JP2766473B2 - トロンビンによるプロテインｃの活性化を促進するペプチド - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、トロンビンに結合
し、トロンビンのプロテインＣ活性化を促進する作用を
有する新規なペプチドに関する。更に詳しくは、本発明
は血栓溶解作用、抗血液凝固作用及び血小板凝集抑制作
用を有し、したがって、血液凝固を制御するための、ま
たは血小板凝集を制御するための医薬組成物として、循
環器系の疾患の治療に有用なペプチドに関する。本発明
は、また、その新規なペプチドをコードするデオキシリ
ボ核酸（以下“ＤＮＡ”と称する）、該ＤＮＡを含有す
る複製可能な組換え体ＤＮＡ、該組換え体ＤＮＡで形質
転換された微生物または細胞及び組換えＤＮＡ技術によ
る該ペプチドの製造方法に関する。

【０００２】本明細書において、アミノ酸及びペプチド
は下記に示すＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ生化学命名委員会（Ｃ
ＢＮ）で採用された略号を用いて表される。なお、アミ
ノ酸などに関し光学異性体があり得る場合は、特に明示
しなければＬ体を示すものとする。更に、特に明示しな
い限りペプチドのアミノ酸配列の左端及び右端はそれぞ
れＮ末端およびＣ末端である。

【０００３】 Ｇｌｎ：グルタミン残基 Ａｓｐ：アスパラギン酸残基 Ｐｒｏ：プロリン残基 Ｔｙｒ：チロシン残基 Ｖａｌ：バリン残基 Ｌｙｓ：リジン残基 Ｇｌｕ：グルタミン酸残基 Ａｌａ：アラニン残基 Ａｓｎ：アスパラギン残基 Ｌｅｕ：ロイシン残基 Ｐｈｅ：フェニルアラニン残基 Ｇｌｙ：グリシン残基 Ｈｉｓ：ヒスチジン残基 Ｓｅｒ：セリン残基 Ｔｈｒ：スレオニン残基 Ｉｌｅ：イソロイシン残基 Ｔｒｐ：トリプトファン残基 Ａｒｇ：アルギニン残基 Ｍｅｔ：メチオニン残基 Ｃｙｓ：システイン残基 また、ポリデオキシリボヌクレオチドおよびオリゴヌク
レオチドは下記の如き略号で表されるデオキシリボヌク
レオチドの配列により表記する。 Ａ：２′−デオキシアデニル酸残基 Ｃ：２′−デオキシシチジル酸残基 Ｇ：２′−デオキシグアニル酸残基 Ｔ：チミジル酸残基 特に明示しない限りデオキシリボヌクレオチド配列の左
端及び右端はそれぞれ５′末端及び３′末端である。

【０００４】

【従来の技術】現在、血栓溶解剤として用いられるもの
には、ストレプトキナーゼやウロキナーゼがある。ま
た、抗血液凝固剤としてはヘパリンやワーファリンが用
いられている。さらに、血小板凝集抑制剤としてはアス
ピリン、スルフィンピラゾン、ジピリダモール等が使わ
れている。これらの血栓溶解剤、抗血液凝固剤および血
小板凝集抑制剤は、それぞれ別個に、あるいは併用し
て、例えば、心筋梗塞、血栓症、塞栓症、末梢血管閉塞
症、閉塞性動脈硬化症、血管内血液凝固症候群（ＤＩ
Ｃ）、狭心症、一過性脳虚血発作、妊娠中毒症等の疾患
の治療及び予防に用いられている。しかしながら、これ
らの血栓溶解剤、抗血液凝固剤および血小板凝集抑制剤
は非常に複雑な機構から成り立つ血液の凝固線溶系の極
く一部に作用するにすぎない。そこで、血液の凝固線溶
系に広く作用し、優れた血液凝固抑制作用を示す薬剤が
要望されていた。

【０００５】ところで、血液凝固機構において重要な役
割を演じているビタミンＫ依存性の蛋白質としてプロテ
インＣが知られている。近年、そのプロテインＣの活性
化を促進し、トロンビンの作用による血小板の活性化と
フィブリン形成を抑制する物質が、ウサギの肺、ウシの
肺、ヒトの肺やヒト胎盤などに存在し、それが前述の薬
剤に比べて優れた血液凝固抑制作用を有することが報告
されている。

【０００６】ウサギの肺に存在する物質については、例
えば、シー ティー エスモン（Ｃ．Ｔ．Ｅｓｍｏｎ）
ら、プロシーディング オブ ナショナル アカデミー
オブ サイエンス ユーエスエー（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ）、７８巻、２２４９頁
（１９８１年）；エヌ エル エスモン（Ｎ．Ｌ．Ｅｓ
ｍｏｎ）ら、ザ ジャーナル オブ バイオロジカル
ケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．）、２５７
巻、８５９頁（１９８２年）；シー ティー エスモン
（Ｃ．Ｔ．Ｅｓｍｏｎ）ら、ザ ジャーナル オブ バ
イオロジカル ケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅ
ｍ．）、２５７巻、７９４４頁（１９８２年）；エヌ
エル エスモン（Ｎ．Ｌ．Ｅｓｍｏｎ）ら、ザ ジャー
ナル オブバイオロジカル ケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏ
ｌ．Ｃｈｅｍ．）、２５８巻、１２２３８頁（１９８２
年）を参照することができる。

【０００７】ウシの肺に存在する物質については、例え
ば楠本ら、生化学、５６巻、８９０頁（１９８４年）を
参照することができる。また、ヒト胎盤に存在する物質
については、例えば特開昭６０−１９９８１９；黒沢
ら、日本血液学会誌、４７巻、６３２頁（１９８４
年）；エッチ エッチ サーレム（Ｈ．Ｈ．Ｓａｌｅ
ｍ）ら、ジャーナル オブ バイオロジカル ケミスト
リー（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．）、２５９巻、１２２
４６頁（１９８４年）；エス．クロサワ（Ｓ．Ｋｕｒｏ
ｓａｗａ）ら、トロンボシス リサーチ（Ｔｈｒｏｍｂ
ｏｓｉｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、３７巻、３５３頁（１
９８５年）を参照することができる。また、ヒトの肺に
存在する物質については、例えば楠本ら、生化学、５７
巻、１１０２頁（１９８５年）を参照することができ
る。

【０００８】上記の先行技術文献には上記物質の一般的
性質が記載されているが、その物質の構造、例えばアミ
ノ酸配列などは解明されておらず、未だにその物質は同
定されていない。従って、上記の先行技術文献に報告さ
れている物質が単一物質であるか否か、また、これらの
先行技術文献の記載にしたがって同一の物質が繰返し得
られるか否かについては全く不明である。さらにまた、
上記の先行技術文献に報告されている物質は、細胞膜上
に存在するものであり、界面活性剤の非存在下では不溶
性であって、循環器疾患の治療などの医薬組成物として
用いる場合にはそのままでは投与量を多くすることがで
きないものであり、そもそも生体由来であることから十
分な量が確保できず、その物質が本当に医薬として使用
できるものであるか否かの検討さえも出来ない状態であ
った。

【０００９】注射剤とする場合に不溶物が存在すること
は、循環器疾患を有する患者において致命的であること
から、界面活性剤の添加を必須とするが、上記の問題を
有する患者にとって界面活性剤の添加は予想外の問題を
引き起こす可能性は否定できず、場合によっては好まし
いものではない。また、一部には細胞膜上に存在する以
外の形態、例えば血中や尿中の存在する旨の開示がある
が〔イシイら、ジャーナル オブ クリニカル インベ
スティゲーション（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．）、
７６巻、２１７８頁（１９８５年）〕、精製が十分にさ
れていないことが明らかであり、またその活性や作用、
物性やその由来等の解析や検討が不十分であり、まして
やアミノ酸配列等の構造についての解析は全くなく、そ
もそも医薬として使用できる効果と安全性を有し、しか
も医薬として常に安定的に供給し得るものとの位置づけ
をすることはできないものであった。即ち、従来、上記
物質においては、その物性や構造等についての十分な解
析がない状況であって、トロンビンに結合し、トロンビ
ンによるプロテインＣの活性化を促進する作用を有する
性質が得られ、且つ十分な可溶性を有するペプチドなど
望むべき状況では全くなかった。

【００１０】

【発明が解決しようとする課題】従来より、血液凝固を
制御するための、または血小板凝集を制御するためのさ
らに有用なペプチドの提供が求められていた。

【００１１】

【課題を解決するための手段】本発明者等は、上述の技
術的背景にあって、血液の凝固線溶系の一因子であるプ
ロテインＣを活性化して血液凝固を抑制するだけでな
く、線溶作用を増進する物質を見出すべく鋭意研究を重
ねた結果、意外にも、後述するように本発明のペプチド
が、従来知られていない新規物質であって、トロンビン
に結合し、且つトロンビンによるプロテインＣ活性化を
促進して血液凝固を制御することができるだけでなく、
線溶を促進することができ、血液凝固を制御する薬剤、
即ち、血液凝固を制御するための、または血小板凝集を
制御するための医薬組成物として有用であることを見出
した。

【００１２】また該ペプチドをコードするＤＮＡを単離
し、更にまた、そのペプチドが、組換えＤＮＡ技術によ
って、好ましくは他のヒト由来蛋白をまったく含まない
純粋な形態で、大量にかつ容易に製造でき、しかも該ペ
プチドが可溶性であって、医薬組成物自体やその製造に
おいて顕著に好ましい性質を有することを見出した。本
発明は、これらの知見に基づいて完成したものである。

【００１３】即ち本発明によれば、配列番号７の１−５
７５のアミノ酸配列、または該アミノ酸配列のアミノ酸
残基の置換、挿入または欠失を施すことにより得られる
アミノ酸配列を有し、且つ下記（ａ）、（ｂ）、（ｄ）
〜（ｆ）に規定される組換えペプチドであって、少なく
とも該組換えペプチド中に、ヒト由来の夾雑成分を実質
的に含有しないことを特徴とする実質的に精製された組
換えペプチド（但し、該ペプチドが配列番号３の１−４
９８のアミノ酸配列からなるペプチドである場合を除
く）。 （ａ）トロンビンに結合し、 （ｂ）トロンビンによるプロテインＣの活性化を促進す
る作用を有する、 （ｄ）トロンビンによる凝固時間を延長する、 （ｅ）トロンビンによる血小板凝集を抑制する、 （ｆ）ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上にて、銀染色
が可能である、が提供される。 本発明においては、以下特に断りのないかぎり配列番号
３の１−４９８のアミノ酸配列からなるペプチドである
場合を除くものである。本発明の組換えペプチドは、ヒ
ト由来の夾雑成分を実質的に含有しないものであって、
好ましいものである。この組換えペプチドは、配列番号
７の１−５７５のアミノ酸配列か、または該アミノ酸配
列のアミノ酸残基の置換、挿入または欠失を施すことに
よって得られるアミノ酸配列からなるペプチドであり、
これらは本発明の実施例により裏付けられている。また
上記組換えペプチドは、界面活性剤の非存在下で可溶性
であることが好ましい。

【００１４】また、本発明によれば、下記（ａ）〜
（ｇ）に規定される実質的に精製された可溶性ペプチド
（但し、該ペプチドが配列番号３の１−４９８のアミノ
酸配列からなるペプチドである場合を除く）。 （ａ）トロンビンに結合し、 （ｂ）トロンビンによるプロテインＣの活性化を促進す
る作用を有する、 （ｃ）少なくとも界面活性剤の非存在下で可溶である、 （ｄ）トロンビンによる凝固時間を延長する、 （ｅ）トロンビンによる血小板凝集を抑制する、 （ｆ）ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上にて、銀染色
が可能である、 （ｇ）該可溶性ペプチドのアミノ酸配列の相同性が、該
アミノ酸配列の範囲において、下記の制限酵素地図

【化２】 に示された制限酵素サイトを有することにより特徴付け
られるヒト由来のＤＮＡがコードし得るトロンビンに結
合し、かつトロンビンによるプロテインＣの活性化を促
進する作用を有するペプチドのアミノ酸配列と完全に一
致する相同性を有する、が提供される。

【００１５】本発明のペプチドがトロンビンに結合する
ことは、例えば、本明細書実施例に記載されているよう
に、ＤＩＰ−トロンビン〔ジイソプロピルホスフォロト
ロンビン（ｄｉｉｓｏｐｒｏｐｙｌｐｈｏｓｐｈｏｒｏ
−ｔｈｒｏｍｂｉｎ）、またはＤＩＰ−トロンビン−ア
ガロースに結合することにより確認される。また、トロ
ンビンによるプロテインＣの活性化を促進する活性を有
することも、本明細書実施例に記載されている通りであ
る。

【００１６】本発明の可溶性ペプチドは、トロンビンに
よるプロテインＣの活性化を促進する活性物質として検
知され、回収される。通常本活性は、試料を０．１５Ｍ
食塩、２．５ｍＭ塩化カルシウム、１ｍｇ／ｍｌ血清ア
ルブミンを含有するｐＨ７．４の２０ｍＭトリス塩酸緩
衝液中にトロンビン及びプロテインＣの存在下添加し、
生成される活性化プロテインＣの量を定量し評価され
る。従って、本発明のペプチドは、上記緩衝液中に少な
くとも検知され得る濃度まで可溶性である。

【００１７】このように、ペプチドが可溶性であるこ
と、即ち、そのペプチドが界面活性剤の非存在下で調製
され得ることは、そのペプチドを医薬組成物として使用
するに際し、極めて有用なことであることについては、
既に述べた通りであるが、例えば、従来の物質において
は、界面活性剤の非存在下では不溶性であり、不溶物が
存在する注射剤としないために界面活性剤の添加を必須
とするが、種々の問題を有する循環器疾患の患者におい
て、この界面活性剤の添加は予想外の問題を引き起こす
可能性は否定できないし、また界面活性剤の添加量との
兼ね合いもあって、必ずしも十分に高い含有濃度の製剤
が調製できない可能性もあることが考えられる。

【００１８】これに対し、本発明のペプチドは、可溶性
であるが故に、これらの問題はことごとく解決されるも
のである。また、医薬組成物を製造する場合において
も、本発明の可溶性であるペプチドが極めて有利である
ことは当然のことであって、例えば、精製が容易である
こと、製剤にするときに凍結乾燥等が容易であること等
が挙げられる。

【００１９】本発明の可溶性ペプチドは、上記の作用と
可溶性を有すれば特に限定されなくともよいが、本発明
のペプチオドのアミノ酸配列の相同性は、図４０の制限
酵素地図に示された制限酵素サイトを有することにより
特徴付けられるヒト由来のＤＮＡのコードし得るトロン
ビンに結合し、トロンビンによるプロテインＣの活性化
を促進する作用を有するペプチドのアミノ酸配列と完全
に一致するものであり、このＤＮＡがコードし得るアミ
ノ酸配列は図４０の制限酵素地図の開始コドンの最初の
塩基から終止コドンの直前の塩基までの１７２５ｂｐの
塩基配列がコードし得るものであるが、このアミノ酸配
列の具体的例示としては、配列番号７の１−５７５のア
ミノ酸配列が好ましい例として挙げられる。尚、図４０
は図１１の一部分を示すものである。

【００２０】本発明の典型的なペプチドにおいては、ト
ロンビンに結合し、トロンビンによるプロテインＣの活
性化を促進する作用を有し、界面活性剤の非存在下で可
溶性であれば特に限定されないが、最も好ましい具体例
としては、配列番号１の１−１１８のアミノ酸配列、即
ち、下記式（Ｉ）： Ｖａｌ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｖａｌ Ａｓｐ Ｐｒｏ Ｃｙｓ Ｐｈｅ Ａｒｇ Ａｌａ Ａｓｎ Ｃｙｓ Ｇｌｕ Ｔｙｒ Ｇｌｎ Ｃｙｓ Ｇｌｎ Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ａｓｎ Ｇｌｎ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ｔｙｒ Ｌｅｕ Ｃｙｓ Ｖａｌ Ｃｙｓ Ａｌａ Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ｐｈｅ Ａｌａ Ｐｒｏ Ｉｌｅ Ｐｒｏ Ｈｉｓ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｈｉｓ Ａｒｇ Ｃｙｓ Ｇｌｎ Ｍｅｔ Ｐｈｅ Ｃｙｓ Ａｓｎ Ｇｌｎ Ｔｈｒ Ａｌａ Ｃｙｓ Ｐｒｏ Ａｌａ Ａｓｐ Ｃｙｓ Ａｓｐ Ｐｒｏ Ａｓｎ Ｔｈｒ Ｇｌｎ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｃｙｓ Ｇｌｕ Ｃｙｓ Ｐｒｏ Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ｔｙｒ Ｉｌｅ Ｌｅｕ Ａｓｐ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｐｈｅ Ｉｌｅ Ｃｙｓ Ｔｈｒ Ａｓｐ Ｉｌｅ Ａｓｐ Ｇｌｕ Ｃｙｓ Ｇｌｕ Ａｓｎ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｐｈｅ Ｃｙｓ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｃｙｓ Ｈｉｓ Ａｓｎ Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｔｈｒ Ｐｈｅ Ｇｌｕ Ｃｙｓ Ｉｌｅ Ｃｙｓ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ｓｅｒ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ａｒｇ Ｈｉｓ Ｉｌｅ Ｇｌｙ Ｔｈｒ Ａｓｐ Ｃｙｓ で表されるアミノ酸配列を含有するペプチドが例示され
る。

【００２１】勿論、式（Ｉ）で表されるアミノ酸配列
は、最も好ましい例であって、上記の活性に程度の差が
あっても、上記の活性が認められる限り、特に式（Ｉ）
で表されるアミノ酸配列に拘泥する必要はない。またヒ
トにおいては、多型性と言われる変異があることは通常
十分に考えられることである。即ち、本発明のペプチド
は実質的に前記式（Ｉ）で表されるアミノ酸配列から成
っていてもよいし、また、その作用と機能を阻害しない
限り若干の欠損、挿入、置換等があっても、その相同変
異体のアミノ酸配列であってもよく、式（Ｉ）で表され
るアミノ酸配列のＮ末端及び／またはＣ末端に結合した
少なくとも１種の他のペプチドのアミノ酸配列を更に含
有してもよい。

【００２２】例えば、組換えペプチドが、配列番号の１
−４９８のアミノ酸配列のアミノ酸残基の置換、挿入ま
たは欠失を施すことにより得られるアミノ酸配列を有す
る組換えペプチドであることも好ましい。また、組換え
ペプチドが、（ｉ）配列番号８の１−２７２のアミノ酸
配列において、少なくとも該配列番号８の１１９−２３
６のアミノ酸配列を包含するように該配列番号８のＮ末
端及び／又はＣ末端の任意の個数のアミノ酸残基が削除
されていてもよいアミノ酸配列からなるトロンビンに結
合し、トロンビンによるプロテインＣの活性化を促進す
る作用を有する組換えペプチド、（ii) 前記（ｉ）に記
載の組換えペプチドのアミノ酸配列のアミノ酸残基の置
換、挿入または欠失を施すことにより得られるアミノ酸
配列からなり、且つトロンビンに結合し、トロンビンに
よるプロテインＣの活性化を促進する作用を有する組換
えペプチド、のいずれかであることも好ましい。因み
に、これらの更に具体的なペプチドの例としては、
（１）上記式（Ｉ）のペプチドの他、下記のペプチドの
（２）〜（５）が挙げられる。（但し、配列番号３の１
−４９８のアミノ酸配列は参考のため例示する）。

【００２３】（２）式（Ｉ）で表されるアミノ酸配列の
Ｎ末端に下記のアミノ酸配列： Ｃｙｓ Ｓｅｒ Ｖａｌ Ｇｌｕ Ａｓｎ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｃｙｓ Ｇｌｕ Ｈｉｓ Ａｌａ Ｃｙｓ Ａｓｎ Ａｌａ Ｉｌｅ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｐｒｏ Ａｒｇ Ｃｙｓ Ｇｌｎ Ｃｙｓ Ｐｒｏ Ａｌａ Ｇｌｙ Ａｌａ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｇｌｎ Ａｌａ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ａｒｇ Ｓｅｒ Ｃｙｓ Ｔｈｒ Ａｌａ Ｓｅｒ Ａｌａ Ｔｈｒ Ｇｌｎ Ｓｅｒ Ｃｙｓ Ａｓｎ Ａｓｐ Ｌｅｕ Ｃｙｓ Ｇｌｕ Ｈｉｓ Ｐｈｅ Ｃｙｓ Ｖａｌ Ｐｒｏ Ａｓｎ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ｇｌｎ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｔｙｒ Ｓｅｒ Ｃｙｓ Ｍｅｔ Ｃｙｓ Ｇｌｕ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ｔｙｒ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ａｌａ Ａｌａ Ａｓｐ Ｇｌｎ Ｈｉｓ Ａｒｇ Ｃｙｓ Ｇｌｕ Ａｓｐ Ｖａｌ Ａｓｐ Ａｓｐ Ｃｙｓ Ｉｌｅ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ｐｒｏ Ｃｙｓ Ｐｒｏ Ｇｌｎ Ａｒｇ Ｃｙｓ Ｖａｌ Ａｓｎ Ｔｈｒ Ｇｌｎ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｐｈｅ Ｇｌｕ Ｃｙｓ Ｈｉｓ Ｃｙｓ Ｔｙｒ Ｐｒｏ Ａｓｎ Ｔｙｒ Ａｓｐ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ｃｙｓ が結合してなるペプチド（即ち、配列番号６の１−２３
６のアミノ酸配列）。

【００２４】（３）式（Ｉ）で表されるアミノ酸配列の
Ｎ末端及びＣ末端にそれぞれ下記のアミノ酸配列： Ｃｙｓ Ｓｅｒ Ｖａｌ Ｇｌｕ Ａｓｎ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｃｙｓ Ｇｌｕ Ｈｉｓ Ａｌａ Ｃｙｓ Ａｓｎ Ａｌａ Ｉｌｅ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｐｒｏ Ａｒｇ Ｃｙｓ Ｇｌｎ Ｃｙｓ Ｐｒｏ Ａｌａ Ｇｌｙ Ａｌａ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｇｌｎ Ａｌａ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ａｒｇ Ｓｅｒ Ｃｙｓ Ｔｈｒ Ａｌａ Ｓｅｒ Ａｌａ Ｔｈｒ Ｇｌｎ Ｓｅｒ Ｃｙｓ Ａｓｎ Ａｓｐ Ｌｅｕ Ｃｙｓ Ｇｌｕ Ｈｉｓ Ｐｈｅ Ｃｙｓ Ｖａｌ Ｐｒｏ Ａｓｎ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ｇｌｎ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｔｙｒ Ｓｅｒ Ｃｙｓ Ｍｅｔ Ｃｙｓ Ｇｌｕ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ｔｙｒ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ａｌａ Ａｌａ Ａｓｐ Ｇｌｎ Ｈｉｓ Ａｒｇ Ｃｙｓ Ｇｌｕ Ａｓｐ Ｖａｌ Ａｓｐ Ａｓｐ Ｃｙｓ Ｉｌｅ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ｐｒｏ Ｃｙｓ Ｐｒｏ Ｇｌｎ Ａｒｇ Ｃｙｓ Ｖａｌ Ａｓｎ Ｔｈｒ Ｇｌｎ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｐｈｅ Ｇｌｕ Ｃｙｓ Ｈｉｓ Ｃｙｓ Ｔｙｒ Ｐｒｏ Ａｓｎ Ｔｙｒ Ａｓｐ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ｃｙｓ 及び Ａｓｐ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｖａｌ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ａｓｐ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ａｌａ Ｖａｌ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｈｉｓ Ｓｅｒ Ｇｌｙ が結合してなるペプチド（即ち、配列番号８の１−２７
２のアミノ酸配列）。

【００２５】（４）式（Ｉ）で表されるアミノ酸配列の
Ｎ末端及びＣ末端にそれぞれ下記のアミノ酸配列： Ａｌａ Ｐｒｏ Ａｌａ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｇｌｎ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｇｌｎ Ｃｙｓ Ｖａｌ Ｇｌｕ Ｈｉｓ Ａｓｐ Ｃｙｓ Ｐｈｅ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｔｙｒ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ａｌａ Ｔｈｒ Ｐｈｅ Ｌｅｕ Ａｓｎ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｇｌｎ Ｉｌｅ Ｃｙｓ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ｇｌｙ Ｈｉｓ Ｌｅｕ Ｍｅｔ Ｔｈｒ Ｖａｌ Ａｒｇ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｖａｌ Ａｌａ Ａｌａ Ａｓｐ Ｖａｌ Ｉｌｅ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ａｓｎ Ｇｌｙ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｇｌｙ Ａｒｇ Ａｒｇ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ｔｒｐ Ｉｌｅ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｇｌｎ Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｃｙｓ Ｇｌｙ Ａｓｐ Ｐｒｏ Ｌｙｓ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ｇｌｙ Ｐｈｅ Ｇｌｎ Ｔｒｐ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ａｓｐ Ａｓｎ Ａｓｎ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ｔｙｒ Ｓｅｒ Ａｒｇ Ｔｒｐ Ａｌａ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ａｓｐ Ｌｅｕ Ａｓｎ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ｃｙｓ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ｃｙｓ Ｖａｌ Ａｌａ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ａｌａ Ａｌａ Ｇｌｕ Ａｌａ Ｔｈｒ Ｖａｌ Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｉｌｅ Ｔｒｐ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｇｌｎ Ｇｌｎ Ｃｙｓ Ｇｌｕ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ａｌａ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｐｈｅ Ｌｅｕ Ｃｙｓ Ｇｌｕ Ｐｈｅ Ｈｉｓ Ｐｈｅ Ｐｒｏ Ａｌａ Ｔｈｒ Ｃｙｓ Ａｒｇ Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ａｌａ Ｖａｌ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ａｌａ Ａｌａ Ａｌａ Ａｌａ Ａｌａ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｉｌｅ Ｔｈｒ Ｔｙｒ Ｇｌｙ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ｐｈｅ Ａｌａ Ａｌａ Ａｒｇ Ｇｌｙ Ａｌａ Ａｓｐ Ｐｈｅ Ｇｌｎ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ｖａｌ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ａｌａ Ａｌａ Ｖａｌ Ａｌａ Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｇｌｎ Ｌｅｕ Ｍｅｔ Ｃｙｓ Ｔｈｒ Ａｌａ Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｖａｌ Ｇｌｎ Ｇｌｙ Ｈｉｓ Ｔｒｐ Ａｌａ Ａｒｇ Ｇｌｕ Ａｌａ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｔｒｐ Ａｓｐ Ｃｙｓ Ｓｅｒ Ｖａｌ Ｇｌｕ Ａｓｎ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｃｙｓ Ｇｌｕ Ｈｉｓ Ａｌａ Ｃｙｓ Ａｓｎ Ａｌａ Ｉｌｅ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｐｒｏ Ａｒｇ Ｃｙｓ Ｇｌｎ Ｃｙｓ Ｐｒｏ Ａｌａ Ｇｌｙ Ａｌａ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｇｌｎ Ａｌａ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ａｒｇ Ｓｅｒ Ｃｙｓ Ｔｈｒ Ａｌａ Ｓｅｒ Ａｌａ Ｔｈｒ Ｇｌｎ Ｓｅｒ Ｃｙｓ Ａｓｎ Ａｓｐ Ｌｅｕ Ｃｙｓ Ｇｌｕ Ｈｉｓ Ｐｈｅ Ｃｙｓ Ｖａｌ Ｐｒｏ Ａｓｎ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ｇｌｎ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｔｙｒ Ｓｅｒ Ｃｙｓ Ｍｅｔ Ｃｙｓ Ｇｌｕ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ｔｙｒ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ａｌａ Ａｌａ Ａｓｐ Ｇｌｎ Ｈｉｓ Ａｒｇ Ｃｙｓ Ｇｌｕ Ａｓｐ Ｖａｌ Ａｓｐ Ａｓｐ Ｃｙｓ Ｉｌｅ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ｐｒｏ Ｃｙｓ Ｐｒｏ Ｇｌｎ Ａｒｇ Ｃｙｓ Ｖａｌ Ａｓｎ Ｔｈｒ Ｇｌｎ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｐｈｅ Ｇｌｕ Ｃｙｓ Ｈｉｓ Ｃｙｓ Ｔｙｒ Ｐｒｏ Ａｓｎ Ｔｙｒ Ａｓｐ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ｃｙｓ 及び Ａｓｐ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｖａｌ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ａｓｐ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ａｌａ Ｖａｌ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｈｉｓ Ｓｅｒ Ｇｌｙ が結合してなるペプチド（即ち、配列番号３の１−４９
８のアミノ酸配列）。

【００２６】（５）配列番号１４の１−４６２のアミノ
酸配列からなるペプチド。 Ala Pro Ala Glu Pro Gln Pro Gly Gly Ser Gln Cys Val Glu His Asp Cys Phe Ala Leu Tyr Pro Gly Pro Ala Thr Phe Leu Asn Ala Ser Gln Ile Cys Asp Gly Leu Arg Gly His Leu Met Thr Val Arg Ser Ser Val Ala Ala Asp Val Ile Ser Leu Leu Leu Asn Gly Asp Gly Gly Val Gly Arg Arg Arg Leu Trp Ile Gly Leu Gln Leu Pro Pro Gly Cys Gly Asp Pro Lys Arg Leu Gly Pro Leu Arg Gly Phe Gln Trp Val Thr Gly Asp Asn Asn Thr Ser Tyr Ser Arg Trp Ala Arg Leu Asp Leu Asn Gly Ala Pro Leu Cys Gly Pro Leu Cys Val Ala Val Ser Ala Ala Glu Ala Thr Val Pro Ser Glu Pro Ile Trp Glu Glu Gln Gln Cys Glu Val Lys Ala Asp Gly Phe Leu Cys Glu Phe His Phe Pro Ala Thr Cys Arg Pro Leu Ala Val Glu Pro Gly Ala Ala Ala Ala Ala Val Ser Ile Thr Tyr Gly Thr Pro Phe Ala Ala Arg Gly Ala Asp Phe Gln Ala Leu Pro Val Gly Ser Ser Ala Ala Val Ala Pro Leu Gly Leu Gln Leu Met Cys Thr Ala Pro Pro Gly Ala Val Gln Gly His Trp Ala Arg Glu Ala Pro Gly Ala Trp Asp Cys Ser Val Glu Asn Gly Gly Cys Glu His Ala Cys Asn Ala Ile Pro Gly Ala Pro Arg Cys Gln Cys Pro Ala Gly Ala Ala Leu Gln Ala Asp Gly Arg Ser Cys Thr Ala Ser Ala Thr Gln Ser Cys Asn Asp Leu Cys Glu His Phe Cys Val Pro Asn Pro Asp Gln Pro Gly Ser Tyr Ser Cys Met Cys Glu Thr Gly Tyr Arg Leu Ala Ala Asp Gln His Arg Cys Glu Asp Val Asp Asp Cys Ile Leu Glu Pro Ser Pro Cys Pro Gln Arg Cys Val Asn Thr Gln Gly Gly Phe Glu Cys His Cys Tyr Pro Asn Tyr Asp Leu Val Asp Gly Glu Cys Val Glu Pro Val Asp Pro Cys Phe Arg Ala Asn Cys Glu Tyr Gln Cys Gln Pro Leu Asn Gln Thr Ser Tyr Leu Cys Val Cys Ala Glu Gly Phe Ala Pro Ile Pro His Glu Pro His Arg Cys Gln Met Phe Cys Asn Gln Thr Ala Cys Pro Ala Asp Cys Asp Pro Asn Thr Gln Ala Ser Cys Glu Cys Pro Glu Gly Tyr Ile Leu Asp Asp Gly Phe Ile Cys Thr Asp Ile Asp Glu Cys Glu Asn Gly Gly Phe Cys Ser Gly Val Cys His Asn Leu Pro Gly Thr Phe Glu Cys Ile Cys Gly Pro Asp Ser Ala Leu Val Arg His Ile Gly Thr Asp Cys

【００２７】本発明のペプチドはＮ末端アミノ酸残基と
してアミノ酸メチオニンを含有していてもよい。本発明
のペプチドはまた、Ｎ末端アミノ酸配列として例えば次
式：Ｍｅｔ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ｖａｌ
Ｌｅｕ Ｇｌｙ ＡｌａＬｅｕ Ａｌａ Ｌｅｕ Ａ
ｌａ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｐｈｅ Ｐｒｏで表さ
れるアミノ酸配列を有するリーダー配列、またはその一
部を含有していてもよい。

【００２８】自然の変異によりまたは人工の変異によ
り、ペプチドの活性および可溶性に重大な変化を与える
ことなく、ペプチドの構造の一部を変化させることが可
能である。本発明のペプチドは、トロンビンい結合し、
トロンビンによるプロテインＣの活性化を促進する作用
を有する限り、前記アミノ酸配列を有するペプチドの相
同変異体（Ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｖａｒｉａｎｔ）に
想到する構造を有するペプチドも包含する。置換、挿入
または欠失については、特に好ましくは１個もしくは数
個が例示されるが、特に限定されることはなく、本発明
の実施例に示される通りに解釈されるものである。本発
明のペプチドは少なくとも１個の糖残基を含有していて
もよいし、含有していなくてもよい。即ち、本発明では
少なくともアミノ酸配列として、本明細書に説明された
配列であることを示すものであって、特に糖残基により
限定されるものではない。

【００２９】本発明のペプチドを製造するに当たって
は、例えば、以下の方法により遺伝子操作技術を用いる
ことが好ましい。この遺伝子操作技術に用いるヒト由来
の遺伝子としては、例えば本発明の図４０に示される制
限酵素地図のＤＮＡ等の遺伝子を出発原料として、本明
細書に開示されるトロンビンに結合し、トロンビンによ
るプロテインＣの活性化を促進する作用を有し、好まし
くは配列番号７の１−５７５のアミノ酸配列の部分配列
からなる、またさらに好ましくは界面活性剤の非存在下
で可溶性であるペプチドである、ペプチドをコードする
遺伝子へと、通常の遺伝子操作技術で変更すれば良いも
のであり、例えば、本明細書で開示された種々のペプチ
ドをコードする遺伝子を用いればよい。

【００３０】本発明における好ましい遺伝子を例示すれ
ば、以下の例が挙げられる。例えば、次式（II）（即
ち、配列番号４の１−３５４の塩基配列）： ＧＴＧＧＡＧＣＣＣＧ ＴＧＧＡＣＣＣＧＴＧ ＣＴＴＣＡＧＡＧＣＣ ＡＡＣＴＧＣＧＡＧＴ ＡＣＣＡＧＴＧＣＣＡ ＧＣＣＣＣＴＧＡＡＣ ＣＡＡＡＣＴＡＧＣＴ ＡＣＣＴＣＴＧＣＧＴ ＣＴＧＣＧＣＣＧＡＧ ＧＧＣＴＴＣＧＣＧＣ ＣＣＡＴＴＣＣＣＣＡ ＣＧＡＧＣＣＧＣＡＣ ＡＧＧＴＧＣＣＡＧＡ ＴＧＴＴＴＴＧＣＡＡ ＣＣＡＧＡＣＴＧＣＣ ＴＧＴＣＣＡＧＣＣＧ ＡＣＴＧＣＧＡＣＣＣ ＣＡＡＣＡＣＣＣＡＧ ＧＣＴＡＧＣＴＧＴＧ ＡＧＴＧＣＣＣＴＧＡ ＡＧＧＣＴＡＣＡＴＣ ＣＴＧＧＡＣＧＡＣＧ ＧＴＴＴＣＡＴＣＴＧ ＣＡＣＧＧＡＣＡＴＣ ＧＡＣＧＡＧＴＧＣＧ ＡＡＡＡＣＧＧＣＧＧ ＣＴＴＣＴＧＣＴＣＣ ＧＧＧＧＴＧＴＧＣＣ ＡＣＡＡＣＣＴＣＣＣ ＣＧＧＴＡＣＣＴＴＣ ＧＡＧＴＧＣＡＴＣＴ ＧＣＧＧＧＣＣＣＧＡ ＣＴＣＧＧＣＣＣＴＴ ＧＴＣＣＧＣＣＡＣＡ ＴＴＧＧＣＡＣＣＧＡ ＣＴＧＴ で表される塩基配列を含有するＤＮＡである。

【００３１】遺伝暗号の縮重に従い、遺伝子から生産さ
れるポリペプチドのアミノ酸配列を変えることなくその
遺伝子の塩基配列の少なくとも１つの塩基を他の種類の
塩基に置換することができる。従って、本発明のＤＮＡ
はまた、遺伝略号の縮重に基づく置換によって変化され
た塩基配列を含有することも可能である。この場合、上
記置換により得られた塩基配列から演繹されるアミノ酸
配列は前に定義したアミノ酸配列と一致する。

【００３２】本発明のＤＮＡは前記式（II）で表される
塩基配列と、その５′末端および／または３′末端に結
合した少なくとも１種の他の塩基配列とを含有していて
もよい。式（II）で表される塩基配列と少なくとも１種
の他の塩基配列とを含有するＤＮＡの例としては下記の
ＤＮＡ（１）〜（５）が挙げられる（但し、配列番号５
の１−１４９４の塩基配列は参考のため提示する）。

【００３３】（１）上記式（II）で表されるＤＮＡ（即
ち、配列番号４の１−３５４の塩基配列）。 （２）式（II）で表される塩基配列とその５′末端に結
合した次式： ＴＧＣＡＧＣＧＴＧＧ ＡＧＡＡＣＧＧＣＧＧ ＣＴＧＣＧＡＧＣＡＣ ＧＣＧＴＧＣＡＡＴＧ ＣＧＡＴＣＣＣＴＧＧ ＧＧＣＴＣＣＣＣＧＣ ＴＧＣＣＡＧＴＧＣＣ ＣＡＧＣＣＧＧＣＧＣ ＣＧＣＣＣＴＧＣＡＧ ＧＣＡＧＡＣＧＧＧＣ ＧＣＴＣＣＴＧＣＡＣ ＣＧＣＡＴＣＣＧＣＧ ＡＣＧＣＡＧＴＣＣＴ ＧＣＡＡＣＧＡＣＣＴ ＣＴＧＣＧＡＧＣＡＣ ＴＴＣＴＧＣＧＴＴＣ ＣＣＡＡＣＣＣＣＧＡ ＣＣＡＧＣＣＧＧＧＣ ＴＣＣＴＡＣＴＣＧＴ ＧＣＡＴＧＴＧＣＧＡ ＧＡＣＣＧＧＣＴＡＣ ＣＧＧＣＴＧＧＣＧＧ ＣＣＧＡＣＣＡＡＣＡ ＣＣＧＧＴＧＣＧＡＧ ＧＡＣＧＴＧＧＡＴＧ ＡＣＴＧＣＡＴＡＣＴ ＧＧＡＧＣＣＣＡＧＴ ＣＣＧＴＧＴＣＣＧＣ ＡＧＣＧＣＴＧＴＧＴ ＣＡＡＣＡＣＡＣＡＧ ＧＧＴＧＧＣＴＴＣＧ ＡＧＴＧＣＣＡＣＴＧ ＣＴＡＣＣＣＴＡＡＣ ＴＡＣＧＡＣＣＴＧＧ ＴＧＧＡＣＧＧＣＧＡ ＧＴＧＴ で表される塩基配列が結合してなるＤＮＡ（即ち、配列
番号９の１−７０８の塩基配列）。

【００３４】（３）式（II）で表される塩基配列の５′
末端および３′末端に夫々次式： ＴＧＣＡＧＣＧＴＧＧ ＡＧＡＡＣＧＧＣＧＧ ＣＴＧＣＧＡＧＣＡＣ ＧＣＧＴＧＣＡＡＴＧ ＣＧＡＴＣＣＣＴＧＧ ＧＧＣＴＣＣＣＣＧＣ ＴＧＣＣＡＧＴＧＣＣ ＣＡＧＣＣＧＧＣＧＣ ＣＧＣＣＣＴＧＣＡＧ ＧＣＡＧＡＣＧＧＧＣ ＧＣＴＣＣＴＧＣＡＣ ＣＧＣＡＴＣＣＧＣＧ ＡＣＧＣＡＧＴＣＣＴ ＧＣＡＡＣＧＡＣＣＴ ＣＴＧＣＧＡＧＣＡＣ ＴＴＣＴＧＣＧＴＴＣ ＣＣＡＡＣＣＣＣＧＡ ＣＣＡＧＣＣＧＧＧＣ ＴＣＣＴＡＣＴＣＧＴ ＧＣＡＴＧＴＧＣＧＡ ＧＡＣＣＧＧＣＴＡＣ ＣＧＧＣＴＧＧＣＧＧ ＣＣＧＡＣＣＡＡＣＡ ＣＣＧＧＴＧＣＧＡＧ ＧＡＣＧＴＧＧＡＴＧ ＡＣＴＧＣＡＴＡＣＴ ＧＧＡＧＣＣＣＡＧＴ ＣＣＧＴＧＴＣＣＧＣ ＡＧＣＧＣＴＧＴＧＴ ＣＡＡＣＡＣＡＣＡＧ ＧＧＴＧＧＣＴＴＣＧ ＡＧＴＧＣＣＡＣＴＧ ＣＴＡＣＣＣＴＡＡＣ ＴＡＣＧＡＣＣＴＧＧ ＴＧＧＡＣＧＧＣＧＡ ＧＴＧＴ 及び ＧＡＣＴＣＣＧＧＣＡ ＡＧＧＴＧＧＡＣＧＧ ＴＧＧＣＧＡＣＡＧＣ ＧＧＣＴＣＴＧＧＣＧ ＡＧＣＣＣＣＣＧＣＣ ＣＡＧＣＣＣＧＡＣＧ ＣＣＣＧＧＣＴＣＣＡ ＣＣＴＴＧＡＣＴＣＣ ＴＣＣＧＧＣＣＧＴＧ ＧＧＧＣＴＣＧＴＧＣ ＡＴＴＣＧＧＧＣ で表される塩基配列が結合してなるＤＮＡ（即ち、配列
番号１１の１−８１６の塩基配列）。

【００３５】（４）式（II）で表される塩基配列の５′
末端および３′末端に夫々次式： ＧＣＡＣＣＣＧＣＡＧ ＡＧＣＣＧＣＡＧＣＣ ＧＧＧＴＧＧＣＡＧＣ ＣＡＧＴＧＣＧＴＣＧ ＡＧＣＡＣＧＡＣＴＧ ＣＴＴＣＧＣＧＣＴＣ ＴＡＣＣＣＧＧＧＣＣ ＣＣＧＣＧＡＣＣＴＴ ＣＣＴＣＡＡＴＧＣＣ ＡＧＴＣＡＧＡＴＣＴ ＧＣＧＡＣＧＧＡＣＴ ＧＣＧＧＧＧＣＣＡＣ ＣＴＡＡＴＧＡＣＡＧ ＴＧＣＧＣＴＣＣＴＣ ＧＧＴＧＧＣＴＧＣＣ ＧＡＴＧＴＣＡＴＴＴ ＣＣＴＴＧＣＴＡＣＴ ＧＡＡＣＧＧＣＧＡＣ ＧＧＣＧＧＣＧＴＴＧ ＧＣＣＧＣＣＧＧＣＧ ＣＣＴＣＴＧＧＡＴＣ ＧＧＣＣＴＧＣＡＧＣ ＴＧＣＣＡＣＣＣＧＧ ＣＴＧＣＧＧＣＧＡＣ ＣＣＣＡＡＧＣＧＣＣ ＴＣＧＧＧＣＣＣＣＴ ＧＣＧＣＧＧＣＴＴＣ ＣＡＧＴＧＧＧＴＴＡ ＣＧＧＧＡＧＡＣＡＡ ＣＡＡＣＡＣＣＡＧＣ ＴＡＴＡＧＣＡＧＧＴ ＧＧＧＣＡＣＧＧＣＴ ＣＧＡＣＣＴＣＡＡＴ ＧＧＧＧＣＴＣＣＣＣ ＴＣＴＧＣＧＧＣＣＣ ＧＴＴＧＴＧＣＧＴＣ ＧＣＴＧＴＣＴＣＣＧ ＣＴＧＣＴＧＡＧＧＣ ＣＡＣＴＧＴＧＣＣＣ ＡＧＣＧＡＧＣＣＧＡ ＴＣＴＧＧＧＡＧＧＡ ＧＣＡＧＣＡＧＴＧＣ ＧＡＡＧＴＧＡＡＧＧ ＣＣＧＡＴＧＧＣＴＴ ＣＣＴＣＴＧＣＧＡＧ ＴＴＣＣＡＣＴＴＣＣ ＣＡＧＣＣＡＣＣＴＧ ＣＡＧＧＣＣＡＣＴＧ ＧＣＴＧＴＧＧＡＧＣ ＣＣＧＧＣＧＣＣＧＣ ＧＧＣＴＧＣＣＧＣＣ ＧＴＣＴＣＧＡＴＣＡ ＣＣＴＡＣＧＧＣＡＣ ＣＣＣＧＴＴＣＧＣＧ ＧＣＣＣＧＣＧＧＡＧ ＣＧＧＡＣＴＴＣＣＡ ＧＧＣＧＣＴＧＣＣＧ ＧＴＧＧＧＣＡＧＣＴ ＣＣＧＣＣＧＣＧＧＴ ＧＧＣＴＣＣＣＣＴＣ ＧＧＣＴＴＡＣＡＧＣ ＴＡＡＴＧＴＧＣＡＣ ＣＧＣＧＣＣＧＣＣＣ ＧＧＡＧＣＧＧＴＣＣ ＡＧＧＧＧＣＡＣＴＧ ＧＧＣＣＡＧＧＧＡＧ ＧＣＧＣＣＧＧＧＣＧ ＣＴＴＧＧＧＡＣＴＧ ＣＡＧＣＧＴＧＧＡＧ ＡＡＣＧＧＣＧＧＣＴ ＧＣＧＡＧＣＡＣＧＣ ＧＴＧＣＡＡＴＧＣＧ ＡＴＣＣＣＴＧＧＧＧ ＣＴＣＣＣＣＧＣＴＧ ＣＣＡＧＴＧＣＣＣＡ ＧＣＣＧＧＣＧＣＣＧ ＣＣＣＴＧＣＡＧＧＣ ＡＧＡＣＧＧＧＣＧＣ ＴＣＣＴＧＣＡＣＣＧ ＣＡＴＣＣＧＣＧＡＣ ＧＣＡＧＴＣＣＴＧＣ ＡＡＣＧＡＣＣＴＣＴ ＧＣＧＡＧＣＡＣＴＴ ＣＴＧＣＧＴＴＣＣＣ ＡＡＣＣＣＣＧＡＣＣ ＡＧＣＣＧＧＧＣＴＣ ＣＴＡＣＴＣＧＴＧＣ ＡＴＧＴＧＣＧＡＧＡ ＣＣＧＧＣＴＡＣＣＧ ＧＣＴＧＧＣＧＧＣＣ ＧＡＣＣＡＡＣＡＣＣ ＧＧＴＧＣＧＡＧＧＡ ＣＧＴＧＧＡＴＧＡＣ ＴＧＣＡＴＡＣＴＧＧ ＡＧＣＣＣＡＧＴＣＣ ＧＴＧＴＣＣＧＣＡＧ ＣＧＣＴＧＴＧＴＣＡ ＡＣＡＣＡＣＡＧＧＧ ＴＧＧＣＴＴＣＧＡＧ ＴＧＣＣＡＣＴＧＣＴ ＡＣＣＣＴＡＡＣＴＡ ＣＧＡＣＣＴＧＧＴＧ ＧＡＣＧＧＣＧＡＧＴ ＧＴ 及び ＧＡＣＴＣＣＧＧＣＡ ＡＧＧＴＧＧＡＣＧＧ ＴＧＧＣＧＡＣＡＧＣ ＧＧＣＴＣＴＧＧＣＧ ＡＧＣＣＣＣＣＧＣＣ ＣＡＧＣＣＣＧＡＣＧ ＣＣＣＧＧＣＴＣＣＡ ＣＣＴＴＧＡＣＴＣＣ ＴＣＣＧＧＣＣＧＴＧ ＧＧＧＣＴＣＧＴＧＣ ＡＴＴＣＧＧＧＣ で表される塩基配列が結合してなるＤＮＡ（即ち、配列
番号５の１−１４９４の塩基配列）。

【００３６】（５）配列番号１５の１−１３８６の塩基
配列からなるＤＮＡ。 GCACCCGCAG AGCCGCAGCC GGGTGGCAGC CAGTGCGTCG AGCACGACTG CTTCGCGCTC TACCCGGGCC CCGCGACCTT CCTCAATGCC AGTCAGATCT GCGACGGACT GCGGGGCCAC CTAATGACAG TGCGCTCCTC GGTGGCTGCC GATGTCATTT CCTTGCTACT GAACGGCGAC GGCGGCGTTG GCCGCCGGCG CCTCTGGATC GGCCTGCAGC TGCCACCCGG CTGCGGCGAC CCCAAGCGCC TCGGGCCCCT GCGCGGCTTC CAGTGGGTTA CGGGAGACAA CAACACCAGC TATAGCAGGT GGGCACGGCT CGACCTCAAT GGGGCTCCCC TCTGCGGCCC GTTGTGCGTC GCTGTCTCCG CTGCTGAGGC CACTGTGCCC AGCGAGCCGA TCTGGGAGGA GCAGCAGTGC GAAGTGAAGG CCGATGGCTT CCTCTGCGAG TTCCACTTCC CAGCCACCTG CAGGCCACTG GCTGTGGAGC CCGGCGCCGC GGCTGCCGCC GTCTCGATCA CCTACGGCAC CCCGTTCGCG GCCCGCGGAG CGGACTTCCA GGCGCTGCCG GTGGGCAGCT CCGCCGCGGT GGCTCCCCTC GGCTTACAGC TAATGTGCAC CGCGCCGCCC GGAGCGGTCC AGGGGCACTG GGCCAGGGAG GCGCCGGGCG CTTGGGACTG CAGCGTGGAG AACGGCGGCT GCGAGCACGC GTGCAATGCG ATCCCTGGGG CTCCCCGCTG CCAGTGCCCA GCCGGCGCCG CCCTGCAGGC AGACGGGCGC TCCTGCACCG CATCCGCGAC GCAGTCCTGC AACGACCTCT GCGAGCACTT CTGCGTTCCC AACCCCGACC AGCCGGGCTC CTACTCGTGC ATGTGCGAGA CCGGCTACCG GCTGGCGGCC GACCAACACC GGTGCGAGGA CGTGGATGAC TGCATACTGG AGCCCAGTCC GTGTCCGCAG CGCTGTGTCA ACACACAGGG TGGCTTCGAG TGCCACTGCT ACCCTAACTA CGACCTGGTG GACGGCGAGT GTGTGGAGCC CGTGGACCCG TGCTTCAGAG CCAACTGCGA GTACCAGTGC CAGCCCCTGA ACCAAACTAG CTACCTCTGC GTCTGCGCCG AGGGCTTCGC GCCCATTCCC CACGAGCCGC ACAGGTGCCA GATGTTTTGC AACCAGACTG CCTGTCCAGC CGACTGCGAC CCCAACACCC AGGCTAGCTG TGAGTGCCCT GAAGGCTACA TCCTGGACGA CGGTTTCATC TGCACGGACA TCGACGAGTG CGAAAACGGC GGCTTCTGCT CCGGGGTGTG CCACAACCTC CCCGGTACCT TCGAGTGCAT CTGCGGGCCC GACTCGGCCC TTGTCCGCCA CATTGGCACC GACTGT

【００３７】本発明のＤＮＡは、例えば、以下のように
して得ることができる。 （１）トロンビンのプロテインＣ活性化を促進すること
のできるヒト肺由来のペプチドに特異的な、ウサギから
得られる抗体を用いて、ヒト肺から調製したｃＤＮＡラ
イブラリーからその抗体と結合するペプチドをコードす
るｃＤＮＡ断片を単離し、単離したｃＤＮＡ断片の塩基
配列を分析する。得られたｃＤＮＡ断片はトロンビンの
プロテインＣ活性化を促進することのできるヒト肺由来
のペプチドの一部分をコードしている。その部分はその
ペプチドのＣ末端を含むがＮ末端を含まない。

【００３８】（２）上述のように、得られたｃＤＮＡ断
片はヒト肺由来のペプチドの全アミノ酸配列をコードし
ておらず、そのペプチドのＮ末端アミノ酸配列に対応す
る塩基配列を欠いているので、Ｎ末端アミノ酸配列をコ
ードするｃＤＮＡ断片を上記工程（１）で得られるｃＤ
ＮＡ断片を利用して通常の公知のプライマーエクステン
ション法により以下のようにして得る。 まず、上記工程（１）で得られたｃＤＮＡ断片のコード
するペプチドのＮ末端側のアミノ酸配列に対応するｃＤ
ＮＡ断片の一部分を有機化学合成する。次に、合成した
ＤＮＡをプライマーとして用いて通常の公知のプライマ
ーエクステンション法によりヒトさい帯内皮細胞より調
製したポリ（Ａ）⁺ ＲＮＡから上記工程（１）で得られ
るｃＤＮＡ断片の５′末端の上流の塩基配列を有するｃ
ＤＮＡ断片を得る。上記プライマーエクステンションを
繰り返すことによりヒト肺由来のペプチドのＮ末端アミ
ノ酸配列をコードするｃＤＮＡ断片を得る。

【００３９】（３）次に、前記工程（１）及び（２）で
得られたｃＤＮＡ断片を適宜結合することにより、開始
コドンから始まる１７２５塩基対（以下“ｂｐ”と略す
る）のオープンリーディングフレームを含有するｃＤＮ
Ａ（以下“ｃＤＮＡ−Ａ”と略する）を得る。このオー
プンリーディングフレームの塩基配列は、配列番号１０
の１−１７２５の塩基配列である。またリーダー配列を
コードする塩基配列を除外し、ヒト肺由来のペプチドの
Ｎ末端アミノ酸配列からの塩基配列とすれば、配列番号
１２の１−１６７１の塩基配列となる。

【００４０】このｃＤＮＡ−Ａから、前述のＤＮＡ
（１）〜（５）の塩基配列と実質的に同等の塩基配列を
有するｃＤＮＡは、以下の部分を位置特異的変異法で削
除することによって得らることができる。 （ｉ）ＤＮＡ（４）の塩基配列と実質的に同等の塩基配
列を含有するｃＤＮＡを調製するに当たっては、削除す
る部分としては、前記のオープンリーディングフレーム
における開始コドンの最初の塩基から数えて１５４９番
目から１７２５番目の塩基までの部分である。 （ii）ＤＮＡ（５）の塩基配列と実質的に同等の塩基配
列を含有するｃＤＮＡを調製するに当たっては、削除す
る部分としては、前記のオープンリーディングフレーム
における開始コドンの最初の塩基から数えて１４４１番
目から１７２５番目の塩基までの部分である。 (iii)ＤＮＡ（３）の塩基配列と実質的に同等の塩基配
列を含有するｃＤＮＡを調製するに当たっては、削除す
る部分としては、前記のオープンリーディングフレーム
における開始コドンの最初の塩基から数えて５５番目か
ら７３２番目および１５４９番目から１７２５番目の塩
基までの部分である。

【００４１】(iv) ＤＮＡ（２）の塩基配列と実質的に
同等の塩基配列を含有するｃＤＮＡを調製するに当たっ
ては、削除する部分としては、前記のオープンリーディ
ングフレームにおける開始コドンの最初の塩基から数え
て５５番目から７３２番目および１４４１番目から１７
２５番目の塩基までの部分である。 (ｖ) ＤＮＡ（１）の塩基配列と実質的に同等の塩基配
列を含有するｃＤＮＡを調製するに当たっては、削除す
る部分としては、前記のオープンリーディングフレーム
における開始コドンの最初の塩基から数えて５５番目か
ら１０８６番目および１４４１番目から１７２５番目の
塩基までの部分である。 このようにして得られた各ｃＤＮＡの塩基配列は公知の
方法で分析して、ＤＮＡ（１）〜（５）の塩基配列とそ
れぞれ一致することを確認する。

【００４２】上記の本発明のＤＮＡは有機化学合成する
ことによっても得ることができる。また、本発明のＤＮ
Ａは前述のプライマーエクステンションを行うことな
く、前駆体ＤＮＡから調製することもできる。前駆体Ｄ
ＮＡは、前記工程（１）で得られるＤＮＡ断片またはそ
のＤＮＡ断片の塩基配列に基づいて調製した合成ＤＮＡ
をプローブとして用いる通常のハイブリダイゼーション
法によってヒト染色体ＤＮＡライブラリーから得ること
ができる。

【００４３】前述の如く、式（II）の塩基配列を含有す
る本発明のＤＮＡは次式： Ｍｅｔ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｌｅｕ Ａｌａ Ｌｅｕ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｐｈｅ Ｐｒｏ で表されるようなリーダー配列をコードする塩基配列を
５′末端塩基配列として含有していてもよく、通常細胞
等での発現においてこのリーダー配列の全部又は一部は
削除され得る。本発明によれば、上記ＤＮＡと相補的な
ＤＮＡもまた提供される。本発明によれば、上記ＤＮＡ
とそれに相補的なＤＮＡが互いに相補的に結合して２重
鎖ＤＮＡを形成していてもよい。本発明のＤＮＡは前述
のすべてのペプチドの相同変異体に相当する構造を有す
るペプチドをコードする塩基配列を含有することも可能
である。

【００４４】遺伝暗号の縮重に従い、遺伝子から生産さ
れるポリペプチドのアミノ酸配列を変えることなくその
遺伝子の塩基配列の少なくとも１つの塩基を他の種類の
塩基に置換することができる。従って、本発明のＤＮＡ
はまた、遺伝略号の縮重に基づく置換によって変化され
た塩基配列を含有することも可能である。この場合、上
記置換により得られた塩基配列から演繹されるアミノ酸
配列は前に定義したアミノ酸配列と一致する。すなわ
ち、本発明は前述の種々のペプチドのアミノ酸配列をコ
ードするＤＮＡまたはその相補的ＤＮＡである。

【００４５】更にまた、本発明によれば、前記の本発明
のＤＮＡと複製可能な発現ベクターとからなる複製可能
な組換え体ＤＮＡが提供される。該組換え体ＤＮＡは、
それによって形質転換された微生物または細胞中で、本
発明のペプチドを発現することができる。適したベクタ
ーの例としては、プラスミドｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２
７、ＹＲｐ７、ｐＳＶ２−ｄｈｆｒ（ＡＴＣＣ ３７１
４６）、ｐＢＰＶ−１（９−１）（ＡＴＣＣ ３７１１
１）などが挙げられる。尚、発現ベクターは宿主として
使用する微生物または細胞に適したものを選択する必要
がある。

【００４６】更に本発明はまた、上述の複製可能な組換
え体ＤＮＡで形質転換された微生物または細胞に関す
る。微生物の例としては、エシェリヒア コリ（Ｅｓｃ
ｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）の菌株、例えばイー コ
リ（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１２株２９４（ＡＴＣＣ ３１４
４６）、イー コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｂ、イー コリ
（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｘ１７７６（ＡＴＣＣ ３１５３
７）、イー コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｃ６００およびイー
コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｃ６００ｈｆｌ並びにイー コ
リ（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｗ３１１０（Ｆ−、λ−、プロトト
ロフィック、ＡＴＣＣ２７３７５）；バチラス サブチ
リス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）の如きバ
チラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属の菌株；サルモネラ チ
フィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕ
ｒｉｕｍ）またはセラチア マーセサンス（Ｓｅｒｒａ
ｔｉａ ｍａｒｃｅｓａｎｓ）等の大腸菌以外の腸内
菌；シュードモーナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属の
種々の菌株；およびサッカロミセスセレビシエ（Ｓａｃ
ｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）などが
挙げられる。細胞の例としては、ＶＥＲＯ（ＡＴＣＣ
ＣＣＬ−８１）細胞、ＨｅＬａ細胞、チャイニーズハム
スター卵巣（ＣＨＯ）細胞株、ＷＩ３８、ＢＨＫ、ＣＯ
Ｓ−７およびＭＤＣＫ細胞株等の動物細胞が挙げられ
る。

【００４７】本発明のぺプチドは、前述の通り、０．１
５Ｍ食塩、２．５ｍＭ塩化カルシウム、１ｍｇ／ｍｌ血
清アルブミンを含有するｐＨ７．４の２０ｍＭトリス塩
酸緩衝液中に検知され得る濃度で可溶性であることは好
ましい。しかしながら、本発明の組換えペプチドにおい
ては、可溶性でないものも包含してもよい。ただし、可
溶性ペプチドが、ＤＩＰ−トロンビン−アガロースカラ
ムに結合せしめたときに、１Ｍ ＮａＣｌ、０．１ｍＭ
ＥＤＴＡ、１ｍＭ ベンズアミジン塩酸、０．５％
（ｖ／ｖ）ポリドカノール（Ｐｏｌｉｄｏｃａｎｏｌ；
商品名Ｌｕｂｒｏｌ ＰＸ）を含む０．０２Ｍトリス塩
酸緩衝液（ｐＨ７．５）により溶出できる性質、又は、
該可溶性ペプチドが、０．１Ｍ ＮａＣｌ、０．５ｍＭ
ＣａＣｌ₂ 、０．５％（ｖ／ｖ）ポリドカノール（Ｐ
ｏｌｉｄｏｃａｎｏｌ；商品名Ｌｕｂｒｏｌ ＰＸ）を
含む０．０２Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）により
平衡化したＤＩＰ−トロンビン−アガロースカラムに、
該緩衝液にて該可溶性ペプチドを溶解せしめた溶液を接
触せしめた場合に、該可溶性ペプチドが前記カラムに結
合せしめることができる性質を有することが好ましい。

【００４８】例えば前述の配列番号７の１−５７５のア
ミノ酸配列をコードする遺伝子の場合を例にとると、生
体内では、血管内皮細胞膜上に次式の一次構造（即ち、
配列番号１３の１−５５７のアミノ酸配列）で発現され
る。 Ａｌａ Ｐｒｏ Ａｌａ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｇｌｎ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｇｌｎ Ｃｙｓ Ｖａｌ Ｇｌｕ Ｈｉｓ Ａｓｐ Ｃｙｓ Ｐｈｅ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｔｙｒ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ａｌａ Ｔｈｒ Ｐｈｅ Ｌｅｕ Ａｓｎ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｇｌｎ Ｉｌｅ Ｃｙｓ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ｇｌｙ Ｈｉｓ Ｌｅｕ Ｍｅｔ Ｔｈｒ Ｖａｌ Ａｒｇ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｖａｌ Ａｌａ Ａｌａ Ａｓｐ Ｖａｌ Ｉｌｅ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ａｓｎ Ｇｌｙ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｇｌｙ Ａｒｇ Ａｒｇ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ｔｒｐ Ｉｌｅ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｇｌｎ Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｃｙｓ Ｇｌｙ Ａｓｐ Ｐｒｏ Ｌｙｓ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ｇｌｙ Ｐｈｅ Ｇｌｎ Ｔｒｐ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ａｓｐ Ａｓｎ Ａｓｎ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ｔｙｒ Ｓｅｒ Ａｒｇ Ｔｒｐ Ａｌａ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ａｓｐ Ｌｅｕ Ａｓｎ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ｃｙｓ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ｃｙｓ Ｖａｌ Ａｌａ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ａｌａ Ａｌａ Ｇｌｕ Ａｌａ Ｔｈｒ Ｖａｌ Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｉｌｅ Ｔｒｐ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｇｌｎ Ｇｌｎ Ｃｙｓ Ｇｌｕ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ａｌａ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｐｈｅ Ｌｅｕ Ｃｙｓ Ｇｌｕ Ｐｈｅ Ｈｉｓ Ｐｈｅ Ｐｒｏ Ａｌａ Ｔｈｒ Ｃｙｓ Ａｒｇ Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ａｌａ Ｖａｌ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ａｌａ Ａｌａ Ａｌａ Ａｌａ Ａｌａ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｉｌｅ Ｔｈｒ Ｔｙｒ Ｇｌｙ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ｐｈｅ Ａｌａ Ａｌａ Ａｒｇ Ｇｌｙ Ａｌａ Ａｓｐ Ｐｈｅ Ｇｌｎ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ｖａｌ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ａｌａ Ａｌａ Ｖａｌ Ａｌａ Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｇｌｎ Ｌｅｕ Ｍｅｔ Ｃｙｓ Ｔｈｒ Ａｌａ Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｖａｌ Ｇｌｎ Ｇｌｙ Ｈｉｓ Ｔｒｐ Ａｌａ Ａｒｇ Ｇｌｕ Ａｌａ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｔｒｐ Ａｓｐ Ｃｙｓ Ｓｅｒ Ｖａｌ Ｇｌｕ Ａｓｎ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｃｙｓ Ｇｌｕ Ｈｉｓ Ａｌａ Ｃｙｓ Ａｓｎ Ａｌａ Ｉｌｅ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｐｒｏ Ａｒｇ Ｃｙｓ Ｇｌｎ Ｃｙｓ Ｐｒｏ Ａｌａ Ｇｌｙ Ａｌａ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｇｌｎ Ａｌａ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ａｒｇ Ｓｅｒ Ｃｙｓ Ｔｈｒ Ａｌａ Ｓｅｒ Ａｌａ Ｔｈｒ Ｇｌｎ Ｓｅｒ Ｃｙｓ Ａｓｎ Ａｓｐ Ｌｅｕ Ｃｙｓ Ｇｌｕ Ｈｉｓ Ｐｈｅ Ｃｙｓ Ｖａｌ Ｐｒｏ Ａｓｎ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ｇｌｎ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｔｙｒ Ｓｅｒ Ｃｙｓ Ｍｅｔ Ｃｙｓ Ｇｌｕ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ｔｙｒ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ａｌａ Ａｌａ Ａｓｐ Ｇｌｎ Ｈｉｓ Ａｒｇ Ｃｙｓ Ｇｌｕ Ａｓｐ Ｖａｌ Ａｓｐ Ａｓｐ Ｃｙｓ Ｉｌｅ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ｐｒｏ Ｃｙｓ Ｐｒｏ Ｇｌｎ Ａｒｇ Ｃｙｓ Ｖａｌ Ａｓｎ Ｔｈｒ Ｇｌｎ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｐｈｅ Ｇｌｕ Ｃｙｓ Ｈｉｓ Ｃｙｓ Ｔｙｒ Ｐｒｏ Ａｓｎ Ｔｙｒ Ａｓｐ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ｃｙｓ Ｖａｌ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｖａｌ Ａｓｐ Ｐｒｏ Ｃｙｓ Ｐｈｅ Ａｒｇ Ａｌａ Ａｓｎ Ｃｙｓ Ｇｌｕ Ｔｙｒ Ｇｌｎ Ｃｙｓ Ｇｌｎ Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ａｓｎ Ｇｌｎ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ｔｙｒ Ｌｅｕ Ｃｙｓ Ｖａｌ Ｃｙｓ Ａｌａ Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ｐｈｅ Ａｌａ Ｐｒｏ Ｉｌｅ Ｐｒｏ Ｈｉｓ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｈｉｓ Ａｒｇ Ｃｙｓ Ｇｌｎ Ｍｅｔ Ｐｈｅ Ｃｙｓ Ａｓｎ Ｇｌｎ Ｔｈｒ Ａｌａ Ｃｙｓ Ｐｒｏ Ａｌａ Ａｓｐ Ｃｙｓ Ａｓｐ Ｐｒｏ Ａｓｎ Ｔｈｒ Ｇｌｎ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｃｙｓ Ｇｌｕ Ｃｙｓ Ｐｒｏ Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ｔｙｒ Ｉｌｅ Ｌｅｕ Ａｓｐ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｐｈｅ Ｉｌｅ Ｃｙｓ Ｔｈｒ Ａｓｐ Ｉｌｅ Ａｓｐ Ｇｌｕ Ｃｙｓ Ｇｌｕ Ａｓｎ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｐｈｅ Ｃｙｓ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｃｙｓ Ｈｉｓ Ａｓｎ Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｔｈｒ Ｐｈｅ Ｇｌｕ Ｃｙｓ Ｉｌｅ Ｃｙｓ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ｓｅｒ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ａｒｇ Ｈｉｓ Ｉｌｅ Ｇｌｙ Ｔｈｒ Ａｓｐ Ｃｙｓ Ａｓｐ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｖａｌ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ａｓｐ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ａｌａ Ｖａｌ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｈｉｓ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｉｌｅ Ｇｌｙ Ｉｌｅ Ｓｅｒ Ｉｌｅ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｃｙｓ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｖａｌ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｃｙｓ Ｈｉｓ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ｇｌｎ Ｇｌｙ Ａｌａ Ａｌａ Ａｒｇ Ａｌａ Ｌｙｓ Ｍｅｔ Ｇｌｕ Ｔｙｒ Ｌｙｓ Ｃｙｓ Ａｌａ Ａｌａ Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ｌｙｓ Ｇｌｕ Ｖａｌ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ｇｌｎ Ｈｉｓ Ｖａｌ Ａｒｇ Ｔｈｒ Ｇｌｕ Ａｒｇ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ｇｌｎ Ａｒｇ Ｌｅｕ

【００４９】また上記遺伝子をＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞
またはＣ₁₂₇ 細胞で遺伝子工学的に発現させた場合も、
同様にそれら細胞膜上に発現・濃縮され、培養液中には
活性が検知されないので、トリトンＸ−１００等の界面
活性剤の存在下調製する。しかし、該ペプチドのアミノ
酸配列のＣ末端から５９番目以降の配列 Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｉｌｅ Ｇｌｙ Ｉｌｅ Ｓｅｒ Ｉｌｅ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｃｙｓ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｖａｌ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｃｙｓ Ｈｉｓ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ｇｌｎ Ｇｌｙ Ａｌａ Ａｌａ Ａｒｇ Ａｌａ Ｌｙｓ Ｍｅｔ Ｇｌｕ Ｔｙｒ Ｌｙｓ Ｃｙｓ Ａｌａ Ａｌａ Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ｌｙｓ Ｇｌｕ Ｖａｌ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ｇｌｎ Ｈｉｓ Ｖａｌ Ａｒｇ Ｔｈｒ Ｇｌｕ Ａｒｇ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ｇｌｎ Ａｒｇ Ｌｅｕ を除くことにより、分泌され得る形態で培養液中に可溶
物として検知・回収できる。

【００５０】本発明のペプチドを製造する方法は、例え
ば以下の方法が好ましい例として挙げられるが、他の方
法によることも本発明が達成される限り特に限定されな
い。 （ａ）前述のペプチドをコードするＤＮＡと複製可能な
発現ベクターに連結して、該ＤＮＡと該複製可能な発現
ベクターとからなる複製可能な組換え体ＤＮＡを得、 （ｂ）該複製可能な組換え体ＤＮＡで微生物または細胞
を形質転換させて形質転換体を形成せしめ、 （ｃ）該形質転換体を該微生物または細胞の親細胞から
選別し、 （ｄ）該形質転換体を培養して、該形質転換体に該ＤＮ
Ａを発現させて該ペプチドを産生せしめ、そして （ｅ）該ペプチドを培養した形質転換体から単離する

【００５１】本発明の方法によれば、前述の本発明のＤ
ＮＡが正しく転写し、それによって得られるｍＲＮＡか
らの翻訳が正しく行われるように本発明のＤＮＡを複製
可能な発現ベクターのプロモーターなどのＤＮＡ領域の
下流に組入れて該ＤＮＡを有する複製可能な組換え体Ｄ
ＮＡを得、得られた該組換え体ＤＮＡで微生物または細
胞を形質転換させて該組換え体ＤＮＡを含有する形質転
換体を得る。得られた形質転換体は、該組み換え体ＤＮ
Ａに与えられた表現型によって微生物または培養細胞の
親細胞から単離される。得られた形質転換体を培養して
前記ＤＮＡの有する遺伝情報を発現させて本発明のペプ
チドを製造する。

【００５２】トロンビンに結合し、トロンビンによるプ
ロテインＣの活性化を促進する作用を有するペプチドに
関して、従来、アミノ酸配列等の解明が不可能であっ
て、遺伝子操作により製造されたことはなく、したがっ
て、ヒト由来の夾雑成分を含有しない実質的に精製され
た組換えペプチドとしては、天然型の１つの具体例であ
る配列番号１３の１−５５７のアミノ酸配列からなるペ
プチドも含めて従来知られていないものであって、本発
明の開示するところによって、初めて遺伝子操作により
製造された実質的に他のヒト由来の成分を含有しない精
製されたペプチドが取得し得たものである。本発明の開
示によって初めて医薬として安定的に大量に提供される
ことができるものとなったことが注目される。なお、天
然型のペプチド等の界面活性剤の非存在下で、可溶性で
ないペプチドを医薬組成物となす場合には適当量の界面
活性剤を存在させればよい。

【００５３】尚、本発明のＤＮＡ及び組換え体ＤＮＡを
構築するために必要なＤＮＡ配列、例えばプロモーター
や複製起源等をクローニングするためには原核細胞を宿
主として用いる宿主−ベクター系を使用するのが好まし
い。原核細胞の例としては、エシェリヒア コリ（Ｅｓ
ｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）の菌株、例えばイーコ
リ（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１２株２９４（ＡＴＣＣ ３１４
４６）、イー コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｂ、イー コリ
（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｘ１７７６（ＡＴＣＣ ３１５３
７）、イー コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｃ６００およびイー
コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｃ６００ｈｆｌ並びにイー コ
リ（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｗ３１１０（Ｆ−、λ−、プロトト
ロフィック、ＡＴＣＣ ２７３７５）；バチラス サブ
チリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）の如き
バチラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属の菌株；サルモネラ
チフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍ
ｕｒｉｕｍ）またはセラチア マーセサンス（Ｓｅｒｒ
ａｔｉａ ｍａｒｃｅｓａｎｓ）等の大腸菌以外の腸内
細菌；シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属の
種々の菌株；およびサッカロミセス セレビシエ（Ｓａ
ｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）などが
挙げられる。

【００５４】これらの細菌のうちエシェリヒア コリ
（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１２株２９４が最も好ましい。上記
微生物を宿主として使用する場合、これら微生物に適し
たプラスミドベクターが組換え体ＤＮＡの複製可能な発
現ベクターとして一般に用いられる。例えば大腸菌を形
質転換するためのプラスミドベクターとしてはプラスミ
ドｐＢＲ３２２やｐＢＲ３２７などを用いることができ
る。プラスミドベクターは通常複製起源、プロモータ
ー、および組換え体ＤＮＡで形質転換した細胞を選別す
るのに有用な表現型を組換え体ＤＮＡに与えるマーカー
遺伝子等を含んでいる。

【００５５】プロモーターの例としては、β−ラクタマ
ーゼ及びラクトースプロモーター、トリプトファンプロ
モーター等が挙げられる。マーカー遺伝子の例として
は、アンピシリン耐性遺伝子やテトラサイクリン耐性遺
伝子が挙げられる。一方、本発明のＤＮＡを発現して本
発明のペプチドを製造するためには上記の原核細胞を宿
主として用いる宿主−ベクター系および脊椎動物の細胞
などの真核生物の細胞を宿主細胞として用いる宿主−ベ
クター系を使用することができる。真核細胞の例として
は前述の動物の細胞株などの細胞が挙げられる。

【００５６】本発明のＤＮＡを前述の真核細胞で発現さ
せるために、本発明の組換え体ＤＮＡは一般に遺伝子発
現を制御するための機能配列、例えば、複製起源、本発
明のＤＮＡの上流に位置すべきプロモーター、リボゾー
ム結合部位、ポリアデニル化部位や転写終止配列を含有
している。本発明のＤＮＡを真核細胞内で発現させるの
に用いることのできるそのような機能配列はウィルスや
ウィルス性物質から得ることができる。

【００５７】例えば、本発明で用いることのできるプロ
モーターは、アデノウィルス２、ポリオーマウィルス、
シミアンウィルス４０（ＳＶ４０）などから得ることが
できる。特に、アデノウィルス２の主後期プロモーター
やＳＶ４０の初期および後期プロモーターが好ましい。
また、トロンビンのプロテインＣ活性化を促進する作用
を有するヒト肺由来のペプチドをコードする遺伝子の上
流の位置に本来存在するプロモーターも、上述の宿主−
ベクター系で使用するのに適しているならば使用するこ
とができる。

【００５８】複製起源については、外来性の起源、例え
ば、アデノウィルス、ポリオーマ、ＳＶ４０、水疱性口
内炎ウィルス（ＶＳＶ）、ウシ乳頭腫ウィルス（ＢＰ
Ｖ）等のウィルス由来の複製起源を用いることができ
る。また、発現ベクターとして宿主染色体に組み込まれ
るような性質を有するベクターを用いる場合、宿主染色
体の複製起源を利用することができる。

【００５９】本発明の複製可能な組換え体ＤＮＡで形質
転換された微生物または細胞は、前述のとおり、組換え
体ＤＮＡに与えられた少なくとも１種の表現型によって
形質転換されずに残った親細胞から選別される。表現型
は少なくとも１種のマーカー遺伝子を組換え体ＤＮＡに
挿入することによって与えることができる。また複製可
能な発現ベクターが本来有しているマーカー遺伝子を利
用することもできる。

【００６０】マーカー遺伝子の例としては、例えば、ネ
オマイシン耐性などの薬剤耐性遺伝子やジヒドロ葉酸レ
ダクターゼ（以下“ＤＨＦＲ”と称する）をコードする
遺伝子などが挙げられる。これに関し、ＤＨＦＲ遺伝子
をマーカー遺伝子として用いる場合、ＤＨＦＲには様々
のタイプがあるため、その使用するマーカー遺伝子のコ
ードしているＤＨＦＲのタイプによって用いるべき宿主
を選択しなければならない。例えば、マーカー遺伝子と
して野生型ＤＨＦＲをコードする遺伝子を用いる場合、
宿主としてはＤＨＦＲ欠損株を用いるのが好ましい。

【００６１】ＤＨＦＲ欠損株はヒポキサンチン、グリシ
ン及びチミジンを要求するので、ヒポキサンチン、グリ
シン及びチミジンを含まない培地中では成育できない。
しかしながら、ＤＨＦＲ欠損株をＤＨＦＲ遺伝子を含有
する組換え体ＤＮＡで形質転換すると、その株はもはや
ヒポキサンチン、グリシン及びチミジンを要求しなくな
り、ヒポキサンチン、グリシン及びチミジンを含まない
培地中でも成育することができる。従って、形質転換細
胞は、ヒポキサンチン、グリシン及びチミジンについて
の栄養要求性を判断基準にして形質転換されないで残っ
た細胞から容易に選択することができる。

【００６２】一方、メトトレキセート（ＭＴＸ）に対す
る親和性の低い変異体ＤＨＦＲをコードする遺伝子（以
下“ＭＴＸ耐性ＤＨＦＲ遺伝子”と称する）をマーカー
遺伝子として用いる場合には、宿主細胞は正常なＤＨＦ
Ｒをコードする遺伝子を有していればよくＤＨＦＲを欠
損している必要はない。その理由は以下のとおりであ
る。正常ＤＨＦＲはＭＴＸによって阻害されるため、正
常ＤＨＦＲをコードする遺伝子を含有する宿主細胞はＭ
ＴＸの存在下ではヒポキサンチン、グリシン及びチミジ
ンを要求する。

【００６３】しかしながら、その宿主細胞がＭＴＸ耐性
ＤＨＦＲ遺伝子を含有する組換え体ＤＮＡで形質転換す
ると形質転換細胞はＭＴＸ存在下においてももはやヒポ
キサンチン、グリシン及びチミジンを要求しない。従っ
て、形質転換細胞は、ＭＴＸ存在下におけるヒポキサン
チン、グリシン及びチミジンについての栄養要求性を判
断基準として用いて形質転換されていない細胞から選択
することができる。これに関し、真核細胞の大多数がＭ
ＴＸ感受性であるのでＭＴＸ耐性ＤＨＦＲ遺伝子はマー
カー遺伝子として用いるのに好都合である。

【００６４】サッカロミセス セレビシエ（Ｓａｃｃｈ
ａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）などの酵母
も本発明のＤＮＡを発現するための宿主として用いるこ
とができる。酵母で本発明のＤＮＡを発現するためには
複製可能な発現ベクターとして例えばプラスミドＹＲｐ
７を用いることができる。プラスミドＹＲｐ７はｔｒｐ
ｌ遺伝子を含有しており、このｔｒｐｌ遺伝子をマーカ
ー遺伝子として利用することができる。

【００６５】酵母細胞用の発現ベクターのプロモーター
の例としては、３−ホスホグリセレートキナーゼまたは
エノラーゼ、グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデ
ヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルベートデカルボ
キシラーゼ、ホスホフラクトキナーゼ、グルコース−６
−ホスフェートイソメラーゼ、グルコキナーゼ、などの
解糖系に関与する酵素類の遺伝子のプロモーターやアル
コールデヒドロゲナーゼ２、イソチトクロームＣ、酸性
ホスファターゼ、窒素代謝に関与する酵素、マルトース
及びラクトースの利用に関与する酵素類の遺伝子のプロ
モーターが挙げられる。

【００６６】これらのうち、アルコールデヒドロゲナー
ゼ２、イソチトクロームＣ、酸性ホスファターゼ、窒素
代謝に関与する酵素類、グリセルアルデヒド−３−ホス
フェートデヒドロゲナーゼ、及びマルトース及びラクト
ースの利用に関与する酵素類の遺伝子のプロモーター
は、これらのプロモーターによる転写を宿主の培養条件
を変えることによって制御することができるので有利で
ある。

【００６７】酵母細胞中における転写や翻訳を制御する
ための複製起源や終止コドンおよびその他のＤＮＡ配列
としては、酵母細胞に適している通常の公知のＤＮＡ配
列を用いることができる。形質転換した微生物または細
胞は通常の栄養培地を用いて通常の公知の方法で培養す
ることにより本発明のペプチドをコードするＤＮＡを発
現して本発明のペプチドを製造することができる。培養
後、本発明のペプチドは形質転換体の培養物から通常の
公知の方法、例えばカラムクロマトグラフィーなどを用
いて単離することができ、本明細書の記載に従って、本
発明の医薬組成物として使用できる程度に実質的に精製
されることが通常行われる。

【００６８】このようにして得られたペプチドは、本発
明の作用と可溶性を有する限り、様々な種類と長さの糖
鎖を少なくとも１種含有していてもよいし、また複数の
アミノ酸配列からなるペプチドの混合物であってもよ
い。得られたペプチドが糖鎖を含有しているか否かは用
いる宿主細胞の種類によって異なる。また、ペプチドが
糖鎖を含有している場合の糖鎖の種類や長さも用いる宿
主細胞の種類によって異なる。

【００６９】一般に翻訳開始シグナルのＡＴＧから翻訳
されたペプチドは宿主細胞から分泌されるときにプロセ
ッシングを受けて成熟蛋白になることが知られている。
本発明のペプチドの場合もそのようなプロセッシングを
受けることがある。ペプチドがプロセッシングを受ける
部位は、宿主により、または培養条件により変化する場
合がある。例えば、本発明のペプチドが、式（Ｉ）で表
されるペプチドとＮ末端アミノ酸配列として前述の１８
個のアミノ酸からなるリーダー配列とを含むプロセッシ
ングを受けていない未成熟形で形質転換細胞中で産生さ
れる場合、その未成熟形ペプチドはプロセッシングを受
けてリーダー配列が削除されて成熟形となることがあ
る。しかしながら、前述のように未成熟形ペプチドのプ
ロセッシングを受ける位置は使用する宿主の種類や宿主
の培養条件により変化するので必ずしも上記のようなプ
ロセッシングが起きるとは限らない。

【００７０】前述のとおり、本発明のトロンビンによる
プロテインＣの活性化を促進する作用を有するペプチド
は組換えＤＮＡ技術を用いる方法により製造することが
できる。また、本発明のペプチドは通常の公知の方法に
より、例えば市販の自動ペプチド合成装置などを用いて
有機合成により製造することもできる。本発明のペプチ
ドはトロンビンによるプロテインＣ活性化を促進する作
用を有する。プロテインＣは血液凝固線溶機構において
重要な役割を演じているビタミンＫ依存性の蛋白質であ
り、トロンビンの作用により活性化される。

【００７１】活性型プロテインＣは、生体内で血液凝固
系補酵素の活性型第Ｖ因子、および活性型第ＶＩＩ因子
を失活させ、また血栓溶解作用を有するプラスミノーゲ
ンアクチベーターの産生に関与していることが知られて
いる。〔鈴木宏治、医学の歩み、第１２５巻、９０１頁
（１９８３年）〕。本発明のペプチドは、このトロンビ
ンによるプロテインＣの活性化を促進して抗血液凝固作
用と血栓溶解作用を示す活性型プロテインＣを大量に産
生せしめるものである。従って、本発明のペプチドは生
体における抗血液凝固及び血栓溶解に大きく寄与するも
のである。

【００７２】前述のように、本発明のペプチドは抗血液
凝固作用と血小板凝集抑制作用及び血栓溶解作用を有す
るので、血液凝固を制御するための、または血小板凝集
を制御するための医薬組成物として用いることが可能で
あり、具体的には、例えば、心筋梗塞、血栓症、塞栓
症、末梢血管閉塞症、閉塞性動脈硬化症、血管内血液凝
固症候群（ＤＩＣ）、狭心症、一過性脳虚血発作、妊娠
中毒症等の疾患の治療及び予防に用いることができる。

【００７３】本発明の医薬組成物となすに際しては、本
発明のペプチドと、薬剤として使用可能な担体とを混合
すればよい。即ち、上記の疾患を治療または予防するの
に有効な量の本発明のペプチドを適当な量の担体と混ぜ
て、患者に効果的に投与するのに適した医薬組成物を調
製することができる。薬剤として使用可能な担体として
は、例えば、メチルセルロース、カルボキシメチルセル
ロースなどが例示される。また本発明の医薬組成物とし
ては、凍結乾燥された製剤となすことが好ましい。また
本発明の医薬組成物は注射用製剤として用いることが好
ましい。さらには、点滴静注用製剤とすることが好まし
い。

【００７４】注射剤として用いる場合に、上記の担体
は、薬剤として投与可能であり、且つ注射可能な溶液と
なり得る担体であることが好ましく、この担体として
は、ショ糖、精製ゼラチン、アルブミン、マンニトー
ル、ブドウ糖および塩化ナトリウムからなる群より選ば
れた１種以上が例示され、また各種無機塩のｐＨ調整剤
などを添加することも好ましい例として挙げられるが、
その場合には本発明の可溶性ペプチドとの組み合わせに
おいて、医薬組成物全体として可溶性であり、且つ綺麗
に凍結乾燥が可能であって、好ましい。また本発明にお
いては、上記担体が、グリセリンであることもまた好ま
しい。上記の担体は、製剤を調製する際に添加すること
が好ましいが、用時に溶解された際において添加される
ことも許されるものである。

【００７５】本発明によるペプチドの成人１回当たりの
投与量は年齢、性別、体重、症状等により異なるが、一
般に約０．１〜２００ｍｇであり、一日当たり一回また
は必要に応じて数回、例えば注射、好ましくは点滴静注
により投与する方法が例示される。本発明者らは、本発
明のペプチドが副作用の少ない極めて有用なものである
ことを確認しており、例えば、動物実験でラットｉｖ投
与において約３ｍｇ／ｋｇで全く死亡例や害を生ずるこ
とがなく、有効な作用も認められることから、ヒトの体
重を約６０〜７０ｋｇと考えて上記の投与量が妥当なも
のとして提示される。

【００７６】

【実施例】本発明をより詳細に記述するために参考例及
び実施例により説明するが、本発明の範囲はこれらの実
施例にのみ限定されるものではない。 参考例１ （プロテインＣ活性化を促進する作用の測定） 本発明のペプチドのプロテインＣ活性化の促進作用の測
定は、合成基質Ｂｏｃ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ａｒ
ｇ−ＭＣＡ（Ｂｏｃ及びＭＣＡはそれぞれｔ−ブトキシ
カルボニル基及び４−メチルクマリル−７−アミドの略
称である）を用いる公知のプロテインＣ測定法〔ワイ
オーノ（Ｙ．Ｏｈｎｏ）ら、ザ ジャーナル オブ バ
イオケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．）９０巻、１
３８７頁（１９８１年）〕に従って行なった。すなわ
ち、プロテインＣ（最終濃度０．５μＭ）およびトロン
ビン（最終濃度８０ｎＭ）を含有する水溶液５μｌに本
発明のペプチドを含む水溶液５μｌ（０〜０．０１ Ａ
₂₈₀ ／ｍｌ）を加え、これにＮａＣｌ、ＣａＣｌ₂ 、血
清アルブミン及びトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）をそ
れぞれ最終濃度が０．１５Ｍ、２．５ｍＭ、１ｍｇ／ｍ
ｌ及び２０ｍＭになるように、そして全量が３０μｌと
なるように加えた。

【００７７】得られた混合物を３７℃で１５分間反応さ
せてプロテインＣを活性化した後に２μＭのアンチトロ
ンビンIII を１０μｌ及び１０単位／ｍｌのヘパリンを
含有する水溶液を１０μｌ加えて３７℃で１５分間加温
して反応を停止させた。得られた反応混合物に、前述の
合成基質Ｂｏｃ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ｍ
ＣＡ〔財団法人蛋白質研究奨励会ペプチド研究会（Ｐｅ
ｐｔｉｄｅ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）（日本）製〕２００
μＭを含む２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）２
５０μｌを加え、３７℃で１０分間反応させた後、２０
％酢酸０．５ｍｌを加えて反応を停止させ、遊離してき
たＡＭＣ（７−アミノ−７−メチル−クマリン）の濃度
を励起波長３８０ｎｍ、発光波長４４０ｎｍで蛍光分光
光度計ＲＦ−５４０型（島津製作所製、日本）により測
定した。

【００７８】得られた蛍光強度を既知濃度のＡＭＣの蛍
光強度と比較して、遊離したＡＭＣ量を求めた。値は１
分間当りに生成するＡＭＣ量で表わす。このＡＭＣ量か
ら本発明のペプチドを含まない水溶液を加えたときのＡ
ＭＣ量を引いた値がサンプルのトロンビンによるプロテ
インＣ活性化を促進する強さを示す。

【００７９】ここで、プロテインＣはヒト血漿から鈴木
らの方法〔鈴木（Ｓｕｚｕｋｉ）ら、ザ ジャーナル
オブ バイオロジカル ケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｌ．
Ｃｈｅｍ．）、２５８巻、１９１４頁（１９８３年
等）〕で精製した。また、ヒトトロンビンはランドブラ
ッド（Ｌｕｎｄｂｌａｄ）らの方法〔ランドブラッド
（Ｌｕｎｄｂｌａｄ）ら、バイオケミカル アンド バ
イオフィジカル リサーチ コミュニケーション（Ｂｉ
ｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕ
ｎ．）６６巻、４８２頁（１９７５年）〕で精製した。

【００８０】参考例２ （１）：ヒト肺ｃＤＮＡライブラリーの入手 ヒトの肺のポリ（Ａ）⁺ ＲＮＡより調製したバクテリオ
ファージλｇｔ₁₁ｃＤＮＡライブラリーは、米国、クロ
ーンテック社（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｉｅｓ，Ｉｎｃ．、９２２ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ，Ａ
ｖｅ．ＰａｌｏＡｌｔｏ，ＣＡ９４３０３）より購入し
た（カタログ番号ＨＬ１００４）。

【００８１】（２）：トロンビンによるプロテインＣ活
性化を促進する作用のあるグリコペプチドの精製 プロテインＣ活性化を促進する作用のあるグリコペプチ
ドは、以下のようにしてヒト肺より抽出して得た。公立
病院より提供されたヒト肺標本約８００ｇを鋏で約１ｃ
ｍ四方程度の大きさに細切りした後、得られた組織片に
１ｍＭのＤＦＰ（Ｄｉｉｓｏｐｒｏｐｙｌ ｆｌｕｏｒ
ｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ）を含む４℃に冷却した５００ｍ
ｌの生理食塩水を加え、ワーリングブレンダーとしてＡ
ｃｅ Ｈｏｍｏｇｅｎｉｚｅｒ ＡＭ−１型（日本精器
会社製、日本）を用いて４℃で５分間、ホモジナイズし
た。ホモジナイズ後、混合物を氷中で５分間冷却した。

【００８２】次に混合物を更に４℃で５分間、ホモジナ
イズし氷中で５分間冷却した。上記のホモジナイズ及び
冷却操作を更に３回くり返した。得られたホモジェネー
トを１２，０００ｇで４℃において３０分間遠心分離に
かけて上澄液とペレットに分け、ペレットを集める。こ
れに０．５％（ｖ／ｖ）トリトンＸ−１００、０．２５
Ｍ庶糖、１ｍＭベンズアミジン塩酸、０．５ｍＭ Ｃａ
Ｃｌ₂ を含む０．０２Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．
５）１００ｍｌに懸濁し、ワーリングブレンダーを用い
て４℃で５分間、５回ホモジナイズして細胞抽出物を得
た。

【００８３】得られた抽出物を３５，０００ｇ、１０℃
で６０分間遠心分離にかけて上澄液を集めた。エヌ エ
ル エスモン（Ｎ．Ｌ．Ｅｓｍｏｎ）ら〔ザ ジャーナ
ルオブ バイオロジカル ケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏ
ｌ．Ｃｈｅｍ．）、２５７巻、８５９頁（１９８２
年）〕の方法に従って作成したＤＩＰ−トロンビン〔ジ
イソプロピルホスフォロトロンビン（ｄｉｉｓｏｐｒｏ
ｐｙｌｐｈｏｓｐｈｏｒｏ−ｔｈｒｏｍｂｉｎ）を、ピ
ー クオトレカサス（Ｐ．Ｃｕａｔｒｅｃａｓａｓ）の
方法〔（ザ ジャーナル オブ バイオロジカル ケミ
ストリー（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．）、２４５巻、３
０５９頁（１９７０年）〕に従ってブロムシアン化した
アガロースに結合させて、ＤＩＰ−トロンビン−アガロ
ースを作成した。

【００８４】次にＤＩＰ−トロンビン−アガロースを
２．５ｃｍφ×１０ｃｍの大きさのカラムに充填してＤ
ＩＰ−トロンビン−アガロースカラムを作成し、室温で
０．１Ｍ ＮａＣｌ、０．５ｍＭ ＣａＣｌ₂ 、１ｍＭ
ベンズアミジン塩酸、０．５％（ｖ／ｖ）Ｌｕｂｒｏｌ
ＰＸ（半井科学薬品製、日本）を含む０．０２Ｍトリ
ス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）でカラムを平衡化した。次
いで、上記の抽出上澄液をカラムに供した。カラムを
０．３Ｍ ＮａＣｌ、０．５ｍＭ ＣａＣｌ₂ 、１ｍＭ
ベンズアミジン塩酸、０．５％（ｖ／ｖ）Ｌｕｂｒｏｌ
ＰＸを含む０．０２Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．
５）で洗浄した後、１Ｍ ＮａＣｌ、０．１ｍＭ ＥＤ
ＴＡ、１ｍＭベンズアミジン塩酸０．５％（ｖ／ｖ）Ｌ
ｕｂｒｏｌ ＰＸを含む０．０２Ｍトリス塩酸緩衝液
（ｐＨ７．５）で溶出して２．０ｍｌずつフラクシヨン
を集めた。溶出によって得られる各フラクションについ
て前記の方法でトロンビンのプロテインＣの活性化促進
能を測定した。同時に島津製作所（日本）製スペクトロ
フォトメーターＵＶ−２４０を用いて各フラクションの
波長２８０ｎｍにおける吸光度（Ａ₂₈₀ ）を測定した。

【００８５】プロテインＣ活性化能のある画分を回収
し、０．１Ｍ ＮａＣｌ、０．５ｍＭＣａＣｌ₂ 、０．
０５％（ｖ／ｖ）Ｌｕｂｒｏｌ ＰＸを含む０．０２Ｍ
トリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）で透析した。得られた
透析液を２回目のＤＩＰ−トロンビン−アガロースカラ
ムクロマトグラフィーに供した。即ち、透析液を１．５
ｃｍφ×１０ｃｍの大きさのＤＩＰ−トロンビン−アガ
ロースカラムに供し、０．４Ｍ ＮａＣｌ、０．５ｍＭ
ＣａＣｌ₂ 、０．１％（ｖ／ｖ）ＬｕｂｒｏｌＰＸを
含む０．０２Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）で洗浄
後、さらに０．４Ｍ ＮａＣｌ、０．１ｍＭ ＥＤＴ
Ａ、０．１％（ｖ／ｖ）Ｌｕｂｒｏｌ ＰＸを含む０．
０２Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）で洗浄し、次い
で１Ｍ ＮａＣｌ、０．５ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１％
（ｖ／ｖ）Ｌｕｂｒｏｌ ＰＸを含む０．０２Ｍトリス
塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）で溶出した。

【００８６】プロテインＣ活性化能のある画分を回収
し、さらに０．１Ｍ ＮａＣｌ、０．０５％（ｖ／ｖ）
Ｌｕｂｒｏｌ ＰＸを含む０．０２Ｍトリス塩酸緩衝液
（ｐＨ７．５）で透析した。得られた透析液を３回目の
ＤＩＰ−トロンビン−アガロースカラムクロマトグラフ
ィーに供した。カラムの大きさ、洗浄条件および溶出条
件は２回目のＤＩＰ−トロンビン−アガロースカラムク
ロマトグラフィーの条件と全く同じ条件で行なった。な
お、溶出して得られるフラクションは２ｍｌずつ集め
た。

【００８７】次にプロテインＣ活性化能のある画分を回
収し、０．１Ｍ ＮａＣｌ、０．０５％（ｖ／ｖ）Ｌｕ
ｂｒｏｌ ＰＸを含む０．０２Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐ
Ｈ７．５）で透析した後、０．９ｃｍφ×８ｃｍの大き
さの４回目のＤＩＰ−トロンビン−アガロースカラムク
ロマトグラフィーに供した。０．３５Ｍ ＮａＣｌ、
０．５ｍＭ ＣａＣｌ₂ 、０．１％（ｖ／ｖ）Ｌｕｂｒ
ｏｌ ＰＸを含む０．０２Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ
７．５）で洗浄後、１Ｍ ＮａＣｌ、０．５ｍＭＥＤＴ
Ａ、０．１％（ｖ／ｖ）Ｌｕｂｒｏｌ ＰＸを含む０．
０２Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）で溶出した。溶
出して得られたフラクションは１．９ｍｌずつ集めた。

【００８８】この第４回目のＤＩＰ−トロンビン−アガ
ロースカラムクロマトグラフィーの溶出パターンを図１
に示す。フラクションナンバー４８番目から５６番目ま
でを回収した。このようにして精製されたフラクション
の吸光度から、得られた精製品の分子吸光係数を一般的
な蛋白質の分子吸光係数にならない１０．０（Ｅ^1% _1cm
・２８０ｎｍ＝１０．０）と規定してそれに基づき本精
製品の量を計算したところ約５００μｇであった。な
お、得られた精製画分をポリアクリルアミドゲル濃度５
〜１０％のグラジェントを用いるＳＤＳ−ポリアクリル
アミドゲル電気泳動を５０Ｖの電圧で２時間行ない、銀
染色によってバンドを観察したところ単一バンドのみ確
認された。

【００８９】また、この精製タンパク約１０μｇを２０
０ｍＭのＮａＣｌおよび０．１％（ｖ／ｖ）Ｌｕｂｒｏ
ｌ ＰＸを含む５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．
５）で透析後、同じ緩衝液で平衡化したＣｏｎＡセファ
ロース（ファルマシア社製、カタログ番号１７−０４４
０）のカラム（樹脂量約１ｍｌ）に供し、同じ緩衝液で
充分洗浄したところ、このタンパクはＣｏｎＡセファロ
ースに吸着して洗浄液中には溶出されなかった。次いで
０．５Ｍのメチル−α−Ｄ−マンノピラノシド（Ｍｅｔ
ｈｙｌ−α−Ｄ−ｍａｎｎｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）
（米国Ｓｉｇｍａ社製、カタログ番号Ｍ−６８８２）を
含む以外は上記と同じ緩衝液を通したところ、このタン
パク質は溶出した。従って、このタンパク質は糖を含む
いわゆるグリコペプチドであることがわかった。

【００９０】（３）：トロンビンのプロテインＣ活性化
を促進するグリコペプチドのアミノ酸配列分析 このグリコペプチドのアミノ酸配列は以下の様にして分
析した。精製したグリコペプチドを０．１％（ｖ／ｖ）
ラウリル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）水溶液で室温で１６
時間透析してアミノ酸配列分析用試料とする。アプライ
ドバイオシステムズ社（米国）製アミノ酸シークエンシ
ングアナライザー（モデル４７０Ａ）を用い、アール
エム ヘウイック（Ｒ．Ｍ．Ｈｅｗｉｃｋ）らの方法
〔ザ ジャーナル オブ バイオロジカル ケミストリ
ー（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．）２５６巻、７９９０頁
（１９８１年）〕に準じて、Ｎ末端側より順次エドマン
分析を行なった。

【００９１】遊離してくるフェニルチオヒダントイン
アミノ酸を、スペクトロフイジクス社（米国）製高速液
体クロマトグラフィー用装置（ＳＰ８１００）および米
国デュポン社製ゾルバックスＯＤＳカラムを用いて分析
を行ない、アミノ酸配列を決定した。その結果、アミノ
酸配列の一部が明らかになり、Ｎ末端より１１個目まで
は下記アミノ酸配列を有するものであることがわかっ
た。 Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ− Ｓｅｒ−Ｇｌｎ

【００９２】（４）：Ｎ末端アミノ酸配列をコードする
ＤＮＡプローブの作成 トロンビンによるプロテインＣ活性化を促進するグリコ
ペプチドのＮ末端アミノ酸配列をコードするＤＮＡプロ
ーブは、前述のＮ末端アミノ酸配列より、ヒト由来遺伝
子においてアミノ酸をコードする塩基配列の塩基の使用
頻度を考慮して〔ニュークリック アシド リサーチ
（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．）、９巻、Ｒ４
３頁（１９８１年）〕、Ｎ末端からのアミノ酸配列をコ
ードする塩基配列として、５′ＣＴＧＧＧ ＡＧＣＣＧ
ＣＣＧＧＧ ＣＴＧＧＧ ＧＣＴＣＧ ＧＣＧＧＧＧ
ＧＣ３′の３３ｍｅｒを、また大塚ら〔イー オーツカ
エト アール（Ｅ．Ｏｈｔｓｕｋａ，ｅｔ ａｌ．）、
ザ ジャーナル オブバイオロジカル ケミストリー
（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．）第２６０巻、２６０５頁
（１９８５年）〕に従って、デオキシイノシン（“Ｉ”
で示す）をチミジル酸の代りに用いてＮ末端からのアミ
ノ酸配列をコードする塩基配列として、 （１）５′ＧＣＩＣＣ ＩＧＣＩＧ ＡＡＣＣＩ ＣＡＧＣＣ ＩＧＧ３′ （２）５′ＧＣＩＣＣ ＩＧＣＩＧ ＡＧＣＣＩ ＣＡＡＣＣ ＩＧＧ３′ （３）５′ＧＣＩＣＣ ＩＧＣＩＧ ＡＧＣＣＩ ＣＡＧＣＣ ＩＧＧ３′ （４）５′ＧＣＩＣＣ ＩＧＣＩＧ ＡＡＣＣＩ ＣＡＡＣＣ ＩＧＧ３′ の４種類の２３ｍｅｒを米国アプライド バイオシステ
ムズ（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）社製の３
８０Ａ型ＤＮＡ合成機で合成し、メーカーマニュアルに
従って精製し、実験書〔イー エフ マニアティスら
（Ｍａｎｉａｔｉｓ Ｅ．Ｆ．，ｅｔ ａｌ）、モレキ
ュラークローニング（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎ
ｇ）、１２２頁（１９８２年）の記載にしたがって、Ｔ
₄ ＤＮＡキナーゼ、およびγ−³²Ｐ−ＡＴＰを用いてラ
ベル化した。

【００９３】（５）：トロンビンによるプロテインＣ活
性化を促進する作用のあるグリコペプチドの抗体 トロンビンのプロテインＣ活性化を促進する作用のある
グリコペプチドに対するウサギ抗体は、前述のようにし
て精製したトロンビンによるプロテインＣ活性化を促進
する作用のあるヒト肺由来のグリコペプチドを用いて、
成書〔エル ハドソンら（Ｌ．ｈｕｄｓｏｎ ｅｔ ａ
ｌ．）、プラクティカル イムノロジー（Ｐｒａｃｔｉ
ｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）、９頁（１９７６
年）、ブラックウェル サイエンティフィック パブリ
ケーションズ（ＢｌａｃｋｗｅｌｌＳｃｉｅｎｔｉｆｉ
ｃ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ）〕に従って作製した。

【００９４】この抗体がトロンビンによるプロテインＣ
活性化を促進する作用のあるヒト肺由来のグリコペプチ
ドと反応することを以下の様にして確認した。すなわ
ち、参考例２−（２）に記載の方法で得た精製タンパク
の約１０ｎｇをニトロセルロースのフィルターにスポッ
トする。よく風乾した後、この抗体を一次抗体としてニ
トロセルロースフィルター上のタンパクと反応させ、次
いでヤギで調製したビオチン化抗ウサギＩｇＧ（ザイメ
ット ラボラトリー社製、米国、カタログ番号６２−１
８４０）を二次抗体として反応させた後、アビジン・ビ
オチン化した西洋ワサビ由来パーオキシダーゼ（アマシ
ャムジャパン社製、日本、カタログ番号ＲＰＮ．１０５
１）を作用させる方法で発色させると黒褐色のスポット
を与えた。

【００９５】（６）：ヒトさい帯内皮細胞の採集及び培
養 ヒトさい帯内皮細胞はディスパーゼＩＩ（合同酒精製、
日本）を用いるマノらの方法〔ワイ マノら（Ｙ．Ｍａ
ｎｏ，ｅｔ ａｌ．）、エクスペリンエンシア（Ｅｘｐ
ｅｒｉｅｎｔｉａ）、第３９巻、第１１４４頁（１９８
３年）〕にしたがって、私立病院より提供された新鮮な
ヒトさい帯から得た静脈より採集し培養した。

【００９６】参考例３ （組換え体ＤＮＡの取得） （１）：ポリ（Ａ）⁺ ＲＮＡの調製 ヒト内皮細胞よりチャーギンらの方法〔ジェイ エム
チャーギン（Ｃｈｉｒｇｗｉｎ，Ｊ．Ｍ．ｅｔ ａ
ｌ．）、バイオケミストリー（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒ
ｙ）、第１８巻、５２９４頁（１９７９年）〕に従って
ポリ（Ａ）⁺ ＲＮＡを調製した。

【００９７】（２）：ヒト肺ｃＤＮＡライブラリーより
のスクリーニング ヒト肺のポリ（Ａ）⁺ ＲＮＡより調製したｃＤＮＡをバ
クテリオファージλｇｔ１１に組み込んだｃＤＮＡライ
ブラリー（クローンテック社製、米国）をそのマニュア
ルに従ってイー コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｙ１０９０（ク
ローンテック社製、米国）に感染させたものをＬＢ培地
プレート上に１５ｃｍ径プレート１枚当り約１０万プラ
ーク程度になる様に移植した。４２℃で３．５時間培養
後、あらかじめ１０ｍＭのＩＰＴＧ（ｉｓｏｐｒｏｐｙ
ｌ−β−Ｄ−ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉ
ｄｅ）に浸してから乾燥させたニトロセルロースフィル
ター（ＢＡ８５メンブランフィルター、シュライヒャー
アンド シェル社製、独国）をプレートの上に載せ、
３７℃で３．５時間インキュベートして、ペプチドをＩ
ＰＴＧで誘導発現させてニトロセルロースフィルター上
にうつしとる。

【００９８】このニトロセルロースフィルターに、マニ
ュアルに従って、ウサギで調製したトロンビンのプロテ
インＣ活性化を促進する作用を有する参考例２−（５）
で得られたグリコペプチドに対する抗体を一次抗体とし
て反応させ、次いでヤギで調製したビオチン化抗ウサギ
ＩｇＧ（ザイメッド ラボラトリー社製、米国 カタロ
グ番号６２−１８４０）を二次抗体として反応させた
後、アビジン・ビオチン化した西洋ワサビ由来パーオキ
シダーゼ（アマーシャム ジャパン社製、日本、カタロ
グ番号ＲＰＮ．１０５１）で発色させて、陽性のクロー
ンを単離した。この陽性クローンの保有する組換え体ｃ
ＤＮＡ／λｇｔ１１に含まれるｃＤＮＡ断片をＴＭ１３
と称した。

【００９９】（３）：Ｎ末端アミノ酸配列をコードする
ＤＮＡプローブとのハイブリダイゼーション 参考例３−（２）で得られたＤＮＡ断片ＴＭＩ３が参考
例２−（４）で調製したＮ末端アミノ酸配列をコードす
るＤＮＡプローブとハイブリダイズするか否かを実験書
〔シルハービイ（Ｓｉｌｈａｖｙ）ら、エクスペリメン
ツ ウイズ ジーン フュージョンズ（Ｅｘｐｅｒｉｍ
ｅｎｔｓ Ｗｉｔｈ Ｇｅｎｅ Ｆｕｓｉｏｎｓ）、１
９１頁（１９８４年）コールド スプリングハーバー
ラボラトリー（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）〕に従って実施した。ＤＮＡ
断片ＴＭ１３はいずれのＮ末端アミノ酸配列をコードす
るＤＮＡプローブともハイブリダイズしないことがわか
った。

【０１００】（４）：ＴＭ１３の塩基配列 参考例３−（２）で得られるクローンが含有するＤＮＡ
断片ＴＭ１３の塩基配列をサンガーらの方法（サンガー
エフ ら（Ｓａｎｇｅｒ，Ｆ，ｅｔ ａｌ．）、プロ
シーディング オブ ナショナル アカデミー オブ
サイエンス ユーエスエー（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃ
ａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ）、７４巻、５４６３頁（１９７
７年）にしたがって決定した。結果を図２〜図３に示
す。

【０１０１】（５）：ＤＮＡ断片ＴＭ１３をプローブと
したヒト肺ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニング ＤＮＡ断片ＴＭ１３を制限酵素ＫｐｎＩおよびＰｖｕII
で消化して約４４０塩基対のＤＮＡ断片を得、これをニ
ックトランスレーション法で³²Ｐで標識した。このＤＮ
Ａ断片をプローブとしてヒト肺ｃＤＮＡライブラリーよ
りプラークハイブリダイゼーションを行なって陽性のク
ローンをスクリーニングした。すなわち、常法に従って
クローンＴＭ１３のＤＮＡをＫｐｎＩおよびＰｖｕIIで
消化してポリアクリルアミドゲル電気泳動で分離し、抽
出、精製して約４４０ｂｐの精製断片約５００ｎｇを得
た。このＤＮＡをアマーシャム ジャパン（日本）社製
のニックトランスレーション キット（カタログ番号
Ｎ．５０００）を用い、それに添付のユーザー マニュ
アルに従ってα−³²Ｐ−ｄＣＴＰを用いて標識した。

【０１０２】この³²Ｐで標識したＤＮＡ断片をプローブ
として実験書〔マニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）ら、
モレキユラー クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃ
ｌｏｎｉｎｇ）、３２０頁、１９８２年、コールド ス
プリング ハーバー ラボラトリー（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒ
ｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）〕に従
ってヒト肺ｃＤＮＡライブラリーのプラークハィブリダ
イゼーションを行なった。陽性のクローンを単離し、そ
のクローンが含有する組換え体を各種制限酵素で解析し
たところ、得られた組換え体にはＴＭ１３よりも前記ペ
プチドのＮ末端側の塩基配列をコードしていると思われ
る約２４００ｂｐのＤＮＡ断片が組み込まれていること
がわかった。このＤＮＡ断片をＴＭ１３７と称した。

【０１０３】（６）：ＤＮＡ断片ＴＭ１３７の塩基配列 前記（５）で得られたＤＮＡ断片ＴＭ１３７の塩基配列
を参考例３−（４）に記載の方法と同様に決定した。結
果を図４〜図７に示す。この結果より、ＤＮＡ断片ＴＭ
１３７は、参考例２−（３）に記載したＮ末端アミノ酸
配列をコードする塩基配列を含まないことがわかった。

【０１０４】（７）：プライマー エクステンション 参考例３−（４）で得られたＤＮＡ断片の塩基配列のう
ち、ＤＮＡ断片ＴＭ１３のＮ末端側の配列を基に３種類
の合成ＤＮＡを参考例２−（４）に記載と同様にして作
成し、ＨＴＭ１３１、ＨＴＭ１３２、ＨＴＭ１３３と命
名した。なお、合成ＤＮＡの設計に当っては、ヒトさい
帯内皮細胞より調製したｍＲＮＡとハイブリダイズする
側の塩基配列を利用した。各合成ＤＮＡの塩基配列は以
下のとおりであり、それらの合成ＤＮＡが対応するＤＮ
Ａ断片ＴＭ１３での位置を図２に、またＴＭ１３７での
位置を図４に示す。

【０１０５】 ＨＴＭ１３１： ５′ＧＡＣＧＣＡＧＡＧＧＴＡＧＣＴＡＧＴＴＴ ３′（２０ｍｅｒ） ＨＴＭ１３２： ５′ＡＡＣＡＴＣＴＧＧＣＡＣＣＴＧ ３′ （１５ｍｅｒ） ＨＴＭ１３３： ５′ＧＡＣＡＧＧＣＡＧＴＣＴＧＧＴＴＧＣＡＡ ３′（２０ｍｅｒ）

【０１０６】次にこのＨＴＭ１３３をプライマーとして
参考例３−（１）に記載した方法で得たヒトさい帯内皮
細胞より調製したポリ（Ａ）⁺ ＲＮＡを用いて、いわゆ
るプライマー エクステンション（Ｐｒｉｍｅｒ Ｅｘ
ｔｅｎｓｉｏｎ）法を行なって、ＤＮＡ断片ＴＭ１３７
のさらに５′上流部分を合成した。すなわち、約１μｇ
／μｌのポリ（Ａ）⁺ ＲＮＡ５μｌに約２７ｎｇ／μｌ
のＨＴＭ１３３溶液２０μｌを加え６５℃で２０分間加
熱後、室温にまで約１時間かけて冷却した。それ以降
は、ｃＤＮＡ合成システム（アマシャム ジャパン社、
日本、カタログ番号ＲＰＮ１２５６）を用いて、そのマ
ニュアルに従ってｃＤＮＡを合成した。但し、ｃＤＮＡ
合成システムに入っているオリゴ（ｄＴ）プライマーの
かわりにＨＴＭ１３３を用いて実施した。

【０１０７】合成されたｃＤＮＡは実験書〔マニアティ
ス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）ら、モレキュラー クローニン
グ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ）、２４１
頁、１９８２年、コールド スプリング ハーバー ラ
ボラトリー（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）〕に従って両末端にＣテールを
つけ、両末端にＧテールをつけたｐＢＲ３２２（ＡＴＣ
Ｃ３７０１７）と混合し、６５℃、５分間加熱後５７
℃、２時間加熱した後、ゆっくりと室温に戻した後大腸
菌Ｋ１２ＭＣ１０６１（ベックマン シティ オブ ホ
ープ メディカルインスティテュート、米国より入手）
を形質転換した。

【０１０８】詳しくは、大腸菌Ｋ１２ＭＣ１０６１株の
コロニーをＬＢ培地を用いて、５５０ｎｍにおける吸光
度が０．３になるまで培養した。該培養物５０ｍｌを集
め、２５ｍｌの１０ｍＭ ＲｂＣｌを含む１０ｍＭ ３
−（Ｎーモルホリノ）プロパン−スルホン酸（ＭＯＰ
Ｓ）（ｐＨ７．０）溶液で洗浄し、次いで、５０ｍＭＣ
ａＣｌ₂、１０ｍＭ ＲｂＣｌを含む２５ｍｌの０．１
Ｍ ＭＯＰＳ（ｐＨ６．５）に再び懸濁した。得られた
懸濁液を３０分間氷冷し、遠心後、上澄を除去し、３０
μｌのＤＭＳＯおよび５０ｍＭ ＣａＣｌ₂と１０ｍＭ
ＲｂＣｌを含む２．０ｍｌの０．１Ｍ ＭＯＰＳ（ｐ
Ｈ６．５）の混合液中に懸濁させた。懸濁液を２００μ
ｌずつ分注し、前述のプラスミドＤＮＡ溶液１０μｌを
それぞれに加えた。

【０１０９】該混合液を３０分間氷冷した後、４４℃で
６０秒ヒートショックを与え、ただちに、あらかじめ３
７℃に温めておいた５ｍｌのＬＢ培地を加えた。この溶
液を３７℃で１時間培養した後、それぞれの溶液を遠心
し、上澄を除去し、細胞ペレットを得た。該細胞ペレッ
トにＬＢ培地を加え、撹拌した後、懸濁液とした。該懸
濁液を５μｇ／ｍｌのテトラサイクリンを含むＬＢ寒天
プレートにまき３７℃で１夜培養を行なった。このよう
にして得られるｃＤＮＡバンクより、参考例２−（４）
に記載した方法に従って５′末端を³²Ｐで標識したＨＴ
Ｍ１３１及びＨＴＭ１３２をそれぞれプローブとして、
コロニーハイブリダイゼーションを参考例３−（３）と
同様の方法で実施した。

【０１１０】コロニハイブリダイゼーションで約７０，
０００個の形質転換体をスクリーニングしてＨＴＭ１３
１及びＨＴＭ１３２の両者のプローブと反応するコロニ
ーが６クローン得られた。この６クローンから、実験書
〔マニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）ら、モレキュラー
クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎ
ｇ）、３６６頁、１９８２年、コールド スプリング
ハーバー ラボラトリー（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈ
ａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）〕に従ってプラス
ミドＤＮＡ（これを“ｐＴＭＰ５”と称する）を調製
し、各種の制限酵素を用いて切断し、電気泳動で解析し
たところ、６クローンから得られたプラスミドＤＮＡは
全て同一であり、約９００ｂｐの大きさのＤＮＡ断片と
ベクターからなることがわかった。このＤＮＡ断片をＴ
ＭＰ５と命名した。

【０１１１】（８）：ＤＮＡ断片ＴＭＰ５とＮ末端アミ
ノ酸配列をコードするＤＮＡプローブとのハイブリダイ
ゼーション 参考例３−（３）に記載の方法と同様にして、ＤＮＡ断
片ＴＭＰ５がＮ末端アミノ酸配列をコードするＤＮＡプ
ローブとハイブリダイズするか否かを調べた。ＤＮＡ断
片ＴＭＰ５はいずれのＮ末端ＤＮＡプローブともハイブ
リダイズしない、つまりＮ末端アミノ酸配列部分をコー
ドしていないことが分かった。

【０１１２】（９）：ＤＮＡ断片ＴＭＰ５の塩基配列 参考例３−（４）に記載の方法と同様にして、ＤＮＡ断
片ＴＭＰ５の塩基配列を決定した。結果を図８〜図９に
示す。

【０１１３】（１０）：第２回目のプライマー エクス
テンション 参考例３−（７）に記載の方法と同様にして、ＤＮＡ断
片ＴＭＰ５の塩基配列を基にしてＨＴＭ１３４、ＨＴＭ
１３５、ＨＴＭ１３６の３本の２０ｍｅｒの合成ＤＮＡ
を作成する。これらの合成ＤＮＡと対応するＤＮＡ断片
ＴＭＰ５における位置を図８に示す。参考例３−（７）
に記載の方法と同様にしてプライマー エクステンショ
ンをＨＴＭ１３６をプライマーとし、ＨＴＭ１３４、及
びＨＴＭ１３５をプローブとして実施した。約５０，０
００個の形質転換体から、ＨＴＭ１３４、及びＨＴＭ１
３５とハイブリダイズする形質転換体が一種類得られ
た。この形質転換体が保有する組換え体に含まれている
ＤＮＡ断片をＴＭＰ２６と命名した。

【０１１４】（１１）：ＤＮＡ断片ＴＭＰ２６とＮ末端
アミノ酸配列をコードするＤＮＡプローブとのハイブリ
ダイゼーシヨン 参考例３−（３）に記載の方法と同様にしてＤＮＡ断片
ＴＭＰ２６がＮ末端アミノ酸配列をコードするＤＮＡプ
ローブとハイブリダイズするか否かを調べた。その結
果、ＤＮＡ断片ＴＭＰ２６は参考例２−（４）で合成し
た３３ｍｅｒのＮ末端アミノ酸配列をコードするＤＮＡ
プローブ及び４種の２５ｍｅｒのプローブのミックスプ
ローブとハイブリダイズした。つまり、ＤＮＡ断片ＴＭ
Ｐ２６はＮ末端アミノ酸配列部分をコードしていること
が分かった。

【０１１５】（１２）：ＤＮＡ断片ＴＭＰ２６の塩基配
列 参考例３−（４）に記載の方法と同様にして、ＤＮＡ断
片ＴＭＰ２６の塩基配列を決定した。ＤＮＡ断片ＴＭＰ
２６のカルボキシル末端からの約５４０塩基の塩基配列
を図１０に示す。

【０１１６】（１３）：ＤＮＡ断片ＴＭＰ２６、ＴＭＰ
５及びＴＭＰ１３７の接合 参考例３−（１）〜（１２）で得られ、塩基配列を決定
した４本のＤＮＡ断片（ＴＭ１３、ＴＭ１３７、ＴＭＰ
５及びＴＭＰ２６）のその塩基配列における対応関係お
よび簡単な制限酵素地図を図１１に示した。図１１に示
すようにＤＮＡ断片ＴＭＰ２６に含まれるＮ末端アミノ
酸配列をコードする塩基配列の上流にある最初のＡＴＧ
よりオープンリーディングフレームを組むとＤＮＡ断片
ＴＭＰ２６、ＴＭＰ５を通過してＴＭ１３７の途中まで
続く１７２５ｂｐからなることが分かった。この各ＤＮ
Ａ断片にわたるオープンリーディングフレームをコード
するＤＮＡ断片を得るためにＤＮＡ断片ＴＭＰ２６、Ｔ
ＭＰ５及びＴＭ１３７を次のようにして常法に従って継
ぎあわせた。

【０１１７】（１３−１）：ＤＮＡ断片ＴＭ１３７とＴ
ＭＰ５の継ぎあわせ まず、λｇｔ１１のＥｃｏＲＩサイトに挿入されている
ＤＮＡ断片ＴＭ１３７を単離し、プラスミドｐＵＣ１８
（ファルマシア社製、スウェーデン、カタログ番号２７
−４９４９−０１）のＥｃｏＲＩサイトに挿入してプラ
スミドｐＵＣ１８ＴＭ１３７を得た。次にプラスミドｐ
ＵＣ１８ＴＭ１３７を制限酵素ＨｉｎｃII、ＥｃｏＲＩ
で消化して４％（ｖ／ｖ）ポリアクリルアミドゲル電気
泳動で分離し、電気泳動抽出装置（日本、アート社製、
ＭＡＸ−ＹＩＥＬＤＲ）を用いて約２，３００ｂｐのＤ
ＮＡ断片を回収し、エタノール沈殿を行なって精製し
た。

【０１１８】一方、参考例３−（７）で得られたＴＭＰ
５をプラスミドｐＢＲ３２２に組み込んだプラスミドｐ
ＴＭＰ５をＤｄｅＩで完全に消化した後、切断末端を
Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｋｌｅｎｏｗ Ｐ
ｏｌＩ断片）を用いて平滑末端にして約８００ｂｐのＤ
ＮＡ断片を回収し、このＤＮＡ断片をｐＵＣ１８のＳｍ
ａＩサイトに挿入してプラスミドｐＵＣ１８ＴＭＰ５を
得た。次にこのプラスミドｐＵＣ１８ＴＭＰ５を制限酵
素ＢａｍＨＩおよびＨｉｎｃIIで完全消化して約６００
ｂｐのＢａｍＨＩ−ＨｉｎｃII断片を得た。

【０１１９】以上の様にしてプラスミドｐＵＣ１８ＴＭ
１３７より調製した約２，３００ｂｐのＤＮＡの断片及
びプラスミドｐＵＣ１８ＴＭＰ５より調製した約６００
ｂｐのＤＮＡ断片プラスミドｐＵＣ１８のＢａｍＨＩお
よびＥｃｏＲＩで消化して調製したベクターに挿入して
プラスミドｐＵＣ１８ＴＭＪ１を得た。この工程を図１
２に示した。

【０１２０】（１３−２）：ＤＮＡ断片ＴＭＪ１とＴＭ
Ｐ２６の継ぎあわせ プラスミドｐＵＣ１８ＴＭＪ１を制限酵素ＤｄｅＩ、Ｋ
ｐｎＩ及びＢａｍＨＩで完全消化し、約９５０ｂｐ及び
約１５００ｂｐの断片を回収した。一方、ＤＮＡ断片Ｔ
ＭＰ２６をプラスミドｐＵＣ１３（ファルマシア社製、
スウェーデン、カタログ番号２７−４９５４−０１）の
制限酵素ＰｓｔＩサイトに挿入してプラスミドｐＵＣ１
３ＴＭＰ２６を得た。これをＢｂｅＩで完全消化した
後、切断末端をＴ₄ＤＮＡポリメラーゼを用いて平滑末
端にし、さらに制限酵素Ｂｇ1 IIで完全消化して約１７
０ｂｐのＤＮＡ断片を得た。さらに別に、プラスミドｐ
ＵＣ１３ＴＭＰ２６をＢｇ1 II及びＤｄｅＩで完全消化
して約２８０ｂｐのＤＮＡ断片を得た。

【０１２１】次に上記の約１７０ｂｐ、約２８０ｂｐ、
約９５０ｂｐのＤＮＡ断片をＴ₄ ＤＮＡリガーゼを用い
て継ぎあわせ、制限酵素ＫｐｎＩで消化した後、５０Ｖ
の電圧で４℃で２時間、１．３％低融点アガロースゲル
電気泳動にかけて精製単離し、約１４００ｂｐのＤＮＡ
断片を得た。また別途、プラスミドｐＵＣ１８をＳｐｈ
Ｉで完全に消化した後、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＮＡポリメラ
ーゼで切断末端を平滑末端にした後、ＢａｍＨＩで完全
消化してベクターを調製した。このベクターに上述の約
１，４００ｂｐ及び約１，５００ｂｐのＤＮＡ断片をＴ
₄ ＤＮＡリガーゼを用いて挿入して、プラスミドｐＵＣ
１８ＴＭＪ２を得た。この工程を図１３に示す。

【０１２２】参考例４ （ヒト染色体からの目的遺伝子のスクリーニング） ヒト染色体ライブラリーからの目的遺伝子のスクリーニ
ングは以下のようにして実施した。λファージのベクタ
ーＥＭＢＬ−３に入ったヒト染色体ライブラリーは米国
クローンテック社（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔ
ｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．９２２Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ａｖ
ｅ．Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ９４３０３）より購入し
た（カタログ番号ＨＬ１００６）。このライブラリーよ
り参考例３−（２）で得られたＤＮＡ断片ＴＭ１３をプ
ローブとして用いて参考例３−（５）と同様の方法でス
クリーニングを行なったところ、約２万ｂｐインサート
を含有する染色体クローンが１種類得られた。

【０１２３】この染色体クローンを制限酵素ＢａｍＨＩ
で完全消化して１．０％アガロースゲル電気泳動を行な
い、実験書〔マニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）ら、モ
レキュラー クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌ
ｏｎｉｎｇ）、３８２頁、１９８２年、コールド スプ
リング ハーバー ラボラトリー（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉ
ｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）〕に従っ
てサザン ブロットハイブリダイゼーションを同じプー
ロブを用いて実施した。

【０１２４】その結果、約４，０００ｂｐのＤＮＡ断片
に強い陽性のバンドを得たのでその断片を常法に従って
単離し、プラスミドｐＵＣ１８のＢａｍＨＩサイトにサ
ブクローニングした。この約４，０００ｂｐのＤＮＡの
塩基配列を決定したところ、参考例３−（１３−２）で
作製したプラスミドｐＵＣ１８ＴＭＪ２に挿入されてい
るＤＮＡ断片の塩基配列と完全に一致することが分かっ
た。

【０１２５】実施例１ プラスミドｐＳＶ２ＴＭＪ２、ｐＳＶ２ＴＭＤ１、ｐＳ
Ｖ２ＴＭＤ２、ｐＳＶ２ＴＭＤ４及び、ｐＳＶ２ＴＭＤ
５の作製 （１）プラスミドｐＳＶ２ＴＭＪ２の構築 プラスミドｐＳＶ２−ｄｈｆｒ（ＡＴＣＣ３７１４６）
をＨｉｎｄIII 及びＢｇl IIで完全消化してＳＶ４０の
初期転写プロモーター及びＳＶ４０の転写ターミネータ
を有するベクターを得た。次に参考例２−（１３−２）
で作成したプラスミドｐＵＣ１８ＴＭＪ２をＨｉｎｄII
I で部分消化した後ＢａｍＨＩで完全消化して約２，９
００ｂｐのＤＮＡ断片を単離した。このＤＮＡ断片をＴ
ＭＪ２と称した。この２，９００ｂｐのＤＮＡ断片と上
記の如く調製したベクターとをＴ₄ＤＮＡリガーゼを用
いて継ぎ合わせ、プラスミドｐＳＶ２ＴＭＪ２を得た。
プラスミドｐＳＶ２ＴＭＪ２を構築する工程を図１４に
示す。得られたプラスミドｐＳＶ２ＴＭＪ２については
ブダペスト条約の規定に基き、アメリカン タイプ カ
ルチャー コレクション（ＡＴＣＣ）に寄託番号第６７
２８３号として寄託されている。

【０１２６】（２）プラスミドｐＳＶ２ＴＭＤ１の構築 （ａ）ＤＮＡ断片ＴＭＤ１の作製 前記工程（１）で得られたプラスミドｐＳＶ２ＴＭＪ２
をＮｃｏＩで完全消化した後、切断末端をＥ．ｃｏｌｉ
ＤＮＡポリメラーゼを用いて平滑末端にした。次いで
ＨｉｎｄIII で完全消化して約１９００ｂｐのＤＮＡ断
片を得た。得られたＤＮＡ断片をＴＭＪ３と称した。一
方、ファージＭ−１３ｍｐ１９（宝酒造社製、日本、カ
タログ番号３１１９）をＨｉｎｄIII 及びＨｉｎｃIIで
消化してベクターを調製した。このベクターにＤＮＡ断
片ＴＭＤ３を挿入して組換え体プラスミドＭ−１３ｍｐ
１９ＴＭＪ３を得た。

【０１２７】また別途、下記の塩基配列を有する削除用
ＤＮＡプローブ〔以下“ディリーター（ｄｅｌｅｔｅ
ｒ）”と称する〕を有機合成した： ５′−ＧＧＡＧＧＣＣＧＣＴＣＡＧＣＣＣＧＡＡＴＧＣＡＣＧ−３′(25 mer)。 合成ディリーターをＴＭＤと称した。このようにして作
成したディリーターＴＭＤを用い、メソッド イン エ
ンザイモロジー（Ｍｅｔｈｏｄ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ
ｏｇｙ）、第１００巻、４６８頁、（１９８３年）、ア
カデミックプレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ）に
記載の方法に従って部位特異的変異の手法で前記の如く
得られた組換え体プラスミドＭ−１３ｍｐ１９ＴＭＪ１
３の１７７塩基からなる部分の削除を行った。

【０１２８】即ち、２５ｐｍｏｌのディリーターＴＭＤ
および１０ｐｍｏｌのＭ１３プライマーＭ３（ユニバー
サルプライマー、宝酒造社製、日本、カタログ番号３８
３１）の５′末端をＴ₄ キナーゼを用いてリン酸化した
後、０．５ｐｍｏｌの組換え体プラスミドＭ１３ｍｐ１
９ＴＭＪ３のシングルストランドＤＮＡを加え、９５℃
で５分間加熱後、室温にまで冷却した。次いで５単位の
Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＮＡポリメラーゼ１（Ｋｌｅｎｏｗ
Ｆｒａｇｍｅｎｔ）、及び１０単位のＴ₄ ＤＮＡリガー
ゼを混合物に加えて３７℃で３０分間インキュベートし
て混合物中に組換え体プラスミドを生成させた。

【０１２９】得られた混合物をイー コリ（Ｅ．ｃｏｌ
ｉ）ＪＭ１０５（ファルマシア社製、スウェーデン、カ
タログ番号２７−１５５０）に加えた。それによって、
このイー コリを組換え体プラスミドでトランスフェク
ションした。３７℃で一夜培養して生じた寒天培地上の
プラークをニトロセルロースフィルターに移しとり、８
０℃で２時間加熱後、プレハイブリダイゼーションを行
った。プレハイブリダイゼーションは６×ＳＥＴ〔０．
９Ｍ ＮａＣｌ、１８０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ８．
０）、６ｍＭ ＥＤＴＡ〕、５×Ｄｅｎｈａｒｔｓ’
〔０．１％（ｗ／ｖ）フィコール（Ｆｉｃｏｌｌ）、
０．１％（ｗ／ｖ）ポリビニルピロリドン、０．１％
（ｗ／ｖ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）〕、０．１
％ＳＤＳ，１００μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡを含む
溶液中で５５℃、２時間加温することにより実施した。

【０１３０】次いで上記の溶液中の変性サケ精子ＤＮＡ
のかわりに³²ＰでラベルしたＴＭＤを加えた溶液を用い
てハイブリダイゼーション反応を５５℃、２時間実施し
た。次いで６×ＳＳＣ（０．９Ｍ食塩、０．０９Ｍクエ
ン酸三ナトリウムの水溶液）を用いてニトロセルロース
フィルターを洗浄した。洗浄は室温で、５分間、２回洗
った後、５５℃、６５℃、７５℃、と段階的に温度を上
げていって、それぞれ５分間２回ずつ洗った。Ｘ線フィ
ルムＸＡＲ−５（イーストマン コダック社製、米国）
を得られたニトロセルロースフィルターに密着させて−
８０℃、一夜露出させたところ、Ｘ線フイルム上に強く
露光した黒いスポットが数１０個検出された。

【０１３１】各スポットは組換え体プラスミドで感染し
たクローンに対応するものである。そのうち、６クロー
ンを選択し、各クローンの組換え体プラスミドを単離し
て制限酵素解析、及び塩基配列の解析を行ったところ、
これらのクローンの保有する組換え体プラスミドは制限
部位と塩基配列がそれぞれ同一であることがわかった。
得られた組換え体プラスミドをＭ１３−ＴＭＤ１と称し
た。さらにこの組換え体プラスミドＭ１３−ＴＭＤ１
は、開始コドン（ＡＴＧ）と、その下流に４９８個のア
ミノ酸からなる本発明のペプチドをコードする塩基配列
を含む塩基配列を含有するＤＮＡ断片を有することがわ
かった。この組換え体プラスミドＭ１３−ＴＭＤ１に含
まれるＤＮＡ断片をＴＭＤ１と称した。図１５に組換え
体プラスミドＭ−１３ｍｐ１９ＴＭＪ３とディリータ−
ＴＭＤとがハイブリダイズし、ＤＮＡ断片ＴＭＪ３に対
応するＤＮＡ領域の一部が削除されるところを示す。

【０１３２】（ｂ）プラスミドｐＳＶ２ＴＭＤ１の構築 実施例１−（２）−（ａ）で作製した組換え体プラスミ
ドＭ１３−ＴＭＤ１をＨｉｎｄIII およびＢａｍＨＩで
完全消化してＴＭＤ１の約１９００ｂｐ ＤＮＡ断片を
単離した。一方、プラスミドｐＳＶ２−ｄｈｆｒ（ＡＴ
ＣＣ ３７１４６）をＨｉｎｄIII 及びＢｇl IIで完全
消化してベクターを得た。このベクターとＤＮＡ断片Ｔ
ＭＤ１とをＴ₄ ＤＮＡリガーゼを用いて継ぎあわせ、プ
ラスミドｐＳＶ２ＴＭＤ１を得た。

【０１３３】（３）プラスミドｐＳＶ２ＴＭＤ２の構築 （ａ）ＤＮＡ断片ＴＭＤ２の作製 下記の塩基配列： ５′−ＣＴＣＣＡＣＧＣＴＧＣＡＧＧＧＧＡＡＣＣＣＣ
ＡＧＧ−３′（２５ｍｅｒ）を有するディリーターＴＭ
ｄ₂ をディリーターＴＭＤの代わりに削除用ＤＮＡプロ
ーブとして用いる以外は、実施例１−（２）−（ａ）と
実質的に同様の方法を繰り返して、ＴＭＤ２と称するＤ
ＮＡ断片を含む組換え体プラスミドＭ１３−ＴＭＤ２を
得た。ＤＮＡ断片ＴＭＤ２は実施例１−（２）−（ａ）
で得られたＤＮＡ断片ＴＭＤ１の５′末端から６７８ｂ
ｐのＤＮＡが削除された構造を有する。このＤＮＡ断片
ＴＭＤ２は開始コドン（ＡＴＧ）と、その下流に２７２
個のアミノ酸からなる本発明のペプチドをコードする塩
基配列を含む塩基配列を有していた。図１６に組換え体
プラスミドＭ１３−ＴＭＤ１とディリーターＴＭｄ₂と
がハイブリダイズし、ＤＮＡ断片ＴＭＤ１に対応するＤ
ＮＡ領域の一部が削除されるところを示す。

【０１３４】（ｂ）プラスミドｐＳＶ２ＴＭＤ２の構築 実施例１−（３）−（ａ）で作製した組換え体プラスミ
ドＭ１３−ＴＭＤ２をＨｉｎｄIII およびＢａｍＨＩで
完全消化してＴＭＤ２の約１２００ｂｐＤＮＡ断片を単
離した。一方、プラスミドｐＳＶ２−ｄｈｆｒ（ＡＴＣ
Ｃ ３７１４６）をＨｉｎｄIII 及びＢｇl IIで完全消
化してベクターを得た。このベクターとＤＮＡ断片ＴＭ
Ｄ２とをＴ₄ ＤＮＡリガーゼを用いて継ぎあわせ、プラ
スミドｐＳＶ２ＴＭＤ２を得た。

【０１３５】（４）プラスミドｐＳＶ２ＴＭＤ４の作製 （ａ）ＤＮＡ断片ＴＭＤ３の作製 前記工程（１）で得られたプラスミドｐＳＶ２ＴＭＪ２
をＮｃｏＩで完全消化した後、切断末端をＥ．ｃｏｌｉ
ＤＮＡポリメラーゼを用いて平滑末端にした。次いで
ＨｉｎｄIII で完全消化して約１，９００ｂｐのＤＮＡ
断片を得た。得られたＤＮＡ断片をＴＭＪ３と称した。
一方、ファージＭ−１３ｍｐ１９（宝酒造社製、日本、
カタログ番号３１１９）のＨｉｎｄIII 及びＨｉｎｃII
で消化してベクターを調製した。このベクターにＤＮＡ
断片ＴＭＪ３を挿入して組換え体プラスミドＭ−１３ｍ
ｐ１９ＴＭＪ３を得た。

【０１３６】また別途、下記の塩基配列を有するディリ
ーターを有機合成した： ５′−ＧＧＡＧＧＣＣＧＣＴＣＡＡＣＡＧＴＣＧＧＴＧＣＣＡ−３′(25 mer)。 合成ディリーターをＴＭｄ₃と称した。このようにして
作製したディリーターをＴＭｄ₃ 用い、メソッド イン
エンザイモロジー（Ｍｅｔｈｏｄ ｉｎ Ｅｎｚｙｍ
ｏｌｏｇｙ）、第１００巻、４６８頁、（１９８３
年）、アカデミック プレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒ
ｅｓｓ）に記載の方法にしたがって部位特異的変異の手
法で前記の如く得られた組換え体プラスミドＭ−１３ｍ
ｐ１９ＴＭＪ３の２８５ｂｐからなる部分の削除を行っ
た。

【０１３７】即ち、２５ｐｍｏｌのディリーターＴＭｄ
₃ 及び１０ｐｍｏｌのＭ１３プライマーＭ３（ユニバー
サルプライマー、宝酒造社製、日本、カタログ番号３８
３１）の５′末端をＴ₄ キナーゼを用いてリン酸化した
後、０．５ｐｍｏｌの組換えプラスミドＭ１３ｍｐ１９
ＴＭＪ３のシングルストランドＤＮＡを加え、９５℃で
５分間加熱後、室温にまで冷却した。次いで５単位の
Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＮＡポリメラーゼ１（Ｋｌｅｎｏｗ
Ｆｒａｇｍｅｎｔ）、及び１０単位のＴ₄ ＤＮＡリガー
ゼを混合物に加えて３７℃で３０分間インキュベートし
て混合物中に組換え体プラスミドを生成させた。

【０１３８】得られた混合物をイー コリ（Ｅ．ｃｏｌ
ｉ）ＪＭ１０５（ファルマシア社製、スウェーデン、カ
タログ番号２７−１５５０）に加えた。それによりイー
コリを組換え体プラスミドでトランスフェクションし
た。３７℃で一夜培養して生じた寒天培地上のプラーク
をニトロセルロースフィルターに移しとり、８０℃で２
時間加熱後、プレハイブリダイゼーションを行った。プ
レハイブリダイゼーションは、６×ＳＥＴ〔０．９Ｍ
ＮａＣｌ、１８０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ８．０）、６
ｍＭ ＥＤＴＡ〕、５×Ｄｅｎｈａｒｔｓ’〔０．１％
（ｗ／ｖ）フィコール（Ｆｉｃｏｌｌ）、０．１％（ｗ
／ｖ）ポリビニルピロリドン、０．１％（ｗ／ｖ）ウシ
血清アルブミン（ＢＳＡ）〕、０．１％ＳＤＳ，１００
μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡを含む溶液中で５５℃、
２時間加温することにより実施した。

【０１３９】次いで、上記の溶液中の変性サケ精子ＤＮ
Ａのかわりに³²ＰでラベルしたＴＭｄ₃ を加えた溶液を
用いてハイブリダイゼーション反応を５５℃、２時間実
施した。次いで６×ＳＳＣ（０．９Ｍ食塩、０．０９Ｍ
クエン酸三ナトリウムの水溶液）を用いてニトロセルロ
ースフィルターを洗浄した。洗浄は室温で、５分間、２
回洗った後、５５℃、６５℃、７５℃、と段階的に温度
を上げていって、それぞれ５分間２回ずつ洗った。Ｘ線
フィルムＸＡＲ−５（イーストマン コダック社製、米
国）を得られたニトロセルロースフィルターに密着させ
て−８０℃、一夜露出させたところ、Ｘ線フィルム上に
強く露光した黒いスポットが数１０個検出された。

【０１４０】各スポットは組換え体プラスミドで感染し
たクローンに対応するものである。そのうち、６クロー
ンを選択し、各クローンの組換え体プラスミドを単離し
て制御酵素解析、及び塩基配列の解析を行ったところ、
これらのクローンの保有する組換え体プラスミドは制限
部位と塩基配列がそれぞれ同一であることがわかった。
得られた組換え体プラスミドをＭ１３−ＴＭＤ３と称し
た。更にこの組換え体プラスミドＭ１３−ＴＭＤ３は、
開始コドン（ＡＴＧ）と、その下流に４６２個のアミノ
酸からなるペプチドをコードする塩基配列（配列番号１
５の１−１３８６の塩基配列）を含有するＤＮＡ断片を
有することがわかった。この組換え体プラスミドＭ１３
−ＴＭＤ３に含まれるＤＮＡ断片をＴＭＤ３と称した。
図１７に組換え体プラスミドＭ−１３ｍｐ１９ＴＭＪ３
とディリーターＴＭｄ₃ とがハイブリダイズし、ＤＮＡ
断片ＴＭＪ３に対応するＤＮＡ領域の一部が削除される
ところを示す。

【０１４１】（ｂ）ＤＮＡ断片ＴＭＤ４の作製 部位特異的変異の手法を用いてディリーターＴＭｄ₃ の
代わりに実施例１−（３）−（ａ）で得られたディリー
ターＴＭｄ₂ を用いる以外は、実施例１−（４）−
（ａ）と実質的に同様の方法で、上述の如く得られた組
換え体プラスミドＭ１３−ＴＭＤ３の一部を削除して、
ＴＭＤ４と称するＤＮＡ断片を含む組換え体プラスミド
Ｍ１３−ＴＭＤ４を得た。ＤＮＡ断片ＴＭＤ４は実施例
１−（４）−（ａ）で得られたＤＮＡ断片ＴＭＤ３の
５′末端から６７８ｂｐのＤＮＡが削除された構造を有
する。このＤＮＡ断片ＴＭＤ４は開始コドン（ＡＴＧ）
と、その下流に２３６個のアミノ酸からなる本発明のペ
プチドをコードする塩基配列を含む塩基配列を有してい
た。図１８に組換え体プラスミドＭ１３−ＴＭＤ３とデ
ィリーターＴＭｄ₂ とがハイブリダイスし、ＤＮＡ断片
ＴＭＤ３に対応するＤＮＡ領域の一部が削除されるとと
ころを示す。

【０１４２】（ｃ）プラスミドｐＳＶ２ＴＭＤ４の構築 実施例１−（４）−（ｂ）で作製した組換え体プラスミ
ドＭ１３−ＴＭＤ４をＨｉｎｄIII 及びＢａｍＨＩで完
全消化してＴＭＤ４の約１１００ｂｐＤＮＡ断片を単離
した。一方、プラスミドｐＳＶ２−ｄｈｆｒ（ＡＴＣＣ
３７１４６）をＨｉｎｄIII 及びＢｇl IIで完全消化
してベクターを得た。このベクターとＤＮＡ断片ＴＭＤ
４とをＴ₄ ＤＮＡリガーゼを用いて継ぎあわせ、プラス
ミドｐＳＶ２ＴＭＤ４を得た。

【０１４３】（５）プラスミドｐＳＶ２ＴＭＤ５の構築 （ａ）ＤＮＡ断片ＴＭＤ５の作製 下記の塩基配列： ５′−ＣＡＣＧＧＧＣＴＣＣＡＣＧＧＧＧＡＡＣＣＣＣ
ＡＧＧ−３′（２５ｍｅｒ）を有するディリーターＴＭ
ｄ₄ をディリーターＴＭｄ₂ の代わりに削除用ＤＮＡプ
ローブとして用いる以外は、実施例１−（４）−（ｂ）
と実質的に同様の方法を繰り返して、ＴＭＤ５と称する
ＤＮＡ断片を含む組換え体プラスミドＭ１３−ＴＭＤ５
を得た。ＤＮＡ断片ＴＭＤ５を実施例１−（４）−
（ａ）で得られたＤＮＡ断片ＴＭＤ３の５′末端から１
０３２ｂｐのＤＮＡが削除された構造を有する。このＤ
ＮＡ断片ＴＭＤ５は開始コドン（ＡＴＧ）と、その下流
に１１８個のアミノ酸からなる本発明のペプチドをコー
ドする塩基配列を含む塩基配列を有していた。図１９に
組換え体プラスミドＭ１３−ＴＭＤ３とディリーターＴ
Ｍｄ₄ とがハイブリダイズし、ＤＮＡ断片ＴＭＤ３に対
応するＤＮＡ領域の一部が削除されるところを示す。

【０１４４】（ｂ）プラスミドｐＳＶ２ＴＭＤ５の構築 実施例１−（５）−（ａ）で作製した組換え体プラスミ
ドＭ１３−ＴＭＤ５をＨｉｎｄIII 及びＢａｍＨＩで完
全消化してＴＭＤ５の約７４０ｂｐ ＤＮＡ断片を単離
した。一方、プラスミドｐＳＶ２−ｄｈｆｒ（ＡＴＣＣ
３７１４６）をＨｉｎｄIII 及びＢｇl IIで完全消化
してベクターを得た。このベクターとＤＮＡ断片ＴＭＤ
５とをＴ₄ ＤＮＡリガーゼを用いて継ぎあわせ、プラス
ミドｐＳＶ２ＴＭＤ５を得た。

【０１４５】実施例２ （プラスミドｐＳＶ２ＴＭＤ５によるＣＯＳ−１細胞の
形質転換） ＣＯＳ−１細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１６５０）を培養器
中に入れた１０％（ｖ／ｖ）のウシ胎児血清（以下“Ｆ
ＣＳ”と略する）を加えたダルベッコの最小必須培地
（以下“ＭＥＭ”と略する）〔フローラボラトリ（Ｆｌ
ｏｗ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）社製、米国、カタロ
グ番号１０−３３１）〕を用いて、３７℃で５％炭酸ガ
スインキューベーター中で対数増殖期になるまで培養
し、０．１％トリプシン及び０．０２％ＥＤＴＡを用い
て培養器に付着増殖した細胞を培養器よりはがして、ハ
ンクス平衡塩類溶液〔フローラボラトリー（Ｆｌｏｗ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）社製、米国、カタログ番号
１７−１０１−２２〕に約１×１０⁷ 個／ｍｌの濃度に
なるように懸濁した。

【０１４６】実施例１−（５）で得られたプラスミドｐ
ＳＶ２ＴＭＤ５を約２μｇ／μｌになるように１ｍＭト
リス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）に懸濁した。約１０μｇ
のプラスミドｐＳＶ２ＴＭＤ５を含む得られたプラスミ
ド懸濁液５μｌを１．５ｍｌ容量のエッペンドルフ型試
験管に入れ、次いでこの試験管に上述の如く得られたＣ
ＯＳ−１細胞の細胞懸濁液２００μｌを入れて、０℃で
１０分間放置した。試験管内の懸濁液を米国Ｄ．Ｅ．
Ｐ．ＳＹＳＴＥＭ社製細胞融合装置ＦＰＨ１００１型の
キュベットに移し、１．２ｋＶで４０μ秒の条件で２回
電気パルスを与えた。その後懸濁液を再び元のエッペン
ドルフ型試験管に移し、０℃で５分間放置した後、１０
％（ｖ／ｖ）ＦＣＳを加えたダルベッコのＭＥＭ１０ｍ
ｌを以下のように用いて直径１０ｃｍの組織培養用プレ
ートに移した。即ち、少量の１０％（ｖ／ｖ）ＦＣＳを
含むダルベッコのＭＥＭを懸濁液に加えてその混合物を
組織培養用プレートに移した。次いで、試験管を残りの
ダルベッコのＭＥＭで数回洗浄して洗浄液を同じプレー
トに加えた。その後、プレートは５％ＣＯ₂ 存在下３７
℃で２４時間培養した。

【０１４７】（トロンビンによるプロテインＣ活性化を
促進する作用の確認） 培養終了後、プレートの培地をＦＣＳを含まないダルベ
ッコのＭＥＭに交換し、４８時間培養した。培養上澄液
を５μｌ採取し、これを試料として参考例１に記載した
方法で、プロテインＣ活性化の促進作用を測定した。更
に、直径１０ｃｍの組織培養用プレート１枚分の細胞を
米国コースター（Ｃｏａｓｔｅｒ）社製セルスクレイパ
ー（Ｃｅｌｌ Ｓｃｒａｐｅｒ）（カタログ番号３０１
０）を用いて掻き取って集め、８００ｒｐｍ、１０分間
の条件で遠心分離して集める。このペレットを試料とし
て用いて参考例１に記載した方法でプロテインＣの活性
化を促進する作用を測定した。またコントロールとして
はプラスミドｐＳＶ２−ｄｈｆｒでトランスフォームし
たＣＯＳ−１細胞の培養上澄液及び細胞ペレットを試料
として用いた。結果を表１に示した。表中に示す吸光度
の数値は試料の吸光度を組織培養用プレート１枚分に換
算したものである。

【０１４８】

【表１】 ┌─────────────────────────────────┐ │ プラスミド 試料 吸光度 │ ├─────────────────────────────────┤ │ ｐＳＶ２ＴＭＤ５ 培養上澄液 ４３００ │ │ （本発明） 細胞ペレット ６．９ │ │ ｐＳＶ２−ｄｈｆｒ 細胞上澄液 検出されず │ │ （コントロール） 細胞ペレット 検出されず │ └─────────────────────────────────┘

【０１４９】実施例３ （プラスミドｐＳＶ２ＴＭＤ４によるＣＯＳ−１細胞の
形質転換および形質転換細胞の産生するペプチドのトロ
ンビンによるプロテインＣ活性化の促進作用の測定） プラスミドｐＳＶ２ＴＭＤ４を用いる以外は実施例２と
同様の操作を行い、プラスミドｐＳＶ２ＴＭＤ４によっ
て形質転換された細胞の産生するペプチドのトロンビン
によるプロテインＣ活性化の促進作用を測定した。その
結果を表２に示した。表中に示す吸光度の数値は試料の
吸光度を組織培養用プレート１枚分に換算したものであ
る。

【０１５０】

【表２】 ┌─────────────────────────────────┐ │ プラスミド 試料 吸光度 │ ├─────────────────────────────────┤ │ ｐＳＶ２ＴＭＤ４ 培養上澄液 ４２００ │ │ （本発明） 細胞ペレット ６．８ │ │ ｐＳＶ２−ｄｈｆｒ 培養上澄液 検出されず │ │ （コントロール） 細胞ペレット 検出されず │ └─────────────────────────────────┘

【０１５１】実施例４ （プラスミドｐＳＶ２ＴＭＤ２によるＣＯＳ−１細胞の
形質転換および形質転換細胞の産生するペプチドのトロ
ンビンによるプロテインＣ活性化の促進作用の測定） プラスミドｐＳＶ２ＴＭＤ２を用いる以外は実施例２と
同様の操作を行い、プラスミドｐＳＶ２ＴＭＤ２によっ
て形質転換された細胞の産生するペプチドのトロンビン
によるプロテインＣ活性化の促進作用を測定した。その
結果を表３に示した。表中に示す吸光度の数値は試料の
吸光度を組織培養用プレート１枚分に換算したものであ
る。

【０１５２】

【表３】 ┌─────────────────────────────────┐ │ プラスミド 試料 吸光度 │ ├─────────────────────────────────┤ │ ｐＳＶ２ＴＭＤ２ 培養上澄液 ４０００ │ │ （本発明） 細胞ペレット ７．０ │ │ ｐＳＶ２−ｄｈｆｒ 細胞上澄液 検出されず │ │ （コントロール） 細胞ペレット 検出されず │ └─────────────────────────────────┘

【０１５３】実施例５ （プラスミドｐＳＶ２ＴＭＤ１によるＣＯＳ−１細胞の
形質転換および形質転換細胞の産生するペプチドのトロ
ンビンによるプロテインＣ活性化の促進作用の測定） プラスミドｐＳＶ２ＴＭＤ１を用いる以外は実施例２と
同様の操作を行い、プラスミドｐＳＶ２ＴＭＤ１によっ
て形質転換された細胞の産生するペプチドのトロンビン
によるプロテインＣ活性化の促進作用を測定した。その
結果を表４に示した。表中に示す吸光度の数値は試料の
吸光度を組織培養用プレート１枚分に換算したものであ
る。

【０１５４】

【表４】 ┌─────────────────────────────────┐ │ プラスミド 試料 吸光度 │ ├─────────────────────────────────┤ │ ｐＳＶ２ＴＭＤ１ 培養上澄液 （ＦＣＳ＋） ６００ │ │ （本発明） （ＦＣＳ−） １２００ │ │ 細胞ペレット（ＦＣＳ＋） １．８ │ │ （ＦＣＳ−） ３．６ │ │ ｐＳＶ２−ｄｈｆｒ 培養上澄液 （ＦＣＳ＋） 検出されず │ │ （コントロール） （ＦＣＳ−） 検出されず │ │ 細胞ペレット（ＦＣＳ＋） 検出されず │ │ （ＦＣＳ−） 検出されず │ └─────────────────────────────────┘

【０１５５】実施例６ （プラスミドｐＳＶ２ＴＭＪ２によるＣＯＳ−１細胞の
形質転換および形質転換細胞の産生するペプチドのトロ
ンビンによるプロテインＣ活性化の促進作用の測定） プラスミドｐＳＶ２ＴＭＪ２を用いる以外は、実施例２
と同様の操作を行い、プラスミドｐＳＶ２ＴＭＪ２によ
って形質転換された細胞の産生するペプチドのトロンビ
ンによるプロテインＣ活性化の促進作用を測定した。そ
の結果、細胞ペレットの試料が強いプロテインＣ活性化
促進作用を示し、生成したプロテインＣの量は約３００
ｎｇであった。一方、コントロールとして用いたプラス
ミドｐＳＶ２−ｄｈｆｒでトランスフォームした細胞で
はこの活性は検出されなかった。

【０１５６】実施例７ （プラスミドｐＳＶ２ＴＭＤ５によるＣＨＯ細胞の形質
転換と形質転換細胞における発現） 約４μｇのプラスミドｐＳＶ−２−ｎｅｏ（ＡＴＣＣ
３７１５０）、及び約２０μｇの実施例１−（５）で作
成したプラスミドｐＳＶ２ＴＭＤ５を混合してエタノー
ル沈殿した。沈殿物を風乾後、４５０μｌのＴＥ（ｐＨ
７．９、１ｍＭトリス塩酸緩衝液、０．１ｍＭ ＥＤＴ
Ａ）に溶解し、５００μｌの２×ＨＢＳ（５０ｍＭ Ｈ
ＥＰＥＳ、２８０ｍＭ ＮａＣｌ、１．５ｍＭ Ｎａ₂
ＨＰＯ₄、ｐＨ７．１２）を加えた。次いで５０μｌの
２．５Ｍ ＣａＣｌ₂ を滴下し室温に１０分間放置し
た。

【０１５７】一方、１０％（ｖ／ｖ）ＦＣＳ及び１ｖ／
ｖ％ペニシリン−ストレプトマイシン（フローラボラト
リー社製、米国、カタログ番号１６−７００−４９）を
含有するＨａｍ’ｓＦ−１２培地（フローラボラトリー
社製、米国、カタログ番号１０−４２１−２０）を用い
て直径６ｃｍの組織培養用プレートにプレート１枚当た
り細胞数約５×１０² 程度播種したＣＨＯ−ＫＩ株（Ａ
ＴＣＣ ＣＣＬＤ ６１）を１夜培養し、培地を新鮮な
培地に交換し、更に３時間培養した。このＣＨＯ−ＫＩ
に前述のＣａＣｌ₂ を滴下したプラスミドＤＮＡ溶液を
重層し、３７℃で約８時間培養した。５ｍｌのＰＢＳ
（−）（フローラボラトリー社製、米国、カタログ番号
２８−１０３−０５）を用いて２回洗浄し、さらに、５
ｍｌの前述の培地で洗浄後、新鮮な培地を加えて約１６
時間さらに培養した。プレートに付着した細胞を０．２
５％トリプシン、０．０２％ＥＤＴＡ溶液を用いてはが
し、直径１０ｃｍの組織培養プレート４枚に広げて培養
した。２４時間後、培地を選択培地に交換した。

【０１５８】選択培地の組成は前述の培地に４００μｇ
／ｍｌになる様にジェネティシンＣ−４１８（ＧＩＢＣ
Ｏ社製、米国、カタログ番号８６０−１８１１）を添加
したものである。３〜４日おきに培地交換を行いながら
約２週間培養して、トランスフォームした細胞をクロー
ニングした。この操作で得られた細胞のクローンをそれ
ぞれ直径１０ｃｍの組織培養プレートでコンフルエント
になるまで生育させた。途中、培地のＦＣＳ濃度を１０
％から１％に減らした培地に切り換えて培養した。この
ＦＣＳ含有選択培地で培養した培養液５０μｌをとり、
これを用いて参考例１に記載した方法でプロテインＣ活
性化を促進する作用を測定したところ、強いプロテイン
Ｃ活性化促進作用が認められた。一方、コントロールと
して用いたプラスミドｐＳＶ２−ｎｅｏだけでトランス
フォームした細胞では本活性は検出されなかった。

【０１５９】実施例８ （プラスミドｐＳＶ２ＴＭＤ４によるＣＨＯ細胞の形質
転換及び形質転換細胞の産生するペプチドのトロンビン
によるプロテインＣ活性化の促進作用の測定） プラスミドｐＳＶ２ＴＭＤ４を用いる以外は実施例７と
同様の操作を行い、プラスミドｐＳＶ２ＴＭＤ４によっ
て形質転換された細胞の産生するペプチドのトロンビン
によるプロテインＣ活性化の促進作用を測定したところ
強いプロテインＣ活性化促進作用が認められた。一方、
コントロールとして用いたプラスミドｐＳＶ２−ｎｅｏ
だけでトランスフォームした細胞では、本活性は検出さ
れなかった。

【０１６０】実施例９ （プラスミドｐＳＶ２ＴＭＤ２によるＣＨＯ細胞の形質
転換及び形質転換細胞の産生するペプチドのトロンビン
によるプロテインＣ活性化の促進作用の測定） プラスミドｐＳＶ２ＴＭＤ２を用いる以外は、実施例７
と同様の操作を行い、プラスミドｐＳＶ２ＴＭＤ２によ
って形質転換された細胞の産生するペプチドのトロンビ
ンによるプロテインＣ活性化の促進作用を測定したとこ
ろ強いプロテインＣ活性化促進作用が認められた。一
方、コントロールとして用いたプラスミドｐＳＶ２−ｎ
ｅｏだけでトランスフォームした細胞では、本活性は検
出されなかった。

【０１６１】実施例１０ （プラスミドｐＳＶ２ＴＭＤ１によるＣＨＯ細胞の形質
転換及び形質転換細胞の産生するペプチドのトロンビン
によるプロテインＣ活性化の促進作用の測定） プラスミドｐＳＶ２ＴＭＤ１を用いる以外は、実施例７
と同様の操作を行い、プラスミドｐＳＶ２ＴＭＤ１によ
って形質転換された細胞の産生するペプチドのトロンビ
ンによるプロテインＣ活性化の促進作用を測定したとこ
ろ強いプロテインＣ活性化促進作用が認められた。一
方、コントロールとして用いたプラスミドｐＳＶ２−ｎ
ｅｏだけでトランスフォームした細胞では、本活性は検
出されなかった。

【０１６２】実施例１１ （プラスミドｐＳＶ２ＴＭＪ２によるＣＨＯ細胞の形質
転換及び形質転換細胞の産生するペプチドのトロンビン
によるプロテインＣ活性化の促進作用の測定） 約４μｇのプラスミドｐＳＶ−２−ｎｅｏ（ＡＴＣＣ
３７１５０）、及び約２０μｇの実施例１で作成したプ
ラスミドｐＳＶ２ＴＭＪ２を混合してエタノール沈殿し
た。沈殿物を風乾後、４５０μｌのＴＥ（ｐＨ７．９、
１ｍＭトリス塩酸緩衝液、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ）に溶
解し、５００μｌの２×ＨＢＳ（５０ｍＭ ＨＥＰＥ
Ｓ、２８０ｍＭ ＮａＣｌ、１．５ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ
４、ｐＨ７．１２）を加えた。次いで５０μｌの２．５
Ｍ ＣａＣｌ₂ を滴下し室温に１０分間放置した。

【０１６３】一方、１０％（ｖ／ｖ）ＦＣＳ及び１ｖ／
ｖ％ペニシリン−ストレプトマイシン（フローラボラト
リー社製、米国、カタログ番号１６−７００−４９）を
含有するＨａｍ’ｓＦ−１２培地（フローラボラトリー
社製、米国、カタログ番号１０−４２１−２０）を用い
て直径６ｃｍの組織培養用プレートにプレート１枚当た
り細胞数約５×１０² 程度播種したＣＨＯ−ＫＩ株（Ａ
ＴＣＣ ＣＣＬＤ ６１）を１夜培養し、培地を新鮮な
培地に交換し、更に３時間培養した。このＣＨＯ−ＫＩ
に前述のＣａＣｌ₂ を滴下したプラスミドＤＮＡ溶液を
重層し、３７℃で約８時間培養した。５ｍｌのＰＢＳ
（−）（フローラボラトリー社製、米国、カタログ番号
２８−１０３−０５）を用いて２回洗浄し、さらに、５
ｍｌの前述の培地で洗浄後、新鮮な培地を加えて約１６
時間さらに培養した。

【０１６４】プレートに付着した細胞を０．２５％トリ
プシン、０．０２％ＥＤＴＡ溶液を用いてはがし、直径
１０ｃｍの組織培養プレート４枚に広げて培養した。２
４時間後、培地を選択培地に交換した。選択培地の組成
は前述の培地に４００μｇ／ｍｌになる様にジェネティ
シンＣ−４１８（米国ＧＩＢＣＯ社製、カタログ番号８
６０−１８１１）を添加したものである。３〜４日おき
に培地交換を行いながら約２週間培養して、トランスフ
ォームした細胞をクローニングした。この操作で得られ
た細胞のクローンをそれぞれ直径１０ｃｍの組織培養プ
レートでコンフルエントになるまで生育させた。途中、
培地のＦＣＳ濃度を１０％から１％に減らした培地に切
り換えて培養した。

【０１６５】プラスミドｐＳＶ２ＴＭＪ２によって形質
転換された細胞の産生するペプチドのトロンビンによる
プロテインＣ活性化の促進作用を細胞ペレットを試料と
して用いて測定したところ強いプロテインＣ活性化促進
作用が認められた。一方、コントロールとして用いたプ
ラスミドｐＳＶ２−ｎｅｏだけで形質転換した細胞及び
その培養上澄液では本活性は検出されなかった。

【０１６６】実施例１２ （プラスミドｐＳＶ２ＴＭＤ５によるＣ₁₂₇ Ｉ細胞の形
質転換および形質転換細胞の産生するペプチドのトロン
ビンによるプロテインＣ活性化の促進作用の測定） 実施例１−（５）で作成したプラスミドｐＳＶ２ＴＭＤ
５をＨｉｎｄIII で完全消化した後、切断末端をＤＮＡ
ポリメラーゼを用いて平滑末端にし、Ｔ₄ ＤＮＡリガー
ゼを作用させ、プラスミドｐＳＶ２ＴＭＤ５のＨｉｎｄ
III サイトを欠失したプラスミドｐＳＶ２ＴＭＤ５−１
を得た。次いでこのプラスミドｐＳＶ２ＴＭＤ５−１を
ＰｖｕII及びＢａｍＨＩで完全消化して約１７００ｂｐ
のＤＮＡ断片を得た。これをプラスミドｐＵＣ１８のＨ
ｉｎｃII及びＢａｍＨＩで完全消化したベクターに挿入
してプラスミドｐＵＣＴＭＤ５−１を得た。

【０１６７】一方、プラスミドｐＢＲ３２２（ＡＴＣＣ
３７０１７）からコバスルビアスらの方法〔エル コ
バスルビアス（Ｌ．Ｃｏｖａｓｒｕｂｉａｓ ｅｔ ａ
ｌ）、ジーン（Ｇｅｎｅ）、１３、２５、（１９８１
年）にしたがってプラスミドｐＢＲ３２７を作製した。
得られたプラスミドｐＢＲ３２７をＢａｍＨＩ及びＨｉ
ｎｄIII で消化して得た約２９６０ｂｐのＤＮＡ断片
に、プラスミドｐＵＣＴＭＤ５−１をＢａｍＨＩ及びＨ
ｉｎｄIII で完全消化して得た約２６００ｂｐのＤＮＡ
断片を挿入してプラスミドｐＢＲＴＭＤ５−１を得た。
このプラスミドｐＢＲＴＭＤ５−１をＨｉｎｄIII で完
全消化したものとプラスミドｐＢＰＶ−１（９−１）
（ＡＴＣＣ ３７１１１）をＨｉｎｄIII で完全消化し
て得た断片とをＴ₄ＤＮＡリガーゼを用いて継いで、Ｃ
₁₂₇細胞発現用のプラスミドｐｄＢＰＶＴＭＤ５−１を
得た。以上の工程を図２０〜図２１に示す。

【０１６８】次に、実施例７に記載の方法に準じてｐｄ
ＢＰＶＴＭＤ５−１でＣ₁₂₇Ｉ細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ
１６１６）をトランスフォームした。１０％ＦＣＳ及び
１ｖ／ｖ％ペニシリン−ストレプトマイシン（フローラ
ボラトリー社製、米国、カタログ番号１６−７００−４
９）を含むダルベッコのＭＥＭで約３週間培養したとこ
ろ、フォーカスを形成する細胞が、６個得られたのでそ
れぞれの細胞をクローニングして、それぞれ直径１０ｃ
ｍの組織培養用プレートでコンフルエントになるまで生
育させた。その後、培地をＦＣＳを含まない培地に置換
して培養した。この培地で１日培養した培養液５０μｌ
をとり、これを用いて参考例１に記載した方法でプロテ
インＣ活性化の促進作用を測定したところ、強い活性が
認められた。一方、コントロールとして用いたプラスミ
ドｐＢＶ−１（９−１）だけでトランスフォームした細
胞では本活性は検出されなかった。

【０１６９】実施例１３ （プラスミドｐＳＶ２ＴＭＤ４によるＣ₁₂₇Ｉ細胞の形
質転換および形質転換細胞の産生するペプチドのトロン
ビンによるプロテインＣ活性化の促進作用の測定） 実施例１−（４）で作成したプラスミドｐＳＶ２ＴＭＤ
４をＨｉｎｄIII で完全消化した後、切断末端をＤＮＡ
ポリメラーゼを用いて平滑末端にし、Ｔ₄ ＤＮＡリガー
ゼを作用させ、プラスミドｐＳＶ２ＴＭＤ４のＨｉｎｄ
III サイトを欠失したプラスミドｐＳＶ２ＴＭＤ４−１
を得た。次いでこのプラスミドｐＳＶ２ＴＭＤ４−１を
ＰｖｕII及びＢａｍＨＩで完全消化して約２１００ｂｐ
の断片を得た。これをプラスミドｐＵＣ１８のＨｉｎｃ
II及びＢａｍＨＩで完全消化したベクターに挿入してプ
ラスミドｐＵＣＴＭＤ４−１を得た。

【０１７０】一方、プラスミドｐＢＲ３２２（ＡＴＣＣ
３７０１７）からコバスルビアスらの方法〔エル コ
バスルビアスら（Ｌ．Ｃｏｖａｓｒｕｂｉａｓ ｅｔ
ａｌ）、ジーン（Ｇｅｎｅ）、１３、２５、（１９８１
年）にしたがってプラスミドｐＢＲ３２７を作製した。
得られたプラスミドｐＢＲ３２７をＢａｍＨＩ及びＨｉ
ｎｄIII で消化して得た約２９６０ｂｐのＤＮＡ断片
に、プラスミドｐＵＣＴＭＤ４−１をＢａｍＨＩ及びＨ
ｉｎｄIII で完全消化して得た約３，０００ｂｐのＤＮ
Ａ断片を挿入してプラスミドｐＢＲＴＭＤ４−１を得
た。このプラスミドｐＢＲＴＭＤ４−１をＨｉｎｄIII
で完全消化したものとプラスミドｐＢＰＶ−１（９−
１）（ＡＴＣＣ ３７１１１）をＨｉｎｄIII で完全消
化して得た断片とをＴ₄ ＤＮＡリガーゼを用いて継い
で、Ｃ₁₂₇細胞発現用のプラスミドｐｄＢＰＶＴＭＤ４
−１を得た。以上の工程を図２２〜図２３に示す。

【０１７１】次に、ｐｄＢＰＶＴＭＤ４−１で実施例７
に記載の方法に準じてＣ₁₂₇Ｉ細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ
１６１６）をトランスフォームした。１０％ＦＣＳ及
び１ｖ／ｖ％ペニシリン−ストレプトマイシン（フロー
ラボラトリー社製、米国、カタログ番号１６−７００−
４９）を含むダルベッコのＭＥＭで約３週間培養したと
ころ、フォーカスを形成する細胞が６個得られたのでそ
れぞれの細胞をクローニングして、それぞれ直径１０ｃ
ｍの組織培養用プレートでコンフルエントになるまで生
育させた。その後、培地をＦＣＳを含まない培地に置換
して培養した。この培地で１日培養した培養液５０μｌ
をとり、これを用いて参考例１に記載した方法でプロテ
インＣ活性化の促進作用を測定したところ、強い活性が
認められた。一方、コントロールとして用いたプラスミ
ドｐＢＰＶ−（９−１）だけでトランスフォームした細
胞では本活性は検出されなかった。

【０１７２】実施例１４ （プラスミドｐＳＶ２ＴＭＤ２によるＣ₁₂₇Ｉ細胞の形
質転換および形質転換細胞の産生するペプチドのトロン
ビンによるプロテインＣ活性化の促進作用の測定） 実施例１−（３）で作成したプラスミドｐＳＶ２ＴＭＤ
２をＨｉｎｄIII で完全消化した後、切断末端をＤＮＡ
ポリメラーゼを用いて平滑末端にし、Ｔ₄ ＤＮＡリガー
ゼを作用させ、プラスミドｐＳＶ２ＴＭＤ２のＨｉｎｄ
III サイトを欠失したプラスミドｐＳＶ２ＴＭＤ２−１
を得た。次いでこのプラスミドｐＳＶ２ＴＭＤ２−１を
ＰｖｕII及びＢａｍＨＩで完全消化して約２, ２００ｂ
ｐのＤＮＡ断片を得た。これをプラスミドｐＵＣ１８の
ＨｉｎｃII及びＢａｍＨＩで完全消化したベクターに挿
入してプラスミドｐＵＣＴＭＤ２−１を得た。

【０１７３】一方、プラスミドｐＢＲ３２２（ＡＴＣＣ
３７０１７）からコバスルビアスらの方法〔エル コ
バスルビアスら（Ｌ．Ｃｏｖａｓｒｕｂｉａｓ ｅｔ
ａｌ）、ジーン（Ｇｅｎｅ）、１３、２５、（１９８１
年）に従ってプラスミドｐＢＲ３２７を作製した。得ら
れたプラスミドｐＢＲ３２７をＢａｍＨＩおよびＨｉｎ
ｄIII で消化して得た約２９６０ｂｐのＤＮＡ断片に、
プラスミドｐＵＣＴＭＤ２−１をＢａｍＨＩ及びＨｉｎ
ｄIII で完全消化して得た約３，０７０ｂｐのＤＮＡ断
片を挿入して、プラスミドｐＢＲＴＭＤ２−１を得た。
このプラスミドｐＢＲＴＭＤ２−１をＨｉｎｄIII で完
全消化したものとプラスミドｐＢＰＶ−１（９−１）
（ＡＴＣＣ ３７１１１）をＨｉｎｄIII で完全消化し
て得た断片とＴ₄ ＤＮＡリガーゼを用いて、Ｃ₁₂₇細胞
発現用のプラスミドｐｄＢＰＶＴＭＤ２−１を得た。以
上の工程を図２４〜図２５に示す。

【０１７４】次にｐｄＢＰＶＴＭＤ２−１で実施例７に
記載の方法に準じてＣ₁₂₇Ｉ細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１
６１６）をトランスフォームした。１０％ＦＣＳ及び１
ｖ／ｖ％ペニシリン−ストレプトマインシ（米国、フロ
ーラボラトリー社製、カタログ番号１６−７００−４
９）を含むダルベッコのＭＥＭで約３週間培養したとこ
ろ、フォーカスを形成する細胞が６個得られたのでそれ
ぞれの細胞をクローニングして、それぞれ直径１０ｃｍ
の組織培養用プレートでコンフルエントになるまで生育
させた。その後、培地をＦＣＳを含まない培地に置換し
て培養した。この培地で１日培養した培養液５０μｌを
とり、これを用いて参考例１に記載した方法でプロテイ
ンＣ活性化の促進作用を測定したところ、強い活性が認
められた。一方、コントロールとして用いたプラスミド
ｐＢＰＶ−１（９−１）だけでトランスフォームした細
胞では本活性は検出されなかった。

【０１７５】実施例１５ （プラスミドｐＳＶ２ＴＭＤ１によるＣ₁₂₇Ｉ細胞の形
質転換および形質転換細胞の産生するペプチドのトロン
ビンによるプロテインＣ活性化の促進作用の測定） 実施例１−（２）で作成したプラスミドｐＳＶ２ＴＭＤ
１をＨｉｎｄIII で完全消化した後、切断末端をＤＮＡ
ポリメラーゼを用いて平滑末端にし、Ｔ₄ ＤＮＡリガー
ゼを作用させ、プラスミドｐＳＶ２ＴＭＤ１のＨｉｎｄ
III サイトを欠失したプラスミドｐＳＶ２ＴＭＤ１−１
を得た。次いでこのプラスミドｐＳＶ２ＴＭＤ１−１を
ＰｖｕII及びＢａｍＨＩで完全消化して約３, １００ｂ
ｐのＤＮＡ断片を得た。これをプラスミドｐＵＣ１８の
ＨｉｎｃII及びＢａｍＨＩで完全消化したベクターに挿
入してプラスミドｐＵＣＴＭＤ１−１を得た。

【０１７６】一方、プラスミドｐＢＲ３２２（ＡＴＣＣ
３７０１７）からコバスルビアスらの方法〔エル コ
バスルビアスら（Ｌ．Ｃｏｖａｓｒｕｂｉａｓ ｅｔ
ａｌ）、ジーン（Ｇｅｎｅ）、１３、２５、（１９８１
年）に従ってプラスミドｐＢＲ３２７を作製した。得ら
れたプラスミドｐＢＲ３２７をＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄ
III で消化して得た約２, ９６０ｂｐのＤＮＡ断片に、
プラスミドｐＵＣＴＭＤ１−１をＢａｍＨＩ及びＨｉｎ
ｄIII で完全消化して得たＤＮＡ断片を挿入してプラス
ミドｐＢＲＴＭＤ１−１を得た。このプラスミドｐＢＲ
ＴＭＤ１−１をＨｉｎｄIII で完全消化したものとプラ
スミドｐＢＰＶ−１（９−１）（ＡＴＣＣ ３７１１
１）をＨｉｎｄIII で完全消化して得た断片とをＴ₄ Ｄ
ＮＡリガーゼを用いて継いで、Ｃ₁₂₇細胞発現用のプラ
スミドｐｄＢＰＶＴＭＤ１−１を得た。以上の工程を図
２６〜図２７に示す。

【０１７７】次に、ｐｄＢＰＶＴＭＤ１−１で実施例７
に記載の方法に準じてＣ₁₂₇Ｉ細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ
１６１６）をトランスフォームした。１０％ＦＣＳ及
び１ｖ／ｖ％ペニシリン−ストレプトマイシン（フロー
ラボラトリー社製、米国、カタログ番号１６−７００−
４９）を含むダルベッコのＭＥＭで約３週間培養したと
ころ、フォーカスを形成する細胞が６個得られたのでそ
れぞれの細胞をクローニングして、それぞれ直径１０ｃ
ｍの組織細胞用プレートでコンフルエントになるまで生
育させた。その後、培地をＦＣＳを含まない培地に置換
して培養した。この培地で１日培養した培養液５０μｌ
をとり、これを用いて参考例１に記載した方法でプロテ
インＣ活性化の促進作用を測定したところ、強い活性が
認められた。一方、コントロールとして用いたプラスミ
ドｐＢＰＶ−１（９−１）だけでトランスフォームした
細胞では本活性は検出されなかった。

【０１７８】実施例１６ （プラスミドｐＳＶ２ＴＭＪ２によるＣ₁₂₇ Ｉ細胞の形
質転換および形質転換細胞の産生するペプチドのトロン
ビンによるプロテインＣ活性化の促進作用の測定） 実施例１−（１）で作成したプラスミドｐＳＶ２ＴＭＪ
２をＨｉｎｄIII で完全消化した後、切断末端をＤＮＡ
ポリメラーゼを用いて平滑末端にし、Ｔ₄ ＤＮＡリガー
ゼを作用させ、プラスミドｐＳＶ２ＴＭＪ２のＨｉｎｄ
III サイトを欠失したプラスミドｐＳＶ２ＴＭＪ２−１
を得た。次いでこのプラスミドｐＳＶ２ＴＭＪ２−１を
ＰｖｕII及びＢａｍＨＩで完全消化して約４, １００ｂ
ｐのＤＮＡ断片を得た。これをプラスミドｐＵＣ１８の
ＨｉｎｃII及びＢａｍＨＩで完全消化したベクターに挿
入してプラスミドｐＵＣＴＭＪ２−１を得た。

【０１７９】一方、プラスミドｐＢＲ３２２（ＡＴＣＣ
３７０１７）からコバスルビアスらの方法〔エル コ
バスルビアス（Ｌ．Ｃｏｖａｓｒｕｂｉａｓ ｅｔ ａ
ｌ）、ジーン（Ｇｅｎｅ）、１３、２５、（１９８１
年）に従ってプラスミドｐＢＲ３２７を作製した。得ら
れたプラスミドｐＢＲ３２７をＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄ
III で消化して得た約２９６０ｂｐのＤＮＡ断片に、プ
ラスミドｐＵＣＴＭＪ２−１をＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄ
III で完全消化して得たＤＮＡ断片を挿入してプラスミ
ドｐＢＲＴＭＪ２−１を得た。このプラスミドｐＢＲＴ
ＭＪ２−１をＨｉｎｄIII で完全消化したものとプラス
ミドｐＢＰＶ−１（９−１）（ＡＴＣＣ３７１１１）を
ＨｉｎｄIII で完全消化して得た断片とをＴ₄ ＤＮＡリ
ガーゼを用いて継いで、Ｃ₁₂₇細胞発現用のプラスミド
ｐｄＢＰＶＴＭＪ２−１を得る。以上の工程を図２８〜
図２９に示す。

【０１８０】次にｐｄＢＰＶＴＭＪ２−１で実施例７に
記載の方法に準じてＣ₁₂₇Ｉ細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ
１６１６）をトランスフォームした。１０％ＦＣＳ及び
１（ｖ／ｖ％）ペニシリン−ストレプトマイシン（フロ
ーラボラトリー社製、米国、カタログ番号１６−７００
−４９）を含むダルベッコのＭＥＭで約３週間培養した
ところ、フォーカスを形成する細胞が６個得られたので
それぞれの細胞をクローニングして、それぞれ直径１０
ｃｍの組織細胞用プレートでコノフルエントになるまで
生育させた。その後、培地をＦＣＳを含まない培地に置
換して培養した。この培地で１日培養した後、培養した
細胞のペレットをかきとり、これを用いて参考例１に記
載した方法でプロテインＣ活性化の促進作用を測定した
ところ、強い活性が認められた。一方、コントロールと
して用いたプラスミドｐＢＰＶ−１（９−１）だけでト
ランスフォームした細胞では本活性は検出されなかっ
た。

【０１８１】実施例１７ （本発明の培養液からのトロンビンによるプロテインＣ
の活性化を促進する作用を有するペプチドの精製） 実施例７に記載した方法で培養したプラスミドｐＳＶ２
−ｎｅｏ及びプラスミドｐＳＶ２ＴＭＤ５でトランスフ
ォームしたＣＨＯ細胞を直径１０ｃｍの組織培養用プレ
ート２５枚で培養した。培地は１日おきに４回新鮮な培
地と交換した。この培養液をすべて集め（約１００ｍ
ｌ）、ｐＨ７．５に調製した後ＤＩＰ−トロンビン−ア
ガロースのカラムクロマトグラフィーにかけて調製し
た。すなわち、エヌ エル エスモン（Ｎ．Ｌ．Ｅｓｍ
ｏｎ）ら〔ザ ジャーナルオブ バイオロジカル ケミ
ストリー（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ）、２５７巻、８５
９頁、（１９８２年）〕の方法にしたがって作製したＤ
ＩＰ−トロンビン〔ジイソプロピルホスホロトロンビン
（ｄｉｉｓｏｐｒｏｐｙｌｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｒｏ
ｍｂｉｎ）〕を、ピー クオトレカサス（Ｐ．Ｃｕａｔ
ｒｅｃａｓａｓ）の方法〔ザ ジャーナル オブ バイ
オロジカル ケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅ
ｍ）、２４５巻、３５９頁（１９７０年）〕に準じてブ
ロムシアン化したアガロースに結合させてＤＩＰ−トロ
ンビン−アガロースを作製した。

【０１８２】次にＤＩＰ−トロンビン−アガロースを
２．５ｃｍφ×１０ｃｍの大きさのカラムに充填してＤ
ＩＰ−トロンビン−アガロースカラムを作製して室温で
０．１Ｍ ＮａＣｌ、０．５ｍＭ ＣａＣｌ₂ 、１ｍＭ
ベンズアミジン塩酸、０．５％（ｖ／ｖ）Ｌｕｂｒｏｌ
ＰＸ（半井化学薬品製、日本）を含む０．０２Ｍトリ
ス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）でカラムを平衡化した。次
いで、上記の上澄液をカラムに供した。カラムを０．３
Ｍ ＮａＣｌ、０．５ｍＭ ＣａＣｌ₂ 、１ｍＭベンズ
アミジン塩酸、０．５％（ｖ／ｖ）Ｌｕｂｒｏｌ ＰＸ
を含む０．０２Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）で洗
浄した後、１Ｍ ＮａＣｌ、０．１ｍＭＥＤＴＡ、１ｍ
Ｍベンズアミジン塩酸、０．５％（ｖ／ｖ）Ｌｕｂｒｏ
ｌ ＰＸを含む０．０２Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．
５）で溶出して２．０ｍｌずつフラクションを集めた。
溶出によって得られる各フラクションについて前記の方
法でプロテインＣ活性化の促進作用を測定した。同時に
島津製作所（日本）製スペクトロフォトメーターＵＶ−
２４０を用いて、各フラクションの波長２８０ｎｍにお
ける吸光度（Ａ₂₈₀ ）を測定した。活性のある画分を回
収し、０．１Ｍ ＮａＣｌ、０．５ｍＭ ＣａＣｌ₂ 、
０．５％（ｖ／ｖ）Ｌｕｂｒｏｌ ＰＸ（半井化学薬品
製、日本）を含む０．０２Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ
７．５）で透析した。得られた透析液を２回目のＤＩＰ
−トロンビン−アガロースカラムクロマトグラフィーに
供した。

【０１８３】即ち、透析液を１．５ｃｍφ×１０ｃｍの
大きさのＤＩＰ−トロンビン−アガロースカラムに通
し、０．４Ｍ ＮａＣｌ、０．５ｍＭ ＣａＣｌ₂ 、
０．１％（ｖ／ｖ）Ｌｕｂｒｏｌ ＰＸを含む０．０２
Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）で洗浄後、さらに
０．４Ｍ ＮａＣｌ、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１％
（ｖ／ｖ）Ｌｕｂｒｏｌ ＰＸを含む０．０２Ｍトリス
緩衝液（ｐＨ７．５）で洗浄し、次いで１Ｍ ＮａＣ
ｌ、０．５ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１％（ｖ／ｖ）Ｌｕｂ
ｒｏｌ ＰＸを含む０．０２Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ
７．５）で溶出した。活性画分を回収し、精製品を−８
０℃で凍結保存した。この精製品の分子吸光係数を一般
的な蛋白質の分子吸光係数にならない１０．０（Ｅ^1%
_1cm ・２８０ｎｍ＝１０．０）と規定して、それに基づ
き精製品の量を計算したところ約４．７μｇであった。
尚、この精製品をポリアクリルアミドゲル濃度５−１０
％のグラジェントを用いるＳＤＳ−ポリアクリルアミド
ゲル電気泳動を行い、銀染色によってバンドを観察した
ところ単一のバンドのみ確認された。

【０１８４】実施例１８ プラスミドｐＳＶ２ＴＭＤ４を用いる以外は実施例１７
と同様の操作を行い本発明のペプチドの精製品を得、波
長２８０ｎｍにおける吸光度を測定した。この精製品の
分子吸光係数を一般的な蛋白質の分子吸光係数にならい
１０．０（Ｅ^1% _1cm ・２８０ｎｍ＝１０．０）と規定し
て、それに基づき精製品の量を計算したところ約４．５
μｇであった。尚、この精製品をポリアクリルアミドゲ
ル濃度５−１０％のグラジェントを用いるＳＤＳ−ポリ
アクリルアミドゲル電気泳動を行い、銀染色によってバ
ンドを観察したところ単一のバンドのみ確認された。

【０１８５】実施例１９ プラスミドｐＳＶ２ＴＭＤ２を用いる以外は実施例１７
と同様の操作を行い本発明のペプチドの精製品を得、波
長２８０ｎｍにおける吸光度を測定した。この精製品の
分子吸光係数を一般的な蛋白質の分子吸光係数にならい
１０．０（Ｅ^1% _1cm ・２８０ｎｍ＝１０．０）と規定し
て、それに基づき精製品の量を計算したところ約４μｇ
であった。尚、この精製品をポリアクリルアミドゲル濃
度５−１０％のグラジェントを用いるＳＤＳ−ポリアク
リルアミドゲル電気泳動を行い、銀染色によってバンド
を観察したところ単一のバンドのみ確認された。

【０１８６】実施例２０ プラスミドｐＳＶ２ＴＭＤ１を用いる以外は実施例１７
と同様の操作を行い本発明のペプチドの精製品を得、波
長２８０ｎｍにおける吸光度を測定した。この精製品の
分子吸光係数を一般的な蛋白質の分子吸光係数にならい
１０．０（Ｅ^1% _1cm ・２８０ｎｍ＝１０．０）と規定し
て、それに基づき精製品の量を計算したところ約３μｇ
であった。尚、この精製品をポリアクリルアミド濃度５
−１０％のグラジェントを用いるＳＤＳ−ポリアクリル
アミドゲル電気泳動を行い、銀染色によってバンドを観
察したところ単一のバンドのみ確認された。

【０１８７】実施例２１ 実施例１１に記載した方法で、プラスミドｐＳＶ２ＴＭ
Ｊ２及びプラスミドｐＳＶ２−ｎｅｏで形質転換したＣ
ＨＯ細胞を直径１０ｃｍの組織培養用プレート２５枚を
用いて培養した。培養後、培養上澄液を８００ｒｐｍで
１０分間遠心分離にかけて細胞を集めた。得られた細胞
ペレットに、０．５％（ｖ／ｖ）トリトンＸ−１００、
０．２５Ｍ庶糖、１ｍＭベンズアミジン塩酸、０．５ｍ
Ｍ ＣａＣｌ₂ を含む０．０２Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐ
Ｈ７．５）１００ｍｌに懸濁し、ワーリングブレンダー
を用いて４℃で５分間、５回ホモジナイズして細胞抽出
物を得た。得られた抽出物を３５，０００ｇ、１０℃で
６０分間遠心分離にかけて上澄液を集めた。この上澄液
から、実施例１７と同様の操作により本発明のペプチド
の精製品を得、波長２８０ｎｍにおける吸光度を測定し
た。この精製品の分子吸光係数を一般的な蛋白質の分子
吸光係数にならない１０．０（Ｅ^1% _1cm ・２８０ｎｍ＝
１０．０）と規定して、それに基づき精製品の量を計算
したところ約３μｇであった。尚、この精製品をポリア
クリルアミド濃度５−１０％のグラジェントを用いるＳ
ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行い、銀染色
によってバンドを観察したところ単一のバンドのみ確認
された。

【０１８８】実施例２２ （トロンビンによるプロテインＣ活性化を促進する作用
の確認）精製した本発明のペプチドのプロテインＣ活性
化の促進作用を次の方法にて評価した。即ち、０．１Ｍ
ＮａＣｌ、３．６ｍＭ ＣａＣｌ₂ 、１０ｍｇ／ｍｌ
ウシ血清アルブミンを含む０．０２Ｍトリス塩酸緩衝液
（ｐＨ７．５）に５０μｇ／ｍｌのプロテインＣ、５ｎ
Ｍのトロンビン及び５ｎＭの精製した本発明のペプチド
を加えて３７℃で反応させた。反応物に３００μｇ／ｍ
ｌのアンチトロンビンIII （米国シグマ社製）および５
ｍＭ ＥＤＴＡを加えて反応を停止して、生成した活性
型プロテインＣの量を前述の合成基質を用いる方法で測
定した。結果を図３０図〜図３４に示すが、本発明のペ
プチドを無添加の場合（Ｂ）では活性化プロテインＣの
生成は認められなかった（点線）が、本発明のペプチド
を添加した場合（Ａ）には、反応時間と共に生成した活
性化プロテインＣの量が増加した（実線）。

【０１８９】実施例２３ （抗血液凝固作用の確認） 本発明のペプチドがトロンビンによるフィブリノーゲン
のフィブリンへの変換を阻害し、血液凝固を実質的に阻
害することはハインリッヒ アメルング社（独国）製の
コアギュロメーターＫＣ−１０を用いて血液凝固時間を
測定することによって調べた。即ち、５ｍＭ ＣａＣｌ
₂ 、０．１Ｍ ＮａＣｌを含む０．０５Ｍトリス塩酸緩
衝液（ｐＨ７．５）に３．０μｇのフィブリノーゲン
（米国シグマ社製、フラクションＩ）を加え、これに０
−５０ｎＭの精製した本発明のペプチドを加え、次い
で、全量が０．４ｍｌになるように１０ｎＭのトロンビ
ンを加えて凝固時間を測定した。結果を図３５〜図３９
図に示す。トロンビンにくらべ、添加した精製ペプチド
の量が多くなるにしたがって、血液凝固時間が延長され
ることが確認された。

【０１９０】実施例２４ （血小板凝集抑制作用の確認） 本発明のペプチドがトロンビンの血小板凝集作用を実質
的に阻害することはＳＩＥＮＣＯ社（米国）製のプレー
トレットアグリゴメーターを用いて評価した。即ち、３
０万ｃｅｌｌｓ／μｌの血小板液（Ｐｌａｔｅｌｅｔ
Ｒｉｃｈ Ｐｌａｓｍａ、Ｐ．Ｒ．Ｐ．）２５０μｌに
１単位のトロンビン（約０．４μｇ）を加えると血小板
が凝集するが、トロンビンを加える前にその加えるトロ
ンビンと等モル以上の精製した本発明のペプチドを加え
ておくと血小板の凝集が起きなかった。

【０１９１】

【適用例】以下に上記の各実施例で得られた種々の可溶
性のペプチドの適用例を応用例をもって説明するが、本
発明はそれら応用例により何ら限定されるものではな
い。 応用例１ 精製した本発明のペプチド １０ ｍｇ 精製ゼラチン ２０ ｍｇ マンニトール １００ ｍｇ 塩化ナトリウム ７．８ｍｇ リン酸（１及び２）ナトリウム １５．４ｍｇ 上記成分を注射用蒸留水２ｍｌに溶解し、通常の製剤条
件により中性付近の注射用製剤を調製した。即ち、前記
溶解液を、無菌バイアルに入れ、−３５℃で２時間予備
凍結し、−３５℃で真空度０．０７５Ｔｏｒｒで３５時
間一次乾燥し、次いで３０℃、真空度０．０３Ｔｏｒｒ
で５時間二次乾燥して、注射用バイアルを製造した。得
られた組成物は、投与直前に生理食塩水もしくはブドウ
糖注射液５００ｍｌに溶解され、その溶解液は、点滴静
注するのに用いられる。

【０１９２】 応用例２ 精製した本発明のペプチド ２．５ ｍｇ アルブミン ５ ｍｇ マンニトール ２５ ｍｇ 塩化ナトリウム １．９５ｍｇ リン酸（１及び２）ナトリウム ３．８５ｍｇ 上記成分を注射用蒸留水２ｍｌに溶解し、通常の製剤条
件により中性付近の注射用製剤を調製した。即ち、前記
溶解液を、無菌バイアルに入れ、−３５℃で２時間予備
凍結し、−３５℃で真空度０．０７５Ｔｏｒｒで３５時
間一次乾燥し、次いで３０℃、真空度０．０３Ｔｏｒｒ
で５時間二次乾燥して、注射用バイアルを製造した。得
られた組成物は、投与直前に生理食塩水もしくはブドウ
糖注射液５００ｍｌに溶解され、その溶解液は、点滴静
注するのに用いられる。

【０１９３】

【発明の効果】本発明のペプチドは、抗血液凝固作用、
血小板凝集抑制作用、血栓溶解作用を併せ持ち副作用の
少ない循環器系疾患などの治療用薬として極めて有用な
物質である。また、本発明のペプチドは、このような医
薬用途以外に、たとえば、人工血管、人工臓器、カテー
テルなどの医用人工材料に結合させて、血栓の形成を防
止する薬剤として用いることができる。

【０１９４】

【配列表】

配列番号：１ 配列の長さ：１１８ 配列の型：アミノ酸 配列の種類：蛋白質 配列 Val Glu Pro Val Asp Pro Cys Phe Arg Ala Asn Cys Glu Tyr Gln Cys 1 5 10 15 Gln Pro Leu Asn Gln Thr Ser Tyr Leu Cys Val Cys Ala Glu Gly Phe 20 25 30 Ala Pro Ile Pro His Glu Pro His Arg Cys Gln Met Phe Cys Asn Gln 35 40 45 Thr Ala Cys Pro Ala Asp Cys Asp Pro Asn Thr Gln Ala Ser Cys Glu 50 55 60 Cys Pro Glu Gly Tyr Ile Leu Asp Asp Gly Phe Ile Cys Thr Asp Ile 65 70 75 80 Asp Glu Cys Glu Asn Gly Gly Phe Cys Ser Gly Val Cys His Asn Leu 85 90 95 Pro Gly Thr Phe Glu Cys Ile Cys Gly Pro Asp Ser Ala Leu Val Arg 100 105 110 His Ile Gly Thr Asp Cys 115

【０１９５】 配列番号：２ 配列の長さ：５９ 配列の型：アミノ酸 配列の種類：蛋白質 配列 Leu Leu Ile Gly Ile Ser Ile Ala Ser Leu Cys Leu Val Val Ala Leu 1 5 10 15 Leu Ala Leu Leu Cys His Leu Arg Lys Lys Gln Gly Ala Ala Arg Ala 20 25 30 Lys Met Glu Tyr Lys Cys Ala Ala Pro Ser Lys Glu Val Val Leu Gln 35 40 45 His Val Arg Thr Glu Arg Thr Pro Gln Arg Leu 50 55

【０１９６】 配列番号：３ 配列の長さ：４９８ 配列の型：アミノ酸 配列の種類：蛋白質 配列 Ala Pro Ala Glu Pro Gln Pro Gly Gly Ser Gln Cys Val Glu His Asp 1 5 10 15 Cys Phe Ala Leu Tyr Pro Gly Pro Ala Thr Phe Leu Asn Ala Ser Gln 20 25 30 Ile Cys Asp Gly Leu Arg Gly His Leu Met Thr Val Arg Ser Ser Val 35 40 45 Ala Ala Asp Val Ile Ser Leu Leu Leu Asn Gly Asp Gly Gly Val Gly 50 55 60 Arg Arg Arg Leu Trp Ile Gly Leu Gln Leu Pro Pro Gly Cys Gly Asp 65 70 75 80 Pro Lys Arg Leu Gly Pro Leu Arg Gly Phe Gln Trp Val Thr Gly Asp 85 90 95 Asn Asn Thr Ser Tyr Ser Arg Trp Ala Arg Leu Asp Leu Asn Gly Ala 100 105 110 Pro Leu Cys Gly Pro Leu Cys Val Ala Val Ser Ala Ala Glu Ala Thr 115 120 125 Val Pro Ser Glu Pro Ile Trp Glu Glu Gln Gln Cys Glu Val Lys Ala 130 135 140 Asp Gly Phe Leu Cys Glu Phe His Phe Pro Ala Thr Cys Arg Pro Leu 145 150 155 160 Ala Val Glu Pro Gly Ala Ala Ala Ala Ala Val Ser Ile Thr Tyr Gly 165 170 175 Thr Pro Phe Ala Ala Arg Gly Ala Asp Phe Gln Ala Leu Pro Val Gly 180 185 190 Ser Ser Ala Ala Val Ala Pro Leu Gly Leu Gln Leu Met Cys Thr Ala 195 200 205 Pro Pro Gly Ala Val Gln Gly His Trp Ala Arg Glu Ala Pro Gly Ala 210 215 220 Trp Asp Cys Ser Val Glu Asn Gly Gly Cys Glu His Ala Cys Asn Ala 225 230 235 240 Ile Pro Gly Ala Pro Arg Cys Gln Cys Pro Ala Gly Ala Ala Leu Gln 245 250 255 Ala Asp Gly Arg Ser Cys Thr Ala Ser Ala Thr Gln Ser Cys Asn Asp 260 265 270 Leu Cys Glu His Phe Cys Val Pro Asn Pro Asp Gln Pro Gly Ser Tyr 275 280 285 Ser Cys Met Cys Glu Thr Gly Tyr Arg Leu Ala Ala Asp Gln His Arg 290 295 300 Cys Glu Asp Val Asp Asp Cys Ile Leu Glu Pro Ser Pro Cys Pro Gln 305 310 315 320 Arg Cys Val Asn Thr Gln Gly Gly Phe Glu Cys His Cys Tyr Pro Asn 325 330 335 Tyr Asp Leu Val Asp Gly Glu Cys Val Glu Pro Val Asp Pro Cys Phe 340 345 350 Arg Ala Asn Cys Glu Tyr Gln Cys Gln Pro Leu Asn Gln Thr Ser Tyr 355 360 365 Leu Cys Val Cys Ala Glu Gly Phe Ala Pro Ile Pro His Glu Pro His 370 375 380 Arg Cys Gln Met Phe Cys Asn Gln Thr Ala Cys Pro Ala Asp Cys Asp 385 390 395 400 Pro Asn Thr Gln Ala Ser Cys Glu Cys Pro Glu Gly Tyr Ile Leu Asp 405 410 415 Asp Gly Phe Ile Cys Thr Asp Ile Asp Glu Cys Glu Asn Gly Gly Phe 420 425 430 Cys Ser Gly Val Cys His Asn Leu Pro Gly Thr Phe Glu Cys Ile Cys 435 440 445 Gly Pro Asp Ser Ala Leu Val Arg His Ile Gly Thr Asp Cys Asp Ser 450 455 460 Gly Lys Val Asp Gly Gly Asp Ser Gly Ser Gly Glu Pro Pro Pro Ser 465 470 475 480 Pro Thr Pro Gly Ser Thr Leu Thr Pro Pro Ala Val Gly Leu Val His 485 490 495 Ser Gly

【０１９７】 配列番号：４ 配列の長さ：３５４ 配列の型：塩基配列 配列の種類：ＤＮＡ 配列 GTG GAG CCC GTG GAC CCG TGC TTC AGA GCC AAC TGC GAG TAC CAG TGC 48 CAG CCC CTG AAC CAA ACT AGC TAC CTC TGC GTC TGC GCC GAG GGC TTC 96 GCG CCC ATT CCC CAC GAG CCG CAC AGG TGC CAG ATG TTT TGC AAC CAG 144 ACT GCC TGT CCA GCC GAC TGC GAC CCC AAC ACC CAG GCT AGC TGT GAG 192 TGC CCT GAA GGC TAC ATC CTG GAC GAC GGT TTC ATC TGC ACG GAC ATC 240 GAC GAG TGC GAA AAC GGC GGC TTC TGC TCC GGG GTG TGC CAC AAC CTC 288 CCC GGT ACC TTC GAG TGC ATC TGC GGG CCC GAC TCG GCC CTT GTC CGC 336 CAC ATT GGC ACC GAC TGT 354

【０１９８】 配列番号：５ 配列の長さ：１４９４ 配列の型：塩基配列 配列の種類：ＤＮＡ 配列 GCA CCC GCA GAG CCG CAG CCG GGT GGC AGC CAG TGC GTC GAG CAC GAC 48 TGC TTC GCG CTC TAC CCG GGC CCC GCG ACC TTC CTC AAT GCC AGT CAG 96 ATC TGC GAC GGA CTG CGG GGC CAC CTA ATG ACA GTG CGC TCC TCG GTG 144 GCT GCC GAT GTC ATT TCC TTG CTA CTG AAC GGC GAC GGC GGC GTT GGC 192 CGC CGG CGC CTC TGG ATC GGC CTG CAG CTG CCA CCC GGC TGC GGC GAC 240 CCC AAG CGC CTC GGG CCC CTG CGC GGC TTC CAG TGG GTT ACG GGA GAC 288 AAC AAC ACC AGC TAT AGC AGG TGG GCA CGG CTC GAC CTC AAT GGG GCT 336 CCC CTC TGC GGC CCG TTG TGC GTC GCT GTC TCC GCT GCT GAG GCC ACT 384 GTG CCC AGC GAG CCG ATC TGG GAG GAG CAG CAG TGC GAA GTG AAG GCC 432 GAT GGC TTC CTC TGC GAG TTC CAC TTC CCA GCC ACC TGC AGG CCA CTG 480 GCT GTG GAG CCC GGC GCC GCG GCT GCC GCC GTC TCG ATC ACC TAC GGC 528 ACC CCG TTC GCG GCC CGC GGA GCG GAC TTC CAG GCG CTG CCG GTG GGC 576 AGC TCC GCC GCG GTG GCT CCC CTC GGC TTA CAG CTA ATG TGC ACC GCG 624 CCG CCC GGA GCG GTC CAG GGG CAC TGG GCC AGG GAG GCG CCG GGC GCT 672 TGG GAC TGC AGC GTG GAG AAC GGC GGC TGC GAG CAC GCG TGC AAT GCG 720 ATC CCT GGG GCT CCC CGC TGC CAG TGC CCA GCC GGC GCC GCC CTG CAG 768 GCA GAC GGG CGC TCC TGC ACC GCA TCC GCG ACG CAG TCC TGC AAC GAC 816 CTC TGC GAG CAC TTC TGC GTT CCC AAC CCC GAC CAG CCG GGC TCC TAC 864 TCG TGC ATG TGC GAG ACC GGC TAC CGG CTG GCG GCC GAC CAA CAC CGG 912 TGC GAG GAC GTG GAT GAC TGC ATA CTG GAG CCC AGT CCG TGT CCG CAG 960 CGC TGT GTC AAC ACA CAG GGT GGC TTC GAG TGC CAC TGC TAC CCT AAC 1008 TAC GAC CTG GTG GAC GGC GAG TGT GTG GAG CCC GTG GAC CCG TGC TTC 1056 AGA GCC AAC TGC GAG TAC CAG TGC CAG CCC CTG AAC CAA ACT AGC TAC 1104 CTC TGC GTC TGC GCC GAG GGC TTC GCG CCC ATT CCC CAC GAG CCG CAC 1152 AGG TGC CAG ATG TTT TGC AAC CAG ACT GCC TGT CCA GCC GAC TGC GAC 1200 CCC AAC ACC CAG GCT AGC TGT GAG TGC CCT GAA GGC TAC ATC CTG GAC 1248 GAC GGT TTC ATC TGC ACG GAC ATC GAC GAG TGC GAA AAC GGC GGC TTC 1296 TGC TCC GGG GTG TGC CAC AAC CTC CCC GGT ACC TTC GAG TGC ATC TGC 1344 GGG CCC GAC TCG GCC CTT GTC CGC CAC ATT GGC ACC GAC TGT GAC TCC 1392 GGC AAG GTG GAC GGT GGC GAC AGC GGC TCT GGC GAG CCC CCG CCC AGC 1440 CCG ACG CCC GGC TCC ACC TTG ACT CCT CCG GCC GTG GGG CTC GTG CAT 1488 TCG GGC 1494

【０１９９】 配列番号：６ 配列の長さ：２３６ 配列の型：アミノ酸 配列の種類：蛋白質 配列 Cys Ser Val Glu Asn Gly Gly Cys Glu His Ala Cys Asn Ala Ile Pro 1 5 10 15 Gly Ala Pro Arg Cys Gln Cys Pro Ala Gly Ala Ala Leu Gln Ala Asp 20 25 30 Gly Arg Ser Cys Thr Ala Ser Ala Thr Gln Ser Cys Asn Asp Leu Cys 35 40 45 Glu His Phe Cys Val Pro Asn Pro Asp Gln Pro Gly Ser Tyr Ser Cys 50 55 60 Met Cys Glu Thr Gly Tyr Arg Leu Ala Ala Asp Gln His Arg Cys Glu 65 70 75 80 Asp Val Asp Asp Cys Ile Leu Glu Pro Ser Pro Cys Pro Gln Arg Cys 85 90 95 Val Asn Thr Gln Gly Gly Phe Glu Cys His Cys Tyr Pro Asn Tyr Asp 100 105 110 Leu Val Asp Gly Glu Cys Val Glu Pro Val Asp Pro Cys Phe Arg Ala 115 120 125 Asn Cys Glu Tyr Gln Cys Gln Pro Leu Asn Gln Thr Ser Tyr Leu Cys 130 135 140 Val Cys Ala Glu Gly Phe Ala Pro Ile Pro His Glu Pro His Arg Cys 145 150 155 160 Gln Met Phe Cys Asn Gln Thr Ala Cys Pro Ala Asp Cys Asp Pro Asn 165 170 175 Thr Gln Ala Ser Cys Glu Cys Pro Glu Gly Tyr Ile Leu Asp Asp Gly 180 185 190 Phe Ile Cys Thr Asp Ile Asp Glu Cys Glu Asn Gly Gly Phe Cys Ser 195 200 205 Gly Val Cys His Asn Leu Pro Gly Thr Phe Glu Cys Ile Cys Gly Pro 210 215 220 Asp Ser Ala Leu Val Arg His Ile Gly Thr Asp Cys 225 230 235

【０２００】 配列番号：７ 配列の長さ：５７５ 配列の型：アミノ酸 配列の種類：蛋白質 配列 Met Leu Gly Val Leu Val Leu Gly Ala Leu Ala Leu Ala Gly Leu Gly 1 5 10 15 Phe Pro Ala Pro Ala Glu Pro Gln Pro Gly Gly Ser Gln Cys Val Glu 20 25 30 His Asp Cys Phe Ala Leu Tyr Pro Gly Pro Ala Thr Phe Leu Asn Ala 35 40 45 Ser Gln Ile Cys Asp Gly Leu Arg Gly His Leu Met Thr Val Arg Ser 50 55 60 Ser Val Ala Ala Asp Val Ile Ser Leu Leu Leu Asn Gly Asp Gly Gly 65 70 75 80 Val Gly Arg Arg Arg Leu Trp Ile Gly Leu Gln Leu Pro Pro Gly Cys 85 90 95 Gly Asp Pro Lys Arg Leu Gly Pro Leu Arg Gly Phe Gln Trp Val Thr 100 105 110 Gly Asp Asn Asn Thr Ser Tyr Ser Arg Trp Ala Arg Leu Asp Leu Asn 115 120 125 Gly Ala Pro Leu Cys Gly Pro Leu Cys Val Ala Val Ser Ala Ala Glu 130 135 140 Ala Thr Val Pro Ser Glu Pro Ile Trp Glu Glu Gln Gln Cys Glu Val 145 150 155 160 Lys Ala Asp Gly Phe Leu Cys Glu Phe His Phe Pro Ala Thr Cys Arg 165 170 175 Pro Leu Ala Val Glu Pro Gly Ala Ala Ala Ala Ala Val Ser Ile Thr 180 185 190 Tyr Gly Thr Pro Phe Ala Ala Arg Gly Ala Asp Phe Gln Ala Leu Pro 195 200 205 Val Gly Ser Ser Ala Ala Val Ala Pro Leu Gly Leu Gln Leu Met Cys 210 215 220 Thr Ala Pro Pro Gly Ala Val Gln Gly His Trp Ala Arg Glu Ala Pro 225 230 235 240 Gly Ala Trp Asp Cys Ser Val Glu Asn Gly Gly Cys Glu His Ala Cys 245 250 255 Asn Ala Ile Pro Gly Ala Pro Arg Cys Gln Cys Pro Ala Gly Ala Ala 260 265 270 Leu Gln Ala Asp Gly Arg Ser Cys Thr Ala Ser Ala Thr Gln Ser Cys 275 280 285 Asn Asp Leu Cys Glu His Phe Cys Val Pro Asn Pro Asp Gln Pro Gly 290 295 300 Ser Tyr Ser Cys Met Cys Glu Thr Gly Tyr Arg Leu Ala Ala Asp Gln 305 310 315 320 His Arg Cys Glu Asp Val Asp Asp Cys Ile Leu Glu Pro Ser Pro Cys 325 330 335 Pro Gln Arg Cys Val Asn Thr Gln Gly Gly Phe Glu Cys His Cys Tyr 340 345 350 Pro Asn Tyr Asp Leu Val Asp Gly Glu Cys Val Glu Pro Val Asp Pro 355 360 365 Cys Phe Arg Ala Asn Cys Glu Tyr Gln Cys Gln Pro Leu Asn Gln Thr 370 375 380 Ser Tyr Leu Cys Val Cys Ala Glu Gly Phe Ala Pro Ile Pro His Glu 385 390 395 400 Pro His Arg Cys Gln Met Phe Cys Asn Gln Thr Ala Cys Pro Ala Asp 405 410 415 Cys Asp Pro Asn Thr Gln Ala Ser Cys Glu Cys Pro Glu Gly Tyr Ile 420 425 430 Leu Asp Asp Gly Phe Ile Cys Thr Asp Ile Asp Glu Cys Glu Asn Gly 435 440 445 Gly Phe Cys Ser Gly Val Cys His Asn Leu Pro Gly Thr Phe Glu Cys 450 455 460 Ile Cys Gly Pro Asp Ser Ala Leu Val Arg His Ile Gly Thr Asp Cys 465 470 475 480 Asp Ser Gly Lys Val Asp Gly Gly Asp Ser Gly Ser Gly Glu Pro Pro 485 490 495 Pro Ser Pro Thr Pro Gly Ser Thr Leu Thr Pro Pro Ala Val Gly Leu 500 505 510 Val His Ser Gly Leu Leu Ile Gly Ile Ser Ile Ala Ser Leu Cys Leu 515 520 525 Val Val Ala Leu Leu Ala Leu Leu Cys His Leu Arg Lys Lys Gln Gly 530 535 540 Ala Ala Arg Ala Lys Met Glu Tyr Lys Cys Ala Ala Pro Ser Lys Glu 545 550 555 560 Val Val Leu Gln His Val Arg Thr Glu Arg Thr Pro Gln Arg Leu 565 570 575

【０２０１】 配列番号：８ 配列の長さ：２７２ 配列の型：アミノ酸 配列の種類：蛋白質 配列 Cys Ser Val Glu Asn Gly Gly Cys Glu His Ala Cys Asn Ala Ile Pro 1 5 10 15 Gly Ala Pro Arg Cys Gln Cys Pro Ala Gly Ala Ala Leu Gln Ala Asp 20 25 30 Gly Arg Ser Cys Thr Ala Ser Ala Thr Gln Ser Cys Asn Asp Leu Cys 35 40 45 Glu His Phe Cys Val Pro Asn Pro Asp Gln Pro Gly Ser Tyr Ser Cys 50 55 60 Met Cys Glu Thr Gly Tyr Arg Leu Ala Ala Asp Gln His Arg Cys Glu 65 70 75 80 Asp Val Asp Asp Cys Ile Leu Glu Pro Ser Pro Cys Pro Gln Arg Cys 85 90 95 Val Asn Thr Gln Gly Gly Phe Glu Cys His Cys Tyr Pro Asn Tyr Asp 100 105 110 Leu Val Asp Gly Glu Cys Val Glu Pro Val Asp Pro Cys Phe Arg Ala 115 120 125 Asn Cys Glu Tyr Gln Cys Gln Pro Leu Asn Gln Thr Ser Tyr Leu Cys 130 135 140 Val Cys Ala Glu Gly Phe Ala Pro Ile Pro His Glu Pro His Arg Cys 145 150 155 160 Gln Met Phe Cys Asn Gln Thr Ala Cys Pro Ala Asp Cys Asp Pro Asn 165 170 175 Thr Gln Ala Ser Cys Glu Cys Pro Glu Gly Tyr Ile Leu Asp Asp Gly 180 185 190 Phe Ile Cys Thr Asp Ile Asp Glu Cys Glu Asn Gly Gly Phe Cys Ser 195 200 205 Gly Val Cys His Asn Leu Pro Gly Thr Phe Glu Cys Ile Cys Gly Pro 210 215 220 Asp Ser Ala Leu Val Arg His Ile Gly Thr Asp Cys Asp Ser Gly Lys 225 230 235 240 Val Asp Gly Gly Asp Ser Gly Ser Gly Glu Pro Pro Pro Ser Pro Thr 245 250 255 Pro Gly Ser Thr Leu Thr Pro Pro Ala Val Gly Leu Val His Ser Gly 260 265 270

【０２０２】 配列番号：９ 配列の長さ：７０８ 配列の型：塩基配列 配列の種類：ＤＮＡ 配列 TGC AGC GTG GAG AAC GGC GGC TGC GAG CAC GCG TGC AAT GCG ATC CCT 48 GGG GCT CCC CGC TGC CAG TGC CCA GCC GGC GCC GCC CTG CAG GCA GAC 96 GGG CGC TCC TGC ACC GCA TCC GCG ACG CAG TCC TGC AAC GAC CTC TGC 144 GAG CAC TTC TGC GTT CCC AAC CCC GAC CAG CCG GGC TCC TAC TCG TGC 192 ATG TGC GAG ACC GGC TAC CGG CTG GCG GCC GAC CAA CAC CGG TGC GAG 240 GAC GTG GAT GAC TGC ATA CTG GAG CCC AGT CCG TGT CCG CAG CGC TGT 288 GTC AAC ACA CAG GGT GGC TTC GAG TGC CAC TGC TAC CCT AAC TAC GAC 336 CTG GTG GAC GGC GAG TGT GTG GAG CCC GTG GAC CCG TGC TTC AGA GCC 384 AAC TGC GAG TAC CAG TGC CAG CCC CTG AAC CAA ACT AGC TAC CTC TGC 432 GTC TGC GCC GAG GGC TTC GCG CCC ATT CCC CAC GAG CCG CAC AGG TGC 480 CAG ATG TTT TGC AAC CAG ACT GCC TGT CCA GCC GAC TGC GAC CCC AAC 528 ACC CAG GCT AGC TGT GAG TGC CCT GAA GGC TAC ATC CTG GAC GAC GGT 576 TTC ATC TGC ACG GAC ATC GAC GAG TGC GAA AAC GGC GGC TTC TGC TCC 624 GGG GTG TGC CAC AAC CTC CCC GGT ACC TTC GAG TGC ATC TGC GGG CCC 672 GAC TCG GCC CTT GTC CGC CAC ATT GGC ACC GAC TGT 708

【０２０３】 配列番号：１０ 配列の長さ：１７２５ 配列の型：塩基配列 配列の種類：ＤＮＡ 配列 ATG CTT GGG GTC CTG GTC CTT GGC GCG CTG GCC CTG GCC GGC CTG GGG 48 TTC CCC GCA CCC GCA GAG CCG CAG CCG GGT GGC AGC CAG TGC GTC GAG 96 CAC GAC TGC TTC GCG CTC TAC CCG GGC CCC GCG ACC TTC CTC AAT GCC 144 AGT CAG ATC TGC GAC GGA CTG CGG GGC CAC CTA ATG ACA GTG CGC TCC 192 TCG GTG GCT GCC GAT GTC ATT TCC TTG CTA CTG AAC GGC GAC GGC GGC 240 GTT GGC CGC CGG CGC CTC TGG ATC GGC CTG CAG CTG CCA CCC GGC TGC 288 GGC GAC CCC AAG CGC CTC GGG CCC CTG CGC GGC TTC CAG TGG GTT ACG 336 GGA GAC AAC AAC ACC AGC TAT AGC AGG TGG GCA CGG CTC GAC CTC AAT 384 GGG GCT CCC CTC TGC GGC CCG TTG TGC GTC GCT GTC TCC GCT GCT GAG 432 GCC ACT GTG CCC AGC GAG CCG ATC TGG GAG GAG CAG CAG TGC GAA GTG 480 AAG GCC GAT GGC TTC CTC TGC GAG TTC CAC TTC CCA GCC ACC TGC AGG 528 CCA CTG GCT GTG GAG CCC GGC GCC GCG GCT GCC GCC GTC TCG ATC ACC 576 TAC GGC ACC CCG TTC GCG GCC CGC GGA GCG GAC TTC CAG GCG CTG CCG 624 GTG GGC AGC TCC GCC GCG GTG GCT CCC CTC GGC TTA CAG CTA ATG TGC 672 ACC GCG CCG CCC GGA GCG GTC CAG GGG CAC TGG GCC AGG GAG GCG CCG 720 GGC GCT TGG GAC TGC AGC GTG GAG AAC GGC GGC TGC GAG CAC GCG TGC 768 AAT GCG ATC CCT GGG GCT CCC CGC TGC CAG TGC CCA GCC GGC GCC GCC 816 CTG CAG GCA GAC GGG CGC TCC TGC ACC GCA TCC GCG ACG CAG TCC TGC 864 AAC GAC CTC TGC GAG CAC TTC TGC GTT CCC AAC CCC GAC CAG CCG GGC 912 TCC TAC TCG TGC ATG TGC GAG ACC GGC TAC CGG CTG GCG GCC GAC CAA 960 CAC CGG TGC GAG GAC GTG GAT GAC TGC ATA CTG GAG CCC AGT CCG TGT 1008 CCG CAG CGC TGT GTC AAC ACA CAG GGT GGC TTC GAG TGC CAC TGC TAC 1056 CCT AAC TAC GAC CTG GTG GAC GGC GAG TGT GTG GAG CCC GTG GAC CCG 1104 TGC TTC AGA GCC AAC TGC GAG TAC CAG TGC CAG CCC CTG AAC CAA ACT 1152 AGC TAC CTC TGC GTC TGC GCC GAG GGC TTC GCG CCC ATT CCC CAC GAG 1200 CCG CAC AGG TGC CAG ATG TTT TGC AAC CAG ACT GCC TGT CCA GCC GAC 1248 TGC GAC CCC AAC ACC CAG GCT AGC TGT GAG TGC CCT GAA GGC TAC ATC 1296 CTG GAC GAC GGT TTC ATC TGC ACG GAC ATC GAC GAG TGC GAA AAC GGC 1344 GGC TTC TGC TCC GGG GTG TGC CAC AAC CTC CCC GGT ACC TTC GAG TGC 1392 ATC TGC GGG CCC GAC TCG GCC CTT GTC CGC CAC ATT GGC ACC GAC TGT 1440 GAC TCC GGC AAG GTG GAC GGT GGC GAC AGC GGC TCT GGC GAG CCC CCG 1488 CCC AGC CCG ACG CCC GGC TCC ACC TTG ACT CCT CCG GCC GTG GGG CTC 1536 GTG CAT TCG GGC TTG CTC ATA GGC ATC TCC ATC GCG AGC CTG TGC CTG 1584 GTG GTG GCG CTT TTG GCG CTC CTC TGC CAC CTG CGC AAG AAG CAG GGC 1632 GCC GCC AGG GCC AAG ATG GAG TAC AAG TGC GCG GCC CCT TCC AAG GAG 1680 GTA GTG CTG CAG CAC GTG CGG ACC GAG CGG ACG CCG CAG AGA CTC 1725

【０２０４】 配列番号：１１ 配列の長さ：８１６ 配列の型：塩基配列 配列の種類：ＤＮＡ 配列 TGC AGC GTG GAG AAC GGC GGC TGC GAG CAC GCG TGC AAT GCG ATC CCT 48 GGG GCT CCC CGC TGC CAG TGC CCA GCC GGC GCC GCC CTG CAG GCA GAC 96 GGG CGC TCC TGC ACC GCA TCC GCG ACG CAG TCC TGC AAC GAC CTC TGC 144 GAG CAC TTC TGC GTT CCC AAC CCC GAC CAG CCG GGC TCC TAC TCG TGC 192 ATG TGC GAG ACC GGC TAC CGG CTG GCG GCC GAC CAA CAC CGG TGC GAG 240 GAC GTG GAT GAC TGC ATA CTG GAG CCC AGT CCG TGT CCG CAG CGC TGT 288 GTC AAC ACA CAG GGT GGC TTC GAG TGC CAC TGC TAC CCT AAC TAC GAC 336 CTG GTG GAC GGC GAG TGT GTG GAG CCC GTG GAC CCG TGC TTC AGA GCC 384 AAC TGC GAG TAC CAG TGC CAG CCC CTG AAC CAA ACT AGC TAC CTC TGC 432 GTC TGC GCC GAG GGC TTC GCG CCC ATT CCC CAC GAG CCG CAC AGG TGC 480 CAG ATG TTT TGC AAC CAG ACT GCC TGT CCA GCC GAC TGC GAC CCC AAC 528 ACC CAG GCT AGC TGT GAG TGC CCT GAA GGC TAC ATC CTG GAC GAC GGT 576 TTC ATC TGC ACG GAC ATC GAC GAG TGC GAA AAC GGC GGC TTC TGC TCC 624 GGG GTG TGC CAC AAC CTC CCC GGT ACC TTC GAG TGC ATC TGC GGG CCC 672 GAC TCG GCC CTT GTC CGC CAC ATT GGC ACC GAC TGT GAC TCC GGC AAG 720 GTG GAC GGT GGC GAC AGC GGC TCT GGC GAG CCC CCG CCC AGC CCG ACG 768 CCC GGC TCC ACC TTG ACT CCT CCG GCC GTG GGG CTC GTG CAT TCG GGC 816

【０２０５】 配列番号：１２ 配列の長さ：１６７１ 配列の型：塩基配列 配列の種類：ＤＮＡ 配列 GCA CCC GCA GAG CCG CAG CCG GGT GGC AGC CAG TGC GTC GAG CAC GAC 48 TGC TTC GCG CTC TAC CCG GGC CCC GCG ACC TTC CTC AAT GCC AGT CAG 96 ATC TGC GAC GGA CTG CGG GGC CAC CTA ATG ACA GTG CGC TCC TCG GTG 144 GCT GCC GAT GTC ATT TCC TTG CTA CTG AAC GGC GAC GGC GGC GTT GGC 192 CGC CGG CGC CTC TGG ATC GGC CTG CAG CTG CCA CCC GGC TGC GGC GAC 240 CCC AAG CGC CTC GGG CCC CTG CGC GGC TTC CAG TGG GTT ACG GGA GAC 288 AAC AAC ACC AGC TAT AGC AGG TGG GCA CGG CTC GAC CTC AAT GGG GCT 336 CCC CTC TGC GGC CCG TTG TGC GTC GCT GTC TCC GCT GCT GAG GCC ACT 384 GTG CCC AGC GAG CCG ATC TGG GAG GAG CAG CAG TGC GAA GTG AAG GCC 432 GAT GGC TTC CTC TGC GAG TTC CAC TTC CCA GCC ACC TGC AGG CCA CTG 480 GCT GTG GAG CCC GGC GCC GCG GCT GCC GCC GTC TCG ATC ACC TAC GGC 528 ACC CCG TTC GCG GCC CGC GGA GCG GAC TTC CAG GCG CTG CCG GTG GGC 576 AGC TCC GCC GCG GTG GCT CCC CTC GGC TTA CAG CTA ATG TGC ACC GCG 624 CCG CCC GGA GCG GTC CAG GGG CAC TGG GCC AGG GAG GCG CCG GGC GCT 672 TGG GAC TGC AGC GTG GAG AAC GGC GGC TGC GAG CAC GCG TGC AAT GCG 720 ATC CCT GGG GCT CCC CGC TGC CAG TGC CCA GCC GGC GCC GCC CTG CAG 768 GCA GAC GGG CGC TCC TGC ACC GCA TCC GCG ACG CAG TCC TGC AAC GAC 816 CTC TGC GAG CAC TTC TGC GTT CCC AAC CCC GAC CAG CCG GGC TCC TAC 864 TCG TGC ATG TGC GAG ACC GGC TAC CGG CTG GCG GCC GAC CAA CAC CGG 912 TGC GAG GAC GTG GAT GAC TGC ATA CTG GAG CCC AGT CCG TGT CCG CAG 960 CGC TGT GTC AAC ACA CAG GGT GGC TTC GAG TGC CAC TGC TAC CCT AAC 1008 TAC GAC CTG GTG GAC GGC GAG TGT GTG GAG CCC GTG GAC CCG TGC TTC 1056 AGA GCC AAC TGC GAG TAC CAG TGC CAG CCC CTG AAC CAA ACT AGC TAC 1104 CTC TGC GTC TGC GCC GAG GGC TTC GCG CCC ATT CCC CAC GAG CCG CAC 1152 AGG TGC CAG ATG TTT TGC AAC CAG ACT GCC TGT CCA GCC GAC TGC GAC 1200 CCC AAC ACC CAG GCT AGC TGT GAG TGC CCT GAA GGC TAC ATC CTG GAC 1248 GAC GGT TTC ATC TGC ACG GAC ATC GAC GAG TGC GAA AAC GGC GGC TTC 1296 TGC TCC GGG GTG TGC CAC AAC CTC CCC GGT ACC TTC GAG TGC ATC TGC 1344 GGG CCC GAC TCG GCC CTT GTC CGC CAC ATT GGC ACC GAC TGT GAC TCC 1392 GGC AAG GTG GAC GGT GGC GAC AGC GGC TCT GGC GAG CCC CCG CCC AGC 1440 CCG ACG CCC GGC TCC ACC TTG ACT CCT CCG GCC GTG GGG CTC GTG CAT 1488 TCG GGC TTG CTC ATA GGC ATC TCC ATC GCG AGC CTG TGC CTG GTG GTG 1536 GCG CTT TTG GCG CTC CTC TGC CAC CTG CGC AAG AAG CAG GGC GCC GCC 1584 AGG GCC AAG ATG GAG TAC AAG TGC GCG GCC CCT TCC AAG GAG GTA GTG 1632 CTG CAG CAC GTG CGG ACC GAG CGG ACG CCG CAG AGA CTC 1671

【０２０６】 配列番号：１３ 配列の長さ：５５７ 配列の型：アミノ酸 配列の種類：蛋白質 配列 Ala Pro Ala Glu Pro Gln Pro Gly Gly Ser Gln Cys Val Glu His Asp 1 5 10 15 Cys Phe Ala Leu Tyr Pro Gly Pro Ala Thr Phe Leu Asn Ala Ser Gln 20 25 30 Ile Cys Asp Gly Leu Arg Gly His Leu Met Thr Val Arg Ser Ser Val 35 40 45 Ala Ala Asp Val Ile Ser Leu Leu Leu Asn Gly Asp Gly Gly Val Gly 50 55 60 Arg Arg Arg Leu Trp Ile Gly Leu Gln Leu Pro Pro Gly Cys Gly Asp 65 70 75 80 Pro Lys Arg Leu Gly Pro Leu Arg Gly Phe Gln Trp Val Thr Gly Asp 85 90 95 Asn Asn Thr Ser Tyr Ser Arg Trp Ala Arg Leu Asp Leu Asn Gly Ala 100 105 110 Pro Leu Cys Gly Pro Leu Cys Val Ala Val Ser Ala Ala Glu Ala Thr 115 120 125 Val Pro Ser Glu Pro Ile Trp Glu Glu Gln Gln Cys Glu Val Lys Ala 130 135 140 Asp Gly Phe Leu Cys Glu Phe His Phe Pro Ala Thr Cys Arg Pro Leu 145 150 155 160 Ala Val Glu Pro Gly Ala Ala Ala Ala Ala Val Ser Ile Thr Tyr Gly 165 170 175 Thr Pro Phe Ala Ala Arg Gly Ala Asp Phe Gln Ala Leu Pro Val Gly 180 185 190 Ser Ser Ala Ala Val Ala Pro Leu Gly Leu Gln Leu Met Cys Thr Ala 195 200 205 Pro Pro Gly Ala Val Gln Gly His Trp Ala Arg Glu Ala Pro Gly Ala 210 215 220 Trp Asp Cys Ser Val Glu Asn Gly Gly Cys Glu His Ala Cys Asn Ala 225 230 235 240 Ile Pro Gly Ala Pro Arg Cys Gln Cys Pro Ala Gly Ala Ala Leu Gln 245 250 255 Ala Asp Gly Arg Ser Cys Thr Ala Ser Ala Thr Gln Ser Cys Asn Asp 260 265 270 Leu Cys Glu His Phe Cys Val Pro Asn Pro Asp Gln Pro Gly Ser Tyr 275 280 285 Ser Cys Met Cys Glu Thr Gly Tyr Arg Leu Ala Ala Asp Gln His Arg 290 295 300 Cys Glu Asp Val Asp Asp Cys Ile Leu Glu Pro Ser Pro Cys Pro Gln 305 310 315 320 Arg Cys Val Asn Thr Gln Gly Gly Phe Glu Cys His Cys Tyr Pro Asn 325 330 335 Tyr Asp Leu Val Asp Gly Glu Cys Val Glu Pro Val Asp Pro Cys Phe 340 345 350 Arg Ala Asn Cys Glu Tyr Gln Cys Gln Pro Leu Asn Gln Thr Ser Tyr 355 360 365 Leu Cys Val Cys Ala Glu Gly Phe Ala Pro Ile Pro His Glu Pro His 370 375 380 Arg Cys Gln Met Phe Cys Asn Gln Thr Ala Cys Pro Ala Asp Cys Asp 385 390 395 400 Pro Asn Thr Gln Ala Ser Cys Glu Cys Pro Glu Gly Tyr Ile Leu Asp 405 410 415 Asp Gly Phe Ile Cys Thr Asp Ile Asp Glu Cys Glu Asn Gly Gly Phe 420 425 430 Cys Ser Gly Val Cys His Asn Leu Pro Gly Thr Phe Glu Cys Ile Cys 435 440 445 Gly Pro Asp Ser Ala Leu Val Arg His Ile Gly Thr Asp Cys Asp Ser 450 455 460 Gly Lys Val Asp Gly Gly Asp Ser Gly Ser Gly Glu Pro Pro Pro Ser 465 470 475 480 Pro Thr Pro Gly Ser Thr Leu Thr Pro Pro Ala Val Gly Leu Val His 485 490 495 Ser Gly Leu Leu Ile Gly Ile Ser Ile Ala Ser Leu Cys Leu Val Val 500 505 510 Ala Leu Leu Ala Leu Leu Cys His Leu Arg Lys Lys Gln Gly Ala Ala 515 520 525 Arg Ala Lys Met Glu Tyr Lys Cys Ala Ala Pro Ser Lys Glu Val Val 530 535 540 Leu Gln His Val Arg Thr Glu Arg Thr Pro Gln Arg Leu 545 550 555

【０２０７】 配列番号：１４ 配列の長さ：４６２ 配列の型：アミノ酸 配列 Ala Pro Ala Glu Pro Gln Pro Gly Gly Ser Gln Cys Val Glu His Asp 1 5 10 15 Cys Phe Ala Leu Tyr Pro Gly Pro Ala Thr Phe Leu Asn Ala Ser Gln 20 25 30 Ile Cys Asp Gly Leu Arg Gly His Leu Met Thr Val Arg Ser Ser Val 35 40 45 Ala Ala Asp Val Ile Ser Leu Leu Leu Asn Gly Asp Gly Gly Val Gly 50 55 60 Arg Arg Arg Leu Trp Ile Gly Leu Gln Leu Pro Pro Gly Cys Gly Asp 65 70 75 80 Pro Lys Arg Leu Gly Pro Leu Arg Gly Phe Gln Trp Val Thr Gly Asp 85 90 95 Asn Asn Thr Ser Tyr Ser Arg Trp Ala Arg Leu Asp Leu Asn Gly Ala 100 105 110 Pro Leu Cys Gly Pro Leu Cys Val Ala Val Ser Ala Ala Glu Ala Thr 115 120 125 Val Pro Ser Glu Pro Ile Trp Glu Glu Gln Gln Cys Glu Val Lys Ala 130 135 140 Asp Gly Phe Leu Cys Glu Phe His Phe Pro Ala Thr Cys Arg Pro Leu 145 150 155 160 Ala Val Glu Pro Gly Ala Ala Ala Ala Ala Val Ser Ile Thr Tyr Gly 165 170 175 Thr Pro Phe Ala Ala Arg Gly Ala Asp Phe Gln Ala Leu Pro Val Gly 180 185 190 Ser Ser Ala Ala Val Ala Pro Leu Gly Leu Gln Leu Met Cys Thr Ala 195 200 205 Pro Pro Gly Ala Val Gln Gly His Trp Ala Arg Glu Ala Pro Gly Ala 210 215 220 Trp Asp Cys Ser Val Glu Asn Gly Gly Cys Glu His Ala Cys Asn Ala 225 230 235 240 Ile Pro Gly Ala Pro Arg Cys Gln Cys Pro Ala Gly Ala Ala Leu Gln 245 250 255 Ala Asp Gly Arg Ser Cys Thr Ala Ser Ala Thr Gln Ser Cys Asn Asp 260 265 270 Leu Cys Glu His Phe Cys Val Pro Asn Pro Asp Gln Pro Gly Ser Tyr 275 280 285 Ser Cys Met Cys Glu Thr Gly Tyr Arg Leu Ala Ala Asp Gln His Arg 290 295 300 Cys Glu Asp Val Asp Asp Cys Ile Leu Glu Pro Ser Pro Cys Pro Gln 305 310 315 320 Arg Cys Val Asn Thr Gln Gly Gly Phe Glu Cys His Cys Tyr Pro Asn 325 330 335 Tyr Asp Leu Val Asp Gly Glu Cys Val Glu Pro Val Asp Pro Cys Phe 340 345 350 Arg Ala Asn Cys Glu Tyr Gln Cys Gln Pro Leu Asn Gln Thr Ser Tyr 355 360 365 Leu Cys Val Cys Ala Glu Gly Phe Ala Pro Ile Pro His Glu Pro His 370 375 380 Arg Cys Gln Met Phe Cys Asn Gln Thr Ala Cys Pro Ala Asp Cys Asp 385 390 395 400 Pro Asn Thr Gln Ala Ser Cys Glu Cys Pro Glu Gly Tyr Ile Leu Asp 405 410 415 Asp Gly Phe Ile Cys Thr Asp Ile Asp Glu Cys Glu Asn Gly Gly Phe 420 425 430 Cys Ser Gly Val Cys His Asn Leu Pro Gly Thr Phe Glu Cys Ile Cys 435 440 445 Gly Pro Asp Ser Ala Leu Val Arg His Ile Gly Thr Asp Cys 450 455 460

【０２０８】 配列番号：１５ 配列の長さ：１３８６ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 配列 GCACCCGCAG AGCCGCAGCC GGGTGGCAGC CAGTGCGTCG AGCACGACTG CTTCGCGCTC 60 TACCCGGGCC CCGCGACCTT CCTCAATGCC AGTCAGATCT GCGACGGACT GCGGGGCCAC 120 CTAATGACAG TGCGCTCCTC GGTGGCTGCC GATGTCATTT CCTTGCTACT GAACGGCGAC 180 GGCGGCGTTG GCCGCCGGCG CCTCTGGATC GGCCTGCAGC TGCCACCCGG CTGCGGCGAC 240 CCCAAGCGCC TCGGGCCCCT GCGCGGCTTC CAGTGGGTTA CGGGAGACAA CAACACCAGC 300 TATAGCAGGT GGGCACGGCT CGACCTCAAT GGGGCTCCCC TCTGCGGCCC GTTGTGCGTC 360 GCTGTCTCCG CTGCTGAGGC CACTGTGCCC AGCGAGCCGA TCTGGGAGGA GCAGCAGTGC 420 GAAGTGAAGG CCGATGGCTT CCTCTGCGAG TTCCACTTCC CAGCCACCTG CAGGCCACTG 480 GCTGTGGAGC CCGGCGCCGC GGCTGCCGCC GTCTCGATCA CCTACGGCAC CCCGTTCGCG 540 GCCCGCGGAG CGGACTTCCA GGCGCTGCCG GTGGGCAGCT CCGCCGCGGT GGCTCCCCTC 600 GGCTTACAGC TAATGTGCAC CGCGCCGCCC GGAGCGGTCC AGGGGCACTG GGCCAGGGAG 660 GCGCCGGGCG CTTGGGACTG CAGCGTGGAG AACGGCGGCT GCGAGCACGC GTGCAATGCG 720 ATCCCTGGGG CTCCCCGCTG CCAGTGCCCA GCCGGCGCCG CCCTGCAGGC AGACGGGCGC 780 TCCTGCACCG CATCCGCGAC GCAGTCCTGC AACGACCTCT GCGAGCACTT CTGCGTTCCC 840 AACCCCGACC AGCCGGGCTC CTACTCGTGC ATGTGCGAGA CCGGCTACCG GCTGGCGGCC 900 GACCAACACC GGTGCGAGGA CGTGGATGAC TGCATACTGG AGCCCAGTCC GTGTCCGCAG 960 CGCTGTGTCA ACACACAGGG TGGCTTCGAG TGCCACTGCT ACCCTAACTA CGACCTGGTG 1020 GACGGCGAGT GTGTGGAGCC CGTGGACCCG TGCTTCAGAG CCAACTGCGA GTACCAGTGC 1080 CAGCCCCTGA ACCAAACTAG CTACCTCTGC GTCTGCGCCG AGGGCTTCGC GCCCATTCCC 1140 CACGAGCCGC ACAGGTGCCA GATGTTTTGC AACCAGACTG CCTGTCCAGC CGACTGCGAC 1200 CCCAACACCC AGGCTAGCTG TGAGTGCCCT GAAGGCTACA TCCTGGACGA CGGTTTCATC 1260 TGCACGGACA TCGACGAGTG CGAAAACGGC GGCTTCTGCT CCGGGGTGTG CCACAACCTC 1320 CCCGGTACCT TCGAGTGCAT CTGCGGGCCC GACTCGGCCC TTGTCCGCCA CATTGGCACC 1380 GACTGT 1386

【図面の簡単な説明】

【図１】ヒト肺から精製して得られる、トロンビンによ
るプロテインＣ活性化を促進する作用を有するペプチド
を参考例２において４回目のＤＩＰ−トロンビン−アガ
ロ−スカラムクロマトグラフィーに供した結果を示すグ
ラフである。

【図２】参考例３−（２）で得られる、ＤＮＡ断片ＴＭ
１３の塩基配列を示すものである。

【図３】図２に続くＤＮＡ断片ＴＭ１３の塩基配列を示
すものである。

【図４】参考例３−（５）で得られる、ＤＮＡ断片ＴＭ
１３７の塩基配列を示すものである。

【図５】図４に続くＤＮＡ断片ＴＭ１３７の塩基配列を
示すものである。

【図６】図５に続くＤＮＡ断片ＴＭ１３７の塩基配列を
示すものである。

【図７】図６に続くＤＮＡ断片ＴＭ１３７の塩基配列を
示すものである。

【図８】参考例３−（７）で得られる、ＤＮＡ断片ＴＭ
Ｐ５の塩基配列を示すものである。

【図９】図８に続くＤＮＡ断片ＴＰＭ５の塩基配列を示
すものである。

【図１０】参考例３−（１０）で得られる、ＤＮＡ断片
ＴＭＰ２６の塩基配列を示すものである。

【図１１】ＤＮＡ断片ＴＭＰ１３、ＴＭ１３７、ＴＭＰ
５およびＴＭＰ２６と参考例３−（１３−１）及び３−
（１３−２）で得られるＤＮＡ断片ＴＭＪ１とＴＭＪ２
の各制限酵素地図と、これらのＤＮＡ断片の有する塩基
配列における対応関係を示すものであり、縦方向にみて
各ＤＮＡ断片の互いに重なる部分は共通の塩基配列を有
することを示す。図中ＤＮＡ断片ＴＭＪ２の制限酵素地
図の斜線部分は斜交線部分とを含む部分は考えられるオ
ープンリーディングフレームであり、斜交線部分に本発
明の塩基配列が存在するものである。

【図１２】ＴＭＪ１とそれに結合したＴＭＰ５を含有す
るプラスミドｐＵＣ１８ＴＭＪ１の構築を示すフローチ
ャートである。

【図１３】ＴＭＪ１とそれに結合したＴＭＰ２６を含有
するプラスミドｐＵＣ１８ＴＭＪ２の構築を示すフロー
チャートである。

【図１４】ＴＭＪ２を動物細胞宿主用発現ベクターに挿
入することによりプラスミドｐＳＶ２ＴＭＪ２の構築を
示すフローチャートである。

【図１５】実施例１−（２）−（ａ）で得られた組換え
体プラスミドＭ−１３ｍｐ１９ＴＭＪ３にディリーター
ＴＭＤが相補的にハイブリダイズしたところを示すもの
であり、ディリーターがプラスミドにハイブリダイズし
ている部分の周辺の塩基配列とそれによってコードされ
ているアミノ酸配列を示すものである。

【図１６】実施例１−（２）−（ｂ）で得られた組換え
体プラスミドｐＳＶ２ＴＭＤ１にディリーターＴＭｄ₂
が相補的にハイブリダイズしたところを示すものであ
り、ディリーターがプラスミドにハイブリダイズしてい
る部分の周辺の塩基配列とそれによってコードされてい
るアミノ酸配列を示すものである。

【図１７】実施例１−（２）−（ａ）で得られた組換え
体プラスミドＭ−１３ｍｐ１９ＴＭＪ３にディリーター
ＴＭｄ₃が相補的にハイブリダイズしたところを示すも
のであり、ディリーターがプラスミドにハイブリダイズ
している部分の周辺の塩基配列とそれによってコードさ
れているアミノ酸配列を示すものである。

【図１８】実施例１−（４）−（ａ）で得られた組換え
体プラスミドＭ１３−ＴＭＤ３にディリーターＴＭｄ₂
が相補的にハイブリダイズしたところを示すものであ
り、ディリーターがプラスミドにハイブリダイズしてい
る部分の周辺の塩基配列とそれによってコードされてい
るアミノ酸配列を示すものである。

【図１９】実施例１−（４）−（ａ）で得られた組換え
体プラスミドＭ１３−ＴＭＤ３にディリーターＴＭｄ₄
が相補的にハイブリダイズしたところを示すものであ
り、ディリーターがプラスミドにハイブリダイズしてい
る部分の周辺の塩基配列とそれによってコードされてい
るアミノ酸配列を示すものである。

【図２０】本発明の複製可能な組換え体ＤＮＡであるプ
ラスミドｐｄＢＰＶＴＭＤ５−１の構築を示すフローチ
ャートである。

【図２１】図２０に続く複製可能可能な組換え体ＤＮＡ
であるプラスミドｐｄＢＰＶＴＭＤ５−１の構築を示す
フローチャートである。

【図２２】本発明の複製可能な組換え体ＤＮＡであるプ
ラスミドｐｄＢＰＶＴＭＤ４−１の構築を示すフローチ
ャートである。

【図２３】図２２に続く複製可能な組換え体ＤＮＡであ
るプラスミドｐｄＢＰＶＴＭＤ４−１の構築を示すフロ
ーチャートである。

【図２４】本発明の複製可能な組換え体ＤＮＡであるプ
ラスミドｐｄＢＰＶＴＭＤ２−１の構築を示すフローチ
ャートである。

【図２５】図２４に続く複製可能な組換え体ＤＮＡであ
るプラスミドｐｄＢＰＶＴＭＤ２−１の構築を示すフロ
ーチャートである。

【図２６】本発明の複製可能な組換え体ＤＮＡであるプ
ラスミドｐｄＢＰＶＴＭＤ１−１の構築を示すフローチ
ャートである。

【図２７】図２６に続く複製可能な組換え体ＤＮＡであ
るプラスミドｐｄＢＰＶＴＭＤ１−１の構築を示すフロ
ーチャートである。

【図２８】本発明の複製可能な組換え体ＤＮＡであるプ
ラスミドｐｄＢＰＶＴＭＪ２−１の構築を示すフローチ
ャートである。

【図２９】図２８に続く複製可能な組換え体ＤＮＡであ
るプラスミドｐｄＢＰＶＴＭＪ２−１の構築を示すフロ
ーチャートである。

【図３０】プラスミドｐＳＶ２ＴＭＤ５でトランスフォ
ームした細胞を培養・精製し、得られたペプチドの存在
下及び非存在下における、プロテインＣとトロンビンと
の反応によって生成した活性化プロテインＣの量と反応
時間との関係を示すグラフである。

【図３１】プラスミドｐＳＶ２ＴＭＤ４でトランスフォ
ームした細胞を培養・精製し、得られたペプチドの存在
下及び非存在下における、プロテインＣとトロンビンと
の反応によって生成した活性化プロテインＣの量と反応
時間との関係を示すグラフである。

【図３２】プラスミドｐＳＶ２ＴＭＤ２でトランスフォ
ームした細胞を培養・精製し、得られたペプチドの存在
下及び非存在下における、プロテインＣとトロンビンと
の反応によって生成した活性化プロテインＣの量と反応
時間との関係を示すグラフである。

【図３３】プラスミドｐＳＶ２ＴＭＤ１でトランスフォ
ームした細胞を培養・精製し、得られたペプチドの存在
下及び非存在下における、プロテインＣとトロンビンと
の反応によって生成した活性化プロテインＣの量と反応
時間との関係を示すグラフである。

【図３４】プラスミドｐＳＶ２ＴＭＪ２でトランスフォ
ームした細胞を培養・精製し、得られたペプチドの存在
下及び非存在下における、プロテインＣとトロンビンと
の反応によって生成した活性化プロテインＣの量と反応
時間との関係を示すグラフである。

【図３５】プラスミドｐＳＶ２ＴＭＤ５でトランスフォ
ームした細胞を培養・精製し、得られたペプチドを添加
した血液の凝固時間と精製した本発明のペプチドの添加
量との関係を示すグラフである。

【図３６】プラスミドｐＳＶ２ＴＭＤ４でトランスフォ
ームした細胞を培養・精製し、得られたペプチドを添加
した血液の凝固時間と精製した本発明のペプチドの添加
量との関係を示すグラフである。

【図３７】プラスミドｐＳＶ２ＴＭＤ２でトランスフォ
ームした細胞を培養・精製し、得られたペプチドを添加
した血液の凝固時間と精製した本発明のペプチドの添加
量との関係を示すグラフである。

【図３８】プラスミドｐＳＶ２ＴＭＤ１でトランスフォ
ームした細胞を培養・精製し、得られたペプチドを添加
した血液の凝固時間と精製した本発明のペプチドの添加
量との関係を示すグラフである。

【図３９】プラスミドｐＳＶ２ＴＭＪ２でトランスフォ
ームした細胞を培養・精製し、得られたペプチドを添加
した血液の凝固時間と精製した本発明のペプチドの添加
量との関係を示すグラフである。

【図４０】ＤＮＡ断片ＴＭＪ２の制限酵素地図である。
図中、斜線部分と斜交線部分とを含む部分は考えられる
オープンリーディングフレームであり、斜交線部分に本
発明のペプチドをコードする塩基配列が存在するもので
ある。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ //(Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (31)優先権主張番号 特願昭62−305876 (32)優先日 昭62(1987)12月４日 (33)優先権主張国 日本（ＪＰ） (31)優先権主張番号 特願昭62−305877 (32)優先日 昭62(1987)12月４日 (33)優先権主張国 日本（ＪＰ） (31)優先権主張番号 特願昭62−305878 (32)優先日 昭62(1987)12月４日 (33)優先権主張国 日本（ＪＰ） (56)参考文献 特開 昭62−169728（ＪＰ，Ａ) 特開 平３−503757（ＪＰ，Ａ) Ｊ．ＣＬＩＮ．ＩＮＶＥＳＴ．ＶＯ Ｌ．76，（1985）ＰＰ．2178−2181 ＴＨＥ ＥＭＢＯ ＪＯＵＲＮＡ Ｌ．，ＶＯＬ．６，ＮＯ．７（1987）Ｐ Ｐ．1891−1897

Claims (7)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 配列番号７の１−５７５のアミノ酸配
   列、または該アミノ酸配列のアミノ酸残基の置換、挿入
   または欠失を施すことにより得られるアミノ酸配列を有
   し、且つ下記（ａ）、（ｂ）、（ｄ）〜（ｆ）に規定さ
   れる組換えペプチドであって、少なくとも該組換えペプ
   チド中に、ヒト由来の夾雑成分を実質的に含有しないこ
   とを特徴とする実質的に精製された組換えペプチド（但
   し、該ペプチドが配列番号３の１−４９８のアミノ酸配
   列からなるペプチドである場合を除く）。 （ａ）トロンビンに結合し、 （ｂ）トロンビンによるプロテインＣの活性化を促進す
   る作用を有する、 （ｄ）トロンビンによる凝固時間を延長する、 （ｅ）トロンビンによる血小板凝集を抑制する、 （ｆ）ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上にて、銀染色
   が可能である。
2. 【請求項２】 該組換えペプチドが、（ｃ）少なくとも
   界面活性剤の非存在下で可溶性である可溶性ペプチドで
   あることを特徴とする請求項１に記載の組換えペプチ
   ド。
3. 【請求項３】 該組換えペプチドが、配列番号３の１−
   ４９８のアミノ酸配列のアミノ酸残基の置換、挿入また
   は欠失を施すことにより得られるアミノ酸配列を有する
   ことを特徴とする請求項１または２に記載の組換えペプ
   チド。
4. 【請求項４】 該組換えペプチドが、 （ｉ）配列番号８の１−２７２のアミノ酸配列におい
   て、少なくとも該配列番号８の１１９−２３６のアミノ
   酸配列を包含するように該配列番号８のＮ末端及び／又
   はＣ末端の任意の個数のアミノ酸残基が削除されていて
   もよいアミノ酸配列からなるトロンビンに結合し、トロ
   ンビンによるプロテインＣの活性化を促進する作用を有
   する組換えペプチド、 （ii) 前記（ｉ）に記載の組換えペプチドのアミノ酸配
   列のアミノ酸残基の置換、挿入または欠失を施すことに
   より得られるアミノ酸配列からなり、且つトロン ビンに
   結合し、トロンビンによるプロテインＣの活性化を促進
   する作用を有する組換えペプチド、のいずれかであるこ
   とを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の組換え
   ペプチド。
5. 【請求項５】 下記（ａ）〜（ｇ）に規定される実質的
   に精製された可溶性ペプチド（但し、該ペプチドが配列
   番号３の１−４９８のアミノ酸配列からなるペプチドで
   ある場合を除く）。 （ａ）トロンビンに結合し、 （ｂ）トロンビンによるプロテインＣの活性化を促進す
   る作用を有する、 （ｃ）少なくとも界面活性剤の非存在下で可溶性であ
   る、 （ｄ）トロンビンによる凝固時間を延長する、 （ｅ）トロンビンによる血小板凝集を抑制する、 （ｆ）ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上にて、銀染色
   が可能である、 （ｇ）該可溶性ペプチドのアミノ酸配列の相同性が、該
   アミノ酸配列の範囲において、下記の制限酵素地図 【化１】 に示された制限酵素サイトを有することにより特徴付け
   られるヒト由来のＤＮＡがコードし得るトロンビンに結
   合し、かつトロンビンによるプロテインＣの活性化を促
   進する作用を有するペプチドのアミノ酸配列と完全に一
   致する相同性を有する。
6. 【請求項６】 該可溶性ペプチドがＤＩＰ−トロンビン
   −アガロースカラムに結合せしめたときに、１Ｍ Ｎａ
   Ｃｌ、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ベンズアミジン
   塩酸、０．５％（ｖ／ｖ）ポリドカノールを含む０．０
   ２Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）により溶出できる
   性質、又は、該可溶性ペプチドが、０ ．１Ｍ ＮａＣ
   ｌ、０．５ｍＭ ＣａＣｌ ₂ 、０．５％（ｖ／ｖ）ポリ
   ドカノールを含む０．０２Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ
   ７．５）により平衡化したＤＩＰ−トロンビン−アガロ
   ースカラムに、該緩衝液にて該可溶性ペプチドを溶解せ
   しめた溶液を接触せしめた場合に、該可溶性ペプチドが
   前記カラムに結合せしめることができる性質を有するこ
   とを特徴とする請求項５に記載の可溶性ペプチド。
7. 【請求項７】 該ペプチドが、糖鎖が付いた、又は糖鎖
   が付いていないことを特徴とする請求項１〜６のいずれ
   かに記載のペプチド。