JP2731344B2

JP2731344B2 - 変異型ヒトリゾチーム

Info

Publication number: JP2731344B2
Application number: JP5335076A
Authority: JP
Inventors: 隆央山田; 清俊関口; 正和菊池
Original assignee: TANPAKU KOGAKU KENKYUSHO KK
Current assignee: TANPAKU KOGAKU KENKYUSHO KK
Priority date: 1993-12-28
Filing date: 1993-12-28
Publication date: 1998-03-25
Anticipated expiration: 2013-03-25
Also published as: JPH07184658A

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】本発明は、組換ＤＮＡ技術による変異型ヒ
トリゾチームおよびその製造に関するものである。より
詳しくは、本発明は、天然型ヒトリゾチーム(以下、単
にヒトリゾチームともいう)のアミノ酸配列の第７４位
のＶと第７５位のＮの間に細胞接着活性を有するアミノ
酸配列が挿入された変異型ヒトリゾチームをコードして
いる変異型ヒトリゾチーム遺伝子、該遺伝子を含有して
いる発現ベクター、該発現ベクターで形質転換された形
質転換体、該形質転換体を用いてヒトリゾチーム活性お
よび挿入されたアミノ酸配列に基づく細胞接着活性を有
するタンパク質を製造する方法、並びにこのようにして
製造された変異型ヒトリゾチームに関するものである。

【従来の技術】

【０００２】リゾチームは１９２２年にフレミングによ
り発見された抗菌活性を有する酵素タンパク質であり、
細菌細胞壁のペプチドグリカンに作用してＮ−アセチル
グルコサミン(ＮＡＧ)とＮ−アセチルムラミン酸(ＮＡ
Ｍ)との間のβ−１,４結合を特異的に切断することによ
り、溶菌を引き起こす。その分布は動物、植物、バクテ
リオファージなどに広く認められており、ヒトではおも
にミルク、涙、尿などに見い出されているが、その生理
的意義はまだ完全には明らかにされていない。ヒトリゾ
チームは、１３０残基のアミノ酸からなる単純タンパク
質で、分子内に４対のジスルフィド結合を有する。その
立体構造はＡrtymiukとＢlakeにより解析が行なわれ(P.
J.Artymiuk, C.C.F.Blake, J.Mol.Biol., 152 737 198
1)、すでに完全なＸ線結晶解析がなされていたニワトリ
卵白リゾチームとほとんど等しい分子構造をもっている
ことがわかっている。一方、ＤＮＡ組換え技術により、
卵白リゾチームのシグナルペプチドにヒトリゾチームを
接続したタンパク質をコードするＤＮＡが化学合成さ
れ、これが酵母発現系においてヒトリゾチームと全く同
一のタンパク質を生産させることがすでに知られている
(K.Yoshimura et al.B.B.R.C. 145 712 1987, Y.Jigami
et al．Gene 43 273 1986)。この手法により現在まで
に多種の変異型ヒトリゾチームが創製され、リゾチーム
を用いたタンパク質の構造機能相関、安定性や折りたた
み機構に関して多くの成果が得られている(Y.Taniyama
et al．B.B.R.C．152 962 1988, Y.Taniyama et al．J.
B.C．2657570 1990など)。

【０００３】一方、フィブロネクチンは、コラーゲン、
エラスチン、プロテオグリカン、ラミニン、ビトロネク
チン、フィブリンなどと同様に細胞を取り囲む細胞外マ
トリックスの構成成分の一つであり、その分子内にヘパ
リン、フィブリン、コラーゲンなどの分子や細胞と相互
作用する部位を有する多機能性の糖タンパク質である。
約２２０ＫＤaの２本のサブユニットからなり、全体と
しては４４０ＫＤaぐらいの分子量を持つといわれてい
る。フィブロネクチンの細胞に対する相互作用、つまり
細胞接着という機能は、多細胞生物の発生と形態形成に
不可欠であるばかりでなく、臨床的にも創傷治癒、血栓
形成、癌転移などの病態の場においても重要な役割を演
じていることが知られている。また、フィブロネクチン
の合成ペプチドを用いたＰierschbacherとＲuoslahtiの
研究から(M.D.Pierschbacher ＆ E.Ruoslahti, Nature
309 30 1984)、フィブロネクチンの細胞に対する結合部
位がＲＧＤ(Ａrg−Ｇly−Ａsp)という簡単な配列よりな
ることが示され、この細胞接着シグナルは、フィブリノ
ーゲン、ラミニン、コラーゲン、ビトロネクチンなどに
も共通に存在し、機能している。さらにフィブロネクチ
ンに対する細胞表面のレセプターも遺伝子が同定され、
他の細胞外マトリックスに関するレセプターと相同性が
あり、インテグリンファミリーとよばれている(E.Ruosl
ahti, Ann.Rev.Biochem．57 375 1988)。このように細
胞接着という重要な生体機能がＲＧＤという簡単な配列
に収束できたことはきわめて興味深く、この接着シグナ
ルの立体構造に関しても情報が待たれているところであ
る。そこで、本発明者らは、以前、ＲＧＤ配列を含む細
胞接着機能部位の高次構造を解析できるようなキメラ蛋
白質を創製することを目的とし、ヒトリゾチームにＲＧ
Ｄ配列を含むペプチドを挿入した多機能性のキメラ蛋白
質(たとえば、ＲＧＤＳを挿入したＲＧＤ４やＴＧＲＧ
ＤＳＰＡを挿入したＲＧＤ８)を創製した(T.Yamada et
al.J.B.C. 268 10588 1993)。ヒトリゾチームは本発
明者らによってすでに精密なＸ線結晶解析が完了し、そ
の立体構造の全容が明らかになっている。ヒトリゾチー
ム−ＲＧＤキメラ蛋白質がヒトリゾチームと類似の立体
構造をとるならば、ＲＧＤ配列を含む挿入ペプチド部分
の構造解析はきわめて容易になってくると考えられる。
事実、創製したＲＧＤ４およびＲＧＤ８蛋白質はＸ線結
晶構造解析が比較的、容易に行われ、その解析結果か
ら、これらキメラ蛋白質のＲＧＤ配列はきわめてflexib
ilityの高い領域に存在することが示された(T.Yamada e
t al.J.B.C．268 105881993)。

【課題を解決するための手段】

【０００４】本発明者らはＲＧＤ配列の細胞接着機能を
増強し、さらには、その機能構造を決定することが期待
できるキメラ蛋白質を創製した。創製した蛋白質はヒト
リゾチームの７４位のＶと７５位のＮの間にＣＲＧＤ
Ｃ、ＣＲＧＤＳＣおよびＣＧＲＧＤＳＣを挿入したキメ
ラ蛋白質である。ＲＧＤ配列を含有するペプチド(たと
えば、ＧＲＧＤＳＰなど)はそれ自身、細胞接着作用や
他の接着蛋白質がもつ接着活性を阻害する作用を有して
いるが、これらのペプチドを環化させることにより(た
とえば、(cyclo)ＧＲＧＤＳＰなど)、その作用が上昇す
ることが知られている(M.D.Pierschbacher ＆ E.Ｒuosl
ahti J.B.C．262 17294 1987, H.Kumagai et al.B.
B.R.C. 177 74 1991)。従って、本発明者らが創製し
たキメラ蛋白質においても、ＲＧＤ配列を取り囲む２つ
のシステイン残基がジスルフィド結合を形成することに
よりＲＧＤ領域が環化され、細胞接着活性が増強される
ことが十分に考えられる。また、ＲＧＤを含有するペプ
チドの場合と同様に、ＲＧＤ領域が環化されることによ
って、その構造が制約をうけ、構造決定を可能にするこ
とが期待できる。さらにこの立体構造に関する情報が得
られれば、ＲＧＤ配列を有する細胞接着シグナルに対す
るアゴニストやアンタゴニストが、ペプチドあるいは低
分子有機化合物でも設計できるであろう。しかも、細胞
接着という現象は創傷治癒、血栓形成、癌転移に関連性
が深いことから、設計されたアゴニストやアンタゴニス
トが臨床応用の場で利用される可能性は十分にあると考
えられる。また、ヒトリゾチーム−ＲＧＤキメラ蛋白質
自体に関しても、リゾチームに由来する抗菌作用とＲＧ
Ｄ配列に由来する創傷治癒作用を合わせ持つことから、
例えば角膜損傷時などにおける殺菌作用を伴った治療薬
として、臨床応用が期待できる。

【０００５】即ち、本発明は、天然型ヒトリゾチームの
アミノ酸配列の第７４位のＶと第７５位のＮの間に細胞
接着活性を有するアミノ酸配列が挿入されたポリペプチ
ドをコードしている変異型ヒトリゾチーム遺伝子を提供
するものである。挿入されるアミノ酸配列としては、Ｃ
ＲＧＤＣ、ＣＲＧＤＳＣおよびＣＧＲＧＤＳＣなどが挙
げられる。

【０００６】また本発明は、上記の変異型ヒトリゾチー
ム遺伝子を含有する発現ベクターを提供するものであ
る。更に本発明は、上記の発現ベクターで形質転換され
た、変異型ヒトリゾチームを産生し、分泌し得る宿主細
胞を提供するものである。更に本発明は、上記の形質転
換宿主細胞を培養し、培養液中に分泌されたヒトリゾチ
ーム活性および挿入されたアミノ酸配列に基づく細胞接
着活性を有するタンパク質を分離し、所望により精製す
ることからなる変異型ヒトリゾチームの製造方法、およ
びこの方法によって製造された変異型ヒトリゾチームを
提供するものである。

【０００７】本明細書に於いては、アミノ酸は以下に示
す一文字表示法によって記載されている。ＱグルタミンＦフェニルアラ
ニンＭメチオニンＰプロリンＮアスパラギンＨヒスチジンＤアスパラギン酸ＧグリシンＩイソロイシンＫリジンＴスレオニンＡアラニンＬロイシンＲアルギニンＳセリンＣシステインＹチロシンＷトリプトファ
ンＥグルタミン酸Ｖバリン

【０００８】本発明の変異型ヒトリゾチーム遺伝子の調
製、該遺伝子を含有する発現ベクターの構築、該発現ベ
クターによる宿主細胞の形質転換、および得られた形質
転換体を用いる変異型ヒトリゾチームの製造は、全て本
出願人の出願に係る特開平１−８６８７６号に開示した
方法に準じて行われた。

【０００９】即ち、図１に示すように、天然のヒトリゾ
チームのアミノ酸配列をコードしている合成遺伝子を含
有する公知のプラスミドpＥＲＩ８６０２(特開平１−８
６８７６号)から、ＸhoＩ−ＳmaＩ制限断片を切り取っ
た。

【００１０】一方、挿入しようとするアミノ酸配列をコ
ードする部分およびヒトリゾチームのＸbaＩ−ＨincＩ
Ｉ部分を４本（上下各２本)のオリゴマーで合成し、Ｍ
１３mp１９hＬＺＭＲＦＤＮＡ(特開平１−８６８７６
号)のＸbaＩ−ＨincＩＩ部位に挿入して、Ｍ１３mp１９
Ｃys−ＲＧＤ３ＲＦＤＮＡ、Ｍ１３mp１９Ｃys−Ｒ
ＧＤ４ＲＦＤＮＡおよびＭ１３mp１９Ｃys−ＲＧＤ
５ＲＦＤＮＡを得る。これをＸhoＩおよびＳmaＩで消
化することによって、所望のアミノ酸配列をコードして
いるヌクレオチド配列が挿入されたＸhoＩ−ＳmaＩ制限
断片を得る。

【００１１】このＸhoＩ−ＳmaＩ断片をpＥＲＩ８６０
２のＸhoＩ−ＳmaＩ断片とライゲーションし、発現プラ
スミド、pＧＥＬＣys−ＲＧＤ３、pＧＥＬＣys−ＲＧＤ
４およびpＧＥＬＣys−ＲＧＤ５を構築する。これらの
プラスミドは全て同様にして構築されるが、代表的にp
ＧＥＬＣys−ＲＧＤ４の構築模式図を図１に示す。

【００１２】以上に概説した一連の操作における個々の
操作は、当業者によく知られている。例えば、ＤＮＡの
クローニング等における大腸菌の形質転換は、コーエン
(Cohen)らの方法[Cohen,S.N.ら、プロシージング・オブ
・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス(Pro
c.Natl.Acad.Sci.USA) 69 2110(1972)]によって行うこ
とができる。大腸菌宿主としては、たとえばＥ.coli Ｔ
Ｇ−１、Ｅ.coli ＤＨ−１、Ｅ.coli ２９４などを用い
ることができる。

【００１３】また、形質転換体から、所望の遺伝子が挿
入されたプラスミドＤＮＡを単離するには、アルカリ抽
出法[Birnboim,H.C.およびDoly,J.,ヌクレイック・アシ
ッズ・リサーチ(Nucleic Acids Res.) 7 1513(1979)]等
を利用することができる。次いで、プラスミドＤＮＡを
適当な制限酵素で処理することによって、挿入された該
遺伝子を切り出し、たとえばアガロースゲル電気泳動あ
るいはポリアクリルアミド電気泳動によってこれを単離
する。これらの一連の操作は公知であり、文献、例えば
「モレキュラー・クローニング(Ｍolecular Cloning)(19
82), Cold Spring Harbor Laboratory」に詳しく記載さ
れている。

【００１４】ＤＮＡの化学合成は、例えばCreaらの方法
[Crea,R.ら,プロシージング・オブ・ザ・ナショナル・
アカデミー・オブ・サイエンス(Proc.Natl.Acad.Sci.US
A) 75 765(1978)]などに従って行うことができる。

【００１５】さらに、ＤＮＡの所望の部位に、特異的に
変異を起こさせるためには、市販のキット(例えばアマ
ーシャム社製キットなど)が用いられ、その配列の確認
には、ジデオキシヌクレオチド合成鎖停止法[Sanger,F.
ら,プロシージング・オブ・ザ・ナショナル・アカデミ
ー・オブ・サイエンス(Proc.Natl.Acad.Sci.USA) 74 54
63(1977)]が用いられる。

【００１６】本明細書では、天然型ヒトリゾチームをコ
ードしている発現プラスミドpＥＲＩ８６０２を使用し
て本発明の発現プラスミドの構築例を示したが、これに
限定されない。

【００１７】酵母宿主の場合には、プロモーターとし
て、たとえばＰＨＯ５プロモーター、ＧＬＤプロモータ
ー、ＰＧＫプロモーター、ＡＤＨプロモーター、ＰＨＯ
８１プロモーター、ＧＡＬ１プロモーター、ＧＡＬ１０
プロモーターなどが、動物細胞宿主を用いた場合には、
プロモーターとして、たとえばＳＶ４０初期遺伝子プロ
モーター、メタロチオネインプロモーター、ヒートショ
ックプロモーターなどがそれぞれ利用できる。なお発現
にエンハンサーの利用も効果的である。

【００１８】本発明のプラスミドpＧＥＬＣys−ＲＧＤ
３、pＧＥＬＣys−ＲＧＤ４およびpＧＥＬＣys−ＲＧＤ
５は、酵母宿主内で変異型ヒトリゾチームを発現させ、
分泌させるのに好適である。とりわけ好ましい宿主はサ
ッカロマイセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisia
e)ＡＨ２２である。

【００１９】本発明の変異ヒトリゾチーム遺伝子を動物
細胞用ベクターに挿入することにより、マウスＬ細胞、
チャイニーズハムスター卵巣細胞(ＣＨＯ)、さらには他
の真核細胞を宿主として用い得る。

【００２０】真核細胞の形質転換方法は当業者既知であ
り、例えば酵母の形質転換は、ヒネン(Hinnen)らの方法
[プロシージングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミ
ー・オブ・サイエンス(Proc.Natl.Acad.Sci.USA) 75 19
27 (1978)]により、また、真核細胞の形質転換は、「蛋
白質・核酸・酵素・28巻、1983年、 “組み換え遺伝子
の細胞への導入と発現"(共立出版)」記載の方法で行うこ
とができる。

【００２１】形質転換体の培養も、当業者既知の方法の
いずれを用いても行うことができる。酵母を使用する場
合、培地としては、例えばバークホルダー(Ｂurkholde
r)最小培地[ボスチヤン(Bostian,K.L.)ら,プロシージン
グス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイ
エンス USA,77 4505(1980)]が挙げられる。培養は通常
１５℃〜４０℃、好ましくは２４℃〜３７℃で１０〜１
４４時間、好ましくは２４〜９６時間行い、必要に応じ
て通気や撹拌を加えてもよい。

【００２２】動物細胞などの真核生物細胞を宿主とした
形質転換体を使用する場合には、培地として例えばイー
グル(Eagle)のＭＥＭ[H.Eagle,サイエンス(Science) 13
0 432(1959)]、ダルベッコ(Dulbecco)の改良イーグル培
地(Modified Eagle's Medium)[Orgad LaubおよびWillia
m J.Rutter,ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミ
ストリー(J.Biol.Chem.) 258 6043(1983)]などが挙げら
れる。培養は通常３０〜４２℃、好ましくは３５℃〜３
７℃で約１〜１０日間行う。

【００２３】培養終了後、当業者既知の方法で細胞と上
清とを分離する。本発明の発現ベクターによれば、生成
した変異型ヒトリゾチームは効率良く分泌されるので上
清から得られるが、細胞内に残存する場合には、当分野
における通常の方法、例えば超音波破砕法、フレンチプ
レスなどを利用した破砕法、摩砕などの機械的破砕法、
細胞溶解酵素による破砕法などにより細胞を破砕した後
抽出する。さらに必要ならば、トリトン−Ｘ１００、デ
オキシコーレートなどの界面活性剤を加え、産生された
変異型ヒトリゾチームを抽出する。得られた変異型ヒト
リゾチームは、通常のタンパク質精製法、例えば塩析、
等電点沈澱、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィ
ー、高速液体クロマトグラフィー(ＨＰＬＣ、ＦＰＬＣ
等)などに従って精製することができる。

【００２４】このようにして得られた形質転換体培養物
から分離した培養上清並びに菌体中のヒトリゾチームを
精製単離し、その活性を後述のアッセイ法で測定したと
ころ、本発明の変異型ヒトリゾチームは、溶菌活性を保
持したままで強い細胞接着活性を発現させることがわか
った。

【００２５】即ち、本発明の変異ヒトリゾチーム遺伝子
を含んだ発現ベクターを適当な宿主に導入し、得られた
形質転換体を適当な条件下で培養し、培養上清のヒトリ
ゾチーム活性を有するタンパク質を単離し、所望により
常法にしたがって精製することにより、溶菌活性と細胞
接着活性を有する変異型ヒトリゾチームを得ることがで
きる。

【００２６】以下、実施例を挙げ、本発明をさらに詳し
く説明する。尚、以下の実施例は単なる例示にすぎず、
如何なる意味においても、本発明を制限するものではな
い。

【実施例】

【００２７】実施例１ＲＧＤ配列を含むペプチドをコ
ードする部分およびヒトリゾチームのＸbaＩ−ＨincＩ
Ｉ部分に対応する合成オリゴヌクレオチドの作製表１に示した８種類のオリゴヌクレオチドを、それぞれ
アプライド・バイオシステムズ社製のＤＮＡシンセサイ
ザー３８０Ｂを用いて合成し、トリチル基を脱保護した
状態で得た。

【００２８】

【表１】合成オリゴヌクレオチド S R Y W C N D G 共通 5'-CTAGATATTGGTGTAACGATGGGA-3' 3'-TATAACCACATTGCTACCCTTCTGA-5' K T P G A V C R G D C Cys-RGD3 5'-AGACTCCAGGTGCTGTTTGCCGCGGTGATTGT-3' 3'-GGTCCACGACAAACGGCGCCACTAACA-5' K T P G A V C R G D S C Cys-RGD4 5'-AGACTCCAGGTGCCGTCTGCCGCGGTGATTCTTGT-3' 3'-GGTCCACGACAGACGGCGCCACTAAGAACA-5' K T P G A V C G R G D S C Cys-RGD5 5'-AGACTCCAGGTGCTGTTTGCGGCCGTGGTGATTCTTGT-3' 3'-GGTCCACGACAAACGCCGGCACCACTAAGAACA-5'

【００２９】このオリゴヌクレオチドを５５℃で６時間
アンモニア処理した後、乾固し、５ＯＤ₂₆₀ 量を、５０
％尿素を含む１０％ポリアクリルアミドゲル電気泳動に
負荷した。泳動後、ガラス板をはずし、ＴＬＣプレート
(メルクArt5554DC-AlutolienKieselgel-60F₂₅₄)上でＵ
Ｖランプを照射して目的とするバンドを切り出し、０.
５Ｍ炭酸水素トリエチルアンモニウム溶液(０.５ＭＴ
ＥＡＢ:和光核酸合成用)(５ml)中に室温で一晩浸し、ゲ
ルからの溶出を行った。次に、溶出されたオリゴヌクレ
オチドをＳＥＰ−ＰＡＫR Ｃ１８カートリッジ(ウォー
ターズ製)に負荷し、２５mＭＴＥＡＢ(１５ml)で洗っ
たのち、１７％アセトニトリル−０.１ＭＴＥＡＢ(４m
l)で溶出し、乾固した。オリゴヌクレオチドの５'−リ
ン酸化は、５０mＭＴris−ＨＣl(pＨ８.０)−１０mＭ
ＭgＣl₂−５mＭＤＴＴ溶液(２０μl)中、精製した合成
オリゴヌクレオチド０.０５５ＯＤ₂₆₀ 量にＴ４ポリヌク
レオチドキナーゼ(宝酒造製)(１０unit)を３７℃で４５
分間作用させて行い、９５℃、５分間の熱処理でキナー
ゼを失活させた。

【００３０】実施例２Ｍ１３mp１９hＬＺＭＲＦＤ
ＮＡからのＸbaＩ−ＨincＩＩ消化フラグメントの作製５０mＭＴris−ＨＣl(pＨ７.５)−１０mＭＭgＣl₂−
１mＭＤＴＴ−１００mＭＮaＣl溶液(７０μl)中、野
性型ヒトリゾチーム遺伝子が挿入されたＭ１３mp１９h
ＬＺＭＲＦＤＮＡ(１５μg)に、ＸbaＩ−(宝酒造製)
(６０unit)およびＨincＩＩ(宝酒造製)(６０unit)を３
７℃で１時間作用させた。次に０.８％低融点アガロー
ス(SeaPlaque^R agarose:FMC製)を用いてゲル電気泳動
し、ＸbaＩ−ＨincＩＩ消化フラグメントを精製した。

【００３１】実施例３Ｍ１３mp１９Ｃys−ＲＧＤ４
ＲＦＤＮＡの作製実施例２で得られたＭ１３mp１９hＬＺＭＲＦＸbaＩ
−ＨincＩＩ消化フラグメント(５μg)と実施例１で得ら
れた共通およびＣys−ＲＧＤ４作製用の合計４種類の合
成オリゴヌクレオチド０.０５５ＯＤ₂₆₀ 量を加えた後、
エタノール沈澱を行った。次に、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ
(宝酒造製)(３５０unit)を加えて６６mＭTris−ＨＣl(p
Ｈ７.６)−６.６mＭＭgＣl₂−１０mＭＤＴＴ−０.１m
ＭＡＴＰ溶液(２０μl)中、１６℃で一晩、反応させた
後、大腸菌ＴＧ−１株にトランスフェクトした。得られ
たクローンから、アルカリ抽出法によりＭ１３mp ＲＦ
ＤＮＡを調製した。これらのクローンの中から東洋紡績
社製の７−デアザシーケネースキットを用いたＤＮＡシ
ークエンシングにより、所望のクローンを選択した。

【００３２】実施例４発現用ベクターpＧＥＬＣys−
ＲＧＤ４の作製１０mＭＴris−ＨＣl(pＨ８.０)−７mＭＭgＣl₂−２
０mＭＫＣl−７mＭ２−メルカプトエタノール溶液(１
５μl)中、実施例３で得られたＭ１３mp１９Ｃys−Ｒ
ＧＤ４ＲＦＤＮＡ(各２μg)にＳmaＩ(宝酒造製)(１０
unit)を３０℃で４５分間作用させた。この反応液にさ
らに１.５ＭＮaＣl(１.３μl)とＸhoＩ(宝酒造製)(１
０unit)を加え、蒸留水で２０μlとした後、３７℃で４
５分間反応させた。得られたＸhoＩ−ＳmaＩフラグメン
トを１％アガロース電気泳動によって精製した後、ミリ
ポア社製ウルトラフリーＣ３ＨＶを用いて４０００×
g、１０分間の遠心を２回行い、回収した。同様にしてp
ＥＲＩ８６０２(３μg)のＸhoＩ−ＳmaＩ消化を行い、
得られたベクターのＸhoＩ−ＳmaＩ断片を０.８％低融
点アガロースゲル電気泳動で精製した。このようにして
得られたＭ１３mp１９Ｃys−ＲＧＤ４ＲＦＤＮＡのＸ
hoＩ−ＳmaＩ断片(１００ng)とpＥＲＩ８６０２ベクタ
ーのＸhoＩ−ＳmaＩ断片(３００ng)を、宝酒造製ＤＮＡ
ライゲーションキットを用いて結合させた後、大腸菌Ｄ
Ｈ−１株のコンピーテントセルにトラスンスフェクトさ
せた。得られたクローンを制限酵素消化によりスクリー
ニングし、所望のプラスミドＤＮＡ(pＧＥＬＣys−ＲＧ
Ｄ４)を得た。得られたプラスミドＤＮＡは、図４に示
す天然型ヒトリゾチームをコードするＤＮＡ配列中、太
線で示したヌクレオチドが表１のＣys−ＲＧＤ４で示さ
れるＤＮＡ断片で置換されているＤＮＡ配列を含んでい
ることを確認した。尚、Ｃys−ＲＧＤ３およびＣys−Ｒ
ＧＤ５についても同様の確認を行った。

【００３３】実施例５酵母形質転換体の調製実施例４で得た発現用プラスミドpＧＥＬＣys−ＲＧＤ
４でＳaccharomyces cerevisiae ＡＨ２２株(ロイシン
要求性)を形質転換させ、形質転換体Ｓ.cerevisiae Ａ
Ｈ２２／pＧＥＬＣys−ＲＧＤ４を得た。形質転換体に
おける変異型ヒトリゾチーム(Ｃys−ＲＧＤ４)の分泌発
現は、Ｍicrococcus菌体を含むアガロースプレート上で
のハロー活性、および液体培養での培養上清中の溶菌活
性を測定することによって確認された。尚、形質転換体
Ｓ.cerevisiae ＡＨ２２／pＧＥＬＣys−ＲＧＤ４、並
びに同様にして得たＳ.cerevisiae ＡＨ２２／pＧＥＬ
Ｃys−ＲＧＤ３およびＳ.cerevisiae ＡＨ２２／pＧＥ
ＬＣys−ＲＧＤ５は、工業技術院生命工学工業技術研究
所に寄託されている(受託番号：ＦＥＲＭＰ−１３９
９１，Ｐ−１３９９０およびＰ−１３９９２；受託日：
いずれも平成５年１２月２日）。

【００３４】実施例６酵母形質転換体の培養実施例５で得た酵母形質転換体Ｓ．cerevisiae ＡＨ２
２／pＧＥＬＣys−ＲＧＤ４を、Ｂurkholderの改変培地
ＩＩＩ(１Ｌ当たり、ＫＨ₂ＰＯ₄(０.４g)、グルコース
(１０g)、アスパラギン(５g)、シュークロース(８０g)
とした)(５ml)を含む試験管に接種し、３０℃で３日間
振盪培養した。得られた培養液(４ml)を同一培地ＩＩＩ
(１６ml)を含む２００ml容コルベンに移し、３０℃で１
日振盪培養した。この培養液(２０ml)を同一培地ＩＩＩ
(１８０ml)を含む５００ml容コルベンに移し、３０℃で
４日間振盪培養した。

【００３５】実施例７変異型ヒトリゾチーム(Ｃys−
ＲＧＤ４)の精製実施例６で得た培養液から、遠心分離操作により培養上
清を得た。次に、５０mＭリン酸ナトリウム緩衝液(pＨ
６.５)で平衡化したＣＭ−トヨパール６５０Ｍカラム
(１.６cmφ×５cm,１０ml)に２０ml／hの流速で培養上
清を負荷した。同一緩衝液(５０ml)で洗浄した後、０.
６ＭＮaＣl−５０mＭリン酸ナトリウム緩衝液(pＨ６.
５)を用いて１０ml／hの流速で溶出を行った。ＹＭ５メ
ンブレンを用いたダイアフロー装置によってこの溶出液
(１０ml)を濃縮脱塩し、最終的に５０mＭリン酸ナトリ
ウム緩衝液(pＨ６.５)(１ml)の試料溶液とした。さら
に、Ａsahipak ＥＳ−５０２Ｃカラム(７.６mmφ×１０
cm)を用いた高速液体クロマトグラフィーを下記の条件
で行った。Ａ液:５０mＭリン酸ナトリウム(pＨ６.５)、
Ｂ液:０.６ＭＮa₂ＳＯ₄−５０mＭリン酸ナトリウム(p
Ｈ６.５)、溶出条件:０分(％Ａ８５,％Ｂ１５)−４５分
(％Ａ７０,％Ｂ３０)−５０分(％Ａ０,％Ｂ１００)、流
速:１ml／min。本条件下で、変異型ヒトリゾチームＣys
−ＲＧＤ４は、３０〜４０分で溶出された。この画分を
集め、蒸留水に対して十分透析した後、凍結乾燥によっ
て最終標品を得た。Ｃys−ＲＧＤ３、Ｃys−ＲＧＤ４お
よびＣys−ＲＧＤ５のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル
電気泳動(ゲル濃度１５％, 還元条件)における泳動パタ
ーンを図２に示す。図２において、レーン１は天然型ヒ
トリゾチーム(２μg)、レーン２はＣys−ＲＧＤ３(２μ
g)、レーン３はＣys−ＲＧＤ４(２μg)、レーン４はＣy
s−ＲＧＤ５(２μg)、レーン５は分子量マーカー(２μ
g)の泳動パターンである。

【００３６】実施例８変異型ヒトリゾチームＣys−Ｒ
ＧＤ３、Ｃys−ＲＧＤ４、およびＣys−ＲＧＤ５の溶菌
活性の測定実施例２〜７と同様にして、変異型リゾチームＣys−Ｒ
ＧＤ３、Ｃys−ＲＧＤ４およびＣys−ＲＧＤ５を製造
し、０.１Ｍリン酸カリウム緩衝液(pＨ６.２)(２ml)中
でＭicrococcus luteus(シグマ社製)(０.４mg)を基質と
して２５℃で３分間反応させ、４５０nmにおける吸光度
の減小を測定することによって溶菌活性の測定を行なっ
た。標準ヒトリゾチームとしては、ミドリ十字製のヒト
尿由来の天然型ヒトリゾチームを使用した。試料液中の
ヒトリゾチーム蛋白量は、２８０nmにおける吸光度をも
とに決定された。溶菌活性の測定を３回行って得た結果
は、以下の表２に示す通りであった。

【００３７】

【表２】溶菌活性(％) 天然型ヒトリゾチーム１００Ｃys−ＲＧＤ３９０Ｃys−ＲＧＤ４９７Ｃys−ＲＧＤ５９２

【００３８】実施例９変異型ヒトリゾチームＣys−Ｒ
ＧＤ３、Ｃys−ＲＧＤ４およびＣys−ＲＧＤ５の細胞接
着活性の測定１）試料の調製試料を０.１ＭＮaＨＣＯ₃で希釈し、テルモ社製２４穴
平型プレートにウエル当り４００μl添加し、４℃で一
晩吸着させた。ＰＢＳで洗浄後、１％ＢＳＡを含むＰＢ
Ｓ(５００μl)を加え、室温で３〜４時間インキュベー
トした後、ＰＢＳで洗浄し、接着活性の測定に用いた。

【００３９】２）細胞懸濁液の調製継代培養中のＢＨＫ細胞を、０.２５％トリプシン、０.
０２％ＥＤＴＡを含むＰＢＳ中、３７℃で２分間インキ
ュベートしてはく離した後、氷冷したＤＭＥ／ＨＥＰＥ
Ｓ生理的食塩水(１:１)(１０ml)に懸濁した。ここで、
ＤＭＥはダルベッコの最少培地を表わし、ＨＥＰＥＳ生
理的食塩水は１３７mＭＮaＣlおよび３mＭＫＣlを含
む２０mＭＨＥＰＥＳバッファー(pＨ７.１)を表わす。
遠心分離して上清を除き、ＳＴＩ(大豆トリプシンイン
ヒビター)(1mg)を含有している氷冷ＤＭＥ／ＨＥＰＥＳ
生理的食塩水(１０ml)に細胞を懸濁させた。遠心分離
し、ＳＴＩ不含の氷冷ＤＭＥ／ＨＥＰＥＳ生理的食塩水
で洗浄した後、細胞を同液に１×１０⁵cells／mlとなる
ように懸濁した。

【００４０】３）接着活性の測定上記試料を吸着させたプレートに細胞懸濁液(３００μ
l)を加え、３７℃で１時間インキュベートした。３７℃
のＤＭＥ／ＨＥＰＥＳ生理的食塩水で３回洗浄すること
によって未吸着の細胞を除き、残った細胞を４％ホルマ
リン／ＰＢＳで固定し、顕微鏡下に細胞の伸展を観察し
た。

【００４１】測定結果を図３に示す。横軸は測定系に添
加された試料蛋白質の濃度、縦軸は伸展が観察された細
胞の個数を示している。図３から、細胞接着活性はＣys
−ＲＧＤ５＜Ｃys−ＲＧＤ４＝Ｃys−ＲＧＤ３の順に増
大していることが認められた。また、ＲＧＤ４の接着活
性と比較すると、Ｃys−ＲＧＤ４の接着活性は２〜３倍
高いことも認められた。

【図面の簡単な説明】

【図１】酵母における変異型ヒトリゾチーム発現用ベ
クターpＧＥＬＣys−ＲＧＤ４の構築に関する模式図で
ある。

【図２】変異型ヒトリゾチームＣys−ＲＧＤ３、Ｃys
−ＲＧＤ４およびＣys−ＲＧＤ５のＳＤＳ−ポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動の結果を示す写真の模写図であ
る。

【図３】変異型ヒトリゾチームＣys−ＲＧＤ３、Ｃys
−ＲＧＤ４およびＣys−ＲＧＤ５の細胞接着活性の測定
結果を示したグラフである。

【図４】天然型ヒトリゾチームをコードするＤＮＡ配
列および対応するアミノ酸配列を示す模式図。太線は表
１に示す変異部位をコードするＤＮＡで置換される部位
を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所 (Ｃ１２Ｎ 9/36 Ｃ１２Ｒ 1:865）

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】天然型ヒトリゾチームのアミノ酸配列の
第７４位のＶ残基と第７５位のＮ残基の間に、細胞接着
活性を有するアミノ酸配列ＲＧＤを含みかつ両端にＣ残
基を有するアミノ酸配列が挿入されたポリペプチドをコ
ードしている変異型ヒトリゾチーム遺伝子。
【請求項２】挿入された細胞接着活性を有するアミノ
酸配列がＣＲＧＤＣである請求項１に記載の変異型ヒト
リゾチーム遺伝子。
【請求項３】挿入された細胞接着活性を有するアミノ
酸配列がＣＲＧＤＳＣである請求項１に記載の変異型ヒ
トリゾチーム遺伝子。
【請求項４】挿入された細胞接着活性を有するアミノ
酸配列がＣＧＲＧＤＳＣである請求項１に記載の変異型
ヒトリゾチーム遺伝子。
【請求項５】請求項１〜４のいずれかに記載の変異型
ヒトリゾチーム遺伝子を含有し、真核生物内で自律的に
複製可能な発現ベクター。
【請求項６】プラスミドpＧＥＬＣys−ＲＧＤ３であ
る請求項５に記載の発現ベクター。
【請求項７】プラスミドpＧＥＬＣys−ＲＧＤ４であ
る請求項５に記載の発現ベクター。
【請求項８】プラスミドpＧＥＬＣys−ＲＧＤ５であ
る請求項５に記載の発現ベクター。
【請求項９】請求項５〜８のいずれかに記載の発現ベ
クターで形質転換された、変異型ヒトリゾチームを産生
し、分泌し得る宿主細胞。
【請求項１０】形質転換体Ｓaccharomyces cerevisia
e ＡＨ２２／pＧＥＬＣys−ＲＧＤ３である請求項９に
記載の宿主細胞。
【請求項１１】形質転換体Ｓaccharomyces cerevisia
e ＡＨ２２／pＧＥＬＣys−ＲＧＤ４である請求項９に
記載の宿主細胞。
【請求項１２】形質転換体Ｓaccharomyces cerevisia
e ＡＨ２２／pＧＥＬＣys−ＲＧＤ５である請求項９に
記載の宿主細胞。
【請求項１３】請求項９〜１２のいずれかに記載の形
質転換体を培養し、培養液中に分泌されたヒトリゾチー
ム活性および挿入されたアミノ酸配列に基づく細胞接着
活性を有するタンパク質を分離し、所望により精製する
ことからなる変異型ヒトリゾチームの製造方法。
【請求項１４】請求項１３に記載の方法で製造された
変異型ヒトリゾチーム。