JP2782017B2

JP2782017B2 - 生体内でのコラーゲン分解の検出方法

Info

Publication number: JP2782017B2
Application number: JP3500884A
Authority: JP
Inventors: アール．エア，デイヴィッド
Original assignee: ワシントンリサーチファンデーション
Priority date: 1989-12-01
Filing date: 1990-11-30
Publication date: 1998-07-30
Anticipated expiration: 2013-07-30
Also published as: IE65280B1; US5576189A; JP2000050865A; DK0682256T3; JP2002139492A; NO309483B1; DE69033082T2; DK0682257T3; JP2999444B2; US5473052A; IE904344A1; US5677198A; WO1991008478A2; DE69025199D1; EP0682256A1; DK0502928T3; AU645049B2; WO1991008478A3; EP0890840A2; NO922149D0

Description

【発明の詳細な説明】発明の技術分野本発明は、生体中でのコラーゲンの分解を検出し、観
察する方法に関する。更に詳しくは、コラーゲンタイプ
II及びIIIの分解により、生体内で生産される架橋した
テロペプチドを定量する方法に関する。

発明の背景本出願は、1987年11月６日に出願された米国出願第11
8,234号の一部継続出願である、1989年11月１日に出願
された米国出願第444,881号の一部継続出願である。

今日まで３種類の公知のクラスのコラーゲンが報告さ
れている。クラスＩのコラーゲンは、タイプＩ、II、II
I、Ｖ及びXIに細分類され、原線維を形成することが知
られている。これらのコラーゲンは、核コラーゲン分子
とこれに付加している、Ｎ−末端及びＣ−末端ペプチド
から成る、プロコラーゲン除去の後、コラーゲン分子の
残りの核は、大部分が、三重らせんではない末端テロペ
プチド配列を有する、三重らせん構造から成る。これら
のテロペプチド配列は、コラーゲン原線維の分子間架橋
点として、細胞外で重要な機能を有している。

本発明は、生体内でのコラーゲン分解により製造され
る特異的架橋テロペプチドの分析に基づくコラーゲン分
解を検出する方法に関する。過去において、種々の生物
化学的マーカーを測定することにより生体内のコラーゲ
ン分解を観察するための分析法が開発されており、マー
カーのいくつかはコラーゲンの分解生成物であった。た
とえば、ページェット病と結合した骨回転は、骨コラー
ゲンの分解に続いて尿中に排泄されたヒドロキシプロリ
ンを含有する小さいペプチドを測定することにより観察
されている。セッセル等（Russell et al）,Metab,Bone
Dis.and Rel.Res.4及び５、255−262（1981）；及びシ
ンガー等（Singer,F.R.,et al.,）、代謝骨病（Metabol
ic Bone Disease）、Vol.2.（eds.Avioli,L.V.and Kan
e,S.M.）489−575（1978）、アカデミックプレス、ニュ
ーヨーク。

他の研究者達は、関節疾患におけるコラーゲン分解の
指標としての尿中の架橋化合物ピリジノリンを測定して
いる。背景及び例として、ウー及びエア（Wu and Eyr
e）、Biochemistry、23:1850（1984）；ブラック等（Bl
ack et al.）;Annals of the Rheumatic Diseases、48:
641−644;ロビンス等（Robins et al.）;Annals of the
Rheumatic Diseases、45:969−973;及びサイベル等（S
eibel et al.）The Journal of Rheumatology、16:964
（1989）参照、本発明とは対照的に、何人かの先行研究
者は、体液からのペプチドを加水分解し、次いで個々の
ヒドロキシピリジニウム残基の存在を捜した。それらの
研究者は何れも、本発明のように、コラーゲンの分解に
より生体内で自然に生産される、架橋を含むテロペプチ
ドの測定を報告してはいない。

英国特許出願GB2,205,643号は、体内のタイプIIIコラ
ーゲンの分解が、体液中のタイプIIIコラーゲンからの
Ｎ−末端テロペプチドの濃度を測定することにより定量
的に決定されることを報告している。この引例において
は、架橋テロペプチド領域は望ましくないことが報告さ
れている。実際、この引例は、テロペプチドを得るため
には、架橋していないコラーゲン源を使用することが必
要であると報告している。本発明のペプチドはすべて架
橋している。コラーゲンの架橋は、「コラーゲン架橋」
と標題された、以下の項目で詳細に記載する。

ある種のプロコラーゲンペプチドを定量することによ
り、コラーゲンの分解が測定できると記載された数多く
の報告がある。本発明は、プロペプチドよりもテロペプ
チドを含むものであり、これら二者は、コラーゲン分子
中のそれらの位置及び生体内でのそれらの開裂の時期に
より区別される。米国特許第4,504,587号、米国特許第
4,312,853号、ピエラルド等（Pierardetal.）、Analyti
cal Biochemistry 141:127−136（1984）；ニエメラ（N
iemera）、Clin.Chem.31/8:1301−1304（1985）；及び
ローデ等（Rohdeetal.）、European Journal of Clinic
al Investigation,9:451−459（1979）参照。

米国特許第4,778,768号は、滑液試料中のプロテオグ
リカン単量体またはその抗原性フラグメントを定量する
ことを含む、関節軟骨に生ずる変化を定量する方法に関
する。この特許は、分解したコラーゲンから誘導される
架橋したテロペプチドを検出するものではない。

ドッジ（Dodge）、J.Clln.Invest.,83:647−661（198
1）は、ヒト及びウシタイプIIコラーゲンの、巻いてい
ないアルファー鎖及びシアナゲンブロミド処理によるペ
プチドと特異的に反応するポリクローナル抗血清を利用
するタイプIIコラーゲンの分解を分析する方法を開示し
ている。含有されているペプチドは、本発明のような架
橋したテロペプチドではない。

ヒトタイプIIIコラーゲン、ヒトプロa1（II）コラー
ゲン、及びヒトタイプIIIコラーゲンの全体のプレプロa
1（III）鎖及び相当するcDNAクローンのアミノ酸配列が
いくつかのグループの研究者らにより研究されており決
定されている。ロイドル等（Loidl et al.）、Nucleic
Acids Research 12:9383−9394（1984）；サンジョルジ
ュ等（Sangiorgi et al.）、Nucleic Acids Research 1
3:2207−2225（1985）；バールドウィン等（Baldwin et
al.）、Biochem.J.,262:521−528（1989）；及びアラ
−コッコ等（Ala−Kokko et al.）、Biochem.J.,260:50
9−516（1989）参照。これらの引例は、何れも、生体内
で分解した原線維コラーゲンの量を定量することができ
る特別なテロペプチドの分解生成物の構造を特定しては
いない。

上記した背景技術の情報にも拘らず、生体内のコラー
ゲン分解を定量するための効果的で簡単な分析方法が必
要とされている。そのような分析法は、変形性関節症
（タイプIIコラーゲン分解）のようなヒトの病状、及び
脈管炎症候群（タイプIIIコラーゲン分解）のような炎
症性の障害を検出し観察するのに使用することができ
る。

親出願の米国出願第118,234号に記載されているタイ
プＩコラーゲン分解の分析は、生体内の骨吸収を検出し
評価するのに利用することができる。骨吸収の検出は、
骨粗しょう症のような病気を観察し検出するのに重要な
因子であるかもしれない。骨粗しょう症は人類における
最も一般的な骨の病気である。主要な骨粗しょう症は、
骨折が起こり易くなると共に、骨格骨量の正味量の急激
な損失を引き起こす。米国においては、1500〜2000万人
の人が罹っていると予想される。その原因は骨を作り直
す際の年令に依存する不均衡、即ち、合成速度と骨組織
の分解における不均衡である。

約120万人の骨粗しょう症に関連する骨折が、毎年、
年長者に起こり、約538,000の背骨の圧縮骨折、役227,0
00のでん部骨折及びかなりの数の耳の末梢骨の骨折が含
まれている。でん部骨折の12〜20％は致命的である。何
故なら、それは重大な外傷及び出血を引き起こし、生き
残った半数の患者はナーシングホームによる療養を必要
とする。骨粗しょう症に関連する障害に要する総額は、
現在、毎年、少なくとも70億ドルである（バーネス（Ba
rnes,O.M.）、Science,236:914（1987））。

骨粗しょう症は、平均して、閉経後の10年間で彼女ら
の骨の15％を失う閉経後の女性に最も一般的なものであ
る。この病気は、また、年長の男性及び若い無月経の女
性競技者にも生ずる。骨粗しょう症の主要で、かつ増加
する、社会的及び経済的な重要性にも拘わらず、患者及
び正常人の骨吸収の速度を測定するのに有用な方法はな
い。この病気を観察する際の主要な困難は、骨吸収速度
を測定する特別の分析法が欠如していることである。

骨量を測定する方法は、しばしば、中性子活性分析に
より身体全体のカルシウム量を、また得られた骨の無機
物質を光子吸収技術により測定することに頼っている。
これらの測定は、骨の量が減少するかどうかの長期間の
結果のみを与えることができる。カルシウムのバランス
を摂取及び放出を比較することにより測定することは冗
長で、信頼性が低く、骨無機物が長い期間に失われてい
るかどうかを間接的に評価するだけである。減少した骨
の量及び変化した骨の代謝を評価するのに、現在、有用
な他の方法としては、選択された骨の位置（手首、踵
骨、等）での定量的操作放射測定及び腸骨稜生体組織検
査の組織形態測定が挙げられる。前者は単一骨中の特定
点の骨無機物量のおおよその値を与える。組織形態測定
は、新たに付着した骨の縫合線と吸収表面の間のバラン
スを半定量的評価として与える。

分解した骨の全身からの排出について24時間の間の尿
を分析することは、より有効であろう。無機物の研究
（例えば、カルシウムバランス）は、これを信頼性高く
または容易に行うことができない。骨吸収は無機物及び
有機マトリックスの分解を伴っているので、体液中の新
たに分解した骨の生成物のための特別の生物化学的マー
カーは、理想的な指標となるであろう。幾つかの可能な
有機指標が試験されている。例えば、コラーゲンに対し
非常に制限されたアミノ酸で、骨及び他の全ての結合組
織の主要組織タンパク質であるヒドロキシプロリンが尿
中に排泄される。その排泄速度は、ある条件においては
増加することが知られており、上記したように、骨の回
転が非常に増大する代謝骨疾患であるページェット病で
顕著である。この理由から、尿のヒドロキシプロリン
は、コラーゲン分解のアミノ酸マーカーとして広範囲に
使用されている。上記に引用したシンガー等（Singer,
F.R.et al.）（1978）。

米国特許第3,600,132号には、コラーゲン代謝の変動
を観察するために、血清、尿、腰椎液及び他の細胞間液
のような体液中のヒドロキシプロリンの定量方法が開示
されている。特に、この発明者は、ページェット病、マ
ーファン症候群、骨形成不全症、コラーゲン組織及び矮
小発育症における腫瘍性成長等の病理学的条件下におい
て、生物学的液体中のヒドロキシプロリン量によって測
定されるように、増加したコラーゲンの同化作用または
異化作用が定量できることを注記している。この発明者
は、ヒドロキシプロリンを、それを過酸化水素及びＮ−
クロロ−ｐ−トルエンスルホンアミドにより酸化してピ
ロール化合物として、次いで、ｐ−ジメチル−アミノ−
ベンズアルデヒド中で比色定量することにより測定して
いる。

ページェット病の場合には、増加した尿のヒドロキシ
プロリンは、恐らく、大部分が骨の分解からきている
が、ヒドロキシプロリンは、しかしながら、一般的には
特異的な指標として使用することができない。尿中の多
くのヒドロキシプロリンは、新しいコラーゲン合成（か
なりの量の新たに作られたタンパク質は、分解され、組
織線維の中に導入されることなく排泄される）から、及
びヒドロキシプロリンを含有するある血液タンパク質な
らびに他のタンパク質の転換からくるのかもしれない。
更に、タンパク質の分解から派生する遊離のヒドロキシ
プロリンの約80％は、肝臓中で代謝され、尿中には決し
て出現しない。キビリコ（Kiviriko,K.I.）、Int.Rev.C
onnect.Tissue Res.5:93（1970）及びヴァイス及びクラ
イン（Weiss,P.H.and Klein,L.）、J.Clin.Invest.48:1
（1969）。

共にコラーゲンタンパク質に固有である、ヒドロキシ
リジン及びそのグリコシド誘導体は、コラーゲン分解の
マーカーとして、ヒドロキシプロリンよりもより正確で
あると考えられている。しかしながら、ヒドロキシプロ
リンについて上記したのと同じ理由で、ヒドロキシリジ
ン及びそのグリコシド誘導体は、おそらく骨吸収のマー
カーとしては同様に非特異的であろう。クレーン及びシ
モン（Kr ane,S.M.and Simon,L.S.）、Develop.Bioche
m.,22:185（1981）。

コラーゲンに独特のアミノ酸に加えて、オステオカル
シン、またはそれらの分解生成物のような種々の骨マト
リックスの非コラーゲンタンパク質は、骨代謝を測定す
ることを目的とした免疫分析の基礎を形成している。プ
ライス等（Price,P.A.et al.）、J.Clin.Invest.,66:87
8（1980）及びガンバーグ等（Gunberg,C.M.et al.）、M
eth.Enzymol.,107:516（1984）。しかしながら、骨から
派生した非コラーゲンタンパク質は、可能性としては骨
代謝活性の有用なインデックスではあるけれども、それ
ら自身、骨吸収の定量的な尺度を提供しそうにはないと
言うことが明らかである。オステオカルシンの血清中濃
度は、例えば、正常と代謝骨病の両者で非常に広く変動
する。その濃度は、骨格の骨の高回転の状態で上昇する
が、しかし、これが増加した骨の合成または骨の分解か
ら引き起こされているかどうか明らかではない。クレー
ン等（Krane,S.M.et al.）、Develop.Biochem.,22:18
5）1981）、プライス等（Price,P.A.et al.）、J.Clin
Invest.,66:878（1980）；及びガンバーグ等（Gunberg,
C.M.et al.）、Meth.Enzymol.,107:516（1984）。

コラーゲン架橋脊椎動物コラーゲンの最も遺伝学的なタイプの重合体
は、通常の機能のためにアルデヒドを介在させた架橋の
形成が必要である。コラーゲンアルデヒドはリジルオキ
シダーゼの作用により、幾つかの特異的なリジンまたは
ヒドロキシリジン側鎖から誘導される。種々の二、三及
び四官能性架橋アミノ酸は、新たに形成されたコラーゲ
ン重合体の内部でそれらのアルデヒドの自発的な分子間
及び分子内反応により形成される。架橋残基の種類は組
織タイプにより特異的に変わる（エア等（Eyre,D.R.et
al.）、Ann.Rev.Biochem.,53:717−748（1984））。

架橋の二つの基本的な経路が、縞模様の（67nm繰り返
し）原線維コラーゲンについて分類することができ、一
つはリジンアルデヒドに基づくものであり、他はヒドロ
キシリジンアルデヒドに基づくものである。リジンアル
デヒド経路は成人の皮膚、角膜、強膜、及びラットの尾
腱で優勢であり、そしてまた他の柔らかい結合組織にし
ばしば生ずる。ヒドロキシリジン経路は骨、軟骨、靭
帯、殆どの腱及び体の殆どの内部結合組織で優勢であ
る、エア等（Eyre,D.R.et al.）、（1974）上記参照。
操作経路は、リジン残基が、アルデヒド残基がリジルオ
キシダーゼにより後に形成される、テロペプチド部位で
ヒドロキシル化されるかどうかにより支配される（バー
ネス等（Barnes,M.J.et al.）、Biochem.J.,139:461（1
974））。

リジンアルデヒド経路上の成熟した架橋アミノ酸の化
学構造は知られていないが、ヒドロキシピリジニウム残
基はヒドロキシリジン経路で完成した生成物として同定
されている。両者の経路において、及び殆どの組織にお
いて、中間体であるボロヒドリドで還元しうる架橋残基
は、新たに形成されたコラーゲン成熟物となって消失
し、それらが比較的短いライフの中間体であることを示
唆している（ベイレイ等（Bailey,A.J.et al.）、FEBS
Lett.,16:86（1971））。例外は骨と象牙質であり、そ
こでは還元性残基が生存中かなりの濃度で存続してお
り、一部では明らかに、新たに作られたコラーゲン線維
の急速な無機化がそれ以上の自発架橋相互作用を阻害す
るからである（コラーゲン（Eyre,D.R.）、In:The Chem
istry and Biology of Mineralized Connective Tissue
s,（Veis,A.ed.）51−55頁（1981）、Elsevier,New Yor
k、及びウォルターズ等（Walters,C.et al.）、Calc.Ti
ss.Intl.,35:401−405（1983））。

３−ヒドロキシピリジニウム架橋の二つの化学式が同
定されている（式1.及び2.）。両者の化合物は本来蛍光
性であり、同一の励起及び発光スペクトル特性を有する
（フジモト等（Fujimoto,D.et al.）,Biochem.Biophys.
Res.Commun.,76:1124（1977）及びエア（Eyre,D.R.）、
Develop.Biochem.,22:50（1981）。それらのアミノ酸
は、逆相HPLC及び蛍光検定を用いることにより、良好な
感度で組織の加水分解物から直接に分離し、分析するこ
とができる。エア等（Eyre,D.R.）、Analyte.Biochem.,
137:380−388（1984）。本発明はアミノ酸よりも特殊な
ペプチドを定量することを含むものであることに注目す
べきである。

成長する動物において、それらの成熟した架橋体が、
無機化されたコラーゲンにおいてよりも骨コラーゲンの
無機化されていない留分中により集中しているであろう
ことが報告されている（バーンズ等（Banes,A.J.,et a
l.）,Biochem.Biophys.Res.Commun.,113:1975（198
3））。しかしながら、若いウシまたは成人のヒトの骨
についての他の研究はこの概念を支持していない、エア
等（Eyre,D.R.）、In:The Chemistry and Biology of M
ineralized Tissues,（Butler,W.T.ed.）105頁（198
5）,Ebsco Media Inc.,Birmingham,Alabama。

ヒト尿中のコラーゲンヒドロキシピリジニウム架橋体
の存在は、長いペプチドの単離工程及び従来のアミノ酸
分析を用いて、グンジャースミス及びボウセック（Gunj
a−Smith,Z.and Boucek,R.J.,Biochem J.,197:759−762
（1281））により報告されている。その際彼らは架橋体
のHP形態のみに気づいている。ロビンス（Robins,S.P.B
iochem.J.,207:617−620（1982）は、ウシ血清アルブミ
ンに接合した遊離アミノ酸に対する活性化したポリクロ
ーナル抗体を有する、尿中のHPを測定するための酵素結
合免疫分析について報告している。この分析法は、関節
炎と共に生ずる増大した関節破壊を観察するための指標
を提供することを意図しており、ロビンスによれば、ピ
リジノリンが骨コラーゲンにおけるよりも、軟骨におけ
るほうが遥かに多く行き渡っていることを見出したこと
に基づいている。

より最近の酸素結合免疫分析を含む研究において、ロ
ビンスは、リジルピリジノリンがウシ血清アルブミンに
共有結合しているピリジノリンに対する抗血清に対して
反応しないことを報告している（ロビンス等（Robins e
t al.,Ann.Rheum.Diseases,45:969−973（1986））。ロ
ビンスの軟骨破壊の尿指標は、軟骨から主に派生するヒ
ドロキシリジルピリジノリンが、関節軟骨吸収（即ち、
分解）の速度に比例する濃度で、尿中に見出されたとい
う発見に基づいている。原理的には、この指標は、全身
の軟骨損失を測定するために使用することができる。し
かしながら、骨吸収についての情報は、全く得られな
い。

それ故、ヒトの全身の骨吸収速度を測定することので
きる方法が求められている。そのような方法で最も有用
なものは、体液、特に尿に適用できるものである。方法
は感度が良くなければならず、即ち、１ピコモル以下ま
で定量でき、且つ、種々の治療（例えば、エストロゲ
ン）の効果が評価できるように、24時間の骨吸収速度を
迅速に測定できなければならならい。

発明の概要本発明は、患者及び健常人の体液中の特異的に架橋し
たテロペプチドの存在を発見したことに基づいている。
これらのテロペプチドは、生体内で、コラーゲンの分解
及びリモデリング（再造形）の間に製造される。「テロ
ペプチド」の語は、ここでは広い意味に使用され、例え
ば、タイプII及びタイプIIIコラーゲンのテロペプチド
領域と結合する連鎖を有し、コラーゲンの三重らせん構
造と結合する残基またはペプチドと架橋してもよい、架
橋ペプチドを意味する。一般に、ここに開示されている
テロペプチドは、タイプII及びタイプIIIコラーゲンの
テロペプチド全体構造よりもより少ないアミノ酸残基を
有するであろう。典型的には、本発明のテロペプチド
は、ピリジニウム架橋により結合している二つのペプチ
ドから成り、また、ピリジニウム架橋によりコラーゲン
三重らせん構造の残基またはペプチドに更に結合してい
る。ここに開示されたこれらのテロペプチドの構造によ
り、当業者には、それらが生体内以外の、例えば、合成
的に製造できるであろうということが理解されよう。そ
れらのペプチドは、一般に、精製された形態で、例え
ば、実質的に不純物、特に他のペプチドを含まない形態
で供給される。

本発明は、また、生体内でのタイプII及びタイプIII
コラーゲンの分解を定量するための方法に関する。この
方法は、３−ヒドロキシピリジニウム架橋を有し、コラ
ーゲン分解により誘導される特殊なポリペプチドの液体
中の濃度を定量するものである。本発明に開示されてい
る方法は、1987年11月６日に出願された米国特許出願第
118,234号に開示されている生体内での骨の絶対吸収速
度を定量するためのものと類似のものである。それらの
方法は、骨コラーゲン吸収から誘導される３−ヒドロキ
シピリジニウム架橋を有するテロペプチドの体液中での
濃度を定量するものを含むものである。

代表的な分析法において、患者の体液はタイプIIまた
はタイプIIIコラーゲンから誘導される３−ヒドロキシ
ピリジニウム架橋を有するテロペプチドに特異的な免疫
学的結合パートナーと接触される。体液はそのまま使用
してもよく、或いは接触工程の前に精製してもよい。こ
の精製工程はカートリッジ吸着及び溶出、分子篩クロマ
トグラフィー、透析、イオン交換、アルミナクロマトグ
ラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー及
びこれらの組合わせを含む一般的工程の幾つかを使用す
ることにより達成してもよい。

体液中の３−ヒドロキシピリジニウム架橋を有するペ
プチド断片の濃度を定量する他の代表的な態様は、電気
化学的滴定、自然蛍光分光、及び紫外吸収を含むもので
ある。電気化学的滴定は、更に精製することなく体液を
直接測定することができる。しかしながら、これが、過
剰量の汚染物質の存在のために不可能であるならば、体
液は電気化学的滴定の前に、先ず精製される。電気化学
的滴定の前の適当な精製方法としては、透析、イオン交
換クロマトグラフィー、アルミナクロマトグラフィー、
分子篩クロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロ
マトグラフィー及びイオン交換吸着及び溶出が挙げられ
る。

３−ヒドロキシピリジニウム架橋を含有する体液の蛍
光分析測定は、コラーゲン分解（そして、それ故、も
し、タイプＩのペプチドが定量されるのであれば、骨吸
収）を定量するもう一つの方法である。蛍光測定分析
は、更に精製することなく体液を直接測定することがで
きる。しかしながら、ある種の体液、特に尿について
は、蛍光測定分析に先立って体液の精製を行うことが好
ましい。この精製工程は、水溶液に対して尿のような体
液の一定量を透析することから成り、それにより非透析
物（保持物）中に保持されている部分的に精製されたペ
プチド断片を生成する。この非透析物は次いで凍結乾燥
され、イオン結合対溶液中に溶解され、そしてアフィニ
ティークロマトグラフィーカラムで吸着される。クロマ
トグラフィーカラムはイオン結合対溶液の一定量で洗浄
し、その後、ペプチド断片は溶出液により溶出される。
これらの精製したペプチド断片は次いで加水分解され、
加水分解物はクロマトグラフィーにより分離される。ク
ロマトグラフィーによる分離は、高速液体クロマトグラ
フィーまたはマイクロボア高速液体クロマトグラフィー
に何れかにより行われる。

本発明は、体液から得てもよい、他のヒトペプチドを
実質的に含まない、コラーゲン分解物から誘導されるポ
リペプチドと同一の構造を有するペプチドを含むもので
ある。このペプチドは、少なくとも一つの３−ヒドロキ
シピリジニウム架橋、特に、リジルピリジノリン架橋ま
たはヒドロキシリジルピリジノリン架橋を含み、典型的
には内因性プロテアーゼ及び／またはペプチダーゼの作
用により、三重らせん構造からの一もしくはそれ以上の
残基と結合するタイプIIまたはタイプIIIコラーゲンの
テロペプチド領域から誘導されるものである。

タイプII及びタイプIIIテロペプチドの構造を以下に
示す。タイプＩテロペプチドについての情報も、米国特
許出願第118,234号に最初に記載されている。

他の本発明の態様は、ピリジニウム環が完全なもの及
び開裂しているものの、ここに記載したペプチドの分析
を含むものである。ピリジニウム環の幾つかの開裂が生
体内で起こることが推測されるので、完全な及び開裂し
たピリジニウム環の両者を検出する分析法が、コラーゲ
ン分解のより正確な評価に導いてくれるかもしれない。
本発明のこの態様に関連して、完全なまたは開裂したピ
リジニウム環を含む個々のペプチドに対する特異的結合
パートナーが分析に使用される。ペプチドの両方のタイ
プ（完全なまたは開裂したピリジニウム環を含有するペ
プチド）を認識する個々の特異的結合パートナーが使用
される。一方、完全なピリジニウム環を含むペプチド及
びピリジニウム環が開裂しているペプチドの相違を識別
する特異的結合パートナーをもまた使用することができ
る。

タイプＩコラーゲンから誘導される架橋テロペプチドの
構造骨タイプＩコラーゲンのＮ−末端（アミノ末端）テロ
ペプチド構造から誘導される３−ヒドロキシピリジニウ
ム架橋を有する特異的テロペプチドは、以下のアミノ酸
配列を有する：式中、Ｋ−Ｋ−Ｋはヒドロキシリジルピリジノリンま
たはリジルピリジノリンであり、そしてGlnはグルタミ
ンまたはピロリドンカルボン酸である。

本発明は、また、骨タイプＩコラーゲンのＣ−末端
（カルボキシ末端）テロペプチド構造から誘導される３
−ヒドロキシピリジニウム架橋を少なくとも一つ有する
ペプチドを包含する。これらのＣ−末端テロペプチド配
列は、リジルピリジノリンまたはヒドロキシリジルピリ
ジノリンの何れかと架橋している。そのようなペプチド
配列の例は以下の式で表される：式中、Ｋ−Ｋ−Ｋはヒドロキシリジルまたはリジルピ
リジノリンである。

米国特許出願第118,234号を出願して以来、発明者
は、以下の構造を有する、体液中の二つの更なるタイプ
Ｉコラーゲンテロペプチドの証拠を発見した。

これらのテロペプチドは、本発明により体液中で定量
することができる。

タイプIIコラーゲンから誘導される架橋テロペプチドの
構造タイプIIコラーゲンのＣ−末端テロペプチドから誘導
されるヒドロキシリジルピリジノリンを有する特異的テ
ロペプチドは、以下のアミノ酸配列（以下に核ペプチド
構造として言及する）を有する：式中、Hyl−Hyl−Hylで示される架橋残基は、ヒドロ
キシリジルピリジノリン（HP）であり、種々の組織の成
熟したコラーゲン原線維に存在する天然の３−ヒドロキ
シピリジニウム残基である。

タイプIIコラーゲンからのアミノ−末端テロペプチド
は、体液中に検出されてはおらず、タイプIIコラーゲン
のＮ−末端テロペプチド領域から誘導される、可能性が
あるペプチドが、生体内で実質的に分解し恐らく遊離の
HP架橋アミノ酸への全ての経路まで分解することが推測
される。

タイプIIIコラーゲンから誘導される架橋テロペプチド
の構造上記開示と類似の内容により、ヒトタイプIIIコラー
ゲンのタンパク分解により誘導される架橋ペプチドが、
体液中に存在するであろう。これらのポリペプチドは、
以下の親構造で示される核構造を有する：式中、Ｋ−Ｋ−Ｋはヒドロキシリジルまたはリジルピ
リジノリンであり、そしてGlnはグルタミンまたはピロ
リドンカルボン酸である。

体液中のタイプIIIコラーゲンから誘導される、恐ら
く架橋しているペプチドはの核構造を有しており、これはヒドロキシリジルピリジ
ノリン残基（Hyl−Hyl−Hyl）に二つのa1（III）Ｎ−テ
ロペプチド構造が結合したものから誘導されるものであ
る。

尿中に観察されるコラーゲンタイプＩ及びIIペプチド
に基づく、Ｃ−テロペプチド架橋構造の第二の考えられ
る断片は、の核構造を有するものである。

また、上記した（式８、及び９）親配列に相当するこ
れら二つのペプチドのより小さい及びより大きい類縁体
（それぞれの組成構成鎖の１〜３のアミノ酸が異なる）
が存在し、体液中で測定可能である。ここに開示された
それぞれのペプチドのより小さい及びより大きい類縁体
もまた、本発明の一部を形成する。

本発明は、ここに記載したペプチドに対する全ての特
異的結合パートナーをも一般に含むものである。「特異
的結合パートナー」は、本発明のペプチドに結合するこ
とが可能な分子である。この言葉に含有されるものは、
抗体（モノクローナル及びポリクローナル）、抗体の抗
原−結合断片（例えば、Fab及びＦ（ab′）２断片）、
単鎖抗原−結合分子、等の免疫学的結合パートナーであ
り、ハイブリドーマまたはrDNAテクノロジーの何れかに
よりつくられるものである。

本発明は、３−ヒドロキシピリジニウム架橋（完全な
ピリジニウム環及び開裂したものの両者）を有する上記
したコラーゲンペプチドに特異的なモノクローナル抗体
を産生する、融合した細胞ハイブリッド（ハイブリドー
マ）を含む。

本発明は、更に、融合した細胞ハイブリッドにより産
生されたモノクローナル抗体、及び検出可能なマーカー
と結合したそれら抗体（並びにそれらの結合断片、例え
ば、Fab）を含むものである。検出可能なマーカーの例
としては、酵素、発色団、蛍光団（fluorophores）、補
酵素、酵素阻害剤、化学発光物質、常磁性金属、スピン
ラベル、及び放射性同位体が挙げられる。そのような特
異的結合パートナーは、一方、配位子−結合パートナー
複合体（例えば、アビジン−ビチオン）の一つの部材と
結合してもよく、その場合、検出可能なマーカーは、複
合体の捕捉的部材と結合することにより供給することが
できる。

本発明はまた体液中のコラーゲン分解により誘導され
る３−ヒドロキシピリジニウム架橋を有するペプチドの
量を定量するのに有用な試験キットをも含むものであ
る。このキットは、ここに開示した、分解したコラーゲ
ンから誘導されるペプチドに対する特異的結合パートナ
ーを含む。試験キットの特異的結合パートナーは、上記
したように、検出可能なマーカーまたは配位子−結合パ
ートナー複合体の部材と結合してもよい。

図面の簡単な説明図１は、タイプIIコラーゲとテロペプチド源を提案し
た図である。記載した二つのテロペプチドが図１に示し
た一つのコラーゲン分子または二つのコラーゲン分子か
ら来るものかは確立されていない。

図２は、架橋したテロペプチドの分子篩クロマトグラ
フィーによる精製中に得られた、相対蛍光度（287nm励
起;390nm発光）に対する留分番号を示している。架橋し
たタイプIIコラーゲンテロペプチドは、図中IIで示した
留分中に含まれている。

図3Aは、イオン交換HPLC（DEAE−5PW）中の、相対蛍
光度（330nm励起;390nm発光）に対する留分の溶出時間
を示す。架橋したタイプIIコラーゲンテロペプチドは、
図中IVで示した留分中に含まれている。

図3Bは、同一のクロマトグラムで、吸光度（220nm）
に対する分での溶出時間を示す。

図4Aは、逆相HPLC中の、相対蛍光度（297nm励起;390n
m発光）に対する留分の溶出時間を示す。架橋したタイ
プIIコラーゲンテロペプチドは、示したように溶出して
いる。バー（−）で示した留分は、ペプチドの配列及び
組成物分析によればgly（Ｇ）及びpro（Ｐ）残基を保持
しているのか失っているかを示していた。

図4Bは、逆相HPLC中での吸光度（220nm）を溶出時間
の関数として示す。

図５は、年齢によるヒトの骨の皮質及び海綿体の骨中
のHP及びLPの濃度を比較したものである。

図６は、年齢の関数としてのHPとLPの架橋モル比を示
すものである。

図7Aは、架橋タイプＩコラーゲンＮ−テロペプチドの
逆相HPLC分離中の、溶出容積の関数としての相対蛍光度
（297nm励起；＞370nm発光）を示す。

図7Bは、架橋タイプＩコラーゲンＣ−テロペプチドの
逆相HPLC分離中の、溶出容積の関数としての相対蛍光度
（297nm励起；＞370nm発光）を示す。

図8Aは、架橋タイプＩコラーゲンテロペプチドについ
ての、溶出時間の関数としての相対蛍光度（297nm励
起；＞380nm発光）を示す。

図8Bは、架橋タイプＩコラーゲンテロペプチドについ
ての、溶出時間の関数としての相対蛍光度（297nm励
起；＞380nm発光）を示す。

図９は、代表的なモノクローナル抗体HB10611と:P1ペ
プチド（ここでは式3.白ヌキ四角）;a2（Ｉ）Ｎ−テロ
ペプチド（QYDGKGVGC、黒菱形）；及びa1（Ｉ）Ｎ−テ
ロペプチド（YDEKSTGGC、黒四角）との結合実験の結果
を示す。

図10は、脱灰されたヒト骨コラーゲンのＮ−テロペプ
チド領域の構造の一部を示す。P1ペプチド（式3.）は箱
の中に囲われている；それは骨吸収と関係するエピトー
プを含有する。

好ましい実施態様の詳細な説明タイプIIコラーゲンテロペプチドタイプIIコラーゲンペプチドの核ペプチド構造は、HP
残基により結合した３つのペプチド配列の１若しくはそ
れ以上の末端の付加的なアミノ酸またはアミノ酸配列を
有する、より大きいペプチド成分として、体液中に見出
されるであろう。図１は、三重−らせん配列に結合する
タイプIIコラーゲンテロペプチドが如何にして、生体内
において、タンパク質分解酵素のペプシン及びトリプシ
ンを用いてヒトの資源から産生されるかを示す。核ペプ
チド構造は、特にらせん構造からアミノ酸を失ったより
小さい断片もまた体液中に生ずる。一般に、核ペプチド
構造からのアミノ酸の付加または削除には、１から約３
のアミノ酸が含まれるであろう。付加的なアミノ酸は一
般に、生体内で自然に生ずるタイプIIコラーゲンテロペ
プチド配列によって定量されるであろう。例として、以
下の構造を有するペプチドは、尿からクロマトグラフにより単離でき、他の構造：もまた、単離されるであろう。更に、核構造のグリコシ
ル化した変異体及びそのより大きい及びより小さい変異
体が生じるであろうし、そこではガラクトース残基また
はグルコシルガラクトース残基がHP架橋残基の側鎖水酸
基に付加している。図4A及び図4Bに示したグラフのそれ
ぞれのピークは、本発明の目的のために定量されるであ
ろう特異的構造の架橋断片に相当する。

これらの構造は、ふたつのa1（II）Ｃ−テロペプチド
及び三重−らせん構造の残基87の間に形成される分子架
橋部位におけるヒトタイプIIコラーゲン原線維中のそれ
らの起源の部位に一致しており、それについての公知の
配列は次のとおりである：単離されたペプチド断片は、体内のタイプIIコラーゲ
ン原線維のタンパク分解生成物を示す。HP残基を含有す
る核構造は、更なるタンパク分解に対し抵抗性があり、
タイプIIコラーゲン分解の量の定量的測定を提供する。

コラーゲンタイプIIは、成人骨格中の関節の硝子質軟
骨中に存在する、例えば、ペプチド構造中のエピトープ
を認識するモノクローナル抗体による、体液中のコラー
ゲンタイプIIテロペプチドの定量は、全身の軟骨分解ま
たはリモデリング（再造形）の定量的測定を提供する。
好ましい態様において、本発明は、この種のテロペプチ
ドの少なくとも一つのものの尿中への排泄速度を定量す
ることにより、ヒトにおける軟骨組織の分解の分析法を
含む。そのような分析法は、例えば、（１）骨関節炎の早期診断指示薬として、異常に高い軟
骨分解速度を有する個体を成人ヒト患者から篩い分け
る；（２）骨関節炎及びリウマチ関節炎の患者における軟骨
代謝に有効な抗関節炎の薬剤の効果を監視する；または（３）骨関節炎及びリウマチ関節炎を伴う患者の変性関
節病の進行及びそれらの種々の治療処方に対する応答を
監視するために使用される。

骨関節炎は、関節の接合された軟骨の変性病である。
その初期の段階では、それは非常に非炎症性である（即
ち、リウマチ関節炎とは明確に区別される）。それは単
一の病気ではなく、種々の因子（例えば、遺伝的素因、
機械的使い過ぎ、関節先天異常または先行障害等）から
引き起こされる関節欠陥の後期を表している。関節の軟
骨の分解は、骨関節炎の中心的進行性特徴である。放射
線写真検査に基づく骨関節炎の出現率は、18〜24歳の年
齢群の４％から75〜79歳の年齢群の85％までである。現
在、この病気は、痛みと軟骨の進行した浸食の放射線写
真または他の画像による兆候によってのみ診断可能であ
る。

上記した分析法は、温和な兆候の患者における進行し
た軟骨分解の早期の証拠を検出し、より進行した患者の
病気の進行を監視し、そして医薬または他の治療の効果
を監視する手段として使用できる。

正常な若い成人（成熟した骨格の）においては、軟骨
のコラーゲンの分解は恐らく非常にわずかである。尿中
（並びに血液及び関節液体中の）の軟骨コラーゲンの断
片を測定することが可能な試験は、全身の及び個々の関
節の軟骨の「健康度」を判断するのに非常に有用であ
る。上記したタイプIIコラーゲン−特異的ペプチド分析
法はこれを達成できるであろう。長期的には、そのよう
な分析は、関節が磨り減った個々人を見分けるための型
にはまった診断篩い分けになり得よう。それらは骨関節
炎のより良い治療薬を熱心に探究している全ての主要な
医薬会社によって、現在、評価されている、所謂、軟骨
防御医薬の次の世代のものによる、予防治療における早
期の目標となり得よう。

関節の軟骨が破壊される他の病気には：リウマチ関節
炎、幼年性リウマチ関節炎、強直脊椎炎、乾せん関節
炎、ライター症候群、再発性多発性軟骨炎、低背痛症候
群、及び他の感染性の関節炎が含まれる。ここに述べた
タイプIIコラーゲン−特異的分析法は、骨関節炎に関連
して上記したように、それらの病気の診断と監視及び治
療に対するそれらの応答を評価するために使用すること
ができる。

タイプIIIコラーゲンテロペプチド先に指摘したように、体液中に存在するであろうヒト
タイプIIIコラーゲンテロペプチドは、以下の親構造式
中に具体的に示したような核構造を有すると予測され
る。

式中、Hyl−Hyl−Hylはヒドロキシリジルピリジノリン
である。

タイプIIペプチドとの類似性により、タイプIIIコラ
ーゲンペプチドは、核構造のグリコシル化された形態で
生ずるであろう。例えば、ガラクトース残基またはグリ
コシルガラクトース残基は、例えば水酸基を介して、核
構造に付加され得る。

タイプIIIコラーゲンペプチドの架橋残基は、３−ヒ
ドロキシピリジニウム残基として示される、ヒドロキシ
リジルピリジノリンである。タイプIIテロペプチド構造
は、第一にヒドロキシリジルピリジノリン架橋残基を有
することが見出されている。しかしながら、タイプIIコ
ラーゲンペプチドは、タイプIIコラーゲンのＮ−末端テ
ロペプチド領域から誘導されるが、タイプIIIコラーゲ
ンペプチドは、少なくとも一つの架橋残基が存在する限
り、タイプIIIコラーゲンのＮ−末端またはＣ−末端の
何れかから誘導される。

タイプIIIコラーゲンは、タイプＩコラーゲンと連携
して、多くの結合組織に存在する。それは特に血管壁
中、皮膚中及び、例えば、リウマチ関節炎のような炎症
性関節病において、その加速された回転が観察されるで
あろう関節の滑液膜に集中している。

上記したように、架橋したタイプIIIコラーゲンペプ
チドを定量することによるタイプIIIコラーゲン分解の
特異的分析は、種々の炎症性疾患を、恐らくは脈管炎症
候群への特殊な応用を含めて、検出し、診断し、そして
監視するために使用することができる。骨タイプＩ及び
軟骨タイプIIコラーゲンの分解速度を測定するための分
析法に関連して、そのような分析法は、結合組織の破壊
または病理学的過程において引き起こされる種々の退行
性及び炎症性疾患を伴う患者用の識別診断手段として使
用できる。

タイプII及びタイプIIIコラーゲンテロペプチドの単離一般的工程：骨格成長の急速期にある正常青年から尿を集める。疎
水性の相互作用キャリアー及びイオン交換キャリアーの
選択的なカートリッジへの吸着並びに分子篩、イオン交
換及び逆相HPLCカラムクロマトグラフィー工程を含む
が、これらには限定されないクロマトグラフィー工程の
列を用いて、個々のペプチドを単離する。HP（及びLP）
残基を含有する架橋ペプチドをカラムクロマトグラフィ
ーの間にそれらの自然蛍光（Ex max 297nm＜pH4,Ex max
330nm,＞pH6;Em max 390nm）により検出する。具体的
な単離工程は以下の実施例において提供される。

具体例：水で５倍に希釈し、トリフルオロ酢酸を２％（ｖ−
ｖ）に調整した新鮮な尿（４℃）を、C18疎水性カート
リッジ（80％（ｖ−ｖ）アセトニトリルで予め湿し、次
いで水で洗浄したウォーターズ（Waters）製Ｃ−18セプ
−パック（Sep−pak）に通した。保持されたペプチドを
水で洗浄し、次いで3mlの20％（ｖ−ｖ）アセトニトリ
ルで溶出し、この溶出液を等容積の0.1M NH₄HCO₃を加え
ることにより、0.05M NH₄HCO₃、10％（ｖ−ｖ）アセト
ニトリルに調整した。この溶液を、10mlの0.1M NaCl、2
0％（ｖ−ｖ）アセトニトリル次いで10mlの水で洗浄し
たQMA−セプ−パック（ウォーターズ）を通し、そして
ペプチドを次いで3mlの１％（ｖ−ｖ）トリフルオロ酢
酸で溶出し、スピード−バック（Speed−Vac）（サヴァ
ント（Savant）製）で乾燥した。

ペプチドは、三つのクロマトグラフィーの工程で分別
した。第一の工程は、10％（ｖ−ｖ）酢酸で溶出したバ
イオーゲル（Bio−Gel）Ｐ−10（バイオ・ラド・ラボ
（Bio Rad Labs）、2.5cm×90cm）のカラムでの分子篩
クロマトグラフィーであり、図２に示したように溶出液
のHP蛍光を監視した。図２において、Ｙ軸は390nm（297
nm励起）での相対的蛍光発光であり、Ｘ軸は留分番号で
ある。留分の量は4mlである。IIとして示した留分は、
架橋コラーゲンタイプIIテロペプチドに富んでいる。架
橋コラーゲンタイプＩテロペプチドは、III及びIVで示
した留分中に含有されている。IIを溜めている全ての留
分（タイプIIコラーゲン架橋ペプチドに富んでいる）を
合わせ、凍結乾燥し、0.02Mトリス/HC1、10％（ｖ−
ｖ）アセトニトリル、pH7.5で均衡にし、図２に示した
ものと同一の緩衝液を用いて０〜0.5M勾配のNaClで溶出
するDEAE−HPLCカラム（TSK−DEAE−5PW、7.5mm×7.5m
m、バイオ・ラド・ラボ）でのイオン交換クロマトグラ
フィーにより分別した。

図3Aは、390nm（330nm励起）での蛍光発光に対する溶
出時間を描いたものである。架橋コラーゲンタイプIIテ
ロペプチドは、主にIVとして示した部分の中に見出され
る。図3Bは、分での溶出時間の関数としての220nmにお
ける吸光度を描いたものである。IVの溜分はタイプIIコ
ラーゲン架橋ペプチドを含有する。個々のペプチドは、
次いで、IVの溜分から逆相HPLCによりＣ−18カラム（ア
クアポア（Aquapore）RP−300、25cm×4.6mm、ブラウン
リー・ラボ（Brown−lee Labs）製）で、0.1％（ｖ−
ｖ）トリフルオロ酢酸中、０〜30％（ｖ−ｖ）勾配のア
セトニトリルで溶出することにより、分別した。図4A
は、溶出時間の関数としての390nm（297nm励起）での相
対蛍光強度を描いたものである。特異的ペプチドと連携
したピークは図4Aに示されている。図4Bは、時間の関数
としての220nmでの相対吸光度を示す。

HP架橋残基を含有するタイプIIIコラーゲンの架橋ペ
プチド断片は、健常人の尿から、または、血管系の炎症
性疾患を伴う患者の尿から、同様に組み合わせた工程に
より単離される。

タイプＩコラーゲンテロペプチド本発明のこの側面は、吸収された骨コラーゲンから誘
導されるリジルピリジノリン（LP）及びヒドロキシリジ
ルピリジノリン（HP）ペプチド断片（即ち、ここで使用
されるテロペプチド）が、代謝されずに尿中に排泄され
るという発見に基づいている。本発明は、また、他の如
何なる結合組織もかなりの水準のLPを含んではおらず、
成熟した骨コラーゲン中のHPとLPの割合が、ヒトの一生
において比較的一定に維持されるという発見にも基づい
ている。

図５は、年齢によるヒトの骨の皮質及び海綿体の骨中
のHP及びLPの濃度を比較している。骨コラーゲン中のHP
及びLP架橋の濃度は10〜15歳で最大に達し、そして成人
の一生をとおしてかなり一定に維持される。さらに、HP
とLPの比は、図６に示したように、一生を通じて殆ど変
化せず、約3.5:1で一定に維持されることを示してい
る。これらの基本データは、骨コラーゲン中の３−ヒド
ロキシピリジニウム架橋が比較的一定に維持され、そし
てそれ故、骨コラーゲンの分解により派生する体液が、
骨吸収の絶対速度に比例する濃度で３−ヒドロキシピリ
ジニウム架橋ペプチド断片を含有するであろうことを示
している。

LPは、骨コラーゲンに独特の３−ヒドロキシピリジニ
ウム架橋体であるので、骨吸収の絶対速度を定量する方
法は、その最も簡単な形態において、体液中の３−ヒド
ロキシピリジニウム架橋そして好ましくはリジルピリジ
ノリン（LP）架橋を含有するペプチド断片の濃度を定量
することに基づいている。

この発明においてタイプＩ、II、またはIIIテロペプ
チドに使用されている、「定量する」によって意味され
るものは、分光測光、重量測定、容量測定、比色測定、
免疫測定、電位差測定、または電流測定方法等を含むが
それらには限定されない如何なる適当な方法により、一
定量の体液中の３−ヒドロキシピリジニウム架橋を含有
するペプチド断片の濃度を測定することである。適当な
体液は、尿、血清及び滑液である。好ましい体液は尿で
ある。

尿のペプチドの濃度は、尿の容量が増加するのに伴い
減少するので、尿が選択された体液である場合には、例
えば、24時間という固定された時間の期間内に採取され
た尿を合わせた全量から一定量を分析することが好まし
い。この場合、骨吸収または骨分解の絶対速度は、24時
間の期間で計算される。一方、尿のペプチドは、クレア
チニンのような尿中に見出されるマーカー物質に対する
相対的な割合として測定することができる。この場合、
コラーゲン分解及び骨吸収の尿指標は、尿の容積とは独
立のものなる。

本発明の一つの実施態様として、尿のような体液中に
見出されるリジルピリジノリン架橋を含有するペプチド
断片に対し特異的なモノクローナルまたはポリクローナ
ル抗体が産生される。タイプＩテロペプチド断片は如何
なる患者の体液からも単離されるであろうが、しかしな
がら、これらのペプチドは、ページェット病の患者から
または急速に成長している青年から単離されることが、
彼らのタイプＩペプチド断片が高濃度であることから好
ましい。タイプII及びタイプIIIテロペプチドは如何な
る患者の体液からも単離されるが、タイプIIまたはタイ
プIIIコラーゲン分解を伴う病気に罹っている患者から
または急速に成長している青年から容易に得られる。

タイプＩコラーゲンテロペプチドの単離活性ページェット病の患者からの尿を、低多孔性透析
チューブ（＜3,500分子量除外、スペクトロポア（Spect
ropore）製）により４℃で48時間、大部分の溶質を除く
ために透析した。これらの条件下で、対象とするペプチ
ドは殆ど保持されていた。凍結乾燥した非透析質を、次
いで、バイオ−ゲルP2（200−400メッシュ、90cm×1.5c
m）のカラムで10％酢酸により室温で200mg毎の留分とし
て溶出した。架橋ペプチドを合わせた溶出液の領域は、
集めた留分の297nm励起/395nm発光での蛍光を測定する
ことにより決定し、この留分を凍結乾燥した。この物質
をバイオ−ゲルＰ−４（200−400メッシュ、90cm×2.5c
m）のカラムで10％酢酸で溶出することにより更に分別
した。

二つの隣接した留分の溜りは、上記のように溶離液の
蛍光を監視することにより分けた。より早い留分は、骨
タイプＩコラーゲンの三重らせん体から誘導される第三
の配列に結合する骨タイプＩコラーゲンのa1（Ｉ）鎖の
Ｃ−末端テロペプチド構造から誘導される、二つのアミ
ノ酸配列を有するペプチド断片に富んでいる。これらの
三つのペプチド配列は、３−ヒドロキシピリジニウムに
より架橋している。重複するより後の留分は、３−ヒド
ロキシピリジニウム架橋を介して結合している骨タイプ
ＩコラーゲンのＮ−末端テロペプチド構造から誘導され
るアミノ酸配列を有するペプチド断片に富んでいる。

個々のペプチドは、次いで、TSK DEAE−５−PWカラム
（バイオ・ラド7.5cm×7.5mm）によるイオン交換HPLCに
より、10％（ｖ−ｖ）アセトニトリルを含有する、pH7.
5の0.02Mトリス−HCl中でNaClの勾配（０〜0.2M）で溶
出することにより、上記したように得られた二つの留分
のそれぞれから分別される。Ｎ−末端テロペプチド及び
Ｃ−末端テロペプチドに基づく架橋ペプチドは、0.08M
及び0.15M NaClの間で一連の３〜４の蛍光ピークを示し
て溶出される。Ｃ−末端テロペプチドに基づく架橋ペプ
チドが、最初に一連の蛍光ピークをもって溶出され、そ
して主要な及び微小なＮ−末端テロペプチドに基づく架
橋ペプチドが特徴的なピークをもって勾配の終わりのほ
うで溶出される。それらはそれぞれ集められ、凍結乾燥
し、Ｃ−18逆相HPLCカラム（ビダック（Vydac）218TP5
4、25cm×4.6mm）で、0.01Mトリフルオロ酢酸中、アセ
トニトリル:n−プロパノール（3:1v−ｖ）の勾配（０〜
10％）で溶出することによりクロマトグラフィーを行っ
た。約100−500μｇの３−ヒドロキシピリジニウム架橋
を含有する個々のペプチド断片が、ページェット病患者
の尿を24時間１回集めたものからこの工程により単離さ
れた。

主要な単離ペプチドのアミノ酸組成は、回収されたア
ミノ酸の全数化学量論により、純度及び分子サイズを確
認した。エドマン（Edman）分解によるＮ−末端配列の
分析により、タイプＩコラーゲンの公知の架橋点の配列
に相当する基本的核構造及びアミノ酸組成の整合を確認
した。a2（Ｉ）鎖のＮ−末端テロペプチドは、恐らくは
公知のようにＮ−末端グルタミンがピロリドンカルボン
酸に環化したことによって、配列分析することができな
かった。

上記の工程により得られるＮ−末端テロペプチドの典
型的な溶出外形を図7Aに示す。得られた主要なペプチド
断片は、（Asx）₂（Glx）₂（Gly）₅Val−Tyr−Ser−Thr
のアミノ酸組成を有している。ここで、Asxはアミノ酸A
spまたはAsnであり、Glnはアミノ酸GlnまたはGluであ
る。このペプチドの配列は、以下の式３によって示され
る。

上記により、逆相HPLCにより分別されるＣ−末端テロ
ペプチドに基づく架橋ペプチドは図7Bに示した。この図
から理解できるように、これらのペプチドは、それぞれ
が３−ヒドロキシピリジニウム架橋を含む一連のＣ−末
端テロペプチドに更に分別される。図7Bに示した主要な
ペプチドは、上記のように分析され、（Asp）₅（Glu）₄
（Gly）₁₀（His）₂（Arg）₂（Hyp）₂（Hla）₅のアミノ
酸組成を有することが見出された。このペプチドの配列
は、以下の式４で示される。図7Bに小さなピークとして
現れる他のＣ−末端テロペプチドに基づく架橋ペプチド
は、式４で示した構造に対するアミノ酸付加及び削除を
表していると思われる。これらの小さなピークに含まれ
る如何なるペプチドも、以下に述べる免疫原として使用
するのに適当である。

式中、Ｋ−Ｋ−ＫはHPまたはLP架橋を表現し、Ginは
グルタミンまたはピロリドンカルボン酸を表す。

コラーゲン分解により体液中にそれらが存在すること
により、上記構造により表されるペプチド等価物は、そ
のペプチド構造に幾つかの変化があるものをも含む。そ
のような変種の例としては、Ｎ及びＣ末端への１〜３の
アミノ酸付加体並びに１〜３の末端アミノ酸除去体が挙
げられる。例えば、式３に相当するが、Ｎ−末端アスパ
ラギン酸残基のアミノ末端にチロシン残基が付加してい
るペプチドは、ヒト尿中からは比較的少ない量で検出さ
れている。骨吸収から誘導される式４で示される分子の
より小さいペプチド断片は、尿中に特に顕著である。こ
れらは、図7Bに見られるようにＣ−末端テロペプチド留
分の小さいピークとして見出され、アミノ酸組成及び配
列分析により同定することができる。

ペプチド定量工程の実施例 A.ペプチド定量用免疫学的工程生理学的液体から得られた骨コラーゲンに由来するペ
プチド断片と特異的に結合することができる免疫学的結
合パートナーは、当業界においてよく知られている方法
により製造することができる。これらのペプチド断片を
単離するための好ましい方法は上記した。ここで使用す
る免疫学的結合パートナーという語は、テロペプチドと
結合することが可能な抗体及び抗体断片を意味する。

ここに開示したペプチドと特異的に結合するオノクロ
ーナル及びポリクローナル抗体の両者及びそれらの等価
物は、当業界で公知の方法により製造される。例えば、
キャンベル（Campbell,A.M.Laboratory Techniques in
Biochemistry and Molecular Biology,Vol.13（198
4））参照。単離された上記ペプチドまたはそれらの等
価物に対する抗体を製造することは可能である。しかし
ながら、これらのペプチド断片の分子量は一般に5,000
未満なので、ハプテンを担体分子に接合することが好ま
しい。適当な担体分子としては、それらに限定されない
が、ウシ血清アルブミン、卵白アルブミン、サイログロ
ブリン、及び陣笠貝ヘモシアニン（KLH）が挙げられ
る。好ましい担体はサイログロブリン及びKLHである。

当業界では、ハプテンの配向は、それが担体タンパク
質に結合する際に、抗血清の特異性に関して臨界的に重
要であることがよく知られている。更に、全てのハプテ
ン−タンパク質接合体が等しく免疫原として成功するわ
けではない。担体タンパク質への特別なハプテンを結合
させるためのプロトコールの選択は、それ故、選択した
尿のペプチド断片のアミノ酸配列に依存する。例えば、
式３で示されるペプチドを選択する場合には、好ましい
プロトコールは、このハプテンを陣笠貝へモシアニン
（KLH）、または他の適当な担体にグルタルアルデヒド
により、結合させることを含む。もう一つのプロトコー
ルは、ペプチドをKLHとカルボジイミドにより結合させ
ることである。これらのプロトコールは、好ましいエピ
トープ（「好ましいエピトープの特性」の標題のもとに
以下において記載する）を、感作した脊椎動物抗体産生
細胞（例えば、Ｂリンパ球）に生じさせることを確実に
するのを助ける。

他のペプチドは、その源に基づき、異なった結合プロ
トコールが必要である。従って、数多くの結合試薬が適
宜、使用される。これらとしては、限定されないが、カ
ルボジイミド、グルタルアルデヒド、混合無水物、並び
にホモ２官能及びヘテロ２官能試薬（例えば、ピアス
（Pierce）1986−87 カタログ、Pierce Chemical Co.,R
ockford,IL参照）が挙げられる。好ましい結合試薬とし
ては、カルボジイミド及びｍ−マレイミドベンジル−Ｎ
−ヒドロキシスクシンイミドエステル（MBS）等のヘテ
ロ２官能試薬が挙げられる。

ハプテンを担体分子に結合する方法は、当業界では知
られている。例えば、ここで引用したチャード（Chard,
T.Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecu
lar Biology,Vol 6（1987）Partz Elsevier,N.Y.）参
照。

ハプテン担体分子免疫原に対するモノクローナルまた
はポリクローナル抗体の何れもが製造することができ
る。しかしながら、モノクローナル抗体（MAb）を製造
することが好ましい。この理由から、免疫化はマウスで
行うことが好ましい。マウスでの免疫化プロトコール
は、通常、アジュバント（補助剤）を含む。適当なプロ
トコールの例としては、チャード（Chard,T）（1987）
（上記参照）に記載されている。免疫化マウスの脾臓細
胞を取り出し、均質にし、その後、ポリエチレングリコ
ールの存在下に癌細胞と融合し、コラーゲンから派生す
るペプチド断片に特異的なモノクローナル抗体を産生す
る融合細胞ハイブリッドを製造した。そのようなペプチ
ドの例としては、上記した式で表されるものが挙げられ
る。適当な癌細胞には、ミエローマ（骨髄腫）、ヘパト
ーマ（肝癌）、カルシノーマ（癌種）及びザルコーマ
（肉腫）細胞が含まれる。スクリーニングのプロトコー
ル、選択したハイブリッド細胞の成長プロトコール及び
選択されたハイブリッド細胞により産生されるモノクロ
ーナル抗体の収穫を含む、この工程はガルフレ及びミル
スタイン（Galfre,G.and Milstein,C.,Meth.Enzymol.,7
3:1（1981））に詳しく記載されている。好ましい予備
的なスクリーニングのプロコールは、骨コラーゲン吸収
により誘導され、３−ヒドロキシピリジニウム架橋を含
有するペプチド断片を固相放射免疫分析で使用すること
を含む。好ましいモノクローナル抗体が記載されている
特徴的な例を以下に挙げる。

組み替えDNA技術を利用する方法は、また、モノクロ
ーナル抗体を組み立てるのに適合させることができる。
これらの方法は、常套手段により発現ライブラリーとプ
ライマーを構築することによって達成され、（例えば、
ウィリアム・ヒューズ等（William D.Huse et al.）、
“Generation of a Large Combinational Library of t
he Immunoglobulin Repertoire in Pharge Lambda",Sci
ence 246:1275−1281,December 1989 参照、またサス
トリー等（L.Sastry et al.）“Cloning of the Immuno
logical Repertoire in Escherichia coli for Generat
ion of Monoclonal Catalytic Antibodies:Constructio
n of a Heavy Chain Variable Region−Specific cDNA
Library",Proc.Natl.Acad.Sci.USA86:5728−5732,Augus
t 1989参照；またミケーレ・アルティング・ミース等
（Michelle Alting−Mees et al.）、“Monoclonal Ant
ibody Expression Libraries:A Rapid Alternative to
Hybridomas",Strategies in Molecular Biology 3:1−
9,January 1990参照）、またはこの目的に有用な市販の
キット（即ち、Stratacyte,La Jolla,Californiaから）
を購入することにより、達成することができる。端的に
は、この実施態様において、mRNAがＢ細胞個体群から単
離され、そしてλ免疫Zap（Ｈ）及びλ免疫Zap（Ｌ）ベ
クター（媒介体）中で重鎖及び軽鎖免疫グロブリンcDNA
の発現ライブラリーをつくるために利用される。これら
のベクターは、個々に篩分けされまたは共に発現され、
Fabフラグメントまたは抗体を形成する（ヒューズ等（H
use et al.）、またサストリー等（Sastry et al.）前
出参照）。陽性のプラクは、続いて、大腸菌（E.coli）
からのモノクローナル抗体断片の高水準発現を可能とす
る非溶解性のプラスミドに変換される。

本発明において使用されるモノクローナル抗体または
他の免疫学的結合パートナーは、特別なタイプのコラー
ゲンテロペプチドに特異的であることが好ましい。例え
ば、タイプIIまたはタイプIIIコラーゲン分解テロペプ
チドの分析は、タイプＩ、タイプII及びタイプIIIペプ
チドを区別できることが好ましい。しかしながら、ある
場合には、そのような選択性は必要がないであろう、例
えば、もし、患者が一つのタイプのコラーゲンの分解に
罹っているのではなく、分析対象とされたタイプのコラ
ーゲン分解に罹っているかどうか疑われている場合であ
る。タイプＩ、タイプII及びタイプIII系列のテロペプ
チド間のアミノ酸配列が異なるので、交差反応は重大な
度合いでは起こらない。実際、ハイブリドーマは、対象
とする架橋テロペプチドに特異的な（及び他の二つのコ
ラーゲンタイプへの親和性に欠ける）モノクローナル抗
体を産生する脾臓融合クローンのスクリーニングの間に
選択することができる。単離されたペプチド構造の配列
の相違に基づき、そのような特異性は完全に実現でき
る。そのようなハイブリドーマのスクリーニングに適し
た親のタイプＩ、II及びコラーゲンのペプチド断片は、
ヒトの骨、軟骨及び他の組織から製造でき、そして体液
から単離した個々の架橋ペプチド抗原と適合するように
免疫化されたマウスからのクローンをスクリーンするの
に使用される。

上記の工程、またはそれと等価の工程で製造された免
疫学的結合パートナー、特にモノクローナル抗体は、上
記した３−ヒドロキシピリジニウム架橋を有するペプチ
ドの濃度を定量するための種々の免疫測定法に使用され
る。これらの免疫測定法は、検出可能なマーカーと結合
したモノクローナル抗体または抗体断片からなることが
好ましい。適当な検出可能なマーカーの例としては、そ
れらには限定されないが、酵素、補酵素、酵素阻害剤、
発色団、蛍光団、化学発光物質、常磁性金属、スピンラ
ベル、及び放射性核種が挙げられる。テロペプチドを定
量するために適当な標準的免疫測定法の例としては、そ
れらには限定されないが、酵素結合免疫吸着測定（ELIS
A）（イングヴァール（Engvall,E.,Meth.Enzymol.,70
（1980））、放射免疫測定（RIA）、及び「サンドウィ
ッチ」免疫放射測定（IRMA）が挙げられる。

その最も簡単な形態において、これらの免疫分析測定
法は、単に体液を３−ヒドロキシピリジニウム架橋を有
するコラーゲンテロペプチドに特異的な免疫学的結合パ
ートナーと接触させることにより、骨吸収またはコラー
ゲン分解の絶対速度を定量するのに使用することができ
る。

上記した免疫学的分析は、直接未処理の体液（例え
ば、尿、血液、血清、または滑液）に行うことが好まし
い。場合によっては、汚染物質が分析を阻害するかもし
れないので、体液の部分的な精製を必要とする。部分的
精製法としては、それらに限定されないが、カートリッ
ジ吸着及び溶出、分子篩クロマトグラフィー、透析、イ
オン交換、アルミナクロマトグラフィー、ヒドロキシア
パタイトクロマトグラフィー及びそれらの組み合わせが
挙げられる。

本発明に使用するのに適当な試験キットは、上記した
ように製造されたモノクローナル抗体のような特異的結
合パートナーを含み、それは体液中に見出されるコラー
ゲン分解に由来するペプチド断片と特異的に結合するも
のである。この試験キットの特異的結合パートナーは、
上記したタイプの検出可能なマーカーと結合したもので
あることが好ましい。２若しくはそれ以上の結合パート
ナー、特に免疫学的結合パートナー、のパネルを含有す
る試験キットが意図されている。そのような試験キット
のそれぞれの結合パートナーは、他のタイプのコラーゲ
ンから由来するテロペプチドと実質的に交差反応しない
ことが好ましいであろう。例えば、タイプIIコラーゲン
と特異的に結合する免疫学的結合パートナーは、タイプ
ＩまたはタイプIIIコラーゲンテロペプチドの何れとも
交差反応しないことが好ましい。多少（例えば、５〜10
％）の交差反応は許容できる。他の試験キットとして
は、ピリジニウム環（それは、OH−置換されていてもよ
い）を含む架橋を有するコラーゲン−由来テロペプチド
に対する第一の特異的結合パートナー、及び例えば、光
分解により、ピリジニウム環が開裂している以外は第一
のテロペプチドと同一の構造を有するテロペプチドに対
する第二の特異的結合パートナーを含んでいてもよい。

（ｉ）モノクローナル抗体の製造以下、上記式３に基づくペプチド免疫原に対するモノ
クローナル抗体の製造例である。

式３（骨コラーゲン分解を示す）のペプチドに富んだ
留分を、逆相及び分子篩クロマトグラフィーを用いて青
年のヒトの尿から調製した。このペプチドを、グルタル
アルデヒドを用いて、通常の工程によって、陣笠貝へモ
シアニン（KLH）と接合させた。マウス（Balb/c）にこ
の接合体（50−70μｇ）を、先ず、完全フロイントアジ
ュバント中において、皮下注射することにより免疫し、
次いで、３週間の間隔で不完全フロイントアジュバント
中、腹腔内に（25μｇ）投与した。試験血液が、ELISA
フォーマットを用いてウシ血清アルブミン（BSA）と接
合した式３のペプチド（以下において、P1と言及する）
に対する高い力価を示した後に、選択したマウスに、殺
菌したPBS中の低濃度（５μｇ）の免疫原を静脈注射す
ることにより投与した。３日後、個々のマウスの脾臓か
らの細胞を、通常の細胞融合技術を用いてマウスミエロ
ーマ細胞と融合させた。96−ウェルのプレートの個々の
ウェルで増殖したハイブリドーマクローンの上清を、最
初に、BSAに接合した粗P1製剤を用いて、反応性モノク
ローナル抗体について分別した。限界希釈による型通り
のクローニングの後、個々のハイブリドーマで産生され
た抗体は、ELISA分析を用いた抗原スクリーニングパネ
ルに対して特性化される。これらの抗体は、BSAに接合
したP1（式３）及びP2（式７）のペプチドである。BSA
に接合したP1がプラスチックウェルにプレートアウトさ
れている場合、抑制分析が使用され、抗体は有効な抗原
の溶液で予めインキュベートされる。第２の抗体（西洋
わさびペルオキシダーゼ、HRPに接合したヤギ抗−マウ
スIgG）は、適当な基質を用いた発色に使用される。P1
ペプチドとの高い結合親和性を有する望ましいモノクロ
ーナル抗体が同定された。腹水液製造に使用される場
合、抗体は、2,000,000倍希釈で最適色領域での抑制分
析において機能する（このことは、結合定数が、10^-9〜
10^-11M^-1の範囲、おそらくは約10^-10M^-1であることを示
している）。ELISAフォーマットにおいて、抗体は、如
何なる濃縮または清浄工程を経ることなく健常人の尿中
に存在するP1を検出し、そして測定することが可能であ
った。この好ましいモノクローナル抗体を産生するハイ
ブリドーマは、寄託番号HB10611のもとにメリーランド2
0852、ロックビル、パークローン・ドライブ12301のア
メリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ATCC）
に寄託されている。このハイブリドーマは以下において
1H11として示されており、それが産生するモノクローナ
ル抗体は以下においてMab−1H11として示されている。

サンドウィッチ分析は、また、P1−特異的モノクロー
ナル抗体及び接合P1に対するウサギで培養されたポリク
ローナル抗血清を用いて機能することがわかった。P1−
特異的モノクローナル抗体、ポリクローナル抗血清、そ
の結合断片、等は何れも、標準ELISA及び他の免疫分析
プロトコルを用いる検出可能な仕様で、尿からのP1と特
異的に結合するために使用することができる。

（ii）好ましいエピトープの特性抗体MAb−1H11によって認識されるエピトープは、P1
の構造中に体現されている。エピトープは、純粋なP1中
で、及びP1構造（例えば、P1のＮ−末端アスパラギン酸
残基を介してチロシン残基に結合したP1）を含有する、
或るより大きいペプチド中に認識される。エピトープ
は、ペプチドP1の構造中に体現された二つのテロペプチ
ドの両方の化学的特徴を含んでいる。ヒトa1（Ｉ）及び
a2（Ｉ）Ｎ−テロペプチド配列と適合するように合成さ
れ、ウシ血清アルブミンと結合するようにＣ−末端シス
ティンを付加したペプチド（即ち、YDEKSTGGC及びQYDGK
GVGC）は、MAb−1H11によっては認識されなかった。こ
のことは、プレートアウトしたP1（図９参照）に対し、
競合する、または直接、結合パートナーとしてBSAに接
合し、プレートアウトした遊離のペプチドを使用するEL
ISAにより示される。図９に言及すると、検出可能なマ
ーカーの450nmにおける吸光度を、遊離P1ペプチドの濃
度に対してプロットしている。遊離P1の量が増大するに
従い、固定（プレートアウト）されたP1に結合した検出
可能なマーカーの量は減少する。比較として、a2（Ｉ）
及びa1（Ｉ）Ｎ−テロペプチドは、MAb−1H11との如何
なる重大な競合結合も殆どないことを示している。

更に、Ｎ−末端アスパラギン酸にチロシン残基を有す
るP1のより大きい形態は、P1より低い収率ではあるが、
MAb−1H11への結合親和力により尿中から回収された。P
1エピトープを有する他のやや大きいペプチドも回収さ
れたが、より少ない量であった。

抗体は、P1中の架橋の性質について、即ち、ヒドロキ
シリジルピリジノリン（HP）かリジルピリジノリン（L
P）かどうかについて選択的ではなかった。アガロース
に結合したMAb−1H11から成るアフィニティカラムで尿
から単離したペプチドの分析から判断すると、明らかに
等しい親和性で、HP−含有及びLP−含有形態の両方が結
合した。骨コラーゲンからの酸加水分解により作られる
か、または尿中に自然に存在する、遊離の架橋アミノ酸
である、HP及びLPは、MAb−1H11により認識されなかっ
た。

紫外光（長紫外光）によるペプチドP1中の３−ピリジ
ノール環の光分解開環の後にも、特異的抗体結合は、恐
らくは、残された個々のペプチドがお互いに架橋したま
まであるために、影響されなかった。実験を以下のよう
に行った。

HP及びLPを完全に破壊することが示された（RP−HPLC
の特性蛍光ピークの蛍光の損失による証拠に基づき）条
件を用いて、遊離アミノ酸または不溶性ペプチドの何れ
か及び完全タンパク質鎖として、P1の調製物は照射され
た（長波長の設定−ミネラライト（Mineralight）UV SL
−25ランプ（Ultra−Violet Products,Inc.,San Gabrie
l,California）。

この溶液は、照射されていない全く同一物質の対照溶
液を用いて、MAb 1H11に対する結合を分析した。1H11の
ELISAによる結果は、P1に対する結合に本質的な損失が
ないことを示し、環の開裂がエピトープに重大な影響を
与えていないことを意味している。UV照射の条件下（pH
9）、環を開くための単結合の開裂の方が、環の窒素及
びその側結合手を除去するための二重結合の開裂よりも
起こり得ることが予測される。比較のために、エア（Ey
re,D.,Met.Enzymol.144:155−139（1987））参照。

MAb−1H11により認識されるエピトープは、それ故、
それらに結合している三価の架橋アミノ酸により付与さ
れる立体的特徴と共に、図10に枠に示したように、二つ
のテロペプチド配列に体現されている。少なくとも化学
的及び構造的特徴の組合せから作られている。a2（Ｉ）
Ｎ−テロペプチド配列であるQYDGKは、エピトープの特
に重要な部分である。

MAb−1H11により認識されるエピトープが完全なピリ
ジニウム環に存在しないという事実は、予測されない発
見である。生体内及び通常の取り扱い条件下試験管内の
何れでも開環が起こるのであれば、おそらく、完全ピリ
ジニウム環を有する対象ペプチドの定量分析では、骨吸
収が低く評価されるであろう。予備的な観察は、対象と
するペプチド中のピリジニウム環の分解が、たとえ冷凍
したとしても、特に、尿中及び／または尿試料中におい
て起こることを示唆している。従って、本開示に基づく
分析は、相対的に、より正確であると考えられる。二つ
の態様が考えられる：即ち目的とするペプチドの閉じた
及び開いた環の態様の両者を認識する。単一の特異的結
合パートナーが使用されるか、或いは、閉じた及び開い
た環のエピトープをそれぞれ区別しうる、二つの結合パ
ートナーが使用される。

目的とするペプチドの閉じた及び開いた環の形態の差
を識別する特異的結合パートナーは、そのような特異的
結合パートナーを得るための工程中に適当なスクリーニ
ング工程を導入することにより得ることができる。例え
ば、P1ペプチドの開環体に特異的に結合するモノクロー
ナル抗体を得るために、モノクローナル抗体の候補のラ
イブラリーは、それらの開鎖ピリジノリン環を有するP1
と結合する能力を有し（例えば、紫外光照射により）、
及びそれらの完全ピリジノリン環を有するP1と結合し得
ないことから分別することができる。そのようなスクリ
ーニング工程に有用な開環及び完全環ペプチドは、上記
したRP−HPLCのような公知の精製技術で得ることができ
る。

更なる実験は、エピトープがヒトの骨コラーゲン中に
存在しているが、広範囲にわたるタンパク質分解の後に
のみ、MAb−1H11にさらされ、そして結合されることを
示した。かくして、殺菌性のコラゲナーゼにより脱灰さ
れたヒト骨コラーゲンから製造されたペプチドはMAb−1
H11に結合され、図10に示されたように、らせん位置の
Ｎ−テロペプチドから由来することが示されている。一
つの形態は、a1（Ｉ）残基928−933から明らかに由来す
るヘキサペプチドのGIKGHR（P1中の非テロペプチドＫ結
合手に代えて）を含んでいた。他の形態は、a2（Ｉ）鎖
から由来するヘキサペプチドと等価であるが明白に区別
されるものであった。ペプシン、CNBr、またはトリプシ
ンで溶解されたヒト骨コラーゲンの断片は、競合阻害剤
として使用される場合のELISA法においても、或いはSDA
−ポリアクリルアミド電気泳動の後のウエスタン・ブロ
ットによっても、MAb−1H11によっては認識されず、こ
れらの溶解剤がMAb−1H11によって認識されるエピトー
プを製造しないことを示している。

B.ペプチド分析用電気化学的工程上記したペプチドを分解するための他の方法は、３−
ヒドロキシピリジニウム架橋を有するペプチドの物理的
性質を測定することから成る。そのような物理的性質の
一つは、電気化学的検出による。この方法は、尿のよう
な体液の一定量を、３−ヒドロキシピリジニウム環を含
有するペプチドの検出に適当な酸化−還元電位に平衡を
とった電気化学的検出器に注入することから成る。３−
ヒドロキシピリジニウム環は、フェノールであり、可逆
酸化反応を受け、そしてそれ故、電気化学的検出器（例
えば、モデル5100A、クーロケム（Coulochem）、エサ
（Esa、45 Wiggins Ave.,Bedford,MA）から市販）は、
本ペプチドの濃度を定量するのに適当な、高度に望まし
い機器である。二つの基本的な形態の電気化学的検出器
が、現在市販されている：アンペア測定（例えば、BioA
nalytical Systems）とクーロン測定（ESA,Inc.,Bedfor
d,MA 01730）である。共に本発明において適当に使用さ
れるが、しかし、後者の系は本来的により高感度であ
り、それ故、カラム流出液において分析すべき分子の完
全な酸化または還元が達成されるので好ましい。さらに
妨害物質を選択的に酸化または還元するために、スクリ
ーニングまたは保護電極を分析電極の「上流」に配置す
ることができ、それにより選択性を非常に改良すること
ができる。本質的には、分析電極の電圧は、試料分子の
酸化還元電位に変えられ、一若しくはそれ以上の前処理
セルが、試料中の妨害物を破壊するために配置される。

好ましい分析方法において、標準電流／電圧曲線は、
最適な感度を設定するための適正な電圧を決定するため
に、リジルピリジノリンまたはヒドロキシリジルピリジ
ノリンを含有する標準ペプチドについて確立される。こ
の電圧は、汚染物質からの妨害を最小にし、感度を最適
化するために、体液に応じて修正される。電気化学的検
出器及びそれらを使用するための最適条件は、当業者に
よく知られている。体液の複合混合物は、しばしば、妨
害なく電気化学的検出器により直接分析される。従っ
て、多くの患者にとって、体液の前処理は必要としな
い。しかしながら、ある場合には、妨害化合物が測定の
信頼性を減ずるかもしれない。そのような場合には、体
液（例えば、尿）の前処理が必要であろう。

従って、発明の他の実施態様において、体液は精製さ
れたペプチド断片を電気化学的に滴定するに先立ち、先
ず精製される。精製工程は、種々の方法によって行わ
れ、限定されないが、透析、イオン交換クロマトグラフ
ィー、アルミナクロマトグラフィー、ヒドロキシアパタ
イトクロマトグラフィー、分子篩クロマトグラフィーま
たはそれらの組合せが挙げられる。好ましい精製のプロ
トコールにおいて、24時間尿試料の測定された一定量
（25ml）を、大部分の汚染蛍光溶質を除去するために、
低多孔性透析チューブで透析される。非透析物を、次い
で、凍結乾燥し、１％ヘプタフルオロ酪酸（HFBA）のイ
オン対溶液に再溶解し、そしてペプチドがウォーターズ
・セプ−パックＣ−18カートリッジに吸着される。この
カートリッジは、次いで、5mlの１％HFBAで洗浄し、更
に１％HFBA中、50％メタノール3mlで溶出される。

精製の他の好ましい方法は、測定した一定量の尿をイ
オン交換フィルターに吸着させ、そして吸着フィルター
を緩衝した溶出液で溶出することから成る。３−ヒドロ
キシピリジニウム架橋を有するペプチド断片を含有する
溶出留分は、次いで、分析のために集められる。

精製の更に他の好ましい方法は、分子篩クロマトグラ
フィーを用いる。例えば、尿の一定量を、バイオ・ゲル
（Bio−Gel）P2またはセファデックス（Sephadex）Ｇ−
20カラムにかけ、次いで、1000−5000ダルトン領域に溶
出した留分を集める。当業者にとっては、上記方法の組
合せが３−ヒドロキシピリジニウム架橋を有するペプチ
ド断片を単離するために、尿または他の体液を精製し、
または部分的に精製するために使用されることは明白で
あろう。上記工程により得られた精製し、または部分的
に精製したペプチド断片は、更に追加の精製工程を行っ
てもよく、更に部分的に精製した状態で直接処理または
分析してもよい。追加の精製工程は、増大した感度が望
ましい場合には、高速液体クロマトグラフィー（HPLC）
またはマイクロボアHPLCを用いることにより、部分的に
精製されたペプチド断片を分別することを含む。これら
のペプチドは、次いで、電気化学的滴定により定量され
る。

好ましい電気化学的滴定法は、電気化学的検出器（ク
ーロケム、モデル5100A）の検出セルの酸化還元電位
を、純粋HPで最高信号となるよう調整することからな
る。検出器は、次いで、部分的に精製したペプチドを分
別するために使用されるＣ−18HPLCカラムからの流出液
を監視するために使用される。

C.ペプチド定量用蛍光分析工程ここで記載する３−ヒドロキシピリジニウム架橋を有
するペプチドの濃度を定量する好ましい方法は、これら
のペプチドの天然の蛍光特性を測定することである。３
−ヒドロキシピリジニウム架橋以外の天然に存在する蛍
光物質を殆ど含まないそれらの体液については、体液を
更に精製することなく、直接蛍光分析が行われる。この
場合、ペプチドはHPLCで分別され、HP及びLPアミノ酸残
基の自然の蛍光を297nmで励起し、395nmで測定する。こ
こで引例として導入されたエア等（Eyre,D.R.,et al.,A
nalyte.Biochem.137:380（1984））に実質的に記載され
ている。

本発明によれば、尿の蛍光分析を行うことが好まし
い。尿は、しかしながら、通常、蛍光分析を行う前に除
去されなくてはならない、かなりの量の自然に生ずる蛍
光汚染物質を含有している。従って、尿試料は、上記の
電気化学的分析で述べたように、先ず、部分的に精製さ
れなければならない。この部分的に精製された尿試料
は、次いで、上記したように、蛍光測定法による分析を
行うことができる。一方、部分的に精製した尿試料又は
他の体液中のHP及びLP架橋ペプチドは、上記したエア
（Eyre,et al.（1984））に記載されているように、6M
HC1中、約108℃でおおよそ24時間加水分解することがで
きる。この工程は、「トリペプチド」HP及びLP架橋のリ
ジン前駆体に連結しているアミノ酸を加水分解し、式１
及び２で示される遊離のHP及びLPアミノ酸を生ずる。こ
れらの小さい「トリペプチド」は、次いで、上記した技
術、好ましくはHPLCで分別され、そして自然の蛍光が測
定される。（Ex 297 nm,Ex 390 nm）。

任意に、体液（好ましくは、尿）は、アセトニトリル
／メタノール５〜10％v/vを添加した後、Ｃ−18逆相ア
フィニティカートリッジに直接通される。非残留物は水
酸化テトラブチルアンモニウム等のカチオン性イオン対
試薬により、0.05〜0.10Mに調整され、そして第二のＣ
−18逆相カートリッジを通される。この第二のカートリ
ッジからの蛍光ペプチドを含有する洗浄した残留物は、
アセトニトリル：水（またはメタノール：水）で溶出さ
れ、乾燥され、そして蛍光ペプチドは、溶離液中の0.01
Mトリフルオロ酢酸のようなアニオン性イオン対試薬を
用いて、逆相HPLCまたはマイクロボアHPLCにより分析さ
れる。

図8Aは、健常人の尿からのペプチド断片の加水分解物
を、自然の蛍光により逆相HPLCによって分別した溶出図
を示す。与えられた成分の周りの統合された領域の測定
は、試料中のその成分の濃度を測定するために使用され
る。健常人尿及びページェット病患者の尿から見出され
るHP:LPの比は、図8Bのように、共に、約4.5:1である。
これは、骨それ自身に見出される4:1の比よりも若干高
い（エア等（Eyre,et al.,1984））。尿中に見出される
高い比は、尿中のHP留分の一部が、食物のような骨以外
の源から、或いはコラーゲン分解の他の源、即ち、軟骨
の異化作用からきていることを示している。この理由の
ために、骨からのみ由来するLPを骨吸収の絶対的指標を
提供するものとして使用することが好ましい。しかしな
がら、リウマチ関節炎のような過剰の軟骨分解がない場
合または骨が急速に吸収される場合には、HPまたはHPプ
ラスLPの組合せを骨吸収の指標としてもよい。

本発明を好ましい実施態様に関連して記載したけれど
も、先の明細書を読んだ後の当業者は、ここに掲載した
主題の種々の変更、等価な置換及び交換を行うことがで
きるであろう。よって、本発明はここに特別に記載した
以外の方法によっても行うことができる。従って、本特
許による保護は、添付した特許請求の範囲及びその均等
物によってのみ限定される。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩＣ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ (58)調査した分野(Int.Cl.⁶，ＤＢ名) G01N 1/00 - 37/00 C07K 1/00 - 19/00 C12P 21/08 ＣＡ

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】体液サンプル中のつぎの一般式VIで示される構造からなる第一のカルボ
キシ末端Ｉ型コラーゲンテロペプチド（上記式中、Ｋ−Ｋ−Ｋはヒドロキシリジルピリジノリ
ン又はリジルポリジノリンを表す）及び架橋アミノ酸のピリジニウム環が開裂している以外
は、第一のテロペプチドと同じものである第二のコラー
ゲンテロペプチドの両者の存在又は濃度を測定することを含む生体内での
Ｉ型コラーゲン分解の測定方法。
【請求項２】体液が、尿、血液、血清または滑液である
第１項に記載の測定方法。
【請求項３】体液を第一及び／又は第二のペプチドに対
して特異的な結合パートナーの少なくとも１つと接触さ
せることを含む、第１項又は第２項に記載の測定方法。
【請求項４】体液を第一のペプチドに対して特異的な結
合パートナー及び第二のペプチドに対して特異的な結合
パートナーと接触させることを含む第２項に記載の測定
方法。
【請求項５】さらに、体液を接触させる前に、体液を精
製することを含む第１〜４項のいずれか１項に記載の測
定方法。
【請求項６】精製工程が、カートリッジ吸着及び溶出、
分子篩クロマトグラフィー、透析、イオン交換、アルミ
ナクロマトグラフィー及びヒドロキシアパタイトクロマ
トグラフィーからなる群から選択されたものである第５
項に記載の測定方法。
【請求項７】つぎの一般式VIで示される構造からなる
第一のカルボキシ末端Ｉ型コラーゲンテロペプチド（上記式中、Ｋ−Ｋ−Ｋはヒドロキシリジルピリジノリ
ン又はリジルポリジノリンを表す）及び架橋アミノ酸のピリジニウム環が開裂している以外
は、第一のテロペプチドと同じものである第二のコラー
ゲンテロペプチドに結合する免疫学的結合パートナーの少なくとも１つを
含む生体内でのＩ型コラーゲン分解の測定用キット。