し、該組換体DNAベクタ
ーが増殖できる細胞の形質転換することにより生成でき
た。ついでこの形質転換細胞をクローニングしてcDNAを
複製できる細胞系を生産し、この細胞系をcDNA生産に充
分な条件で培養し、ついでcDNAを細胞培地から採取でき
た。細胞内で抗原合成を指示できる特異的cDNAを選択、
単離し、ついで抗原を生成する様に細胞に挿入できた。
ついで動物等の宿主をこの抗原で免疫して宿主に原RNA
ウイルス又はその一部に対する抗体を生産させた。
実験によりRNAウイルスcDNAが感染性をもつことが示
されたが、これは驚くべき発見である。これら実験は細
菌プラスミドpBR322のPst I部位で構成されたポリオウ
イルスのRNAゲノムの同寸のクローン化cDNAコピーを用
いて行つた（後記実施例を参照せよ）。これら交雑プラ
スミドでトランスフエクシヨンされた培養哺乳動物細胞
から感染性ポリオウイルスが生産された。別のポリオウ
イルスcDNAクローンでトランスフエクシヨンされた細胞
はポリオウイルスゲノムの最初の115の塩基対を欠き、
ウイルスは生産しなかつた。
されたが、これは驚くべき発見である。これら実験は細
菌プラスミドpBR322のPst I部位で構成されたポリオウ
イルスのRNAゲノムの同寸のクローン化cDNAコピーを用
いて行つた（後記実施例を参照せよ）。これら交雑プラ
スミドでトランスフエクシヨンされた培養哺乳動物細胞
から感染性ポリオウイルスが生産された。別のポリオウ
イルスcDNAクローンでトランスフエクシヨンされた細胞
はポリオウイルスゲノムの最初の115の塩基対を欠き、
ウイルスは生産しなかつた。
この発見は、細胞をRNAウイルスに対するcDNAでトラ
ンスフエクシヨンし、ウイルス生産に適当な条件で細胞
を培養し、ついでRNAウイルス粒子を採取することでRNA
ウイルス粒子の生産が可能なことを意味する。
ンスフエクシヨンし、ウイルス生産に適当な条件で細胞
を培養し、ついでRNAウイルス粒子を採取することでRNA
ウイルス粒子の生産が可能なことを意味する。
それは又、RNAウイルス研究とワクチン生産とに対す
る様々な新しい端諸となる可能性のある、RNAでは不可
能な遺伝的操作が可能であることを意味する。
る様々な新しい端諸となる可能性のある、RNAでは不可
能な遺伝的操作が可能であることを意味する。
例えば、現在のワクチン種から生産されるワクチンと
は別の特性を持つワクチンをcDNAから次の如くして製造
できた。まず、RNAゲノムのcDNAコピーを本明細書記載
の如く生産し、このcDNAを組換え体DNA技術を用いて突
然変異させることができた。ついで、RNAウイルスを生
産できる細胞をcDNAでトランスフエクシヨンし、変更ウ
イルス生産に充分な条件で培養し、ついでワクチン生産
で使用できた。
は別の特性を持つワクチンをcDNAから次の如くして製造
できた。まず、RNAゲノムのcDNAコピーを本明細書記載
の如く生産し、このcDNAを組換え体DNA技術を用いて突
然変異させることができた。ついで、RNAウイルスを生
産できる細胞をcDNAでトランスフエクシヨンし、変更ウ
イルス生産に充分な条件で培養し、ついでワクチン生産
で使用できた。
一つの特異的方法では組換え体DNA技術を使いウイル
スゲノムの特異的領域をcDNAから除去できる。ついで変
更cDNAを含むプラスミドを哺乳動物細胞等の細胞にトラ
ンスフエクシヨンできた。これら細胞で生産されたウイ
ルス粒子は回収され、適当な宿主で弱毒化が分析され
る。
スゲノムの特異的領域をcDNAから除去できる。ついで変
更cDNAを含むプラスミドを哺乳動物細胞等の細胞にトラ
ンスフエクシヨンできた。これら細胞で生産されたウイ
ルス粒子は回収され、適当な宿主で弱毒化が分析され
る。
細胞へのトランスフエクシヨンは既知技術で達成でき
る。例えば、元々GrahamとVan der Fbとにより記載され
たリン酸カルシウムDNA共沈技術が適当である。Virolog
y 52,456（1973）を参照されたい。同様に、元々McCut
cheonとPaganoにより記載されたDNA/DEAE−デキストラ
ン法も適している。J.Nat′1 Cancer Inst．41,351（19
68）を参照されたい。当業者なら他の適当なトランスフ
エクシヨン技術を知つているし、或はルーチンな実験を
使い発見できるであろう。
る。例えば、元々GrahamとVan der Fbとにより記載され
たリン酸カルシウムDNA共沈技術が適当である。Virolog
y 52,456（1973）を参照されたい。同様に、元々McCut
cheonとPaganoにより記載されたDNA/DEAE−デキストラ
ン法も適している。J.Nat′1 Cancer Inst．41,351（19
68）を参照されたい。当業者なら他の適当なトランスフ
エクシヨン技術を知つているし、或はルーチンな実験を
使い発見できるであろう。
以下の実験で本発明を更により特定的に例示する。
実施例 １ 交雑プラスミド−ポリオウイルスds cDNAの生産と大腸
菌でのクローニング 1.ポリオウイルスRNAの生産 標準法（Flanegan等、1977,PNAS 74:961）を使いポリ
オウイルスRNAを得た。HeLa細胞を浮遊液培地で増殖さ
せて４×105個/mlの密度とし、遠心分離し、10の感染多
重度（MOI）でポリオウイルス１型ストツクで感染させ
た。感染を37゜で６時間進行させ、終了後細胞を遠心分
離した。ウイルスを界面活性剤で細胞から放出し、塩化
セシウム均衡遠心分離で細胞質から精製した。ついでフ
エノールクロロホルム抽出、エタノール沈殿でRNAをウ
イルスから抽出した。（Flanegan等の1977年の論文を参
照されたい） 2. ポリオウイルス二本鎖cDNAの合成 a.第１ストランド合成 ポリオウイルスRNA（150μg/ml）、50mMのトリスHCl
（pH8.3）、10mMのMgCl2、50mMのKCl、0.4mMのジチオス
レイトール、30μg/mgのオリゴ（デオキシチミジレー
ト）、4mMのピロリン酸ナトリウム、各0.5mMのdATP,dCT
P,dGTP及びdTTP,100μCi/mlのα−32P−dCTP,150Uの逆
転写酵素を含む0.5mlの反応混合物中でポリオウイルスc
DNAを合成した。混合物を42゜で60分培養し、EDTA添加
で停止した。反応混合物をフエノール抽出し、エタノー
ル沈殿し、精製ペレツトを0.3NのNaOH、0.7MのNaCl、5m
MのEDTAを含む0.2mlの緩衝液に再浮遊させた。反応生成
物をベツクマンSW41ロータで20゜で35000rpmでアルカリ
性シユクローズ勾配沈殿に付した。各0.2mlの画分を採
集し、アルカリ性アガロースゲル電気泳動で分析した。
完全ポリオウイルスcDNAを含む画分をプールし、エタノ
ール沈殿し、0.05mlの水に再浮遊させた。
菌でのクローニング 1.ポリオウイルスRNAの生産 標準法（Flanegan等、1977,PNAS 74:961）を使いポリ
オウイルスRNAを得た。HeLa細胞を浮遊液培地で増殖さ
せて４×105個/mlの密度とし、遠心分離し、10の感染多
重度（MOI）でポリオウイルス１型ストツクで感染させ
た。感染を37゜で６時間進行させ、終了後細胞を遠心分
離した。ウイルスを界面活性剤で細胞から放出し、塩化
セシウム均衡遠心分離で細胞質から精製した。ついでフ
エノールクロロホルム抽出、エタノール沈殿でRNAをウ
イルスから抽出した。（Flanegan等の1977年の論文を参
照されたい） 2. ポリオウイルス二本鎖cDNAの合成 a.第１ストランド合成 ポリオウイルスRNA（150μg/ml）、50mMのトリスHCl
（pH8.3）、10mMのMgCl2、50mMのKCl、0.4mMのジチオス
レイトール、30μg/mgのオリゴ（デオキシチミジレー
ト）、4mMのピロリン酸ナトリウム、各0.5mMのdATP,dCT
P,dGTP及びdTTP,100μCi/mlのα−32P−dCTP,150Uの逆
転写酵素を含む0.5mlの反応混合物中でポリオウイルスc
DNAを合成した。混合物を42゜で60分培養し、EDTA添加
で停止した。反応混合物をフエノール抽出し、エタノー
ル沈殿し、精製ペレツトを0.3NのNaOH、0.7MのNaCl、5m
MのEDTAを含む0.2mlの緩衝液に再浮遊させた。反応生成
物をベツクマンSW41ロータで20゜で35000rpmでアルカリ
性シユクローズ勾配沈殿に付した。各0.2mlの画分を採
集し、アルカリ性アガロースゲル電気泳動で分析した。
完全ポリオウイルスcDNAを含む画分をプールし、エタノ
ール沈殿し、0.05mlの水に再浮遊させた。
b.第２ストランド合成 10mMのトリスHCl（pH7.5）、5mMのMgCl2、5mMのジチ
オスレイトール、DNAポリメラーゼＩのクレノウ（Kleno
w）フラグメント（0.003U/ng cDNA）を含む反応混合物
で完全ポリオウイルスcDNA（約0.5μｇ）を培養した。
混合物を37゜で30分培養し、フエノール抽出で停止し
た。0.1MのNaCl、10mMのトリスHCl（pH7.5）、1mMのEDT
Aで平衡にされた１×10cmのセフアデツクスＧ−100カラ
ムに適用し、同一緩衝液で展開した。カラムの放出画分
をプールした。
オスレイトール、DNAポリメラーゼＩのクレノウ（Kleno
w）フラグメント（0.003U/ng cDNA）を含む反応混合物
で完全ポリオウイルスcDNA（約0.5μｇ）を培養した。
混合物を37゜で30分培養し、フエノール抽出で停止し
た。0.1MのNaCl、10mMのトリスHCl（pH7.5）、1mMのEDT
Aで平衡にされた１×10cmのセフアデツクスＧ−100カラ
ムに適用し、同一緩衝液で展開した。カラムの放出画分
をプールした。
c.S1ヌクレアーゼ処理 前述の如くして生成した二本鎖ポリオウイルスcDNAを
1.0〜1.5mlに入れた。これを、最終濃度がNaCl0.3M、Na
OAc30mM（pH4.5）、ZnCl23mM、グリセリン５％となる様
に緩衝液とあわせた。ついでヌクレアーゼS1を、前もつ
て定めた量で混合物に加えて、分子残部を刻むことなく
cDNA二本鎖の一端のループ部分を切り開いた。フエノー
ル抽出で反応を停止し、5mMのトリスHCl（pH7.5）と0.5
mMのEDTAを含む緩衝液で水相を透析した。透析後にcDNA
をエタノールで２度沈殿させ、0.2mlの水に再浮遊させ
た。
1.0〜1.5mlに入れた。これを、最終濃度がNaCl0.3M、Na
OAc30mM（pH4.5）、ZnCl23mM、グリセリン５％となる様
に緩衝液とあわせた。ついでヌクレアーゼS1を、前もつ
て定めた量で混合物に加えて、分子残部を刻むことなく
cDNA二本鎖の一端のループ部分を切り開いた。フエノー
ル抽出で反応を停止し、5mMのトリスHCl（pH7.5）と0.5
mMのEDTAを含む緩衝液で水相を透析した。透析後にcDNA
をエタノールで２度沈殿させ、0.2mlの水に再浮遊させ
た。
d.ポリオウイルスds cDNAへのポリ（デオキシシチジレ
ート）の付加 上記工程からのcDNA（0.05〜１μｇ）を0.15Mのカコ
ジル酸、1mMのCoCl2、0.2mMのジチオスレイトール、50
μg/mlの牛血清アルブミン、0.15mMのdCTPを含む0.1ml
の反応混合物に加えた。過剰の末端デオキシヌクレオチ
ジルトランスフエラーゼ（6U）を加え、反応を室温で20
分進行させた。20分経過時に反応混合物をフエノール抽
出し、２度エーテル抽出し、エタノール沈殿させた。最
終ペレツトを0.05mlの0.1M NaCl、10mMのトリスHCl（pH
7.5）、1mMのEDTAからなる0.05mlに再浮遊させた。この
物質をＣ尾ポリオウイルスds cDNAと呼ぶ。
ート）の付加 上記工程からのcDNA（0.05〜１μｇ）を0.15Mのカコ
ジル酸、1mMのCoCl2、0.2mMのジチオスレイトール、50
μg/mlの牛血清アルブミン、0.15mMのdCTPを含む0.1ml
の反応混合物に加えた。過剰の末端デオキシヌクレオチ
ジルトランスフエラーゼ（6U）を加え、反応を室温で20
分進行させた。20分経過時に反応混合物をフエノール抽
出し、２度エーテル抽出し、エタノール沈殿させた。最
終ペレツトを0.05mlの0.1M NaCl、10mMのトリスHCl（pH
7.5）、1mMのEDTAからなる0.05mlに再浮遊させた。この
物質をＣ尾ポリオウイルスds cDNAと呼ぶ。
3. ポリオウイルds cDNAの分子組換体 a.ベクター製造 プラスミドpBR322のDNAをDNA（500μg/ml）、15mMト
リスHCl（pH7.5）、5mMのMgCl2、50mMのNaCl、過剰酵素
を含む0.1mlの反応混合物中で制限エンドヌクレアーゼP
st Iで開いた。37゜で１時間培養し、フエノール抽出で
停止した。プラスミドDNAをエタノール沈殿し、0.02ml
の水平に再浮遊させた。
リスHCl（pH7.5）、5mMのMgCl2、50mMのNaCl、過剰酵素
を含む0.1mlの反応混合物中で制限エンドヌクレアーゼP
st Iで開いた。37゜で１時間培養し、フエノール抽出で
停止した。プラスミドDNAをエタノール沈殿し、0.02ml
の水平に再浮遊させた。
上記２（ｄ）記載の方法でポリ（デオキシグアニレー
ト）をプラスミドDNAの３′末端に付加した。違いは
（１）dCTPの代わりにdGTPを使つた；（２）反応容量を
0.3mlに増した；（３）反応を20℃で30〜60秒進行させ
た；点であつた。
ト）をプラスミドDNAの３′末端に付加した。違いは
（１）dCTPの代わりにdGTPを使つた；（２）反応容量を
0.3mlに増した；（３）反応を20℃で30〜60秒進行させ
た；点であつた。
反応後に混合物をフエノール抽出し、10mMのNaCl＋1m
Mのトリス−HCl（pH7.4）＋0.1mMのEDTA中の1cm×10cm
セフアデツクスＧ−100カラムでクロマトグラフイーし
た。放出画分をプールし、Ｎガス流下で10倍に濃縮し
た。この物質を“Ｇ−尾pBR322DNA"と呼ぶ。
Mのトリス−HCl（pH7.4）＋0.1mMのEDTA中の1cm×10cm
セフアデツクスＧ−100カラムでクロマトグラフイーし
た。放出画分をプールし、Ｎガス流下で10倍に濃縮し
た。この物質を“Ｇ−尾pBR322DNA"と呼ぶ。
b.ポリオウイルスcDNAとベクタープラスミドのアニーリ
ング １μg/mlのＧ−尾pBR322DNA、適量のポリオウイルスc
DNA、0.1MのNaCl、10mMのトリスHCl（pH7.5）、1mMのED
TAを含む緩衝液中で等モル量のＧ−尾pBR322DNAとＣ−
尾ポリオウイルスds cDNAを混合した。混合物を68゜迄
に２分加熱し、ついで45゜で３〜４時間保持した。この
期間後に、アニールされた物質を形質転換達成迄４゜で
貯蔵した。
ング １μg/mlのＧ−尾pBR322DNA、適量のポリオウイルスc
DNA、0.1MのNaCl、10mMのトリスHCl（pH7.5）、1mMのED
TAを含む緩衝液中で等モル量のＧ−尾pBR322DNAとＣ−
尾ポリオウイルスds cDNAを混合した。混合物を68゜迄
に２分加熱し、ついで45゜で３〜４時間保持した。この
期間後に、アニールされた物質を形質転換達成迄４゜で
貯蔵した。
c.形質転換 大腸菌細胞を次法で形質転換感受性とした。100mlの
Ｌ−培地中で細胞を増殖させて550nmでの光学的密度を
0.1とした。細胞を遠心分離し、20mlの冷0.1M CaCl2に
再浮遊させ、25分間氷上に置いた。ついで細胞を遠心分
離し、1.0mlの冷0.1M CaCl2に再浮遊させ、24時間氷上
に保持した。
Ｌ−培地中で細胞を増殖させて550nmでの光学的密度を
0.1とした。細胞を遠心分離し、20mlの冷0.1M CaCl2に
再浮遊させ、25分間氷上に置いた。ついで細胞を遠心分
離し、1.0mlの冷0.1M CaCl2に再浮遊させ、24時間氷上
に保持した。
上記３（ｂ）からのアニーリングしたDNA（0.001μ
ｇ）を0.1mlの感受性大腸菌に加え、氷上で15分培養し
た。この混合物をついで37゜として５分間保ち、ついで
1mlのＬ−培地を加え、混合物を37゜で１時間振とうし
た。この時間経過後に3mlの軟質寒天を加え、15μg/ml
のテトラサイクリンを含むＬ−寒天プレートに注いだ。
細菌コロニーが肉眼で見える迄（普通18時間）37゜で培
養した。
ｇ）を0.1mlの感受性大腸菌に加え、氷上で15分培養し
た。この混合物をついで37゜として５分間保ち、ついで
1mlのＬ−培地を加え、混合物を37゜で１時間振とうし
た。この時間経過後に3mlの軟質寒天を加え、15μg/ml
のテトラサイクリンを含むＬ−寒天プレートに注いだ。
細菌コロニーが肉眼で見える迄（普通18時間）37゜で培
養した。
d.ポリオウイルス特異性クローンの確認 テトラサイクリン平板上の細菌コロニーを50μg/mlの
アンピシリン含有の１つのＬ−寒天平板ともう１つのテ
トラサイクリン含有寒天平板上にある配列でつまようじ
で移した。アンピシリン感受性、テトラサイクリン耐性
と確認されたコロニーを新しいテトラサイクリン平板上
にある配列でつまようじで取り出し、37゜で18時間増殖
させた。ついでこれらコロニーをGrunsteinとHognessと
のコロニーハイブリダイゼーション技術（1975,PNAS 7
2:3961〜５）を使いポリオウイルスDNA検出のためスク
リーニングした。略述すれば、コロニーをニトロセルロ
ースフイルターに移し、細菌をフイルター上で溶菌し、
細菌DNAをニトロセルロースに固定した。ついでフイル
ターを同位体被標識化ポリオウイルスcDNAプローブにハ
イブリダイズし、洗い、オートラジオグラフに付した。
放射能プローブを保持したコロニーをポリオウイルスcD
NA配列を含むと確認した。
アンピシリン含有の１つのＬ−寒天平板ともう１つのテ
トラサイクリン含有寒天平板上にある配列でつまようじ
で移した。アンピシリン感受性、テトラサイクリン耐性
と確認されたコロニーを新しいテトラサイクリン平板上
にある配列でつまようじで取り出し、37゜で18時間増殖
させた。ついでこれらコロニーをGrunsteinとHognessと
のコロニーハイブリダイゼーション技術（1975,PNAS 7
2:3961〜５）を使いポリオウイルスDNA検出のためスク
リーニングした。略述すれば、コロニーをニトロセルロ
ースフイルターに移し、細菌をフイルター上で溶菌し、
細菌DNAをニトロセルロースに固定した。ついでフイル
ターを同位体被標識化ポリオウイルスcDNAプローブにハ
イブリダイズし、洗い、オートラジオグラフに付した。
放射能プローブを保持したコロニーをポリオウイルスcD
NA配列を含むと確認した。
プラスミドDNAを単離し、制限エンドヌクレアーゼPst
Iで開き、アガロースゲルでの電気泳動によりポリオウ
イルスDNA挿入体のサイズを決定することにより多くの
陽クローンを調べた。最長挿入体（4.0〜6.5Kbp）を含
むプラスミドをヌクレオチド配列分析と制限酵素遺伝地
図作成技術を使つてウイルスゲノム上に一列とした。
Iで開き、アガロースゲルでの電気泳動によりポリオウ
イルスDNA挿入体のサイズを決定することにより多くの
陽クローンを調べた。最長挿入体（4.0〜6.5Kbp）を含
むプラスミドをヌクレオチド配列分析と制限酵素遺伝地
図作成技術を使つてウイルスゲノム上に一列とした。
実施例 ２ ほぼ完全なポリオウイルスcDNAクローンの構成 実施例１に略示した方法を用いて挿入長が4.0Kbp、6.
5Kbpの２つのポリオウイルスcDNAを発生させた。これら
DNAのダイヤ図を第３図に示す。第３図でそれらはpVR10
2、pVR103で示されている。比較目的で完全ポリオウイ
ルスRNA鎖も例示されている。
5Kbpの２つのポリオウイルスcDNAを発生させた。これら
DNAのダイヤ図を第３図に示す。第３図でそれらはpVR10
2、pVR103で示されている。比較目的で完全ポリオウイ
ルスRNA鎖も例示されている。
両プラスミドpVR102、pVR103のDNAを15mMのトリスHCl
（pH7.4）、5mMのMgCl2、50mMのNaCl、DNA（500μg/m
l）、制限エンドヌクレアーゼEcoR IとBg1 IIとの混合
物を含む0.1mlの反応混合物中で37℃で培養することに
より開裂した。60分後に混合物をフエノール抽出し、エ
タノール沈殿させ、１％アガロースゲルで電気泳動させ
た。この消化で生じた両クローンの最大フラグメントを
ゲルから溶離させて0.01mlのH2Oに再浮遊させた。これ
らDNAの各々を0.002ml、50mMのトリスHCl（pH7.5）、10
mMのMgCl2、1.0mMのATP、300単位のフアージT4DNAリガ
ーゼを含む混合物に加えた。反応混合物を15゜で16時間
培養した。ついで0.002mlの混合物を前述の如く使つて
大腸菌を形質転換した。生成テトラサイクリン耐性コロ
ニーを、プラスミドDNAを前述の如く単離することによ
り調べた。様々な制限酵素でのプラスミドDNAの開裂と
アガロースゲルでの消化物の分析とにより、ほぼ完全な
ポリオウイルスcDNAクローンが構成されていたことが示
された。このクローン（pVR104）は第３図に例示される
如くポリオウイルスRNAの３′ポリ（Ａ）配列で始ま
り、全内部配列を含み、ウイルスRNAの５′末端から115
番目の塩基で終つている。
（pH7.4）、5mMのMgCl2、50mMのNaCl、DNA（500μg/m
l）、制限エンドヌクレアーゼEcoR IとBg1 IIとの混合
物を含む0.1mlの反応混合物中で37℃で培養することに
より開裂した。60分後に混合物をフエノール抽出し、エ
タノール沈殿させ、１％アガロースゲルで電気泳動させ
た。この消化で生じた両クローンの最大フラグメントを
ゲルから溶離させて0.01mlのH2Oに再浮遊させた。これ
らDNAの各々を0.002ml、50mMのトリスHCl（pH7.5）、10
mMのMgCl2、1.0mMのATP、300単位のフアージT4DNAリガ
ーゼを含む混合物に加えた。反応混合物を15゜で16時間
培養した。ついで0.002mlの混合物を前述の如く使つて
大腸菌を形質転換した。生成テトラサイクリン耐性コロ
ニーを、プラスミドDNAを前述の如く単離することによ
り調べた。様々な制限酵素でのプラスミドDNAの開裂と
アガロースゲルでの消化物の分析とにより、ほぼ完全な
ポリオウイルスcDNAクローンが構成されていたことが示
された。このクローン（pVR104）は第３図に例示される
如くポリオウイルスRNAの３′ポリ（Ａ）配列で始ま
り、全内部配列を含み、ウイルスRNAの５′末端から115
番目の塩基で終つている。
実施例 ３ プラスミドpVR105の構成 1.プライマーの単離 ポリオウイルスRNAの５′末端を表現するプラスミド
を構成するためにプライマー伸張技術を用いた。プラス
ミドpVR103を使つて次法でプライマーを単離した。プラ
スミドDNA（100μｇのpVR103）を制限エンドヌクレアー
ゼBam H I、Bg1 IIで消化した。消化生成物をポリアク
リルアミドゲル電気泳動で分離し、ゲルから最も泳動速
度の遅いフラグメントを抽出した。このDNAフラグメン
トはPst I部位でポリオウイルスゲノムの塩基116〜220
を発現するDNAに結合した塩基375〜3607から構成される
が、牛アルカリ性ホスフアターゼでの処理により５′−
末端ホスフエートを除去した。ついでこのDNAをτ−32P
−ATPとポリヌクレオチドキナーゼとを使いその５′末
端で32Pでホスホリル化した。このホスホリル化フラグ
メントをついで制限エンドヌクレアーゼRsa Iで開裂
し、開裂生成物をポリアクリルアミドゲル電気泳動で分
離した。Bam H I部位（位置220）からRsa I部位（位置1
49）への74−塩基フラグメントをゲルから精製した。こ
のフラグメントはBam H I部位でのみ32Pを含み、末端被
標識化プライマーとして役立つた。
を構成するためにプライマー伸張技術を用いた。プラス
ミドpVR103を使つて次法でプライマーを単離した。プラ
スミドDNA（100μｇのpVR103）を制限エンドヌクレアー
ゼBam H I、Bg1 IIで消化した。消化生成物をポリアク
リルアミドゲル電気泳動で分離し、ゲルから最も泳動速
度の遅いフラグメントを抽出した。このDNAフラグメン
トはPst I部位でポリオウイルスゲノムの塩基116〜220
を発現するDNAに結合した塩基375〜3607から構成される
が、牛アルカリ性ホスフアターゼでの処理により５′−
末端ホスフエートを除去した。ついでこのDNAをτ−32P
−ATPとポリヌクレオチドキナーゼとを使いその５′末
端で32Pでホスホリル化した。このホスホリル化フラグ
メントをついで制限エンドヌクレアーゼRsa Iで開裂
し、開裂生成物をポリアクリルアミドゲル電気泳動で分
離した。Bam H I部位（位置220）からRsa I部位（位置1
49）への74−塩基フラグメントをゲルから精製した。こ
のフラグメントはBam H I部位でのみ32Pを含み、末端被
標識化プライマーとして役立つた。
2. プライマー伸張 次法で被標識化プライマーを２μｇの精製ポリオウイ
ルスRNAとハイブリダイズした。プライマーとウイルスR
NAとを0.005mlの全容量であわせ、２分間沸騰させ、ド
ライアイス中で急冷した。混合物をついで0.01M Pipes.
HClでpH6.4に調整し、0.4M NaCl、2mMのEDTA、80％ホル
ムアミドを全容量0.05mlで加えた。この混合物を42゜で
４時間保持し、ついで水で0.2mlに希釈し、３倍容量の
エタノールで沈殿させた。混合物をエタノールで更に３
度沈殿させて残留ホルムアミドを除いた。
ルスRNAとハイブリダイズした。プライマーとウイルスR
NAとを0.005mlの全容量であわせ、２分間沸騰させ、ド
ライアイス中で急冷した。混合物をついで0.01M Pipes.
HClでpH6.4に調整し、0.4M NaCl、2mMのEDTA、80％ホル
ムアミドを全容量0.05mlで加えた。この混合物を42゜で
４時間保持し、ついで水で0.2mlに希釈し、３倍容量の
エタノールで沈殿させた。混合物をエタノールで更に３
度沈殿させて残留ホルムアミドを除いた。
最終エタノールペレツトを50mMのトリスHCl（pH8.
3）、50mMのKCl、0.5mMのジチオスレイトール（DTT）、
10mMのMgCl2、40μg/mlのアクチノマイシンＤ、各0.5mM
のデオキシアデノシントリホスフエート、デオキシシチ
ジントリホスフエート、デオキシクアノシントリホスフ
エート及びデオキシチミジントリホスフエートを含む0.
05mlの反応混合物に再浮遊させた。逆転写酵素（RNA依
存性DNAポリメラーゼ）を加え、混合物を42゜で60分培
養した。ついで混合物をNaOHで0.3Nとし、37゜で３時間
培養し、中和し、反応内容物をエタノールで沈殿させ
た。反応生成物を、6M尿素を含む８％ポリアクリルアミ
ドゲルで分離した。このゲルをオートラジオグラフにと
つたら74−bpプライマーが220塩基長に伸張されておる
ことが明らかにされ、逆転写酵素が恐らくはウイルスRN
Aの第１塩基まで伸張合成していることが示された。こ
のプライマー伸張物質のヌクレオチド配列分析により伸
張生成物がウイルスRNAの正に５′末端に達しているこ
とが確認された。
3）、50mMのKCl、0.5mMのジチオスレイトール（DTT）、
10mMのMgCl2、40μg/mlのアクチノマイシンＤ、各0.5mM
のデオキシアデノシントリホスフエート、デオキシシチ
ジントリホスフエート、デオキシクアノシントリホスフ
エート及びデオキシチミジントリホスフエートを含む0.
05mlの反応混合物に再浮遊させた。逆転写酵素（RNA依
存性DNAポリメラーゼ）を加え、混合物を42゜で60分培
養した。ついで混合物をNaOHで0.3Nとし、37゜で３時間
培養し、中和し、反応内容物をエタノールで沈殿させ
た。反応生成物を、6M尿素を含む８％ポリアクリルアミ
ドゲルで分離した。このゲルをオートラジオグラフにと
つたら74−bpプライマーが220塩基長に伸張されておる
ことが明らかにされ、逆転写酵素が恐らくはウイルスRN
Aの第１塩基まで伸張合成していることが示された。こ
のプライマー伸張物質のヌクレオチド配列分析により伸
張生成物がウイルスRNAの正に５′末端に達しているこ
とが確認された。
3. プライマー伸張物質の分子クローニング プライマー拡張バンド220塩基を８％ポリアクリルア
ミドゲルから切り出して精製した（前記参照）。このフ
ラグメントをエタノール沈殿し、1mMのCoCl2、0.14Mの
カコジル酸、0.2mMのDTT、0.15mMのdCTP、0.3mg/mlの牛
血清アルブミン、末端デオキシヌクレオチジルトランス
フエラーゼ酵素を含む0.1mlの混合物に浮遊させた。室
温で20分培養後に反応混合物をフエノールで抽出し、エ
タノール沈殿させた。この処理により一筋のｄ（Ｃ）残
渣をプライマー拡張フラグメントの３′末端に付加し
た。
ミドゲルから切り出して精製した（前記参照）。このフ
ラグメントをエタノール沈殿し、1mMのCoCl2、0.14Mの
カコジル酸、0.2mMのDTT、0.15mMのdCTP、0.3mg/mlの牛
血清アルブミン、末端デオキシヌクレオチジルトランス
フエラーゼ酵素を含む0.1mlの混合物に浮遊させた。室
温で20分培養後に反応混合物をフエノールで抽出し、エ
タノール沈殿させた。この処理により一筋のｄ（Ｃ）残
渣をプライマー拡張フラグメントの３′末端に付加し
た。
このオリゴｄ（Ｃ）が尾部に付いたフラグメントをつ
いで、オリゴｄ（Ｇ）12-18のプライマーとDNAポリメラ
ーゼＩ（クレノウ）を使い二本鎖にした。このフラグメ
ントを0.1MのトリスHCl（pH7.5）、0.2MのMgCl2、0.1M
のDTT、各1mMのdCTP、dATP、dTTP、dGTP、20μg/mlのオ
リゴｄ（Ｇ）、DNAポリメラーゼＩのクレノウフラグメ
ントを含む0.1mlの混合物中で培養した。37゜で60分培
養後に反応混合物をフエノールで抽出し、0.5cm×5cmの
セフアデツクスＧ−100カラムに適用し、0.1MのNaCl、1
0mMのトリスCl（pH7.5）、1mMのEDTAで平衡、展開し
た。放出分画をプールし、エタノール沈殿した。生成物
を末端トランスフエラーゼ反応（前述）に付して数筋の
オリゴｄ（Ｃ）をその３′末端に付加した。これらの尾
部付加分子をついで実施例１記載の技術を使いプラスミ
ドpBR322のPst I部位中にクローニングした。オリゴｄ
（Ｃ）の尾部を使いこのフラグメントをクローニングす
ることにより、プライマー伸張のためにホスホリル化さ
れていたBam H I部位を回復した。それ故この物質の大
腸菌への形質転換で得たテトラサイクリン耐性コロニー
をBam H Iでの開裂の点からスクリーニングした。Pst I
＋Bam H Iで除去される約220塩基長の挿入物を含む数分
子クローンを単離した。pVR105と呼ばれる１つのかかる
クローンのヌクレオチド配列分析により、それがウイル
スRNAの塩基１〜220を表現するDNAを含むことが示され
た。プラスミドpVR105は第３図に例示されている。
いで、オリゴｄ（Ｇ）12-18のプライマーとDNAポリメラ
ーゼＩ（クレノウ）を使い二本鎖にした。このフラグメ
ントを0.1MのトリスHCl（pH7.5）、0.2MのMgCl2、0.1M
のDTT、各1mMのdCTP、dATP、dTTP、dGTP、20μg/mlのオ
リゴｄ（Ｇ）、DNAポリメラーゼＩのクレノウフラグメ
ントを含む0.1mlの混合物中で培養した。37゜で60分培
養後に反応混合物をフエノールで抽出し、0.5cm×5cmの
セフアデツクスＧ−100カラムに適用し、0.1MのNaCl、1
0mMのトリスCl（pH7.5）、1mMのEDTAで平衡、展開し
た。放出分画をプールし、エタノール沈殿した。生成物
を末端トランスフエラーゼ反応（前述）に付して数筋の
オリゴｄ（Ｃ）をその３′末端に付加した。これらの尾
部付加分子をついで実施例１記載の技術を使いプラスミ
ドpBR322のPst I部位中にクローニングした。オリゴｄ
（Ｃ）の尾部を使いこのフラグメントをクローニングす
ることにより、プライマー伸張のためにホスホリル化さ
れていたBam H I部位を回復した。それ故この物質の大
腸菌への形質転換で得たテトラサイクリン耐性コロニー
をBam H Iでの開裂の点からスクリーニングした。Pst I
＋Bam H Iで除去される約220塩基長の挿入物を含む数分
子クローンを単離した。pVR105と呼ばれる１つのかかる
クローンのヌクレオチド配列分析により、それがウイル
スRNAの塩基１〜220を表現するDNAを含むことが示され
た。プラスミドpVR105は第３図に例示されている。
実施例 ４ 完全ポリオウイルスds cDNAプラスミドであるpVR106、p
VR106aの構成 プラスミドpVR104とpVR105をあわせてpBR322において
ポリオウイルスds cDNAの完全コピーを形成するに用い
た方法を第４図に示す。
VR106aの構成 プラスミドpVR104とpVR105をあわせてpBR322において
ポリオウイルスds cDNAの完全コピーを形成するに用い
た方法を第４図に示す。
プラスミドpVR104の部分的Bam H I開裂条件はプラス
ミドを酵素と共に37゜で長時間インキュベートすること
により決定した。消化物を0.6％アガロースゲル中で電
気泳動分析し、線状完全分子の存在を調べた。相当収量
の線状完全分子（定義すれば、Bam H Iにより一度切断
された分子の配列である）を使い100μｇのpVR104を消
化した。消化生成物を0.6％アガロースゲルで電気泳動
し、線状完全分子を除き、ゲルから回収した。ついでこ
れら分子をEcoR Iで開裂し、開裂生成物を0.6％アガロ
ースゲル電気泳動で分離した。ウイルスゲノムの塩基22
0から同ゲノムの３′末端を経てpBR322EcoR I部位に伸
張された８−Kb DNAフラグメントをそのサイズで確認
し、アガロースゲルから抽出した。
ミドを酵素と共に37゜で長時間インキュベートすること
により決定した。消化物を0.6％アガロースゲル中で電
気泳動分析し、線状完全分子の存在を調べた。相当収量
の線状完全分子（定義すれば、Bam H Iにより一度切断
された分子の配列である）を使い100μｇのpVR104を消
化した。消化生成物を0.6％アガロースゲルで電気泳動
し、線状完全分子を除き、ゲルから回収した。ついでこ
れら分子をEcoR Iで開裂し、開裂生成物を0.6％アガロ
ースゲル電気泳動で分離した。ウイルスゲノムの塩基22
0から同ゲノムの３′末端を経てpBR322EcoR I部位に伸
張された８−Kb DNAフラグメントをそのサイズで確認
し、アガロースゲルから抽出した。
同様に、プラスミドpVR105を線状完全分子を生産する
条件下で、0.6％アガロースゲル電気泳動での判断によ
り消化した。線状分子はゲル電気泳動で精製し、EcoR I
で開裂した。開裂生成物を0.6％アガロースゲル電気泳
動で分離した。ポリオウイルスゲノムの塩基１〜220を
表現するDNAに結合したpBR322のヌクレオチド１〜3607
からなるフラグメントをそのサイズで確認し、精製し
た。
条件下で、0.6％アガロースゲル電気泳動での判断によ
り消化した。線状分子はゲル電気泳動で精製し、EcoR I
で開裂した。開裂生成物を0.6％アガロースゲル電気泳
動で分離した。ポリオウイルスゲノムの塩基１〜220を
表現するDNAに結合したpBR322のヌクレオチド１〜3607
からなるフラグメントをそのサイズで確認し、精製し
た。
pVR104とpVR105とから単離した約0.1μｇのDNAフラグ
メント（前記を参照）を混合し、50mMのトリスHCl（pH
7.8）10mMのNgCl2、20mMのDTT、1mMのATPを含む反応混
合物中でインキュベートした。T4 DNAリガーゼを加え、
15℃で18時間インキュベートした。ついでこの被結合DN
Aで前述の如く大腸菌C600を形質転換した。様々な制限
エンドヌクレアーゼでのプラスミドDNAの開裂により完
全ポリオウイルスcDNAクローンの存在をテトラサイクリ
ン耐性コロニーで調べた。例えば、完全クローンをKpn
Iで開裂し、0.6％アガロースゲル電気泳動で調べたら82
00、2998、596塩基長のフラグメントが発生すると予測
される。pVR106、pVR106aとして確認された２つのクロ
ーンを酵素Bam H I、Kpn I、Pst I、Bg1 I、Bg1 II、Xb
a Iで消化したら完全クローンから予想されるパターン
と一致するパターンが得られた。
メント（前記を参照）を混合し、50mMのトリスHCl（pH
7.8）10mMのNgCl2、20mMのDTT、1mMのATPを含む反応混
合物中でインキュベートした。T4 DNAリガーゼを加え、
15℃で18時間インキュベートした。ついでこの被結合DN
Aで前述の如く大腸菌C600を形質転換した。様々な制限
エンドヌクレアーゼでのプラスミドDNAの開裂により完
全ポリオウイルスcDNAクローンの存在をテトラサイクリ
ン耐性コロニーで調べた。例えば、完全クローンをKpn
Iで開裂し、0.6％アガロースゲル電気泳動で調べたら82
00、2998、596塩基長のフラグメントが発生すると予測
される。pVR106、pVR106aとして確認された２つのクロ
ーンを酵素Bam H I、Kpn I、Pst I、Bg1 I、Bg1 II、Xb
a Iで消化したら完全クローンから予想されるパターン
と一致するパターンが得られた。
pVR106、pVR106aからの挿入体の５′末端のヌクレオ
チド配列により、これら分子クローン中にウイルスRNA
の５′末端が存在することが実証された。それ故、pVR1
06とpVR106aとはpBR322のPst I部位にポリオウイルスゲ
ノムの完全cDNAコピーを含んでいた。
チド配列により、これら分子クローン中にウイルスRNA
の５′末端が存在することが実証された。それ故、pVR1
06とpVR106aとはpBR322のPst I部位にポリオウイルスゲ
ノムの完全cDNAコピーを含んでいた。
プラスミドpVR106を含む細菌細胞系の寄託はATCCにな
されており、ATCC受入No.31844として確認される。この
寄託物は細胞宿主大腸菌HB101中のプラスミドpVR106か
らなる。このプラスミドはrecA-であるこの細菌株に挿
入されてその安定性を維持されている。実施例１の3c項
記載の方法を用いて形質転換を達成した。
されており、ATCC受入No.31844として確認される。この
寄託物は細胞宿主大腸菌HB101中のプラスミドpVR106か
らなる。このプラスミドはrecA-であるこの細菌株に挿
入されてその安定性を維持されている。実施例１の3c項
記載の方法を用いて形質転換を達成した。
実施例 ５ ポリオウイルスcDNAの配列 クローンpVR106へのポリオウイルス特異性挿入体の完
全ヌクレオチド配列を公表技術を使い得た。Maxam,A.M.
とGilbert,W.（1980）のMethods in Enzymology,Grossm
an,L.とMoldave,K.のeds.,第65巻、499〜559頁、ニユー
ヨークのアカデミツクプレス発行、を参照されたい。こ
の配列は表Ｉに示されている。
全ヌクレオチド配列を公表技術を使い得た。Maxam,A.M.
とGilbert,W.（1980）のMethods in Enzymology,Grossm
an,L.とMoldave,K.のeds.,第65巻、499〜559頁、ニユー
ヨークのアカデミツクプレス発行、を参照されたい。こ
の配列は表Ｉに示されている。
５′未翻訳領域では潜在的末端コードンが星印でマー
クされ、それらが生ずる相が示されている。未翻訳領域
のATGコードンには下線が付され、それらが生ずる相が
示されている。配列は塩基743で始まり塩基7339を経る
アミノ酸に翻訳される。
クされ、それらが生ずる相が示されている。未翻訳領域
のATGコードンには下線が付され、それらが生ずる相が
示されている。配列は塩基743で始まり塩基7339を経る
アミノ酸に翻訳される。
ウイルスRNAの５′末端に結合した蛋白であるVPgのコ
ード領域とアミノ酸配列とは下線で示されている。VPg
の位置は公表配列に基く。Larsen,G.R.,Semler,B.L.,Wi
mmer,E.のJ.Virol．37,328〜335（1981）を参照された
い。
ード領域とアミノ酸配列とは下線で示されている。VPg
の位置は公表配列に基く。Larsen,G.R.,Semler,B.L.,Wi
mmer,E.のJ.Virol．37,328〜335（1981）を参照された
い。
ビリオン蛋白の位置はアミノ酸配列データに基づいて
示してある。
示してある。
実施例６ 完全ポリオウイルスクローンによる細胞のトランスフエ
クシヨン 10cmプラスチツク皿でCV−１細胞とHeLa細胞とを増殖
させて80％集合にした。略述すれば、細胞を10％牛血清
を含むダルベッコ（Dulbecco）改良イーグル培地（DME
M）で増殖させた。細胞を、５％CO2が補充された大気を
含む給湿インキュベータ内で37℃で維持した。
クシヨン 10cmプラスチツク皿でCV−１細胞とHeLa細胞とを増殖
させて80％集合にした。略述すれば、細胞を10％牛血清
を含むダルベッコ（Dulbecco）改良イーグル培地（DME
M）で増殖させた。細胞を、５％CO2が補充された大気を
含む給湿インキュベータ内で37℃で維持した。
実施例１記載と同様にして作つた、１皿当たり１μｇ
のプラスミドDNAから２μｇのウイルスRNAで細胞をトラ
ンスフエクシヨンした。ParkerとStarkにより記載の改
良リン酸カルシウム技術を使いトランスフエクシヨンを
達成した。B.A.ParkerとG.R.StarkのJ.Virol.,31,360
（1979）を参照されたい。略述すれば、培地を細胞から
除き、DNAをヘペス緩衝塩水中でリン酸カルシウム沈殿
物として加えた。室温で20分後に細胞を温培地（ダルベ
ツコ改良イーグル培地＋10％牛血清）で被い、37゜で数
時間培養した。ついで培地を除き、細胞を温培地で１度
洗い、2.5ml/皿のヘペス緩衝塩水中15％グリセリンを加
えた。37℃で3.5分間にグリセリンを除き、細胞を温培
地で１度洗つた。ついで、反復皿のうちの１枚を温培地
で被い、他は１％アガロース（シグマ）を含む培地で被
つた。両プレートを37℃で４〜５日培養した。プラーク
を計数するために上層の寒天を除き、細胞を50％エタノ
ール中0.1％クリスタルバイオレットで染色した。液体
下で培養した細胞からの培地をHeLa細胞単層で病原性ポ
リオウイルスの有無の寒天から分析した。
のプラスミドDNAから２μｇのウイルスRNAで細胞をトラ
ンスフエクシヨンした。ParkerとStarkにより記載の改
良リン酸カルシウム技術を使いトランスフエクシヨンを
達成した。B.A.ParkerとG.R.StarkのJ.Virol.,31,360
（1979）を参照されたい。略述すれば、培地を細胞から
除き、DNAをヘペス緩衝塩水中でリン酸カルシウム沈殿
物として加えた。室温で20分後に細胞を温培地（ダルベ
ツコ改良イーグル培地＋10％牛血清）で被い、37゜で数
時間培養した。ついで培地を除き、細胞を温培地で１度
洗い、2.5ml/皿のヘペス緩衝塩水中15％グリセリンを加
えた。37℃で3.5分間にグリセリンを除き、細胞を温培
地で１度洗つた。ついで、反復皿のうちの１枚を温培地
で被い、他は１％アガロース（シグマ）を含む培地で被
つた。両プレートを37℃で４〜５日培養した。プラーク
を計数するために上層の寒天を除き、細胞を50％エタノ
ール中0.1％クリスタルバイオレットで染色した。液体
下で培養した細胞からの培地をHeLa細胞単層で病原性ポ
リオウイルスの有無の寒天から分析した。
結果は表２に示されており、そこに示されているウイ
ルス力価は典型的実験での値である。
ルス力価は典型的実験での値である。
RNAse処理のために５μｇの沸騰パンクレアチンRNAse
（ワシントン）を10μｇのDNA又は２μｇのRNAに対して
使つた。
（ワシントン）を10μｇのDNA又は２μｇのRNAに対して
使つた。
判明する如く、pVR106でトランスフエクシヨンされた
細胞からの培値において高ウイルス力価が発見された
が、pBR322−トランスフェクション細胞からはウイルス
は放出されなかつた。細胞をpVR106でトランスフエクシ
ヨンし、寒天下で培養し、クリスタルバイオレツトで染
色したら、ポリオウイルス誘発プラークに似たプラーク
が示された。pBR322DNAでトランスフエクシヨンされた
細胞ではプラークは観察されなかつた。普通、10μｇの
pVR106でトランスフエクシヨンされた細胞の100mmプレ
ート１個当たり10〜70のプラークが観察された。Parker
とStarkが提示の如くこれら細胞のうちの約10％がDNAを
受け入れたならば、感染性病巣は約２〜８×10-5の率で
発生していた。
細胞からの培値において高ウイルス力価が発見された
が、pBR322−トランスフェクション細胞からはウイルス
は放出されなかつた。細胞をpVR106でトランスフエクシ
ヨンし、寒天下で培養し、クリスタルバイオレツトで染
色したら、ポリオウイルス誘発プラークに似たプラーク
が示された。pBR322DNAでトランスフエクシヨンされた
細胞ではプラークは観察されなかつた。普通、10μｇの
pVR106でトランスフエクシヨンされた細胞の100mmプレ
ート１個当たり10〜70のプラークが観察された。Parker
とStarkが提示の如くこれら細胞のうちの約10％がDNAを
受け入れたならば、感染性病巣は約２〜８×10-5の率で
発生していた。
pVR106a（実施例４参照）と呼ばれる独立して誘導さ
れた完全ポリオウイルスcDNAクーロンでトランスフエク
シヨンにしても、細胞へのトランスフエクシヨン後に感
染ウイルスが生じた。
れた完全ポリオウイルスcDNAクーロンでトランスフエク
シヨンにしても、細胞へのトランスフエクシヨン後に感
染ウイルスが生じた。
結果を同じく表２に提示した別の実験により、トラン
スフエクシヨンされた細胞でのウイルス生産がプラスミ
ドpVR106で指示されることが示された。プラスミドpVR1
06を45部位で切断し、ウイルスRNAの感染性を下げない
酵素であるHinf Iで開裂されたpVR106DNAでトランスフ
エクシヨンされた細胞ではウイルスは検出されなかつ
た。ウイルスRNAの感染性を損う条件下でのRNAscでの処
理ではpVR106 DNAの感染性は有意には下がらなかった。
それ故、感染性はpVR106 DNAに混在しているウイルスRN
Aに起因するのではなかつた。pVR106 DNAのフエノーウ
抽出のみ、或はこれに続くRNAse処理ではプラスミドの
感染性は下がらなかつた。従つて、ビリオンがpVR106調
製物中に存在するとは思われなかつた。HeLe細胞単層で
のビリオン夾雑をpVR106 DNAで直接分析したら感染性は
検出されなかつた（データは示されていない）。これら
結果は、pVR106の感染性がプラスミドDNAに固有である
ことを示している。
スフエクシヨンされた細胞でのウイルス生産がプラスミ
ドpVR106で指示されることが示された。プラスミドpVR1
06を45部位で切断し、ウイルスRNAの感染性を下げない
酵素であるHinf Iで開裂されたpVR106DNAでトランスフ
エクシヨンされた細胞ではウイルスは検出されなかつ
た。ウイルスRNAの感染性を損う条件下でのRNAscでの処
理ではpVR106 DNAの感染性は有意には下がらなかった。
それ故、感染性はpVR106 DNAに混在しているウイルスRN
Aに起因するのではなかつた。pVR106 DNAのフエノーウ
抽出のみ、或はこれに続くRNAse処理ではプラスミドの
感染性は下がらなかつた。従つて、ビリオンがpVR106調
製物中に存在するとは思われなかつた。HeLe細胞単層で
のビリオン夾雑をpVR106 DNAで直接分析したら感染性は
検出されなかつた（データは示されていない）。これら
結果は、pVR106の感染性がプラスミドDNAに固有である
ことを示している。
実施例７ 抗体中和テスト pVR106−トラスフエクシヨン細胞で生産されたウイル
スの本体を抗体中和テストを使い調べた。実施例６の方
法で得られたpVR106トランスフエクシヨン細胞の培地中
に放出された約100プラーク形成単位のウイルスを様々
な希釈度のウサギ抗ポリオウイルス抗血清と混合して感
染性を分析した。並行して、100プラーク形成単位の真
正ポリオウイルスの血清による中和を分析した。両ウイ
ルスを1/50,000希釈度の血清で５％に中和したらpVR106
誘導ウイルスが真正ポリオウイルスであることが示され
た。
スの本体を抗体中和テストを使い調べた。実施例６の方
法で得られたpVR106トランスフエクシヨン細胞の培地中
に放出された約100プラーク形成単位のウイルスを様々
な希釈度のウサギ抗ポリオウイルス抗血清と混合して感
染性を分析した。並行して、100プラーク形成単位の真
正ポリオウイルスの血清による中和を分析した。両ウイ
ルスを1/50,000希釈度の血清で５％に中和したらpVR106
誘導ウイルスが真正ポリオウイルスであることが示され
た。
実施例８ ポリオウイルスクローンpVR104による細胞のトランスフ
エクシヨン 上記実施例２に記載の如くして製造したプラスミドpV
R104は全ポリオウイルスゲノムに対するほぼ完全なcDNA
配列を含むがポリオウイルスゲノムの初めの115の塩基
を欠く、プラスミドpVR104を実施例６の方法でCV−１細
胞にトランスフエクシヨンしたがウイルスは生産され
ず、ポリオウイルスRNAの５′末端は蛋白をコードしな
い（この領域にはAUGコードンはない）が感染性にとり
必要であることを示している。
エクシヨン 上記実施例２に記載の如くして製造したプラスミドpV
R104は全ポリオウイルスゲノムに対するほぼ完全なcDNA
配列を含むがポリオウイルスゲノムの初めの115の塩基
を欠く、プラスミドpVR104を実施例６の方法でCV−１細
胞にトランスフエクシヨンしたがウイルスは生産され
ず、ポリオウイルスRNAの５′末端は蛋白をコードしな
い（この領域にはAUGコードンはない）が感染性にとり
必要であることを示している。
本明細書記載の発明は組換体DNA技術によりポリオウ
イルスcDNA等のRNAウイルスの生産に役立つ。一方ポリ
オウイルスcDNA等の生産物はかかるウイルスの検出分
析、かかるウイルスに対するウイルス系抗原、抗体の生
産等に役立つ。
イルスcDNA等のRNAウイルスの生産に役立つ。一方ポリ
オウイルスcDNA等の生産物はかかるウイルスの検出分
析、かかるウイルスに対するウイルス系抗原、抗体の生
産等に役立つ。
当業者ならば本明細書記載の発明の特定態様の多くの
均等態様を認識し、或は単なるルーチンの実験で確認で
きるであろう。かかる均等態様も次の請求の範囲に包含
される。
均等態様を認識し、或は単なるルーチンの実験で確認で
きるであろう。かかる均等態様も次の請求の範囲に包含
される。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:92） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (56)参考文献 Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｅ．Ａｃａｄ．Ｓｃ ｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ Ｖｏｌ．73（1976) Ｐ．3408−3412
Claims (13)
- 【請求項１】表１に記載の配列中の塩基配列を有するcD
NA、または表１に記載の配列中のアミノ酸配列と同じア
ミノ酸配列をコードするcDNA、あるいはそれらのcDNAと
相補性を有するcDNAである感染性を有するポリオウイル
スcDNA。 - 【請求項２】表１に記載の配列中の塩基配列を有するcD
NA、または表１に記載の配列中のアミノ酸配列と同じア
ミノ酸配列をコードするcDNA、あるいはそれらのcDNAと
相補性を有するcDNAである感染性を有するポリオウイル
スcDNAを含む、組換え体DNAベクター。 - 【請求項３】キメラプラスミドである、請求項２の組換
え体ベクター。 - 【請求項４】ベクターがプラスミドpVR106である、請求
項２の組換え体ベクター。 - 【請求項５】ａ）ポリオウイルスRNAを逆転写して一本
鎖のポリオウイルスcDNAを生成し； ｂ）該一本鎖ポリオウイルスcDNAから二本鎖のポリオウ
イルスcDNAを生成し； ｃ）該二本鎖ポリオウイルスcDNAを細菌プラスミドに挿
入してキメラプラスミドを作成し； ｄ）該キメラプラスミドで細菌細胞を形質転換し； ｅ）形質転換された細菌細胞をクローニングして該二本
鎖ポリオウイルスcDNAを複製可能なクローン細菌細胞系
を作成し； ｆ）上記二本鎖ポリオウイルスcDNAを生産可能な条件で
該クローン細菌細胞系を培養し； ｇ）該細胞培養物から上記二本鎖ポリオウイルスcDNAを
回収する ことからなる、表１に記載の配列中の塩基配列を有する
cDNA、または表１に記載の配列中のアミノ酸配列と同じ
アミノ酸配列をコードするcDNA、あるいはそれらのcDNA
と相補性を有するcDNAである感染性を有するポリオウイ
ルスcDNAの生産方法。 - 【請求項６】上記細菌細胞が大腸菌細胞である、請求項
５の方法。 - 【請求項７】上記細菌プラスミドが形質転換細胞に対す
る選択可能なマーカーを含む、請求項５または６の方
法。 - 【請求項８】上記選択可能なマーカーが抗生物質耐性で
ある、請求項７の方法。 - 【請求項９】上記細菌プラスミドが大腸菌プラスミドpB
R322からなる、請求項８の方法。 - 【請求項１０】表１に記載の配列中の塩基配列を有する
cDNA、または表１に記載の配列中のアミノ酸配列と同じ
アミノ酸配列をコードするcDNA、あるいはそれらのcDNA
と相補性を有するcDNAである感染性を有するポリオウイ
ルスcDNAを含む組換え体DNAベクターで形質転換され
た、クローン細胞系。 - 【請求項１１】上記組換え体DNAベクターがキメラプラ
スミドである、請求項10のクローン細胞系。 - 【請求項１２】上記細胞が大腸菌である、請求項10また
は11のクローン細胞系。 - 【請求項１３】ATCC受託番号No.31884を有するクローン
細胞系である、請求項11のクローン細胞系。
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US25587981A | 1981-04-20 | 1981-04-20 | |
| US255879 | 1981-04-20 | ||
| US06/320,525 US4719177A (en) | 1981-04-20 | 1981-11-12 | Production of complementary DNA representing RNA viral sequences by recombinant DNA methods and uses therefor |
| US320525 | 1999-05-26 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS58500589A JPS58500589A (ja) | 1983-04-21 |
| JP2647072B2 true JP2647072B2 (ja) | 1997-08-27 |
Family
ID=26945024
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP57501652A Expired - Lifetime JP2647072B2 (ja) | 1981-04-20 | 1982-04-14 | ポリオウイルスｃＤＮＡ |
Country Status (6)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4719177A (ja) |
| EP (1) | EP0076847B1 (ja) |
| JP (1) | JP2647072B2 (ja) |
| DE (1) | DE3280246D1 (ja) |
| IT (1) | IT1156461B (ja) |
| WO (1) | WO1982003632A1 (ja) |
Families Citing this family (39)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| IL66614A (en) * | 1981-08-28 | 1985-09-29 | Genentech Inc | Method of constructing a dna sequence encoding a polypeptide,microbial production of human serum albumin,and pharmaceutical compositions comprising it |
| FR2521165A1 (fr) * | 1982-02-08 | 1983-08-12 | Pasteur Institut | Fragments d'adn codant pour un peptide immunogene susceptible d'introduire in vivo la synthese d'anticorps anti-poliovirus |
| US5478746A (en) * | 1982-04-07 | 1995-12-26 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | cDNA encoding attenuated cell culture adapted hepatitis A virus genome |
| EP0120906B1 (en) * | 1982-10-11 | 1988-09-21 | National Research Development Corporation | Polypeptides useful in vaccination against enteroviruses |
| DE3381494D1 (de) * | 1982-11-30 | 1990-05-31 | Pasteur Institut | Immunogen-lage des poliovirus enthaltende peptide und dns enthaltend nukleotidfragmente die fuer diese peptide kodieren. |
| FR2548212B1 (fr) * | 1983-06-29 | 1990-06-08 | Pasteur Institut | Peptides comportant un site immunogene du poliovirus et adns contenant des sequences nucleotidiques codant pour ces peptides |
| EP0323861B1 (fr) * | 1982-11-30 | 1993-10-06 | Institut Pasteur | Peptides comportant un site immunogène du poliovirus de la souche sabin |
| DE3484244D1 (de) * | 1983-09-30 | 1991-04-11 | Massachusetts Inst Technology | Herstellung von cdna die hepatitis a virale sequenzen darstellen. |
| WO1985004663A1 (en) * | 1984-04-06 | 1985-10-24 | Life Technologies Inc. | Method of detecting nucleic acid sequences |
| US4743553A (en) * | 1984-07-18 | 1988-05-10 | W. R. Grace & Co. | Synthetic genes for bovine parainfluenza virus |
| JPS61158792A (ja) * | 1984-08-31 | 1986-07-18 | リサ−チ・コ−ポレイシヨン | ブル−タングウイルス検出用ｄｎａプロ−ブ |
| GB8508685D0 (en) * | 1985-04-03 | 1985-05-09 | Minor P D | Peptides |
| US8597910B1 (en) | 1985-04-11 | 2013-12-03 | Children's Medical Center Corporation | DNA encoding Von Willebrand Factor (VWF) and methods and cells for producing VFW, and VFW produced by the DNA, methods and cells |
| US5091309A (en) * | 1986-01-16 | 1992-02-25 | Washington University | Sindbis virus vectors |
| US5262177A (en) * | 1986-02-07 | 1993-11-16 | Oncogen | Recombinant viruses encoding the human melanoma-associated antigen |
| US5348741A (en) * | 1987-02-03 | 1994-09-20 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Vector for recombinant poxvirus expressing rabies virus glycoprotein |
| FR2623817B1 (fr) * | 1987-11-26 | 1990-05-04 | Pasteur Institut | Sondes pour la detection d'enterovirus par hybridation moleculaire et pour la discrimination entre des poliovirus et d'autres enterovirus |
| ATE121779T1 (de) * | 1988-01-11 | 1995-05-15 | American Cyanamid Co | Nichtzurückschlagende rns-viren. |
| US5622820A (en) * | 1988-03-10 | 1997-04-22 | City Of Hope | Method for amplification and detection of RNA and DNA sequences |
| US5217879A (en) * | 1989-01-12 | 1993-06-08 | Washington University | Infectious Sindbis virus vectors |
| US5026686A (en) * | 1989-02-01 | 1991-06-25 | Washington University | Antiviral peptides |
| US5438126A (en) * | 1989-09-11 | 1995-08-01 | Arch Development Corporation | Human thyroid hormone receptor DNA |
| IL99232A0 (en) * | 1990-08-20 | 1992-07-15 | Univ Columbia | Methods for producing rna viruses from cdna |
| US6027722A (en) * | 1990-10-25 | 2000-02-22 | Nature Technology Corporation | Vectors for gene transfer |
| CA2072581A1 (en) * | 1990-10-25 | 1992-04-26 | Clague Hodgson | Method of gene transfer using retrotransposons |
| CA2157931A1 (en) | 1993-03-12 | 1994-09-15 | Clague P. Hodgson | Improved vectors for gene therapy |
| US5585477A (en) * | 1993-07-13 | 1996-12-17 | Us Health | Poliovirus specific primers |
| US5591579A (en) * | 1993-12-21 | 1997-01-07 | Washington University | Indicator cell line for detecting RNA viruses and method therefor |
| US20030190753A1 (en) * | 1995-11-09 | 2003-10-09 | Nature Technology Corporation | Vectors for gene transfer |
| US6001613A (en) * | 1996-05-24 | 1999-12-14 | Board Of Regents Of University Of Nebraska | Plasmid bearing a cDNA copy of the genome of bovine viral diarrhea virus, chimeric derivatives thereof, and method of producing an infectious bovine viral diarrhea virus using said plasmid |
| BRPI9701774B8 (pt) | 1997-04-11 | 2015-09-29 | Fundação Oswaldo Cruz Fiocruz | cdna mutante e infeccioso do vírus da febre amarela, constructo de dna, vírus recombinante de febre amarela e vacina para humanos contra infecções de febre amarela. |
| US7179473B2 (en) * | 1998-06-05 | 2007-02-20 | Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh | Attenuated pestiviruses |
| US7135561B2 (en) | 2001-09-06 | 2006-11-14 | Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh | Infectious bovine viral diarrhea virus clone |
| US7572455B2 (en) * | 2004-05-19 | 2009-08-11 | Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh | Vaccine comprising an attenuated pestivirus |
| US7247457B2 (en) * | 2005-04-26 | 2007-07-24 | United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services, Centers For Disease Control And Prevention | Detection and identification of enteroviruses by semi-nested amplification of the enterovirus VP1 protein |
| US20090068223A1 (en) * | 2005-11-15 | 2009-03-12 | Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. | Combination vaccine comprising an attenuated bovine viral diarrhea virus |
| UY31930A (es) * | 2008-06-25 | 2010-01-29 | Boheringer Ingelheim Pharma Kg | Pestivirus atenuados recombinantes, en particular a csfv, bvdv o bdv atenuado recombinante |
| US8846054B2 (en) * | 2009-01-09 | 2014-09-30 | Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. | Method of treating pregnant cows and/or heifers |
| US10954492B2 (en) | 2015-06-10 | 2021-03-23 | The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | Processes for production and purification of nucleic acid-containing compositions |
Family Cites Families (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4237224A (en) * | 1974-11-04 | 1980-12-02 | Board Of Trustees Of The Leland Stanford Jr. University | Process for producing biologically functional molecular chimeras |
| DD143794A1 (de) * | 1979-06-01 | 1980-09-10 | Liebscher Dirck Hartmut | Verfahren zur isolierung langer doppelstrang-cdns-molekuele aus einer heterogenen population |
| US4271145A (en) * | 1979-10-22 | 1981-06-02 | The Massachusetts General Hospital | Process for producing antibodies to hepatitis virus and cell lines therefor |
| DK207681A (da) * | 1980-05-12 | 1981-11-13 | Biogen Nv | Dna-sekvenser rekombinations-dna-molekyler og fremgangsmaade klovsyge virale antigener til fremstilling af polypeptider med specificitet som mund og |
| NZ198388A (en) * | 1980-09-18 | 1985-05-31 | Wellcome Found | Dna molecule comprising sequence substantially corresponding to at least part of foot and mouth disease virus rna;transformed host cell;antigen and vaccine |
| FR2506326A1 (fr) * | 1981-05-19 | 1982-11-26 | Pasteur Institut | Fragments d'adn portant des parties de l'information genetique des poliovirus, notamment du type pv1, et procede pour leur obtention |
| GB2103622B (en) * | 1981-06-16 | 1986-01-15 | Genentech Inc | Production of foot and mouth disease vaccine from microbially expressed antigens |
-
1981
- 1981-11-12 US US06/320,525 patent/US4719177A/en not_active Expired - Lifetime
-
1982
- 1982-04-14 JP JP57501652A patent/JP2647072B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1982-04-14 DE DE8282901667T patent/DE3280246D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1982-04-14 WO PCT/US1982/000467 patent/WO1982003632A1/en not_active Ceased
- 1982-04-14 EP EP82901667A patent/EP0076847B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1982-04-20 IT IT67522/82A patent/IT1156461B/it active
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｅ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ Ｖｏｌ．７３（１９７６）Ｐ．３４０８−３４１２ |
| PROC.NATL.ACAD.SCI.U.S.A=1976 * |
| PROC.NATL.ACAD.SCI.USA=1976 * |
| VIROLOGY=1981 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS58500589A (ja) | 1983-04-21 |
| WO1982003632A1 (en) | 1982-10-28 |
| EP0076847A1 (en) | 1983-04-20 |
| DE3280246D1 (de) | 1990-10-25 |
| IT1156461B (it) | 1987-02-04 |
| IT8267522A0 (it) | 1982-04-20 |
| EP0076847B1 (en) | 1990-09-19 |
| US4719177A (en) | 1988-01-12 |
| EP0076847A4 (en) | 1983-07-08 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP2647072B2 (ja) | ポリオウイルスｃＤＮＡ | |
| FI86437C (fi) | Foerfarande foer framstaellning av polypeptider med de antigena egenskaperna hos ett hepatitis b- virusantigen. | |
| AU574385B2 (en) | Streptococal m protein immunogens | |
| US5436139A (en) | Non-passageable virus | |
| JPH08510129A (ja) | Ｂ型肝炎ウイルス突然変異体、試薬及び検出方法 | |
| JPH05502156A (ja) | 真核細胞でのｈｃｖ培養法 | |
| JP2004089197A (ja) | 組換えｄｎａ技術によってｄｎａ、ｒｎａ、ペプタイド、ポリペプタイド、または蛋白質を取得するための方法 | |
| EP0162054B1 (en) | Production of cdna representing hepatitis a viral sequences | |
| JP4142093B2 (ja) | Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ Ｔｙｐｈｉのゲノムに由来する核酸配列、及び特に食料品中におけるサルモネラ属の細菌の存在のｉｎ ｖｉｔｒｏ診断のためのその使用 | |
| Marquardt et al. | Detection of foot-and-mouth disease virus in nasal swabs of asymptomatic cattle by RT-PCR within 24 hours | |
| CA2526403A1 (en) | New enterovirus, vaccines, medicaments and diagnostic kits | |
| WO1994005700A2 (en) | Methods and reagents to detect and characterize norwalk and related viruses | |
| Stanwick et al. | Role of interferon in six cell lines persistently infected with rubella virus | |
| EP0182442B2 (en) | Recombinant DNA molecules and their method of production | |
| US5061623A (en) | Peptides comprising an immunogenic site of poliovirus and dnas containing nucleotide sequences coding for these peptides | |
| Polvino-Bodnar et al. | Construction and characterization of viable deletion mutants of simian virus 40 lacking sequences near the 3′ end of the early region | |
| US5525715A (en) | Method for producing RNA viruses from cDNA | |
| US5849562A (en) | Production of complementary DNA representing hepatitis A viral sequences by recombinant DNA methods and uses therefor | |
| PT85572B (pt) | Processo para a preparacao de polipeptidos da estirpe de rhinovirus hrv89 assim como de moleculas de dna que os codificam e de composicoes farmaceuticas que os contem | |
| Winocour | The investigation of oncogenic viral genomes in transformed cells by nucleic acid hybridization | |
| US6270955B1 (en) | Pharmaceutical compositions and methods for producing antibodies to hepatitis b virus and kits and methods for detecting antibodies to hepatitis b virus | |
| Radloff | Isolation and preliminary characterization of temperature-sensitive mutants of encephalomyocarditis virus | |
| Old et al. | Development of chemiluminescent probe hybridization, RT-PCR and nucleic acid cycle sequencing assays of Sabin type 3 isolates to identify base pair 472 Sabin type 3 mutants associated with vaccine associated paralytic poliomyelitis | |
| RU2073718C1 (ru) | Фрагмент днк нс 280, полученный с помощью химического синтеза, рекомбинантный полипептид нс 280 молекулярной массы 120-130 кда, обладающий способностью связывать антитела к продукту гена белка ns4 вируса гепатита с, полученный при культивировании штамма бактерий escherichia coli - штамм бактерий escherichia coli - продуцент рекомбинантного полипептида нс 280, обладающего способностью связывать антитела к продукту гена белка ns4 вируса гепатита с | |
| US5198536A (en) | Peptides comprising an immunogenic site of poliovirus and DNAs containing nucleotide sequences coding for these peptides |