JP2650155B2 - モノクローナル抗体、その製法およびそれからなる酵素定量用試薬 - Google Patents
モノクローナル抗体、その製法およびそれからなる酵素定量用試薬Info
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- JP2650155B2 JP2650155B2 JP62205073A JP20507387A JP2650155B2 JP 2650155 B2 JP2650155 B2 JP 2650155B2 JP 62205073 A JP62205073 A JP 62205073A JP 20507387 A JP20507387 A JP 20507387A JP 2650155 B2 JP2650155 B2 JP 2650155B2
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- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明はモノクローナル抗体、その製法およびモノク
ローナル抗体からなる酵素定量用試薬ならびに心臓およ
び肝臓疾患診断剤としての上記試薬に関する。
ローナル抗体からなる酵素定量用試薬ならびに心臓およ
び肝臓疾患診断剤としての上記試薬に関する。
さらに詳しくは本発明はヒト乳酸脱水素酵素Ｍサブユ
ニットに対するモノクローナル抗体、その製法および該
モノクローナル抗体からなるヒト乳酸脱水素酵素アイソ
ザイムの定量用試薬ならびに心臓および肝臓疾患診断剤
としての上記試薬に関するものである。
ニットに対するモノクローナル抗体、その製法および該
モノクローナル抗体からなるヒト乳酸脱水素酵素アイソ
ザイムの定量用試薬ならびに心臓および肝臓疾患診断剤
としての上記試薬に関するものである。
ヒト血清中における乳酸脱水素酵素（これを以下LDH
と略称する）の活性はヒトの各種疾患と相互に関連性が
あり、LDHの活性の検査は臨床検査の分野で疾患診断の
ための資料として重要な役割を演じている。
と略称する）の活性はヒトの各種疾患と相互に関連性が
あり、LDHの活性の検査は臨床検査の分野で疾患診断の
ための資料として重要な役割を演じている。
LDHはＨサブユニット（心筋型サブユニット）および
Ｍサブユニット（骨核筋型サブユニット）と呼ばれる２
種類のサブユニットの４量体からなる酵素であって、そ
のサブユニットの組合わせからなる５種類のアイソザイ
ム、すなわちH4のＩ型、H3MのII型、H2M2のIII型、HM3
のIV型およびM4のＶ型の合計５種類のアイソザイムが存
在する。
Ｍサブユニット（骨核筋型サブユニット）と呼ばれる２
種類のサブユニットの４量体からなる酵素であって、そ
のサブユニットの組合わせからなる５種類のアイソザイ
ム、すなわちH4のＩ型、H3MのII型、H2M2のIII型、HM3
のIV型およびM4のＶ型の合計５種類のアイソザイムが存
在する。
ヒト血清中におけるこれらのLDHアイソザイムの構成
比はヒトの疾患と関係があり、例えば心臓疾患の心筋梗
塞ではＩ型およびII型が多いのに対し、肝臓疾患では逆
にＶ型が多いことが知られている（F.Wroblewski,“Enz
ymes in clinical chemistry"p.399,Butterworth,Londo
n,1962）。従ってこれらのアイソザイムの構成比を分析
することにより疾病の診断にきわめて有力な情報がもた
らされることになる。
比はヒトの疾患と関係があり、例えば心臓疾患の心筋梗
塞ではＩ型およびII型が多いのに対し、肝臓疾患では逆
にＶ型が多いことが知られている（F.Wroblewski,“Enz
ymes in clinical chemistry"p.399,Butterworth,Londo
n,1962）。従ってこれらのアイソザイムの構成比を分析
することにより疾病の診断にきわめて有力な情報がもた
らされることになる。
［従来の技術］ LDHアイソザイムの分別測定には従来から電気泳動
法、イオン交換クロマトグラフィー法、アイソザイムの
安定性の違いに基づく分析法などが用いられてきたが、
これらの方法は手間と時間のかかる煩雑なものであるた
めに、臨床検査の実務家からより簡単でかつ正確なLDH
アイソザイムの分析法の開発が望まれていた。
法、イオン交換クロマトグラフィー法、アイソザイムの
安定性の違いに基づく分析法などが用いられてきたが、
これらの方法は手間と時間のかかる煩雑なものであるた
めに、臨床検査の実務家からより簡単でかつ正確なLDH
アイソザイムの分析法の開発が望まれていた。
［問題点を解決するための手段］ 本発明者等は鋭意研究の結果ヒトLDHのＭサブユニッ
トに特異的に反応するモノクローナル抗体を得ることに
成功し、またこれを利用することによってヒトLDHアイ
ソザイムの分析、定量をきわめて簡便に行う測定法を開
発し、心臓疾患、肝臓疾患の診断のために応用可能であ
るとの知見を得たのである。
トに特異的に反応するモノクローナル抗体を得ることに
成功し、またこれを利用することによってヒトLDHアイ
ソザイムの分析、定量をきわめて簡便に行う測定法を開
発し、心臓疾患、肝臓疾患の診断のために応用可能であ
るとの知見を得たのである。
本発明はこの知見に基づいて完成されたものである。
すなわち、本発明によれば、ヒト乳酸脱水素酵素Ｍサ
ブユニットに対するモノクローナル抗体が提供される。
ブユニットに対するモノクローナル抗体が提供される。
本発明によれば特にIgGに属する免疫グロブリンであ
るヒト乳酸脱水素酵素Ｍサブユニットに対するモノクロ
ーナル抗体が提供される。さらに本発明によれば、マウ
スをヒト乳酸脱水素酵素Ｍサブユニットで免疫して得ら
れるマウスの脾細胞と、マウスミエローマ細胞とを通常
の方法で融合し、ヒト乳酸脱水素酵素Ｍサブユニットに
対するモノクローナル抗体を産生する能力を有する融合
細胞を、培地で培養するか、またはマウス腹腔内に移植
して腹水癌化することにより培養液中または腹水中に該
モノクローナル抗体を生成蓄積させ、該培養液または腹
水中から該モノクローナル抗体を採取することを特徴と
するヒト乳酸脱水素酵素Ｍサブユニットに対するモノク
ローナル抗体の製法が提供される。
るヒト乳酸脱水素酵素Ｍサブユニットに対するモノクロ
ーナル抗体が提供される。さらに本発明によれば、マウ
スをヒト乳酸脱水素酵素Ｍサブユニットで免疫して得ら
れるマウスの脾細胞と、マウスミエローマ細胞とを通常
の方法で融合し、ヒト乳酸脱水素酵素Ｍサブユニットに
対するモノクローナル抗体を産生する能力を有する融合
細胞を、培地で培養するか、またはマウス腹腔内に移植
して腹水癌化することにより培養液中または腹水中に該
モノクローナル抗体を生成蓄積させ、該培養液または腹
水中から該モノクローナル抗体を採取することを特徴と
するヒト乳酸脱水素酵素Ｍサブユニットに対するモノク
ローナル抗体の製法が提供される。
本発明の方法によればヒト乳酸脱水素酵素Ｍサブユニ
ットに対するモノクローナル抗体は、次の如くして製造
される。
ットに対するモノクローナル抗体は、次の如くして製造
される。
（１） 免疫化動物細胞の調製 マウスをヒト乳酸脱水素酵素Ｖ型アイソザイムで免疫
し、そのマウスから脾細胞を採取する。免疫化はそれ自
体公知の方法によって実施される。
し、そのマウスから脾細胞を採取する。免疫化はそれ自
体公知の方法によって実施される。
（２） 融合細胞の作製 上記免疫化脾細胞とマウスミエローマ細胞とを常法に
従って融合させる。融合細胞はヒポキサンチン−アミノ
プテリン−チミジン（HAT）培地中で選択培養する。固
相エンザイムイムノアッセイ（ELISA）により抗体を産
生している細胞群を選別し、クローニングを行ない、ヒ
ト乳酸脱水素酵素Ｍサブユニットに特異的なモノクロー
ナル抗体を産生する８箇の融合細胞LD−10、LD−11、LD
−17、LD−21、LD−25、LD−52、LD−58およびLD−66株
を得る。
従って融合させる。融合細胞はヒポキサンチン−アミノ
プテリン−チミジン（HAT）培地中で選択培養する。固
相エンザイムイムノアッセイ（ELISA）により抗体を産
生している細胞群を選別し、クローニングを行ない、ヒ
ト乳酸脱水素酵素Ｍサブユニットに特異的なモノクロー
ナル抗体を産生する８箇の融合細胞LD−10、LD−11、LD
−17、LD−21、LD−25、LD−52、LD−58およびLD−66株
を得る。
（３） モノクローナル抗体の調製 融合細胞LD−10、LD−11、LD−17、LD−21、LD−25、
LD−52、LD−58およびLD−66株を培地で培養するかまた
はマウス腹腔内に移植して腹水癌化することにより培養
液中または腹水中にモノクローナル抗体を生成蓄積さ
せ、培養液または腹水中から常法によりモノクローナル
抗体を採取する。
LD−52、LD−58およびLD−66株を培地で培養するかまた
はマウス腹腔内に移植して腹水癌化することにより培養
液中または腹水中にモノクローナル抗体を生成蓄積さ
せ、培養液または腹水中から常法によりモノクローナル
抗体を採取する。
本発明において得られる融合細胞LD−10、LD−11、LD
−17、LD−21、LD−25、LD−52、LD−58およびLD−66株
は次の特性を有する。
−17、LD−21、LD−25、LD−52、LD−58およびLD−66株
は次の特性を有する。
マウスミエローマ細胞（P3−NS1/1−Ag4−１）とマウ
ス脾臓細胞との融合細胞である。
ス脾臓細胞との融合細胞である。
マウスミエローマ細胞とほぼ同様の形態を示す。
LD−11、LD−21およびLD−66株は免疫グロブリンIgG2
b,κを定常的に産生する。
b,κを定常的に産生する。
LD−10、LD−17、LD−25、LD−52およびLD−58株は免
疫グロブリンIgG1,κを定常的に産生する。
疫グロブリンIgG1,κを定常的に産生する。
ミエローマ細胞とほぼ同様の増殖性を示す。たとえ
ば、RPMI 1640（米国、ギブコ社製）に10％の牛胎児血
清を含ませた培地において、37℃、48時間で約10倍に増
殖する。
ば、RPMI 1640（米国、ギブコ社製）に10％の牛胎児血
清を含ませた培地において、37℃、48時間で約10倍に増
殖する。
−80℃以下の長期間保存可能である。
上記融合細胞LD−10、LD−11、LD−17、LD−21、LD−
25、LD−52、LD−58およびLD−66株は昭和62年８月14日
に工業技術院微生物工業技術研究所に寄託申請されたが
受託は拒否された（寄託受託拒否通知書62微寄文第1473
号、62微寄文第1474号、62微寄文第1475号、62微寄文第
1476号、62微寄文第1477号、62微寄文第1478号、62微寄
文第1479号、および62微寄文第1480号）。
25、LD−52、LD−58およびLD−66株は昭和62年８月14日
に工業技術院微生物工業技術研究所に寄託申請されたが
受託は拒否された（寄託受託拒否通知書62微寄文第1473
号、62微寄文第1474号、62微寄文第1475号、62微寄文第
1476号、62微寄文第1477号、62微寄文第1478号、62微寄
文第1479号、および62微寄文第1480号）。
本発明により得られたモノクローナル抗体はＭサブユ
ニットを含有するヒトLDHアイソザイムとは反応する
が、ＨサブユニットのみからなるヒトLDHアイソザイム
すなわちＩ型のアイソザイムとは反応しない。従ってヒ
トLDHアイソザイムの選択的測定に使用されるものであ
る。
ニットを含有するヒトLDHアイソザイムとは反応する
が、ＨサブユニットのみからなるヒトLDHアイソザイム
すなわちＩ型のアイソザイムとは反応しない。従ってヒ
トLDHアイソザイムの選択的測定に使用されるものであ
る。
本発明のモノクローナル抗体を用いてヒトLDHアイソ
ザイムを測定するには、LD−10、LD−11、LD−17、LD−
21、LD−25、LD−52、LD−58およびLD−66株から得られ
るモノクローナル抗体と検体とを反応させ、抗体と結合
したLDHを２抗体法、不溶性担体法などの公知の方法で
検体と分離し、その酵素活性を測定することで行われ
る。このようにしてＭサブユニットを含有するLDHアイ
ソザイムが測定される。
ザイムを測定するには、LD−10、LD−11、LD−17、LD−
21、LD−25、LD−52、LD−58およびLD−66株から得られ
るモノクローナル抗体と検体とを反応させ、抗体と結合
したLDHを２抗体法、不溶性担体法などの公知の方法で
検体と分離し、その酵素活性を測定することで行われ
る。このようにしてＭサブユニットを含有するLDHアイ
ソザイムが測定される。
或いはまた、検体中のモノクローナル抗体と結合しな
かったLDH酵素活性を測定することによりＨサブユニッ
トを含有するLDHアイソザイムの測定を行うことも可能
である。
かったLDH酵素活性を測定することによりＨサブユニッ
トを含有するLDHアイソザイムの測定を行うことも可能
である。
本発明のモノクローナル抗体を用いることによって上
記したようにヒトLDHアイソザイムを分別測定すること
ができる。そして心臓疾患および肝臓疾患のある患者の
血清中のLDHアイソザイム組成には特徴的な片よりが見
られる事実から、本発明のモノクローナル抗体を利用す
るヒトLDHアイソザイムの測定により心臓疾患および肝
臓疾患の有無の診断が可能となるのである。
記したようにヒトLDHアイソザイムを分別測定すること
ができる。そして心臓疾患および肝臓疾患のある患者の
血清中のLDHアイソザイム組成には特徴的な片よりが見
られる事実から、本発明のモノクローナル抗体を利用す
るヒトLDHアイソザイムの測定により心臓疾患および肝
臓疾患の有無の診断が可能となるのである。
本発明のモノクローナル抗体を利用して疾患の診断を
行うには、例えば患者の血清中のヒトLDHアイソザイム
を上記の測定法により測定し、ヒトLDHアイソザイムの
量が一定以上または以下の値を示す血清の患者について
疾患の有無を判断することになる。
行うには、例えば患者の血清中のヒトLDHアイソザイム
を上記の測定法により測定し、ヒトLDHアイソザイムの
量が一定以上または以下の値を示す血清の患者について
疾患の有無を判断することになる。
次に実施例を示して本発明をさらに具体的に説明す
る。
る。
実施例 １ 融合細胞の調製 （１） 融合のための脾細胞の調製 Ba1b/cマウス（６週令，♂）に生理食塩水に溶解させ
た100μｇのヒトLDH Ｖ型を当容量のフロインド完全ア
ジュバントと懸濁させ皮下および腹腔内に50μｇずつ注
射した。２週間後に生理食塩水に溶解させた30μｇのヒ
トLDH Ｖ型を腹腔内に注射した。さらに２週間後に同
様に注射を行い、３日後に脾臓をとり出し、脾細胞を血
清不含の培養液〔RPMI 1640（ギブコ社製）〕中に浮遊
させた。
た100μｇのヒトLDH Ｖ型を当容量のフロインド完全ア
ジュバントと懸濁させ皮下および腹腔内に50μｇずつ注
射した。２週間後に生理食塩水に溶解させた30μｇのヒ
トLDH Ｖ型を腹腔内に注射した。さらに２週間後に同
様に注射を行い、３日後に脾臓をとり出し、脾細胞を血
清不含の培養液〔RPMI 1640（ギブコ社製）〕中に浮遊
させた。
（２） 細胞融合のためのミエローマ細胞の調製 マウスミエローマ細胞（P3−NS1/1−Ag4−１）は10％
牛胎児血清を含有するRPHI 1640培地に継代した。
牛胎児血清を含有するRPHI 1640培地に継代した。
P3−NS1/1−Ag4−１のミエローマ細胞の発育は５％炭
酸ガスを含む気流を流した炭酸ガスインキュベーターに
37℃で継代培養することにより行った。この細胞は選択
的にヒポキサンチン−アミノプテリン−チミジン培地中
で阻害されることを確認した。
酸ガスを含む気流を流した炭酸ガスインキュベーターに
37℃で継代培養することにより行った。この細胞は選択
的にヒポキサンチン−アミノプテリン−チミジン培地中
で阻害されることを確認した。
（３） 融合細胞の作製 マウスミエローマ細胞（P3−NS1/1−Ag4−１）のRPMI
浮遊液（１×107個）を用意し、前記の脾細胞浮遊液
（１×108個）と混合した後400×ｇで５分間遠心分離し
て上清を除き両細胞の混合した沈殿を採取した。沈殿に
50％（重量／容量）ポリエチレングリコール−4000（メ
ルク社製）の溶液1mlを37℃１分間にわたってゆるく撹
拌しながら加えて、両細胞を融合させた。その後、牛胎
児血清を含まない15mlのRPMI 1640培地を徐々に加えて
反応を停止させ、RPMI 1640で２〜３回洗浄（400×g,5
分間）し、融合細胞を得た。
浮遊液（１×107個）を用意し、前記の脾細胞浮遊液
（１×108個）と混合した後400×ｇで５分間遠心分離し
て上清を除き両細胞の混合した沈殿を採取した。沈殿に
50％（重量／容量）ポリエチレングリコール−4000（メ
ルク社製）の溶液1mlを37℃１分間にわたってゆるく撹
拌しながら加えて、両細胞を融合させた。その後、牛胎
児血清を含まない15mlのRPMI 1640培地を徐々に加えて
反応を停止させ、RPMI 1640で２〜３回洗浄（400×g,5
分間）し、融合細胞を得た。
上記の融合細胞をヒポキサンチン−アミノプテリン−
チミジン（HAT）選択培地に浮遊させて、１×106個/ml
の細胞を含む懸濁液とし、その1.5mlずつを24穴の組織
培養プレートに入れ、95％空気/5％炭酸ガスの気流中で
炭酸ガスインキュベーターを用いて、37℃で培養した。
培養後10日目以後に各培養液上清を取り抗体を産生して
いる細胞をELISA（固相エンザイムイムノアッセイ）で
選びだした。選別は希釈法を用い、96穴の組織培養プレ
ートに１ウェルあたり１個の融合細胞が含まれるように
して増殖させた。培養の際にラット胸腺細胞を１ウェル
あたり５×105個加えた。得られたクローンを幾度か希
釈して培養をくり返し、クローニングを行った。こうし
てヒトLDH Ｍサブユニットに特異的なモノクローナル
抗体を産生する融合細胞LD−10、LD−11、LD−17、LD−
21、LD−25、LD−52、LD−58およびLD−66株を得た。
チミジン（HAT）選択培地に浮遊させて、１×106個/ml
の細胞を含む懸濁液とし、その1.5mlずつを24穴の組織
培養プレートに入れ、95％空気/5％炭酸ガスの気流中で
炭酸ガスインキュベーターを用いて、37℃で培養した。
培養後10日目以後に各培養液上清を取り抗体を産生して
いる細胞をELISA（固相エンザイムイムノアッセイ）で
選びだした。選別は希釈法を用い、96穴の組織培養プレ
ートに１ウェルあたり１個の融合細胞が含まれるように
して増殖させた。培養の際にラット胸腺細胞を１ウェル
あたり５×105個加えた。得られたクローンを幾度か希
釈して培養をくり返し、クローニングを行った。こうし
てヒトLDH Ｍサブユニットに特異的なモノクローナル
抗体を産生する融合細胞LD−10、LD−11、LD−17、LD−
21、LD−25、LD−52、LD−58およびLD−66株を得た。
実施例 ２ モノクローナル抗体の調製 （１） LD−10、LD−11、LD−17、LD−21、LD−25、LD
−52、LD−58およびLD−66株が産生するモノクローナル
抗体の免疫グロブリンクラスおよびサブクラスの同定 融合細胞の培養液についてELISA法で免疫グロブリン
（Ig）の存在について分析した。ヒトLDH Ｖ型を20μg
mlの濃度で固相化液（50mM炭酸ナトリウム緩衝液pH9.
8）に溶解し、これをポリスチレン製96穴マイクロプレ
ート（ヌンク社製）に50μずつ分注し、４℃で一晩放
置し、0.15Mの食塩を含むリン酸緩衝液（PBS）pH7.2で
洗い、次に１％牛血清アルブミンを含む固相化液300μ
に加えて４℃で一晩放置しブロッキングした。次にプ
レートをPBSで洗浄後融合細胞を培養した培養液50μ
を加えて37℃１時間インキュベートした。プレートをPB
S−Tween（0.05％ Tween 20）で洗浄後家兎より得た抗
血清（抗マウスIgG1,G2a,G2b,G3,IgM,IgA）（ザイメッ
ト社）を別々に加えて37℃１時間インキュベートし、PB
S−Tweenで洗浄後、ペルオキシダーゼ標識した抗ウサギ
免疫グロブリン（バイオラド社）50μを加えてさらに
37℃１時間インキュベートしてPBS−Tweenで洗浄後、発
色液（1mg/ml Ｏ−フェニレンジアミン、0.03％過酸化
水素、0.1Mリン酸緩衝液pH6.0）を加えて発色させ、６
規定塩酸で反応を停止後490nmの吸光度を測定した。結
果を第１図に示す。第１図に示すように上記実施例で得
られたモノクローナル抗体はIgG2b,IgG1に属する免疫グ
ロブリンである。
−52、LD−58およびLD−66株が産生するモノクローナル
抗体の免疫グロブリンクラスおよびサブクラスの同定 融合細胞の培養液についてELISA法で免疫グロブリン
（Ig）の存在について分析した。ヒトLDH Ｖ型を20μg
mlの濃度で固相化液（50mM炭酸ナトリウム緩衝液pH9.
8）に溶解し、これをポリスチレン製96穴マイクロプレ
ート（ヌンク社製）に50μずつ分注し、４℃で一晩放
置し、0.15Mの食塩を含むリン酸緩衝液（PBS）pH7.2で
洗い、次に１％牛血清アルブミンを含む固相化液300μ
に加えて４℃で一晩放置しブロッキングした。次にプ
レートをPBSで洗浄後融合細胞を培養した培養液50μ
を加えて37℃１時間インキュベートした。プレートをPB
S−Tween（0.05％ Tween 20）で洗浄後家兎より得た抗
血清（抗マウスIgG1,G2a,G2b,G3,IgM,IgA）（ザイメッ
ト社）を別々に加えて37℃１時間インキュベートし、PB
S−Tweenで洗浄後、ペルオキシダーゼ標識した抗ウサギ
免疫グロブリン（バイオラド社）50μを加えてさらに
37℃１時間インキュベートしてPBS−Tweenで洗浄後、発
色液（1mg/ml Ｏ−フェニレンジアミン、0.03％過酸化
水素、0.1Mリン酸緩衝液pH6.0）を加えて発色させ、６
規定塩酸で反応を停止後490nmの吸光度を測定した。結
果を第１図に示す。第１図に示すように上記実施例で得
られたモノクローナル抗体はIgG2b,IgG1に属する免疫グ
ロブリンである。
（２） 得られた抗体のアイソザイム特異性 ヒトLDH Ｉ型，同II型，同III型，同IV型および同Ｖ
型を用いてモノクローナル抗体のアイソザイム特異性を
検討した。ヒトLDH各型アイソザイムを実施例２−
（１）と同様にマイクロプレートに固相化し、ブロッキ
ングした。同様にモノクローナル抗体の培養液50mlを加
え、37℃で１時間反応させたのち、プレートをPBS−Twe
enで洗滌し、ペルオキシダーゼで標識化した抗マウスIg
G（バイオラド社製）を加えて37℃で１時間反応させ
た。プレートをPBS−Tweenで洗滌後同様に発色を行い49
0nmの吸光度を測定した。結果を第２図に示す。第２図
に示したように各モノクローナル抗体はＩ型では反応せ
ず、II,III,IV,V型と反応した。反応の強さは各アイソ
ザイムで異なり、II型から順次強くなってＶ型で最も強
かった。
型を用いてモノクローナル抗体のアイソザイム特異性を
検討した。ヒトLDH各型アイソザイムを実施例２−
（１）と同様にマイクロプレートに固相化し、ブロッキ
ングした。同様にモノクローナル抗体の培養液50mlを加
え、37℃で１時間反応させたのち、プレートをPBS−Twe
enで洗滌し、ペルオキシダーゼで標識化した抗マウスIg
G（バイオラド社製）を加えて37℃で１時間反応させ
た。プレートをPBS−Tweenで洗滌後同様に発色を行い49
0nmの吸光度を測定した。結果を第２図に示す。第２図
に示したように各モノクローナル抗体はＩ型では反応せ
ず、II,III,IV,V型と反応した。反応の強さは各アイソ
ザイムで異なり、II型から順次強くなってＶ型で最も強
かった。
このことは、本発明のモノクローナル抗体がLDHのＭ
サブユニットに対して特異的であり、Ｍサブユニット構
成比が夫々のアイソザイムに対するモノクローナル抗体
の結合性に反映していることを示している。従って本発
明の上記モノクローナル抗体の夫々はLDHのＭサブユニ
ット総量或いはＨサブユニット総量を測定するのに適し
ている。
サブユニットに対して特異的であり、Ｍサブユニット構
成比が夫々のアイソザイムに対するモノクローナル抗体
の結合性に反映していることを示している。従って本発
明の上記モノクローナル抗体の夫々はLDHのＭサブユニ
ット総量或いはＨサブユニット総量を測定するのに適し
ている。
（４） LD−10、LD−11、LD−17、LD−21、LD−25、LD
−52、LD−58およびLD−66株が産生するモノクローナル
抗体の結合様式 ヒトLDH Ｖ型アイソザイムを6Mグアニジン塩酸中
で、２％メルカプトエタノールで還元し、ジスルフィド
結合を開裂させた後、モノヨード酢酸でカルボキシメチ
ル化しSH基をブロックし、グアニジン塩酸を除去し、ジ
スルフィド結合に由来する高次構造を失なった変性抗原
を調製した。未変性抗原、変性抗原を、実施例−２
（１）と同様にして固相化、ブロッキングし、各モノク
ローナル抗体を加え37℃１時間反応させ、PBS−Tweenで
洗浄後ペルオキシダーゼ標識抗マウス免疫グロブリンを
加え37℃１時間反応させ、PBSで洗浄後、実施例２−
（１）と同様に発色を行ない490nmの吸光度を測定し
た。結果を第３図に示す。第３図に示したようにLD−1
0、LD−11、LD−17、LD−25、LD−33、LD−58が産生す
る各モノクローナル抗体は変性抗原とは反応せず、ヒト
LDH Ｖ型アイソザイムのジスルフィド結合に由来する
高次構造を認識していることが認められた。またLD−21
およびLD−52の産生する各モノクローナル抗体はヒトLD
Hの一次構造を認識していることが認められた。
−52、LD−58およびLD−66株が産生するモノクローナル
抗体の結合様式 ヒトLDH Ｖ型アイソザイムを6Mグアニジン塩酸中
で、２％メルカプトエタノールで還元し、ジスルフィド
結合を開裂させた後、モノヨード酢酸でカルボキシメチ
ル化しSH基をブロックし、グアニジン塩酸を除去し、ジ
スルフィド結合に由来する高次構造を失なった変性抗原
を調製した。未変性抗原、変性抗原を、実施例−２
（１）と同様にして固相化、ブロッキングし、各モノク
ローナル抗体を加え37℃１時間反応させ、PBS−Tweenで
洗浄後ペルオキシダーゼ標識抗マウス免疫グロブリンを
加え37℃１時間反応させ、PBSで洗浄後、実施例２−
（１）と同様に発色を行ない490nmの吸光度を測定し
た。結果を第３図に示す。第３図に示したようにLD−1
0、LD−11、LD−17、LD−25、LD−33、LD−58が産生す
る各モノクローナル抗体は変性抗原とは反応せず、ヒト
LDH Ｖ型アイソザイムのジスルフィド結合に由来する
高次構造を認識していることが認められた。またLD−21
およびLD−52の産生する各モノクローナル抗体はヒトLD
Hの一次構造を認識していることが認められた。
実施例 ３ モノクローナル抗体を利用したヒトLDHの測定 （１） Ｈサブユニット含有LDH活性の測定 LDHを含む検体50μに本発明のモノクローナル抗体
を結合したセファロース4B（20μｇのモノクローナル抗
体を含む）を加え、37℃で30分間反応させた。反応後遠
心分離によって抗体を結合したセファロース4Bを沈殿さ
せ、上清液を採取した。この上清中の残存LDH活性をジ
ホルマザン生成法で測定した。
を結合したセファロース4B（20μｇのモノクローナル抗
体を含む）を加え、37℃で30分間反応させた。反応後遠
心分離によって抗体を結合したセファロース4Bを沈殿さ
せ、上清液を採取した。この上清中の残存LDH活性をジ
ホルマザン生成法で測定した。
LD−11株およびLD−52株が産生したモノクローナル抗
体をセファロース4Bに結合させたものを用いる上記した
上清中の残存LDH活性の測定例の結果を次の第１表に示
す。この場合、LDHを含む検体としては各アイソザイム
に分別したものを用いた。そして各検体には単独のアイ
ソザイムが500ウロベレウスキイ単位/mlで含まれてい
た。なおIV型のアイソザイムは単離が困難であったので
このものを用いる測定例は得られなかった。
体をセファロース4Bに結合させたものを用いる上記した
上清中の残存LDH活性の測定例の結果を次の第１表に示
す。この場合、LDHを含む検体としては各アイソザイム
に分別したものを用いた。そして各検体には単独のアイ
ソザイムが500ウロベレウスキイ単位/mlで含まれてい
た。なおIV型のアイソザイムは単離が困難であったので
このものを用いる測定例は得られなかった。
第１表に示されるようにLDH Ｉ型の活性は全て保持
されＶ型の活性はすべて除かれている。II型,III型につ
いてはＨサブユニット構成比にほぼ比例する割合で活性
が保持されていることが分る。この測定系を用いればＨ
サブユニット構成比を反映した検体中のLDH活性を求め
ることができる。
されＶ型の活性はすべて除かれている。II型,III型につ
いてはＨサブユニット構成比にほぼ比例する割合で活性
が保持されていることが分る。この測定系を用いればＨ
サブユニット構成比を反映した検体中のLDH活性を求め
ることができる。
次にこの測定法を利用して各種疾患の患者の血清中の
Ｈサブユニット含有LDHの活性を測定した結果を第２表
に示す。
Ｈサブユニット含有LDHの活性を測定した結果を第２表
に示す。
この第２表から心筋梗塞の患者の血清中に明瞭に特に
高い値が認められる。
高い値が認められる。
（２） Ｍサブユニット含有LDH活性の測定 96穴マイクロプレート（ヌンク社製）にLD−10、LD−
11、LD−17、LD−25、LD−52およびLD−66株が産生した
モノクローナル抗体を結合させて抗体固相プレートを作
成した。
11、LD−17、LD−25、LD−52およびLD−66株が産生した
モノクローナル抗体を結合させて抗体固相プレートを作
成した。
この抗体固相プレートに検体50μを加え37℃で１時
間反応させた。反応後プレートをPBS−Tweenで洗滌した
のちプレートに結合しLDH活性をジホルマザン生成法で
測定した。
間反応させた。反応後プレートをPBS−Tweenで洗滌した
のちプレートに結合しLDH活性をジホルマザン生成法で
測定した。
上記した測定方法によって各種疾患患者の血清中のＭ
サブユニット含有LDH活性の測定結果を第３表に示す。
測定値は620nmの吸光度で表示した。
サブユニット含有LDH活性の測定結果を第３表に示す。
測定値は620nmの吸光度で表示した。
第３表に示されるように急性肝炎の患者血清中に明瞭
にＭサブユニット含有LDHの高い値が認められた。
にＭサブユニット含有LDHの高い値が認められた。
第１図−１および２は実施例で得られたモノクローナル
抗体のIgGクラスおよびサブクラスを示す。 第２図−１および２はモノクローナル抗体のLDHアイソ
ザイムに対する反応の特異性を示す。 第３図はモノクローナル抗体と未変成および変成したLD
Hとの反応性を示す。
抗体のIgGクラスおよびサブクラスを示す。 第２図−１および２はモノクローナル抗体のLDHアイソ
ザイムに対する反応の特異性を示す。 第３図はモノクローナル抗体と未変成および変成したLD
Hとの反応性を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 独国特許出願公開3623846 Ｃｌｉｎｉｃａ Ｃｈｉｍｉｃａ Ａ ｃｔａ，Ｖｏｌ．161，Ｎｏ．３，Ｐ. 315−325（1986)
Claims (4)
- 【請求項１】マウス融合細胞LD−11株、LD−21株または
LD−66株が産生するヒト乳酸脱水素酵素Ｍサブユニット
を特異的に認識するIgG2bに属する免疫グロブリンであ
るモノクローナル抗体。 - 【請求項２】マウスをヒト乳酸脱水素酵素Ｖ型アイソザ
イムで免疫して得られるマウスの脾細胞とマウスミエロ
ーマ細胞とを通常の方法で融合し、ヒト乳酸脱水素酵素
Ｍサブユニットに対するモノクローナル抗体を産生する
能力を有する融合細胞を培地で培養するかまたはマウス
腹腔内に移植して腹水癌化することにより培養液中また
は腹水中に該モノクローナル抗体を生成蓄積させ、該培
養液または腹水中から該モノクローナル抗体を採取する
ことを特徴とする、マウス融合細胞LD−11株、LD−21株
またはLD−66株が産生するヒト乳酸脱水素酵素Ｍサブユ
ニットを特異的に認識するIgG2bに属する免疫グロブリ
ンであるモノクローナル抗体の製法。 - 【請求項３】マウス融合細胞LD−11株、LD−21株または
LD−66株が産生するヒト乳酸脱水素酵素Ｍサブユニット
を特異的に認識するIgG2bに属する免疫グロブリンであ
るモノクローナル抗体からなるヒト乳酸脱水素酵素アイ
ソザイムの定量用試薬。 - 【請求項４】ヒト乳酸脱水素酵素アイソザイムの定量用
試薬が心臓および肝臓疾患診断に用いるためのものであ
る特許請求の範囲第３項記載の試薬。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP62205073A JP2650155B2 (ja) | 1987-08-20 | 1987-08-20 | モノクローナル抗体、その製法およびそれからなる酵素定量用試薬 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP62205073A JP2650155B2 (ja) | 1987-08-20 | 1987-08-20 | モノクローナル抗体、その製法およびそれからなる酵素定量用試薬 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6451090A JPS6451090A (en) | 1989-02-27 |
| JP2650155B2 true JP2650155B2 (ja) | 1997-09-03 |
Family
ID=16500976
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP62205073A Expired - Fee Related JP2650155B2 (ja) | 1987-08-20 | 1987-08-20 | モノクローナル抗体、その製法およびそれからなる酵素定量用試薬 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2650155B2 (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2003047470A (ja) * | 2001-08-01 | 2003-02-18 | Asahi Kasei Corp | 新規な抗体及びその用途 |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| IL75828A (en) * | 1985-07-17 | 1991-06-10 | Univ Ramot | Immobilization by biologically active proteins |
-
1987
- 1987-08-20 JP JP62205073A patent/JP2650155B2/ja not_active Expired - Fee Related
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| Ｃｌｉｎｉｃａ Ｃｈｉｍｉｃａ Ａｃｔａ，Ｖｏｌ．１６１，Ｎｏ．３，Ｐ．３１５−３２５（１９８６） |
| 独国特許出願公開３６２３８４６ |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS6451090A (en) | 1989-02-27 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |